FI111016B - Menetelmä seuloa aineita, jotka moduloivat interleukiini-5-reseptorista riippuvaa signaalin välitysreittiä soluissa - Google Patents

Description

111016

Menetelmä seuloa aineita, jotka moduloivat interleukiini- t. 5-reseptorista riippuvaa signaalin välitysreittiä soluis sa. - Förfarande för utvälja ämnen, vilka modulerar en av interleukin-5-receptor beroende signals förbindelseled i 5 celler.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä, jonka avulla voidaan löytää farmakologisesti vaikuttavia aineita määrittämällä aineiden moduloiva vaikutus interleukiini-5-resepto-10 rista riippuvaan signaalin välitysreittiin ihmis- tai eläin-soluissa.

Perinnäisillä nk. "radioliganditesteillä", joissa aineesta tutkitaan, kykeneekö se syrjäyttämään reseptoriin sitoutu-15 neen ligandin ja joita käytetään farmakologisesti vaikuttavien aineiden löytämiseen, voidaan tunnistaa vain sellaisia aineita, jotka vaikuttavat tunnettujen ligandien sitoutumiseen reseptoreiden sitoutumiskohtiin. Näiden testien avulla ei voida erottaa, onko sitoutuvalla aineella agonistinen tai 20 antagonistinen vaikutus.

Korkeampien eukaryoottisten solujen systeemit, jotka välittävät signaalin membraanin yli, perustuvat usein seuraaviin . membraaneihin sitoutuneisiin komponentteihin: 25 a) solupinnan reseptori, joka mahdollisesti voi muodostua useammasta alayksiköstä; b) guaniini-nukleotidiin sitoutuva ja GTP:a pilkkova sääte-lyproteiini, josta käytetään nimitystä G-proteiini ja 30 joka voi olla kytkeytynyt sekä reseptoriin että sen • * efektoriin; c) nk. "efektorit", jotka usein muuttavat esimerkiksi ioni-kanavan sekundääristen lähettimolekyylien, kuten cAMP:n, DAG:n, IP3:n jne. tai adenylaattisyklaasien, guanylaat- 35 tisyklaasien tai fosfolipaasien konsentraatiota; ja/tai d) erilaiset kinaasit.

111016 2

Solupinnan reseptorit tunnistavat ohittavat ligandit lukuisista solunulkoisista ärsykkeistä. Ligandien sitoutuminen reseptoreihin aktivoi signaalikaskadin. G-proteiiniin kytkeytyneiden reseptoreiden, joiden signaalin välitysreitti on 5 selvitetty suhteellisen hyvin ja jotka välittävät hyvin erilaisten solunulkoisten signaalien vaikutuksia, tapauksessa tämä alkaa heterotrimeerisen G-proteiinin aktivoitumisella.

10 Pienimolekyyliset sekundääriset lähettiaineet ("Second

Messengers"), kuten cAMP (syklinen AMP), jonka adenylaat-tisyklaasin aktivoituminen laukaisee, cGMP (syklinen GMP), jonka guanylaattisyklaasin aktivoiminen laukaisee, tai inositoli-1,4,5-trifosfaatti (IP3) ja diasyyliglyseriini 15 (DAG), jotka fosfolipaasien, kuten fosfolipaasi C:n aktivoituminen tai hydrolaasien osallistuessa fosfolipaasi D:n aktivoituminen (Billah et ai., 1989) laukaisevat, saavat taas aikaan solunsisäisiä muutoksia, mm. proteiinien selektiivisen fosforyloitumisen proteiinikinaasien aktivoitumisen 20 vaikutuksesta (esimerkiksi IP3/DAG:n vaikutuksesta PKC, cAMP:n vaikutuksesta PKA) määrättyjen geenien transkription säätelyyn kohdistuvan vaikutuksen ja lisääntymisen. (Anta-gonistisesti vaikuttava aine voi estää kokonaan tai osittain agonistisesti vaikuttavan aineen aiheuttaman vuorovaikutuk- t 25 sen ja näin aikaansaadun sekundäärisen lähettiaineen kon-sentraation muutoksen tai se voi itse saada aikaan käänteisen funktionaalisen vaikutuksen.) Solut voivat kommunikoida keskenään tämän signaalin välityssysteemin kautta ja koordinoida kehittymistään tai laukaisemiaan vaikutuksia.

30 » ” Koska yksi ainoa reseptoreiden alatyyppi (mahdollisesti samassa solussa tai eri soluissa) voi kytkeytyä useampaan kuin yhteen efektoriin ja monet reseptoreiden alatyypit voivat aktivoida samoja efektoreita, voi muodostua monimut-35 kaisia signaalin välitysverkostoja. Reseptoreiden aktivoitu- .. misen seurauksena signaalin välityskaskadin yhteydessä aktivoituvat transkriptiofaktorit (esimerkiksi CREB-prot.e:: -

WOW

3 ni, AP1-proteiini) toimivat vuorovaikutuksessa DNA-säätely-elementtien kanssa. Näistä esimerkkejä ovat CRE (CRE-ele-mentti, "cAMP responsive element") tai TRE (TRE = "TPA responsive 5 element"; TPA = forboli-12-myristaatti-13-asetaatti = forbo-liesteri), jotka sitovat CREB:n tai AP1:n: monet geenit, joiden transkriptiota säätelee cAMP (esimerkiksi rottien somatostatiini, ihmisen α-gonadotropiini, c-Fos), sisältävät 5'-sivustalla konservoituneen sekvenssin säätelyelementtinä. 10 CRE-sekvenssi on sama tai samankaltainen kuin palindrominen oktameeri TGACGTCA (Montminy et ai., 1990). TRE-elementit sisältävät erittäin samankaltaisen heptameerisen TGAGTCA-motiivin, joka eroaa CRE-elementin konsenssisekvenssistä vain yhden ainoan nukleotidin osalta (Deutsch et ai., 1988). 15 TRE-motiivi tai erittäin samankaltaisia motiiveja on tunnistettu monissa geeneissä, joiden transkription aktivoi forbo-liesteri (Angel et ai., 1987a ja b; Lee et ai., 1987). Ympäröivät DNA-sekvenssit tai proteiinien väliset vuorovaikutukset muiden faktoreiden kanssa määrittävät mm. konkreet-20 tiset säätelytapahtumat jossakin tietyssä geenissä.

Muita DNA-säätelyelementtejä ovat nk. "SRE-elementit", jotka reagoivat seerumifaktoreihin ("serum responsive element"; Treisman, 1985). SRE-elementtejä ovat indusoitavia cis-25 elementtejä, jotka muodostuvat 20 emäsparista, joilla on dyadinen symmetrinen rakenne. SRE-elementit reagoivat erilaisiin kasvutekijöihin; lyhyesti kerrottakoon, että SRE on ratkaiseva, kun erilaiset sytokiinit saavat aikaan c-fos-induktion (Hatakeyama et ai., 1989). Glukokortikoidien - ; 30 konsentraation muutokseen reagoivista motiiveista käytetään nimitystä "GRE-elementit" (Yamamoto, 1985; Scheidereit et ai., 1986; Jantzen et ai., 1987; Strähle et ai., 1987).

Signaalin välitysreittien monimutkaisuuden johdosta sig-35 naalin välitysreittien, esimerkiksi signaalin adenylaattisyklaasivälitysreitin ja fosfolipaasi C-väli- » tysreitin, välillä voi esiintyä nk. "ylikuulumista". "Yli- 111016 4 kuulumisella" ymmärretään ilmiötä, jossa yhteen efektorisys-teemiin kohdistuva vaikutus saa aikaan myös toiseen kohdistuvan vaikutuksen (Sassone-Corsi et ai., 1990; Houslay, 1991). Ylikuulumisilmiötä käytetään fysiologisesti signaali-5 en yhdistämiseen tai signaalien verkostamiseen niin, että signaalit on mahdollista saattaa redundanssitilaan tai erilaisten signaalin välitysreittien kommunikointi on mahdollista.

10 Ylikuulumista voi tapahtua signaalin välitysreitin eri tasoilla. Solujen patologisten muutosten eräs mahdollinen syy on näiden vuorovaikutusten häiriintyminen, esimerkiksi, kun jollakin määrätyllä reseptorilla ei ole fysiologisessa mielessä oikea vuorovaikutus efektorisysteemin kanssa.

15

Niihin reseptoreihin, jotka eivät ole kytkeytyneitä G-prote-iineihin, kuuluvat sytokiini-reseptorit. Näiden otaksutaan olevan kytkeytyneitä useampiin signaalin transduktioreittei-hin, jotka taas ovat osittain päällekkäisiä eri reseptorei-20 den kanssa niin, että solun sisällä tapahtuu moninkertaista ylikuulumista.

Sytokiineilla on tärkeä osuus immuuni- ja tulehdusreaktioiden koordinoinnissa (lymfokiinit ja monokiinit), virusinfek-25 tioiden torjunnassa (interferonit) ja hematopoeesissa ("colony-stimulating factors", CSF). Ne säätelevät lukuisten solujen lisääntymistä, erilaistumista ja toimintaa hemato-poeettisten, lymfoidisten ja muiden elinsysteemeiden sisällä. Jokainen yksittäinen sytokiini kohdistaa vaikutuksensa . 30 erilaisiin solutyyppeihin, ja yksittäiset solut reagoivat usein useampaan sytokiiniin niin, että sytokiinejä tuottavat solut ja solut, joita sytokiinit säätelevät, muodostavat monimutkaisen solunsisäisen verkoston, jossa sytokiinit vaikuttavat synergistisesti tai toistensa vastaisesti.

35 Sytokiinin aktiivisuus on mm. seuraus lukuisista erityyppi-• sistä solutyypeistä, jotka ekspressoivat sytokiinin spesifi

siä reseptoreita. Interleukiini-3 (IL-3) ja GM-CSF

111016 5 (Granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor) ovat esimerkkejä peiotrooppisista tekijöistä, jotka stimuloivat multipotentteja hematopoeettisia soluja sekä koko joukkoa hematopoeettisten linjojen esisoluja. Sitä vastoin inter-5 leukiini-5:n (IL-5) vaikutusalue on verrattomasti kapeampi. Se vaikuttaa ennen kaikkea eosinofiilisiin esisoluihin (Miyajima et ai., 1992).

Proteiinirakenteen analysointi on osoittanut, että kaikki 10 sytokiinireseptorit ovat membraaniin sitoutuneita glykopro-teiineja, jotka muodostuvat ekstrasellulaarisesta N-ter-minaalisesta alueesta, yhdestä transmembraani-alueesta ja sytoplasma-alueesta. Ekstrasellulaarisilla alueilla on joukko yhteisiä rakennekomponentteja, joiden perusteella 15 sytokiinireseptorit voidaan luokitella useiksi reseptoriper-heiksi, joiden jäsenet oletettavasti ovat lähtöisin yhteisistä edeltajägeeneistä (Gillis, 1991). IL-5-reseptorigeeni kuuluu hematopoetiini-reseptorigeeniperheeseen. Tämän perheen jäsenet sisältävät tunnusomaisia konservoituneita 20 kysteiiniryhmiä, joita esiintyy yksittäisinä tai monikopioi-sina ekstrasellulaarisissa alueissa. Näiden lisäksi ne sisältävät tryptofaani-seriini-X-tryptofaani-seriini-motii-vin (jossa X voi olla mikä tahansa mielivaltainen aminohappo), joka sijaitsee usein ekstrasellulaarisessa alueessa 25 lähellä transmembraanialuetta. Tämän perheen reseptoreissa on lisäksi tyypin 3 fibronektiinin sitoutumismotiivin yksittäisiä kopioita tai useita kopioita hajallaan koko ekst-rasellulaarisella alueella (Gillis, 1991).

, 30 Hemapoteiini-reseptori-perheeseen kuuluvat IL-5-reseptorin > * (molemmat alayksiköt) lisäksi myös IL-3:n, IL-6:n ja GM-CSF:n molemmat alayksiköt, IL-4-, IL-7-, erytropoietiini-(EPO) ja LIF- ("leukemia inhibitory factor")-reseptorit, IL-2-reseptorin β-alayksikkö sekä "kasvuhormonin" (GH), 35 prolaktiinin ja G-CSF:n reseptorit.

» IL-5-reseptori muodostuu yhdestä α-alayksiköstä, joka sisäl- 111016 6 tää spesifisen sytokiinin sitoutumisalueen, ja yhdestä β-alayksiköstä, joka osaltaan vaikuttaa IL-5:n reseptorin korkean affiniteetin muodostumiseen ja joka on välttämätön signaalin transduktiolle. IL-5-reseptorin ihmisen (Tavernier 5 et ai., 1991; Murata et ai., 1992) ja hiiren (Takaki et ai., 1990) α-alayksikköä sekä ihmisen (Tavernier et ai., 1991) ja hiiren (Devos et ai., 1991; Takaki et ai., 1991) β-alayksik-köä koodaavat DNA:t on kloonattu. IL-5:n, IL-3:n ja GM-CSF:n reseptoreilla on identtinen β-alayksikkö (Kitamura et ai., 10 1991; Tavernier et ai., 1991). Kun solussa ekspressoituu näistä kolmesta reseptorista useampi kuin yksi, reseptori-tasolla voi siten sytokiinien välillä esiintyä "ylikuulumista".

15 Päinvastoin kuin kasvutekijöiden, kuten EGF:n tai PDGFrn reseptorit sytokiini-reseptoreiden alayksiköt eivät lainkaan sisällä sisäistä tyrosiinikinaasi-aktiivisuutta. Kuitenkin on osoitettu, että IL-5-, IL-3- tai GM-CSF-reseptorin stimuloiminen kyseisillä ligandeilla indusoi tiettyjen solupro-20 teiinien nopean tyrosiinifosforyloitumisen (Koyasu et ai., 1987; Isfort et ai., 1988; Moria et ai., 1988; Murata et ai., 1990). Identifioitu tyrosiinikinaasi liittyy reseptorin β-alayksikköön GM-CSF:lla stimuloimisen jälkeen (Hanazono et al·., 1993). Muita, GM-CSF:lla indusoidun signaalin välityk-25 seen liittyviä tapahtumia ovat p21ras:n (Satoh et ai., 1991, 1992) ja c-raf:n (Carroll et ai., 1990) aktivoituminen, kun taas IL-3:11a indusoidulle signaalin transduktiolle on osoitettu p21ras:n (Carroll et ai., 1990) aktivoitumisen lisäksi myös proteiinikinaasi C:n aktivoituminen (Whetton et , 30 ai., 1988) ja MAP ("mitogen-activated protein")-kinaasin — fosforyloituminen (Welham ja Schrader, 1992). Toistaiseksi ei vielä kuitenkaan tunneta näiden tapahtumien tarkkaa järjestystä koko signaalin transduktiokaskadissa.

35 Vielä ei ole tunnistettu pääosaa geeneistä, jotka syto- kiinireseptoreiden stimuloinnin jälkeen indusoituvat signaalin transduktiokoneiston komponenttien kautta. Siten myös 111016 7 tiedetään vähän säätelyelementeistä tällaisten geenien promoottoreissa. Esimerkiksi IL-6-reseptorin stimulointi aktivoi spesifisen DNA-sitoutumisproteiinin, NF-IL-6:n, joka sitoutumalla 6-interleukiiniin reagoiviin elementteihin 5 kohdegeenin promoottorialueella saa aikaan geenin ekspres-soitumisen ja siten IL-6:sta riippuvan biologisen vaikutuksen (Akira et ai., 1990). IL-2, IL-3 ja EPO indusoivat c-fos-proto-onkogeenin, joka sisältää promoottorialueella useita indusoituvia sekvenssielementtejä (Verma ja Sassone-10 Corsi, 1987), jolloin sen induktioon ottaa osaa mm. c-fos-promoottorissa oleva SRE ("serum-response-element") (Hatakeyama et ai., 1989, 1992).

IL-5-reseptori aktivoituu, kun sen ligandi interleukiini-5 15 (IL-5) sitoutuu. IL-5 on peptidihormoni, jota tuottavat T- solut ja syöttösolut ja jolla on oleellinen tehtävä eo-sinofiilien lopullisessa erikoistumisessa.

Signaalin välitysreiteistä, jotka liittyvät IL-5-resepto-20 riin, tiedetään tuskin mitään. Eräiden, tähän mennessä tunnistamattomien soluproteiinien fosforyloitumisen lisäksi (Murata et ai., 1990) ei ole selvitetty mitään tapahtumia, jotka liittyvät IL-5-reseptorin stimuloinnin laukaisemaan signaalin transduktioon. Koska mainitulla kolmella syto-. ‘ 25 kiinilla, IL-5, IL-3 ja GM-CSF, on erilaiset biologiset tehtävät, on mahdollista, että kaikille kolmelle reseptorille yhteisen β-alayksikön lisäksi myös reseptoreiden syto-kiinispesifisillä α-alayksiköillä on osuus solunsisäisten signaalireittien indusoinnissa, erityisesti sytokiini-30 spesifisten signaalien välityksen ja toimintojen indusoin- « · nissa (Tominaga et ai., 1992). IL-3-reseptorin tai GM-CSF-reseptorin aktivoimisen laukaisemien välitystapahtumista koskevista tiedoista ei sen vuoksi voi vetää mitään yksiselitteisiä johtopäätöksiä IL-5-reseptoriin kytkeytyneistä 35 signaaliteistä. Koska myöskään ei ole identifioitu geenejä, . jotka indusoituvat IL-5-reseptorin stimuloimisen jälkeen, mitään ei myöskään tiedetä säätelyelementeistä, joita on 111016 8 tällaisten geenien promoottorialueilla ja jotka reagoivat IL-5-reseptorin aktivoimisen käynnistämiin signaalin väli-tysreitteihin.

5 IL-5-reseptoreiden aktivoituminen sen ligandien sitoutumisen kautta on yhdistetty erilaisiin sairauksiin, jotka liittyvät eosinofiileihin, so. eosinofiilien lisääntymiseen veressä. Näihin lukeutuvat autoimmuunisairaudet, siirrosteiden hylkiminen, allergiset sairaudet, määrätyt parasiittisairaudet ja 10 astmaattiset sairaudet. Tähän mennessä tällaisten sairauksien syyperäiseen hoitoon esitettyjää ehdotuksia ovat toisaalta IL-5-reseptorin liukoisen α-alayksikön antaminen antagonistina (EP-A 0 492 214) ja toisaalta antagonistien tai agonistien rationaalinen suunnittelu lähtemällä IL-5:n 15 kiderakenteesta (Milburn et ai., 1993).

Viime aikoina on kehitetty seulontamenetelmiä, joiden avulla on mahdollista löytää patologisten tilojen hoitamiseen tarkoitettuja lääkeaineita, jotka ovat spesifisiä määrätylle 20 reseptorityypille tai reseptorin alatyypille ja jotka sen vuoksi vaikuttavat spesifisesti reseptorista riippuvaan signaalin välitysreittiin. Nämä menetelmät perustuvat siihen periaatteeseen, että geenien ekspression avulla voidaan osoittaa aineiden moduloiva vaikutus reseptorista riippuvaan ' 25 signaalin välitysreittiin:

King'in et ai., 1990, kuvaama määritysmenetelmä perustuu signaalin välitysreitin vaikutukseen, jossa käytetään hyväksi Saccharomyces cerevisiae-hiivan G-proteiiniin kytkettyjä 30 feromoni-reseptoreita. Menetelmässä mitataan kolorimetrises- s, * ti hiivasolussa reaktio agonistisesti vaikuttavan yhdisteen sitoutumiseen hiivasoluun transfektoituun reseptoriin.

Montmayeur ja Borelli, 1991, ovat kuvanneet menetelmän, joka 35 perustuu G-proteiiniin kytkettyjen reseptoreiden (käytetään D2-reseptoreita ja β-adrenergiinistä reseptoria) aktivoinnin aiheuttamaan signaalin adenylaattisyklaasivälitysreitin 111016 9 vaikutukseen.

Himmler et ai., 1993, ovat kehittäneet funktionaalisen testin, jossa mitataan raportointigeenin transkriptionaali-5 sen aktivoitumisen kautta reseptoreiden (ihmisen dopamiini D1- ja D5-reseptorit) kytkemisen aktiivisuus signaalin cAMP-välitysreittiin.

Tähän mennessä tunnetut määritysmenetelmät rajoittuvat 10 sellaisten geenien ekspression mittaamiseen, joita säätelee cAMP:n, joka on G-proteiiniin kytkettyjen reseptoreiden signaalin välitysreitin yksi lähettiaine, konsentraatio.

Sitä vastoin esillä olevan keksinnön tavoitteena oli tuoda 15 esiin seulontamenetelmä, jolla voidaan tunnistaa aineita, jotka moduloivat IL-5-reseptorista riippuvaa signaalin välitysreittiä, jonka mekanismista ja lähettiaineista tiedetään erittäin vähän. Esillä olevan keksinnön avulla oli tarkoitus tuoda erityisesti esiin menetelmä, joka sopii 20 automatisoimiseen ja siten aineiden nopeaan seulomiseen ja joka mahdollistaa myös monimutkaisten aineseosten, kuten organismien uutteiden, tutkimisen farmakologisesti vaikuttavien aineiden suhteen.

25 Aineiden identifiointikykynsä avulla moduloida IL-5-resepto-rista riippuvaa signaalin välitysreittiä, erityisesti IL-5-reseptoreiden antagonistien, muodostaa lähtökohdan sellaisten lääkeaineiden kehittämiselle, joita voidaan käyttää hoidettaessa sairauksia, joihin liittyy IL-5-resep-30 torin modulaatio, usein aktivoituminen.

• «

Esillä olevan keksinnön puitteissa voitiin osoittaa, että IL-5-reseptorin aktivointi sen ligandien sitoutumisen jälkeen indusoi raportointigeenikonstruktin soluissa, jotka 35 ekspressoivat IL-5-reseptorin toimimiseen tarvittavat rakenne-elementit sekä IL-5-reseptorista riippuvat signaalin välitysreitin komponentit (tällaisista soluista käytetään 111016 10 jäljempänä yksinkertaisuuden vuoksi nimitystä "solut, jotka ekspressoivat funktionaalisen IL-5-reseptorin") ja jotka on transformoitu DNA-säätelyelementeillä sisältävällä rapor-tointigeenikonstruktilla.

5 IL-5-reseptorista riippuvan signaalin välitysreitin vähäisestä tietämyksestä johtuen tämä tulos oli yllättävää, varsinkin, kun myöskään ei ollut mahdollista edeltäkäsin sanoa, reagoisiko jokin tähän mennessä karakterisoiduista 10 DNA-säätelyelementeistä IL-5-reseptorin käynnistämään signaalin välitysreitin lähettlaineeseen.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä määrittää jonkin aineen moduloiva vaikutus reseptorista riippuvaan 15 signaalin välityreittiin ihmis- tai eläinsoluissa. Menetelmälle on tunnusomaista, että aineen moduloiva vaikutus signaalin välitysreitin, joka on laukaistu aktivoimalla IL- 5-reseptori, komponenttiin määritetään siten, että nisä-kässoluja, 20 a) jotka on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, joka sisältää raportointigeenin ja säätelysekvenssin, joka reagoi yhden tai useamman, IL-5-reseptoriin kytketyn signaalin välitysreitin sekundäärisen lähettiaineen konsentraation muutokseen niin, että välittäjäaineen konsentraation muutos 25 moduloi raportointigeenin ekspressiota, ja b) jotka lisäksi ekspressoivat funktionaalisen interleukii-ni-5-reseptorin, inkuboidaan testattavan aineen kanssa, mitataan raportointi- geenituotteen konsentraatio ja tutkitaan, onko testattavan . . 30 aineen havaittu vaikutus selektiivinen IL-5-reseptorista * ·* riippuvalle signaalin välitysreitille.

Määritelmään "interleukiini-5-reseptorista riippuva signaalin välitysreitti" sisältyy esillä olevan keksinnön puit-35 teissä myös interleukiini-5-reseptorista riippuva signaalin välitysmekanismi, joka mahdollisesti muodostuu useammasta * kuin yhdestä signaalin valitysreitista.

111016 11 Määritelmään "signaalin välitysreitin komponentti" sisältyvät kaikki signaalin välitysreitin mekanismiin osallistuvat molekyylit, mukaanlukien itse IL-5-reseptori tai sen alayksiköt .

5

Kun etsitään IL-5:sta riippuvan signaalin välitysreitin inhibiittoreita, testattavista aineista tutkitaan niiden antagonistinen vaikutus siten, että niitä tuodaan soluihin yhdessä IL-5:n kanssa, jolloin IL-5 yleensä tuodaan soluihin 10 samanaikaisesti testattavan aineen kanssa tai sen jälkeen.

Rekombinantti-DNArsta, joka reagoi sekundäärisen lähettlaineen muutokseen ja joka myös on esillä olevan keksinnön kohteena, käytetään jäljempänä nimitystä "sensori-DNA".

15 Raportointigeeni määritellään siten, että sen ekspressointi-tuote voidaan detektoida ja sen määrä voidaan mitata signaalin avulla, joka on suhteellinen sen konsentratioon.

Soluista, jotka on transformoitu sensori-DNA: 11a ja jotka 20 ekspressoivat IL-5-reseptorin, käytetään jäljempänä nimitystä "testisolut"; myös nämä solut ovat esillä olevan keksinnön kohteena.

"IL-5-reseptorilla" ymmärretään esillä olevan keksinnön ‘ 25 puitteissa funktionaalista IL-5-reseptoria, jolloin tähän määritelmään sisältyvät myös mahdollisesti läsnäolevat IL-5-reseptorin alatyypit. "Funktionaalisella reseptorilla" ymmärretään esillä olevan keksinnön puitteissa toisaalta luonnonmukaista IL-5-reseptoria, joka muodostuu saman lajin 30 a- ja β-alayksiköstä, edelleen testisoluissa, erityisesti i, ihmissoluissa, eri lajien IL-5-reseptoreiden a- ja β-alayk- siköiden toimintakykyisistä yhdistelmistä, esimerkiksi ihmisreseptorin α-alayksiköstä ja hiirireseptorin β-alayksiköstä tai päinvastoin. Tämän määritelmän mielessä reseptori 35 on funktionaalinen myös silloin, kun se on solussa, jossa β-alayksikkö on luonnonmukaisesti integroitu toisen resepto-'· rin, esimerkiksi IL-3- tai GM-CSF-reseptorin a-alayksikön 111016 12 kanssa, kun soluun viedään IL-5-reseptorin α-alayksikkö ja ekspressoidaan, jolloin myös tässä tapauksessa a-alayksikkö voi olla peräisin toisesta lajista, mikäli kummankin alayksikön toiminnallinen yhteisvaikutus tekee mahdolliseksi 5 signaalin transduktioreitin laukaisemisen.

Rekombinantti-DNA:sta, joka sisältää yhden tai useamman IL- 5-reseptorin alayksikköä koodaavan sekvenssin, käytetään jäljempänä nimitystä "reseptori-DNA".

10

Testisolujen valmistamisen lähtösoluiksi sopivat solut, jotka jo sisältävät endogeenisesti täydellisen funktionaalisen IL-5-reseptorin, mutta myös solut, jotka sisältävät reseptoriin kytketyn signaalin transduktioreitin sensori-15 DNA:n indusoinnille välttämättömät komponentit. Tällaisten solujen sopivuuden kannalta ei ole välttämätöntä, että ne ekspressoivat täydellisen IL-5-reseptorin tai edes toisen sen alayksiköistä. Kun toinen tai molemmat alayksiköt puuttuvat, solut voidaan transformoida sensori-DNA:n lisäksi 20 myös reseptorin puuttuvaa alayksikköä tai puuttuvia alayksiköitä koodaavalla sekvenssillä.

Esillä olevan keksinnön eräässä suoritusmuodossa testisolu on peräisin solusta, joka luonnonmukaisesti ekspressoi 25 funktionaalisen IL-5-reseptorin tarvitsemat alayksiköt.

Esillä olevan keksinnön toisessa suoritusmuodossa testisolu on peräisin lähtösolusta, joka ekspressoi vain β-alayksikön. Tässä tapauksessa solu transformoidaan sensori-DNA:n lisäksi 30 plasmidilla, joka sisältää IL-5-reseptorin a-alayksikköä « ·'· koodaavan DNA-sekvenssin.

Eräässä toisessa keksinnön suoritusmuodossa lähtösolu ei sisällä testisolulle luonnonmukaisesti IL-5-reseptorin a-35 eikä β-alayksikköä. Tässä tapauksessa solut on transformoitava kummallakin DNA-sekvenssillä, jotka voivat olla yhdessä ·. . samassa tai myös eri plasmideissa.

111016 13

Kun aineista on tarkoitus tutkia niiden farmakologinen vaikutus ihmisen patologisten tilojen hoitamista varten, reseptori-DNA sisältää ensisijaisesti ihmisen IL-5-resepto-ria koodaavan sekvenssin. (Keksinnön mukaista menetelmää 5 käytetään mieluummin sellaisten aineiden löytämiseen, jotka sopivat ihmisen patologisten tilojen hoitamiseen. Sitä voidaan kuitenkin käyttää myös sellaisten aineiden seulomiseen, joita käytetään eläinten hoitamiseen; tässä tapauksessa käytetään vastaavaa eläinperäistä IL-5-reseptoria.) 10

Testisolujen valmistamiseen tarkoitetut solut valitaan ensisijaisesti sen perusteella, että niillä on voimakas raportointigeenin ekspressio sen jälkeen, kun niitä on stimuloitu aineilla, jotka IL-5-reseptorista riippuen nosta-15 vat sekundääristen lähettiaineiden konsentraatiota. Tämä tutkitaan tarkoituksenmukaisesti siten, että solut, jotka ekspressoivat funktionaalisen IL-5-reseptorin, transformoidaan väliaikaisesti sensori-DNA:11a ja määritetään rapor-tointituotteen konsentraatio sen jälkeen, kun reseptori on 20 stimuloitu IL-5:lla.

Testisolujen lähtösoluina kysymykseen tulevat erityisesti solut, joista tiedetään, että ne ekspressoivat IL-5-resepto-rin tai β-alayksikön sisältävän reseptorin, tai solut, 25 joiden alkuperän tai organismissa tapahtuvan toiminnan perusteella voidaan olettaa, että ne ekspressoivat jonkin puheena olevan reseptorin, erityisesti hematopoeettiset esisolut. Reseptoreiden ekspressio voidaan todeta mahdollisesti sitoutumismääritysten ja/tai lisääntymismääritysten 30 avulla, joissa määritetään solujen kasvu kyseisten ligandien * (IL-5, IL-3 tai GM-CSF) läsnäollessa.

Sopivista lähtösoluista esimerkkejä ovat luuydinsoluista etabloidut, faktoreista riippuvat solulinjat; esimerkiksi 35 Dexter et ai., 1980, on kuvannut hiirisoluille tällaisten solulinjojen, jotka ekspressoivat β-alayksikön, valmistami-sen. Esillä olevan keksinnön puitteissa transfektoitiin 111016 14 yhden tällaisen hiirisolulinjan edustaja hiiren IL-5-resep-torin α-alayksiköllä ja käytettiin testisoluina. Toinen esimerkki sopivista testisoluista ovat IL-5:sta riippuvat hematopoeettiset solut, esimerkiksi Kitamura'n et ai., 1989 5 ja 1991 kuvaaman solulinjan TF-1 solut.

Soluissa, joissa kummatkin alayksiköt ovat hiiriperäisiä, esimerkiksi hiirisolulinjassa 1H3, voidaan a- ja mahdollisesti myös β-alayksikkö kytkeä pois esimerkiksi homologisen 10 rekombinaation avulla ja korvata vastaavalla ihmissekvens-sillä.

Lähtösoluina tulevat kysymykseen periaatteessa minkä tahansa lajin nisäkässolut, jolloin mieluummin käytetään ihmissolu-15 ja. Käytettäessä muita kuin ihmissoluja käytetään mieluummin sellaisia soluja, jotka on transformoitu ihmisen IL-5-resep-tori-DNA:lla (β- ja/tai α-alayksikkö).

Toinen edellytys solun sopivuudelle testisoluksi esillä 20 olevan keksinnön puitteissa on sen stabiilisuus. Solujen stabiilisuuden (elinkyky, vieras-DNA:n stabiili integrointi genomiin) testaamista varten testisoluilla suoritetaan pidemmän ajan kuluessa identtisissä olosuhteissa kokeita ja tutkitaan mittaustulosten toistettavuutta.

' 25

Sensori-DNA on ensisijaisesti plasmidissa, joka voidaan monistaa suurella kopioluvulla sopivassa isäntäorganismissa, esimerkiksi E. coli'ssa, ja joka mahdollistaa raportointi-geenin ekspression säätelyelementtien kontrollin alaisena 30 isäntäsoluissa transfektoinnin ja isäntägenomiin integroin-nin jälkeen. Tällöin on kysymys mieluummin sukkulavektoris-ta, joka sisältää raportointigeenin (sensori-DNA) ekspres-sointikasetin ja selektointikykyisen markkerin nisäkässo-luille sekä ainakin yhden replikaation alkukohdan ja markke-35 rin lisääntymiselle ja selektoinnille E. coli'ssa.

Pysyvien solulinjojen, jotka sisältävät genomiinsa stabii- 111016 15 listi integroituneena sensori-DNA: n, valmistamista varten vektori sisältää dominantin selektointimarkkerin. Jonkin määrätyn selektointimarkkerin käyttö ei ole kriittistä. Sopivia ovat esimerkiksi neomysiini-fosfotransferaasi (neo)-5 geeni, joka antaa vastustuskyvyn genetisiini-antibiootille (G-418) (Southern ja Berg, 1982), DHFR-vajaille soluille DHFR-geeni (dihydrofolaattireduktaasi), ksantiini-guaniini-fosforiribosyylitransferääsi (gpt)-geeni, joka antaa vastustuskyvyn mykofenolihappoa vastaan (Mulligan ja Berg, 1981) 10 tai hygromysiini-B-fosfotransferaasi-geeni (hph; Gritz ja Davies, 1983). Promoottoreista, jotka ohjaavat selektointi-markkeri-geeniä, esimerkkejä ovat SV40-Early-promoottori, sytomegalovirus-promoottori (CMV-promoottori), Herpes simplex-viruksen tymidiini-kinaasi-geenin promoottori (TK-15 promoottori), Rous'n Sarcoma-viruksen (RSV) pitkä terminaalinen toistosekvenssi (LTR). Plasmidit rakennetaan ensisijaisesti siten, että yksittäiset tärkeät elementit, kuten raportointigeeni, raportointigeenin promoottori, selektointimarkkerin säätelysekvenssit, voidaan vaihtaa tai muuttaa 20 yksinkertaisesti niin, että voidaan sopeutua muuttuneisiin vaatimuksiin, jotka aiheutuvat kyseisestä käytöstä, esimerkiksi toisen solulinjan käyttämisestä. Tällaisia toimenpiteitä ovat esimerkiksi se, että promoottorin tai promootto-reiden tai raportointigeenin eteen rakennetaan multi-... 25 kloonauskohtia, jotta olisi mahdollista kloonata promootto ria moduloivia säätelysekvenssejä tai erilaisia raportointi-geenejä.

Sopivaa raportointigeeniä valittaessa lähdettiin siitä, että 30 käyttöön saatu menetelmä olisi ensisijaisesti ei-radioaktii-vinen, automatisoitava ja hyvin herkkä.

Esillä olevan keksinnön puitteissa voidaan käyttää periaatteessa kaikkia raportointigeenejä, jotka täyttävät nämä 35 edellytykset: . Alkalinen fosfataasi voidaan mitata suurella herkkyydellä 111016 16 käytettäessä kemiluminoivaa substraattia, mutta sen haittana tosin on, että monet nisäkässolut ekspressoivat tämän entsyymin suhteellisen voimakkaasti. Raportointigeeneinä tulevat sen vuoksi kysymykseen yleisesti vain sellaiset solulin-5 jät, jotka eivät ekspressoi tätä tai ekspressoivat vain heikosti.

β-galaktosidaasi- ja β-glukuronidaasi-geenin ekspressointi-tuotteet voidaan lohkaista vastaavaksi metyyliumbeliferyyli-10 galaktosidiksi tai -glukuroniksi, jolloin muodostuu fluoresoivia ryhmiä. Näitä entsyymireaktioita voidaan seurata etabloitujen fluoresenssimenetelmien avulla (Wieland et ai., 1985; Kricka, 1988).

15 Kloramfenikoli-asetyylitransferaasin (CAT) ekspressointi on tosin osoitettavissa suhteellisen herkästi, mutta menetelmällä on kuitenkin mm. se haitta, että se on radioaktiivinen ja vaikeasti automatisoitavissa (Hartmann, 1991).

20 Esillä olevan keksinnön puitteissa käytetään raportointi-geeninä mieluummin Photinus pyralis-lusiferaasia koodaavaa geeniä (De Wet et ai., 1987). Tällä enstyymillä on se etu, että ATP:a lisättäessä se muodostaa lusiferiini-substraat-tinsa kanssa korkealla saannolla bioluminenssia, joka voi-25 daan mitata etabloitujen, automatisoitavissa olevien menetelmien avulla, ja että nisäkässolut eivät tuota tätä entsyymiä endogeenisesti. Lisäksi lusiferaasilla on suhteellisen lyhyt in vivo puoliintumisaika eikä se myöskään ole toksinen suurissa konsentraatioissa (Hartmann, 1991; Brasier 30 et ai., 1989).

«

Sensori-DNA:a rakennettaessa laitetaan raportointigeeni sellaisten promoottoreiden kontrollin alle, jotka sisältävät moduloitavia säätelyelementtejä, kuten TR- ja/tai CRE-35 ja/tai SRE- ja/tai GRE-elementtejä. Koska IL-5-reseptorin signaalin transduktioteitä ei tunneta tarkkaan yksityiskohtaisesti, parhaiten sopivat sensori-DNA-konstruktiot määri- 111016 17 tetään empiirisesti esikokeissa. Tätä varten solu, joka ekspressoi funktionaalisen IL-5-reseptorin, transformoidaan väliaikaisesti erilaisilla sensori-DNA-konstrukteilla, jolloin vaihtelu tapahtuu toisaalta raportointigeenin ja 5 toisaalta kontrollisekvenssien suhteen. Raportointigeeni-tuotteista tutkitaan sen herkkyys siten, että raportointi-geeni-tuotteen konsentraatio mitataan sen jälkeen, kun reseptoria on stimuloitu agonistilla, ensisijaisesti IL-5:lla. Sensori-DNA:n säätelysekvensseiksi sopivat kaikki 10 DNA-elementit, joiden avulla voidaan promoottorit aktivoida, esimerkiksi elementit, jotka on valittu joukosta, johon kuuluvat TRE, CRE, GRE tai SRE, tai myös sellaiset elementit, jotka sisältävät näiden erilaisten elementtien yhdistelmän. Tällaisella, kaksi tai useampia erilaisia elementte-15 jä sisältävällä sensori-DNA: 11a voidaan selvittää yksitellen useampien signaalin transduktioreittien aktivoituminen tai myös useampien signaalin transduktioreittien rinnakkainen aktivoituminen. Testisolua kehitettäessä pyritään sensori-DNA: n valinnalla siihen, että raportointigeeni voidaan 20 indusoida mahdollisimman voimakkaasti annetussa solusystee-missä. DNA-säätelyalue voi olla luonnossa esiintyvä promoottorialue, mutta se voidaan valmistaa myös keinotekoisesti.

Mahdollisesti käytetään usealla sekundäärisellä lähettäjäai-25 neella indusoitavissa olevan geenin täydellistä promoottoria, esimerkiksi ICAM-1-geenin (intrasellulaarinen adheesiomolekyyli 1) tai c-fos-geenin 5'-säätelysekvenssiä. Luonnonmukaisesta, IL-5-reseptorin aktivoimiseen reagoivasta promoottorista, joka sisältää useita säätelyelementtejä, 30 esimerkiksi ICAM-1-promoottorista (Voraberger et ai.), joka sisältää mm. TRE-, NKKB-, SP1- ja AP2-elementit, tai c-fos-promoottorista (Hipskind und Nordheim, 1991), joka CRE- ja SRE-elementtien lisäksi sisältää mm. nimillä "SIF-E-element-ti" ja "AP·]-kaltainen elementti" kutsuttuja säätelysekvens-35 sejä, voidaan tämän jälkeen tutkia, mikä sen elementeistä aiheuttaa aktivoinnin. Tätä varten voidaan toimia niin, että aktivoitavuus tutkitaan keinotekoisista promoottorisekvens- 111016 18 seistä, joissa on luonnonmukaiseen promoottoriin verrattuna erilaisia mutaatioita ja/tai deleetioita. Tällaisten tutkimusten tulosten perusteella voidaan promoottoria haluttaessa optimoida edelleen siten, että esimerkiksi ratkaisevaksi 5 identifioitua elementtiä tai elementtejä voidaan käyttää monikertakopioina.

Tunnettuja luonnonmukaisia tai synteettisiä promoottoreita on mahdollista modifioida siten, että ne lyhennetään pro-10 moottorin toiminnan vaatimaan minimisekvenssiin.

Rakennettaessa sensori-DNA:a, jossa raportointigeeniä ohjaa ei-luonnonmukainen promoottori, heikkojen promoottoriele-menttien eteen laitetaan tarkoituksenmukaisesti yksi tai 15 useampi elementti, esimerkiksi TRE- ja/tai CRE- ja/tai SRE-ja/tai GER-säätelyelementti, joka moduloi promoottoria. Kontrollisekvenssit, jotka sopivat ekspressointiin määrätyissä nisäkässoluissa, ovat tuttuja ammattimiehille; valinta voi aluksi tapahtua asianomaisen kirjallisuuden perus-20 teella (esim. Landschulz et ai., 1988, Turner ja Tjian, 1989). Karsiminen tai optimointi voidaan tehdä käyttämällä edellä annettuja, yksinkertaisesti suoritettavissa olevia väliaikaisia transfektointikokeita. Sopivista promoottoreista esimerkkejä ovat β-globiini-promoottori ja TK-promootto-25 ri.

Kun valitaan sensori-DNA:n sisältämä säätelysekvenssi (mukaanlukien sen sivustasekvenssit), lähdetään kirjallisuudesta tunnetuista elementeistä (esim. TRE- ja CRE-elementeille 30 Montminy et ai., 1990; Deutsch et ai., 1988), joista esiko-keissa tutkitaan annetussa solusysteemissä niiden sopivuus raportointigeenin herkästi osoitettavissa olevan indusoita-vuuden suhteen. Sopivista TRE-elementeistä, mukaanlukien niiden sivustasekvenssit, esimerkkejä ovat seuraavien sek-35 venssit: somatostatiini, "vasoactive intestinal peptide", ; sytomegaloviruksen tehostussekvenssi, BLV LTR (naudan leuke- « miavirus-Long Terminal Repeat) (CRE-elementit) tai ICAM-' 111016 19 kollagenaasi, paratyroidihormoni (TRE-elementit). Mikäli luonnonmukaisten sekvenssien sisältämillä motiiveilla ei ole täydellistä konsensussekvenssiä, ne voidaan muuttaa vaihtamalla yksi tai useampi nukleotidi, mikäli tämä on tarpeen 5 tai toivottavaa, samoin kuin myös viereiset sekvenssit.

Säätelyelementit ja niiden sivustasekvenssit voidaan valmistaa synteettisesti tai ne voivat olla alkuperältään luonnonmukaisia.

10

Sekundäärisen lähettiaineen moduloivaa vaikutusta raportoin-tigeenin ekspressioon voidaan vahvistaa käyttämällä mahdollisesti konstruktiota, joka sisältää peräkkäin useampia, homologisia tai heterologisia, säätelysekvenssejä. Konstruk-15 tion yksittäisiä elementtejä järjestettäessä valitaan elementtien keskinäinen etäisyys siten, että transkriptiofakto-rin sitoutuminen elementteihin on mahdollista. Säätelyele-menttien optimaalinen etäisyys toisistaan, jolloin tätä määritettäessä on otettava huomioon myös steerisyys, selvi-20 tetään empiirisesti esikokeissa, mahdollisesti myös etäisyys muihin DNA-säätelyelementteihin, jotka vaikuttavat transkriptioon, esimerkiksi etäisyys TATA-boksista. Kun säätelysekvenssejä on useita, elementit ja/tai sivustasekvenssit voivat olla identtisiä tai ne voivat olla ainakin osittain 25 erilaisia. Tandem-konstruktiossa on jälkimmäinen suoritusmuoto suositeltava.

Säätelyelementin sivustasekvensseinä, joista on todettu, että myös ne vaikuttavat elementtien säätelyominaisuuksiin, 30 käytetään mieluummin, erityisesti niiden välittömässä ympäristössä, sekvenssejä, joita käytetään kyseisen säätelyelementin ympärillä luonnonmukaisesti (Montiminy et ai., 1990; Deutsch et ai., 1988). Sekvenssi tai sen sijoitus saadaan selville empiirisesti.

35 ; Sensori-DNA:n elementit ja selektointiin käytetty markkeri- geeni ovat mahdollisesti kahdessa erillisessä plasmidissa.

111016 20 joista toinen sisältää raportointigeenikonstruktin (mukaanlukien ekspressoinnin kontrollisekvenssin, joka sisältää säätelysekvenssin) ja toinen sisältää selektointimarkkeri-geenikonstruktin. (Sopivista selektointimarkkerigeeni-5 konstrukteista esimerkkejä ovat plasmidit (pRSVneo, pSV2neo, pRSVgpt, pSV2gpt, joiden rakenne käy ilmi asianmukaisista käsikirjoista, esimerkiksi "Cloning Vectors"). Siinä tapauksessa, että käytetään erillisiä plasmideja, solut ko-trans-fektoidaan kummallakin plasmidilla ja selektoidaan markkerin 10 suhteen. Selektointimarkkerin läsnäolosta voidaan päätellä, että solu sisältää myös raportointigeenikonstruktin, koska tiedetään, että kahden geenin, jotka ovat fyysisesti toisiinsa liittymättömissä DNA-segmenteissä, ko-transformointi usein johtaa kummankin ko-transformoidun geenin ekspressoi-15 miseen (Winnacker, 1985).

Mitä taas tulee testausmenetelmässä käytettävään mittaustapaan, on tarkoituksenmukaista optimoida mittaussignaalin maksimaalisen muutoksen ja normaaliarvon välinen suhde, 20 ensisijaisesti muuttamalla sensori-DNA:n konstruktiota, esimerkiksi tekemällä rakenteellinen muutos promoottorin sijaintiin. Taustasignaali on mieluummin niin alhainen, että raportointigeenin ekspressio voidaan todeta suurella herkkyydellä, mutta toisaalta niin korkea, että voidaan määrit-25 tää määritysraja negatiivikontrolleille.

Reseptori-DNA-konstruktiota koskevat periaatteessa samat näkökohdat kuin sensori-DNA-konstruktia, sillä erolla, että reseptorisekvenssi (-sekvenssit) laitetaan mieluummin voi-30 makkaan, konstitutiivisen promoottorin kontrollin alaiseksi. Reseptori-DNA voidaan saada tavanomaisten molekyylibiologisten menetelmien avulla, esimerkiksi siten, että solujen, jotka ekspressoivat IL-5-reseptorin, RNA-preparaatista preparoidaan käänteis-transkriptaasi-PCR-menetelmän avulla 35 cDNA, alukkeet rakennetaan julkaistun sekvenssin (sekvenssien) perusteella, ja kloonataan sopivaan vektoriin. cDNA * voidaan myös monistaa PCR-menetelmän avulla cDNA-kirjastos- 111016 21 ta.

Myös reseptori-DNA:n tapauksessa reseptori-alayksikköä koodaava sekvenssi ja dominoiva selektointimarkkeri ovat 5 mahdollisesti eri plasmideissa, joilla solut ko-transformoi-daan.

Solujen transfektointi sensori- tai reseptori-DNA:11a tehdään tavanomaisilla transfektointimenetelmillä (vrt. esim.

10 Potter et ai. 1984; Feigner et ai., 1987). Mieluummin käytetään elektroporaatio-, kalsiumfosfaatti-saostus- tai lipo-fektointimenetelmiä.

Jotta testattavan aineen selektiivisyys IL-5-reseptorin 15 suhteen voitaisiin kontrolloida, valmistetaan tarkoituksenmukaisesti muita kontrollikokeita varten testisoluja erilaisille muille reseptoreille ja käsitellään tällä aineella.

Kun aine saa vaikuttaa spesifisesti vain IL-5-reseptoriin, kuten asianlaita yleensä on lääkeaineen spesifisyyden huo-20 mioonottaen, aine saa moduloida vain tätä yhtä reseptoria.

Kontrollireseptori voi olla periaatteessa kontrollisoluissa mukana joko endogeenisesti tai muutoin soluun transformoitu na. Jos IL-5-reseptorin testisoluun käytettyä sensori-DNA:a 25 indusoi mitattavasti myös tämän reseptorin stimulointi agonistilla, esimerkiksi IL-5:lla, IL-5-reseptorin testisolu sopii kontrollisoluksi, kun kontrollireseptoria koodaava sekvenssi on mukana endogeenisesti tai on lisäksi transformoitu soluun. (Kontrollireseptoreilla ymmärretään myös 30 sellaisia reseptoreita, joilla on yhteinen β-alayksikkö . IL-5-reseptorin kanssa, esimerkiksi IL-3-reseptoria). Myös tässä tapauksessa voidaan kontrollisoluina käyttää soluja, jotka sisältävät tämän sensori-DNA:n ja kontrollireseptorin, mutta ei kuitenkaan IL-5-reseptoria. Jos sitä vastoin kont-35 rollireseptorin stimulointi ei indusoi IL-5-reseptorin . testisolulle käytettyä sensori-DNA:a, sopiva sensori-DNA on määritettävä empiirisesti, jolloin lähdetään kirjallisuudes- 111016 22 ta tunnetuista elementeistä (kts. esim. Montminy et ai., 1990; Deutsch et ai., 1988), joista esikokeissa tutkitaan annetussa solusysteemissä niiden sopivuus raportointigeenin herkästi osoitettavissa olevaan indusoitavuuteen. Sen jäi— 5 keen sensori-DNA voidaan yhdessä kontrollireseptoria koodaa-van sekvenssin kanssa, mikäli tämä ei ole mukana endogeeni-sesti, transformoida soluun.

aineen moduloivan vaikutuksen selektiivisyys interleukiini-10 5-reseptorista riippuvaan signaalin välitysreittiin tutkitaan ensisijaisesti siten, että sitä tuodaan identtisissä olosuhteissa kontrollisoluille, jotka ekspressoivat kontrol-lireseptorin ja jotka on transformoitu sensori-DNA; 11a, jonka säätelysekvenssi ei reagoi interleukiini-5-reseptoriin 15 vaan kontrolli-reseptorin aktivoitumiseen, ja että rapor- tointigeenituotteen konsentraatiota interleukiini-5-resepto-rin ekspressoivissa soluissa verrataan konsentraa-tioon kontrollisoluissa.

20 Sen jälkeen, kun solut on transformoitu reseptori-DNA; 11a, positiivisista klooneista tutkitaan reseptorin ekspressoin-tivoimakkuus esimerkiksi sitoutumismääritysten avulla, joissa käytetään tunnettuja radioaktiivisesti leimattuja agonisteja ja antagonisteja.

25

Reseptoreiden määrä molekyyleissä solua kohti voidaan määrittää Scatchard-blottien avulla (Human Pharmacology, 1991).

Stabiileista, reseptori-DNA:a sisältävistä transformanteista 30 valitaan mieluummin klooni, jolla on reseptoriluku, joka vastaa mahdollisimman hyvin fysiologista reseptoreiden konsentraatiota. (Jos reseptoriluku on liian korkea, voi käydä niin, että kytkeytyminen on epätäydellistä ja mahdollisesti epäspesifistä tai että spesifisen kytkeytymisen 35 lisäksi tapahtuu epäspesifistä kytkeytymistä, jolloin mukana aktivoituu mahdollisesti muita efektorisysteemejä. Jos 1 - reseptoriluku on liian alhainen, signaali on mahdollises^i 111016 23 liian alhainen, jotta se voitaisiin todeta mittaamalla).

"Moduloivalla" vaikutuksella ymmärretään agonistista tai antagonistista vaikutusta IL-5-reseptorista riippuvaan 5 signaalin välitysreittiin.

Aineista, joilla testimenetelmässä on osoittautunut olevan IL-5-reseptorista riippuvan raportointigeenin ekspressiota inhiboiva vaikutus, voidaan testata toisessa vaiheessa, 10 inhiboivatko ne IL-5:sta riippuvaa solujen lisääntymistä. Tällaisessa menetelmässä määritetään aineen solujen lisääntymistä inhiboiva vaikutus siten, että soluja, jotka muiden kasvutekijöiden reseptoreiden lisäksi ekspressoivat funktionaalista IL-5-reseptoria ja joiden kasvu riippuu IL-5:n 15 läsnäollessa vähintään yhden tällaisen reseptorin ligandis-ta, esimerkiksi IL-5:sta, inkuboidaan yksinään 5-inter-leukiinin kanssa sekä toisessa erässä lL-5:n ja testattavan aineen kanssa ja mitataan kummankin panoksen lisääntyminen.

20 Tällaisiin lisääntymismäärityksiin on valittavissa suuri joukko menetelmiä. Ne voidaan esimerkiksi tehdä 96-kaivoisissa mikrotiitterilevyissä ja ovat automatisoitavissa yksinkertaisella tavalla. Tällaisista menetelmistä esimerkkejä ovat määritykset, jotka perustuvat [3H]-tymidiinin tai 25 bromidesoksiuridiinin(BrdUrd) sisäänoton mittaamiseen (BrdUrd:n sisäänotto mitataan esimerkiksi fluoresenssileima-tun anti-BrdUrd-vasta-aineen sitoutumisen avulla).

Lisääntymismääritysten toinen perustyyppi perustuu väriai- 30 neiden, jotka solun entsyymit muodostavat reagoimalla sopi- vien substraattien kanssa, mittaamiseen. Eräs tälle pohjalle kehitetty menetelmä on kaupallisesti saatavissa oleva tet- ratsoliumsuola-menetelmä (MTT-menetelmä), jossa mitataan spektrofotometrisesti formatsaani-värin konsentraatio, joka 35 on muodostunut dehydrogenaasin reagoidessa tetratsolinium- . suolan kanssa. Lisääntymismäärityksessä käytetyistä soluista * ’ esimerkkejä ovat IL-5:sta riippuvat hematopoeettiset solut.

111016 24 esimerkiksi Kitamura'n et ai., 1989 ja 1991, kuvaaman solu-linjan TF-1 solut.

Aineet, joiden potentiaalinen farmakologinen vaikutus tutki-5 taan keksinnön mukaisen menetelmän avulla, ovat luonnonmukaisia tai synteettisiä aineita, jolloin voidaan käyttää puhtaita aineita tai aineiden seoksia (esimerkiksi kasviuutteita, fermentaatioliuoksia jne.). Puhtaista aineista erityisen mielenkiintoisia ovat geenimolekyyliset synteettiset 10 orgaaniset yhdisteet. Niihin aineisiin, jotka on tarkoitus selvittää seulontojen avulla, lukeutuvat periaatteessa aineet, jotka sitoutuvat reseptoreiden ligandien sitoutumiskohtiin, allosteerisesti vaikuttavat aineet sekä aineet, jotka eivät kilpaile ligandien sitoutumiskohdista. Nämä 15 aineet voivat olla luonteeltaan peptidimäisiä tai ei-pepti-dimäisiä.

Aineet laitetaan soluihin tarkoituksenmukaisesti sarjalai-mennoksina, jotta voitaisiin selvittää suurin mahdollinen 20 konsentraatioalue. Inkubointiaika määritetään empiirisesti siten, että esimerkiksi käsitellään saadut testisolut tunnetuilla reseptori-agonisteilla ja määritetään ajankohta, josta lähtien raportointigeenin ekspression induktio voidaan mitata toistettavasti. Inkubointiaika säädetään yleensä 25 tähän ajankohtaan. Yleensä se on vähintään yksi tunti.

Solumäärä riippuu ennen kaikkea mittaussignaalin määritysra-jasta ja siitä kasvuvaiheesta, jossa solut ovat. Alarajan määrittää lisäksi tekninen mahdollisuus jakaa solut tasaisesti testattavaan aineeseen. Mikrotiitterilevyjä, joissa on 30 96 syvennystä, käytettäessä solumäärä on esimerkiksi noin 1000 - 100.000 solua testattavaa ainetta kohti, mutta se voi kuitenkin olla myös pienempi samalla, kun mittaussignaalin herkkyys on vastaava ja solut voidaan jakaa tarkasti. Kasvuvaihe, jossa soluja käytetään, riippuu lähtösolujen solutyy-35 piile spesifisistä ominaisuuksista ja lisäksi se määritetään ennen kaikkea kyseisen reseptorin avulla (eri reseptoreilla voi sama efektorisysteemi aktivoitua eri tavalla tai ~r: 111016 25 voimakkuudella riippuen kasvuvaiheesta); siten myös kasvuvaihe ja solumäärä selvitetään empiirisesti esikokeissa määrittämällä raportointigeenin ekspression kinetiikka eri kasvuvaiheessa olevissa esitesti- ja testisoluissa.

5

Esillä olevassa keksinnössä voitiin osoittaa, että solut, jotka ekspressoivat IL-5-reseptorin ja jotka oli transformoitu sensori-DNA:11a, reagoivat IL-5:n, joka on IL-5-resep-torin luonnonmukainen ligandi, lisäämiseen indusoimalla 10 raportointigeenin ekspressio. (Toisaalta testattiin myös hiirisoluja, jotka ekspressoivat luonnonmukaisesti β-alayk-sikön ja jotka lisäksi oli transformoitu a-alayksiköllä, sekä ihmissoluja, jotka ekspressoivat luonnonmukaisesti kummatkin funktionaalisen IL-5-reseptorin edellyttämät 15 yksiköt.) Käytetty sensori-DNA sisälsi säätelyelementtinä joko ihmisen ICAM-1-geenin 1,3 kb 5'-säätelyalueen, joka sisältää mm. TRE-elementin, tai ihmisen c-fos-geenin 0,756 kb 5' -säätelyalueen, joka sisältää mm. TRE-, CRE- ja SRE-elementin. Jos näitä soluja, jotka sisälsivät endogeenisiä 20 IL-3- ja GM-CSF-reseptoreita, stimuloitiin IL-3:lla tai GM-CSF:lla, voitiin samoin mitata raportointigeenin ekspression indusoituminen. Kontrollisoluissa, jotka olivat identtisiä edellä käytettyjen soluen kanssa lukuunottamatta IL-5-reseptorin α-alayksikön puuttumista (joka välittää ligandin · 25 sitoutumisen reseptoriin), voitiin myös indusoida raportoin tigeenin ekspressio käsittelemällä IL-3:11a tai GM-CSF:lla, mutta ei kuitenkaan IL-5:lla.

Esillä olevan keksinnön avulla saadaan käyttöön herkkä ja 30 monipuolinen funktionaalinen menetelmä, jolla voidaan löytää aineita, jotka vaikuttavat IL-5-reseptorista riippuvalla tavalla spesifisesti yhteen tai useampaan signaalin välitys-reittiin solussa. Keksinnön mukaisen menetelmän avulla selville saatuja aineita käytetään ohjeaineina kehitettäessä 35 sellaisten sairauksien hoitoon tarkoitettuja lääkeaineita, jotka liittyvät IL-5-reseptorin tai siihen kytkeytyneen signaalin välitysreitin virheelliseen toimintaan. Niistä 26 111016 voidaan lisäksi tutkia niiden farmakologiset ominaisuudet myöhemmin toisessa seulonnassa, esimerkiksi antagonistien tapauksessa lisääntymismäärityksessä käyttämällä solulinjoja tai primäärisoluja ja vasta sen jälkeen eläinkokeessa.

5 Tarvittavien eläinten lukumäärää voidaan sen vuoksi huomattavasti pienentää käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää.

Keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa lisäksi sen edun, että se voidaan automatisoida niin, että robotit peittävät solu-10 viljelyastiat, esimerkiksi 96-kaivoiset mikrotiitterilevyt, peittävät testattavan aineen liuoksilla, tekevät inkubointi-ja pesuvaiheet sekä suorittavat mittauksen, esimerkiksi luminometrin avulla, kun raportointigeenituotteena on lusi-feraasi. Keksinnön mukainen menetelmä sopii siten suurite-15 hoiseen seulontaohjelmaan, jossa voidaan testata esimerkiksi viikossa noin 2000 ainetta tai aineseosta.

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla on mahdollista tutkia allosteerisesti vaikuttavia aineita ja ligandien sitoutumis-20 kohtien suhteen ei-kilpailevia aineita.

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla on edelleen mahdollista kloonata reseptoreita, jotka ovat karakterisoidut farmakologisesti tai biokemiallisesti ja joiden ligandit tunnetaan.

' 25 Tällöin lähdetään cDNA- tai genomipankeista, joiden avulla transformoidaan vastaavat solulinjat. Reseptoreiden ekspres-sio osoitetaan raportointigeenin ekspression avulla sen jälkeen, kun ligandin sitoutuminen on aktivoinut reseptorin.

30 Piirustuksissa: * • · .

Kuvio 1: Sensori-DNA-plasmidi pBHlucl.3, joka sisältää ICAM-1-geenin promoottorialueen 35 Kuvio 2: Sensori-DNA-plasmidi pBHfosluci, joka sisältää c-fos-geenin promoottorialueen * 111016 27

Kuvio 3: pBHlucl.3:n ja pBHfosluci:n indusointi stimuloimalla reseptoreita lH3-soluissa

Kuvio 4: pBHlucl.3:n indusointi stimuloimalla reseptoreja 5 hiiren FDC-P1-soluissa

Kuvio 5: pBHluc1.3:n indusointi stimuloimalla reseptoreja ihmisen TF-1-soluissa 10 Kuvio 6: TF-1-solujen lisääntymisen indusointi stimuloimalla reseptoreja

Esimerkki 1 15 Raportointiplasmidien, joissa on sekundääristen lähettiai-neiden säätelemiä elementtejä (sensori-DNA), valmistaminen a) pBHlud.3-plasmidin rakentaminen 20 Solunsisäisen adheesiomolekyylin ICAM-1 ihmisgeenin 1,3 kb 5'-sivusta-alueen kloonaus ja deleetioanalyysi on antanut tulokseksi, että i) tämä fragmentti voidaan indusoida TPA:lla keuhkoadenoomakarsinooma-solulinjassa A549 (ATCC CCL 185), ja että ii) tämä fragmentti sisältää TRE-elementin 25 (TPA Response Element), jossa on DNA-sekvenssi TGATTCA, (Voraberger et ai., 1991). pBHlud.3-plasmidi (kuvio 1) sisältää ICAM-1-geenin 1,3 kb pitkän säätelyalueen, joka on kytketty lusiferaasigeenin eteen. Voraberger et ai., 1991, on kuvannut sen valmistamisen.

30 L b) pBHfosluci-plasmidin rakentaminen pBHfosluci-plasmidi sisältää lusiferaasigeenin ihmisen c-fos-geenin promoottorin kontrollin alaisena, erilaisia 35 säätelyelementtejä, esimerkiksi TRE, CRE ja SRE. Plasmidista pfosCAT (Schönthal et ai., 1988) eristettiin fragmentti, joka sisälsi c-fos-promoottorin (asemat -711 - +45) kloonat- 111016 28 tiin väliin pBluescriptSK-vektoriin (Stratagene) ja tähän konstruktioon insertoitiin lusiferaasi-geenin eteen pBHluc (Voraberger et ai., 1991).

5 Plasmidi pfosCAT (Schönthal et al·., 1988) pilkottiin Xbal:lla ja Hindlll:11a. Eristettiin c-fos-promoottorin sisältävä 756 bp fragmentti ja tämä ligitoitiin Xbal:lla ja Hindlll:11a pilkottuun pBluescriptSK-vektoriin. E.coli'n transformoinnin jälkeen saadulle plasmidille annettiin 10 nimeksi pBSfos. Plasmidi pBSfos pilkottiin Xbalrlla, plasmi-din DNA-päät tasattiin lisäämällä Klenow'in entsyymiä ja kaikkia neljää dNTP:a ja sen jälkeen pilkottiin Sällillä. Eristettiin c-fos-promoottorin sisältävä Salll/tasapäinen fragmentti. Plasmidi pBHluci(Voraberger et ai., 1991) pil-15 kottiin Hindlll:11a, DNA-päät tasattiin ja pilkottiin Sall:-11a. Näin pilkottu vektori ligitoitiin c-fos-promoottorin sisältävään Sali/tasapäiseen fragmenttiin. E. coli'ssa transformoinnin jälkeen saadulle plasmidille annettiin nimeksi pBHfosluci (kuvio 2).

20

Esimerkki 2

Reseptorin välittämä sensori-DNA:n indusointi 25 Sen osoittamiseksi, että soluissa, jotka ekspressoivat IL-5-reseptorin, sensori-DNA indusoituu agonistisesti vaikuttavalla aineella tapahtuvan reseptorin stimuloinnin jälkeen, sensori-DNA:11a (pBHluc1.3 tai pBHfosluci) transfektoitiin väliaikaisesti hiiren solulinjan ja ihmissolulinjan soluja: 30 ! Hiiren 1H3-soluja valmistettiin seuraavalla tavalla FDC-P1- soluista, joka on hiiren, luuydinsoluista etabloitu faktorista riippuva solulinja (Dexter et ai., 1980), transformoimalla hiiren IL-5-reseptorin α-alayksikön kanssa: hiiren IL-35 5-reseptorin α-alayksikköä (Takaki et ai., 1990) koodaava cDNA syntetisoitiin käänteistranskriptaasi-PCR-reaktiolla < : - (Frohman et ai., 1988) käyttämällä BCLl-solulinjasta, klooni 111016 29 5b1b (ATCC TIB 197), preparoitua RNA:a. Tähän käytetyt alukkeet olivat MF71 (SEQ ID NO:1) (5 'TCGGCTACCATGGTGCCTGTG3 ' ) ja MF73 (SEQ ID NO: 2)

(5'ATGGCAAAATGCCATCAAAACGTG3'); ne ovat reseptorin α-alayk-5 sikköä (Takaki et ai., 1990) koodaavan alueen sivustoilla. (Synteettiset oligodesoksiribonukleotidit on annettu sek-venssiprotokollassa "cDNA:na"). 1272 bp PCR-tuote kloonattiin edelleen pUC19-plasmidin (Pharmacia) Smal-pilkkomiskoh-taan. Koodaava sekvenssi pilkottiin pois BamHI:lla ja 10 EcoRI:lla ja insertoitiin ekspressointiplasmidiin pcDNAI

(Invitrogen), joka oli pilkottu samoilla entsyymeillä. 25 pg linearisoitua plasmidia transfektoitiin 4x107 FDC-Pl-soluis-sa elektroporaation avulla (300 V, 960 pF, BioRad Gene Pulser. IL-5-reseptorin ekspressoivat solut selektoitiin 15 hiiren IL-5:n suhteen rikastetussa RPMI-1640-alustassa.

Päinvastoin kuin FDC-Pl-solut, jotka ekspressoivat vain IL- 5-reseptorin β-alayksikön, 1H3-solut ekspressoivat sen vuoksi funktionaalisen IL-5-reseptorin (6- plus β-alayksik-20 kö). lH3-soluissa ja FDC-Pl-soluissa on endogeenisiä IL-3-ja GM-CSF-reseptoreita. β-alayksikkö on IL-5-, IL-3- ja GM-CSF-reseptoreissa identtinen.

Ihmissolulinja TF-1 etabloitiin erytroleukemiaisen potilaan ' , 25 luuydinsoluista Kitamura'n et ai., 1989, kuvaamalla tavalla.

Nämä solut ekspressoivat IL-5:n, IL-3:n ja GM-CSF:n funktionaalisia reseptoreita, ja niiden lisääntyminen, että kolmesta hematopoeettisesta kasvutekijästä mukana on ainakin yksi (Kitamura et ai, 1989, 1991).

30 • V. Yksi päivä sen jälkeen, kun 1H3- tai TF-1-solut oli trans- fektoitu sensori-DNA:11a, soluja pidettiin noin 12 tuntia faktoreita sisältämättömässä alustassa ja sen jälkeen käsiteltiin reseptorille spesifisellä ligandilla IL-5. 1H3-35 solujen negatiivisina kontrolleina tehtiin sama koe hiiren FDC-Pl-soluilla, jotka eivät ekspressoi lainkaan funktionaa- • - lista IL-5-reseptoria. Toisessa kontrollikokeessa IH3- 111016 30 FDC-Pl- tai TF-1-solut käsiteltiin IL-5:n asemesta IL-3:lla tai GM-CSF:11a.

a) pBHlucl1.3:n ja pBHfosluci:n indusointi stimuloimalla 5 reseptorilla 1H3-soluissa 1H3-solulinjaa, joka ekspressoi funktionaalisen IL-5-resep- torin, kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Gibco), joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua vasikansikiöseerumia (FCS) ja 10 1 % hiiren toonisuussublementtia (1M NaCl, 0,1M natriumpyru- vaatti, 11,3M monotioglyseriini), 37°C:ssa 5 % C02:ssa lisäämällä noin 500 yksikköä/ml 5-interleukiinia (hiiren rekom-binantti-IL-5). Transfektointia kohti erotettiin noin 3x1 O7 solua sentrifugoimalla 5 minuuttia 1000 k/min. ja solut 15 suspendoitiin uudelleen 200 pl:aan alustaa, joka sisälsi kaikki lisäaineet. Sen jälkeen, kun 107 solua oli lisätty 15 pg plasmidi-DNA:a, tilavuus täytettiin 400 pl:ksi täydellisellä alustalla. Solut transfektoitiin elektroporaation avulla BioRad Gene Pulser™-laitteella 300 V, 960 pF virta-20 pulssilla ja sen jälkeen niitä inkuboitiin uudessa, täydellisessä alustassa, johon oli lisätty IL-5:a, yön yli 37 °C :ssa. Seuraavana päivänä soluja sentrifugoitiin 5 minuuttia 1000 k/min. ja pestiin kaksi kertaa 5-interleukiinia sisältämättömällä täydellisellä alustalla. Solut suspendoi-! 25 tiin uudelleen 5-interleukiinia sisältämättömään täydelli seen alustaan ja inkuboitiin uudelleen yön yli. Solut sentrifugoitiin uudelleen indusointia varten, suspendoitiin uudelleen 60 ml:aan faktoria sisältämätöntä alustaa ja jaettiin tasaisesti kolmeen kudosviljelypulloon. Yhden 30 pullon soluja ei indusoitu ja niitä pidettiin lusife-i raasimääritykseen asti faktoria sisältämättömässä alustassa (negatiiviset kontrollit), kun taas molempiin muihin pulloihin lisättiin noin 1000 yksikköä/ml 5-interleukiinia tai 3-interleukiinia. Soluja inkuboitiin 8 tuntia 37°C:ssa, minkä 35 jälkeen ne erotettiin sentrifugoimalla, pestiin PBS:ssa ja

otettiin 500 pl:aan lyysaus/määritys-puskuria (25 mM trisii-. ni, 0,5 mM EDTA, 0,54 mM natriumtripolyfosfaatti, 6,5 mM

111016 31 DTT, 16,3 mM MgS04-7H20, 0,1 % Triton X-100, 1,2 mM ATP, 0,05 mM lusiferiini; pH 7,8. Tästä otettiin mittaukseen 400 μΐ, johon lisättiin 20 μΐ lusiferiinia (1 mM). Mittaus tehtiin Luminometer Lumat 9501 (Berthold)-mittarissa. Kokeen tulok-5 set on annettu kuviossa 3, joka osoittaa, että kummatkin sensuurikonstruktit, pBHlucl.3 ja pBHfosluci, voidaan indusoida 5-interleukiinilla yli 1 0-kertaisesti. Solujen stimulointi 3-interferonilla johtaa endogeenisten IL-3-reseptoreiden indusoinnin lisäksi kummankin sensori-10 konstruktin indusoitumiseen.

b) pBHlucl.3:n indusointi stimuloimalla reseptoria FDC-P1-soluissa

15 Solulinjaa FDC-P1 (Dexter et ai., 1980) viljeltiin RPMI

1640-alustassa (Gibco), johon oli lisätty samat aineet kuin mitä kohdassa a) on kuvattu IL-3-solujen yhteydessä, mutta IL-5:n asemesta lisättiin noin 500 yksikköä/ml 3-inter-leukiinia. Noin 4x107 solua transfektoitiin kohdassa a) 20 kuvatulla tavalla elektroporaation avulla käyttämällä 15 pg pBHlud.3-DNA:a 107 solua kohti, inkuboitiin ja pidettiin 3-interleukiinia sisältämättömässä alustassa. Solut jaettiin tasaisesti neljään kudosviljelypulloon. Yhden pullon soluja pidettiin lusiferaasimäärityksen suorittami-! 25 seen asti faktoria sisältämättömässä alustassa (negatiiviset kontrollit), kun taas kolme muuta käsiteltiin noin 1000 yksiköllä/ml IL-5:a, IL-3:a tai GMS-CSF:a. 8 tunnin inku-boinnin jälkeen tehtiin kohdassa a) kuvattu lusiferaasimää-ritys. Kokeen tulokset on annettu kuviossa 4. Sensori-DNA 30 pBHlucl.3 on FDC-Pl-soluissa, jotka ekspressoivat vain IL-5-1 reseptorin β-alayksikön, kun taas niitä ei voi indusoida IL-5:lla, koska ligandin sitova α-alayksikkö puuttuu. Sitä vastoin solujen käsittely IL-3:lla tai GM-CSF:lla saa aikaan sensori-DNA:n indusoinnin, koska 1H3-soluissa olevat endo-35 geeniset IL-3- ja GM-CSF-reseptorit stimuloituvat.

32 moi 6 c) pBHfosluci:n indusointi stimuloimalla reseptoria TF-1-soluissa

Solulinjaa TF-1 kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Gibco),

5 joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua vasikansikiöseerumia (FCS), 37°C:ssa 5 % C02:ssa lisäämällä 1 mg/ml 3-interleukii-nia. Transfektointiin erotettiin noin 3x107 solua sentrifu-goimalla 5 minuuttia 1000 k/min. ja suspendoitiin uudelleen 200 pl:aan alustaa, jossa oli kaikki lisäaineet. 107 solua 10 kohti lisättiin 15 pg plasmidi-DNA:a, minkä jälkeen tilavuus täytettiin 400 piiksi täydellisellä alustalla. Solut trans-fektoitiin elektroporaation avulla Biorad Gene Pulser™-laitteessa 280 V, 980 pF virtapulssilla ja sen jälkeen inkuboitiin 37°C:ssa yön yli uudessa, täydellisessä alustas-15 sa, johon oli lisätty 3-interleukiinia. Seuraavana päivänä soluja sentrifugoitiin 5 minuuttia 1000 k/min. ja pestiin kaksi kertaa 3-interleukiinia sisältämättömällä täydellisellä alustalla. Solut suspendoitiin uudelleen faktoria sisältämättömään täydelliseen alustaan ja inkuboitiin vielä yön 20 yli. Indusointia varten solut sentrifugoitiin uudelleen, suspendoitiin uudelleen 60 ml:aan faktoria sisältämätöntä alustaa ja jaettiin tasaisesti neljään kudosviljelypulloon. Yhden pullon soluja ei indusoitu ja niitä pidettiin lusife-raasimäärityksiin asti faktoria sisältämättömässä alustassa I' 25 (negatiiviset kontrollit), kun taas kolmeen muuhun lisättiin noin 10 mg/ml IL-5:a tai 1 mg/ml IL-3:a tai 100 mg/ml GM-CSF:a. Soluja inkuboitiin 8 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen ne erotettiin sentrifugoimalla, pestiin PBS:ssa ja otettiin 500 pl:aan lyysaus/määritys-puskuria (25 mM trisii-30 ni, 0,5 mM EDTA, 0,54 mM natriumtripolyfosfaatti, 6,5 mM

' ; DTT, 16,3 mM MgS04.7 H20, 0,1 % Triton X-100, 1,2 mM ATP, * ·« 0,05 mM lusiferiini; pH 7,8). Tästä otettiin määritykseen 400 pl ja tähän lisättiin 20 pl lusiferiinia (1 mM). Mittaus tehtiin Luminometer Lumat 9501 (Berthold)-laitteessa. Kokeen 35 tulokset on annettu kuviossa 5, joka osoittaa, että sensori-konstrukti pBHfosluci voidaan indusoida IL-5:lla sekä myös IL-3:11a että GM-CSF:lla.

33 111016 d) TF—1-solujen lisääntymisen indusointi stimuloimalla reseptoria

Sen osoittamiseksi, että TF-1-solut, jotka ekspressoivat IL-5 5-reseptorin, lisääntyvät sen jälkeen, kuin reseptoreita on stimuloitu agonistisesti vaikuttavalla aineella, solut laitettiin 96-kaivoisiin mikrotiitterilevyihin. Käytettiin kahta levyä, jotka sisälsivät kaivoa kohti noin 3x103 solua 100 pl:ssa RPMI 1540-alustaa, jossa oli 2 % vasikansikiösee-10 rumia. Jokaisella levyllä viljeltiin kolmea erää ilman 5-interleukiinia (negatiivikontrollit) ja kulloinkin kolmea erää, joihin oli lisätty 0,001 %, 0,01 % tai 0,1 % ihmisen rekombinantti-IL-5:a. Ensimmäisen levyn eriin lisättiin 48 tunnin inkubointiajan jälkeen ja toisen levyn eriin 72 15 tunnin inkubointiajan jälkeen 37°C:ssa 1 pCi [6-3H]tymi-diiniä (Amersham) kaivoa kohti ja inkuboitiin kummassakin tapauksessa vielä 12 tuntia. Tämän jälkeen levyjä säilytettiin -20°C:ssa siihen asti, kunnes tymidiinin sisäänotto mitattiin Packard FilterMate Cell Harvester-laitteen ja 20 TopCount Microplate Szintillation-laskurin avulla. Tulokset on esitetty kuviossa 6. Korkeimmassa IL-5-konsentraatiossa (0,1 %) tymidiinin sisäänmeno nousee 48 tunnin inkubointiajan jälkeen 8,1-kertaiseksi ja 72 tunnin jälkeen 8,7-kertaiseksi verrattuna kontrollisolujen arvoon alustassa, • r 25 jossa ei ole 5-interleukiinia. 1 * ...

1 1 V ( 111016 34

Kirjallisuus:

Akira, S., Isshiki, H., Sugita, T., Tanabe, O.,

Kinoshita, S., Nishio, Y., Nakajima, T., Hirano, T. ja Kishimoto, T., 1990, EMBO J. 9, 1897-1906.

Angel, P-, Baumann, I., Stein, B., Delius, H.,

Rahmsdorf, H.J. ja Herrlich, P., 1987a, Mol.

Cell. Biol. 7, 2256-2266.

Angel, P-, Imagawa, M., Chiu, R., Stein, B., Imbra, R.J., Rahmsdorf, H.J., Jonat, L., Herrlich, P.ja Karin, M., 1987b, Cell 49, 729-739.

Billah, M.M., Pai, J.-K., Mullmann, T.J., Egan, R.W. ja Siegel, 1989, J. Biol. Chem. 264, 9069-9076.

Brasier, A.R., Tate, J.E. ja Habener, J.F., 1989, BioTechniques 7, 1116-1122.

Carroll, M.P., Clark-Lewin, I., Rapp, U.R. ja May, W.S., 1990, J. Biol. Chem. 265, 19812-19817.

Deutsch, P.J., Hoeffler, J.?., Jameson, J.L. ja

Habener, J.F., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 7922-7926.

De Wet, J.R., Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D. ja

Subramani, S., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.

Devos, R. et al., 1991, EMBO J. 10, 2133-2137.

• Dexter , T.M., Garland, J., Scott, D., Scolnick, E.

Metcalf, D., 1980, J. Exp. Med. 152, 1036-1047.

Feigner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M., Roman, R., Chan, H.N., Wenz, M., Northrop, J.P., Ringold, G.M.,ja Danielsen, M., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84, 7413-7417.

j Frohman et al., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 8998- 9002.

Gillis, S., 1991, Current Opinion in Immunology 3, 315-319.

Gritz, L. ja Davies, J., 1983, Gene 25, 179-188.

35 111016

Hanazono, Y., Chiba, S., Sasaki, K., Mano, H.,

Miyajima, A., Arai, K.-i., Yazaki, Y. ja Hirai, H., 1993, EMBO J. 12, 1641-1646.

Hartmann, A., 1991, BioTec 5, 40-45.

Hatakeyama M., Mori, H., Doi, T. ja Taniguchi, T., 1989, Cell 59, 837-845.

Hatakeyama M., Kawahara, A., Mori, H., Shibuya, H. 3a Taniguchi, T., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89, 2022-2026.

Himmler, A., et al., 1993, Journal of Receptor Research 13, 79-94.

Hipskind, R.A. ja Nordheim, A., 1991, J. Biol.

Chemistry 266, 19583-19592.

Houslay, M.D., 1991, Eur. J. Biochem. 195, 9-27.

Isfort, R., Huhn, R.D., Frackelton, A.R., Jr. ja ihle, J. N., 1988, J. Biol. Chem. 263, 19203-19209. Jantzen et al., 1987, Cell 49, 29-38,

Julius, D., Huang, K.N., Livelli, T.J., Axel, R. 3a

Jessell, T.M., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 928-932.

King, K., Dohlman, H.G., Thorner, J., Caron, M.G. ja Lefkowitz, R.J., 1990, Science 250, 121-123. Kitamura, T., Tange, T., Terasawa, T., Chiba, S.,

Kuwaki, T., Miyagawa, K., Piao, Y.-F., Miyazono, K. , Urabe, A. ja Takaku, F., 1989, J. Cell. Physiolog. 140, 323-334.

Kitamura, T., Takaku, F. ja Miyajima, A., 1991, International Immunology 3, 571-577.

Koyasu, S., Tojo, A., Miyajima, A., Akiyama, T., ; Kasuga, M., Urabe, A., Schreurs, J., Arai, K-i.,

Takaku, F. und Yahara, I., 1987, EMBO J. 6, 3979-3984.

Kricka, L.J., 1988, Analyt. Biochem. 175, 14-21.

Lee, W., Mitchell, P. ja Tjian, R., 1987, Cell 49, 741-752.

t 36 111016

Landschulz, W.H., Johnson, P.F. ja McKnight, S.L., 1988, Science 240, 1759-1764.

Milburn, M.V., Hassell, A.M., Lambert, M.H., Jordan, St.R., Proudfoot, A.E.I., Graber, P. ja Wells T.N.C., 1993, Nature 363, 172-176.

Miyajima, A., Kitamura, T., Harada, N., Yokota, T. 3a Arai, K., 1992, Annu. Rev. Immunol. 10, 295-311. Montmayeur, J.-P. ja öorrelli, E., 1991,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88, 3135-3139.

Montminy, M.R., Gonzalez, G.A. ja Yamamoto, K.K., 1990, Trends Neurosci. 13, 185.

Moria, A.0., Schreurs, J., Miyajima, A. ja Wang, J.Y.J., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 2214-2218 Mulligan, R. ja Berg, P., 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 78, 2072-2076.

Murata, Y., Yamaguchi, N., Hitoshi, Y., Tominaga, A. ja Takatsu, K., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 173, 1102-1108.

Murata, Y., Takaki, S., Migita, M., Kikuchi, Y.,

Tominaga, A. ja Takatsu, K., 1992, J. Exp. Med. 175, 341-351.

Potter, H., Weir, L., ja Leder, P., 1984,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 7161.

Sassone-Corsi, P., Ransone, L.J. ja Verma, I.M., 1990, Oncogene 5, 427-431.

Satoh, T., Nakafuku, M., Miyajima, A. ja Kaziro, Y., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88, 3314-3318.

Satoh, T., Uehara, Y. ja Kaziro, Y., 1992, J. Biol.

Chem. 267, 2537-2541.

Scheidereit et al., 1986, DNA 5, 383-391.

«

Schönthal, A. et ai., 1988, Cell 54, 325-334.

Southern, P. ja Berg, P., 1982, J. Mol. Appi. Gen. 1, 327.

Strähle, U. et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84, 7871-7875.

t 111016 37

Takaki, S., Tominaga, A., Hitoshi, Y., Mitä, S.,

Sonoda, E., Yamaguchi, N. ja Takatsu, K., 1990, EMBO J. 9, 4367-4374.

Takaki, S., Mitä, S., Kitamura, T., Yonehara, S., Yamaguchi, N., Tominaga, A., Miyajima, A. ja Takatsu, K., 1991, EMBO J. 10, 2833-2838. Tavernier, J., Devos, R., Cornells, S., Tuypens, T.,

Van der Heyden, J., Fiers, W. ja Plaetinck, G., 1991, Cell 66, 1175-1184.

Tominaga, A., Takaki, S., Hitoshi, Y. ja Takatsu, K., 1992, BioEssays 14, 527-533.

Treisman, R., 1985, Cell 42, 889-902.

Turner R. ja Tjian, R.f 1989, Science 243, 1689-1694. Verma, I.M. Sassone-Corsi, P., 1987, Cell 51, 513-514. J

Voraberger, G., Schäfer, R. ja Stratowa, Ch., 1991, J. Immunol. 147, 2777.

Welham, M.J. ja Schrader, J.W., 1992, J. Immunol. 149, 2772-2783.

Whetton, A.D., Monk, P.N., Consalvey, S.D., Huang, S.J., Dexter, T.M. ja Downes, C.P., 1988,

Proc.Natl.Acad.Sei. USA 85, 3284-3288.

Wieland, E. et ai., 1985, Ärztl. Lab. 31, 203-214.

, Winnacker, E.L., 1985, Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie, VCH Verlagsges. Vfeinheim, 264.

Yamamoto, K.R., 1985, Annu. Rev. Genet. 19, 209-252.

Cloning Vectors: Chapter VIII, Hsg. Pouwels, Enger-

Valk, Brammer, Elsevier, Amsterdam, New York, ·* Oxford, 1985.

» ·

Human Pharmacology - Molecular-To-Clinical, Chapter 2: Sites of Action: Receptors, Hsg. Wingard., L.B., Brody, T.M., Lamer, J. ja Schwartz, A., Mosby Year-Book Inc., St.Louis, 1991.

111016 38

SEKVENSSIPORTOKOLLA

(1) YLEISTIEDOT:

(i) HAKIJA

5 (A) NIMI: Boehringer Ingelheim International GmbH

(B) KATU: Postfach 200 (C) PAIKKAKUNTA: Ingelheim am Rhein (E) MAA: Saksa (F) POSTINUMERO: 55216 10 (G) PUHELIN: 01632/772282 (H) TELEFAX: 01632/774377 (ii) HAKEMUKSEN NIMI: Menetelmä seuloa aineita, jotka moduloivat interleukiini-5-reseptorista riippuvaa signaalin 15 välitysreittiä soluissa (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 2 (iv) TIETOKONEELTA LUETTAVAT TIEDOT: 20 (A) TALLENNUSTAPA: lerppu (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PCT-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1,0, versio #1,25 (EPÄ) 25

(2) INFORMAATIO SEQ ID NO: 1:STA

(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 21 emäsparia 30 (B) LAJI: nukleiinihappo (C) SÄIEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: cDNA 35 (iii) ANTISENSE: ei 111016 39 (ix) TUNNUSMERKIT:

(A) NIMI/AVAIN: 5'UTR

(B) ASEMA: 1..21 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1:

TCGGCTACCA TGGTGCCTGT G

(2) INFORMAATIO SEQ ID NO: 2:STA

10 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) LAJI: nukleiinihappo (C) SÄIEMUOTO: yksi 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLIN LAATU: cDNA

(iii) ANTISENSE: ei 20 (ix) TUNNUSMERKIT:

(A) NIMI/AVAIN: 5'UTR

(B) ASEMA: 1..24 25 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 2:

ATGGCAAAAT GCCATCAAAA CGTG

• i • ·

Claims (20)

171016

1. Menetelmä määrittää jonkin aineen moduloiva vaikutus reseptorista riippuvaan signaalin välitysreittiin ihmis-5 tai eläinsoluissa, tunnettu siitä, että aineen moduloiva vaikutus signaalin välitysreitin, jonka inter-leukiini-5-reseptorin aktivoiminen laukaisee, komponenttiin määritetään siten, että nisäkässoluja a) jotka on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, joka 10 sisältää raportointigeenin ja säätelysekvenssin, joka reagoi interleukiini-5-reseptorista riippuvan signaalin välitysreitin yhden tai useamman sekundäärisen lähettiai-neen konsentraation muutokseen niin, että lähettiaineen konsentraation muutos moduloi raportointigeenin ekspres-15 siota, ja b) jotka lisäksi ekspressoivat funktionaalisen interleukiini - 5-reseptorin, inkuboidaan tutkittavan aineen kanssa, mitataan raportoin-tigeenituotteen konsentraatio ja tutkitaan, onko testatta-20 van aineen todettu vaikutus selektiivinen interleukiini-5-reseptorista riippuvalle signaalin välitysreitille siten, että ainetta kohdistetaan identtisissä olosuhteissa myös kontrollinisäkässoluihin, jotka ekspressoivat erilaisen kontrollireseptorin kuin interleukiini-5-reseptori ja jotka 25 on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, joka sisältää raportointigeenin ja säätelysekvenssin, joka reagoi kont-. : . rollireseptorista riippuvan signaalin välitysreitin sekun däärisen lähettiaineen konsentraation muutokseen, ja että raportointigeenituotteen konsentraatiota interleukiini-5-, 30 reseptorin ekspressoimissa soluissa verrataan konsentraati- oon kontrollisoluissa. .· 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet - t u siitä, että testattavan aineen antagonistinen vaikutus 35 interleukiini-5-reseptorista riippuvaan signaalin välitys-reittiin tutkitaan siten, että soluihin laitetaan lisäksi 5 -interleukiinia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet - 111016 t u siitä, että käytetään soluja, jotka luonnonmukaisesti ekspressoivat funktionaalisen interleukiini-5-reseptorin.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-5 t u siitä, että käytetään soluja, jotka luonnonmukaisesti ekspressoivat vain interleukiini-5-reseptorin β-alayksikön ja jotka on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, joka sisältää interleukiini-5-reseptorin α-alayksikköä koodaavan sekvenssin niin, että solut ekspressoivat funktionaalisen 10 interleukiini-5-reseptorin.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että käytetään soluja, jotka on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, joka sisältää interleukiini-5-resep- 15 torin a-alayksikköä ja β-alayksikköä koodaavat sekvenssit niin, että solut ekspressoivat funktionaalisen interleukii-ni- 5-reseptorin.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että solut ekspressoivat ihmisen funktionaalisen interleukiini-5-reseptorin.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ekspressoivat hiiren 25 funktionaalisen interleukiini-5-reseptorin.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ekspressoivat funktionaalisen interleukiini-5-reseptorin, jonka α-alayksikkö ja 30 jonka β-alayksikkö ovat peräisin eri lajeista.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, t u n -n e t t u siitä, että α-alayksikkö on ihmisperäinen.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa a) määritelty rekombinantti-DNA sisältää säätelysekvenssinä c-fos-geenin promoottorin. 111016

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa a) määritelty rekom-binantti-DNA sisältää säätelysekvenssinä ICAM-1-geenin 5 promoottorin.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa a) määritelty rekom-binantti-DNA sisältää raportointigeeninä lusiferaasigeenin. 10

13. Jonkin patenttivaatimuksen 2-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että testattavan aineen antagonistinen vaikutus tutkitaan siten, että lisäksi soluja, jotka ekspressoivat muiden kasvutekijöiden reseptoreiden lisäksi 15 funktionaalisen interleukiini-5-reseptorin ja joiden kasvun edellytyksenä on jonkin näiden reseptoreiden ligandin läsnäolo, inkuboidaan toisaalta pelkästään 5-interleukiinin kanssa ja toisaalta 5-interleukiinin ja yhdessä testattavan aineen kanssa ja verrataan kummankin soluviljelmän lisään-20 tyrnistä.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aineen moduloivan vaikutuksen selektiivisyys interleukiini-5-reseptorista riippuvaan sig- 25 naalin välitysreittiin tutkitaan siten, että ainetta laitetaan lisäksi identtisissä olosuhteissa kontrolli-nisäkässo-luihin, jotka ekspressoivat muunlaisen kontrollireseptorin kuin interleukiini-5-reseptorin ja jotka on transformoitu kohdassa a) määritellyllä rekombinantti-DNA:11a, jonka sää-30 telysekvenssi ei reagoi ainoastaan interleukiini-5-reseptorista riippuvan signaalin välitysreitin vaan myös kont-rollireseptorista riippuvan signaalin välitysreitin yhden ·· tai useamman sekundäärisen lähettiaineen konsentraation muutokseen, ja että raportointigeenituotteen konsentraa-35 tiota interleukiini-5-reseptorin ekspressoivissa soluissa verrataan konsentraatioon kontrollisoluissa.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, t u n - 111016 n e t t u siitä, että kontrollireseptori on interleukiini- 3-reseptori.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että nisäkässoluja, jotka on transformoitu kohdassa a) määritellyllä rekombinantti-DNA:11a ja jotka eivät ekspressoi funktionaalista interleukiini-5-reseptoria, inkuboidaan lisäksi identtisissä olosuhteissa tutkittavan aineen kanssa ja mitataan raportointigeenituot-10 teen konsentraatio.

17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sitä käytetään seulontamenetelmänä, jossa tutkittava aine on yksi lukuisista aineista, 15 joiden kanssa määrätty määrä nisäkässoluja inkuboidaan määrätyissä olosuhteissa, mitataan raportointigeenituotteen konsentraatio ja tutkitaan aineiden selektiivisyys inter-leukiini-5:sta riippuvaan signaalin välitysreittiin.

18. Nisäkässolut, tunnettu siitä, että a) ne on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, joka sisältää raportointigeenin ja säätelysekvenssin, joka reagoi inter-leukiini-5-reseptorista riippuvan signaalin välitysreitin yhden tai useamman sekundäärisen lähettiaineen konsentraa- 25 tion muutokseen, ja että b) ne on transformoitu rekombinantti-DNA:11a, jotka koodaa-vat interleukiini-5-reseptorin α-alayksikköä tai a- ja β-alayksikköä niin, että ne ekspressoivat funktionaalisen interleukiini-5-reseptorin. 30

19. Patenttivaatimuksen 18 mukaiset nisäkässolut, tunnettu siitä, että ne ovat ihmissoluja.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukaiset nisäkässolut, tunnettu siitä, että ne ovat hiirisoluja. 35 111016