KR100318188B1 - 인터루킨-5-수용체-의존성세포시그날전달경로에대한조절효과를갖는물질을스크리닝하는방법 - Google Patents

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Abstract

포유동물 세포에서 인터루킨-5-수용체-의존성 시그날 전달 경로에 대한 조절 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법이 개시되어 있다. 시험 물질을 기능성 인터루킨-5-수용체를 발현하고 리포터 유전자, 및 그에 기능적으로 결합된, 인터루킨-5-수용체-의존성 시그날 전달 경로의 제 2 메신저 물질의 농도 변화에 민감한 조절 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환된 세포에 적용한다. 인터루킨-5-수용체-의존성 시그날 전달 경로에 특이적이고 잠재적인 약물학적 효과를 갖는 물질은 이 방법에 의해 확인될 수 있다.

Description

인터루킨-5-수용체 의존성 세포 시그날 전달 경로에 대한 조절 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법
본 발명은 사람 또는 동물 세포에서 인터루킨-5-수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 물질의 조절 효과를 측정함으로써 약물학적으로 활성인 물질을 발견하는 방법에 관한 것이다.
물질을 수용체에 결합된 리간드를 어느 정도로 치환할 수 있는지에 대해 조사하고 약물학적으로 활성인 물질을 발견하기 위해 사용되는 통상의 소위 "방사성리간드(radioligand) 시험" 은 공지된 리간드 수용체 결합 부위의 결합에 영향을 주는 물질을 확인하는데만 사용될 수 있다. 이들 시험은 결합 물질이 아고니스트 활성 또는 길항 활성을 갖는지 여부를 말해줄 수 없다.
고등 진핵 세포의 투과막 시그날 전달 시스템은 자주 하기 막-결합 성분으로 구성되어 있다:
a) 임의로 다수의 서브유니트(subunit) 로 구성될 수 있는 세포 표면 수용체; 임의로
b) G-단백질로서 언급되고 수용체 및 그의 효과인자(effector) 둘 모두에 커플링될 수 있는 구아닌-뉴클레오타이드 결합 및 GTP 절단 조절 단백질;
c) cAMP, DAG, IP3등과 같은 제 2 메신저(messenger) 분자, 즉 이온채널 또는 아데닐레이트 사이클라제(cyclase), 구아닐레이트 사이클라제 또는 포스포리파제(phospholipase)의 농도 변화를 자주 유도하는 소위 "효과인자"; 및/또는 d) 다양한 키나제(kinase).
세포 표면 수용체는 복수의 세포외 자극으로부터 적절한 리간드를 인지한다. 수용체에 대한 리간드의 결합은 시그날 캐스케이드(cascade)를 활성화시킨다. G 단백질 커플링된 수용체의 경우, 이의 시그날 전달 경로는 비교적 잘 이해되고 매우 상이한 세포외 시그날의 활성을 매개하며, 이는 헤테로트라이머(heter-otrimer) G-단백질의 활성화로 개시된다.
저분자량 제 2 메신저, 예를 들어 아데닐레이트 사이클라제의 활성화에 의해 유발되는 cAMP(사이클릭 AMP), 구아닐레이트 사이클라제의 활성화에 의해 유발되는 cGMP(사이클릭 GMP), 또는 포스포리파제 C 또는 가수분해효소가 관여하는 경우 포스포리파제 D(Billah et al., 1989)와 같은 포스포리파제의 활성화에 의해 유발되는 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세린(DAG) 은 차례로 특정 유전자의 전사의 조절 및 증식에 영향을 주는 단백질 키나제(즉 IP3/DAG에 의한 PKC, cAMP 에 의한 PKA) 의 활성화에 의한 단백질의 선택적 인산화를 포함하여 세포내 변화를 초래한다(길항적으로 활성적인 물질은 아고니스트적으로 활성적인 물질에 의해 유발된 상호작용 및 제 2 메신저의 농도의 결과적인 변화를 전체 또는 부분적으로 제거할 수 있거나, 그 자체가 역기능 효과를 유도할 수 있다). 이 시그날 전달 시스템을 사용하여, 세포는 서로 소통할 수 있고 그들의 발생 또는 그들이 유발하는 활성을 조화시킬 수 있다.
단일 수용체 서브타입(subtype) (가능하게는 동일한 세포 또는 상이한 세포에서) 이 하나 이상의 효과인자에 커플링될 수 있고 다양한 수용체 서브타입은 동일한 효과인자를 활성화시킬 수 있으므로, 복잡한 시그날 전달 네트워크(network) 가 형성된다. 시그날 전달 캐스케이드에서 수용체의 활성화의 결과로서 활성화되는 전사인자 (예를 들어 CREB-단백질, AP1-단백질)는 조절 DNA 요소와 상호작용한다. 이의 예는 CRE(CRE-요소, "cAMP 반응 요소") 또는 TRE(TRE = "TPA 반응 요소"; TPA = 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 = 포르볼에스테르)이고, 이는 CREB 또는 AP1 에 결합한다: 전사가 cAMP 에 의해 조절되는 많은 유전자들(예: 래트 소마토스타틴, 사람-α-고나도트로핀, c-Fos) 은 조절 요소로서 5'-플랭킹(flanking) 영역에서 보존된 서열을 함유한다. CRE-서열은 회문형(palimdromic) 옥타머 TGACGTCA 와 동일하거나 유사하다(Montminy et al., 1990). TRE-요소는 매우 유사한 헵타머 모티프 TGAGTCA 를 함유하고, 이는 단일 뉴클레오타이드에서만 CRE-요소 콘센서스 (consensus) 서열과 상이하다(Deutsch et al., 1988). TRE-모티프, 또는 매우 유사한 모티프는 전사가 포르볼에스테르에 의해 활성화되는 많은 유전자에서 확인되었다(Angel et al., 1987a 및 b; Lee et al., 1987). 주위 DNA 서열, 또는 다른 인자와의 단백질-단백질 상호작용은 그중에서도 특정한 유전자에서 구체적인 조절 현상을 결정한다.
다른 조절 DNA-요소는 혈청 인자에 반응하는 소위 "SRE-요소"("혈청 반응 요소"; Treisman, 1985) 이다. SRE-요소는 2 대칭 구조를 갖는 20 염기쌍으로 구성된유도가능한 시스-요소이다. SRE-요소는 다양한 성장 인자에 반응한다; SRE 는 다양한 사이토카인에 의한 c-fos 유도에 대한 중요한 표적이라고 최근에 보고되었다 (Hatakeyama et al., 1989). 글루코코르티코이드의 농도 변화에 반응하는 모티프는 "GRE-요소" 로서 언급된다(Yamamoto, 1985; Scheidereit et al., 1986; Jantzen et al., 1987; Striihle et al., 1987).
시그날 전달 경로의 네트워크의 복잡성의 결과로서, 시그날 전달 경로, 즉 아데닐레이트 사이클라제 및 포스포리파제 C 시그날 전달 경로 사이의 소위 "크로스토크(crosstalk)" 가 존재할 수 있다. 용어 "크로스토크" 는 한 효과인자 시스템의 영향이 다른 시스템에 영향을 주는 현상을 의미한다(Sassone-Corsi et al., 1990; Houslay, 1991). 크로스토크의 현상은 풍부한 시그날을 생성시키거나 다양한 시그날 전달 경로의 소통을 확실하게 하기 위하여 시그날의 통합 또는 결합에 생리적으로 사용된다. 크로스토크는 시그날 전달 경로의 다양한 수준에서 발생할 수 있다. 세포에 대한 병리학적 변화의 한 가지 가능한 원인은 이들 상호작용의 파괴, 즉 특정 수용체가 더 이상 효과인자 시스템과 생리학적인 의미에서 정확하게 상호작용하지 않게 되는 경우이다.
G-단백질에 커플링되지 않는 수용체는 사이토카인 수용체를 포함한다. 이들은 상이한 수용체에 대해 중복되는 많은 시그날 전달 경로에 커플링되는 것으로 추정되므로, 세포 내에는 다중 크로스토크가 존재한다.
사이토카인은 바이러스 감염과의 대항(인터페론) 및 조혈("콜로니 자극인자" , CSF) 에서 면역 및 염증 반응의 조화에서 중요한 역할을 한다. 그들은 조혈, 림프 또는 다른 기관 시스템 내에서의 많은 세포의 증식, 분화 및 기능을 조절한다. 각각의 개별적인 사이토카인은 다양한 세포 타입에 대해 그의 효과를 나타내고, 개별적인 세포는 자주 복수의 사이토카인과 반응하므로, 사이토카인 생성-세포 및 사이토카인에 의해 조절되는 세포는 사이토카인이 상승적이거나 반대로 작용하는 복잡한 세포내 네트워크를 형성한다. 사이토카인의 생물학적 활성의 스펙트럼을 그중에서도 특히 사이토카인에 대한 특이적 수용체를 발현하는 상이한 세포 타입의 수에 의해 결정한다.
인터루킨-3(IL-3) 및 과립구-마크로파지(macrophage)-콜로니-자극-인자(GM-CSF) 는 전체 범위의 조혈 계통에 대한 다중의 강력한 조혈세포 및 전구체 세포를 자극하는 다형질발현 인자의 예이다. 다른 한편 인터루킨-5(IL-5) 는 매우 협소한 활성 범위를 갖고 호산성 전구 세포에 대해 우세하게 작용한다(Miyajima et al., 1992).
그들의 단백질 구조의 분석은 모든 사이토카인 수용체가 세포외 N-말단영역, 단일 투과막 영역 및 세포질 영역으로 구성된 막-결합 당단백질임을 보여준다. 사이토카인 수용체가 동일한 전구체 유전자로부터 유래된 멤버인 많은 수용체 유전자 훼밀리에 속할 수 있음에 따라 세포외 영역은 많은 공통적인 구조적 성분을 갖는다 (Gillis, 1991). IL-5-수용체 유전자는 헤마토포에틴(haemat-opoetin)-수용체 유전자 부류에 속한다. 이러한 훼밀리의 멤버는 세포외 영역에서 개별적으로 또는 다중 카피로 발생하는 특징적으로 보존된 시스테인 그룹을 함유한다. 그들은 또한 트립토판-세린-X-트립토판-세린 모티프(여기에서 X 는 임의의 아미노산일 수 있다)를함유하고, 이는 투과막 영역에 밀접한 세포외 영역에 자주 위치한다.
결국, 이 훼밀리의 수용체는 전체 세포외 영역 상에 산재된 개별적 또는 다중 카피의 피브로넥틴 타입 3 결합 모티프를 갖는다(Gillis, 1991).
IL-5-수용체(서브유니트 둘 모두)와 달리, IL-3, IL-6 및 GM-CSF 에 대한 수용체의 서브유니트 둘 모두, IL-4, IL-7, 에리트로포에틴(erythropoetin) (EPO) 및 "백혈병 억제 인자"(LIF)-수용체, IL-2 수용체의 β-서브유니트 및 성장 호르몬 (GH) 에 대한 수용체, 프로락틴 및 G-CSF 는 또한 헤마토포에틴 수용체 부류에 속한다. IL-5-수용체는 특이적인 사이토카인 결합 부위를 함유하는 α-서브유니트, 및 IL-5 에 대한 고친화성의 수용체를 형성하고 시그날 전달에 필요한 β-서브 유니트로 구성된다. 사람(Tavernier et al., 1991) 및 뮤린(Takaki et al., 1990) α-서브유니트를 암호화하는 DNA, 및 IL-5 수용체의 사람(Tavernier et al., 1991) 및 뮤린(Devos et al., 1991; Takaki et al., 1991) β-서브유니트를 클로닝하였다. IL-5, IL-3 및 GM-CSF 에 대한 수용체는 동일한 β-서브유니트를 갖는다(Kitamura et al., 1991; Tavernier et al., 1991). 3 개의 수용체 중 하나 이상이 세포 상에서 발현될 경우, 따라서 수용체 수준에서 사이토카인 사이의 "크로스토크"가 존재할 수 있다.
EGF 또는 PDGF 와 같은 성장 인자에 대한 수용체와 달리 사이토카인 수용체의 서브유니트는 어떠한 고유의 티로신 키나제 활성도 함유하지 않는다. 그러나, 당해 리간드에 의한 IL-5, IL-3 및 GM-CSF 수용체의 자극은 특정한 세포성 단백질의 신속한 티로신 인산화를 유도하는 것으로 나타났다(Koyasu et al., 1987;Isfort et al., 1988; Morla et al., 1988; Murata et al., 1990). 티로신 키나제는 GM-CSF 로 자극한 후 수용체의 β-서브유니트와 회합하는 것으로 확인되었다 (Hanazono et al., 1993). GM-CSF-유도된 시그날 전달 동안 발생하는 다른 과정은 p21ras(Satoh et al., 1991, 1992) 및 c-raf(Carroll et al., 1990) 의 활성화인 반면에, IL-3-유도된 시그날 전달에 있어서 p21ras(Satoh et al., 1991, 1992) 및 c-raf(Carroll et al., 1990) 의 활성화 이외에 단백질 키나제 C (Whetton et al., 1988) 의 활성화 및 "마이토젠(mitogen)-활성화 단백질"(MAP)-키나제(Welham and Schrader, 1992) 이 인산화를 또한 증명하고 있다. 그러나, 현재까지 전체 시그날 전달 캐스케이드 내에서의 이들 과정의 정확한 순서는 결정되지 않았다.
시그날 전달 장치의 성분을 통해 사이토카인-수용체를 자극한 후 유도된 유전자는 거의 대부분 확인되지 않았다. 따라서, 그러한 유전자의 프로모터에서의 조절 요소는 거의 공지되어 있지 않다. 예를 들어, IL-6 수용체의 자극은 특이적 DNA-결합 단백질, NF-IL-6 의 활성화를 유도하고, 이는 표적 유전자의 프로모터 부위에서 IL-6 반응성 요소에 결합함으로써 유전자의 발현을 초래하고 이로 인해 IL-6-의존성 생물학적 효과를 초래한다(Akira et al., 1990). 프로모터 부위에서의 다중의 유도가능한 서열 요소를 함유하는 c-fos 원종양 유전자 (Verma and Sassone-Corsi, 1987) 는 IL-2, IL-3 및 EPO 에 의해 유도되는 반면에, c-fos 프로모터에 존재하는 "혈청-반응-요소"(SRE) 는 그중에서도 특히 그의 유도에 관여한다 (Hatakeyama et al., 1989, 1992).
IL-5 수용체는 그의 리간드 인터루킨-5(IL-5) 의 결합에 의해 활성화된다. IL-5 는 T-세포 및 마스트(mast) 세포에 의해 생성된 펩타이드 호르몬이고 호산구의 말기 분화에서의 필수적인 기능을 갖는다.
IL-5 수용체에 커플링된 시그날 전달 경로에 대해 공지된 것이 거의 없다. 아직 미확인된 세포성 단백질로서 일부의 인산화(Murata et al., 1990) 이외에는, IL-5 수용체의 자극에 의해 유발된 시그날 전달에서의 과정은 설명된 것이 없다. 3 개의 사이토카인 IL-5, IL-3 및 GM-CSF 가 상이한 생물학적 기능을 가지므로, 모든 3 개의 수용체에 공통적인 β-서브유니트와 달리 수용체의 사이토카인-특이적 α-서브유니트 또한 세포내 시그날 경로, 특히 사이토카인-특이적 시그날 전달 및 기능의 유도에서 역할을 하는 것이 가능하다(Tominaga et al., 1992).
그러므로, IL-5 수용체에 커플링된 시그날 경로에 대한 명백한 결론을 IL-3 수용체 또는 GM-CSF 수용체 활성화에 의해 유발되는 시그날 전달 과정의 지식으로부터 유추할 수는 없다. 유전자가 IL-5 수용체의 자극 후에 유도됨을 아직 확인하지 못했으므로, IL-5 수용체의 활성화에 의해 개시된 시그날 전달 경로에 반응하는, 그러한 유전자의 프로모터 부위에 존재하는 조절 요소에 대해서도 공지된 것이 없다.
IL-5 수용체의 그의 리간드의 결합에 의한 활성화는 호산구증가증, 즉 혈액에서 호산구의 증가가 수반되는 다양한 질환과 관련되어 있다. 이들 질환은 자가면역 질환, 이식거부반응, 알러지성 질환, 특정한 기생충 질환 및 천식 질환을 포함한다. 그러한 질환의 원인 치료를 위해 지금까지 제안된 접근법은 한편으로는 길항제로서 IL-5-수용체의 가용성 α-서브유니트의 투여 (EP-A 0 492 214) 이고, 다른 한편으로는 길항제 또는 아고니스트의 합리적인 고안에서의 IL-5 의 결정 구조로부터의 출발(Milburn et al., 1993)로 구성된다.
최근에, 특정한 수용체 또는 수용체 서브타입에 특이적이고 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 특이적으로 영향을 주는 병리학적 상태를 치료하는 약제를 발견할 수 있는 스크리닝 방법이 개발되었다. 이들 방법은 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 물질의 조절 효과가 유전자의 발현에 의해 검출될 수 있다는 원리를 기초로 한다:
분석 시스템[문헌: King et al., 1990] 은 효모 세포에서, 효모 세포내로 형질감염된 수용체에 대해 아고니스트적으로 활성인 화합물의 결합반응이 비색법에 의해 측정되는, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 의 G 단백질 커플링된 페로몬 수용체에 의해 사용되는 시그날 전달 경로에 영향을 주는 것에 기초한다.
몬트마이어르와 보렐리(Montmayeur and Borelli, 1991) 는 G 단백질 커플링된 수용체(D2-수용체 및 β-아드레날린 수용체가 사용되었다)를 활성화함으로써 아데닐레이트-사이클라제 시그날 전달 경로에 영향을 주는 것을 기초로 하는 분석을 기술한다.
힘믈러 등(Himmler et al., 1993) 은 cAMP-시그날 전달 경로에 대한 수용체 커플링(사람 도파민 D1- 및 D5-수용체)의 활성이 리포터(reporter) 유전자의 전사활성화에 의해 측정되는 기능성 시험을 개발하였다.
지금까지 공지된 분석은 cAMP, 즉 G 단백질 커플링된 수용체의 시그날 전달 경로 중의 하나의 메신저 물질의 농도에 의해 조절되는 유전자 발현의 측정에 제한되어 있다.
반대로, 본 발명의 목적은 그의 기작 및 메신저 물질이 거의 알려져 있지 않은 IL-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로를 조절하는 물질을 확인할 수 있는 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 자동화될 수 있으므로 고처리량 속도로 물질을 스크리닝하기에 적합하고 또한 약물학적으로 활성인 물질의 함량에 있어서 유기체로부터의 추출물과 같은 물질의 복합적인 혼합물을 조사하는 것을 가능하게 하는 방법을 제공해 준다.
IL-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로를 조절하는 능력에 기초한 물질, IL-5 수용체의 아고니스트의 동정은 IL-5 수용체의 조절, 및 빈번히 활성화를 포함하는 질환의 치료에 사용되는 약제의 개발을 위한 출발점을 형성한다.
본 발명의 범주내에서, IL-5 수용체 및 IL-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로의 성분의 기능에 필요한 구조 요소를 발현하는 세포(그러한 세포들은 이후에 간단하게 언급하기 위해 "기능성 IL-5 수용체를 발현하는 세포"로서 언급된다)이고 조절 DNA 요소를 함유하는 리포터 유전자 구성체로 형질전환되는 세포에서 리포터 유전자 구조체는 그의 리간드 결합 후 IL-5 수용체의 활성화에 의해 유도되는 것으로 나타났다.
IL-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로의 제한된 지식의 관점에 있어서, 이들결과는 특히 지금까지 특성화된 조절 DNA 요소가 IL-5 수용체에 의해 개시되는 시그날 전달 경로의 메신저 물질에 반응하는지 여부를 예측하는 것이 불가능하였으므로 놀라운 것이다.
본 발명은 사람 또는 동물 세포에서 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 물질의 조절 효과를 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은
a) 리포터 유전자 및 IL-5 수용체에 커플링된 시그날 전달 경로의 하나 또는 그 이상의 제 2 메신저 물질의 농도 변화에 반응하는 조절 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환되어 리포터 유전자의 발현이 메신저 물질의 농도 변화에 의해 조절되고, 추가로
b) 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현하는 포유동물 세포를 시험 물질과 함께 배양하고,
리포터 유전자 생성물의 농도를 측정하고, 확인된 시험 물질에 의한 활성이 IL-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대해 선택적인지 여부를 조사함으로써 IL-5 수용체의 활성화에 의해 개시된 시그날 전달 경로에서의 성분에 대한 물질의 조절 효과를 결정함을 특징으로 한다,
본 발명의 범주내에서의 "인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로의 정의는 또한 임의로 하나 이상의 시그날 전달 경로로 구성된 인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 메카니즘을 포함한다.
"시그날 전달 경로에서의 성분"의 정의는 IL-5 수용체 자체 또는 그의 서브유니트를 포함하여 시그날 전달 경로에 관여하는 분자의 모든 메카니즘을 포함한다.
IL-5 의존성 시그날 전달 경로의 저해제를 발견하고자 할 경우, 시험 물질은 그들을 IL-5 와 함께 세포 상에 위치시킴으로써(일반적으로 IL-5 를 시험 물질과 동시에 또는 이후에 세포에 가함) 그들의 길항 효과에 대해 조사한다.
제 2 메신저 물질에서의 변화에 반응하고 또한 본 발명의 일부인 재조합 DNA 는 이후에 "센서 DNA" 로서 언급된다. 리포터 유전자는 그의 발현 생성물이 검출가능하고 그의 농도에 비례하는 시그날의 측정에 의해 정량분석가능하다는 사실에 의해 정의된다.
센서 DNA 로 형질전환되고 IL-5 수용체를 발현하는 세포는 이후에 "시험 세포" 로서 언급된다; 이들 세포는 또한 본 발명의 대상물질이다.
본 발명에 따른 용어 "IL-5 수용체" 는 기능성 IL-5 수용체를 의미하는 반면에, 이 정의는 또한 존재하는 모든 IL-5 수용체 서브타입을 포함할 것이다. 본 발명에 따른 "기능성 수용체" 는 한편으로는 동일한 종의 α- 및 β-서브유니트, 및 또한 시험 세포, 특히 사람 세포에서 상이한 종의 IL-5 수용체의 α- 및 β-서브 유니트의 생존가능한 조합, 즉 사람 수용체의 α-서브유니트 및 뮤린 수용체의 β-서브유니트, 또는 역으로 구성되는 천연 IL-5 수용체를 의미한다. 이 정의에 따른 기능성 수용체는 또한 β-서브유니트가 다른 수용체, 즉 IL-3 또는 GM-CSF 수용체의 α-서브유니트와 천연적으로 상호작용하는 세포에서, IL-5 수용체의 α-서브유니트가 세포내로 도입되어 그곳에서 발현되는 경우에 존재하는 반면에, 이 경우에 α-서브유니트는 또한 상이한 종으로부터 유래될 수 있지만, 단 두 개의 서브유니트의 기능적 협동이 시그날 전달 경로의 개시를 확실하게 하여야 한다.
IL-5 수용체의 서브유니트 또는 서브유니트들을 암호화하는 하나 또는 그 이상의 서열을 함유하는 재조합 DNA 는 이후에 "수용체-DNA" 로서 언급된다.
시험 세포를 제조하기에 적합한 출발 세포는 완전한 기능성 IL-5 수용체를 이미 내생적으로 함유하는 세포 뿐만 아니라 센서-DNA 의 유도에 필요한 수용체-커플링된 시그날 전달 경로의 성분을 함유하는 세포이다. 적합한 그러한 세포에 있어서, 그들은 전체 IL-5 수용체 또는 그전에 그의 서브유니트 중의 단지 하나조차 발현하는 것도 필수적이지는 않다. 하나 또는 양 서브유니트가 부재하는 경우, 세포는 센서-DNA 뿐만 아니라 누락된 수용체 서브유니트 또는 서브유니트들을 암호화하는 서열로 추가로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 시험 세포는 기능성 IL-5 수용체에 필요한 양 서브유니트를 천연적으로 발현하는 세포로부터 유래된다.
본 발명의 다른 실시태양에 따라, 시험 세포는 β-서브유니트만을 발현하는 출발 세포로부터 유래된다; 이 경우에 세포는 센서 DNA 뿐만 아니라 IL-5 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드로 형질전환된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 시험 세포를 위한 출발 세포는 천연적으로 IL-5 수용체의 α- 또는 β-서브유니트를 함유하지 않는다. 이 경우에 세포는 양 DNA 서열로 형질전환되어야 하고, 이는 하나의 플라스미드상에 함께 또는 별개의 플라스미드 상에 존재할 수 있다.
물질을 사람에서 병리학적 상태를 치료하기 위한 그들의 약물학적 활성에 대해서 조사할 경우, 수용체-DNA 는 바람직하게는 사람 IL-5 수용체를 암호화하는 서열을 함유한다(본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 사람에서 병리학적 상태를 치료하기에 적합한 물질을 발견하기 위해 사용한다. 그러나, 또한 동물을 치료하기 위해 사용된 물질을 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다; 이 경우에 상응하는 동물 IL-5 수용체가 사용된다).
바람직하게는, 시험 세포를 제조하기 위한 세포는 IL-5 수용체의 기능으로서 제 2 메신저 물질의 농도를 증가시키는 물질로 자극한 후 리포터 유전자의 강력한 발현을 나타냄을 기초로 하여 선별된다. 이는 통상적으로 센서 DNA 를 사용하여 기능성 IL-5 수용체를 발현하는 세포를 일시적으로 형질전환시키고 수용체를 IL-5 로 자극한 후 리포터 생성물의 농도를 조사함으로써 편리하게 시험된다.
시험 세포를 위한 출발 세포는 특히 IL-5 수용체 또는 β-서브유니트를 함유하는 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포, 또는 유기체에서의 그들의 기원 또는 기능을 기초로 하여 당해 수용체 중 하나, 특히 조혈 전구 세포를 발현하는 것으로 추측될 수 있는 세포일 수 있다. 수용체의 발현은 결합 분석 및/또는 당해 리간드(IL-5, IL-3 또는 GM-CSF)의 존재하에서 세포의 성장을 결정하는 증식분석에 의해 임의로 확인될 수 있다.
적합한 출발 세포의 예로는 골수 세포로부터 정착된 인자-의존성 세포주이다; β-서브유니트를 발현하는 그러한 세포주의 제조는 예를 들어 뮤린 세포에 대한 덱스터 등(Dexter et al., 1980) 에 의해 설명되었다. 본 발명의 범주내에서 그러한 뮤린 세포주의 예는 뮤린 IL-5 수용체의 α-서브유니트로 형질감염되고 시험세포로서 사용되었다. 적합한 시험 세포의 다른 예는 IL-5 의존성 조혈 세포, 즉 문헌[참조: Kitamura et al., 1989 및 1991] 에 의해 기술된 세포주 TF-1 의 세포로 구성되어 있다.
양 서브유니트가 뮤린 기원, 즉 뮤린 세포주 1H3 인 세포에서, α- 및 가능한한 β-서브유니트는 또한 동종(homologous) 재조합에 의해 스위치 오프(switch off)될 수 있고, 상응하는 사람 서열에 의해 대체될 수 있다.
원칙적으로, 모든 종으로부터의 포유동물 세포를 출발 세포로서 사용할 수 있지만, 사람 세포가 바람직하게 사용된다. 비-사람 세포를 사용하는 경우, 사람 IL-5 수용체 DNA(β- 및/또는 α-서브유니트)로 형질전환된 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적을 위해 시험 세포로서의 세포의 적합성을 위한 다른 예비조건은 그의 안정성이다. 세포의 안정성(생존가능성, 게놈내로의 외래 DNA의 안정한 도입)을 시험하기 위해, 동일한 조건하에서 장기간에 걸쳐서 시험 세포를 사용하여 시험을 수행하고 측정의 재현가능성을 체크한다.
센서-DNA 는 바람직하게는 적합한 숙주 유기체, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli) 에서 높은 카피수로 복제될 수 있고 포유동물 세포내로 형질감염 및 숙주 게놈내로의 도입 후 리포터 유전자의 발현이 조절 요소의 조절하에서 일어날 수 있는 플라스미드 상에 위치한다. 이는 바람직하게는 리포터 유전자(센서-DNA)에 대한 발현 카세트(cassette), 및 포유동물 세포에 대한 선별가능한 마커 뿐만 아니라 적어도 하나의 복제 기원, 및 이. 콜라이에서의 복제 및 선별을 위한 마커를 함유하는셔틀(shuttle) 벡터이다.
그들의 게놈에 안정하게 도입된 센서 DNA 를 함유하는 영구적인 세포주를 제조하기 위해, 벡터는 우세한 선별 마커를 함유한다. 특이적 선별 마커의 사용이 결정적이지는 않다; 적합한 것은 예를 들어 항생제 제네티신(G-418) 에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자(neo) (Southern and Berg, 1982), DHFR-결핍 세포에 대한 DHFR-유전자(디하이드로폴레이트 환원효소), 뮤코페놀산에 대한 내성을 갖는 크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라제에 대한 유전자 (gpt) (Mulligan and Berg, 1981), 또는 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 유전자 (hph; Gritz and Davies, 1983) 를 포함한다. 선별 마커 유전자를 유도하는 프로모터의 예는 SV40-초기-프로모터, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터(CMV-프로모터), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)의 티미딘 키나제 유전자의 프로모터(TK-프로모터), 라우스 사코마바이러스(Rous Sarcoma virus) (RSV) 장 말단 반복(long terminal repeat) (LTR)이다. 플라스미드는 바람직하게는 리포터 유전자, 리포터 유전자에 대한 프로모터, 선별 마커에 대한 조절 서열과 같은 개별적인 중요한 요소가 특별한 적용, 즉 상이한 세포주의 사용의 결과로서 초래되는 모든 변형된 요구조건에 적응하기 위해 쉽게 대체되거나 변화될 수 있도록 설계된다. 그러한 측정은 예를 들어 프로모터 또는 다양한 리포터 유전자를 조절하는 조절 서열의 클로닝을 허용하기 위해 프로모터 또는 프로모터들의 전면 또는 리포터 유전자의 전면에 다중클로닝 위치를 도입하는 것으로 구성된다.
적합한 리포터 유전자를 선택하는 경우, 출발 전제조건은 자동화가능한, 바람직하게는 고감도의 비방사활성 분석을 제공하는 것이다.
본 발명의 범주내에서, 이론적으로 이들 예비조건을 만족하는 모든 리포터 유전자를 사용할 수 있다:
알칼라인 포스파타제는 화학발광 기질을 사용하는 경우 고도의 감도로 측정될 수 있지만, 많은 포유동물 세포가 이 효소를 비교적 강력하게 발현하는 단점을 갖는다. 그러므로, 그것은 일반적으로 그것을 발현하지 않거나 그것을 약하게만 발현하는 그들 세포주에 대한 리포터 유전자로서만 간주될 수 있다.
β-갈락토시다제- 및 β-글루쿠로니다제(glucuronidase)-유전자의 발현 생성물은 상응하는 메틸움벨리페릴-갈락토시드(methylumbeliferyl-galactoside) 또는 -글루쿠로니드(glucuronide)를 절단하여 형광 그룹을 형성할 수 있다. 이들 효소 반응은 확립된 형광 분석을 사용하여 모니터링된다(Wieland et al., 1985; Kricka, 1988).
클로람페니콜-아세틸트랜스퍼라제(CAT)의 발현은 비교적 고감도로 검출할 수 있지만, 분석은 방사활성이고 자동화하기가 곤란한 단점을 갖는다(Hartma-nn, 1991).
바람직하게는, 본 발명의 범주내에서 포티누스 피랄리스 루시페라제 (Photinus pyralisluciferase)를 암호화하는 유전자 (De Wet et al., 1987) 가 리포터 유전자로서 사용된다. 이 효소는 그의 기질 루시페린을 사용하고 ATP 를 첨가하여 확립된 자동화된 방법에 의해 측정할 수 있는 고수율의 생물발광을 생성하고, 이 효소는 포유동물 세포에 의해 내생적으로 생성되지 않는 장점을 갖는다. 추가로, 루시페라제는 비교적 짧은 생체내 반감기를 가지고 고농도에서조차 독성이 없다 (Hartmann, 1991; Brasier et al., 1989).
센서 DNA 의 구성에서 리포터 유전자는 TRE- 및/또는 CRE- 및/또는 SRE- 및/또는 GRE-요소와 같은 조절가능한 조절 요소를 함유하는 프로모터의 조절하에 위치한다. IL-5 수용체의 시그날 전달 경로가 상세하게 특정적으로 알려져 있지 아니하므로, 가장 적합한 센서-DNA 구성은 예비 시험에서 실험적으로 측정된다. 이를 수행하기 위해, 기능성 IL-5 수용체를 발현하는 세포가 다양한 센서 DNA 구성체로 일시적으로 형질전환되고, 한편으로는 리포터 유전자를 변화시키고 다른 한편으로는 대조 서열을 변화시키며, 리포터 유전자 생성물의 측정은 아고니스트, 바람직하게는 IL-5 로 수용체를 자극한 후 리포터 유전자 생성물의 농도를 측정함으로써 그의 감도에 대해 시험된다. 센서 DNA 에서 적합한 조절 서열은 프로모터, 즉 TRE, CRE, GRE 또는 SRE, 또는 이들 다양한 요소의 조합을 함유하는 요소들로 구성된 그룹 중에서 선택된 요소의 활성화를 초래하는 모든 DNA 요소이다. 둘 또는 그 이상의 상이한 요소를 함유하는 이러한 종류의 센서 DNA를 사용하여, 많은 시그날 전달 경로의 개별적인 활성화, 및 많은 시그날 전달 경로의 평행적인 활성화가 회복된다. 시험 세포 개발을 위한 센서 DNA 의 선택은 주어진 세포 시스템에서 리포터 유전자의 최대 가능한 유도가능성의 성취를 기초로 하여 이루어진다. 조절 DNA 부위는 천연적으로 발생하는 프로모터 부위일 수 있지만, 또한 인공적으로 생성될 수도 있다.
복수의 제 2 메신저 물질에 의해 유도가능한 유전자의 완전한 프로모터, 즉 ICAM-1- 유전자(세포간 유착 분자 1) 또는 c-fos 유전자의 5'-조절 서열을 임의로사용할 수 있다. IL-5 수용체의 활성화에 반응하고 다중 조절 요소를 함유하는 천연 프로모터, 즉 그 중에서도 특히 TRE-, NKkB-, SPI- 및 AP2-요소를 함유하는 ICAM-1-프로모터(Voraberger et al.) 또는 CRE- 및 SRE-요소에 부가하여, 특히 "SIF-E-요소" 및 "AP1-형 요소"(Hipskind and Nordheim, 1991) 로 표시된 조절 서열을 함유하는 c-fos-프로모터는 그의 요소들의 어느 것이 활성화를 담당하는가에 대해 조사될 수 있다. 이는 그들의 활성화가능성에 대하여 천연 프로모터와 비교하여 다양한 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 인공적 프로모터 서열을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 시험의 결과로부터 출발하여, 프로모터는 원한다면 예를 들어 결정적인 것으로 확인된 요소 또는 요소들의 다중 카피를 사용함으로써 추가로 최적화될 수 있다.
원한다면, 공지된 천연 또는 합성 프로모터는 프로모터 기능을 위해 필요한 최소 서열로 그들을 단축시킴으로써 변형된다.
리포터 유전자가 비천연 프로모터에 의해 유래된 센서-DNA 를 구성하는 경우, 하나 또는 그 이상의 요소, 즉 프로모터를 조절하는 TRE- 및/또는 CRE- 및/또는 SRE- 및/또는 GRE-조절 요소는 바람직하게는 약한 프로모터 요소 앞에 위치된다. 본 기술분야의 당업자들은 특이적인 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 대조(control) 서열에 대해 잘 알고 있다; 관련된 문헌(즉, Landschulz et al., 1988, Turner and Tjian, 1989) 을 기초로 하여 우선 선택할 수 있고, 협소화 또는 최적화를 상기 언급된 용이하게 수행될 수 있는 일시적 형질감염 실험을 사용하여수행할 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 β-글로빈 프로모터 및 TK 프로모터이다.
센서 DNA 에 함유된 조절 서열(그의 플랭킹 서열을 포함) 을 선택하는 경우, 문헌으로부터 공지된 요소를 출발물질(즉, TRE- 또는 CRE-요소)[참조:Montminy et al., 1990; Deutsch et al., 1988) 로서 선택하고 이들을 주어진 세포 시스템에서의 리포터 유전자의 유도가능성의 민감한 검출에 대한 그들의 적합성에 대해 예비 시험에서 시험한다. 그들의 플랭킹 서열을 함유하여 적합한 TRE-요소의 예는 소마토스타틴, "혈관작용성 소장 펩타이드(vasoactive intestinal peptide)", 사이토메갈로바이러스 인핸서(enhancer), 소 백혈병 바이러스 장 말단 반복(BLV LTR) (CRE-요소) 및 ICAM-1, 콜라게나제 및 부갑상선 호르몬(TRE-요소) 의 서열이다. 천연 서열에 함유된 모티프는 완전한 콘센서스 서열을 갖지 않는 경우, 그들 및 가능하게는 그들의 인접 서열은 완전한 콘센서스 서열이 필요하거나 바람직하다면 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환에 의해 변화될 수 있다.
조절 요소 및 그들을 플랭킹하는 서열은 합성에 의해 제조되거나 천연기원일 수 있다.
리포터 유전자 발현에 대한 제 2 메신저 물질의 조절 효과를 증강하기 위해, 탠뎀(tandem) 으로 복수의 동종 또는 이종 조절 서열을 함유하는 구성체를 임의로 사용할 수 있다. 구성체의 개별적인 요소를 배열하는 경우, 서로 다른 요소로부터의 요소의 간격을 선택하여 요소에 대한 전사 인자의 결합을 확실하게 해준다. 서로 다른 요소로부터의 조절 요소의 최적 간격(여기에서 이의 측정은 입체적 배열에 대한 고려를 포함한다)은 예비 시험에서 실험적으로 결정되며, 임의로 전사에 영향을 주는 다른 조절 DNA-요소, 즉 TATA 박스로부터의 간격 또한 그러하다. 다중 조절 서열에서 요소 및/또는 플랭킹 서열은 동일하거나 적어도 부분적으로 상이할 수 있으며, 후자가 탠뎀 구성에 대해 바람직하다.
요소의 조절 특성에 영향을 주는 것으로 밝혀진 조절 요소를 플랭킹하는 서열로서, 특히 그들의 바로 인접한 위치에서, 특별한 조절 요소를 천연적으로 포위하는 서열을 사용하는 것이 바람직하다(Montminy et al., 1990; Deutsch et al., 1988). 서열 또는 그의 배열은 실험적으로 측정된다.
센서 DNA 의 요소 및 선별을 위해 사용되는 마커 유전자는 가능하게는 두 개의 별개의 플라스미드로서, 하나는 리포터 유전자 구성체(조절 서열을 포함하는 발현 대조 서열을 포함)를 함유하고 하나는 선별 마커 유전자 구성체를 함유하는 것 (적합한 선별 마커 유전자 구성체의 예는 플라스미드 pRSVneo, pSV2neo, pRSVgpt, pSV2pt, 관련된 문헌, 즉 "클로닝 벡터"에서 발견되어질 수 있는 구성)상에 위치할 수 있다. 별개의 플라스미드를 사용하는 경우 세포를 양 플라스미드로 공동-형질감염시키고 마커에 대해 선별한다. 서로 물리적으로 결합되지 않은 DNA-단편 상에 위치한 두 개의 유전자의 공동-형질전환은 양 공동-형질전환된 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있으므로(Winnacker, 1985), 선별 마커의 존재는 세포가 또한 리포터 유전자 구성체를 함유하는 것으로 결론지을 수 있다.
시험 방법에서 사용된 측정 배열에 대해서, 바람직하게는 센서 DNA 구성의 변화에 의해, 즉 프로모터 배열의 구조적 변화에 의해 측정 시그날의 최대 변화 및 정상치 사이의 비를 최적화하는 것이 바람직하다. 백그라운드 시그날은 바람직하게는 고도의 감도를 갖는 리포터 유전자 발현의 유도를 검출하기에 충분히 낮지만, 음성 대조에 대해 검출의 한계를 결정할 수 있을 정도로 층분히 높다.
수용체 서열 또는 서열들이 바람직하게는 강력한 구조 프로모터의 조절하에 위치하는 것을 제외하고는, 수용체 DNA 구성체는 센서 DNA 구성체와 근본적으로 동일하게 고려된다. 수용체 DNA 는 분자생물학의 통상적인 방법, 즉 프라이머를 공지된 서열 또는 서열들을 기초로 하여 제작하여 그것을 적합한 벡터내로 클로닝하는, 역전사효소 PCR 을 사용하여 IL-5 수용체를 발현하는 세포로부터의 RNA 제제로부터 출발하여 cDNA 를 제조함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 또한 PCR을 사용하여 cDNA 라이브러리로부터 증폭될 수 있다.
수용체 DNA 의 경우에, 수용체 서브유니트를 암호화하는 서열 및 우세한 선별 마커는 또한 세포를 공동-형질전환시키는 별개의 플라스미드 상에 존재할 수 있다.
센서 또는 수용체 DNA 를 사용한 세포들의 형질감염은 통상적인 형질감염 방법(참조: 예를 들어 Potter et al., 1984; Felgner et al., 1987), 바람직하게는 일렉트로포레이션(electroporation), 인산칼슘 침전법 또는 리포펙션(lipofection) 방법을 사용하여 수행한다.
IL-5 수용체에 대한 시험 물질의 선택성을 시험하기 위하여, 추가의 대조시험을 위해, 다양한 다른 수용체에 대한 시험 세포를 제조하고 그 물질로 처리한다. 약제의 특이성에 대한 경우와 같이 일반적으로, 물질이 IL-5 수용체에 특이적으로 영향을 줄 경우, 물질은 이 하나의 수용체만을 조절해야만 한다.
대조 세포에서 대조 수용체는 원칙상 내생성이거나 세포내로 형질전환될 수 있다. IL-5 수용체 시험 세포에 대해 사용한 센서 DNA 는 또한 아고니스트, 즉 IL-5 에 의한 이러한 수용체의 자극에 의해 측정가능하게 유도되는 경우, IL-5 수용체 시험 세포는 대조 수용체를 암호화하는 서열이 내생적으로 존재하거나 추가로 세포내로 형질전환된다면 대조 세포로서 적합하다(용어 대조 수용체는 또한 IL-5 수용체와 공통된 β-서브유니트를 갖는 그들 수용체, 즉 IL-3 수용체를 포함한다). 또한, 이 경우에 이 센서 DNA 및 대조 수용체를 함유하지만 IL-5 수용체를 함유하지 않는 세포들을 대조 세포로서 사용하는 것이 가능하다. 다른 한편, IL-5 수용체 시험 세포에 대해 사용된 센서 DNA 가 대조 수용체의 자극에 의해 유도되지 않는 경우, 적합한 센서 DNA 는 주어진 세포 시스템에서 리포터 유전자의 유도가능성의 민감한 검출에 대한 그들의 적합성에 대해 예비 시험에서 조사한 문헌[참조: 예를 들어 Montminy et al., 1990; Deutsch et al., 1988] 에 공지되어 있는 요소들로부터 출발하여 실험적으로 결정되어야만 한다. 센서 DNA 를 이어서 대조 수용체에 대한 암호화 서열이 내생적으로 존재하지 않는 경우 그들과 함께, 세포내로 형질감염시킨다.
인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 물질의 조절 효과에 대한 선택성은 바람직하게는, 물질을 대조 수용체를 발현하고 센서 DNA(이의 조절 서열은 인터루킨-5 수용체 뿐만 아니라 대조 수용체의 활성화에 반응한다) 로 형질 전환된 대조 세포에 대해 동일한 조건하에 적용시키고, 인터루킨-5 수용체를 발현하는 세포에서의 리포터 유전자 생성물의 농도를 대조 세포에서의 농도와 비교함으로써 시험된다.
수용체-DNA 로 세포를 형질전환시킨 후, 양성 클론을 수용체의 발현 수준에 대해, 즉 공지된 방사성표지된 아고니스트 및 길항제를 사용하는 결합 분석을 사용하여 조사한다.
수용체의 수는 스캐차드 블롯(Scatchard blot) (Human Pharmacology, 1991)을 사용하여 세포당 분자수로 측정할 수 있다.
바람직하게는, 가능한한 생리학적 수용체 농도에 상응하는 수용체 수를 갖는 클론은 수용체 DNA 를 함유하는 안정한 형질전환체로부터 선별한다(수용체 수가 너무 높을 경우, 불완전하고 가능하게는 비특이적인 커플링이 발생할 수 있거나, 특이적 커플링 이외에 비특이적 커플링이 발생할 수 있으므로 다른 효과인자 시스템을 활성화시킬 수 있다. 수용체 수가 너무 낮을 경우, 시그날이 너무 낮아 측정에 의해 선택될 수 없다)
"조절" 효과는 IL-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 아고니스트 또는 길항 효과를 의미한다.
시험 방법에서 리포터 유전자의 IL-5 수용체 매개된 발현에 대한 저해 효과를 나타내는 물질을 연속 단계에서 시험하여 그것들이 세포의 IL-5 의존성 증식을 억제하는지 여부를 알 수 있다. 이러한 종류의 방법에서 세포들의 증식에 대한 물질의 저해 효과는 다른 성장 인자에 대한 수용체 이외에 기능성 IL-5 수용체를 발현하며, 적어도 이들 수용체들의 하나, 즉 IL-5 에 대한 리간드인 IL-5 의 존재에 대해 그들의 증식이 의존적인 세포를 선택하고, 이들 세포를 한편으로는 그 자체의IL-5 와 함께 배양하고, 다른 한편으로는 시험 물질 및 IL-5와 함께 배양하여 양 배양물의 증식을 측정함으로써 결정된다.
그러한 증식 분석에 대한 광범위하게 다양한 방법이 있다; 예를 들어 그들을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 수행할 수 있고 쉽게 자동화할 수 있다. 그러한 분석의 예는 [3H]-티미딘 또는 브로모데옥시-우리딘(BrdUrd) 도입량의 측정(예를 들어 형광-표지된 안티-BrdUrd-항체의 결합에 의한 BrdUrd 의 도입량의 측정) 을 기초로 한 것이다. 증식 분석의 다른 타입은 세포 효소를 사용하여 적합한 기질의 반응에 의해 생성되는 염료의 측정을 기초로 한다. 이러한 원리에 대해 개발된 방법 중의 하나는 탈수소효소에 의한 테트라졸리움 염의 반응에 의해 형성된 염료 포르마잔의 농도가 분광분석학적으로 측정하는 시판중인 테트라졸리움염 방법이다.
증식 분석에 적합한 세포의 예는 문헌[참조: Kitamura et al., 1989 및 1991] 에 의해 기술된 IL-5 의존성 조혈 세포, 즉 세포주 TF-1 의 세포이다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여 그들의 잠재적인 약물학적 활성에 대해 시험될 물질은 천연 또는 합성 물질일 수 있고, 순수한 물질 또는 물질들의 혼합물 (즉 식물 추출물, 발효액 등) 을 사용할 수 있다. 순수한 물질 중에서, 저분자량 합성 유기 화합물이 특히 흥미롭다. 스크리닝에 의해 선택될 물질은 주로 수용체의 리간드 결합 부위에 결합하는 물질, 알로스테릭적으로 활성인 물질, 및 리간드 결합 부위에 대해 비경쟁적으로(non-competitively) 작용하는 물질을 함유한다. 이들 물질은 펩타이드성 또는 비펩타이드성일 수 있다.
바람직하게는, 물질을 가장 광범위하게 가능한 범위의 농도로 수득하기 위해 연속 희석액 중의 세포에 적용시킨다. 리포터 유전자 발현의 유도가 재현 가능하게 측정될 수 있는 것으로부터 배양 시간은 주어진 시험 세포를 공지된 수용체 아고니스트로 처리하고 시간을 측정함으로써 실험적으로 결정된다. 배양 시간은 일반적으로 이 시간에 고정되며 일반적으로 적어도 1 시간이다. 세포의 수는 측정하는 시그날의 검출 한계 및 세포가 도달하는 성장 단계에 일차적으로 의존하는 반면에, 하한은 시험 단위에 대해 균일하게 세포를 분포시키는 기술적 능력에 의해 추가로 정의된다. 96 웰을 갖는 마이크로타이터 플레이트를 사용할 경우, 세포의 수는 예를 들어 시험 단위당 약 1000 내지 100,000 개의 세포일 것이지만, 그 수는 만약 측정하는 시그날이 매우 민감하고 세포들이 정확하게 분포가능한 경우 더 낮아질 수 있다. 사용되는 세포들의 성장 단계는 출발 세포의 세포 타입 특성에 의존하고, 더우기 당해 수용체에 의해 일차적으로 결정된다(상이한 수용체에서, 동일한 효과인자 시스템은 성장 단계에 따라 상이하게 또는 상이한 강도로 활성화될 수 있다); 따라서 세포의 성장 단계 및 수는 또한 다양한 성장 단계에 있는 예비시험 및 시험 세포에서 리포터 유전자 발현의 역학을 결정함으로써 예비 시험에서 실험적으로 결정된다.
본 발명의 범주내에서, IL-5 수용체를 발현하고 센서 DNA 로 형질전환된 세포들이 IL-5, IL-5 수용체의 천연 리간드의 첨가에 대해 반응함을 리포터 유전자의 발현의 유도에 의해 설명하고 있다(한편으로는 천연적으로 β-서브유니트를 발현하고 추가로 α-서브유니트로 형질전환된 뮤린 세포 뿐만 아니라 천연적으로 기능성IL-5 수용체에 필요한 두 개의 단위를 발현하는 사람 세포를 시험하였다). 사용된 센서 DNA 는 그중에서도 특히 TRE-요소를 함유하는 사람 ICAM-1-유전자의 1.3 kb 5'-조절 구역, 또는 그중에서도 특히 TRE, CRE 및 SRE 를 함유하는 사람 c-fos-유전자의 0.756 kb 5'-조절 부위를 조절 요소로서 함유한다. 내생성 IL-3 및 GM-CSF 수용체를 함유하는 이들 세포들은 IL-3 또는 GM-CSF 로 자극될 때, 리포터 유전자 발현의 유도를 다시 측정할 수 있다. IL-5 수용체의 α-서브유니트(수용체에 결합하는 리간드를 매개하는) 의 부재를 제외하고는, 상기에서 사용된 것과 동일한 대조 세포에서, 리포터 유전자의 발현은 또한 IL-3 또는 GM-CSF 로 처리함으로써 유도될 수 있지만, IL-5 로 처리함으로써는 유도될 수 없다.
본 발명은 IL-5 수용체에 의존하여 세포에서의 하나 또는 그 이상의 시그날 전달 경로에 특이적으로 영향을 주는 물질을 발견하는 민감하고 융통성 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 방법에 의해 발견된 물질은 IL-5 수용체 또는 여기에 커플링된 시그날 전달 경로의 기능장애에 관련된 질환을 치료하는 약제를 개발하기 위한 가이드 물질로서 작용하고, 더욱 상세하게는 길항제의 경우 그들의 약물학적 성질을 조사하기 위해 2 차 스크리닝, 즉 세포주 또는 1 차 세포를 사용하는 증식 분석 및 이어서 동물 시험에서 계속하여 조사될 수 있다. 필요한 동물의 수는 따라서 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 상당히 감소될 것이다.
본 발명에 따른 방법은 또한 세포 배양 용기, 즉 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 충전, 시험 물질 용액의 충전, 배양 및 세척 단계 및 리포터 유전자 생성물로서 루시페라제의 경우에 광도계를 사용한 측정이 로보트에 의해 수행될 수 있는점에서, 자동화될 수 있다는 장점을 갖는다. 본 발명에 따른 방법은 따라서 고처리 용량을 갖는 스크리닝 프로그램에 적합하고, 이는 예를 들어 1 주일당 약 2000 개의 물질 또는 물질들의 혼합물을 시험할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여, 알로스테릭적으로 활성인 물질 및 리간드 결합 부위에 대해 비경쟁적으로 작용하는 물질을 검출할 수 있다.
본 발명에 다른 방법은 또한 약물학적으로 또는 생화학적으로 특성화되고 리간드에 대해 공지된 수용체를 클로닝할 수 있다. 사용되는 출발 물질은 cDNA 또는 게놈 뱅크(genomic bank) 이고, 이로부터 풀을 상응하는 세포주내로 형질전환시킨다. 수용체의 발현은 수용체를 리간드의 결합에 의해 활성화시킨 후의 리포터 유전자의 발현을 의미한다.
도면의 요약
제 1 도 : ICAM-1 유전자의 프로모터 부위를 함유하는 센서 DNA 플라스미드 pBHluc1.3
제 2 도 : c-fos-유전자의 프로모터 부위를 함유하는 센서 DNA 플라스미드 pBHfosluci
제 3 도 : 1H3-세포에서 수용체 자극에 의한 pBHluc1.3 및 pBHfosluci 의 유도
제 4 도 : 뮤린 FDC-P1-세포에서 수용체 자극에 의한 pBHluc1.3 의 유도
제 5 도 : 사람 TF-1-세포에서 수용체 자극에 의한 pBHluc1.3 의 유도
제 6 도 : 수용체 자극에 의한 TF-1-세포 증식의 유도
실시예 1
이차 메신저 물질에 의해 조절될 수 있는 요소를 갖는 리포터 플라스미드 (센서-DNA)의 제조
a) 플라스미드 pBHluc1.3 의 구성
세포간 유착 분자 ICAM-1 에 대한 사람 유전자의 1.3 kb 의 5-플랭킹 부위의 클로닝 및 결실 분석이 이 단편이 i) 폐의 선암 세포주 A549(ATCC CCL 185) 의 TPA 에 의해 유도될 수 있고, ⅱ) DNA 서열 TGATTCA 을 갖는 TPA 반응 요소(TRE) 를 함유하는 것으로 나타났다(Voraberger et al., 1991). 플라스미드 pBHluc1.3 (제 1 도) 는 ICAM-1 유전자의 1.3 kb 길이의 조절 부위를 함유하며, 이는 루시페라제 유전자에 선행한다. 그의 제조는 문헌[참조: Voraberger et al., 1991] 에 의해 기재되어 있다.
b) 플라스미드 pBHfosluci 의 제작
플라스미드 pBHfosluci 는 사람 c-fos 유전자의 프로모터 조절하에 루시페라제 유전자를 함유하며, 이는 각종 조절 요소, 즉 TRE, CRE 및 SRE 를 함유한다. c-fos 프로모터를 포함하는 단편 (부위 -711 내지 +45) 은 플라스미드 pfosCAT(Schontion et al., 1988)에서 분리되었으며, 벡터 pBluescriptSK (스트라타진)에서 중간 클로닝하여, 루시페라제 유전자 앞에 있는 구성체 pBHluc 에 삽입되었다(Vora-berger et al., 1991).
플라스미드 pfosCAT (Schonthal et al., 1988) 을 XbaI 및 HindⅢ 로 절단하였다. c-fos 프로모터를 함유하는 756 bp 단편을 분리하고, 벡터 pBluescriptSK 에결찰시킨 후, XbaI 및 HindⅢ 로 절단하였다. 이. 콜라이의 형질전환 후에 수득한 플라스미드를 pBSfos 라 명명하였다. 플라스미드 pBSfos를 XbaI 으로 절단하고, 플라스미드의 DNA-말단을 클레나우(Klenow) 효소와 모든 4 dNTPs 을 첨가함으로써 "평활화(blunt)" 한후, 마지막으로 SalI 으로 절단하였다. c-fos 프로모터를 함유하는 SalII/평활 단편을 분리하였다. 플라스미드 pBHluc(Voraberger et al., 1991) 를 HindⅢ 로 절단하고, DNA 말단을 "평활화" 한후 SalI으로 절단하였다. 이 방법으로 절단된 벡터를 c-fos 프로모터를 함유하는 SalI/평활 단편과 결합시켰다. 이. 콜라이 형질전환 후 수득한 플라스미드를 pBHfosluci라 명명하였다 (제 2 도).
실시예 2
센서 DNA 의 수용체 매개된 유도
IL-5 수용체를 발현하는 세포에서 센서 DNA가 수용체의 아고니스트적으로 작용하는 물질로의 자극후 유도됨을 입증하기 위하여, 뮤린 및 사람 세포주의 세포들을 일시적으로 센서-DNA 로 형질감염시켰다(pBHluc1.3 또는 pBHfosluci):
뮤린 1H3-세포는 뮤린 IL-5 수용체의 α-서브유니트를 사용하여 하기와 같이 형질전환시킴으로써 FDC-P1-세포, 뮤린, 골수 세포로부터 정착된 인자-의존성 세포주(Dexter et al., 1980) 로부터 제조되었다: 뮤린 IL-5 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 cDNA(Takaki et al., 1990) 를 세포주 BCL1, 클론 5B1b(ATCC TIB 197) 로부터 제조한 RNA 를 사용하여 역전사효소 PCR 반응(Frohman et al., 1988) 에서 합성하였다. 이 목적을 위해 사용된 프라이머는 MF71 (SEQ ID NO : 1) (5' TCGGCTACCATGGTGCCTGTG 3') 및 MF73 (SEQ ID NO : 2) (5' ATGGCAAAATGCCATCAAAACGTG 3') 이다 ; 이들은 수용체 α-서브유니트를 위한 암호화 영역을 플랭킹한다(Takaki et al., 1990) (서열 목록에는 합성 올리고데옥시리보뉴클레오타이드는 "cDNS" 로서 주어진다). 1272 bp PCR 생성물을 플라스미드 pUC19 (Pharmacia)의 SmaI 절단 부위에 서브클론닝하였다. 암호화 서열을 BamHI 및 EcoRI 으로 절단하고, 발현 플라스미드 pcDNA1(인비트로겐)에 삽입시킨 후, 동일한 효소로 절단하였다. 25 ㎍ 의 선형화된 플라스미드를 일렉트로포레이션 (300 V, 960 ㎌, BioRad Gene Pulser) 에 의해 4×107FDC-P1-세포내로 형질감염시켰다. IL-5 수용체 발현 세포들을 뮤린 IL-5 로 풍부화시킨 RPMI-1640-배지에서 선별하였다. 그러므로 1H3-세포는 단지 IL-5 수용체 β-서브유니트만을 발현하는 FCS-P1-세포와는 달리 기능성 IL-5 수용체(α-플러스 β-서브유니트)를 발현한다. 1H3-세포 및 FDC-P1-세포는 내생성 IL-3 과 CM-CSF 수용체를 갖는다. β-서브유니트는 IL-5, IL-3 및 GM-CSF 수용체에서 동일하다.
사람 세포주 TF-1 은 기타무라 등(Kitamura et al., 1989)에 기재된 바와같이 적백혈병을 가진 환자의 골수 세포로부터 정착되었다. 세포들은 IL-5, IL-3 및 GM-CSF 를 위한 기능성 수용체을 발현하고, 그들의 증식은 세 개의 조혈 성장인자 중 적어도 하나의 존재에 의존한다 (Kitamura et al., 1989, 1991).
센서 DNA 로 1H3- 및 TF-1-세포를 형질감염시킨지 1 일후, 세포를 인자 결핍 배지에서 약 12 시간 동안 유지시키고, 이어서 수용체 특이적 리간드 IL-5로 처리하였다. 1H3-세포에 대한 음성 대조용으로서 기능성 IL-5 수용체를 발현하지 않는뮤린 FDC-P1-세포를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 다른 대조용 실험에서, 1H3-, FDC-Pl- 및 FT-1-세포를 IL-5 대신 IL-3 또는 GM-CSF로 처리하였다.
a) 1H3 세포에서 수용체 자극에 의한 pBHlucl.3 및 pBHfosluci 의 유도
기능성 IL-5 수용체를 발현하는 세포주 IH3 을 37℃ 에서 5 % CO2중에 약 500 단위/㎖ 의 IL-5 (재조합 뮤린 IL-5) 를 첨가하면서 10 % 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(FCS) 및 1 % 마우스 강장 보충물 (1 M NaCl, 0.1 M 나트륨 피루베이트, 11.3 M 모노티오글리세롤)을 갖는 RPMI 1640 배지(Gibco)에서 배양하였다. 형질감염체당 약 3×107세포를 1000 rpm 에서 5 분간 원심분리하고, 모든 첨가물을 갖는 배지 200 ㎕ 에 재현탁시켰다. 107세포당 15 ㎍ 의 플라스미드-DNA 를 첨가한후, 완전 배지를 사용하여 용적을 400 ㎕ 로 만들었다. 세포들을 바이오라드 진 펄서TM(Biorad Gene PulserTM) 에서 300 V, 960 ㎌ 의 전류 펄스를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 형질감염시킨 후, 첨가된 IL-5 를 함유하는 신선한 완전 배지에서 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 다음날 세포들을 1000 rpm 에서 5 분간 원심분리하고, IL-5 결핍 완전 배지를 사용하여 2 회 세척하였다. 세포를 IL-5 결핍 완전 배지에 재현탁시키고, 밤새 추가 배양하였다. 유도를 위해 세포들을 다시 원심분리하고, 인자 결핍 배지 60 ㎖ 에 재현탁시키고, 3 개의 조직 배양 플라스크에 균일하게 분할하였다. 하나의 플라스크의 세포들을 유도하지 않고, 루시페라제 분석 때까지 인자 결핍 배지에 유지하면서(음성 대조), 다른 두 개의 플라스크에 약 1000 단위/㎖ 의 IL-5 또는 IL-3 와 혼합하였다. 37 ℃에서 8 시간 배양한 후, 세포들을 원심분리하고, PBS 로 세척한 후, 500 ㎕ 의 용균/분석 완충용액 (25 mM 트리신, 0.5 mM EDTA, 0.54 mM 나트륨 트리폴리포스페이트, 6.5 mM DTT, 16.3 mM MgSO47H2O, 0.1 % 트리톤 X-100, 1.2 mM ATP, 0.05 mM 루시페린; pH 7.8)에 용해시켰다. 이중 400 ㎕ 를 광도계 루마트 9501 (베르톨드(Berthold))에서 20 ㎕ 의 루시페린 (1 mM) 을 첨가하여 측정하였다. 실험 결과는 제 3 도에서 알 수 있으며, 이는 두 센서 구성체, PBHluc1.3 및 pBHfosluci 가 IL-5 에 의해 10 배 이상 유도될 수 있음을 나타내었다. IL-3 를 이용한 세포들의 자극은 또한 내생성 IL-3 수용체를 통한 두 센서 구성체의 유도를 초래한다.
b) FDC-P1 세포에서 수용체 자극에 의한 pBHluc1.3 의 유도
세포주 FDC-P1 (Dexter et al., 1980) 을 RPMI 1640 배지(Gibco) 에서 a) 에서 1H3 세포용으로 기재된 것과 동일한 첨가물을 사용하여 배양하였지만, IL-5 대신 약 500 단위/㎖ 의 IL-3 를 첨가하였다. 약 4×107세포들을 a) 에 기재된 바와 같이 107세포당 15 ㎍ 의 pBHluc1.3 DNA 를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 형질감염시키고, 배양한 후, IL-3 결핍 배지에서 유지하였다. 세포들을 4 개의 조직 배양 플라스크간에 균일하게 분할하였다. 한 플라스크의 세포들을 루시페라제 분석이 행해질 때까지 인자 결핍 배지에 유지시키고(음성 대조), 다른 세 개의 플라스크는 약 1000 단위/㎖ 의 IL-5, IL-3 또는 GM-CSF 로 처리하였다. 약 8 시간 배양한 후, a) 에 기재된 방법으로 루시페라제 분석을 수행하였다. 실험 결과를 제 4 도에서 알 수 있다. 센서 DNA pBHluc1.3 은 IL-5 수용체의 β-서브유니트만을 발현하는 반면 리간드 결합 α-서브유니트가 부재하는 FDC-P1 세포에서 IL-S 에 의해서는 유도될 수 없다. 반대로, 세포의 IL-3 또는 GM-CSF 처리는 1H3 세포에서와 같이 존재하는 내생성 IL-3 및 GM-CSF 수용체를 자극함으로써 센서 DNA 의 유도를 초래한다.
c) TF-1-세포에서 수용체 자극에 의한 pBHfosluci 의 유도
세포주 TF-1 을 37 ℃ 에서 5 % CO2중의 1 ng/㎖ 의 IL-3 를 첨가한 10 % 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(FCS)을 갖는 RPMI 1640 배지(Gibco)에서 배양하였다. 형질감염체당 약 3×107세포를 1000 rpm 에서 5 분간 원심분리하고, 모든 첨가물을 갖는 200 ㎕ 의 배지에 재현탁시켰다. 15 ㎍/107세포의 플라스미드-DNA 를 첨가한 후, 용량을 완전 배지로 400 ㎕ 로 만들었다. 세포들을 바이오라드 진 펄서TM에서 280 V, 980 ㎌ 의 전류 펄스를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 형질감염시킨 후, IL-3 가 첨가된 신선한 완전 배지에서 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 다음날 세포들을 1000 rpm 에서 5 분간 원심분리하고, IL-3 결핍 완전 배지를 사용하여 2 회 세척하였다. 세포를 인자 결핍 완전 배지에서 재현탁시키고, 밤새 추가 배양하였다. 유도를 위해 세포들을 다시 한 번 원심분리하고, 인자 결핍 배지 60 ㎖ 에 재현탁시키고, 4 개의 조직 배양 플라스크에 균일하게 분할하였다. 하나의 플라스크에 있는 세포들을 유도하지 않고, 루시페라제 분석 때까지 인자 결핍 배지에 유지하는 반면(음성 대조), 다른 세 개의 플라스크는 약 10 ng/㎖ 의 IL-5 또는 1 ng/㎖ 의 IL-3 또는 100 ng/㎖ 의 GM-CSF 와 혼합하였다. 37 ℃ 에서 8 시간 배양한 후, 세포들을 원심분리하고, PBS 로 세척한 후, 500 ㎕ 의 용균/분석 완충용액 (25 mM 트리신, 0.5 mM EDTA, 0.54 mM 나트륨 트리폴리포스페이트, 6.5 mM DTT, 16.3 mM MgSO47H2O, 0,1 % 트리톤 X-100, 1.2 mM ATP, 0.05 mM 루시페린; pH 7.8)에 용해시켰다. 이중 400 ㎕ 를 광도계 루마트 9501 (베르톨드)에서 20 ㎕ 의 루시페린 (1 mM) 을 첨가하여 측정하였다. 실험 결과를 제 5 도에서 알 수 있으며, 이는 센서 구성체 pBHfosluci 가 IL-5 에 의해, 또한 IL-3 및 GM-CSF 에 의해 유도될 수 있음을 증명한다.
d) 수용체 자극에 의한 TF-1-세포의 증식 유도
IL-5 수용체를 발현하는 TF-1-세포들이 수용체의 아고니스트적으로 작용하는 물질로의 자극 후 증식함을 보여주기 위하여, 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 접종하였다. 두 개의 플레이트에 웰당 2 % FCS 를 함유하는 100 ㎕ 의 RPMI 1640 배지에 약 3×107개의 세포들로 접종하였다. 각 플레이트에서 세 개의 배치를 IL-5 없이 배양하고(음성 대조), 세 개의 배치를 각각 0.001 %, 0.01 % 및 0.1 % 의 재조합 사람 IL-5 와 혼합하였다, 1μCi 의 [6-3H] 티미딘(아머샴(Amersham)) 을 48 시간의 배양 시간 후 첫 번째 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37 ℃ 에서 72 시간 배양 후 두 번째 플레이트의 웰에 첨가한 후, 그후 배양을 추가로 12 시간 동안계속하였다. 플레이트를 -20 ℃ 에서 저장한후, 팩커드 필터메이트 세포 수획기 및 탑카운트 마이크로플레이트 섬광계수기를 사용하여 티미딘의 도입량을 측정하였다. 그 결과는 제 6 도에 도시되어 있다. 최고 농도의 IL-5 (0.1 %)에서는, 티미딘 도입량이 IL-5 결핍 배지의 대조 세포들의 값에 비해, 48 시간 배양 후에는 8.1 배, 및 72 시간 후에는 8.7 배에 이르렀다.
참조문헌
서열 데이타
(1) 일반적인 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 명칭 : 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
(B) 거리 : 포스트파흐 200
(C) 도시 : 인겔하임 암 라인
(E) 국명 : 독일연방공화국
(F) 우편 번호 : 55216
(G) 전화 번호 : 06132/772282
(H) 팩스 번호 : 06132/774377
(ⅱ) 출원의 명칭 : 인터루킨-5-수용체-의존성 세포 시그날 전달 경로에 대한 조절 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법
(ⅲ) 서열수 : 2
(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 데이타 운반체 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 조작 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release ＃l.0, 버전 ＃1.25(EPA)
(1) SEQ ID NO: 1 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜드 형태 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 유형 : cDNA
(ⅲ) 안티센스 : 없음
(ix) 특성 :
(A) 명칭/코드 : 5'UTR
(B) 위치 : 1..21
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO:1 :
TCGGCTACCA TGGTGCCTGT G 21
(2) SEQ ID NO:2 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 24 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜드 형태 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 분자 유형 : cDNA
(ⅲ) 안티센스 : 없음
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키 : 5'UTR
(B) 위치 : 1..24
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO:2 :
ATGGCAAAAT GCCATCAAAA CGTG 24

Claims (28)

  1. a) 리포터 유전자 및 인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로의 하나 또는 그 이상의 제 2 메신저 물질의 농도 변화에 반응하는 조절 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환되어 리포터 유전자의 발현이 메신저 물질의 농도 변화에 의해 조절되고, 추가로
    b) 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현하는,
    포유동물 세포를 시험 물질과 함께 배양하고,
    리포터 유전자 생성물의 농도를 측정하고, 물질을 추가로 인터루킨-5 수용체 이외의 대조 수용체를 발현하며 리포터 유전자 및 대조 수용체 매개된 시그날 전달 경로의 제 2 메신저 물질의 농도 변화에 반응하는 조절 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환된 포유동물 대조 세포에 대해 동일한 조건하에 적용시킴으로써, 시험 물질에 대해 확인된 활성이 인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대해 선택적인지 여부를 조사하고, 인터루킨-5 수용체를 발현하는 세포에서의 리포터 유전자 생성물의 농도를 대조 세포에서의 농도와 비교함으로써, 인터루킨-5 수용체의 활성화에 의해 유발되는 시그날 전달 경로의 성분에 대한 물질의 조절 효과를 결정함을 특징으로 하여, 사람 또는 동물 세포에서 수용체-매개된 시그날 전달 경로에 대한 물질의 조절 효과를 결정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 인터루킨-5 를 또한 세포에 적용시킴으로써 시험 물질을인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 그의 길항적 효과에 대해 조사함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 기능성 인터루킨-5 수용체를 천연적으로 발현하는 세포를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 인터루킨-5 수용체의 β-서브유니트만을 천연적으로 발현하며 인터루킨-5 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환된 세포를 사용하여, 세포가 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 인터루킨-5 수용체의 α-서브유니트를 암호화하는 서열 및 β-서브유니트를 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환된 세포를 사용하여, 세포가 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, α-서브유니트를 암호화하는 DNA 서열 및 β-서브유니트를 암호화하는 DNA 서열이 두 개의 별개의 플라스미드 상에 존재함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 기능성 사람 인터루킨-5 수용체를 발현함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 기능성 뮤린 인터루킨-5 수용체를 발현함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 그의 α-서브유니트 및 β-서브유니트가 상이한 종으로부터 유래된 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, α-서브유니트가 사람 기원임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 에서 정의된 재조합 DNA 가 조절 서열로서 c-fos-유전자의 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 에서 정의된 재조합 DNA 가 조절 서열로서 ICAM-1-유전자의 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 에서 정의된 재조합 DNA 가 리포터 유전자로서 루시페라제 유전자를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 2 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 기능성 인터루킨-5 수용체 및 다른 성장 인자에 대한 수용체를 발현하며, 그들의 증식이 적어도 이들 수용체들 중의 하나에 대한 리간드의 존재에 대해 의존적인 세포를, 한편으로는 그 자체의 인터루킨-5 와 함께 배양하고 다른 한편으로는 시험 물질 및 인터루킨-5 와 함께 배양하여 두 세포 배양물의 증식을 비교함으로써, 시험 물질을 그의 길항 활성에 대해 조사함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인터루킨-5 수용체 매개된 시그날 전달 경로에 대한 물질의 조절 효과의 선택성을, 물질을 인터루킨-5 수용체 이외의 대조 수용체를 발현하며 a) 에서 정의된 재조합 DNA(그의 조절 서열은 인터루킨-5 수용체 매개된 신호 전달 경로의 제 2 메신저 물질의 농도에 있어서의 모든 변화 뿐만 아니라 대조 수용체-의존성 신호 전달 경로의 농도에 있어서의 모든 변화에 반응한다)로 형질전환된 포유동물 대조 세포에 대해 동일한 조건하에서 적용시키고, 인터루킨-5 수용체를 발현하는 세포에서의 리포터 유전자 생성물의 농도를 대조 세포에서의 농도와 비교함으로써 시험함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 대조 수용체가 인터루킨-3 수용체임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 a) 에서 정의된 재조합 DNA 로 형질전환되고 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현하지 않는 포유동물 세포를 시험 물질과 함께 동일한 조건하에서 배양하고 리포터 유전자 생성물의 농도를 측정함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 시험 물질이 정해진 조건하에서 정해진 수의 포유동물 세포와 함께 배양하는 다수의 물질 중의 하나이며, 리포터 유전자 생성물의 농도를 측정하여, 인터루킨-5 의존성 시그날 전달 경로에 대한 물질의 선택성을 체크하는 스크리닝 분석으로 사용함을 특징으로 하는 방법.
  19. a) 리포터 유전자 및 인터루킨-5 수용체-의존성 시그날 전달 경로의 하나 또는 그 이상의 제 2 메신저 물질의 농도 변화에 반응하는 조절 서열을 함유하는 재조합 DNA 에 의해 형질전환되며,
    b) 인터루킨-5 수용체의 α-서브유니트 또는 α- 및 β-서브유니트를 암호화하는 재조합 DNA 로 형질전환되어, 기능성 인터루킨-5 수용체를 발현함을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  20. 제 19 항에 있어서, 사람 세포임을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  21. 제 19 항에 있어서, 뮤린 세포임을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서, 천연적으로 인터루킨-5 수용체의 β-서브유니트만을 발현하고 α-서브유니트를 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환됨을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  23. 제 22 항에 있어서, α-서브유니트가 다른 종으로부터 유래됨을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  24. 제 22 항에 있어서, 사람 α-서브유니트를 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환됨을 특징으로 하는 사람 세포.
  25. 제 22 항에 있어서, 뮤린 α-서브유니트를 암호화하는 서열을 함유하는 재조합 DNA 로 형질전환됨을 특징으로 하는 뮤린 세포.
  26. 제 19 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 에서 정의된 재조합 DNA 가 조절 서열로서 c-fos-유전자의 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  27. 제 19 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 에서 정의된 재조합 DNA 가 조절 서열로서 ICAM-1-유전자의 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  28. 제 19 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 에서 정의된 재조합 DNA 가 리포터 유전자로서 루시페라제 유전자를 함유함을 특징으로 하는 포유동물 세포.
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