JPH08510643A

JPH08510643A - インターロイキン‐５受容体を介した細胞シグナル伝達経路に対する変調作用を有する物質のスクリーニング法

Info

Publication number: JPH08510643A
Application number: JP7500238A
Authority: JP
Inventors: アルミンペーターツェルニロフスキー; ウルリケヴァイアー; イアンジーヤング
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1996-11-12
Also published as: NZ291131A; EP0701628A1; FI955700A; DK0701628T3; HU9503363D0; FI955700A0; HUT73742A; NO954781D0; KR960702532A; US5922549A; EP0701628B1; NO316027B1; NO954781L; AU6997794A; CN1125467A; FI111016B; AU691816B2; ES2113109T3; WO1994028170A1; CA2163549A1

Abstract

(57)【要約】哺乳類の細胞において、インターロイキン-5受容体依存型シグナル伝達経路に対する変調作用を有する物質を、スクリーニングする方法を明らかにする。試験物質は、機能的インターロイキン-5受容体を発現し、かつリポーター遺伝子、及びそれらに機能的に結合し、インターロイキン-5受容体依存型シグナル伝達経路の第二メッセンジャー物質の濃度変化に感受性があるような調節配列を含む組換えDNAで形質転換されるような細胞に晒される。インターロイキン-5受容体依存型シグナル伝達経路に特異的であり、かつ医薬効果を有する可能性がある物質は、本方法によって、同定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン-5受容体を介した細胞シグナル伝達経路に対する変調作用を有する物質のスクリーニング法本発明は、ヒト及び動物のインターロイキン-5受容体を介在した細胞内シグナル伝達経路に対する物質の変調作用を測定することによって、医薬として活性がある物質を検出する方法に関する。通常のいわゆる“放射性リガンド試験”は、受容体に結合したリガンドをどの程度置換することができるかに関して物質を調べるものであり、医薬として活性がある物質を検出するために使用されるが、公知のリガンド受容体結合部位の結合に影響する物質を同定するためにのみ使用することができる。これらの試験は、該結合物質が、作動性活性又は拮抗性活性のいずれを有するかを明らかにすることはできない。より高等な真核細胞の膜貫通型シグナル伝達システムは、下記の膜結合性成分から成ることが多い： a）任意に多数のサブユニットから成ることができる、細胞表面受容体；任意にb ）グアニン−ヌクレオチド結合性及びGTP切断抑制のタンパク質で、これはＧタンパク質と呼ばれ、かつ該受容体及びそのエフェクターの双方に連結することができる； c）いわゆる“エフェクター類”で、これはしばしば、例えばcAMP、DAG、IP₃などの第二メッセンジャー分子の濃度を変化させるものであり、例えばイオンチャンネル、又はアデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼである；及び／又は d）様々なキナーゼ類である。細胞表面受容体類は、多数の細胞外刺激物質からそれに適したリガンドを認識する。このリガンドの受容体への結合は、シグナルカスケードを活性化する。Ｇタンパク質連結受容体の場合、このシグナル伝達経路は、比較的良く理解され、かつ非常に異なる細胞外シグナル類の活性を仲介するが、これはヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化と共に始まる。低分子量の第二メッセンジャー類、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって誘発されるcAMP（サイクリックAMP）、グアニル酸シクラーゼの活性化によって誘発されるcGMP（サイクリックGMP）、ホスホリパーゼＣ、もしくは加水分解酵素が関与する場合にはホスホリパーゼＤ（Billahらの論文(1989)）のようなホスホリパーゼ類の活性化によって誘発されるイノシトール-1,4,5-トリスリン酸（IP₃）及びジアシルグリセリン（DAG）は、プロテインキナーゼの活性化によるタンパク質の選択的リン酸化（例えば、IP₃/DAGによるPKCN、cAMPによるPKAなど）を含む細胞内変化を順にもたらし、特定の遺伝子の転写及び増幅の調節に影響を及ぼす。（ある拮抗的活性物質は、作動的活性物質によって引き起こされた相互作用、及び第二メッセンジャーの濃度の結果的変化を、完全に又は部分的に取り消すことができ、もしくはそれ自身で逆作用をもたらすことができる。）このシグナル伝達システムによって、細胞は、互いに連絡し、かつそれらの出現又はそれらが誘発する活性を調和することができる。１種の受容体サブタイプ（おそらく同一細胞内又は異なる細胞内の）は、１種以上のエフェクターに連結することができ、かつ多数の受容体サブタイプは、同一のエフェクター類を活性化することができるので、複合的シグナル伝達ネットワークが形成される。このシグナル伝達カスケードで受容体が活性化された結果活性化される転写因子（CREB-タンパク質、AP1-タンパク質など）は、調節DNAエレメント類と相互作用する。この例は、CRE（CRE-エレメント、“cAMP応答エレメント”）又はTRE（TRE=“TPA応答エレメント”；TPA=ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート=ホルボールエステル）であり、これらはCREB又はAP1と結合し：それらの転写がcAMPによって調節されるような多くの遺伝子（例えば、ラットのソマトスタチン、ヒト-α-ゴナドトロピン、c-fos）は、5'-フランキング領域に、調節エレメントとして、保存配列を有する。CRE-配列は、パリンドロームな八量体TGACGTCAと同一又は類似である（Montminyらの論文(1990)）。TRE-エレメント類は、非常に類似した七量体モチーフTGAGTCAを含み、これはCRE-エレメントの共通配列とは、ヌクレオチド１個のみが異なる（Deutschらの論文(1988) ）。TRE-モチーフ、又は非常に類似したモチーフ類が、多くの遺伝子において、同定されていて、それらの転写は、ホルボールエステル類によって活性化される（Angelらの論文(1987a及びb);Leeらの論文(1987)）。外部DNA配列又は他の因子とのタンパク質−タンパク質相互作用は、とりわけ、特定の遺伝子における具体的な調節現象を決定する。他の調節DNA-エレメントは、血清因子に反応する、いわゆる“SRE-エレメント ”である（“血清反応性エレメント”、Treismanらの論文(1985)）。SRE-エレメントは、二回対称性の構造を持つ、20塩基対から成る誘導可能なシス−エレメントである。SRE-エレメントは、様々な増殖因子に応答し；SREが、各種のサイトカイン類によるc-fos誘導の重要な標的であることが、最近報告された（Hatakey amaらの論文(1989)）。糖質コルチコイドの濃度変化に応答するようなモチーフは、“GRE-エレメント”と称される（Yamamoto(1985);Scheidereitらの論文(198 6);Jantzenらの論文(1987);Straehleらの論文(1987)）。このシグナル伝達経路のネットワークの複雑さの結果、例えばアデニル酸シクラーゼ及びホスホリパーゼＣのシグナル伝達経路のように、シグナル伝達経路間にいわゆる“混線”が生じることがある。用語“混線”は、あるエフェクターシステムの影響が別の影響を引き起こすような現象を意味する（Sassone-Corsiらの論文(1990);Houslayらの論文(1991)）。この混線現象は、過剰なシグナルを産生すること又は各種のシグナル伝達経路の伝達を確実にすることを目的とする、シグナル類の複合化又は連結のために生理的に活用される。混線は、シグナル伝達経路の様々なレベルで生じることがある。細胞に対する病的変化の考えられる原因のひとつは、これらの相互作用の崩壊、例えばある受容体が、エフェクターシステムと、生理的に、もはや正しく相互作用しないような場合である。Ｇタンパク質と結合しない受容体には、サイトカイン受容体類が含まれる。これらは、異なる受容体と一部共通する多くのシグナル導入経路と順に連関されると仮定され、その結果細胞内で多重混線が生じる。サイトカイン類は、免疫及び炎症反応の調整（リンホカイン及びモノカイン）、ウイルス感染の撃退（インターフェロン）、並びに造血機能（“コロニー刺激因子”、CSF）において重要な役割を演じる。これらは、造血系、リンパ系又は他の臓器系において、いくつかの細胞の増殖、分化及び機能を調整する。個々のサイトカインはそれぞれ、様々な細胞種にその影響を発揮し、かつ個々の細胞は、多数のサイトカインと反応することが多く、その結果、サイトカイン産生細胞及びサイトカインによって制御された細胞は、サイトカインが相乗的又は抵抗性に作用するような、複雑な細胞内ネットワークを形成する。サイトカインの生物活性スペクトルは、特にそのサイトカインに特異的な受容体を発現する異なる細胞型の数によって決まる。インターロイキン-3（IL-3）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）は、造血系全体の、多能性造血細胞及び前駆細胞を刺激する多面的因子の例である。一方インターロイキン-5（IL-5）は、活性の範囲が非常に狭く、かつ主に好酸球前駆細胞に作用する（Miyajimaらの論文(1992) ）。これらのタンパク質構造の解析は、全てのサイトカイン受容体が、Ｎ-末端側細胞外領域、１つの膜貫通領域及び細胞内領域から成る、膜結合性糖タンパク質であることを示している。この細胞外領域は、サイトカイン受容体を、そのメンバーの起源がおそらく同一の前駆遺伝子であると思われる、多くの受容体遺伝子ファミリーに帰するような、いくつかの共通の構造成分を有する（Gillisの論文 (1991)）。IL-5受容体遺伝子は、造血因子受容体遺伝子ファミリーに属する。このファミリーのメンバーは、細胞外領域に、単独でもしくは複数のコピーで生じる特徴的に保存されたシステイン基を含む。これらは更に、トリプトファン−セリン-X-トリプトファン−セリンモチーフも含み（Xは、任意のアミノ酸）、これは膜貫通領域に近接した細胞外領域に局在することが多い。最後に、このファミリーの受容体は、細胞外領域全体に分散したフィブロネクチン３型結合モチーフの単独又は複数のコピーを有する（Gillsの論文(1991)）。 IL-5受容体（両方のサブユニット）以外にも、IL-3、IL-6及びGM-CSF、IL-4、 IL-7、エリトロポエチン（EPO）に対する受容体の両方のサブユニット、及び“ 白血球遊走阻止因子”（LIF）-受容体、IL-2受容体のβ−サブユニット、並びに成長ホルモン（GH）、プロラクチン及びG-CSFに対する受容体も、造血因子受容体ファミリーに属する。 IL-5受容体は、特異的なサイトカイン結合領域を含むα−サブユニット、及び IL-5受容体に対する高親和性の形成に貢献し、かつシグナル導入に必要なβ-サブユニットから成る。IL-5受容体のヒト（Tavernierらの論文(1991)）及びマウス（Takakiらの論文(1990)）のα−サブユニット、並びにヒト（Tavernierらの論文 (1991)）及びマウス（Devosらの論文(1991);Takakiらの論文(1991)）のβ−サブユニットをコードしているDNA類が、クローン化された。IL-5、IL-3及びGM-CSF 受容体は、同一のβ−サブユニットを有す（Kitamuraらの論文(1991);Tavernier らの論文(1991)）。これら３種の受容体の１種以上が、細胞上に発現する場合に、結果的に受容体レベルでのこれらのサイトカイン間が“混線”することがある。 EGF又はPDGFのような増殖因子の受容体と異なり、これらのサイトカイン受容体のサブユニットは、いずれのチロシンキナーゼ固有活性も有さない。しかし、当該のリガンドによる、IL-5、IL-3及びGM-CSF受容体の刺激は、特定の細胞タンパク質の迅速なチロシンリン酸化を誘導することが示されている（Koyasuらの論文(1987);Isfortらの論文(1988);Morlaらの論文(1988);Murataらの論文(1990)）。チロシンキナーゼは、GM-CSFによる刺激後の、該受容体のβ-サブユニットに関連していることが確認されている（Hanazonoらの論文(1993)）。GM-CSFに誘発されたシグナル伝達の間に生じる他の作用は、p21^ras（Satohらの論文(1991,199 2)）及びc-raf（Carrollらの論文(1990)）の活性化であり、IL-3に誘発されたシグナル導入も、p21^ras（Satohらの論文(1991,1992)）及びc-raf（Carrollらの論文(1990)）の活性化に加えて、プロテインキナーゼＣの活性化（Whettonらの論文(1988)）及び“マイトジェンが活性化したタンパク質”（MAP）キナーゼのリン酸化（Welham及びSchraderの論文(1992)）であることも明らかになっている。しかし現在まで、シグナル導入カスケード全体におけるこれらの作用の正確な配列は決定されていない。シグナル導入機構の成分によるサイトカイン受容体の刺激後に誘導された遺伝子は、未だ大部分同定されてはいない。従って、このような遺伝子のプロモーターの調節エレメントについては、ほとんど解明されていない。例えば、IL-6受容体の刺激は、特異的DNA-結合タンパク質、NF-IL-6の活性化をもたらし、これは、標的遺伝子のプロモーター領域のIL-6応答性エレメントに結合することによって、該遺伝子の発現をもたらし、これによりIL-6依存性の生物学的作用をもたらす（Akiraらの論文(1990)）。プロモーター領域に複数の誘導可能な配列エレメントを含むc-fosプロトがん遺伝子（Verma及びSassone-Corsiの論文(1987)）は、IL-2、IL-3及びEPOによって誘導される一方、c-fosプロモーターに存在する“ 血清応答エレメント”（SRE）は、特にその誘導に関連している（Hatakeyamaらの論文( 1989,1992)）。 IL-5受容体は、そのリガンドであるインターロイキン-5（IL-5）と結合することによって、活性化される。IL-5は、Ｔ細胞及びマスト細胞で産生され、かつ好酸球の最終分化において必須の機能を有する、ペプチドホルモンである。 IL-5受容体に連関したシグナル伝達経路に関しては、ほとんどなにも解ってはいない。未だ同定されていない細胞タンパク質の一部のリン酸化（Murataらの論文(1990)）以外の、IL-5受容体の刺激によって誘発されたシグナル導入の過程は明らかにされていない。３種のサイトカインIL-5、IL-3及びGM-CSFは、生物学的機能が異なるので、おそらく３種の受容体総てに共通であるβ−サブユニット以外の、これらの受容体のサイトカインに特異的なα−サブユニットが、細胞内シグナル経路の誘発、特にサイトカインに特異的なシグナル伝達及び機能において、役割を果たすであろう（Tominagaらの論文(1992)）。従って、IL-5受容体に連関したシグナル経路に関する明らかな結論は、IL-3受容体又はGM-CSF受容体の活性化によって誘発されたシグナル伝達過程の知識から引き出すことはできない。 IL-5受容体の刺激後に誘発された遺伝子は、まだ同定されていないので、このような遺伝子のプロモーター領域に存在し、IL-5受容体の活性化によって起動するシグナル伝達経路に応答する調節エレメントのいずれも、解っていない。 IL-5受容体のそのリガンドとの結合による活性化は、好酸球増加症、すなわち血中の好酸球増加に随伴する様々な疾患に関連づけられている。これらは、自己免疫疾患、移植拒否反応、アレルギー疾患、ある種の寄生虫病及び喘息疾患を含んでいる。このような疾患の原因治療のためにこれまでの提唱されている方法の一つは、アンタゴニストとしてのIL-5受容体の可溶性α−サブユニットの投与（欧州特許出願公開第0492214号）であり、もう一つはIL-5の結晶構造から出発する、アンタゴニスト又はアゴニストの論理的デザイン（Milburnらの論文(1993) ）である。最近、ある種の受容体又は受容体サブタイプに特異的であり、かつ受容体を介したシグナル伝達経路に特異的に影響を及ぼすような病的状態の治療用の医薬品の検出を可能にするスクリーニング法が開発されている。これらの方法は、該受容体を介したシグナル伝達経路に対する物質の変調作用を、遺伝子発現を用いて検出することができるという原理を基にしている。 Kingらの論文（1990）に記載されたアッセイシステムは、酵母細胞において、作動的活性化合物を受容体に結合する反応を、該酵母細胞にトランスフェクションするような、Saccharomyces cerevisiaeのＧタンパク質が結合したフェロモン受容体によって利用されるシグナル伝達経路への作用を、比色によって測定することを基にしている。 Montmayeur及びBorelliの論文（1991）は、Ｇタンパク質と結合した受容体（D₂ -受容体及びβ-アドレナリン受容体を使用）の活性化による、アデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路への作用を基にしたアッセイを明らかにした。 Himmlerらの論文（1993）は、cAMP-シグナル伝達経路へ連関した受容体（ヒトのドパミンD1-及びD5-受容体）の活性を、受容体遺伝子の転写活性によって測定する機能試験を開発した。これまでに公知であるアッセイは、Ｇタンパク質結合受容体のシグナル伝達経路の一種のメッセンジャー物質であるcAMPの濃度によって調節される遺伝子類の発現を測定することに限定されている。これと対照的に、本発明の目的は、機序及びメッセンジャー物質についてはほとんど解っていないような、IL-5受容体を介したシグナル伝達経路を変調する物質を同定するスクリーニング法を提供することである。特に、本発明は、自動化でき、かつ物質の高速処理スクリーニングに適した方法であり、更に生物由来の抽出物のような、物質の複合的混合物の、医薬活性物質の含有量を調べることを可能にする方法を提供する。 IL-5受容体を介したシグナル伝達経路を変調する能力に基づく物質、特にIL-5 受容体アゴニストの同定は、IL-5受容体の変調、並びに多くは活性化に関連がある疾患の治療に使用される医薬品の開発の出発点となる。本発明の範囲において、IL-5受容体の機能に必要な構造エレメント及びIL-5受容体を介したシグナル伝達経路の成分を発現する細胞（以後このような細胞を、簡略化のために、“機能的IL-5受容体を発現する細胞”と称す）、並びに調節DN Aエレメントを含むリポーター遺伝子構成体で形質転換された細胞において、該リポーター遺伝子構成体が、IL-5受容体のリガンドとの結合後の活性化によって誘導されることが示されている。 IL-5受容体を介したシグナル伝達経路に関する限られた知識から判断して、これらの結果は、特にこれまでに特徴づけられた調節DNAエレメントが、IL-5受容体によって起動されるシグナル伝達経路のメッセンジャー物質に応答するかどうか、もしくはいずれのエレメントが応答するかを予測することは不可能であるので、驚異的であった。本発明は、ヒト及び動物の細胞における、受容体を介したシグナル伝達経路に対する物質の変調作用を測定する方法に関する。本方法は、IL-5受容体の活性化によって開始されたシグナル伝達経路の成分に対する該物質の変調作用を、下記の哺乳類細胞： a）リポーター遺伝子、及びIL-5受容体に連関したシグナル伝達経路の１種以上の第二メッセンジャー物質の濃度変化に応答するような調節配列を含む、組換え DNAで形質転換され、その結果該リポーター遺伝子の発現が、該メッセンジャー物質の濃度変化によって変調されるような細胞で、更に b）前記試験物質によって、機能的インターロイキン-5受容体を発現する細胞、をインキュベートしかつ該リポーター遺伝子生成物の濃度を測定し、更に検出された試験物質の活性が、IL-5受容体を介したシグナル伝達経路に対し選択的であるかどうかを調べることによって測定されるという特徴がある。本発明の範囲の“IL-5受容体を介したシグナル伝達経路”の定義は、任意に１種以上のシグナル伝達経路から成る、インターロイキン-5受容体を介したシグナル伝達の機序も含んでいる。 “シグナル伝達経路の成分”の定義は、IL-5受容体それ自身又はそのサブユニットを含む、シグナル伝達経路に関連した分子のあらゆる機序を含んでいる。 IL-5依存型シグナル伝達経路の阻害剤を探す場合は、試験物質を、前述の細胞上にIL-5と共に配置することによって、それらの拮抗作用について調べ、一般にこのIL-5は、該試験物質と同時に又は遅れて該細胞に添加される。前述の第二メッセンジャー物質の変化に応答し、かつ本発明の一部であるような組換えDNAは、今後“センサ-DNA”と称する。リポーター遺伝子は、その発現生成物が、検出可能であり、かつその濃度に比例したシグナルを測定することによって定量化されるという事実によって定義づけられている。センサーDNAによって形質転換され、かつIL-5受容体を発現する細胞は、今後 “試験細胞”と称し；これらの細胞も、同じく本発明の対象である。本発明においては用語“IL-5受容体”は、前述の機能的IL-5受容体を意味し、一方でこの定義は、存在するいずれかのIL-5受容体サブタイプも含むであろう。本発明の“機能的受容体”の意味は、一つは同一種のα−及びβ−サブユニットから成る天然のIL-5受容体であり、更に試験細胞、特にヒトの細胞における、異なる種のIL-5受容体のα−及びβ−サブユニットの実行可能な組み合わせであり、例えばヒト受容体のα−サブユニット及びマウス受容体のβ-サブユニット、又はその逆である。この定義に従う機能的受容体は、β−サブユニットが、別の受容体、例えばIL-3又はGM-CSF受容体のα−サブユニットと、自然に相互作用するような細胞内で、IL-5受容体のα−サブユニットが、該細胞内に導入され、かつその場で発現するような場合にもあてはまり、この場合には、これらの２種のサブユニットの機能的協力が、該シグナル伝達経路の開始を確実にするという条件で、該α−サブユニットは異なる種に由来することもできる。 IL-5受容体の１個のサブユニット又は複数のサブユニットをコードしている１種以上の配列を含む組換えDNAを、今後“受容体-DNA”と称す。試験細胞調製に適した出発細胞は、完全な機能的IL-5受容体をすでに内在的に含有している細胞であり、更に前記センサー-DNAの誘導に必要な、受容体が連関したシグナル伝達経路の成分を含有している細胞でもある。このような適した細胞においては、それらが完全なIL-5受容体、もしくは元来のサブユニットのただ一方のみを発現するということは本質的ではない。一方又は両方のサブユニットが欠如している場合は、該細胞は、センサー-DNAのみではなく、更に欠失している受容体の１個又は複数のサブユニットをコードしている配列によって、形質転換することができる。本発明の実施態様において、試験細胞は、機能的IL-5受容体に必要な両方のサブユニットを天然に発現している細胞由来である。本発明の別の実施態様において、試験細胞は、β−サブユニットのみを発現している出発細胞に由来し；この場合、該細胞は、センサー-DNAのみではなく、IL -5受容体のα−サブユニットをコードしているDNA配列を含むプラスミドによっても形質転換される。本発明の他の実施態様において、試験細胞の出発細胞は、IL-5受容体のα−又はβ-サブユニットのいずれも天然には含まない。この場合、該細胞は、１個のプラスミド又は分離したプラスミドにおいて共に生じることができるような、両方のDNA配列で形質転換されなければならない。物質を、ヒトの病的状態の治療を目的としてそれらの医薬活性について調べる場合、その受容体-DNAは、ヒトIL-5受容体をコードしている配列を含むことが好ましい。（本発明の方法は、ヒトの病態の治療に適している物質を検出するために使用されることが好ましい。しかし、これは、動物の治療に使用される物質のスクリーニングにも活用され；この場合、対応する動物のIL-5受容体が、用いられる。）前述の試験細胞調製のための細胞は、第二メッセンジャー物質の濃度を高めるような物質による刺激後に、IL-5受容体の機能として、該受容体遺伝子の強力な発現をもたらすという理由で選択されることが好ましい。これは、センサ-DNAを用い、機能的IL-5受容体を発現する細胞を一過性に形質転換し、かつIL-5による該受容体刺激後のリポーター生成物の濃度を調べることによって、簡便に試験される。該試験細胞のための出発細胞は、特にIL-5受容体又はβ−サブユニットを含む受容体を発現することが公知である細胞、もしくはそれらの出発材料又は生物の機能の点で、当該の受容体の１種を発現すると仮定することができる細胞、特に造血前駆細胞であることができる。該受容体の発現は、任意に、当該のリガンド（IL-5、IL-3又はGM-CSF）の存在下で、細胞の増殖が測定されるような結合アッセイ及び／又は増幅アッセイによって、確認することができる。適した出発細胞の例は、骨髄細胞から樹立された因子依存型細胞株（factor d ependent cell lines）であり；このようなβ−サブユニットを発現するような細胞株の産生は、マウスの細胞に関して、例えばDexterらの論文（1980）に記載されている。本発明の範囲において、このようなマウス細胞株の例は、マウスIL-5受容体のα−サブユニットをトランスフェクションされ、試験細胞として使用された。別の適当な試験細胞の例は、IL-5依存性造血細胞、例えばKitamuraらの論文（1989,1991）に記載された細胞株TF-1の細胞から成る。両方のサブユニットが、マウス由来のものであるような細胞、例えばマウス細胞株1H3においては、α−、並びにおそらくβ−サブユニットも、例えば相同的組換えによって交換され、かつ対応するヒトの配列で置換される。原則的には、哺乳類のいずれの種由来の細胞であっても、出発細胞として使用することができるが、ヒト細胞の使用が好ましい。ヒト以外の細胞を使用する場合は、ヒトのIL-5受容体DNA（β−及び／又はα−サブユニット）で形質転換された細胞を使用することが好ましい。本発明の目的のために、細胞を試験細胞として適正化する際の他の必須条件は、その安定性である。これらの細胞の安定性を試験するために（生存度、該ゲノムへの異種DNAの安定な組込み）、長期間に渡り、同一条件下での該試験細胞の試験を行い、かつこの測定結果の再現性を調べる。前述のセンサ-DNAは、適当な宿主生物、好ましくはE.coliにおいて、多数のコピーを複製することができ、かつ哺乳類細胞へのトランスフェクション、及び宿主ゲノムへの組込み後に、リポーター遺伝子の発現を、調節エレメント制御下で生じることが可能であるようなプラスミドに局在することが好ましい。これは好ましくは、少なくとも１種の複製起点、並びにE.coliの複製及び選択のためのマーカーに加え、このリポーター遺伝子（センサ-DNA）の発現カセット、及び哺乳類細胞の選択マーカーを含む、シャトルベクターである。それらのゲノム内に安定して組込まれたセンサ-DNAを含む永久細胞株を産生するために、このベクターは、有力な選択マーカーを含む。特定の選択マーカーの使用は重要ではないが；適しているものとして、例えば、抗生物質ゲネチシン（ G-418）耐性を示すネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子（Sout hern及びBergの論文(1982)）、DHFR-欠失細胞のDHFR-遺伝子（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ムコフェノール酸耐性を示すキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）遺伝子（Mulligen及びBergの論文(1981)）、又はハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph；Gritz及びDavies の論文(1983)）がある。前記選択マーカー遺伝子を起動するプロモーターの例は、SV40-初期−プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（CMV-プロモーター）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター（TK -プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の長末端反復（LTR）である。前記プラスミドは、例えば異なる細胞株の使用の結果のように、特別な適用の結果もたらされるあらゆる修飾された必要条件に適合させるために、そのリポーター遺伝子、リポーター遺伝子のプロモーター、選択マーカーの調節配列のような個々の重要なエレメントが、容易に置換及び変化することができるようにデザインされることが好ましい。このための処置は、例えば該プロモーター又は様々なリポーター遺伝子を変調する調節配列のクローニングを可能にするための、１個又は複数のプロモーターの上流、もしくはリポーター遺伝子の上流への、多クローニングサイトの導入から成る。適したリポーター遺伝子を選択する際の、最初の前提は、自動化可能な、好ましくは非放射性である、高感度アッセイを提供することであった。本発明の範囲においては、これらの前提条件を満たすいずれのリポーター遺伝子も、理論的に使用することができる。化学発光基質を使用する場合は、アルカリホスファターゼを高感度で測定することができるが、これには多数の哺乳類細胞がこの酵素を比較的強力に発現するという欠点がある。従って、一般にこれを発現しない、もしくはごくわずかに発現するような、哺乳類の細胞株のリポーター遺伝子としてのみ考慮することができる。 β−ガラクトシダーゼ−及びβ−グルクロニダーゼ−遺伝子の発現生成物は、対応するメチルウンベリフェリル−ガラクトシド又は−グルクロニドを切断し、発蛍光基を生じる。これらの酵素反応は、確立された蛍光アッセイ法でモニタリングされる（Wielandらの論文(1985);Krickaの論文(1988)）。クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ（CAT）の発現は、比較的良い感度で検出することができるが、このアッセイは、放射性であり、かつ自動化が困難であるという欠点を有する（Hartmannの論文(1991)）。本発明の範囲においては、Photinus pyralisのルシフェラーゼをコードする遺伝子（De Wetらの論文(1987)）を、リポーター遺伝子として使用することが好ましい。この酵素は、その基質ルシフェリン及び追加ATPを添加することで、確立され自動化された方法で測定することができる生物発光物質を、高い収量で生じ、かつこの酵素は哺乳類細胞によって内生されないという利点がある。更に、ルシフェラーゼは、in vivoの半減期が比較的短く、かつ高濃度であっても毒性がない（Hartmannの論文(1991);Brasierらの論文(1989)）。センサーDNAの構成において、前述のリポーター遺伝子は、TRE-及び／又はCRE -及び／又はSRE-及び／又はGRE-エレメントのような、変調可能な調節エレメントを含むプロモーター類の制御下に置かれる。IL-5受容体のシグナル伝達経路は詳細に解明されてはいないので、もっとも適したセンサーDNA構成は、予備試験で経験的に決定される。このため、機能的IL-5受容体を発現する細胞は、様々なセンサ-DNA構成体で一過性に形質転換され、一方で該リポーター遺伝子を変化し、他方で該制御配列を変化し、かつこのリポーター遺伝子生成物の測定は、アゴニスト、好ましくはIL-5で、この受容体を刺激した後の、該リポーター遺伝子生成物の濃度を測定することによって、その感度が検定される。このセンサーDNA の適した調節配列は、該プロモーターの活性化をもたらすような全てのDNAエレメント、例えばTRE、CRE、GRE又はSRE、もしくはこれらの各種のエレメントの組み合わせを含む群から選択されたエレメントである。２種以上の異なるエレメントを含むこの種のセンサーDNAによって、多数のシグナル導入経路の個々の活性化、又は多数のシグナル導入経路の平行した活性化がカバーされる。この試験細胞開発のためのセンサ-DNAの選択は、所定の細胞システムにおけるリポーター遺伝子の可能な導入を最大に達成することを基になされる。この調節DNA領域は、天然に生じるプロモーター領域であるが、人工的に産生することもできる。複数の第二メッセンジャー物質によって誘導可能な遺伝子の完全なプロモーター、例えばICAM-1-遺伝子（細胞間接着分子１）又はc-fos遺伝子の5'-調節配列を、任意に使用することができる。特にTRE-、NKkB-、SP1-及びAP2-エレメントを含むICAM-1-プロモーター（Vorabrergerらの論文）、又は特にCRE-及びSRE- エレメントに加え“SIF-E-エレメント”及び“AP₁-様エレメント”と称された調節配列を含むc-fos-プロモーター（Hipskind及びNordheimの論文(1991)）などの、IL-5受容体の活性化に応答し、かつ複数の調節エレメントを含む天然のプロモーターは、いずれのエレメントが活性化の原因となるかを調べることができる。これは、天然のプロモーターと比べ、様々な変異及び／又は欠失を有する、人工のプロモーター配列の活性化能を調べることに関連している。このような試験結果から出発し、所望であるならば、例えば重要であると判断された１種又は複数のエレメントの多コピーを用いて、プロモーターを更に最適化することができる。所望であるならば、公知の天然又は合成のプロモーター類は、そのプロモーター機能に必要とされる最少の配列にまでそれらを短くすることによって、修飾される。該リポーター遺伝子が非天然のプロモーターによって起動されるようなセンサーDNAを構成する場合は、１種以上のエレメント、例えば該プロモーターを変調するTRE-及び／又はCRE-及び／又はSRE-及び／又はGRE-調節エレメントは、弱いプロモーターエレメントの上流に置かれることが好ましい。当業者のいずれも、特定の哺乳類細胞内での発現に適しているような、制御配列について精通していて；この選択は、まず関連文献（例えば、Landschulzらの論文(1988);Turner及びTjianの論文(1989)）を基に行うことができ、かつ選定又は最適化は、前述の実行が容易な一過性のトランスフェクション実験を用いて行うことができる。適したプロモーターの例は、β−グロブリンプロモーター及びTKプロモーターである。該センサ−DNAに含まれた調節配列（そのフランキング配列を含む）の選択に際し、前述の文献で公知のエレメント類を、出発物質として用い（例えば、TRE- 又はCRE-エレメント、Montminyらの論文(1990);Deutschらの論文(1988)参照）、かつこれらは、予備試験において、所定の細胞システム中の、リポーター遺伝子の誘導性の感度検定に関するそれらの適性について試験される。フランキング領域を含む、適したTRE-エレメントの例は、ソマトスタチン、“血管作用性腸管ポリペプチド”、サイトメガロウイルスエンハンサー、ウシ白血病ウイルス長末端反復（BLV LTR）（CRE-エレメント）、並びにICAM-1、コラゲナーゼ及び副甲状腺ホルモン（TRE-エレメント）の配列である。天然の配列に含まれたモチーフが完全な共通配列を有さない場合に、完全な共通配列が必要もしくは所望であるならば、これら、及びおそらくその隣接配列を、１種以上のヌクレオチドの置換によって変化させることができる。前記調節エレメント及びそれらのフランキング配列は、合成的に生成することができる、もしくは天然の原料であることができる。前記リポーター遺伝子発現に対する第二メッセンジャー物質の変調効果を増強するために、構成体は、縦列に複数の同種又は異種の調節配列を任意に含むものを使用することができる。この構成体の個々のエレメントを配列する際に、これらのエレメントの互いのスペーシングは、これらのエレメントに対する転写因子の結合を確実にするように選択される。これらの調節エレメントの互いの最適のスペーシングは、立体配列に関する考察を基に測定するが、予備試験において経験的に決定され、並びに任意に転写に影響を及ぼすような別の調節DNA-エレメント、例えばTATA-ボックスなどからのスペーシングも同様である。多調節配列において、これらのエレメント及び／又はフランキング配列は、同一であるか、もしくは少なくとも部分的に異なるものであってよく、縦列構造には後者が好ましい。これらのエレメントの調節特性に影響することが解っている、該調節エレメントのフランキング配列として、特にそれらのすぐ隣に、特定の調節エレメントを天然に取り囲んでいるような配列を用いることが好ましい（Montminyらの論文(1 990);Deutschらの論文(1988)）。この配列もしくはそれらの配置は、経験的に決定される。選択に使用されるセンサーDNA及びマーカー遺伝子のエレメントは、おそらく２種の個別のプラスミドで、該リポーター遺伝子構成体を含むもの（該調節配列を有する発現制御配列を含む）、及び選択マーカー遺伝子構成体を含むものとに位置するであろう。（適した選択マーカー遺伝子構成体の例は、プラスミド類、 pRSVneo、pSV2neo、pRSVgpt、pSV2ptであり、それらの構成は、“クローニングベクター”のような関連書籍において調べることができる。）個別のプラスミドを使用する場合は、これらの細胞は、両方のプラスミドで同時にトランスフェクションされ、かつ該マーカーに選択される。互いに物理的に連結されていない DNA-セグメントに位置した２種の遺伝子の同時の形質転換は、しばしば両方の同時形質転換された遺伝子の発現をもたらすことは公知であるので（Winnackerの論文(1985)）、選択マーカーの存在は、この細胞が、リポーター遺伝子構成も有しているという結論につながる。本試験方法で使用される測定配置については、好ましくは該センサ-DNAの構成を変化すること、例えばプロモーター配置の構造的変化によって、測定シグナルの最大変化値及び正常値の間の比を最適化することが望ましい。バックグラウンドシグナルは、該リポーター遺伝子発現の誘導を高感度で検出するのに十分な程度低いが、負の対照について検出限界を決定することができるのに十分な程度高いことが好ましい。該受容体DNA構成は、この１種又は複数の受容体配列が、好ましくは強力な構造的プロモーターの制御下にあること以外は、前記センサーDNA構成と基本的に同一の考察を行う。この受容体DNAは、分子生物学の通常の方法、例えば、IL-5 受容体を発現する細胞から、RNA調製物由来のcDNAを調製し、逆転写PCRを行い、このプライマーを公表された１種又は複数の配列を基に構成し、かつこれを適当なベクターにクローニングすることで入手することができる。このcDNAは、PCR を用いてcDNAライブラリーから増幅することもできる。この受容体DNAの場合、該受容体サブユニット及び有力な選択マーカーをコードしている配列を、該細胞を同時に形質転換するような、個別のプラスミド上に見出すこともできる。この細胞のセンサー又は受容体DNAによるトランスフェクションは、通常のトランスフェクション法を用いて行われ（例えば、Potterらの論文(1984);Felgner らの論文(1987)参照）、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法又はリポフェクション（lipofection）法が好ましい。試験物質のIL-5受容体に対する選択性を試験するために、様々な他の受容体のための試験細胞、更に対照試験のための細胞を調製し、該物質で処理する。物質がIL-5受容体のみに特異的に影響を及ぼすならば、医薬の特異性として一般的であるように、該物質はこの受容体のみを変調しなければならない。対照細胞においては、原則的にこの対照受容体は、内在的に生じるか、もしくはこの細胞の中に形質転換されたかのいずれかである。IL-5受容体試験細胞のために使用されたセンサーDNAも、アゴニスト、例えばIL-5によるこの受容体の刺激によって定量的に誘導される場合、このIL-5受容体試験細胞は、この対照受容体をコードしている配列が、内在的に存在するか、もしくはこの細胞の中に追加的に形質転換されたものであっても、対照細胞として適している。（対照受容体という用語は、同じくIL-5受容体と共通のβ−サブユニットを有するような受容体、例えばIL-3受容体を含む。）更にこの場合、このセンサーDNA及び該対照受容体を含むが、IL-5受容体を含まないような細胞を、対照細胞として使用することが可能である。一方、IL-5受容体試験細胞に使用されるセンサーDNAが、該対照受容体の刺激によって誘導されない場合は、適したセンサーDNAを経験的に決定し、所定の細胞システム中での該受容体遺伝子の誘導性の感度検出に関するそれらの適合性を予備試験で調べた、文献で公知のエレメントから始める（例えば、Montminyらの論文(1990);Deutschらの論文(1988)参照）。その後このセンサー DNAを、該対照受容体をコードしている配列が内在性に存在しない場合はこれと共に、該細胞中に形質転換する。インターロイキン-5受容体を介したシグナル伝達経路に対する該物質の変調作用の選択性は、対照受容体を発現し、かつその調節配列がインターロイキン-5受容体のみでなく該対照受容体の活性化にも応答するようなセンサーDNAで形質転換された、対照細胞に、これを同一の条件下で晒し、かつインターロイキン-5受容体を発現する細胞のリポーター遺伝子生成物の濃度と、対照細胞のそれとを比較することで、試験されることが好ましい。該細胞の受容体DNAによる形質転換後に、この正のクローンは、該受容体の発現のレベルに関して、例えば公知の放射能標識されたアゴニスト及びアンタゴニストを使用する結合アッセイを用いて調べる。受容体の数は、スキャチャードブロット（ヒト薬理学(Human Pharmacology)(1 991)）を用い、細胞当たりの分子数で、決定することができる。できる限り生理的受容体濃度と一致している受容体数のクローンが、受容体DN Aを含む安定な形質転換細胞から選択されることが、好ましい。（この受容体数が非常に高い場合は、不完全又はおそらく非特異的な結合が生じるか、もしくは更に特異的結合、非特異的結合が生じ、その結果おそらく他のエフェクターシステムを活性化するであろう。該受容体数が非常に低い場合には、このシグナルは、測定によって検出されるには低すぎる。） “変調”作用は、IL-5受容体を介したシグナル伝達経路への、作動性又は拮抗性の作用を意味する。本試験方法において、リポーター遺伝子のIL-5を介した発現に対し阻害作用を示す物質は、それらがIL-5依存型細胞増殖を阻害するかどうかを調べる連続工程で試験することができる。この種の方法において、細胞の増殖に対する該物質の阻害作用は、他の増殖因子の受容体に加え、機能的IL-5受容体を発現し、かつその増殖を、IL-5のようなこれらの受容体の少なくとも１種のリガンドの、IL-5の存在に依存するような細胞を採取し、これらの細胞を、IL-5のみを加えてインキュベートし、並びに別の混合物をIL-5及び該試験物質と共にインキュベートし、かつこれら２種の混合物の増殖を測定することによって決定される。このような増殖アッセイの方法には広範な多様性があり；これらは、例えば、 96-ウェル微量滴定プレートで行うことができ、かつ容易に自動化することができる。このようなアッセイの例は、［³H］-チミジン又はブロモデオキシウリジン（BrdUrd）取込みの測定を基本にしたものである（例えば、蛍光標識された抗 BrdUrd抗体の結合による、BrdUrdの取込みの測定）。別の種類の増殖アッセイは、細胞酵素を用い、適当な基質の反応によって形成された色素の測定を基本にしたものである。この原理をもとに開発された方法の１種は、市販されているテトラゾリウム塩法（MTT法）であり、これはデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩の反応によって生成された色素ホルマザンの濃度を、分光光度で測定するものである。この増殖アッセイに適している細胞の例は、IL-5依存型造血細胞、例えばKita muraらの論文（1989及び1991）に記載された、細胞株TF-1の細胞である。本発明の方法を用いてその医薬活性の可能性を試験される物質は、天然又は合成の物質で、純物質又は物質の混合物（例えば、植物の抽出物、発酵酒など）のいずれかを使用することができる。純物質の中では、低分子量の合成有機化合物が特に興味深い。スクリーニングによって検出される物質は、主に受容体のリガンド結合サイトに結合する物質、アロステリック活性物質及びリガンド結合サイトに関して非競合的に作用する物質である。これらの物質は、ペプチド性又は非ペプチド性の性質である。好ましくは、これらの物質は、最も広範な可能性のある濃度範囲を得るために、順次希釈して該細胞に適用する。インキュベーション時間は、実験的に決定し、例えば、所定の試験細胞を公知の受容体アゴニストで処理し、リポーター遺伝子発現の誘導が再現性をもって測定できるような時間を測定する。インキュベーション時間は、一般に、この時間に設定し、かつ一般に短くとも１時間である。細胞数は、主に測定シグナルの検出限界、及び該細胞が到達している増殖段階によって決まり、一方でその下限は、試験ユニット全体に均一に細胞を分散する技術力によって制限される。96ウェルの微量滴定プレートを使用する場合は、細胞数は、例えば、１試験ユニットにつき約1000〜100,000細胞であろうが、この数は、測定シグナルが適当に感度が良く、かつ細胞が正確に分散可能な場合には、これよりも小さくとも良い。使用された細胞の増殖段階は、出発細胞の細胞種に特異的な特性によって決まり、かつ更に当該の受容体によって主に決定される（異なる受容体において、同じエフェクターシステムを、異なるように、もしくは増殖段階によって左右される異なる強度まで、活性化することができる。）；従って、細胞の増殖段階及び細胞数も、予備試験において、様々な増殖段階での前試験及び試験細胞における、該リポーター遺伝子の発現の反応速度論を決定することによって、実験的に決定される。本発明の範囲において、IL-5受容体を発現し、かつセンサ-DNAで形質転換されている細胞が、該リポーター遺伝子の発現を誘導することによって、追加のIL-5 、IL-5受容体の天然のリガンドと、応答することが示されている。（我々は、一方で、機能的IL-5受容体に必要な、２種のユニットを天然に発現するヒトの細胞に加え、天然にβ−サブユニットを発現し、かつ更にα−サブユニットで形質転換されたマウス細胞を試験した。）使用したセンサ-DNAは、調節エレメントとして、特にTRE-エレメントを含むヒトICAM-1-遺伝子の1.3kbの5'-調節領域、もしくは特にTRE、CRE及びSREを含むヒトc-fos-遺伝子の0.756kbの5'-調節領域のいずれかを含んでいる。内在性IL-3及びGM-CSF受容体を含むこれらの細胞が、IL-3又はGM-CSFによって刺激された場合には、リポーター遺伝子発現の誘導を、再び測定した。IL-5受容体のα−サブユニット（受容体へのリガンドの結合を仲介している）の欠如の点を除き、前述の使用された細胞と同一の対照細胞において、同じく該リポーター遺伝子の発現は、IL-3又はGM-CSFによる処理によって誘導されたが、IL-5によってはされなかった。本発明は、細胞において、IL-5受容体に依存して、特異的に１種以上のシグナル伝達経路に影響を及ぼす物質を検出する感度が良くかつ万能の方法を提供する。本発明の方法によって検出された物質は、IL-5受容体、又はそれらに連関したシグナル伝達経路の機能不全に関連した疾患を治療するための医薬品の開発のガイド物質として作用し、かつそれに続く第二のスクリーニング、例えば細胞株を用いる増殖アッセイにおけるアンタゴニストに関して、もしくは一次細胞及びその後の動物実験において、それらの医薬特性を更に詳細に、調べることができる。その結果、必要な動物の数は、本発明の方法を採用することによって、かなり減少するであろう。更に本発明の方法は、自動化できるという利点があり、これは、細胞培養容器、例えば96ウェル微量滴定プレートの装填、試験物質溶液の充填、インキュベーション及び洗浄工程、並びに例えばリポーター遺伝子生成物がルシフェラーゼである場合は発光測定器を用いるような測定を、ロボットによって実行することができる。従って本発明の方法は、例えば１週間に約2000の物質又は物質混合物を試験するような、高い処理量能力を伴うスクリーニングプログラムに適している。本発明の方法を用いて、アロステリック活性物質、及びリガンド結合サイトに関して非競合的に作用する物質を検出することが可能である。更に本発明の方法は、薬理学的又は生化学的に特徴づけられ、かつリガンドとして公知であるような受容体をクローン化することを可能にする。使用された出発材料は、cDNA又はゲノムバンクであり、これらから、プールされたものは、対応する細胞株へと形質転換される。該受容体の発現は、受容体がリガンド結合によって活性化された後の、リポーター遺伝子の発現によって示される。図面の概要図１：ICAM-1遺伝子のプロモーター領域を含む、センサーDNAプラスミド pBHlu c1.3。図２：c-fos-遺伝子のプロモーター領域を含む、センサーDNAプラスミド pBHfo sluci。図３：1H3-細胞における受容体刺激による、pBHluc1.3及びpBHfosluciの誘導。図４：マウスFDC-P1-細胞における受容体刺激による、pBHluc1.3の誘導。図５：ヒトTF-1-細胞における受容体刺激による、pBHluc1.3の誘導。図６：受容体刺激によるTF-1-細胞の増殖の誘導。実施例１第二メッセンジャー物質（センサーDNA）によって調節可能なエレメントによるリポータープラスミドの調製 a）プラスミドpBHluc1.3の構築細胞間接着分子ICAM-1のヒト遺伝子の5'-フランキング領域の1.3kbのクローニング及び欠失の解析は、この断片が、i）肺の腺癌細胞株A549（ATCC CCL 185）によって誘導することができ、かつii）DNA配列TGATTCAを有するTPA応答エレメント（TRE）を含むことを示した（Vorabergerらの論文(1991)）。プラスミドpBH luc1.3（図１）は、ICAM-1遺伝子の1.3kb長の調節領域を含み、これはルシフェラーゼ遺伝子上流に位置している。この調製は、Vorabergerらの論文（1991）に記載されている。 b）プラスミドpBHfosluciの構築プラスミドpBHfosluciは、様々な調節エレメント、例えばTRE、CRE及びSREを含む、ヒトc-fos遺伝子プロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。c-fosプロモーターを含む断片（-711位〜+45位）を、プラスミドpfosCAT（Sch oenthalらの論文(1988)）から単離し、ベクターpBluescriptSK（ストラタジーン社(Stratagene)）中で媒介的にクローン化し、かつルシフェラーゼ遺伝子上流に、構成体pBHluc（Vorabergerらの論文(1991)）を挿入した。プラスミドpfosCAT（Schonthalらの論文(1988)）を、XbaI及びHindIIIで切断した。c-fosプロモーターを含む756bpの断片を単離し、ベクターpBluescriptSK と結合させ、XbaI及びHindIIIで切断した。E.coli形質転換後に得られたプラスミドを、pBSfosと称する。このプラスミドpBSfosを、XbaIで切断し、該プラスミドのDNA-末端を、クレノウ酵素及び４種のdNTP総てを添加することによって、“ 平滑末端”とし、最後にSalIで切断した。c-fosプロモーターを含む、このSalI ／平滑フラグメントを、単離した。プラスミドpBHluc（Vorabergerらの論文(199 1)）を、HindIIIで切断し、このDNA-末端を“平滑末端”とし、SalIで切断した。この方法で切断されたベクターを、前述のc-fosプロモーターを含むSalI／平滑断片と結合した。E.coli形質転換後に得られたプラスミドを、pBSfosluciと称する（図２）。実施例２センサーDNAの受容体を介した誘導 IL-5受容体を発現する細胞内で、作動性活性物質で該受容体を刺激した後に、センサーDNAが誘導されることを示すために、マウス及びヒトの細胞株由来の細胞を、センサ-DNA（pBHluc1.3又はpBHfosluci）に、一過性にトランスフェクションした。マウス1H3-細胞は、マウスの骨髄細胞から樹立された因子依存型細胞株である、FDC-P1-細胞（Dexterらの論文(1980)）から、下記のマウスのIL-5受容体のα −サブユニットを形質転換することで調製した：マウスのIL-5受容体をコードしているcDNA（Takakiらの論文(1990)）は、細胞株BCLIから調製されたRNAを用い、逆転写PCR反応で合成し（Frohmanらの論文(1988)）、5B1b（ATCC TIB 197）でクローン化した。この目的で使用されたプライマーは、MF71（SEQ ID N 0:1）（ 5'TCGGCTACCATGGTGCCTGTG3'）及びMF73（SEQ ID N 0:2）（5'ATGGCAAAATGCCATCA AAACGTG3’）であり；これらは、該受容体のα−サブユニットのコード領域をフランキングしている（Takakiらの論文(1990)）。（配列表において、この合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、“cDNS”とする。）1272bpのPCR生成物は、プラスミドpUC19（ファルマシア社）のSmaI切断サイトにサブクローニングした。このコード配列を、BamHI及びEcoRIで切断し、発現プラスミドpcDNA1（インビトロゲン(Invitrogen)社）に挿入し、同じ酵素類で切断した。線状化したこのプラスミド25μgを、４×10⁷FCS-P1-細胞に、電気穿孔法（300V、960μF、バイオラドジーンパルサー）で、トランスフェクションした。IL-5受容体発現細胞は、マウスのIL-5を添加したRPMI-1640-培地で選別した。その結果、IL-5受容体β−サブユニットのみを発現するFCS-P1-細胞とは異なる1H3-細胞は、機能的IL-5受容体（α−とβ−サブユニット両方）を発現した。1H3-細胞及びFDC-P1-細胞は、内因性のIL-3及びGM-CSF受容体を有する。IL-5、IL-3及びGM-CSF受容体のβ−サブユニットは、同一である。ヒト細胞株TF-1は、Kitamuraらの論文（1989）に記載された方法で、赤白血病患者の骨髄細胞から樹立された。この細胞は、IL-5、IL-3及びGM-CSFの機能的受容体を発現し、かつそれらの増殖は、３種の造血促進因子の少なくとも１種が存在することによって左右される（Kitamuraらの論文（1989,1991））。 1H3-細胞及びTF-1-細胞を、センサーDNAでトランスフェクションした１日後に、これらの細胞を因子を含まない培地で12時間培養し、その後受容体に特異的リガンドIL-5で処理した。1H3-細胞の負の対照として、機能的IL-5受容体を発現しないマウスのFDC-P1-細胞で、同じ実験を行った。別の対照実験として、1H3-、F DC-P1-FT-1-細胞を、IL-5の代わりに、IL-3又はGM-CSFで処理した。 a）1H3-細胞における受容体刺激による、pBHluc1.3及びpBHfosluciの誘導機能的IL-5受容体を発現する細胞株1H3を、10％の熱処理して不活性化したウシ胎仔血清（FCS）及び１％のマウス緊張性（tonicity）補剤（1M NaCl、0.1Mピルビン酸ナトリウム、11.3Mモノチオグリセロール）を含むRPMI 1640培地（ギブコ社）に、IL-5（組換えIL-5）約500ユニット/mlを添加し、37℃、５％CO₂下で培養した。１回のトランスフェクションにつき約３×10⁷細胞を、1000rpmで５分間遠心分離し、全ての添加剤を加えた培地200μl中に再懸濁した。細胞10⁷につきプラスミド-DNAを15μg加えた後、完全培地を加えてその体積を400μlとした。この細胞を、バイオラドジーンパルサー（登録商標）を用い、電気パルス300V 、960μFで、電気穿孔法を行うことによって、トランスフェクションし、その後追加したIL-5を含有する新鮮な完全培地で、37℃で一晩インキュベートした。翌日、この細胞を、1000rpmで５分間遠心分離し、IL-5を含まない完全培地で、２回洗浄した。これらの細胞は、IL-5を含まない完全培地中に再懸濁し、更に一晩インキュベートした。誘導のために、これらの細胞を再度遠心分離し、因子を含まない培地60mlに再懸濁し、３本の組織培養フラスコに均等に分配した。１本のフラスコの細胞は、誘導せず、因子を含まない培地中に、ルシフェラーゼアッセイ時まで保存する（負の対照）一方、他の２本は、1000ユニット/mlのIL- 5又はIL-3と混合した。37℃で８時間インキュベートした後、この細胞を遠心分離し、PBSで洗浄し、500μlの溶菌／アッセイバッファー（25mMトリシン、0.5mM EDTA、0.54mMトリポリリン酸ナトリウム、6.5mM DTT、16.3mM MgSO₄・7H₂O、0. 1％トリトンX-100、1.2mM ATP、0.05mMルシフェリン；pH7.8）に加えた。これらの溶液の400μlに、ルシフェリン20μl（1mM）を加え、発光測定器ルマット9501 （ベルソールド社）で測定した。この実験結果は、図３に示しているが、これは両方のセンサー構成体、pBHluc1.3及びpBHfosluciが、IL-5によって、10倍以上誘導されたことを示している。同様に、IL-3による細胞の刺激も、内在性IL-3受容体を介し、両方のセンサー構成体の誘導をもたらした。 b）FDC-P1-細胞における受容体刺激による、pBHluc1.3の誘導細胞株FDC-P1（Dexterらの論文（1980））を、a）の1H3細胞に記載したものと同じ添加剤を含み、IL-5の代わりにIL-3を約500ユニット/ml含む、RPMI 1640培地（ギブコ社）で培養した。約4×10⁷細胞を、a）に記載した方法で、細胞10⁷につきpBHluc1.3-DNAを15μgで、電気穿孔法を行うことによって、トランスフェクションし、インキュベートし、IL-3を含まない培地中に保存した。これらの細胞を、更に４本の組織培養フラスコに分配した。１本のフラスコの細胞は、因子を含まない培地中に、ルシフェラーゼアッセイ時まで保存する（負の対照）一方、他の３本は、約1000ユニット/mlのIL-5、IL-3又はGM-CSFで処理した。８時間インキュベートした後、a）に記載した方法で、ルシフェラーゼアッセイを行った。この実験結果は、図４に示した。IL-5受容体のβ−サブユニットのみを発現し、リガンド結合α−サブユニットを欠くような、FDC-P1-細胞においては、センサーDNA pBHluc1.3は、IL-5によって誘導されなかった。これと対照的に、IL-3 又はGM-CSF処理細胞は、1H3細胞に存在する内在性のIL-3及びGM-CSF受容体を刺激することによって、該センサーDNAの誘導をもたらした。 c）TF-1-細胞における受容体刺激による、pBHfosluciの誘導細胞株TF-1を、10％の熱処理して不活性化したウシ胎仔血清（FCS）を含むRPM I1640培地（ギブコ社）に、IL-3 1ng/mlを添加し、37℃、５％CO₂下で培養した。１回のトランスフェクションにつき約３×10⁷細胞を、1000rpmで５分間遠心分離し、全ての添加剤を加えた培地200μl中に再懸濁した。細胞10⁷につきプラスミド-DNAを15μg加えた後、完全培地を加えてその体積を400μlとした。この細胞を、バイオラドジーンパルサー（登録商標）を用い、電気パルス280V、980μF で、電気穿孔法を行い、トランスフェクションし、その後追加したIL-3を含有する新鮮な完全培地中で、37℃で一晩インキュベートした。翌日、この細胞を、10 00rpmで５分間遠心分離し、IL-3を含まない完全培地で、２回洗浄した。これらの細胞は、因子を含まない完全培地中に再懸濁し、更に一晩インキュベートした。誘導のために、これらの細胞を再度遠心分離し、因子を含まない培地60mlに、再懸濁し、更に４本の組織培養フラスコに分配した。１本のフラスコ中の細胞は、誘導せず、因子を含まない培地中に、ルシフェラーゼアッセイ時まで保存する（負の対照）一方、他の３本は、IL-5 10ng/ml又はIL-3 1ng/ml又はGM-CSF100ng /mlと結合した。37℃で８時間インキュベートした後、これらの細胞を遠心分離し、PBSで洗浄し、500μlの溶菌／アッセイバッファー（25mMトリシン、0.5mM E DTA、0.54mMトリポリリン酸ナトリウム、6.5mM DTT、16.3mM MgSO₄・7H₂O、0.1 ％トリトンX-100、1.2mM ATP、0.05mMルシフェリン；pH7.8）に加えた。これらの溶液400μlに、ルシフェリン20μl（1mM）を加え、発光測定器ルマット9501（ベルソールド社）で測定した。この実験結果は、図５に示しているが、これはセンサー構成体pBHfosluciが、IL-5によって、同じくIL-3及びGM-CSFによっても、誘導されたことを示している。 d）受容体刺激によるTF-1細胞増殖の誘導 IL-5受容体を発現するTF-1細胞が、作動性の活性物質による受容体刺激後に増殖することを示すために、この細胞を、96ウェル微量滴定プレートに植え付けた。２個のプレートは、１個のウェル当たり、２％FCSを含むRPMI 1640培地100μl 中に、約３×10³細胞になるように植え付けた。各プレート毎に、３バッチは、I L-5を加えずにインキュベートし（負の対照）、かつ３バッチに、ヒトの組換え IL-5を、それぞれ0.001％、0.01％及び0.1％混合した。第一のプレートの各ウェルに、48時間インキュベートした後に、［6-³H］チミジン（アメルシャム社）１ μCiを添加し、第二のプレートに、37℃で72時間インキュベートした後に加え、これらのプレートは、その後更に12時間インキュベーションを継続した。その後、パッカードフィルターメイト細胞収集器及びトップカウント微量滴定シンチレーションカウンターを用いて、チミジンの取り込みを測定するまで、これらのプレートは-20℃で保存した。得られた結果は図６に示した。最も高濃度のIL-5（0 .1％）で、48時間のインキュベーション後に、チミジンの取り込み値は、IL-5を含まない培地における対照細胞の値に比べ、8.1倍に達し、72時間後8.7倍に達した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/15 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ヤングイアンジーオーストラリアオーストラリアンキャピタルテリトリー 2614 ホーカーフロリナプレイス 12

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト又は動物の細胞における受容体を介したシグナル伝達経路に対する、物質の変調作用を測定する方法で、インターロイキン-5受容体の活性化によって誘発される該シグナル伝達経路の成分に対する、該物質の変調作用が、下記の哺乳類の細胞： a）リポーター遺伝子、及びインターロイキン-5受容体に連関したシグナル伝達経路の１種以上の第二メッセンジャー物質の濃度変化に応答するような調節配列を含む、組換えDNAで形質転換され、その結果該リポーター遺伝子の発現が、該メッセンジャー物質の濃度変化によって変調され；かつ更にを、調べるべき物質と共にインキュベーションし b）調べるべき物質によって、機能的インターロイキン-5受容体を発現する細胞、かつ該リポーター遺伝子生成物の濃度を測定し、更に該試験物質に検出された活性が、インターロイキン-5受容体を介したシグナル伝達経路に対し選択的であるかどうかを調べることによって、測定されることを特徴とする方法。２．前記試験物質が、更に該細胞をインターロイキン-5に晒すことによって、そのインターロイキン-5受容体を介したシグナル伝達経路に対する拮抗性の作用について調べられることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。３．前記機能的インターロイキン-5受容体を天然に発現する細胞類が使用されることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。４．前記インターロイキン-5受容体のβ−サブユニットのみを天然に発現し、かつ該インターロイキン-5受容体のα−サブユニットをコードしている配列を含む、組換えDNAで形質転換された細胞類が、使用され、その結果該細胞は機能的インターロイキン-5受容体を発現することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。５．前記インターロイキン-5受容体のα−サブユニットをコードしている配列、並びにβ−サブユニットをコードしている配列を含む、組換えDNAで形質転換された細胞類が、使用され、その結果それらが機能的インターロイキン-5受容体を発現することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。６．前記α−サブユニットをコードしているDNA配列、並びにβ−サブユニットをコードしているそれらは、２種の個別のプラスミドに出現することを特徴とする、請求の範囲第５項記載の方法。７．前記細胞が、ヒトの機能的インターロイキン-5受容体を発現することを特徴とする、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。８．前記細胞が、マウスの機能的インターロイキン-5受容体を発現することを特徴とする、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。９．前記細胞が、異なる種由来のα−サブユニット及びβ−サブユニットの、機能的インターロイキン-5受容体を発現することを特徴とする、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。 10．前記α−サブユニットがヒト由来であることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の方法。 11．前述のa）で定義された組換えDNAが、調節配列として、c-fos-遺伝子プロモーターを含むことを特徴とする、請求の範囲第１〜10項のいずれか１項に記載の方法。 12．前述のa）で定義された組換えDNAが、調節配列として、ICAM-1-遺伝子プロモーターを含むことを、特徴とする請求の範囲第１〜10項のいずれか１項に記載の方法。 13．前述のa）で定義された組換えDNAが、リポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする、請求の範囲第11又は12項に記載の方法。 14．前記試験物質が、同様に機能的インターロイキン-5受容体に加え、他の増殖因子の受容体を発現し、かつ少なくともこれらの受容体の１種に対するリガンドの存在によってそれらの増殖が左右されるような細胞を、一方はインターロイキン-5だけを加え、他方は試験物質を伴うインターロイキン-5と共にインキュベートし、かつこれら２種の細胞培養の増殖を比較することによって、その拮抗活性について調べられることを特徴とする、請求の範囲第２〜13項のいずれか１項に記載の方法。 15．前記物質の、インターロイキン-5受容体を介したシグナル伝達経路に対する変調作用の選択性を、同じくインターロイキン-5受容体以外の対照受容体を発現し、かつ前述のa）で定義された、その調節配列が同様に、対照受容体に連関したシグナル伝達経路の第二メッセンジャー物質の濃度変化に応答するような、組換えDNAで、形質転換されたような哺乳類対照細胞に、該物質を、同一条件下で晒し、かつ該インターロイキン-5受容体を発現する細胞のリポーター遺伝子生成物の濃度を、対照細胞のそれと比較することによって、試験することを特徴とする、請求の範囲第１〜13項のいずれか１項に記載の方法。 16．前記対照受容体が、インターロイキン-3受容体であることを特徴とする、請求の範囲第15項記載の方法。 17．更に、前述のa）で定義された組換えDNAで形質転換され、かつ機能的インターロイキン-5受容体を発現しない哺乳類細胞を、調べるべき物質と、同一条件下でインキュベートし、該リポーター遺伝子生成物の濃度を測定することを特徴とする、請求の範囲第１〜13項のいずれか１項に記載の方法。 18．前記試験物質が、あらかじめ定められた数の哺乳類細胞と共に、所定の条件下でインキュベートされるような、いくつかの物質の中の１種であり、該リポーター遺伝子生成物濃度が測定され、かつインターロイキン-5受容体依存性シグナル伝達経路に対する該物質の選択性を調べるような、スクリーニングアッセイとして使用されることを特徴とする、請求の範囲第１〜17項のいずれか１項に記載の方法。 19．a）リポーター遺伝子、及びインターロイキン-5受容体に連関されたシグナル伝達経路の１種以上の第二メッセンジャー物質の濃度変化に応答するような調節配列を含む、組換えDNAで形質転換され、並びにb）インターロイキン-5受容体のα−サブユニット、又はα−及びβ−サブユニットをコードしている組換えDN Aで形質転換され、その結果これらが機能的インターロイキン-5受容体を発現することを特徴とする、哺乳類細胞。 20．前述のものが、ヒトの細胞であることを特徴とする、請求の範囲第19項記載の哺乳類細胞。 21．前述のものが、マウスの細胞であることを特徴とする、請求の範囲第19項記載の哺乳類細胞。 22．前述のものが、天然にインターロイキン-5受容体のβ−サブユニットのみを発現し、かつα−サブユニットをコードしている配列を含む組換えDNAで形質転換されることを特徴とする、請求の範囲第19〜21項のいずれか１項に記載の哺乳類細胞。 23．前記α−サブユニットが、他の種由来のものであることを特徴とする、請求の範囲第22項記載の哺乳類細胞。 24．前述のものが、ヒトのα−サブユニットをコードしている配列を含む組換え DNAで形質転換されることを特徴とする、請求の範囲第22項に記載のヒトの細胞。 25．前述のものが、マウスのα−サブユニットをコードしている配列を含む組換えDNAで形質転換されることを特徴とする、請求の範囲第22項に記載のマウスの細胞。 26．前述のa）で定義された組換えDNAが、調節配列として、c-fos-遺伝子プロモーターを含むことを特徴とする、請求の範囲第19〜25項のいずれか１項に記載の哺乳類細胞。 27．前述のa）で定義された組換えDNAが、調節配列として、ICAM-1-遺伝子プロモーターを含むことを特徴とする、請求の範囲第19〜25項のいずれか１項に記載の哺乳類細胞。 28．前述のa）で定義された組換えDNAが、リポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする、請求の範囲第19〜27項のいずれか１項に記載の哺乳類細胞。