JPH07505046A

JPH07505046A - レセプター依存細胞シグナル誘導経路に関する調節効果を有する物質のスクリーニング法

Info

Publication number: JPH07505046A
Application number: JP5509799A
Authority: JP
Inventors: ツェルニロフスキー　アルミン　ペーター; ヒンムラー　アドルフ; シュトラトワ　クリスチャン; ヴァイアー　ウルリケ; ラムヒェ　ヘルベルト; シェフアー　レナーテ
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1991-11-25
Filing date: 1992-11-25
Publication date: 1995-06-08
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: JP3571718B2; AU668118B2; ATE165115T1; EP0621901A1; DE4138621A1; DE59209288D1; CA2122356A1; WO1993011257A3; US5854004A; ES2114951T3; AU2945592A; TW380162B; EP0621901B1; WO1993011257A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２４、前記細胞がレセプターを発現するように、ホスホリパーゼＣエフェクター・システムと共役するレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項２３記載の哺乳類細胞。

２５、前記組み換えＤＮＡがヒトのレセプターをコードする配列を含むことを特徴とする請求項２４記載の哺乳類細胞。

２６、前記組み換えＤＮＡがＧ−プロティン共役レセプターをコードする配列を含むことを特徴とする請求項２４または２５記載の哺乳類細胞。

２７、前記発現コントロール配列がホスホリパーゼＣの調節によって起こるＩＰｓおよｎＡＧの濃度変化に応答する調節配列を含むことを特徴とする請求項２６記載の哺乳類細胞。

２８、前記細胞を！ｒＨＴ＋。−および５−ＨＴ、−型のセロトニン・レセプター、トロンビン・レセプター、ニューロペプチドＹ−レセプター、ニューロキニン・レセプター、ＰＡＦ−レセプター、アンジオテンシン・レセプター、Ｍ＋− １Ｍ３−およれるレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームすることを特徴とする請求項２７記載の哺乳類細胞。

２９、レポーター遺伝子および哺乳類細胞における発現が該遺伝子と機能的に連結している発現コントロール配列を含む組換えＤＮＡであって、該発現コントロール配列がアデニレート・シクラーゼの調節によってもたらされるＣＡＭＰの濃度の変化に応答する調節配列を含むことを特徴とする請求項５乃至９のいずれか１項記載の方法で使用するのに適した組み換えＤＮＡ０３０、発現コントロール配列が合成的に生産されることを特徴とする請求項２９記載の組み換えＤＮＡ。

３１、調節配列が互いに間隔をおいてｃＡＭＰの調節に応答する複数の調節要素を含むことを特徴とする請求項３０記載の組み換えＤＮＡ０３２．３個乃至１２個の前記調節要素を含むことを特徴とする請求項３１記載の組み換えＤＮＡ０３３、前記調節要素および／またはそれらの間に存在する配列領域の少なくともいくつかが互いに異なることを特徴とする請求項３１または３２記載の組み換えＤＮＡ。

３４、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする特許環２９乃至３３のいずれか１項記載の組み換えＤＮＩｌ、。

３５．マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項２９乃至３４のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡ　０３６、請求項２９乃至３５のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡでトランスホームしだ哺乳類細胞。

３７、前記細胞がレセプターを発現するように、ホスホリパーゼＣエフェクター・システムと共役するレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項３６記載の哺乳類細胞。

３８、前記細胞を５−ＨＴｔ。−および５−ＨＴｔ−型のセロトニン・レセプター、トロンビン・レセプター、ニューロペプチドＹ−レセプター、ニューロキニン・レセプター、ＰＡＦ−レセプター、アンジオテンシン・レセプター、Ｍ＋− １Ｍ、−およびＭ、−型のムスカリン性アセチルコリン・レセプターからなる群から選択されるレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームすることを特徴とする請求項３７記載の哺乳類細胞。

３９、前記細胞がレセプターを発現するようにアデニレート・ンクラーゼ・エフェクター・システムに共役したレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項３６記載の哺乳類細胞。

４０、　Ａ２−およびＡ４−型のムスカリン性アセチルコリン・レセプター、Ｄ＋−１Ｄ２１−１Ｄ２＋−、およびり、−型のドーパミン・レセプター、５−）ＩＴ、Ａ−および５ＪＩＴ＋ｏ−型のセロトニン・レセプターおよびＡ、−およびＡ、−型のアデノシン・レセプターからなる群から選択されるレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項３９記載の哺乳類細胞。

（２）ＳＥＯＩＤＮｏ二２４玩Ｅ：（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）　長さ：　４７１アミノ酸（Ｂ）　配列タイプ：アミノ酸（Ｄ）　トポロジー：線状（ｉｉｌ　分子型：タンパク貢（ｘｉ）　［す：ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：２：Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌ健ｕ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　ｄｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌ、ｙｉ　Ａｓｈ　Ｔｒｐ　ｓｅｒ　八Ｌａ　Ｌａｕ　Ｌ＊■ ６５　７Ｃ）　７５　８０丁ｈｒ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ｖａｌ　ＩＬｅ　工Ｌａ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｉｉａ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　八ｓｎ　ＩＬｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　工ｉｓＭａｔ　人Ｌａ　ｖａＬ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　ＬｙＩ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　入１＆　Ｔｈｒ　入ｓｎ　Ｔｙｒ　ＰｈＧＬｎｕ　Ｍｓｔ　ｓａｔ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　ｆｌ＠Ａｌａ＾ｓｐ　ＭａｅＬａｕ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　Ｐｈｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＨａｔＰｒｏ　ＶａＬ　ｓ＠ｒ　ＨＩＩＣｔａｕ　ｔｈｒ　ｆＬ嗜　ＬＩＩＬＩ　丁ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　入ｒ９　丁ｒｐ　ｐｒｏ　ｒ、ａｕ　垂秩B １３０　１コ５　１４０Ｓａｔ　Ｌｙｍ　Ｌａｕ　ＣｙＭ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ｔｒｐ　ＩＬｅ　’ｒｙｒ　Ｌｓｕ　八Ｓｐ　ＶａＬ　Ｌｓｕ　ｐｈ・　ｓｓｒ　τｈ■ ＡＬａ　Ｓｓｒ　工１＠　ｓ＠ｔ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　入Ｌａ　Ｘｉｓ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｉ’ｙｒ　ｖａＬ　Ａｌ■ Ｘｉ＠　Ｇｉｎ　ｘｓｎ　Ｐｒｏ　Ｉｉａ　Ｈｉｊ　Ｈｉｓ　Ｓｕｒ　人？９　ｐｈｓ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ａｘｑ　Ｔｈｒ　ＬＹＩ　Ａｌａｌｇｏ　１８５　１９０Ｐｈ＠Ｌｅｕ　Ｌ？ｌ工Ｌｍ　＝ｌｅ　ｘＬａ　ｖａＬ　ｒ＝ｐ　−、Ｑ＝　＝Ｌｍ　ｓｅｒ　ｖａＬ　ｃｒｙｌｌｌ　５＠ｒ　Ｍ嗜？。

Ｐｒｏ　Ｉｉａ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　ｙ’：、−ＧＩＹＬｅｕ　ｃ比λ５ｐ＾Ｓｐ　ｓｅｔ　Ｌｙｓ　ＶａＬ　ｆ’ｈ＠　ＬＹＩ　ＧＬｕｃｌｙｓＩＩｒＣｙｓｔ、ａｕＪｖＡＬｍＡｓｐＡｓｐλｓｎ？ｈ儂ＶａｌＬａｕ工Ｌ＠ＧｌｙＳｉｒＰｈｅ２２Ｓ　し　２コ８　２コ５　２４０Ｖａｌ　Ｓａｒ　ＰＭ　Ｐｔｖ　ＩＬｅ　ｉ’ｒ＋　Ｌｅｕ　Ｔｈ：　：ｆ　ＭＣＶａｌ　ＩＬｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙ：　Ｐｈｓ　Ｌｅｕ２４５　２５り　２５５ τｈｒ　ＩＬｅ　［、ＹＩ　Ｓａｒ　２曇ｕ　Ｃａ’ｂｎ　ｃｙｓ　Ｇｉｕ　＾二１　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　Ｓｅｅ：　Ａｌｐ@Ｌｌｉｕ２６０　２４５　２フロＣ１＞′　Ｔｈｒ　Ａ；９　へユ曇　二Ｈ，ｓ　−ｅ＝　ＡＬａ　ｓｅ：　？：脅　ｓｅ：　Ｐｈ倫　Ｌｅｕ　ｐｒｏ　ＣＬｒ、Ｓａｒ　５奄■ ２７５　２５０　２！ＳＬ＠１１　ｓ軽ｓｅｅ　ＧＬｕ町ｓ　Ｌａ＝　Ｐｈｅ　ｃｌｎ　ａ＝ｑ　ｓｅｒ　Ｈｅ　ｐ、ｉｓ　Ａｒｑ　ａｌ＝　ｐｒｏ　ｃｒｙ２９０　２９５　コ００Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　入ｒ９　人ｒｑ　Ｔｂｔ　Ｍｔ　ＧＬｎ　ｓｅｒ　工Ｌｅ　Ｓｅｒ　入ｓｎ　ｃＬｕ　ＧＬｎ　Ｌｙｓ３０５　３１０　、　３１５　３２０人Ｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　ＩＬｅ　Ｖａｌ　ｆ’ｈ＊　Ｉ’ｈ＠　Ｌａｕ　ｔｈｅ　ＶａＬ　ＶａＬ　Ｍｅ　τｒ■ コ２５　コ３０　ココ５コ４ｏコ４５３５ＧＣｙｓ　Ａｓｎ　ａＬｕ　Ａｓｐ　ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　入Ｌ＆　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ｋｉｎ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　工１・ＧＩＹ　Ｔｙｒ　ｒ、ａｕ　ｓ＠ｒ　ｓ＠ｒ　ＡＬｉ　ν１１＾寥ｎ　ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ｔｙｔ　Ｔｈｒ　Ｗｕ　ｔｈｅ　Ａｓｎコフ０　３７５　コ８０ｔｙｓ　テｈｒ　’ｒｙｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　＾１ｍ　Ｐｈｅ　ｓｉｒ　入ｒｇ　Ｔｙｒ　ＸＬｔｓ　ＧＬｎ　ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｔ’ｙｒ　I、ｙｍコ８５　コ９０　コ９５　４００Ｃ１ｕ　Ａｓｈ　ｔ、ｙｍ　Ｌｙｍ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｏｌｎ　Ｌａｕ　ＩＩｓ　Ｌｅｕ　ＶａＬ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ａｌ■ ４０ｓ　ｔｔｏ　４１％ｔ、＠ｕ　ＡＩＡ　ｒｙｒ　ｚｙｔ　ｓａｒ　ｓ＠ｗ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍｓｔ　Ｏｌｙ　＋Ｊｎ　ムｙｓ　ｒ＋ｙｓ　Ａｓｈ　５奄■ Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓτｈ；　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａ１１）　Ｃｙ第Ｓ＠ｒ　Ｍ壷ｔ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｌ＊ｕａｎｙｔｙｓａｌｎＨｉｘｓ＠ｒｃｌ＊ｃＬｕＡｌａＳ＠Ｆ、ＬＹＩＡＩＧ）Ａｓｎｓ・ｒＡＳＰａｌｙｖａｌ入ｓｎ　ＧＬｕ　ＬＹＩ　Ｖｌｌｌ　Ｓａｒ　ｃｙｓ　ｖａｔ（２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３の情報：（ｉ＋　配列の特徴：（Ａ＋　長さ：　２コ塩基＋Ｂ＋　配４汐イブ：核酸（Ｃ１鏡型ニー重鎮（Ｄ）トポロジー二線状（１１）　分子型：合成オリゴデオキシリポヌクレオチド（×よ）　ｖｌＩ＠！ｆ徴、ＳＥＱ　１０．　ＮＯ：３：ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧ　ＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧ　ＧＣＧ　２］（２）ＳＥＯＩＩ）ＮＯ：４（７１１ｕ：（１）配列の特徴：（Ａ）　長さ：３７　塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｌ工）　分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＸｉｌｌｓｉＪＩＩ：５ＥＱＩＤＮＯ：４：ＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧ　ＴＴＴＴＴＣＣ〕１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の情報：（ｉ）　配列の特徴：（Ａｌ　長さ：６４　塩基（Ｂｌ　配ダ汐イブ゛核酸（Ｃ）　鏡型　−重鎮（Ｄ）トポロジー・線状（工１）分子型：合成オリコブオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）　ＦＩｉＪリ　ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：５：ＧＡＣＴＴＣＡＧＡＴ　ＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣ：ＴＣＧ；、Ｇ’：ＧＴＡ　ＧＣＧＴ−’ＡＣＧτＣ’−ＡＣλすＣＣＣＣＣＣＣＣ，” 、ＧbＧＴ　６ＣＣττＧ　６４（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：６の情報：（１）　配列の特徴：（Ａ）　長さ：　５６塩基（Ｂ）　蛋１１汐イブ：核酸（Ｃ）　鏡型、−重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｉｉｌ　分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）ｒｉ己３２１ト５ＥＱＩＤＮＯ：６：（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：Ｔの情報（１）配列の特徴：（Ａｌ　長さ：　５６塩基 −（ＢＪ　ｆｉｌ＋汐イブ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー重鎖（ｘｉｌ　配列：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　７’：ＧＡ（〕丁ＣＧＧＡＴ　ＣＣＧＡＧＣτＣＡＣＴＡＧＴ？（ＴＡＧＡ　ＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧ　ＣＴＧＴＴＡＡＣ，ＣＧ　ＧＧＴＣＧＣ５６（２１ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋８の情報。

（１）翫牙りの特徴：（λ）　長さ：４５塩基対（ＢＩ　ＩＢ＋Ｂ＋ライブ酸（Ｃ）　鎖型ニ一本鎖浄書（内容に変更なし）（ｉ）配列の特徴；（Ａ）　長さ：２７塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー二線状（ｉｉ）分子型二合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３＋ＣＴＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＧＧＴＡＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４の情報：（ｉ）配列の特徴二（Ａ）　長さ＝４７塩基（Ｂ）　配列タイプ・核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー二線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＧ　ＴＧＡＣＧＴＣｍ　ＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡ　ＡＴＧＧＧＡＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）　長さ：４１塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー、線状（ｘｉ）配列＋ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：ＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡ　ＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧ　ＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡ　ＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧ　Ｃ４１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６の情報：（ｉ）配列の特徴：２□　（Ａ）　長さ・３５塩基ＣＢ）　配列タイプ；核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー二線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　［）　ＮＯ：１６：ＣＴＣＣＴｒ’ＧＧＣＴ　ＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡ　ＧＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣ３５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７の情報：４□　（ｉ）配列の特徴：（Ａ）　長さ：６３塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー二線状（ｉｉ）分子型二合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７：浄責（内容（ユ変史なし）ＴＣＧＡＣＴＣＣＣＡ　ＴＴＧＡＣＧＴＣＭ　ＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴ　ＧＡＡＡＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡ　U０ＣＴ６３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｏｉ８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）　長さ一５７塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー二線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８：ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴ　ＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡ　ＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡ　ＧＡＣＣＧＴＧＡＴＴ　ＣＡＡＧＣＴｒＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣ５７（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）　長さ：４１塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー水路（Ｄ）　トポロジー二線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ｒｐ　ＮＯ：１９：ＧＣＴＴＧＡＡＴＣＡ　ＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＴ　ＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧ　Ｃ４１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０の情報：（１）　翫ラリの特ｙ１：＋Ａ）　長さ：５６塩基（ＢＩ　ＩＢＩ汐イライブ酸（Ｃ）　鏡型ニー重鎮（Ｄ）　トポロジー：線状（ｉｉ）　分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（×１）　配列：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２０：ＴＣＧＡＣＴｋ＾ＧＣＴＴＧλ＾τＣＡＣＧ　（ａＴｃＴＡｃＡＧｃＴ　ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴ　（ＡＣＣＧＴ（ＴＡＣＡＧＣＴ入Ａ　５ｇ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ−：２１の情報：（１）　阪ｌりの特徴：（Ａ）　長さ＝　４０塩基（巳）　翫ツ１汐イブ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー重鎮（Ｄ）トポロジー二線状（１１）分子型；合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉｌ　配列：ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：２１＋ＣＧＴＧＡＴＴＣＡＡ　ＧＣＴＴＡＧＣＴＧＴ　ＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴ　ＴＣＡＡＧＣＴτＡＧ　４０（２］　ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：２２の情報：（１）５５りの特徴：に）　長さ＋５６　塩基（Ｂｉ　翫ツリタイプ：核酸（Ｃｉ　鏡型ニー重鎮〔ｏｉ　）ポロジー二線状（ｉＩ）　分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）　！ＦＪす：ＳＥＯ１０Ｎ　○：２２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３ｆ７Ｗ肯：（ｉ）　ｖｌＩ＃ｆ徴：（Ａｌ　長さ＝５０塩基（Ｂ）　酊１汐イブ：核酸（Ｃ１鏡型ニー重鎮（Ｄ）トポロジー二線状（１１）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉｌ　１ｌｉＪす：ｓ　Ｅｏ　ＩＤ　ＮＯ：２３：（２１ＳＥＯ１０ＮＯ：２４の情報・（ｉＩ　配列の特徴：（Ａｌ　長さ＝　３５塩基（８）ｖリタイブ：核酸（Ｃ）　鏡型・−重鎖ＣＤ、トポロジー：線状（ｉｉｌ　分子型二合成オリコデオキシリボヌクレオチド（Ｘｉｉ’ｒＲＪす：５ＥＯＩＤＮＯ：２４：ＣＧＴＧＡ、ＴＴＣＡＡ　ＧＣＴＴキ：丁５丁−ＧへＣＣＧＴＣへＴｌ’　ＣＡ、１ｔＧＧ　３５（２）ＳＥＯＩＱ　ＮＯ：２５の情報：（１）酊りの特徴：（Ａｌ　長さ：　５３　塩基（Ｂ）　ｆｉＪリタイプ；核酸（Ｃ）　鏡型；−重鎮（Ｄ）トポロジー；線状（１ｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）ｋ二３ｉす：Ｓ ε０ＩＤＮＯ：２５：ＧＧＣＣＧＣＡＧＧτ　ｘｃｃＡｃ；ｌ：ｃｒＡ　ｃτＣＧＡＣＴＧＴＡ　Ｇ、、ＣＣＧＴＧきτＴＣλＡＧＣＴ丁ＡＧＣ（丁Ｇ　５３（２）Ｓε０　１０　ＮＯ：２６の情報：（ｉｌ　ＶＪりの特徴：（Ａｌ　長さ＝　６４　塩基（Ｂｌ　′ｒｊｉＪ１汐イブ：核酸（Ｃ＋　鏡型ニー重鎖（Ｏ）　トポロジー、線状（１１）分子型；合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｘｌ）　配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６：τＣＧＡＣＴＡＡＧＣτＴＧ？；、−、Ｃ，ユＣＧＧ−，Ｃ？Ａ’：ｒ、’：’：Ｑ：：、’−、−；、’−：’ｒτＣ−１τごＱ、ＳＣ ’A、＋τ：；、こ＾：ζλＧＧにＣ−リ　５４（２１ＳＥＱＩＤＮＯ：２了（２：）′ｉ１１［ｊ）１１）：（１）配ｌりの特徴：（Ａ）　長さ：　５２塩基（Ｂ）　ｆｉｉＪ＋汐イブ、核酸（Ｃ）　鏡型コー重鎮（Ｄ）トポロジー、線状（ｉｉ）　分子型；合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）　配列：ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：２７：＋２１　３ＥＯＩＤ　ＮＯ：２８の情報：（１）配列の特徴：（Ａ）　長さ＝　６４塩基（Ｂｌ　翫ｌリタイプ：核酸（Ｃ）　鏡型ニー重鎖（Ｄ）　トポロジー二線状（１１）　分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）　１：１１：：））プ１１二ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８　・（２１３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９の情報・（ｉＩ　翫ツリの特徴。

二　長さ：；＝　塩基５ミ　ｖ１汐イブ：核酸こ　鏡型・−重鎖Ｄ　トポロジー：線状（ｉＩ）　分子型２合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｘｌ）　配列：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２９：ＣＣｋＧＬ：：ＣＴＡＡＧ　ＣＴＴＧＡＡτＣＡＣＧＧＴＣτＡＣＡＣＴ　ＣＧＡＧＴＡＧＡτＣＴＧＧτλＣＣＴＧＣＳ。

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薬学的に活性を有する物質に関する従来のテスト法は、レセプターに結合した（ラベル化した）リガンドを置換しつる程度を評価する検定法が多い（ラジオリガンド・テスト法）。この種のテスト法は既知のレセプター結合部位の結合に影響する物質しか同定できない。従って、このようなテスト法は物質の結合をカバーするだけで細胞の機能的応答をカバーできず、結合する物質がアゴニスト的活性を有するのかアンチアゴニスト的活性を有するのか区別できない。ラジオリガンド・テスト法は比較的大量の物質を必要とし、しばしば動物組織から単離したレセプター含有膜画分が使用される。この組織には種々のレセプターを含む数種類の細胞が含まれている。このような物質の重要性にもかかわらず、組成の多様性、またはヒトに対する医薬効果を研究する場合のヒトと動物の種差およびヒト・レセプターと動物レセプターに対するリガンドの結合性の差は結果の説明する際に問題となる。

多くのトランスメンブレン・シグナル誘導システムは以下のメンブレン結合成分を含んでいる。ａ）細胞表面レセプター、ｂ）Ｇプロティンとして知られ、レセプターおよびエフェクターの両方に結合しつるグアニン・ヌクレオチド・結合およびＧＴＰ切断調節タンパク質、Ｃ）いわゆる「エフェクター」、例えばイオンチャンネルまたはアデニレート・シクラーゼ、グアニレート・シクラーゼまたはホスホリパーゼ。

いわゆるＧプロティン結合レセプターは光、匂い、（ペプチド）ホルモン、ニューロトランスミツター等の非常に多種に渡る細胞外シグナルの効果を受け渡す。

これらは進化的にヒトと酵母はど離れた生物の両方に同定される（ドールマン等、１９９１）。はとんど全ての６プロテイン結合レセプターは配列に類似性を有している。全ての類似性は脂質二重層を貫通する７つの疎水的（おそらくαヘリックス）領域からなる、全てのＧプロティン結合レセプターに共通する同様のトポロジカル・モチーフに基づくものと考えられている。

細胞表面レセプターは種々の細胞外刺激から適したリガンドを認識する。レセプターへのリガンドの結合はへテロトリメリックＧプロティンの活性化で開始するシグナル・カスケードを活性化する。長期間に渡るレセプターの活性化はレセプターの種々の修飾によって引き起こされる減感作を誘導する。Ｇプロティンの活性化レセプターとの相互作用はαサブユニットに結合したグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）のグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）による置換、β−γ− へテロダイマーからのα−ＧＴＰ−複合体の解離およびＧＴＰのＧＤＰへの加水分解を引き起こす。単一のレセプターが多（のＧプロティン分子を活性化し、それによってリガンド結合現象を強める。ＧＴＰが結合するαサブユニットおよび遊離型β−γサブユニットはエフェクターと相互作用し、いわゆる「第２メツセンジヤー」を形成することによりシグナルを強める。アデニレート・シクラーゼの活性化によりトリガーされるｃＡＭＰ　（サイクリックＡＭＰ　）　、グアニレート・シクラーゼの活性化によりトリガーされるｃＧＭＰ　（サイクリックＧＭＰ）または場合によりではヒドロラーゼも関与するホスホリパーゼＣまたはホスホリパーゼＤ等のホスホリパーゼの活性化によりトリガーされるイノシトール −１，４，５−）ジホスフェート（Ｉｐｓ）およびジアシルグリセロール（ＤＡＣ）等の低分子第２メツセンジヤーは、細胞外変化をもたらす（ピラー（Ｂｉｌｌａｈ）等、１９８９）。これらは特定の遺伝子の転写の調節、細胞骨格の再構築および膜の脱極性化に影響するプロティン・キナーゼの活性化によるタンパク質の選択的リン酸化（例えばＩＰ、／ＤＡＣによるＰＫＣ、ｃＡＭＰによるＰＫＡ）を含んでいる。（アンタゴニスト効果を有する物質はアゴニスト効果を有する物質によって起こった相互作用およびそれに伴う全体的または部分的第２メツセンジヤー濃度の変化を戻すことができ、さらに逆機能的効果を起こすことさえある。）このシグナル誘導システムにより細胞はお互いにコミュニケーションでき、発生またはそれに伴う現象を統一しうる。Ｇプロティンのαサブユニットに結合するＧＴＰが加水分解してＧＤＰが生成すると非活性型Ｇプロティンが再生される。

ホスホリパーゼの活性化、生産物がＤＡＣである反応、またはアデニレート・シクラーゼに関連する特異的シグナル誘導経路を最終生産物がＤＡＣである「ホスホリパーゼ・シグナル誘導経路」　（または「ホスホリパーゼ・エフェクター・システムｊ）または「アデニレート・シクラーゼ・シグナル誘導経路」　（または「アデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システム」）と呼ぶ。

哺乳類では約１００種のＧプロティン結合レセプターが発見されている（その中のいくつかは同じリガンドに結合する）。例えば、現在まで５種類のムスカリン性レセプター・サブタイプ、８種類以上のアドレナリン性レセプター、少な（とも５種類のセロトニン・レセプターおよび４種類のオプシン・レセプターがそれぞれ同定されている。プリン、ボンベシン、ブラジキニン、トロンビン、ヒスタミン、ドーパミン、エコジノイド、パップレシン、ＧＨＲＨ（ｒ成長ホルモン放出ホルモン」）等のペプチドホルモンおよびソマトスタチンに応答するレセプターおよびレセプター・サブタイプがクローン化され、特性が明らかにされてきている（ドールマン（Ｄｈｏｌｍａｎ）等、１９９１．サイセン（Ｓｉｍｏｎ）等、１９９１．　ＴＩＰＳレセプター命名法、追補、１９９１、ドッグ（Ｄｏｏｄｓ）およびヴオンミール（Ｙｏｎ　Ｍｅｅｌ）、１９９１）。

同じリガンドに応答する種々のレセプターは、それらがトリガーする細胞内反応に基づいて互いに区別しつる。これらの特異的レセプター・サブタイプは種々のエフェクター・システムと共役しており種々のイオンチャンネルを調節しつる。

単一のシグナル・レセプター（同細胞または異細胞）は１つ以上のエフェクターと共役し、いくつかのレセプター・サブタイプが同様のエフェクターを活性化して複雑なシグナル誘導ネットワークが生成する。さらに、Ｇプロティンおよびエフェクターの特徴は、これらも大きな遺伝子群により特定されていることを示している。多くのＧプロティン、種々のアデニレート・シクラーゼおよびホスホリパーゼＣおよびＡ２等のホスホリパーゼが同定されている。Ｇプロティン依存イオンチャンネルも種々のタンパク質群により分類しうる。現在、どの基準力電プロティンおよびエフェクタータンパク質の不均一な集団の相互作用の特異性を決定するか、特異的レセプターがどのように特異的Ｇプロティンに結合するか、どのような経路でこれらのシグナル回路が互いに作用し合うか、およびこれらがどのように細胞分化の際に再生されるか等は明らかになっていない。

この様に活性化された転写因子（例えば、ＣＲＥＢタンパク質、ＡＰＩタンパク質）は、ＣＲＥＢおよびＭｌと結合する調節ＤＮＡ要ｔｃＲＩＥ　（Ｃ■要素、ｒｃｆｉＭＰ応答要素」）またはＴＨＥ　（ＴＲＥ＝　ｒＴＰＡ応答要素Ｊ：ＴＰＡ＝フォーボッｌ、−１２−ミリスタット−１３−アセテート・７オーボルエステル）と相互作用する。その転写がｃＡＭＰによって調節される多くの遺伝子（例えばラットのソマトスタチン、ヒトα−ゴナドトロピン）は、５°隣接領域に調節要素として保存的配列を含む。この配列はパリンドローム構造のオクタマーＴＧＡαπＣＡと同一かまたは類似している（モントミニー（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ）等、１９９０）。１要素は大変類似したペンタマーモチーフＴＧＡＧＴＣＡを含んでおり、この配列はＣＲＥ要素コンセンサス配列と僅かｌヌクレオチドしか相違していない（デユーシュ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）等、１９８８）。１モチーフ、またはこれに非常に類似したモチーフは、多くの遺伝子内に同定されており、その遺伝子の転写は７オルポエステルによって活性化される（エンジェル（Ａｎｇｅｌ）等、１９８７ａおよびｂ、リー（Ｌｅｅ　）等、１９８７）。周囲のＤＮＡ配列または他の因子とのタンパク質・タンパク質相互作用が取り分は特異的遺伝子の固有の調−現象を決定する。

シグナル誘導経路のネットワークの複雑性のために、シグナル誘導経路間、例えば、アデニレート・シクラーゼおよびホスホリパーゼＣ−シグナル誘導経路間のいわゆる「クロストーク」が存在する。「クロストーク」とは１つのエフェクターシステムの影響が他のシステムに及ぶ現象である（セイソン・コルシ（Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ）等、１９９０、ホースレー（Ｈｏｕｓｌａｙ）　、１９９１）　ｏクロストークの現象は生理学的にも冗長するシグナルの生産または種々のシグナル誘導のコミュニケーションの確認のためのシグナルの統合または連結に使用されている。クロストークは種々の段階、取り分けＧプロティンの段階で起こる。例えば、あるレセプターまたはレセプター・サブタイプが１つ以上のＧプロティンと相互作用し、その結果ｃＡＭＰ−およびＩＰ、　／ＤＡＣ−レベルの両方が影響を受ける。細胞における病理学的変化の原因にはこれらの相互作用の破壊、例えば、特異的レセプターが生理学的観点からエフェクターシステムと正しく相互作用しない場合等が考えられる。

特定のレセプターまたはレセプター・サブタイプに対して特異的で、さらに、唯一の特定のレセプター依存シグナル誘導経路に特異的に影響を及ぼす、病理学的状態の治療に関する医薬の発見を可能にする検定法が必要とされている。

レセプター依存シグナル誘導系に関する物質の調節活性が遺伝子の発現によって検出しうることを利用した検定法が既に開発されている。

キング（Ｋｉｎｇ）等、１９９０の検定システムは、酵母細胞にトランスフェクトされたレセプターに対するアゴニスト性化合物の結合反応が酵母細胞中でのカロリメトリーで測定される・サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ）のＧプロティン共役フェロモンレセプターによって使用されるシグナル誘導経路への影響に基づいている。この目的のために、ガラクトース誘導可！ＡＬ１プロモーターのコントロール下の（高発現率を達成するため）修正β−アドレルセブター遺伝子を、フェロモンに応答するＦＵＳＩ−プロモーターのコントロール下のゲノムに安定して統合したレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を含む酵母に哺乳類Ｇプロティン・ザブユニットＧ、αと共にトランスフェクトした。このシステムはそのアゴニスト性がβ−ガラクトシダーゼを活性化し、この活性化は色変化に基づ（簡単で自動化された検定法で測定しつる物質のスクリーニングの機会を提供する。しかし、このシステムは酵母細胞中の複雑なシステムから単離したヒトタンパク質の使用がヒト細胞における過程に関する直接的結論を誘導しえないという欠点を有している。さらに、酵母細胞におけるこのシステムは、ヒト・のレセプターと相互作用しつる適当なＧプロティン・サブユニットのコトランスフェクションを必要とする。このシステムは高等細胞固有のシグナル誘導システムを利用していないことから、このシステムのレセプター活性物質の機能的分析が問題となる。

セントメイヤ−（Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒ）およびボレリ（Ｂｏｒｅｌｌｉ）　、　１９９１は、Ｇプロティン共役レセプターの活性化（Ｄ、レセプターおよびβ −アドレナリン性レセプターを使用）によるアデニレート・シクラーゼ・シグナル誘導経路の影響に基づ（検定法を報告した。このレセプターを利用してチミジン・キナーゼ（ＴＫ）プロモーターのコントロール下にレポーター遺伝子としてタロラムフェニコール・アセチルトランカフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含むヒト細胞をトランスホームした。このプロモーターに先行してｃＡＭＰに応答するプロモーター要素（ｒｃＡＭＰ応答要素Ｊ　ＣＲＥ　）を含む合成オリゴデオキシヌクレオチド配列がある。ＣＡＴ活性によりアデニレート・シクラーゼを活性化することが知られているβ−アドレナリン性レセプターに対するアゴニスト的に活性な化合物がＣＡＴ活性の投与量依存的増加をもたらすことを示しつる。アデニレート・シクラーゼを阻害するドーパミン・レセプターによるコトランスフエクション後、この活性が再び減退した。この事はこのレポーター遺伝子のｃＡＭＰ誘導型発現が投与量依存的に正にも負にも調節しうろことを示している。

この検定法にはｃＡＭＰ濃度によって調節されている遺伝子の発現を測定するという制限がある。これはＩＰ！／ＤＡＣ調節遺伝子の発現の測定を許容しない。

クロスト・−りによるアデニレート・シンラーゼおよびホスホリパーゼＣのシグナル誘導経路間の相互作用はこの検定法では部分的にしか、もしくは全く検出しえない。

本発明の目的はレセプターに依存してホスホリパーゼ・シグナル誘導経路、特にホスホリパーゼＣのシグナル誘導経路を調節する物質をスクリーニングするのに適した方法を提供することである。これらの物質にはレセプターのリガンド結合部位に結合する物質であって、アロステリック活性を有する物質並びに該リガンド結合部位に非競合的に作用する物質が含まれる。特に本発明は自動化が可能であり、効率よく物質をスクリーニングでき、また、生物からの抽出物などのような複雑な混合物から医薬的に活性を有する物質を探しつる方法を提供することを目的としている。

従って、本発明はヒトまたは動物細胞におけるレセプター依存シグナル誘導経路に関する物質の調節効果を測定する方法に関する。この方法は、場合によっては加水分解も含めてジアシルグリセロールを生ずるホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＣの活性、またはシグナル誘導経路におけるホスホリパーゼＣの活性化前後のメカニズム、望ましくはＧプロティン共役レセプターによってトリガーされるシグナル誘導経路の調節に関する物質の調節効果が、ａ）レポーター遺伝子およびホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＣの調節によっておこるイノシトール −１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ、）およびジアシルグリセロール（ＤＡＣ）の濃度変化に応答する調節配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされ、その結果レポーター遺伝子の発現がＩＰ、／ＤＡｃの濃度変化で調節されている、および、さらに、ｂ）該細胞がレセプターを発現するようにホスホリパーゼ・エフェクターシステムと共役させたレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされている、哺乳類細胞を物質とインキュベートし、該レポーター遺伝子産物の濃度を測定することにより検定することを特徴とする。

また、ＩＦ５　／ＤＡＣ濃度の変化、または後に述べるコントロール細胞の場合はｃＡＭＰ濃度の変化に応答する組み換えＤＮＡも本発明に関する。以後これを「センサーＤＮＡ　Ｊと呼ぶ。レポーター遺伝子は、その発現産物が検出可能であり、かつ濃度に比例したシグナルを測定することにより定量可能であるという制約を持つ。

センサーＤＮＡに含まれ、ＩＰ、　／ＤＡＣ濃度の変化に応答する調節配列は１つ以上のヘプタマーＩモチーフ（以後ＴＨＥ要素と呼ぶ）を含む。

センサーＤＮＡに含まれ、ｃＡＭＰ濃度の変化に応答する調節配列は１つ以上のオクタマーＣＲＥモチーフ（以後ＣＲＥ要素と呼ぶ）を含む。

これとは別に、センサーＤＮＡはカルシウム濃度を増加することにより直接転写後に活性化されるタンパク質をコードする配列を含みうる。

レセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡを以後［レセプターＤＮＡ　Ｊと呼ぶ。

本発明の別の特徴はセンサーＤＮＡによってのみトランスホームされた細胞に関する。この細胞を以後「ブレ・テスト細胞」と呼ぶ。

センサーＤＮＡおよびレセプターＤＮＡでトランスホームした細胞を以後テスト細胞と呼ぶ。この細胞も本発明の目的物である。

ヒトの病気治療の医薬的効果に関して物質を検定する場合、レセプターＤＮＡはヒト・レセプターをコードする配列を含むことが望ましい。（本発明の方法はヒトの病気を治療するの適した物質を発見することに使用されることが望ましい。

しかし、動物の治療に使用する物質のスクリーニングにも使用しつる。この場合、対応する動物のレセプターが使用される。）本発明の目的に関する「物質」には純粋な物質および物質の混合物の両方が含まれる。

「調節」効果は、レセプター依存シグナル誘導経路に関するアゴニストまたはアンタゴニスト的効果を意味する。

本発明の望ましい態様では細胞をＧプロティン共役レセプターをコードするＤＮＡでトランスホームしている。

さらに、本発明の望ましい態様ではステップａ）に従った組み換えＤＮＡのみでトランスホームしたコントロール細胞（ＴＲＥ−ブレ・テスト細胞）をテスト物質で処理し、レポーター遺伝子の発現をレセプター依存の調節に寄因させつるかどうかを探っている。もし、レポーター遺伝子の発現がホスホリパーゼＣ・エフェクターシステムのレセプター非依存的調節に従うならば、または内在性レセプターが存在し、ホスホリパーゼＣ・エフェクターシステムの調節がこれらのレセプターに依存するならば、この調節様式はＴＲＥブレ・テスト細胞で検出される。

ホスホリパーゼＣ・シグナル誘導経路に関するテスト物質の特異性を調べるには、センサーＤＮＡがアデニレート・シクラーゼの調節によって起こるｃＡＭＰ濃度の変化に応答する調節配列を含むブレ・テスト細胞（ＣＲＥブレ・テスト細胞）を用いた平行テストで簡便に行うことができる。望ましい場合には１テスト細胞と同様のレセプターでトランスホームしたＣＲＥテスト細胞をコントロールとして使用する。

ＣＲＢテスト細胞はコントロール細胞としてだけではなくアデニレート・シクラーゼ・シグナル誘導経路に関するレセプター依存調節鉱化に関して物質を検定するスクリーニングにおける一次基質細胞としても使用しつる。この場合、ＣＲＢテスト細胞をアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムと共役したレセプターをコードする配列を含むレセプターＤＮＡでトランスホームする。ＣＲＥテスト細胞はこの様なスクリーニングにおいてコントロール細胞として使用される。

望ましい場合には、アデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムと共役した同一のレセプターでトランスホームしたＴＲＥブレ・テスト細胞、場合によってはＴＲＥテスト細胞もコントロールとして使用される。

レポーター遺伝子の発現量の変化に基づいてレセプター自体の内在的発現が測定結果を妨害するシグナルを発生するので、問題のレセプターを内在的に発現しない細胞は（ブレ・）テスト細胞の生産に適している。しかし、細胞が外来性レセプターを過剰生産し、その結果比較的に内在的発現が無視できるほど小さく、測定結果が影響を受けないならば、内在的にレセプターを発現する細胞を使用する事は排除されない。細胞が基本的に本発明の方法の（ブレ・）テスト細胞として適しているかどうか、例えば、テスト物質によるホスホリパーゼＣ・エフェクターシステムへの調節的効果を測定する特定のレセプターを全く、または僅かしか発現しないことを知るために使用する操作は、例えば、１センサーＤＮＡで哺乳類細胞をトランスホームし、問題のレセプターを活性化する事が知られている物質で処理することである。もし、細胞がこの処理に応答しないか、または限定された応答しかしないならば、基本的にこの細胞はテスト細胞として適していると考えられる。（ＣＲＥテスト細胞としての適性をテストする為には、ＣＲＥセンサーＤＮＡを用いること以外は同様にテストする）細胞がそのレセプターを発現するかどうかを知る別の方法には例えば、ＰＣＲ（ポリメレース・チェーン・リアクション）またはノーザン・プロットによる分子生物学的方法を用いて直接発現を測定する方法がある。

出来るかぎり数多くのレセプターをトランスホームできるように問題となるレセプターを内在的に全く発現しないか、または出来る限り発現が少ないような、出来るかぎり多くのテスト細胞を生産するのに適するな（ブレ・）テスト細胞生産用の原料細胞が選択されることが望ましい。

ＩＰｓ　／ＤＡＣ濃度を増加させる物質による刺激後ＴＨＥ調節レポーター遺伝子の強い発現を示す細胞、またはｃＡｌｉｌＰレベルを増加させる物質による刺激後ＣＲＥ調節レポーター遺伝子の強い発現を示すブレ・テスト細胞を使用する事が望ましい。薬剤の作用後、問題のレセプターをホスホリパーゼＣシグナル誘導経路と効率的に共役させるテスト細胞を得るために、先ず１つ以上のＴＲＥ要素、またはカルシウムによって活性化されるタンパク質をコードする配列を含むセンサーＤＮＡ　（ブレ・テスト細胞）　でトランスホームすることによりテスト細胞としての適性を哺乳類細胞について検討した。センサーＤＮＡでトランスホームしたブレ・テスト細胞を一方ではｃＡＭＰ濃度の増加をもたらす物質（例えばホルスコリン）で処理し、他方ではＩＰ、　／ＤＡＣ濃度の増加をもたらす物質（例えばＴＰＡ　）で処理した。もし、細胞力（ＴＰＡで処理した時のみシグナルを発生し、ホルスコリンで処理した時シグナルを発生しないならば、これはＩＰ、　／ＤＡＣ濃度の変化に特異的に応答するという基本的条件を満足しており、すなわち、細胞中での発現のクロストークはない（ＣＲＥテスト細胞にも同様の操作が行われる。ＣＲＥブレ・テスト細胞はホルスコリンに応答する）。

さらに、導入されるレセプターに関して生理学的に「正しい」共役が起こるかどうか、およびシグナル誘導経路が開始するかどうかを見定める簡便なブレ・テスト細胞の検定を行った。この事に関する必要条件には、細胞がそのレセプターに対して特異的なＧプロティン変異体くまたはレセプター特異的な変異体と機能的に置換しうるＧプロティン変異体）を含むことが挙げられる。この種の検討には、例えば、ブレ・テスト細胞を問題のレセプターでトランスホームし、既知のリガンドで処理し、レポーター遺伝子発現の調節が起こっているかどうかをテストする。

さらに、本発明の範囲で使用する細胞の適性に関する条件は、ブレ・テスト細胞として（センサーＤＮＡのみでトランスホーム）およびテスト細胞（センサーＤＮＡおよびレセプターＤＮＡでトランスホーム）として有用な細胞の安定性である。細胞の安定性（生存率、ゲノムへの外来ＤＮＡの安定な組み込み）をテストするために、ブレ・テスト細胞（第２メツセンジヤーの濃度に影響を与える物質による処理）およびテスト細胞（レセプターリガンドによる処理）を用いた同一条件下の長期間に渡る実験を行い、その結果の再現性を確認した。

適当な細胞の例にはＣ）１０（ｒチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞」系列）、Ｃ０３（モンキー腎細胞系列）　、Ａ３４９　（ヒト肺癌細胞系列）およびＪＥＧ−３（ヒトチョリオ力ルシノーマ細胞系列）がある。

本発明に従うブレ・テスト細胞は、一方ではレセプターＤＮＡを含むテスト細胞調製用の原料として使用し、他方では本発明の方法においてシグナルをテスト物質によるシグナル誘導経路のレセプター依存調節に寄因させつるかどうかをチェックするためのコントロール細胞として使用しうる。もし、この物質がテスト細胞においてシグナルを発するが、コントロールとして使用したブレ・テスト細胞ではシグナルを発生しないならば、シグナルにより検出されるレポーター遺伝子の発現の調節は排他的にレセプター依存である。例えコントロール細胞がシグナルを発しても、その物質はレセプター非依存的シグナル誘導経路のプロセスに影響している。このシグナルに対応するコントロール測定値をテスト細胞で得られた測定値から差し引かなければならない。

センサーＤＮＡは適当な宿主生物、望ましくは大腸菌中で高コピー数の複製が可能であり、哺乳類細胞へのトランスフェクションおよびヒトゲノムへの組み込み後、調節要素のコントロール下、レポーター遺伝子の発現を可能にするプラスミドに存在する事が望ましい。それはレポーター遺伝子（センサーＤＮＡ　）に関する発現カセットおよび哺乳類細胞に対する選択可能マーカー、並びに少なくとも１つの復製開始点、および大腸菌における複製および選択マーカーを含むシャトルベクターであることが望ましい。

ゲノム中に安定に組み込まれたセンサーＤＮＡを含む永続的細胞系列を生産するために、ベクターは優れた選択マーカーを含む。特定の選択マーカーの使用は本質的ではない。例えば、抗生物質ゼネチシン（Ｇ−４１８）に対する耐性を提供するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼの遺伝子（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、１９ｇ２）　、ＤＨＦＲ欠失細胞に対するＤＨＦＲＩＩ伝子（ジハイドロホレート・リダクターゼ）、マイコフェノール酸に対する耐性を提供するキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、１９８１）またはハイグロマイシレン〜Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ　、グリフ（Ｇｒｉｔｚ）およびデーピース（Ｄａｖｉｅｓ）、１９１１１３）が使用しうる。選択マーカー遺伝子をプロモートするプロモーターの例にはＳＶ４０アーリー・プロモーター、サイトメガロウィルスのプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ヘルペス・シンプレックス・ウィルスのチミジン・キナーゼ遺伝子のブロモ−クー（ＴＫプロモーター）、ラウス・ザルコーマ・ウィルス（ＲＳＶ）のロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）がある。プラスミドは例えば種々の細胞系列を使用する結果として、特定の用途から生ずる種々の必要条件に対応しつるようにレポーター遺伝子、レポーター遺伝子のプロモーターおよび選択マーカーの調節配列などの個々の重要な要素が簡単に交換又は修正できように構築することが望ましい。このような内容には、例えば、プロモーターの前に、またはレポーター遺伝子の前にマルチクローニング部位を含ませ、プロモーターを調節する調節配列または種々のレポーター遺伝子のクローニングを可能にすることが含まれる。

適当なレポーター遺伝子を選択するための前提は、高感度で望ましくは非放射性、自動化可能な検定法が提供されることであった。

本発明の範囲では、理論的にこれらの条件を満足する全てのレポーター遺伝子を使用することが可能である。

化学発光基質を使用する場合アルカリホスファターゼを高感度で測定することが出来るが、多くの哺乳類細胞がこの酵素を比較的高いレベルで発現しているという欠点がある。従って、一般にこれを発現しないか、またはごく僅かしか発現しない細胞系列に対してのみレポーター遺伝子として使用することができる。

β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現産物は各々メチルウンベリフェリル−ガラクトシドまたは−グルクロニドを切断して蛍光発色団を生成しうる。これらの酵素反応は確立された蛍光検定法で測定しうる（ライ− ランド（Ｗｉｅｌａｎｄ）等、１９８５、クリ力（Ｋｒｉｃｋａ）、１９８８）。

クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の発現は比較的高感度で明確に検出しつるが、取り分けこの検定法は放射能を使用し、かつ自動化しにくいという欠点を有している（ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎｎ）、ｌｌｌ ’ｌｌ）。

本発明の範囲においては、ホチナス・ビラリス・ルシフェラーゼをコードする遺伝子（デ・ウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８７）をレポーター遺伝子として使用することが望ましい。この酵素は、ＡＴＰの存在下、基質ルシフェリンにより高収率の生物化学発光を生成し、該生物化学発光は確立された指導下可能な方法で測定でき、カリ、この酵素は哺乳類細胞内で内在的に生産されていないという利点を有している。さらに、ルシフェラーゼは生体内での寿命が比較的短（、高濃度でさえ毒性が無い（ハートマン（Ｉｈｒｔｍａｎｎ）、１９９１、プレーシア（Ｂｒａｄｉｅｒ）等、１９８９）。

生物化学発光による蛍のルシフェラーゼの活性の測定は酵素の測定法のなかで最も感度の高いものの１つである。従って、ルシフェラーゼ活性が通常の哺乳類細胞には存在しないという観点から、この酵素は遺伝子調節の研究におけるレポーター遺伝子として特に適している（スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　）およびデル力（ＤｅＬｕｃａ）、１９８７）。

ルシフェラーゼ活性を測定することに関する１つの欠点は最高値を達成させる理想的反応条件下での光シグナルの安定性が乏しいことである（デル力（ＤｅＬｕｃａ）等、１９７９）。このことは、発光反応に必要な成分を基質溶液に添加した直後、生成する光を測定できる測定装置内でルシフェラーゼ活性を最もよく測定しうろことを意味している。レポーター遺伝子を用いた研究でルシフェラーゼ活性を測定する上でのもう一つの問題は酵素を放出させるための細胞の分解であり、そのためのステップがさらに必要となる（ブレーシア（Ｂｒａｓｉｅｒ）等、１９８９）。

また、本発明の別の特徴は、細胞培養物中で発現されたルシフェラーゼ活性を測定することを目的とする試薬に関する。

本発明の該試薬は単一ステップで直接細胞培養物中の発現されたルシフェラーゼ活性を測定することが可能である。この試薬は一方で界面活性剤により細胞を分解し、他方ではルシフェラーゼ反応に必要な基質を提供する。選択された基質を含む該試薬により、特に変化のない光シグナルが得られ、この事により試薬添加後２乃至２０分の間でルシフェラーゼ活性を測定することが可能となった。さらに、この試薬はレディー・トウー・ユースの状態で少なくとも１週間安定である。

この試薬には、トリシン、ＨＥＰＥＳ　、グリシルグリジン、リン酸、トリス等憧ましくはトリシン）の適当な緩衝物質を含む基本バッファが含まれる（リーチ（Ｌｅａｃｈ）およびウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）　、　１９８６）。このバッファのｐＨは６乃至９の範囲、望ましくは７乃至８の範囲にある。さらに、マグネシウム塩、望ましくは硫酸マグネシウム・７水塩（ＭｇＳＯ４・７　Ｈ，Ｏ）が１０乃至０．１ｇ／ｌ、望ましくは４ｇ／ｌの濃度で添加される。ルシフェラーゼ反応に必要な基質は以下の濃度で存在することが望ましい：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ　’Ｉ　Ｏ，０５乃至５　ｇ／ｌ　、望ましくは０．７　ｇ／ｌ　、ルシフェリン０．００１乃至０．１　ｇ／Ｉ　、望ましくは０．０１５　ｇ／ｌ　、さらに、バッファは約０．２ｇ／ｌの量のエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）等の複合体形成剤を含む。

望ましい基本バッファ（ルシフェラーゼ反応の基質を含む）には、２５ａ＋ｏｌ力のトリシン、０．５ａｎｏｌ／ＩのＥＤＴＡ、１６．３ｖｎｏＩ／Ｉ　Ｍｇ５Ｏ，・７　ＬＯ、ｌ　２ａｎｏｌ／Ｉ　ＡＴＰおよび０．０５ｖｎｏＩ／Ｉのルシフェリン・ナトリウム塩が含まれる。

ルシフェラーゼを安定化するために、ジチオスレイトール（ＤＴｒ　）またはβ −メルカプトエタノール等の温和な還元剤を単独または他の還元剤と組み合わせて使用する。この種の還元剤は酵素中のＳＨ基の酸化およびそれに伴う発光反応中のルシフェラーゼの失活をを防止する。ＤＴｒは０．１乃至５０ｇ／ｌ　、望ましくはＩｇ／ｌの濃度で使用する。ＢＭＥは０．１乃至５０ｍ１／　Ｉ　、望ましくは４ｍｌ／Ｉの濃度で添加する。

発光を安定化および強化するために、さらにトリポリリン酸ナトリウム（ＮａＴＰＰ）を０．００５乃至５　ｇ／ｌ　、望ましくは０．２ｇ／ｌの濃度で使用する。トリポリリン酸ナトリウムの代わりにビロリン酸ナトリウムも使用しつる。

細胞はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ　２０またはＮＰ４０、ブリッジ等の適当な界面活性剤を用いて分解する。Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００は０．０１乃至５％、望ましくは０．１％の濃度で使用する。

また、レポーター遺伝子としてアクオリア・ビクトリア由来の酵素アポアクオリンをコードする遺伝子を使用しつる（タナハシ（Ｔａｎａｈａｓｈｉ）等、１９９１））。この酵素はカルシウムイオンとの結合後、コファクターのコエレンテラジンの存在下で確立された自動化法によって測定しつる生物化学発光を高収率で生成する利点を有する。さらに、利点としてこの酵素は哺乳類細胞では内在的に発現されていないことが挙げられる。

センサーＤＮＡを構築する際、レポーター遺伝子は、一つ以上の先行す制■またはＣＲＥ　￥Ｒ節要素によって調節しつる構成的な、望ましくは弱いプロモーター要素のコントロール下に置かれる。最も適したセンサーＤＮＡの構築は、種々のセンサーＤＮＡプラスミド構築物で細胞を一時的にトランスホームし、一方ではレポーター遺伝子、他方ではコントロール配列を変化させ、その感度に関してレポーター遺伝子産物の測定値を評価することで決定する。当業者は特に哺乳類細胞の於ける発現に適したコントロール配列に親しんでいる。選択は当初は関連文献に従ってもよいしく例えばランドシュルツ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ）等、１９８８、ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）およびジャン（ｔｊｉａｎ）　、１９８９）　、実行するのが容易である先に述べた一時的トランスフエクション実験で絞っていき、目的を達成していくことも出来る。適当なプロモーターの例にはβ−グロビンプロモーターおよびπプロモーターがある。

望ましい場合には、既知の天然の、もしくは合成したプロモーターを、例えば、プロモーター機能に必要な最小配列にまで短縮するなどして修正する。望ましい場合には、ｃＡＭＰまたはＩＰ、　／ＤＡＣによって誘導しつる遺伝子であって、プロモーターおよび調節要素（セントミニ（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ）等、１９９０、デウーシ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）等、１９８８）　、例えばＩＣＡＭ−１遺伝子の５゛調節配列を含む遺伝子の調節配列を使用しうる。もし、アポアクオリン遺伝子をレポーター遺伝子として使用するなら、この遺伝子は強力な構造的プロモーターのコントロール下に置かれる。

一般に、センサーＤＮＡに含まれる調節配列（隣接配列を含も℃ＲＥまたはＴＲＥ要素）の選択は、所定の細胞系において感度良く検出可能なレポーター遺伝子の誘導を提供する適性を予備実験で検定した文献から知ることができる要素から始めて経験的に決定される。隣接配列を含む適当な調節要素の例には、ソマトスタチン［ヴアソアクティブ・インテスチナル・ペプチド」、サイトメガロウィルス・エンハンサ−１子牛白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（ＢＬＶ　ＬＴＲ）（ＣＲＥ要素）およびＩＣＡＭ−１、コラゲナーゼ、パラチロイド・ホルモン（ＴＨＥ要素）の配列が含まれる。もし、天然の配列中に含まれるＴＲＥまたはＣＲＥモチーフが完全なコンセンサス配列を有していないならば、これらを、または場合によってはこれらの隣接配列を１つ以上のヌクレオチドを交換することにより修正しつる。

調節要素（ＴＲＥまたはＣＲＥ要素）およびこれらの隣接配列は合成したものでも、天然のものに由来するものでもよい。もの、細胞型に依存してｃＡＭＰおよび／またはＩＰ、　／ＤＡＣに応答することが知られている天然の配列を使用するなら、細胞を例えｆｆ１ＰＡおよびホルスコリンで処理することにより、それが応答する第２メツセンジヤーに関してブレ・テスト細胞で調べておく。

センサーＤＮＡには１つ以上のＴＲＥ要素に加えて１つ以上のＣＲＥ要素を含ませる。

この種のセンサーＤＮＡを用いれば１つまたはもう１つののシグナル誘導経路の活性化または両シグナル誘導経路の平行した活性化の両方を検出しつる。

場合によってはレポーター遺伝子の発現に関するＩＰＳ　／ＤＡＧおよび／またはｃＡＭＰの調節効果を強調するために、多くのＣＲＥおよび／またはＴＲＥ調節配列をタンデムに含む構築物も使用しうる。この調節配列には３乃至１２個の１および／またはＣＲＥ要素が含まれることが望ましい。この構築物の個々の要素を整列させる際には、転写因子がＣＲＥまたはＴＲＥ要素に結合しつるように互いのＴＲＥおよび／またはＣＲＥ要素の間隔を選択する。また、立体的配置の観点から決定されるＴＲＢまたはＣＲＥ要素の至適間隔は、例えばＴＡＴＡボックス由米のもの等、転写に影響する他の調節ＤＮＡ要素からの間隔と同様に予備テストで経験的に決定する。丁ＲＥまたはＣ邪要素および／またはその隣接配列は同一か、もしくは少なくとも部分的に異なっていてもよいが、後者の態様はタンデム型になっていることが望ましい。

また、０匹またはＴＲＥ要素の調節能に影響を与えることが知られているＣＲＥまたは１要素に隣接する配列のように、天然において特定の調節要素を囲んでいる配列で特にその前後の配列を使用する事は望ましい（セントミニ（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ）等、１９９０、デウーシ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）等、１９８８）。その配列または配置は経験的に決定する。

センサーＤＮＡの要素および選択に使用するマーカー遺伝子は、２つの別個のプラスミド上に存在して、一方がレポーター遺伝子構築物を含み（調節配列を含む発現コントロール配列を含む）、他方が選択マーカー遺伝子構築物を含んでもよい。

適当な選択マーカー遺伝子構築物の例には、その構築法が、例えば「クローニングベクターｊ等の関連マニュアルで見ることができるプラスミドｐＲ５Ｖｎｅｏ　、　ｐＳＶ２ｎｅｏ　、　Ｉ）ＲＳＶｇｐｔ　、　ｐｓＶ２ｇｐ＋がある。もし、別個のベクターを使用した場合は、細胞をその２つのベクターでコトランスホームし、そのマーカーで選択する。選択マーカーの存在で互いに物理的に結合していないＤＮＡセグメ゛／ト上に存在する２つの遺伝子のコトランスホーメーンヨンはしばしばコトランスホーメーションされた両遺伝子の発現を誘導することが知られていることから、その細胞がレポーター遺伝子構築物も含むと結論づけさせる（ウィナツカ−（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ）　、１９８５）。

テスト操作で使用する測定システムに関しては、望ましくは、例えばプロモーター配置の構造的変化等センサーＤＮＡの構築法を変化させることにより、測定シグナルの最高値と通常値の比を完成させていくことが望ましい。バックグランド・シグナルは高感度でレポーター遺伝子発現の誘導を検出しうるのに十分なほど低（、同時にネガティブ・コントロールに関して検出限界を決定するのに十分なほど高いことが望ましい。

レセプターＤＮＡ構築物に関してはレセプター配列が強力で構成的なプロモーターのコントロール下にあることが望ましいこと以外は基本的にセンサーＤＮＡ構築物と同様の考え方が採用される。必要な場合は、レセプターをコードする配列および選択マーカーはレセプターＤＮＡの場合も同様に細胞にコトランスホームされた２つの別個のプラスミドに存在してもよい。

センサーまたはレセプターＤＮＡによる細胞のトランスフェクションは従来のトランスフエクション法、望ましくはエレクトロポレーション、カルシウム沈殿法、リポフェクションを用いて行う（例えば、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）等、１９８４、フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｔ）等、１９８７）。

一般に、細胞を先ずセンサーＤＮＡでトランスホームしてブレ・テスト細胞を作り、次いでレセプターＤＮＡをトランスホームしてテスト細胞を作製する。

他のエフェクターシステムによる誘導が最小となることを目的とする事から望ましくはセンサーＤＮＡの構築はブレ・テストまたはテスト細胞の単一の特定のエフェクターシステムにより最高の誘導性が達成されるように完成度を高めることが望ましい。従って、ＴＲＥテスト細胞はレセプター依存的にホスホリパーゼＣシグナル誘導経路を調節する物質に特異的に応答する事が望ましい。

先に説明したようにテスト物質によるレセプター非依存的影響を除外するために、平行して対応するＴＲＥブレ・テスト細胞をこの物質で処理する。ホスホリパーゼＣ−エフェクターシステムに関するこの物質の特異性を明確にするために、場合によってはネガティブ・コントロールとしてブレ・テスト細胞をＣＲＥ−センサーＤＮＡでトランスホームし、誘導されたテスト細胞をさらに検定している同じレセプターでトランスホームする測定を行う。

発見された物質により検定しているレセプターに関するホスホリパーゼＣ−シグナル誘導経路への影響をモニターするためには、さらにＴＲＥテスト細胞を別の種々のレセプターでトランスホームし、この物質で処理するコントロールテストを行うと便利である。もし、一般に薬剤の特異性に関してはそうであるようにある物質だけが特異的に１つのレセプターに影響するならば、この物質だけがそのレセプターを調節しうる。

皿テスト細胞を得るためのＴＲＥブレ・テスト細胞のトランスフェクションに適したレセプターは、ホスホリパーゼＣ・シグナル誘導経路と共役しうるすべてのレセプターである。これらには、αヨ型のα−アドレノセブター（アドレナリン）−レセプター、アンジオテンシン■レセプター、アトリオナトリウレチック・ペプチドレセプター、ボンペンシン・レセプター、ブラジキニン・レセプター、コレシストキニンおよびガストリン・レセプター、エンドセリン・レセプター、メタボトロフィック・エフシタトリー・アミノ酸レセプター、ヒスタミン・レセプター（Ｈ＋）　、セｏトニン・レセプター（５−ＨＴ＋ｃ、５−ＨＴり、リュウコトリエン・レセプター（ＬＴＢ、、ＬＴＤ４）、ムスカリニック・アセチルコリン・レセプター幅、Ｍｌ、Ｍ、）、ニュウロペプチド・Ｙ−レセプター（また、Ｐを、ＮＰＰ）、ニュウロテンシン・レセプター、ＰＡＦ　（血小板活性化因子）レセプター、プロスタノイド・レセプター（ＥＰ、、　、ＦＰ、　ＴＰ）　、Ｐｔ−ブリオセプタ−（Ｐ、ガンマ）、タチキニン・レセプター（ＮＫ＋、　ｔ、　ｓ　）　、パップレシンおよびオキシトシン・レセプター　（ＶＩＡ　、’ｂｓ　−ｆｆｒ）、トロンビン・レセプター等が含まれる。また、これらの多くはアデニレート・シクラーゼ等の他のエフェクターと共役しうる。先に述べたレセプターおよび他の適当なレセプター並びにそれらのレセプターが共役するエフェクターは文献中に見られる。例えば、ＴｉＰＳレセプター・ノーメンクレーチャー・サブルメント、１９９１に纏められている。

ホスホリパーゼＣを活性化し、従って基質細胞をトランスフェクションするのに本発明にしたがって使用しつる非−Ｇプロティン共役レセプターの例には、ＦＧＦ−レセプター、インシュリン・レセプター、ＰＤＧＦ−レセプター、Ｅｌ：ＪＦ−レセプター群のメンバーが挙げられる（ウルリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）およびシュリジンガ−（ＳｃｈＩｅｓｓｉｎｇｅｒ）、１９９０）。

アデニレート・シクラーゼ・エフェクターに共役し、ＣＲＥテスト細胞を得るためにＣＲＥブレ・テスト細胞をトランスフェクションするのに使用しつるレセプターもＴｉＰＳレセプター・ノーメンクレーチャー・サブルメント、１９９１に示されている。この例にはアデノシン（ＡＩ、　Ａ２）　、アドレナリン（β− およびαヨー型）、ドーパミン（ＤＩ、　Ｄ２１（ＤＪ　、Ｄｚｓ　（’Ｄｔｉ　）　、ヒスチジン（Ｈｔ−型）、セロトニン（５−ＨＡ　Ｉ　Ａ−および５− 酊、Ｄ−型、５−１１７４　）　、アセチルコリン（ト）、−また３誌、−型）およびエンセファリンに対するレセプターが含まれる。

（もし、またクローン化されていないレセプターまたはそのｃＤＮＡが適当なベクターに準備されていないレセプターを使用するなら、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムバンクのスクリーニングによってレセプターＤＮＡを入手し、クローン化することが出来る。

もし、レセプターがアデニレート・シクラーゼと負に共役している（例えば、Ｍ、−またはＭ４−型のアセチルコリン・レセプター、ニュウロペプチド・Ｙ−レセプター）、すなわち、レセプターの活性化がｃＡＭＰａ度の低下をもたらすならば、ｃＡＭＰＩ度の減少は以下のように測定する。細胞をテスト物質で処理する；もし、アゴニスト適に作用する物質ならばレセプターが活性化され、ｃＡＭＰレベルが低下する。同時もしくはその後、細胞をｃＡＭＰ濃度を増加することが知られている物質で処理する。また、逆に先ずｃＡＭＰ濃度を増加し、次いで検定する物質とのインキュベーションを行うこともできる。（ｃＡＭＰレベルの増加は、例えばホルスコリンを用いて直接的に、またはアデニレート・シクラーゼと正に共役しているレセプターに関してアゴニスト効果を有している物質で細胞を処理することにより間接的に行うことができる。このレセプターは内在性レセプターか、または細胞にコトランスフェクトしたレセプターである。）　コントロールとして、ｃＡＭＰ濃度の増加のみが測定される同一のインキュベーション条件の平行テストを行う。シグナル値の差は物質の活性に寄因させうるｃＡＭＰ濃度の低下に対応する。これはアデニレート・シクラーゼ活性のレセプター依存的低下の尺度となる。もし、細胞内に本来存在するｃＡＭＰ濃度が非常に低く、従ってこの濃度の減少が測定器で検出しえない場合は、負のアデニレート・シクラーゼの共役によりレセプター活性化を間接的に測定することが必要となる。

取り分け、クロストークによりホスホリパーゼＣシグナル誘導経路に加えて活性化がアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムを調節するレセプターも本発明の範囲内で使用しうる。もし、センサーＤＮＡがＩｐｓ　／ＤＡＣ濃度の変化のみに応答するなら（ＴＲＥ−センサーＤＮＡ　）　、ＴＨＥ要素が結合するシグナルは転写因子が活性化したときに発生する。平行してアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムが活性化されているかどうかとは無関係にシグナルまたはシグナルの一部はクロストークによって発生する。

レセプターＤＮＡによる細胞のトランスホーメーション後、例えば、既知の放射能標識したアゴニストおよびアンタゴニストを使用する結合検定法を用いて、ポジティブクローンをレセプター発現に関して検定する。

細胞当たりのレセプターの分子数はスキャッチャード・プロットで決定しつる（Ｈｕｍａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　１９９１）。

生理学的レセプター濃度に出来るかぎり近いレセプター数を有するクローンをレセプターＤＮＡを含む安定したトランスホーマントから選択することが望ましい。

（もし、レセプター数が高すぎる場合は、不完全または非特異的結合が起こり、特異的結合に加えて非特異的結合が同時にだのエフェクターシステムを活性化してしまう。もし、レセプター数が少ない場合はシグナルが小さすぎて測定にかからなくなってしまう）一方はＩＰｓ　／ＤＡＣ濃度に応答し、他方はｃＡｌｉ［Ｐ濃度に応答する２つの興なるブレ・テスト細胞に１つのレセプター、またはレセプターサブタイプをトランスフェクトしうる。（平行して使用する細胞は他のエフェクターシステム、例えばアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムに特異的なセンサーＤＮＡを用いた検定により、例えば、ホルスコリンおよびＴＰＡ等のｃＡＭＰまたはｒｐｓ　／ＤＡＣ濃度を増加させるか、またはそのような増加を誘導する物質で細胞を処理することでｃＡＭＰシグナル誘導経路による特異的活性化が起こるかどうかを調べてお（。これらの予備テストで使用する細胞は安定したトランスホーメーションを必要としないセンサーＤＮＡのみでトランスホーメーションした細胞、またはレセプターＤＮＡとコトランスホームした細胞のいずれかである。後者の場合、培地にはレセプターを活性化する物質を含めるべきではない。細胞がホルスコリンにのみ応答することが確認されれば、ＴＲＥ／レセプター・トランスホーム細胞を用いて行った検定をＣＲＥテスト細胞を用い、同条件下で繰り返す。）特異的ＴＨＥ細胞および特異的ＣＲＩ！細胞およびＩＰ、　／ＤＡＧおよびｃＡＭＰに応答するテスト細胞における特定の物質および特定のレセプター（サブタイプ）を用いて得られたデータを比較することにより、そのシグナルをどの程度クロストークに寄因させつるか、どのようにシグナルを２つのエフェクターシステムの内の１つのみの影響に結び付けつるかを確認する事ができる。

本発明の方法に従い潜在的な医薬的活性を検定する物質は天然物でも合成物質でもよく、純物質でも混合物（例えば野菜抽出物、醒酵液等）でも使用しつる。

特に純物質は低分子合成有機物でもよい。最も大きな濃度範囲を検出するために物質の段階的希釈物を細胞に作用させる。インキュベーション時間は、例えば、所定のテスト細胞を既知のレセプターアゴニストで処理し、レポーター遺伝子発現の誘導が再現的に測定される時間を計測する事などにより経験的に決定する。

一般にこの時点でインキュベーションを止めるが、通常は少なくとも１時間はかかる。テスト細胞の絶対数は重要ではない。特に細胞数は測定シグナルの検出限界および細胞の生育段階に依存し、その下限はテストユニット上で細胞を均一・に分布させる技術によって制限される。９６大のマイクロプレートを使用する場合、細胞数は例えばテストユニット当たり約２０．０００乃至２００．０００細胞となるが、測定シグナルカ叶分感度を持ち、細胞の分布が正確に行われるなら、より低い細胞数が用いられる。細胞の生育段階は開始細胞の細胞型特異的性質に依存する。さらに、これは基本的に特定のレセプターによって決定される（種々のレセプターに関して、同じエフェクターシステムでも生育段階に依存して活性化の程度が異なる）。細胞の生育段階および細胞数も種々の生育段階におけるブレ・テストおよびテスト細胞におけるレポーター遺伝子発現の速度を測定する予備実験で経験的に決定する。

本発明の範囲において、ＴＲＥ−センサーＤＮＡでトランスホームした種々の細胞（ｌブレ・テスト細胞）がＤＡＣを刺激することが知られている物質の添加に応答し、それによりレポーター遺伝子の発現を誘導する一方、それらはｃＪＮ１加部室には２答しないことを示すことができる。（センサーＤＮＡは調節要素として罫の要素を含むヒトＩＣＡＭ−１遺伝子（細胞内粘着分子ｌ）の１．３ｋｂ５°隣接領域、または多くのタンデムに配列したＩＣＡ！ｉ！−１遺伝子のＴＨＥ要素を含んでいる）。ホスホリパーゼＣシグナル誘導経路と特異的に共役するレセプター（ヒト５−ＨＴｌ−レセプター、ニュウロキニン２−レセプターおよびヒトＭ、−レセプターが使用された）で皿ブレ・テスト細胞をトランスホームする場合、レセプターアゴニストによる処理後ルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定した。このアゴニストにより仲介される誘導はアンタゴニストの添加で停止した。一方、この効果はｃＡＭＰに応答するブレ・テスト細胞にホスホリパーゼＣ共役レセプターがトランスホームされた場合は検出されなかった。

また、本発明の範囲において、ＣＲＥ−センサーＤＮＡでトランスホームした（ＣＨＯ細胞（ＣＲＥブレ・テスト細胞）におけるＣＲＥ調節レポーター遺伝子の発現は、ｃＡＭＰの濃度を増加する物質によってのみ増加した。ＩＰｓ　／ＤＡＣ濃度の増加をもたらすか、またはこれを刺激する物質によるＣＲＥブレ・テスト細胞の処理ではルシフェラーゼ発現は誘導されず、またはドーパミンおよびムスカリニック・アセチルコリン・レセプターに対するアゴニストである物質により処理でもその発現は誘導されなかった。後者の結果は、細胞が内在的にこれらのレセプターを発現していないことを示している。ＣＲ１３ブレ・テスト細胞をアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムと正に共役するレセプターでトランスフェクションした場合（ドーパミンＤ＋−レセプターを使用した）、ＤＩ−レセプターに対するアゴニストでルシフェラーゼ発現を誘導でき、また、この誘導は再びアンタゴニストで停止する。

本発明をによりレセプター依存的に細胞内のシグナル誘導経路を特異的に調節しつる物質を提供する高感度で多機能な方法が提供される。本発明にしたがった方法で見つかった物質はシグナル誘導経路の機能不全と関連する病気を治療するための薬剤の開発を目的としたガイド物質として役立つし、また、さらに例えば− 次細胞を用いた二次スクリーニングおよびその後の動物の臨床試験によるそれらの医薬的性質の検定に使用しうる。従って、必要とされる動物の数は本発明の方法を使用する事により有意に軽減される。

また、本発明の方法は、例えば９６六マイクロプレート等の細胞培養容器の導入、テスト物質溶液の導入、インキュベーションおよび洗浄ステップおよび、例えばレポーター遺伝子産物としてルシフェラーゼを使用した場合のりミノメーター等の装置はロボットで運転することが出来ることから自動化しつるという利点を有する。従って、本発明は例えば、１週間に２０００種の物質または物質の混合物をテストしうる高効率のスクリーニング・プロモーターに適している。

また、本発明の方法を用いることにより、リガンド結合部位に関して非競合的に作用するアロステリックに作用する物質を検出しつる。

さらに、本システムの利点には、ある物質が特定の多段階レセプター依存細胞内シグナル誘導経路のい（つかの段階に介在する場合に、特定のシグナル誘導経路の調節に最も好ましいパラメーターを検出できる期待がより大きいという事がある。使用しうる多数のレセプターおよびレセプター・サブタイプに関する本システムの多様性は医薬的に活性な物質を発見するのに種々の指示タイプの使用を可能にしている。また、本発明のシステムは特異的レセプターおよびレセプター・サブタイプを注意深く選択することにより種々の細胞システム、例えば中枢神経系や末梢神経系における重要メカニズム間の優れた特異性を区別しつる。

また、本発明の方法により、リガンドに対する医薬的または生化学的特徴を明らかにされたレセプターをクローン化しつる。オペレーターは対応するブレ・テスト細胞系列をトランスホームするｃＤＮＡまたはゲノムバンクを取り扱うことから始める。レセプターの発現はレセプターがリガンドの結合により活性化された後のレポーター遺伝子の発現により示される。

（図面の説明）第１図・プラスミドｐＡＤｎｅｏの構築第２図ニブラスミドｐＡＤｎｅｏＴＫの構築を目的としたＰＣＲ後のＢｇｌｌ　ｌ−Ｂａｍ）ＩＩフラグメント第３図ニブラスミドｐＡＤｎａｏＴＫ第４図Ａ　ニブラスミドｐＡＤｎｅｏＴＫｌｕｃｉの構築第４図Ｂ　プラスミドｐＡＤｎｅｏＢＧＩｕｃｉの構築第５図、プラスミドｐＲｃ／Ｒ３ＶΔＮａｅ　Ｉの構築第６図・プラスミドｐＲｃ／Ｒ３Ｖｎｅｏの構築第７図、プラスミドｐＡＤｎｅｏ２８Ｇ１ｕｃｉの構築第８図、３個のＣＲＥ要素を含むオリゴヌクレオチド配列第９図二６個のＣＲＥ要素を含むプラスミドｐＡＤｎｅｏ２−６Ｃ− ＢＧＬの構築第１０図、プラスミドｐＨＥＢ。

第１１図　プラスミドｐ２９０第１２図・プラスミドｐＡｌ（ｙｇｃＭＶ１第１３図、プラスミドｐＡＨｙｇＣＭＶ２第１４図・プラスミドｐＢＨＩｕｃ１．３第１５図：　ｒｃＡＭ−ｉ遺伝子の５′調節配列を含むプラスミドｐＡＤｎｅｏ（１，３ＩＣＡＭ）ｌｕｃｉ第１６図：　ＩｃＡＭ−１遺伝子の３個のＴＨＥ要素を含むプラスミドｐＡＤｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧＩｕｃｉ第１７図　５ＨＴルセブターをコードする配列を含むプラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ２−５ＨＴｔ第１８図　ドーパミン−ＤＩ−レセプターをコードする配列を含むプラスミドｐＡＤ−ＯＪＶ２：Ｄｌ第１９図Ａ：ＮＫ２レセプターをコードする配列を含むプラスミドｐＡＩ（Ｙｇ −ＮＫ２第１９　図Ｂ　：　５ＨＴ２レセプターをコードする配列を含むプラスミドｐＡＨＹＧ−５ＨＴ２第２０図：細胞系列Ａ３４９、ＨｅＬａおよびＣＯ３ −７におけるＴＰＡによる皿−センサーＤＮＡ（ｐＢＨｌｕｃｌ、３　）の誘導第２１図Ａ：ＨａＬａ細胞においてＴＰＡによって起こるがホルスコリンによっては起こらないＴＲＥ−センサーＤＮＡ　（ｐＢＨｌｕｃｌ、３　）の誘導策２１図Ｂ：ＣＯＳ細胞においてＴＰＡによって起こるがホルスコリンによっては起こらないＴＲＥ−センサーＤＮＡ　（１）ＢＨＩｕｃｌ、３　）の誘導第２２図：細胞系列Ａ３４９、ＨｅＬａおよびＣＯ３においてＴＰＡによって起こるがホルスコリンによっては起こらないＴＨＥ−センサーＤＮＡ　（ｐＡＤｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧｌｕｃｉ）の誘導第２３図Ａ　：ＣＯ５−７細胞におけるＴＰＡによる、３または６個のｍ要素が互いに異　なる間隔で含まれているＴＲＥ−センサーＤＮＡの誘導策２３図Ｂ：Ａ３４９細胞におけるＴＰＡによる、３または６個のＴＲＥ要素が互いに異なる間隔で含まれている１−センサーＤＮＡの誘導第２４図：　ＣＯ５−７細胞においてムスカリンｔ４Ｊ１１３レセプターにアゴニスト的に作用する物質を結合する事によるＴＨＥ−センサーＤＮＡ　（ｐＡＤｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧｌｕｃｉ）の誘導第２５図：Ａ）５ＨＴ、レセプターＤＮＡでトランスホームしたＣＯ３−７細胞においてアゴニスト的に作用する物質を５ＨＴｔレセプターに結合することによるＴＲＥ−センサーＤＮＡ　（Ｉ）ＢＨｌｕｃｌ、　３）の誘導Ｂ）５ＨＴ、レセプターＤＮＡでトランスホームしたＣＯ３−７細胞における５ＨＴ！レセプターに対してアゴニスト的に作用する物質によるＣＲＥ−センサーＤＮＡ　（ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬ）の非誘導第２６図二Ａ）ドーパミンＤルセプターＤＮＡでトランスホームしたＣＯ５−７細胞においてＴＰＡによっては起こるが、ドーパミンＤＩレセプターに対してアゴニスト的に作用する物質によっては起こらないＴＲＥ−センサーＤＮＡ　（ｐＢＨｌｕｃｌ、　３　）の誘導Ｂ）ＣＯ５７細胞においてホルスコリンおよびドーパミン−Ｄｌ−レセプターにアゴニスト的に作用する物質を結合する事によるＣＲＢ−センサーＤＮＡ（ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬ）の誘導第２７図：ＴＲＥブレ・テスト細胞系列およびヒトのニュウロキニン２レセプターを発現するＴＨＥテスト細胞系列ＮＫ２− １２２のおけるルシフェラーゼ発現の誘導第２８図：ＮＫ２特異的アゴニストによるルシフェラーゼ誘導の速度論第２９図Ａ：ニュウロキニンによるヒトのユニつロキニン２レセプターの活性化に依存するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線第２９図Ｂ：ニュウロキニンレセブターに対するアゴニストによるヒトのニュウロキニン２−レセプターの活性化に依存するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線第３０図：ＮＫ２特異的アンタゴニストによるニュウロキニンへのアゴニスト的活性の阻害第３１図：　５８Ｔ２レセプターを発現するテスト細胞系列におけるセロトニン誘導型ルシフェラーゼ発現の速度論第３２図：アゴニストによるヒトの５）ＩＴ２レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線第３３図：ｃＡＭＰまたはＩＰ３／ＤＡＣ濃度を修正するか、またはそれらの濃度変化を誘導する種々の物質またはレセプター特異的アゴニストによるＣＲＥブレ・テスト細胞（ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬで安定にトランスホームしたＣＨＯ細胞）処理第３４図：ホルスコリンによるＣＲεブレ・テスト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子の活性化の転写に関する投与量・活性曲線第３５図Ａ：ホルスコリンの投与量に関するＣＨＯ細胞中でのルシフェラーゼ誘導の速度論第３５図Ｂ：ホルスコリンの投与量に対するＣＨＤ細胞におけるルシフェラーゼ誘導の速度論第３６図・ＣＲＥ−センサーＤＮＡおよびドーパミン−ＤＩ−レセプターＤＮＡで安定にトランスホームしたＣＨＯブレ・テスト細胞およびテスト細胞の種々の物質による処理第３７図Ａ、第３７図Ｂ、第３８図Ａ、第３８図Ｂ　＝ドーパミンーＤＩ−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線第３９図Ａ１第３９図Ｂ　：ドーパミンーＤ５−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線第４０図：ルシフェラーゼ活性を測定するための試薬の完成本発明は、以下に示す実施例によってより良（説明される。

実施例で使用されている物質の活性は以下に示す表に示されている。

Ａ２３１８７　Ｃａ”−イオノフオアアポモルフイン　ドーパミン・レセプターに対するアゴニストアトロピン　ムスカリン性レセプターに対するアンタゴニスト［異的）ブロモクリプチン　ドーパミン・レセプターに対するアゴニストカルバコール　ムスカリン性レセプターに対するアゴニストアロピン　ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（Ｄ４特異的）ジブチリル−ｃＡＭＰ　膜透過性ｃＡＭＰ誘導体（ｄｂｃＡＭＰ）ドーパミン　ドーパミン・レセプターに対するアゴニストフルペンチクソール　ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（ＤＩ特異的）ホルスコリン　アデニレート・シクラーゼの刺激剤（ｃＡＭＰの増加）ハロペリドール　ドーパミン、レセプターに対するアンタゴニスト（Ｄ２特異的）ＩＢＭＸ　ホスホジェステラーゼ阻害剤（ｃＡＭＰの蓄積）ケタンセリン　セロトニン・レセプターに対するアンタゴニスト（５−）ｎ’！特異的）ＰＩｉｌＡ（ＴＰＡ）　プロティン・キナーゼＣアクナベ−ター、ＩＰ、　／ＤＡＣを刺激５ＣＨ２３３３９０ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（Ｄｉ特異的）セロトニン＜５−ＨＴ）　セロトニン・レセプターに対するアゴニストセピロペリドール　アンタゴニスト（！ｒＨＴ＋Ａ−レセプター〉ドーパミン・レセ（：スピペロン）　ブタ−）ＳＫＦ−３８３９３ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（ＤＩ特異的）実施例１哺乳類細胞におけるレポーター遺伝子の発現を目的とした基本ベクターの調製ａ）プラスミドｐＡＤｎｅｏの構築プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（ショート（Ｓｈｏｒｔ）等、１９８８、ストブタジーン、う・ジョン、ＣＡ）およびｐＲｃ／ＣＭＶ　（インビトロゲン、サン・ディエゴ、ＣＡ：カタログ番号Ｖ７５０−２０　）の一部から、大腸菌における複製開始点（ｏｒｉ）およびアンピシリン耐性の選択マーカー（Ａｍｐ　、β−ラクタマーゼ）を含むプラスミドを調製した。Ｍ１３のインタージェニック領域はへルバーファージ（例えば、Ｒ４０８またはＭ１３ＫＯ？　、ストブタジーン）によるトランスホームしたバクテリアのスーパーインフヱクション後の一本鎖の調製を可能にし、該プラスミドのシーケンシングおよび突然変異誘発を容易にする。さらに、ＳＶ４０のアーリー・プロモーター（ＳＶ４０）の転写コントロール下にあるネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ　）およびＳＶ４０のポリアゾニレ−ジョン・シグナル（ＳＶ４０　ｐｏｌｙ（Ａ））も存在する。

プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｄｒｉｐｔ　ＳＫ＋をＨｉｎｄｌｌｌで線状にし、ＤＮＡ　１００　ｎｇをＩ００μｌのＰＣＲ混合物（（サイキ（Ｓａｉｋｉ）等、１９８８）　（反応液：５０ｏ＃　ＫＣＩ　、１０−　トリス−ＨＣＩ（１）Ｈ８，３）　、１．５−ＭｇＣ１ｔ　、０．０１％　（ｗ／ｖ　）ゼラチン、０．２ｍＭ　各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴｒＰ）　、１００　μｌ当たり２．５ユニツトのＴａｑポリメラーゼ）に入れた。使用したプライマーは各５０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＥＢＩ−１７３０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧ−３°）および９４℃、５分間の変性後、ｌＯサイクルのＰＣＲを行った（サイクル条件：９４℃、４０秒；５５℃、４５秒；７２℃、５分、パーキン・エルマー・シータス、サーマル・サイクラ−）。オリゴヌクレオチドは中間にβ−ラクタマーゼ遺伝子を有するＭ１３のインタージェニック領域または複製開始点（ｏｒｉ）に隣接している。同時に、ｏｒｉの一端にＸｈｏ１部位、他端にＥｃｏＲ１部位が生成する（オリゴヌクレオチド配列の下線部分）。フェノール・クロロホルム抽出でタンパク質を除き、ＤＮＡをエタノールで沈殿させる。得られたＤＮＡをＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで切断し、アガロース・ゲル電気泳動で２．２ｋｂの７ラグメントを単離した。

プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶをＦ、ｃｏＲ［および５ａｌｌで二重切断した後、アガロース・ゲルを用いた電気泳動で分離して、ＳＶ４０プロモーター、ｎｅｏ遺伝子およびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含む１．５ｋｂのフラグメントを単離した。２．２ｋｂのベクターＤＤＮＡ１００ｎを２−３倍量の１．５ｋｂの挿入ＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、１４℃で一晩インキユベーションし、次いで、ＤＮＡ取り込みようにコンピテント細胞とした大腸菌ＪＭ１０１　（チャン（Ｃｈｕｎｇ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８Ｂ）にこのＤＮＡ試料をトランスホームした後アンピシリン耐性で選択した。生成したコロニーからプラスミドＤＮＡを取り出し、種々の制限酵素による切断で特徴を調べた。望ましい構造のプラスミドをｐＡＤｎｅｏと命名した（第１図）。

ｂ）プラスミドｐＡＤｎｅｏＴＫの構築プラスミドｐＡＤｎｅｏの中に２つのポリクローニング部位に隣接するヘルペス・シンプレックス・ウィルス・タイプＩ（ＨＳＶ−１）のチミジン・キナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター領域を挿入した。このＤＮＡフラグメントはＰＣＲによって生成した。

耐プロモーターの前駆体として、プラスミドｐＸｌを使用しくワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９８１）　、ポリクローニング部位は５゛末端での増幅プライマーの延長で生成させているので、５′末端はもはや前駆体に相補的ではなくなっている。１００　ｎＨのプラスミドｐＸｌを各々５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＥＢＩ−２９８３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）　（５°−ＧＡＣＴｒＣ２９８４（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：６）　（５°−ＧＡＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＡσ［ＴσｒＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＴfＴＴＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＣ−３’　）を用イタ２０サイクルノＰＣＲニかケタ（サイクル条件 −９４℃、４０秒；５５℃、４５秒；７２℃、１分）。フェノール／クロロホルムによるＴａｑポリメラーゼの除去およびＤＮＡのエタノール沈殿後、末端をＢａｍＨＩおよＩ：ａｇｌｌＩ　（下線部分）で切断し、アガロース・ゲルによる電気泳動で０．２ｋｂのフラグメントを単離した（第２図）。次いで、このＤＮＡをＢａｍ１ｌｌで線状化したプラスミドｐＡＤｎｅｏと連結し、大腸菌ＪＭＩ０１にトランスホームし、た。ｎｅｏ遺伝子と同じ配向のＴＫプロモーターを有するプラスミドをｐＡＤｎｅｏＴＫと命名した（第３図）。これは露プロモーターの５′側にプロモーターを調節する調節配列をクローニングするためのＮｏｔｌ、Ｘｈｏｌ、ＫｐｎＬ　）Ｉｐａｌおよび５ａｉｌ切断部位を含み、かつ、耐プロモーターの３′側にレポーター遺伝子の挿入に使用するＨｉｎｄｌｌｌ　、ＸｂａＬＳｐｅｌ、　５ａｃｌおよびＢａｍＨＩ切断部位を含む。

Ｃ）プラスミドｐＡＤｎｅｏＴＫｌｕｃｉの構築ＳＶ４０　ｐｏｌｙ（Ａ）領域を含む７オチナスービラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ遺伝子を２．．５ｋｂのＨｉｎｃｌｌｌｌ　−ＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミドｐＳＶ２３２ＡＬ−ＡΔ５“（デ・つｚット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８７）の誘導体ｐＢＨ１ｕｃ　（ボラバーガーｆｆｏｒａｂｅｒｇｅｒ）等、１９９１）から単離した。ｐＡＩ）ｎｅＯＴＫをＨｉｎｄｌＩＩおよびＢａｍＨＩで二重切断し、プラスミドｐＢＨＩｕｃ由来の２．５ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントに連結した。

大腸菌ＪＭＩＯＩのトランスホーメーション後に得られた望ましい構造のプラスミドをｐＡＤｎｅｏＴＫＩｕｃｉと命名した（第４図Ａ）。このプラスミドで哺乳類細胞においてＴＫプロモーターのコントロール下、ルシフェラーゼの発現が可能となった。

ｄ）プラスミドｐＡＤｎｅｏＢＧ　ｌｕｃ　ｉの構築レポーター遺伝子の誘導能を向上するために、ＴＫプロモーターをウサギβ−グロビン遺伝子の最小プロモーター配列で置換した。プラスミドｐＡＤｎｅｏＴＫｌｕｃｉを５ａＩＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで二重切断し、アガロース・ゲルからベクター成分を単離した。

５ａｉｌおよびＨｉｎｄｌｌｌ適合末端に隣接するβ−グロビンプロモーターは、合成オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３１８２（ＳＡＱ　１０　ＮＯニアＸ５’　 −ＧＡＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＡＧＴｒＣＴＡＧＡＡ`Ｇ５ＡＣＧＣＴＧＴｒＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＣ−３’　）およびＥＢＩ−３１８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８Ｘ５’−ＡＧＣ’ｎ’ＧＴＭＧＣOＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴｍＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧ−３’　）ニヨり調製シタ。コレら２つのオリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼおよびＡＴＰとインキュベートすることにより５°末端をり〉酸化し、次いで先に述べたベクターに連結した。大腸菌ＪＭ１１）１へのトランスホーメーション後、正しい配列を含むプラスミドをｐＡＤｎｅｏＢＧｌｕｃｉと命名した（第４図Ｂ）。

ｅ）プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶΔＮａｅｌおよびｐＲｃ／Ｒ３Ｖｎｅｏの構築ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドの複製が可能な細胞系列（例えばｃｏｓ−７（ＡＴＣＣＣＲＩ、１６５１）および２９３（ＡＴＣＣ：　ＣＲＬ１５７３））においてセンサーＤＮＡを使用するために、上述のプラスミド中のｎｅｏ遺伝子をコントロールするＳＶ４０プロモーターを別のプロモーター（例えば、ラウス・ザルコーマ・ウィルス（Ｒ５Ｖ）ロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）　）で置換する別の細胞を用いた比較実験をすることが望ましい。

ｎｅｏ遺伝子のための新しいカセットを調製するために、以下に述べるプラスミドｐＲｃ／Ｒ３ＶΔＮａｅ　ＩおよびｐＲｃ／Ｒ１Ｖｎｅｏを調製した。

プラスミドｐＲｃ／Ｒ３Ｖ（インビトロサン、サン・ディエゴ、ＣＡ：カタログ番号Ｖ７８０−２０）をＮａｅｌで切断し、アガロース・ゲルから３．８ｋｂのベクター成分を単離し、再連結した。結果的にｎｅｏ遺伝子を含む１．６ｋｂのフラグメントが欠失した。このプラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶΔＮａｅｌと呼ぶ（第５図）。

ｐＲｃ／Ｒ３ｖΔＮａｅｌをＨｉｎｄｌＩＩおよびＸｂａ　Ｉで二重切断し、次いで、４種のデオキシヌクレオチドの存在下、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント（クレノー酵素）による処理でＤＮＡ末端を平滑化した。

プラスミドｐＡＤｎｅｏをＥｃｏＲＶ’およびＢｓｔＢＩで二重切断し、これも同様にクレノー酵素による処理でＤＮＡ末端を平滑化してｎｅｏ遺伝子を含む０．８６ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した。上述のベクターとのライゲーションおよびトランスホーメーション後、得られた望ましい構造のプラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶｎｅｏと命名した（第６図）。

このプラスミドはＲ５Ｖプロモーターの転写コントロール下のｎｅｏ遺伝子および子牛成長ホルモン（ｂＧＨ）およびＳＶ４０のポリアゾニレ−ジョン・シグナルを含む。

ｆ）プラスミドｐＡＤｎｅｏ２ＢＧＩｕｃｉの構築ｐＡＤｎｅｏＢＧＩｕｃｉの発現カセットＳＶ４０プロモーター−ｎｅｏ遺伝子−３Ｖ４０　ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルをプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶｎｅｏ由来の発現カセットＲＳＶプロモーター−ｎｅｏ遺伝子七んＨｐｏｌｙ（Ａ）と交換した。

プラスミドｐＲｃ／Ｒ３ＶｎｅｏをＸｈｏｌで切断し、そのＤＮＡ末端をクレノー酵素で平滑化した。オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３２８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９Ｘ５°−ＴＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧ−３’　）お上びＥＢｌ−３２８６（ＳＥＱ　（Ｄ　Ｎｏ：　１ＯＸ５’　−ＣＴＧＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡ−３’　）から調製したＸｂｏｌ−Ｎｏｔｌアダプターを切断したｐＲＣ／Ｒ３ＶｎｅＯのＤＮＡに連結した。このようにしてＸｈｏｌ切断部位を破壊し、Ｎｏｔ１部位（下線）を挿入した。ＤＮＡリガーゼの熱失活後、ＤＮＡをＮｒｕ　Ｉおよｎｏｔ＋で二重切断し、アガロース・ゲルから１．５４ｋｂのフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントはＲ３Ｖ−ｎｅｏ−ｂＧＨ−ｐｏｌｙ（Ａ）カセットを含んでいる。

プラスミドｐＡＤｎｅｏＢＧｌｕｃｉをＥｃｏＲＩで部分分解し、末端をクレノー酵素で平滑化したＵｏｔｌで再び切断した。アガロース・ゲルから４．９ｋｂ長のＤＮＡフラグメントを単離し、上述の１．５４ｋｂのＮｒｕＩ−Ｎｏｔｌフラグメントと連結した。大腸菌へのトランスホーメーション後、望ましい構造のプラスミドをｐＡＤｎｅｏ２ＢＧ１ｕｃｊと命名した（第７図）。

ｇ）ｃＡＭＰによって調節可能な要素（ＣＲＥ−センサーＤＮＡ　）を含むレポータープラスミドの構築ＩＰｓ　／ＤＡＣに対するセンサーＤＮＡ　（ＴＲＥ要素を含む）トランスバース感受性をコントロールするために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコントロール下に発現カセットを置いた。ＣＲＥ配列の選択は特徴付けられたＣＲＥ要素の組成にしたがって行った（セントミニ（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ）等、１９９０）。選択したＣＲＥ配列は一方では完全な８塩基長のパリンドローム・コンセンサス配列ＴＧＡＣＧＴＣＡを有しており、他方では周囲の配列中にＳｐ１転写因子の認識配列（ＣＣＧＣＣＣまたはＧＧＧＣＧＧ）に対する類似性を示すＧＣ対のグループをもはや持っていないものである。ｃＡＭＰの調節効果を強調するために多くのＣＲＥ配列をタンデムに配列しである。もし、いくつかの繰り返しの中で全体的に同一の配列が出現し、クローニングおよび大腸菌における安定性に関して不都合な効果が起こることを避けるために、種々のＣＲＢ配列の組み合わせを使用した。

プラスミドｐＡＤｎｅｏ２８Ｇｌｕｃｅのβ−グロビンプロモーターの５゛側に合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより、３つの連続するＣＲＥ配列を有する２つのプラスミド（ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ３ＢＶＣ−ＢＧＬおよびｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ３ＳＶＣ−ＢＧＬ　）を作製し、これらのプラスミドを合わせることにより、６つのＣＲＢ配列を有するプラスミドｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬを調製した。

３重ＣＲＥ配列は互いに相補的なりＮＡ末端を有する２対のオリゴヌクレオチドを連結することにより作製した（第８図）。各２０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＥＢＩ−３４８９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１１Ｘ５’　−ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣ−３’　）およ凋Ｂ１−３４９１（Ｓdｏ　１ＯＮｏ　：１２　Ｘ　５’　−ＣＴＣＣＴｒＧＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣ−３°）を１．５μｍ（７）キ＋|ゼ　、＜ソファ中（７０ｍＭ　＋−リス−〇ＣＩ（１）Ｈ７，６）　；　１０−ＭｇＣｌ、　、５酬ジチオスレイトール、２ｍＡＴＰ）、１５ユニツトのポリヌクレオチド・キナーゼと３７℃で１時間インキュベーションし、次いでこの酵素を熱で失活させた（９５℃、５分）。同様にして、オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３４９０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３Ｘ５’−ＣＴＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡガＡＣ−３°）オヨヒＥＢＩ−３４９４（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１４Ｘ５ ’　−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＧＴＧＡＣＧＴＣＴＴｒＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＡＴｒＧ`ＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧ−３”　）　ノ５’末端ヲリン酸化シタ。

等モル量の５′リン酸基を持たない相補的オリゴヌクレオチドをリン酸化したオリゴヌクレオチドと混合し：　ＥＢＩ−３４９２（ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：１５）（５°−ＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣ−３°）とＥＢＩ−３４８９、ＥＢＩ３４９１（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１６Ｘ５’−訂Ｃ篇ＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’　）とＥＢＩ−３４９０、８ＢＩ−３４９３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７ＸT°−ＴＣＧＡＣＴＣＣＣＡＴｒＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡ丁σＴ−３’）@とＥＢＩ−３４９４、次いで５６℃で５分間インキュベーションした。ｌＯｐｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチド対ＥＢ１３４８９／ＥＢ１３４９２およ汎Ｂ１−３４９３／ＥＢＩ−３４９４を３０μｌのライゲーションバッファ（７０ｒｒＭトリス−）１ｃＩ（ｐＨ７，６）　、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣｌ、　、　５−　ジチオスレイトール、Ｉ酬ＡＴＰ）中、１ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼと共に１４℃で一晩インキユベーションし、次いで、酵素を７０°Ｃ，１０分間の熱処理で失活した。連結したオリゴヌクレオチドは、５０μｍのキナーゼバッファ中、１５ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼと３７℃で１時間インキュベートする事により５゛リン酸化した。

同様に、オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３４９（１／ＥＢＩ−３４９１および蔀１ −３４９３ルＢ１−３４９４のペアも連結し、リン酸化した。

ＮｏｔＩおよび５ａｉｌで二重切断したプラスミド１０００ｇを１ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼを含む２０μｌのライゲーションバッファ中、ＥＢＩ−３４８９／３４９２／３４９３／３４９４を含む連結したオリゴヌクレオチド複合体０．２ｍｏｌと２２℃で４時間インキュベートし、大腸菌ＪＭＩＯＩにトランスホームした。これから得られたプラスミドを配列分析し、望ましい構造のプラスミドをｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ３ＢＶＣ−ＢＧＬと命名した（第９図）。このプラスミドは子牛の白血病ウィルスＬＴＲ（ＢＬＶ）、バソアクティブ・インテステイナル・ペプチド（ＶＩＰ）およびサイトメガロウィルス・プロモーター（ＣＭＶ）由来の３個のＣＲＥ配列を含んでいる。（プラスミド塩は略号ｒＢＶｃ　Ｊにより配列を示している。）同様に、オリゴヌクレオチド複合体ＥＢＩ−３４９０／３４９１／３４９３／３４９４をＫｐｎｌおよび５ａＩＩで二重切断したプラスミドベクターｐＡＤｎｅｏ２ＢＧ１ｕｃｉにクローン化し、プラスミドｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ３ＳＶＣ−ＢＧＬを得た（第９図）。このプラスミドはソマトスタチン（Ｓｏｍ）、ＶＩＰおよび菌由来の３個のＣＲＢ配列を含んでいる。（プラスミド塩は略号ｒｓＶｃ　Ｊにより配列を示している。）６個のＣＲＥ配列を有するプラスミドを調製するために、プラスミドｐＡＩ）ｍｅｏ２−Ｃ３ＢＶＣ−ＢＧＬをＢａｍＨＩおよび５ａｉｌで二重切断し、アガロース・ゲルから３．８ｋｂのベクター成分を単離した。プラスミドｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ３ＳＶＣ−ＢＧＬをＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌで二重切断し、２．７ｋｂの挿入物を単離した。これら２つのＤＮＡフラグメントを連結し大腸菌にトランスホームした。得られた望ましい構造のプラスミドをｐＡＤｍｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬと命名した（第９図）。

ｈ）ハイグロマイシンＢ耐性マーカーを含む哺乳類細胞における遺伝子の発現を目的とした基本ベクターの調製発現プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩおよびｐＡＤ−ＣＭＶ２（ＥＰ−Ａ３９３４３８）およびｐＨＥＢｏ　（サグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）等、１９８５）から出発して、ＣＭＶプロモーター／エンハンサ−の転写コントロール下にある遺伝子またはｃＤＮＡの発現およびハイグロマイシンＢ耐性による選択を目的としたプラスミドを作製した。

Ｈ３Ｖチミジン・キナーゼ・プロモーターの転写コントロール下にある細菌性ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（グリッツ（Ｇｒｉｔｚ）およびデーピース（Ｄａｖｉｅｓ）　１９８０　）を含むプラスミドｐＨＥＢｏ　（スグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）等、１９８５　；第１Ｏ図）をＣ１ａｌで切断し、そのＤＮＡの末端をクレノー酵素で充填してからＢａｍＨｌで切断した。このベクターに０■プロモーター／エンハンサ−配列ヲ含む０．７６ｋｂのＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント（ＢａｍＨＩ末端はクレノー酵素で充填されている）（スチンスキー（Ｓｔｉｎｓｋｉ）およびロアー（Ｒｏｅｈｒ）　１９８５）をクローン化し、プラスミドｐ２９０　（第１１図）を得た。

Ｃｌｌ１Ｖブ０％−ターおよびＥＢＶ　ｏｒｉ　Ｐを含むプラスミドｐ２９０の５ｐｅｌ−ＥｃｏＲＶフラグメントを切りだした。プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩをＢｇｌｌｌで切断し、ＤＮＡの末端をクレノー酵素で平滑化した後、５ｐｅｌで切断した。開プロモーター、ポリクローニング部位、ＳＶ４０スプライスシグナルおよびｐｏｌｙ（Ａ）シグナルを含むゲル精製した１、６ｋｂのＤＮＡフラグメントを先に述べたｐ２９０のベクタ一部分と連結した。得られたプラスミドをｐＡＨｙｇｃＭＶｌと命名した（第ｘ２［）。

同様に、プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ２から５ｐｅｌ−Ｂｇｌｌｌ　７ラグメントを単離し、ｐ２９０の５ｐｅｌ−ＥｃｏＲＶベクタ一部分にライゲーションした。ｐＡＨｙｇｃＭＶｌとは配向が逆のポリクローニング部位を含む該プラスミドをｐＡｌ（ｙｇｃＩｉｌＶ２と命名した（第１３図）。

プラスミドｐＡＨｙｇｃＭＶｌの全ヌクレオチド配列をＳＥｏ　１０　ＮＯ：３６に示す。

プラスミドｐＡＨｙｇｃＭＶｌ上の各領域（塩基番号で示されている）は以下の配列に対応している：１　−７６７　ＣＭＶプロモーター７６８−７８５　７７　プロモーター７９４　−８５４　ポリクローニング部位８５４　−１５５２　５Ｖ４０ｔ　イントロンおよびポリアゾニレ−ジョンシグナル１５５３−１７３６　ハムスターＤＨＦＲＩＩ伝子の５°非コード領域１７３７−２２６１　ＥＢＶ　ｏｒｉ　Ｐ部分配列２２６２−２８５６　ポリアゾニレ−ジョンシグナルを含むＨ３ｖチミジン・キナーゼ３゜非コード領域２８５７−３９１２　ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子３９１３−４１６１　ＨＳｖチミジン・キナーゼ・プロモーター４１６２−６５３１　１］ＢＲ３２２ベクタ一成分６５３２−６６２３　部分的にはｐｌ　１ｎｋ３２２に由来する種々のクローニングプロセスから形成されたリンカ−配列（マニアチス（ＭａｎｉａｔｉＳ）等、１９８２）プラスミドｐＡＨｙｇｃＭＶ２のヌクレオチド配列をＳＥｏ　１０　ＮＯ＋３７に示す。ポリクローニンク部位ノ領域ノミｐＡＦＩｙｇＱＩＶｌと異ナル。ｐＡＨｙｇＣＭＶ２０８５６番のシトシンはｐＡＨＹｇＣＭＶｌの８４９番のシトシンと対応する。

実施例２ホルボルエステル（ＴＰＡ　）で誘導可能な要素（ＴＨＥ−センサーＤＮＡ　）を含むレポータープラスミドの構築細胞内粘着分子ＩＣＡＭ−１のヒト遺伝子の１．３ｋｂ５’隣接領域のクローニングおよび欠失分析は、このフラグメントがｉ）肺のアデノカルシノーマ細胞系列Ａ３４９（ＡＴＣＣＣＣＬ　１８５）においてＴＰＡで誘導されるが、ホルスコリンでは活性化されないず、また１ｉ）ＤＮＡ配列ＴＧＡＴｒＣＡ　ヲ含むＴＰＡ応答要素（ＴＲＥ　）を含むことを示した（ボラバーガー（Ｖｏｒａｂｅｒｇｅｒ　）等、１９９１）、従って、１．３ｋｂの長いｒｃＡＭ−ｉフラグメントまたはタンデム状の３個のＴＲＥ要素を含むヌクレオチドをルシフェラーゼ遺伝子がＴＰＡで誘導しつるベクターの構築に使用した。

ａ）プラスミドｐＢＨＩｕｃ１．３の構築プラスミドｐＢ）Ｉｌｕｃｌ、３　（第１４図）は、ルシフェラーゼ遺伝子に先行するＩＣＡＭ−１遺伝子の１．３ｋｂ長の調節領域を含んでいる。この調製法はボラバーガー（Ｖｏｒａｂｅｒｇｅｒ）等、１９９１に示されている。

ｂ）プラスミドｐＡＤｎｅｏ（１，３１ＣＡＭ）Ｉｕｃｉ（ＴＲＥ−センサーＤＮＡ　）の調製先ず、プラスミドｐＡＤｎｅｏ２ＢＧＩｕｃｉ　（実施例１参照）からこのプラスミドを制限酵素５ａｌｒおよ■１ｎｄｌｌｌで切断し、ＤＮＡ末端を四種のｄＮＴＰおよびクレノー酵素で平滑化し、最後に７４　ＤＮＡリガーゼを添加することにより再ライゲーションさせることでβ−グロビンプロモーターを切りだした。ｐＡＤｎｅｏ２１ｕｃｉと命名したβ−グロビンプロモーターを持たないプラスミドをＮｏｔｌおよびＫｐｎｌで切断し、再びプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　（ボラバーガー（Ｖｏｒａｂｅｒｇｅｒ）等、１９９１）から１．３ｋｂのＩＣＡＭ−１７ラグメントを切りだしてｐＡＤｎｅｏ２１ｕｃｉにライゲーションした。ｐＡＤｎｅｏ（ＩＪＩＣＡｊＪ）Ｉｕｃｉと命名したこのプラスミド（第１５図）は、ルシフェラーゼ遺伝子に先行してｒｃＡＭ−１の調節およびプロモーター領域を含んでいる。

Ｃ）プラスミドｐＡＤｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧｌｕｃｉ　（ＴＲＥ−センサーＤＮＡ　）の調製プラスミドｐＡＤｎｅｏ２ＢＧｌｕｃｊのβ−グロビンプロモーターの５°側にＫｐｎｌ、ＢｇｌｌｌおよびＸｈｏｌの制限部位をコードする合成オリゴヌクレオチドと、それに続（３個の皿配列を挿入することによりこのプラスミドを調製した。これを行うために、ｔ　ＩＪ　コック１ｚ、ｔチ）’ＥＢＩ−３６７７（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　１８Ｘ５’　−ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣsＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣ−３°）　、ＥＢＩ−３６７１（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１９Ｘ５°−ＧＣＴsＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣ−３’　）　、ＥＢＩ−３６７８（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２０Ｘ５°−sＣＧＡＣＴＭＧＣＴＴＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＡＧＣＴｒＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＡ−３°）およｎＢＩ−３３６７２iＳＥＱｌｏ　ＮＯ：２１　）（５’　−ＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴｒＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴｒＡＧ−３’　）をリン_化して実施例１と同様に等モル量の相補的オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３６７７およびＥＢＩ−３６７１、およｒＪ′ＥＢ＋−３６７８およｎＢＩ−３６７２を互いに付加させた。ベクターｐＡＤｎｅｏ２ＢＧｌｕｃｉをＮｏｔｌおよび５ａｌｌで切断し、等モル量の切断したプラスミドｐＡＤｎｅｏ２８Ｇ１ｕｃｉ　、オリゴヌクレオチド対ＥＢ　ｌ−３６７７／３６７１およびオリゴヌクレオチド対１ｉＢＩ−３６７２／３６７８を混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを添加して互いに連結させた。生成したプラスミドの配列分析ヲ行イ、望ましい３個１７）ＴＲＢ配列を含むプラスミドをｐＡＩ）ｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧｌｕｃｉと命名した（第１６図）。

ｄ）プラスミドｐＡＤｎｅｏ（ｎＴＲＥｄｘ）ＢＧｌｕｃｉの調製これらのプラスミドは、高いにＸ塩基長の間隔でｎ個のＴＲＢ要素を含んでいる。Ｃ）と同様の方法で以下に示すオリゴヌクレオチドを使用して、プラスミドｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ１６）ＢＧｌｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ２１）ＢＧＩｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ２４）Ｂfｌｕｃｉ、およびｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ３４）ＢＧＩｕｃｉを調製した：ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ１６）ＢＧｌｕｃｉについては、ＥＢＩ−３７７５（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２２Ｘ５°−ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴ`ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴｒＡＧＴＧＴＡＧＡＣ−３’　）および相補的オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３６７１恨）　、ＥＢＩ−３７７６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３Ｘ５’　−ＴＣＧＡＣＣＴｒＧＡＡＴＣＡＣＧ信ＣＴＡＣＡＣＴＭＧＣＴＴＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＴＡＡ−３°）オヨヒ相補的オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３７７７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４ＸＳ°−ＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴｒＡＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＡＡＧＧ−３’　）　；ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ２１）ＢＧｌｕｃｉについては、ＥＢＩ−３７７１，（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２５Ｘ５ °−ＧＧＣＣＧＣＡＧＧsＡＣＣＡＧＡＴＣ′ｒＡＣ′ｒＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＴＡＧＣ口Ｇ−３°）および相補的オリゴヌクレオチＦＥＢＩ−３６７１（１ｍ）　、ＥＢＩ−３７７２（ＳＢＱ　１０　ＮＯ：２６Ｘ５’−ＴＣＧＡＣＴＭＧＣＴｒＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣ■ ＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＡＡＧＣＴｒＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＡＡ−３”）および相補的オリゴヌクレオチドＥＢＩ−３７７４（ＳＢＱ　ＴＤ　ＮＯ：２７Ｘ５“−ＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＭＧＣＴｒＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧsＧＡＴｉ℃ ＡＡＧＣＴＩ’ＡＣ−３”）　；ｐＡＤｎｅｏ（３ｘ″ＴＲＥｄ２４）ＢＧＩｕｃｉについては、ＥＢＩ−３７８０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８Ｘ５’　−ＧＧＣＣＧＣＡＧfＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣ宵ＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＡＣ−３’　）および相補的オ■ ゴヌクレオチドＥＢＩ−３７７８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９Ｘ５’−ＣＣＡＧＧＣＴ品印百Ｇ品ＴＣＡＣ印Ｔ訂ＡＣＡ訂ＣＧＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣ−３′）、ＥＢＩ−３７７９（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３０）（５’　−ＣＧＴＧＡ′ＴＴＣＡＡＧＣsＴＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧ−３’　）および相補的７ｌ−ＩＪゴヌクレオチドＢＢＩ−３７８１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）（５′−ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＧ０ＴＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣ′ｒＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧ訂品ＧコＭＴＣＡb ＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＧ−３’　）　；＋１ＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ３４）ＢＧｌｕｃｉについては、Ｅ［ｌ＋−３７８６（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３２Ｘ５’ 　−ＧＧＣＣＧＣＡfＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴｒＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴｒＡ［、ＣＧＣＧＧＴＧＴＡＧＡＣ|３’　）および相補的オリゴヌクレオチドＥＢｒ−３７８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３Ｘ５° −ＣＧＣＧＣＴＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡＧＣＴｒＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣ−３°）、ＥＢＩ− ３７９０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯF３４）（５’− ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＡ　ＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＧＣＴＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡＧＣＴｒＧ品ＴＣＡbＧＧＴＣＴＡＣＡＣ−３°〕オヨヒ相補的オリゴヌクレオチドＦＢＩ−３７９１（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：３５Ｘ５’−ＣＧＴＧＡＴｒＣＡＡＧＣＴｒＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧ−３’ 　）。

６個のＴＲＥ要素を含む対応するプラスミドを得るために、３個の１要素を含む関連するプラスミドをＮｏｔｌおよびＸｂａｌで切断し、もう一度対応するオリゴヌクレオチドをライゲーションした。オリゴヌクレオチドの構築により、対応する間隔を有するＴＲＥ要素の重複が起こる。生成したプラスミドをｐＡＤｎｅｏ（６ｘＴＲＥｄ１６）ＢＧｌｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（６ｘＴＲＥｄ２１）ＢＧｌｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（６ｘＴＲＥｄ２４）ＢＧｌｕｃｉ、およびｐＡＤｎｅｏ（UｘＴＲＥｄ３４）ＢＧｌｕｃｉと命名した。

実施例３Ｇプロティン共役レセプターのクローニングおよび発現プラスミド（レセプターＤＮＡ　）の調製問題のヒト５−ＨＴ、−レセプターのｃＤＮＡを、ｃＤＮＤＮＡクのスクリーニングによって入手し、発現ベク９−ｐＡＤ−ＣＭＶＩまたはｐＡＤ−ＣＭＶ２（ＯＰ−Ａ　３９３４３８）ニクローニングした。

ａ）ヒト５−１（Ｔ、−レセプターをコードする配列を含むクローンの単離ラットの５−ｉｒｒｔ−レセプター配列を含むクローンによる（シュリアス（Ｊｕｌｉｕｓ）等、１９９０、ブリチェット（Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ）等、１９８８）ラムダＺＡＰベクター（ストラタジーン９３６２０５）中のヒトのヒポカンバスｃＤＮＡバンクのホモロジー・スクリーニングにより、１つのクローンを単離し、プラスミドｐＢｕｅｓｃｒｊｐｔ　ＳＫに含まれる挿入物をシーケンシングした。そのＤＮＡ配列およびそこから誘導されたアミノ酸の配列をＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ二ｌおよびＳＥＱ　１０　ＮＯ：２に示す。公表されているラットの５−）ＩＴ！−レセプターの配列（シュリアス（Ｊｕｌｉｕｓ）等、１９９０）とヒトの５−１ＩＴｙ−レセプターのアミノ酸の配列の比較は９０％の一致を示した。

ｂ）発現ベクターｐＡＤ−ＯｉＩＶ２への５−ＨＴ！−レセプター配列のサブクローニング発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ２をＥｃｏＲＩで切断し、４種のｄＮＴＰおよびクレノーフラグメントによりＤＮＡ末端を平滑化し、次いで、このベクターをＢａｍＨＩで切断した。このベクターに、プラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔからＳｍａｌおよびＢａｍＨＩで切りだした５１−−レセプター配列をライゲーションし、得られたクローンをｐＡＤ−ＣＭＶ２−５−ＩＴ！と命名した（第１７図）。

Ｃ）発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ２へのドーパミン−ＤＩ−レセプター配列のクローニングｐＧＥＭブルー・プラスミド・ベクター（プロメガ）（シー（Ｚｈｏｕ）等、１９９０）中に３ｋｂのヒトのドーパミン−ＤＩ−レセプター配列のＥｃｏＲＩ　−Ｓａｃ！フラグメントを含むプラスミドＩ）ｌ’ｌＤ＋−ｇｅｍをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで二重切断し、３　ｋｂｆ７＞ＤＮＡ挿入物を単離した。発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ２（ＢＰ−Ａ　３９３４３８）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨｒで二重切断し、３ｋｂのＤｌ−レセプターフラグメントをドーパミンＤＩレセプターがサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサ−要素のコントロール下にあるようにクローン化した。得られたプラスミドをｐＡＩ）−ＣＭＶＩ：ＤＩと命名した（第１８図）。

ｄ）発現ベクターｐＡ１（ｙｇｃＭＶｌへのＮＨ３−または５１（Ｔ２−レセプター配列のサブクローニングプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（ストラタジーン）中にＮＨ３−レセプターｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＯＮＫから制限酵素５ａｌｌおよｎｏ　ｔ　Ｉを用いてヒトノＮＫ２−　ｔｚセブタ−（７）ｃＤＮＡを切りだして、：（７）ｃＤＮＡを発現べ’ｙターｐＡＩ（ｙｇｃＭＶｌ　（実施例１　ｈ）にクローン化し、生成したプラスミドをｐＡＨｙｇ− ＮＫｚと命名した（第１９図へ）。

５ＨＴ２レセプター配列を上述のベクター１）ＡＤ−ＣＭＶ２−５）ＨＴ２からＸｂａｌ−Ｃ１ａｌフラグメントとして切りだし、ベクターｐＡＩ（ｙｇＣＭＶ２　（実施例１ｈ）にクローン化した。この構築物をｐＡＨｙｇ−５石２と命名した（第１９図Ｂ）。

実施例４３種のブレ・テスト細胞におけるＴＨＥ−センサーＤＮＡの誘導以下に示す細胞系列：ヒト肺ガン細胞系列Ａ３４９（ＡＴＣＣＣＣＬ　１８５）、ヒト子宮ガン細胞系列ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　２）およびモンキーの腎細胞系列ＣＯ３−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）を、各々＾５４９−およびＣＯ３−７細胞はＲＰＭＩ−１６４（］培地（ギブコ）およ１ｅＬａ細胞は１０％熱失活ウシつ児血清（Ｆｅ２　）を含むＥａｒｌｅ’ｓ　ＢＳＳ添加ＭＥＭ培地（ギブコ）中、５　％　Ｃｏ、雰囲気下、３７℃でインキュベートすることによりＴＨＥ−センサーＤＮＡ　（ｐＢＨＩｕｃｌ、３）でトランスフェクションした。トリプシンおよび室温、１２００ｒｐｍ、５分間の遠心（ヘラウス製ミニフウージ）によりトランスフェクション当たりＩ　ＸＩＯ’個の細胞が培養皿の表面から回収され、これを５ｍｌの無血清培地で１度洗浄し、１２０Ｏｒｐｍ、５分間の遠心後、１ｍｌの無血清培地に懸濁した。この細胞を２５０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、５μｇのプラスミドＤＮＡおよび５０μｇ／ｍｌのクロロキンと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした後ＦＣＳを含まない培地で１度洗浄してから１０ｍ１の新鮮な血清培地と３７℃で一晩インキユベートした。

培地を交換し、４時間後、１ｍｌ当たり１ＯｎｇのＴＰＡまたは２０μＭのホルスコリンで細胞を誘導した。さらに１８８時間後細胞をＰＢＳで洗浄し、ゴム製スクラッパーでシャーレから落として室温、１２００ｒｐｍで５分間遠Ｊ１−ルた（ヘラウス製ミニフウージ）。細胞で１００　ｐｌの分解バッフｙ　（］　８％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，２５−グリシルグリシンｐＨ７，８，１５ｎ＃　Ｍｇ５Ｏい４酬　ＥＤＴＡおよび１酬り貫　）で分解し、その分解物を５分間遠心して上清を新しい試験管に移した。３０μｌの上滑を３５０μｌの検定バッフｙ　（２５ｍＭ　グリシルグリシン　ｐＨ７，８，５０１１１１ＡＴＰ　、　１５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ　）に添加し、その試験管をルミノメータ−・ルマット９５０１に入れ、インジェクション・バッファ（０，２ｍＭ　ルシフェリン、２０ｍＭ　グリシルグリシン　ｐＨ７，８）　３００μｌ注入することにより反応を開始してルシフェラーゼ検定を行った（デ・ウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８５）。発光の測定時間は１０秒で行った。

ａ）ＴＰＡでは起こるがホルスコリンでは起こらないｐＢＨｌｕｃｌ、　３の誘導光に示したように細胞系列Ａ３４９、ＨｅＬａおよびＣＯ３−７にプラスミドｐＢＨ１ｕｃ１．３を添加することによりトランスフェクションし、ＴＰＡを添加して誘導を行った。トランスフェクションされたが誘導が起こらない細胞をネガティブ・コントロールとして使用した。特定のインキュベーション時間後、細胞を分解し、ルシフェラーセ検定を行った。実験結果を第２０図に示すが、これらはプラスミドｐＢＨ１ｕｃ１゜３がテストした細胞中で１０倍以上にも誘導可能であることを示している。ボラバーガー（Ｖｏｒａｂｅｒｇｅｒ）等、１９９１は、この構築物はＡ３４９中でホルスコリンによって誘導されないことを示した。同様にＨｅＬａ細胞およびＣＯ５−７細胞に対してこの結果を確認するために、もう一度これらの細胞をｐＢＨｌｕｃｌ、　３でトランスフェクトし、再びコントロールとして非誘導細胞を使用してＴＰＡまたはホルスコリンによる誘導を行った。これらの実験結果として第２１図Ａおよび第２１図Ｂから分かるように、ＨｅＬａ細胞およびＣＯ３−７細胞もＴＰＡによって誘導されるがホルスコリンによっては誘導されなかった。

ｂ）ＴＰＡによっては起こるがホルスコリンでは起こらないｐＡＪ）ｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧｌｕｃｉの誘細胞系列Ａ３４９、ＨｅＬａおよびＣＯ５−７をプラスミドｐＡＤｎｅｏ（３ｔｒｅ）ｂｇｌｕｃｉでトランスフェクトし、ＴＰＡまたはホルスコリンで誘導した。再び、トランスフェクトしたが誘導を受けなかった細胞をネガティブ・コントロールとして使用しこ。特定のインキュベーション時間後、細胞を分解し、ルシフェラーゼ検定を行った。実験結果を第２２図に示すが、これらはＩＣＡＭ−１遺伝子のＴＨＥ要素のみを含むベクターはテスト細胞中でＴＰＡによっては誘導されるが、ホルスコリンでは誘導されないことを示している。

ｃ）ＴＰＡでは起こるがホルスコリンでは起こらないプラスミドｐＡＤｎｅｏ（ｎＴＲＥｄｘ）ＢＧｌｕｃｉの誘導細胞系列ＣＯ３−７およびＡ３４９をプラスミドｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＢｄ１６）ＢＧｌｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ２１）ＢＧＩｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ２４）ＢＧｌｕｃｊ、　ｐＡＤｎｅｏ（３ｘＴＲＥｄ３４）ＢＧＩｕｃｉ、　ｐＡＤ獅■潤i６ｘＴＲＥｄ１６）ＢＧｌｕｃｉ、　ｐＡＤｎｅｏ（６ｘＴＲＥｄ２１）ＢＧｌｕｃｉＳｐＡＤｎｅｏ（６ｘＴＲＥｄ２４）ＢＧＩｕｃｉ、またはｐＡcｎｅ。

（６ｘＴＲＥｄ３４）ＢＧｌｕｃｔでトランスフェクトし、ＴＰＡまたはホルスコリンを添加して誘導を行った。再び、トランスフェクトされるが誘導されない細胞をネガティブ・コントロールとして使用した。特定のインキュベーション時間後、細胞を分解し、ルシフェラーゼ検定を行った。実験結果を第２３図Ａおよび第２３図Ｂに示したが、これらはｉ）６個のＴＨＥ要素を含む構築物に関するＴＰＡによる誘導は３個のＴＨＥ要素を含む構築物の時よりも大きいこと（ホルスコリンでは構築物は誘導されない）　、ｉｉ）　６個のＴＲＥ要素を含む構築物のＴＰＡによる誘導は、ＴＲＥ要素の間隔が大きいときよりも小さいときの方がより大きいことを示している。

実施例５ＴＨＥ−センサーＤＮＡのレセプター仲介誘導細胞系列力℃プロティンを介してホスホリパーゼＣ−リパーゼシステムに共役している表面上にレセプターを発現し、かつ適当な時間にレセプター特異的アゴニストを添加したならば、ＰＡで誘導可能なセンサーＤＮＡが誘導されることを示すために、ＣＯ５−７細胞を１− センサーＤＮＡとレセプター−ＤＮＡでコトランスフェクトした。ＣＯ５−７細胞とＳＶ４０複製開始点を含むレセプター−ＤＮＡを使用することで高コピー数のレセプター−ＤＮＡの自動的複製が可能となり、細胞表面でのレセプターの発現の効率が高くなる。コトランスフエクションは、各々５μｇの皿−センサーＤＮＡおよびレセプター−ＤＮＡをトランスフェクトすること以外は、実施例４に述べたＤＥＡＢ−デキストラン法で行った。この一連のテストにおいて、−晩のインキュベーションおよび培地交換後、平行してレセプター特異的アゴニスト、またはアゴニストおよび競合的アンタゴニスト、またはポジティブ・コントロールとしてのＴＰＡを添加した。１８時間のインキュベーション後、細胞を分解し、実施例４に示したようにルシフェラーゼ検定を行った。

ａ）ムスカリン性議−レセブターにアゴニスト的作用物質を結合することによるｐＡＤｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧｌｕｃｉの誘導ｃｏｓ−７細胞をセンサーＤＮＡ　ｐＡＤｎｅｏ（３ＴＲＥ）ＢＧＩｕｃｉおよびオカヤマ／バーグｐｃｏ発現ベクター（オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、１９８３）中のヒトのムスカリン性議−レセブターの配列を含むレセプターＤＮＡ　ｐＣＤ− Ｍ３　（バラフレー（Ｂｕｃｋｌｅｙ）等、１９８９）でコトランスフエクトした。誘導は、ｉ）１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＡ　（シグマ、Ｐ８１３９　）　、１ｆ）ｌ請　カルバコール（シグマ、Ｃ４３８２）　、　１ｉｉ）１−カルバコールおよび１０μＭ　アトロピン（シグマ、ＡＯ１３２）およびｉｖ）１ｍＭ　カルバコールおよび２０ｔｔＭ　アトロピンで行った。細胞のインキュベーションおよび分解後のルシフェラーゼ検定の結果は第２４図に示すが、これらはルシフェラーゼの発現がＴＰＡおよびケスカリン性レセプターに対するアゴニストであるカルバコールの両方で誘導されることを示している。アゴニストによって誘導される誘導は、選択的アンタゴニストであるアトロピンを同時に添加することで妨害される。

ｂ）セロトニン−！ｒ）ｔｒｉ−レセプターにアゴニスト的に作用する物質が結合することによるｐＢ）Ｉｌｕｃｌ、　３の誘導およびｐＡＤｎｅｐ２−Ｃ６− ＢＧＬの非誘導ＣＯ５−７細胞にセンサーＤＮＡ　ｐＢＨｌｕｃｌ、３および発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ２中にヒト５ＨＴｔレセプターの配列を含むレセプターＤＮＡ　ｐＡＤ−ＣＭＶ２−５ＨＴｔ　（実施例３参照）をコトランスフェクトした。誘導はｉ）ＩＯｎｇ／ｍｌのミディアムＴＰＡ　（ジグｖ　Ｐ８１３９）　、１ｉ）ｌＯμＭ　α−メチルセロトニン−マレニー）　（ＲＢＩ　リサーチ・バイオケミカルス・インニーボレーティドＭ−１１０）　、および１ｉｉ）１０μＭ　α−メチルセロトニン−マレエートおよび１０μＭケタンセリンータルトレート（ＲＢＩ　Ｓ−００６）　で行った。

細胞のインキュベーションおよび分解後のルシフェラーゼ検定の結果は、第２５図Ａに示したが、これらはルシフェラーゼの発現がＴＰＡおよび５”’ＨＴｔのアゴニストであるα−メチルセロトニン−マレエートの両方で誘導されることを示している。アゴニストによって仲介される誘導は、選択的アンタゴニストであるケタンセリンータルトレートを同時に添加することで阻害される。平行した実験で、ＣＯ３−７細胞を６個のＣＲＥ要素を含むセンサーＤＮＡ　ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬおよびレセプターＤＮＡ　Ｉ）ＡＤ−ＣＭＶ２−５ＨＴ２　Ｔ：’　トラ：／　スフ　エクトシｔ：。誘導ハ１）２０μＭホルスコリン（シグマＰ８１３９）　、１ｉ）１０μＭ　α−メチルセロトニン−マレニー）　（ＲＢＩＭ−１１０）、および１ｉｉ）α−メチルセロトニン−マレエートおよびｌＯμＭ　ケタンセリンータルトレート（ＲＢＩ　Ｓ−００６）で行った。インキュベーションおよび細胞分解後のルシフェラーゼ検定の結果は第２５図Ｂに示したが、これらはルシフェラーゼの発現が実際にホルスコリンによっては起こるが、！ｒ）ｒｒｔ−レセプター−アゴニスト　α−メチルセロトニン−マレエートでは起こらないことを示している。

以上の結果から５−ＨＴｔ−レセプターに依存して、ＩＰｓ　／ＤＡＣに応答する調節要素では選択的活性化が起こるが、ｃＡＭＰ　（ＣＲＥ　）に応答する調節要素では起こらないことが確認される。

Ｃ）ドーパミン−ＤＩ−レセプターへのアゴニスト的に作用する物質の結合によるｐＡＩ）ｎａｏ２−Ｃ６−ＢＧＬの誘導およびｐＢＨｌｕｃｌ、　３の非誘導ＣＯ５−７細胞にセンサーＤＮＡ　ｐＢＨｌｕｃｌ、　３および発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ２中にヒトドーパミン−ＤＩ−レセプターの配列を含むレセプターＤＮＡ　ｐＡＤ−ＣＭＶ２−ＤＩ　（実施例３参照）をコトランスフエクトした。誘導はｉ）１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ　（シグマＰ８１３９）、１ｉ）２０μＭ　ホルスコリン（シグマＰ８１３９）　、１ｉｉ）１μＭ　アポモルフイン（ＲＢＩＤ−００４）、および１ｖ）１μＭアポモルフインおよび１　μＭ　５ＣＨ２３３９０（ＲＢＩ　Ｄ−０５４）で行った。細胞のインキュベーションおよび分解後のルシフェラーゼ検定の結果は、第２６図Ａに示したが、これらはルシフェラーゼ遺伝子の発現力（ＴＰＡ　Ｚ寄っては誘導されるがＤＩ−レセプターに対するアゴニストであるアポモルフインでは誘導されないことを示している。平行した実験で、ＣＯ５−７細胞を６個のＣＲＥ要素を含むセンサーＤＮＡ　ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬおよびレセプターＤＮＡ　ｐＡＤ−ＣＭＶ２−Ｄｉでコトランスフェクトした。インキュベーションおよび細胞分解後のルシフェラーゼ検定の結果は第２６図Ｂに示したが、これらはルシフェラーゼの発現が実際にホルスコリンとアポモルフインの両方で誘導されることを示している。アゴニストによりて仲介される誘導は、同時に選択的アンタゴニストである５ＣＨ２３３９０を添加することで阻害される。以上の結果からドーパミン−ＤＩ−レセプターはアデニレート・シクラーゼのシグナル誘導経路に応答する調節要素（ＣＲＥ　’）を選択的に活性化するがホスホリパーゼＣシグナル誘導経路に応答する調節要素（ＴＲＥ　’）は活性化しないことが確認された。

実施例６ａ）細胞内ＩＰ！　／ＤＡＣ濃度に依存してルシフェラーゼを発現する組み換えＡ３４９細胞系列σ部細胞系列）の開発ｎ＄−センサーＤＮＡ　ｐＢＨｌｕｃｌ、　３は細胞系列＾５４９のトランスフェクション実験においてＴＰＡの添加により１０倍以上も誘導される（実施例４ａ）。直接的またはレセプターを仲介するＩＰ、　／ＤＡＣシグナル誘導経路の調節によりルシフェラーゼ遺伝子の発現に影響する物質に対する安定な（ブレ・）テスト細胞を作製するために、以下に示すようにエレクトロポレーションによりＡ３４９をプラスミドｐＢＨ１ｕｃ１．３および選択プラスミドｐＲｓｖｎｅｏで同時にトランスフェクトした。培地除去後、細胞をトリプシン／ＰＢＳ溶液で表面から落とし、培地に懸濁してから２５０　Ｘｇで５分間遠ｌＣルた。この細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ）で洗浄し、再び遠心してから１．２５刈０７細胞／ｍｌの密度となるように無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した。

細胞懸濁液０．８ｍｌを２０μｇ＋７）ｐＢＨＩｕｃｌ、　３および２μｇのｐＲｓＶｎｅｏと混合した。両プラスミドは予めＢａｍＨＩで線状化しておく。トランスフェクションは２１０Ｖ、　１０８０μＦ　、　１０００１００Ｏの単一電流パルスを用いたＰＧ２００ブロゲネタ−ＩＩエレクトロポレーション装置（ホーファー・サイエンティフィック・インスツルメント）で行った。次いで、細胞を１０％ウシ胎児血清を混合したＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、９００１１培養皿当たり２−５　ＸＩＯ’細胞の密度となるようにブレーティングした。

トランスフエクションした日から細胞を選択培地（１０％透析処理ウシつ児廁清、ベニシリンＮａ塩（１００ユニツト／ｍｌ）、刈・レプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ）および８００μｇ　／　ｍｌ　ゲネチシン（Ｇ−４，１８、ギブＤ −ＢＲＬ　）を含むＲＰＭＩ−１６４０）で生育させた。

トランスフェクションからＢ５−２０日後、各細胞クローンを９６穴マイクロプレーＩ・に移し、さらに培養した。Ｇ−４１８耐性クローンについてＴＰＡの添加によるルシフェラーゼ発現の誘導性を調べた。６回の反復操作のながで各クローンにおいて約４０．０００個の細胞を組織培養物をコートした遮光９６穴マイクロブレ・−ト（マイクロライド葎、ダイナチク・ラボラトリ−）のウェル当たり２００μｌ中にまき、３７℃で一晩インキユベートした。３個の混合物をｌＯｎｇ／　ｍｌのＴＰＡで処理し、さらに８時間インキュベートした。その後、培地を除去し細胞をＰＢＳで２回洗浄した。

細胞をバッチ当たり１５０μｍの分解バッファ（２５ｍＭ　＋−リシン、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５４ｄｌ　）ＩＪポリリン酸ナトｌＪウム、６．５　ｍＭ　ＤＴＴ　、１６．３ｄ　ＭｇＳＯ４−７ＨｆｆＯｌｏ、　Ｉ　Ｘ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１，２ｄ＋　ＡＴＰ　、　０．０５ｒｒＭ　ルシフェリン；　ｐ８７．８　）に入れ、９６穴ルミノメータ−（ＭＬ−１０００、ダイナチク）でルシフェラーゼ活性を測定した。

細胞クローンＡ２０は、ＴＰＡによって１５−２０倍に誘導されるルシフェラーゼ活性の測定可能な基本レベルを示したことから以後の実験にこのクローンを選択した。

ｂ）ヒトのニュウロキニン２−レセプターの活性化に対応してルシフェラーゼを発現する組み換えＡ３４９テスト細胞系列の開発本実施例はホスホリパーゼＣフグナル誘導経路と共役するヒトのニュウロキニン２（Ｎ’に２）−レセプターに関するテスト細胞系列の調製を説明している。このテスト細胞はルシフェラーゼ活性を測定することによりレセプターに依存して細胞内ＩＰ、　／ＤＡＣを調節する物質を同定しつる。

ａ）で述べたように予め１３ｇ１ＩＪで線状化したプラスミドｐＡＨＹｇ−ＮＫ２のエレク）・ロボレーンヨンによりブレ・テスト細胞系列Ａ２０をトランスフェクトした。トランスフェクションした日から、細胞を細胞系列Ａ２０に使用した選択培地にさらに１５０μｇ　／　ｍｌのハイグロマイシンＢ　（シグマ）を添加した培地で培養した。ａ）で述べたように個々のクローンのルシフェラーゼ活性の誘導性を調べた。しかし、個の場合、誘導材としてＴＰＡの代わりにニュウロギニンＡ　（１８Ｍ、シグマ）を使用した。反復実験において、クローンＡ２０．／ＮＫ２−１２２はニュウロギニン２−レセプターの活性化後、５−７倍のルシフェラーゼ活性の誘導を示した。

第２７図に見られるように、ブレ・テスト細胞系列Ａ２１ＪおよｃＦＮＫ２テスト細胞系列Ａ２０ＮＫ２−１．２２におけるルシフェラーゼ発現はＩＰ、　／ＤＡＣシグナル誘導経路によってのみ増加し、細胞内ｃＡＭＰａ度の増加によるものではない。両細胞系列においてルシフェラーゼ活性はＴＰＡにより投与量に依存して最高１８倍まで誘導されたが、ホルスコリン（アゾニレ−１・・ンクラーゼの刺激剤）（４いかなるルシフェラーゼ活性の誘導も示さなかった。

テスト細胞系列Ａ２０／ＮＫ２−１２２におけるＮＫ２特異的アゴニストであるＮＫＡ　Ｇ６４３４９（１８Ｍ、ネオシステムＳ、Ａ、　）　ｌこよるルシフェラーゼ誘導の速度論を第２８図に示す。最高のルシフェラーゼ活性は７−８時間の誘導時間後に測定された。一方、細胞系列Ａ２０においてはＮＫ２−アゴニストＧＲ６４３４９の添加によってルシフェラーゼ活性が誘導されなかった。このことは、ブレ・テスト細胞系列Ａ２０は、内在ｔｕＫ２−レセプター分子を含んでおらず、従ってＮＫ２テスト細胞系列に関する適当なコントロール細胞系列であることを意味している。

第２９図Ａは、ニュウロキニンによるヒトのニュウロキニン２レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性化曲線を示している。細胞系列Ａ２Ｑ／ＮＫ２−１２２におけるニュウロキニン（シグマ）の相対的効果、ＮＫＡ＞ニュウロメジンＫ（ＮＭＫ）＞物質Ｐ（ＳＰ）は、レセプター結合実験から得られた、すでに報告されているデータと一致している。細胞系列Ａ２０は、３種のタキキニンのいずれによっても誘導しえず、このことはこの細胞がいかなるニュウロキニン・レセプターを含んでいないことを意味している。３種のニュウロキニン・レセプターのうちの１つに特異的な一連ノアゴニア、　トＮＫＩ：ＧＲ７３６３２（ネオシステム、Ｓ、Ａ、　）　、ＢＩＩＣ１２３０（［β−Ａｌａ ’、Ｓａｒｇ、Ｍｅｔ（Ｏｒ）”コ５Ｐ（４−１；　ＮＫ２：Ｇ６４３４９（ネオシステム、Ｓ、Ａ。）、Ｂ１１Ｃ１２１９（［β−Ａｌａ”］ＮＫＡ（４−１０））；　ＮＫ３：［ＭｅＰｂｅ’］ＮＭＫ（バッヶム・フエインヶミカリエンＡＧ）の投与量依存的活性は第２９ｆＪＢに示す。

細胞系列Ａ２０ＮＫ２−１２２におけるニュウロキニンのアゴニスト効果は照２ −特異的アンタゴニスト（ＧＲ８３０７４、ＧＲ８７３１１１９、ＧＲ９４８００、ネオシステムＳ、Ａ、　）　（第３０図）により阻害された。この目的のために細胞を同時に一定量のニュウロキニンＡ　（５Ｍ）および種々の量のアンタゴニストで処理した。一方、ＮＫＩ−特異的アンタゴニスト（すなわち、ＢＩＢＯ２０２０（±ｃｉｓ−３−（２−メトキシベンジルアミノ）−２−ペンズヒドリルキヌリジン）、Ｐ７４９２（ペニンスラ・ラボ））またはＮＫ３−特異的アンタゴニスト（Ｈ−９２９０、バッケム・フエインケミカリエンＡＧ）は高濃度で効果があった（Ｐ７４９２＞ＢＩＢｏ　２０２０＞＋（−９２９０）。

Ｃ）ヒト５肝２−レセプターの活性化に応じてルシフェラーゼを発現するＡ３４９細胞系列の開発ヒトの５Ｈ７２−レセプターは、ホスホリパーゼＣシグナル誘導経路に共役するレセプターの別の例である。従って、ＴＲＥ細胞系列Ａ２０も５）ＩＴ２−レセプターの活性を調節する物質を発見することを目的としたテスト細胞系列の確立のための開始細胞に適している。

この目的のために１３ｇ１ＩＩで線状化したプラスミドｐＡＨｙｇ−５ＨＴ２をａ）で述べたようにエレクトロポレーションにより細胞系列Ａ２０にトランスフェクトし、選択培地で生育させた。ハイグロマイシンＢ耐性細胞クローンに関して５）Ｂ７２−特異的アゴニストα−メチルセロトニン・マレエート（１０μＭ、リサーチ・バイオケミカル社）の添加後のルシフェラーゼ活性の誘導性を調べ、以後の実験で使用するために４−５倍の誘導が測定されたクローンＡ２０１５ＨＴ２−１１を選択した。

テスト細胞系列Ａ２０１５ＨＴ２−１１におけるセロトニン（１μＭ）によるルシフェラーゼ誘導の速度を第３１図に示した。第２８図に見られるように、６時間の誘導時間までルシフェラーゼ活性は連続的に増加した。従って、アゴニスト的またはアンタゴニスト的に作用する物質をテストするには６−８時間の誘導時間で十分である。細胞系列Ａ２０において、セロトニンの添加はルシフェラーゼ活性を誘導しえなかった。このことは、ブレ・テスト細胞系列Ａ２０が内在的に５ＨＴ２−レセプター分子を含んでおらず、従って、５１（Ｔ２−テスト細胞系列に対する適当なコントロール細胞系列であることを示している。

第３２図Ａは、アゴニストによるヒトの５）ＩＴ２−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性化曲線を示している。期待されるように、投与量・活性曲線は、５ＨＴＩＡ−レセプターのアゴニスト８０Ｈ−ＤＰＡＴ（リサーチ・バイオケミカルλ社）およびバスピロンとは異なり、セロトニンおよび５）ＩＴ２−レセプターのアゴニスト、セロトニン・マレエートに対して選択的である。

細胞系列Ａ２０１５ＨＴ２−１１におけるセロトニンのアゴニスト活性は５１（Ｔ２−特異的ア　・ンタゴニスト、スピペロンおよびミアンセリン（リサーチ・バイオケミカルス社）の添加で阻害しうる（第３２図Ｂ）。この目的のために細胞を同時に一定量のセロトニン（１８Ｍ）および種々の量のアンタゴニストで処理した。

実施例７ａ〕細胞内ｃＡＭＰ濃度に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えチャイニーズ・ハムスター卵巣（Ｃ）ｉｏ　）細胞系列（ＣＲＥ細胞系列）の開発レセプター分子と相互作用することにより直接的または間接的に細胞内ｃＡＭＰレベルに影響を与える物質を検定するための（ブレ・）テスト細胞を調製するために、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系列ＣＨＯ−ＤＸＢＩＩ　（ウルロウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、１９８０）をセンサーＤＮＡ　ｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬでトランスフェクトした。親細胞系列Ｃ）１０−ＤＸＩＩＩＩをＩＯＮウシ胎児血清（セバク）、ヒポキサンチン（１００μＭ）、チミジン（１６μＭ）、ペニンジンＧナトリウム塩（１００ユニツト／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ）を含むメスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート（ＲＰＭＩ）培地！６４０　（ギブコ）で培養した。トランスフェクションの前日こ細胞を新鮮な培地に移した。

エレクトロポレーションによるトランスフェクションは以下のように行った。

培地の除去後、細胞をトリプンン／ＰＢＳ溶液により表面から落とし、培地に懸濁後２５０　Ｘｇ　、　５分間０）遠心テヘレノト状とした。細胞をＨＢＳ　（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳｐＨ？、４．１５０　ｍＭ　ＮａＣＩ）　テ洗浄し、遠心でペレットにした。細胞をＩ　ＸＩＯ’細胞／細胞７密ｌとなるようＨＢＳ　Ｉ：懸濁した。この細胞懸濁液０．８ｍｌを５ｃａｒで線状にしたプラスミドｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬのＤＮＡ　２０μｇと混合し、エレクトロポレーション・セルに移した。トランスフェクションは３２０Ｖ、１０８０μＦ　、　１０００１００Ｏの単一電流パルスを使用するＰＧ２００ブロゲネタ−ＩＩエレクトロポレーション装置（ホーファー・サイエンティフィック・インスッルメント、サン・フランシスコ、ＣＡ）で行った。

エレクトロポレーション後、細胞を上述の培地に希釈し、９ｏ−養皿当たり２０．０００個の細胞となるようにブレーティングし、３７℃で一晩インキユベートした。トランスフェクションの次の日から、細胞を選択培地ＣＩＯ％ウシ胎児血清、ヒボキサンチン（１００μＭ）、チミジン（１６μＭ）、ペニシリンＧナトリウム塩（１００ユニツト／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ）　、ゲネチシン（Ｇ−４１８、ギブ）−ＢＲＬ　）　（７００ｕｇ　／　ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−１，６４０）で培養し、以後、細胞増殖を観察した。

トランスフェクションから７−１０日後、生成した個々の細胞クローンを２４穴の細胞培養皿に移し、培養を続けた。アデニレート・シクラーゼの活性化によるルシフェラーゼ発現の誘導性について２５個の単離したＧ〜４１８耐性細胞クローンを調べた。

各クローン約３００．０００個の細胞を６穴細胞培養皿の各ウェルに合計４箇所植種し、３７℃で２４時間インキュベートした。各々のクローンの２バツチを２０μＭのホルスコリンで処理し、さらに３７℃で５時間インキュベートした。次に全ての細胞から培地を除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０ｎで分解し、ベルソルド・ルマットＬＢ９５０１ルミノメータ−中でルシフェラーゼ活性を測定した（ブレーザー（Ｂｒａｓｉｅｒ）等、１９８９）。

最も高いレベルのルシフェラーゼ活性を有しており、同時にホルスコリンによる最も高い誘導性を示したことから以下の実験のために細胞クローンＣ６−１３を選択した。

細胞系列ＣＦＩＯＣ６−１３の細胞をｃＡＩｉｌＰまたはＩＰ、　／ＤＡＣの細胞内濃度を変えるか、または濃度変化を刺激する種々の物質で３時間処理し、さらに上述のシグナル誘導メカニズムに影響するレセプター特異的アゴニストで処理した。第３３図に示されているように、細胞系列ＣＨＯＣ６−１３におけるルシフェラーゼの発現はホルスリン（アデニレート・シクラーゼのスチムレーター）、ジブチリル−ｃＡＭＰ　暗過性ａ１誘導体）およびイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ホスホジェステラーゼ・インヒビター）等のｃＡＭＰ増加物質によってのみ増加した。ホルボルエステルＰＭＡ　、Ｃａ２＋イオノフオアＡ２３１８７およびドーパミン・レセプターに対するアゴニスト化合物（アポモルフイン、ブロモクリプチン）、ムスカリン性アセチルコリン・レセプターに対するアゴニスト化合物（カルバコール）およびセロトニンはルシフェラーゼ活性の有意な変化をもたらさなかった。このことは細胞系列ＣＨＯＣ６−１３におけるルシフェラーゼ発現がｃＡＩＪＰ濃度の変化によってのみ調節され、ＩＰ。

／’ＤＡＣ濃度変化では調節されず、さらに、この細胞はドーパミン性、ムスカリン性またはセロトニン型の生物学的に検出可能なｃＡＲ４Ｐ刺激性レセプターを含まないことを示している。

第３４図に示したように、ホルスコリンによって誘導されたｃＡＭＰ濃度の増加によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写型活性化の投与量・活性曲線は２０μＭのホルスコリンで最高の誘導を示した。十分高いホルスコリン濃度でのルシフェラーゼ誘導の低下はホルスコリン自信の毒性効果またはｃＡｌｉｌＰの過剰レベルに寄因すると考えられる。ＩＢＭＸによるホスホジェステラーゼの阻害は形成されたぽの分解を減少させ、結果的にアデニレート・シクラーゼの活性化を伴ってｃＡＭＰレベルを増加させる。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の最高の誘導値はｌ［処理によって有意な影響を受けず、このことは転写の最高の活性化が２０μＭのホルスコリンで得られるｃＡＭＰ濃度で達成されることを意味している。ＩＢＭＸによる投与量・活性曲線の１オーダー低いホルスコリン濃度へのシフトは、ｃＡＭＰの分解を担っている酵素を阻害することによるｃＡ！ｉｌＰの蓄積を明確に示している。

第３５図Ａに示されているように、ホルスコリンの投与量に対するルシフェラーゼ誘導の速度は、ホルスコリンによる刺激から６０分後にルシフェラーゼ活性の増加を検出しうろことを示している。ルシフェラーゼ発現の全誘導は２．５時間後に達成され、ホルスコリン刺激後４時間までは変化しない。ルシフェラーゼ誘導の絶対レベルは２．５時間まで増加するが、ホルスコリン処理の間、ＥＤ、。

レベルは実質的な影響を受けない（第３５図口）。

ｂ）ヒトのドーパミン−ＤＩ−レセプターの活性化に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えＣＨＯテスト細胞系列の開発以下に示す実施例８と同様に本実施例は特異的な、望ましくはヒトのアデニレート・シクラーゼ共役レセプターを調節する物質の細胞性スクリーニング・システムにも適している（コントロール）ＣＲＥテスト細胞の調製を説明している。ヒトのドーパミン−Ｄｉ−レセプター配列を使用してレセプターＤＮＡを生成した。

上述の特徴を有する細胞系列ＣＨＯＣ６−１３をａ）で述べた方法にしたがい、予めＦｓｐｌで線状化したプラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ２　：　Ｄ　１を用いたエレクトロポレーションでトランスフェクトした。トランスフェクションした日から細胞をジハイドロフォレート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ）による選択に適した選択培地（無ヌクレオチド培地α−ＭＥＩＩＩ（ギブコ））、ｌＯ％透析ウシ胎児血清（セバク）、ペニシリンＧナトリウム塩（１００ユニツト／ｍｌ）　、およびストレプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ）　、７００μｇ　／　ｍｌ　ゲネチシン（Ｇ−４１８、ギブニーＢＲＬ　）中で培養し、細胞増殖を観察した。

先に述べたように６穴の細胞培養皿で２４個の単離細胞クローンを増殖し、１０ μＭのアポモノフィン（ドーパミンレセプターに対するアゴニスト）による処理後４時間に未処理細胞と比較してルシフェラーゼ活性の増加を検定した。反復実験において、クローンＣＨＯ１３Ｄ１−３８は、ドーパミンＤｉレセプターの活性化後ルシフェラーゼ活性の最も高い増加を示した。

高効率の自動スクリーニングシステムでテスト細胞系列を使用するためにはプレート当たり９６個のウェルを有するマイクロプレートを使用すると便利である。

このために、組織培養物でコートした非透過性マイクロプレート（マイクロライド１、ダイナチク・ラボラトリーズ）中ウェル当たり２００μｍの培地に６０．０００個の細胞（ＣＨＯＣ６−１３またはＣＨＯ１３Ｄｌ−３６）を植種し、３７°Ｃで一晩インキユベートした。この細胞に種々の薬剤を添加し、特定の時間（通常３時間）インキュベートした。培地の除去後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で分解してから９６穴ルミノメータ−（ＭＬ−１０００、ダイナチク）によってルシフェラーゼ活性を測定した（第３６図）。

第３７図Ａおよび第３７図口、　および第３８図Ａおよび第３８図口に示されているようにヒトのドーパミンＤＩ−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線は、マイクロプレート様式でプロットしたが、曲線上の各ドツトは４回の実験の平均値を表しており、標準偏差は約１５％であった。

プレ・テスト細胞系列ＣＨＯＣ６−１３におけるホルスコリンによるルシフェラーゼ誘導の速度と同様に（実施例７ａ））、アポモルフインによるＤＩ−レセプターの刺激後１時間にドーパミンＤ１−レセプターテスト細胞系列ＣＨＯ１３０１−３８におけるルシフェラーゼ活性の増加が測定された（第３７図Ａ）。最高のルシフェラーゼ活性化は刺激後２．５時間に達成され、４時間まで定常的に維持された。ホルスコリンを用いたアデニレート・シクラーゼの直接的活性化後の速度と比較することにより（第３５図へ）速度を決定する段階はルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の転写および翻訳であり、活性化されたレセプターによるアデニレート・シクラーゼの刺激の段階ではないと結論付けられる。

第３７図口におけるアポモルフインのＥＤＩ。値を決定するための測定値の修正によってＥＤＩ。値がアゴニストによるレセプター刺激時間に有意に依存しないことが示された。

第３８図Ａは、アゴニスト（アポモルフイン）でのＤｌ−レセプターの活性化によるレポーター遺伝子の誘導はアンタゴニストにより投与量依存的に阻害］、うろことを示している。この目的のために、テスト細胞をマイクロプレートに植種してから２４時間後に一定量のアポモルフイン（最終濃度ｌμＭ）添加して直ちにアンタゴニストと混合すると、第３７図Ａに示したようにルシフェラーゼ遺伝子の最高の誘導をもたらす。テスト物質が均一な溶液として供給されるスクリーニング法を模倣して、この実験では最終濃度１％のＤＭＳＯを使用した。

このテストで使用した物質の効果はレセプター結合実験を行った文献に報告されているデータと良く一致した。

第３８図口は別の形で記録された同じ値（コントロールとしての同一の未処理細胞と比較したルシフェラーゼのＸ−倍の誘導）、さらにアゴニストであるブロモクリプチンの投与量依存活性を示している。最も高いブロモクリプチン濃度（１００μＭ）におけるルシフェラーゼ誘導の逆転はブロモクリプチン自身の細胞毒性、またはブロモクリプチンを溶解するのに必要な低ｐＨに帰することが出来る。

実施例８ａ）細胞内ｃＡＭＰ濃度に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えチャイニーズ・ハムスター・卵巣（Ｃ）１０　）細胞系列（ＣＲＥ細胞系列）の開発レセプター分子と直接的または間接的に相互作用することにより細胞内ｃＡＭＰレベルに影響する物質をテストするための（ブレ・）テスト細胞の調製を目的として、チャイニーズ・ハムスター・卵巣細胞系列ＣＨＯ−ＤＸＢＩＩ（ウルローブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、１９８０）をセンサーＤＮＡ　ｐＡＤｎｅｏ２−ＣＩ２−ＴＫＬでトランスフェりトシた。（このプラスミドは、６個のＣＲＥ要素を含む領域が倍加しており、β−グロビン・・プロモーターが１’にプロモーターに置換している点で（実施例１ｂ参照）実施例１で示したｐＡＤｎｅｏ２−Ｃ６−ＢＧＬとは異なる）。これを行うためには、５ａｌＩ− １１ｉｎｃｌｌｌｌ−β−グロビン−プロモーター−フラグメントを耐プロモーターを同様の切断フラグメントで置換した（マクナイｔ−（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）　、１９８０）。

親細胞系列ＣＨＯ−ＤＸＢＩ　１をｌ（１％ウシ胎児血清（セバク）、ヒポキサンチン（１００μＭ）、チミジン（１６μＭ）、ペニシリン肛ナトリウム塩（１００ユニツト／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ）を含むロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート（ＲＰＭＩ）培地１６４０　（ギブコ）で培養した。トランスフェクション１日前、細胞を新鮮な培地に移した。

細胞クローンのトランスフェクションおよびテストは実施例７ａ）と同様に行った。以後の実験用に、最も高いルシフェラーゼ活性を示し、同時にホルスコリンによる高い誘導性を示す細胞クローンＣ１２−３２を選択した。

ｂ）ヒトのドーパミンＤ５レセプターの活性化に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えＣｌｌ０テスト細胞系列の開発（先の実施例７と同様に）本実施例は特異的な、望ましくはヒトのアデニレート・シクラーゼ共役レセプターに適した（コントロール）　ＣＲＥテスト細胞の調製を示している。レセプターＤＮＡの調製にはヒトのドーパミン−Ｄ５−レセプター配列を使用した。

先に特徴を明らかにされた細胞系列ＣＨＯＣｌ２−３２を、ａ）と同様にトランスポレーションによって２ＯＮｇの５ｔｕｌで線状化したプラスミドＩ）ＡＤ− ＣＭＶｌ、　：Ｄ５でトランスフェクションした。（プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩ　：　Ｄ５は、ヒトのＤ５レセプター遺伝子のコード領域を含むｐｈＤ５−ｇａ＋ｎの１．６ｋｂの５ａｌｌ−Ｘｂａｌフラグメント（グランディ（Ｇｒｎｄｙ）等、１９９１）を切断したヒト・ベクターｐＡＤ−ＣＭＶＩに連結することにより調製した。）トランスフェクションした日から細胞をジハイドロホレ−１・・リダクターゼ（ＤＮＦＲ）による選択に適しこ選択培地（１０ｘウシ胎児血清（セバク）、ペニシリンＧナトリウム塩（Ｉ００ユニット／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ）　、７００　μｇ　／　ｍｌのゲネヂンン（Ｇ−４１８、ギブニーＢＲＬ　’Ｉを含む無ヌクレオチド培地α−１８（ギブコ））中で培養し、細胞増殖を観察した。先に述べた。ように単離した２４個の細胞クローンを６穴細胞培養皿で培養し、１ＯＮＭアポモルフイン（ドーパミンレセプターに対するアゴニスト）による処理から４時間後、未処理細胞と比較してルシフェラーゼ活性の増加を見た。反復実験の結果、クローンＣＩＯ３２Ｄ５−３９はドーパミンＤ５レセプターの活性化後ルシフェラーゼ活性の高い増加を示した。

第３９図Ａはアゴニスト（アポモルフイン）でのＤ５レセプターの活性化によるレポーター遺伝子の誘導は投与量依存的にアンタゴニストによって阻害しうろことを示している。これを行うためには、テスト細胞をマイクロプレートへの植種から２４時間後であって一定量のアポモルティン（最終濃度０．１μＭ）添加後直ちにアンタゴニストと混合したが、この事で第３９図Ａに示されているようにルシフェラーゼレポーター遺伝子の最高の誘導がもたらされた。これらの実験結果を第３９図Ｂに示す。

このテスト操作に使用した物質の能力は、レセプター結合実験を行った文献のデータと良く一致した。

実施例９ルシフェラーゼ活性を測定するための試薬の開発ＡＴＰ　、ｋシ’７エ！Ｊ　：／、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，Ｏ、ジチオスレイト−ＡＩ　（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリポリリン酸ナトリウム（ＮａＴＰＰ　）、Ｔｒｆｔｏｎ　Ｘ−１００の濃度およびｐＨを変化させることによるルシフェラーゼ測定シグナルへの影響を調べた（表２）。その他の成分は表１に示した望ましい基本バッファに対応する濃度を使用した。試薬添加から３分後に得られた測定値を比較のために使用した（得られた最高測定シグナルに対するパーセンテージで表される）。

第４０図は基本バッファにβ−メルカプトエタノールおよび／またはトリポリリン酸ナトリウムを添加することのルシフェラーゼ測定シグナルへの影響を示している（黒四角二基本バッファ；白四角＝４μｍ７ｍ１のβ−メルカプトエタノールの添加：黒丸　０．２■／ｍｌのトリポリリン酸ナトリウムの添加；白丸、４ａｌｌｍｌのβ−メルカプトエタノールおよび０．２■／ｍｌのトリポリリン酸ナトリウムの添加）。全ての測定にダイナチク社製マイクロライドＭＬ１００Ｏを搭載するルミノメータ−を使用した。

浄書（内容に変更なし）表１物質　ｎｍｏｌ／Ｉ　ＭＷ　ｇ／ｌｌ・リシン　＊　２５　１７９　４．４８ＥＤＴＡ　Ｏ，５３７２０，１８６ＭｇＳＯ４”７ＨｔＯ１６，３２４６４，０ＡＴＰ　１．２　６０５　０．７２６ルシフエリン、　０．０５　３０２　０．０１５ナトリウム塩ＤＴＴ　６．５　１５４　１．０ＮａＴＴＰ　Ｏ，５４３６８０，２ＯＮ−トリス−（ヒドロキシンチル）メチル−グリシンＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋　１ｍｌ／１．　ＩＮ　ＮａＯＨでｐＨ７，８に調整２争書（内容に変更なし）表２（参考文献）エンジェル（Ａｎｇｅｌ）、Ｐ、、ボーマン（Ｂａｕｍａｎｎ）、　１．、スティン（Ｓｔｅｉｎ）、　Ｂ、、プリウス（Ｄｅｌｉｕｓ）、Ｈ，、ロームスドルフ（ｈｔｕｎｓｄｏｒｆ　）、　Ｈ，Ｊ、およびヘルリッヒ（Ｈｅｒｒｌｉｃｈ）、Ｐ、　１９８７＆、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７．２２５６−２２６６エンジエル（んｕｅｌ　）、　Ｐ、、イマガヮ（Ｉｍａｇａｗａ）、　Ｍ、　、チュウ（Ｃｈｉｕ）、Ｒ，、スティン（Ｓｔｅｉｎ）、Ｂ、、インプラ（Ｉｍｂｒａ　）、　Ｒ，Ｊ、、ロームスドルフ（Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ　）、　Ｌ　Ｊ、、ジョナット（Ｊｏｎａｔ）、Ｔ、Ｊ、、ヘルリッヒ（）！ｅｒｒｌｉｃｈ）、Ｐ、およびカリシ（Ｋａｒｉｎ）。

Ｍ、、　１９ｇ７ｂ、　Ｃｅ１ｌ　４９．７２９−７３９ビｏ−（Ｂｉｌｌａｂ）、１Ｍ、　、パイ（Ｐａｉ）、Ｊ、−に、　、ｖルマン（Ｍｕｌｌｍａｎｎ）、Ｔ、Ｊ、　、ｘ−ガン（Ｅｇａｎ）、　Ｒ，Ｗ、およびシーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）、１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．９０６９ブレーザー（Ｂｒａｓｉｅｒ）、丸え、テート（Ｔａｔｅ）、Ｊ、ε、およびハーベナー（Ｈａｂｅｎｅｒ）、　Ｊ。

Ｆ、　１９８９．　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　？、　１１１６−１１２２バックレ−（Ｂｕｃｋｌｅｙ）、　Ｎ、　Ｊ、等、１９８９．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３５．４６９−４７６チヤン（Ｃｈｕｎｇ）、　Ｃ，Ｔ、およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｒ，Ｈ，，１９８８，Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６゜デユーシュ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）、Ｐ、Ｊ、、ホーフラー（Ｈｏｅｆｆｌｅｒ）、Ｊ、Ｐ、　、ジェームソン（Ｊａｍｅｓｏｎ）ｊ、Ｌ、およびハーベナー（Ｈａｂｉｎｅｒ）、　Ｊ、　Ｆ、、１９８８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８５．７９２２９−７９２６デルカ（ＤｅＬｕｃａ）、　Ｋ　、ワンランド（Ｗａｎｎｌｕｎｄ）、　Ｊ、およびマツヶロイ（ＭｃＥｌｒｏｙ）、　Ｗ。

Ｄ９．１９７９、Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｅＩＬ９５．１９４−１９８デウエツト（Ｄｅ　Ｗｅｔ）、Ｊ、Ｒ，、ウッド（Ｗｏｏｄ）Ｊ、■、　、およびデル力（ＤｅＬｕｃａ）、ＩＬ。

１９８５、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．７８７０−７８７３デウエツト（Ｄｅ　Ｗｅｔ）、Ｊ、Ｒ，、ウッド（Ｗｏｏｄ）、に、Ｖ、　、デル力（ＤｅＬｕｃａ）、Ｍ、　、ヘリンスキー（Ｈｅｌ　１ｎｓｋｉ　）、　Ｄ、　Ｒ，およびサブラｖ−（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　）、　ｓ、、１９８７．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、　７．７２５−７３７ドール７　ン（Ｄｏｈｌｍａｎ）、　Ｈ，Ｇ、等、１９９１．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６０．６５３−６８８ドツズ（Ｄｏｏｄｓ　）、　Ｎ、　Ｌおよび７オンミール（ｖａｎ　Ｍｅｅｔ）、　Ｊ、　Ｃ，ん、１９９１．生化学実験のためのレセプターデータ、薬学科学におけるエリス・ホーウッド（ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄ　）シリーズフェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｒ）、　Ｐ、　Ｌ、、ガデク８Ｈａｄｅｋ）、　Ｔ、　Ｒ，、ホルム（Ｈｏ１ｍ）、Ｍ、　、ローマン（Ｒｏｍｎ）、　Ｒ，、チャン（Ｃｈａｎ）、Ｈ，Ｎ、　、ウエンズ（Ｗｅｎｚ）、ｌｉＬ　、ノースロップ（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ）、Ｊ、Ｐ、　、リンコールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）、Ｇ、Ｍ、、およびダニエルセン（Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ）、＆Ｌ、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．７４１３−７４１７グランデイ（Ｇｒａｎｄｙ）、Ｄ、に、　、ザン（Ｚｈａｎｇ）、　Ｙ　、ポービア（Ｂｏｕｖｉｅｒ）、　Ｃ，、ゾウ（Ｚｈｏｕ）。

Ｑ、　Ｙ、等、１９９１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．９１７５−９１７９グリツツ（Ｇｒｉｔｚ）ル、およびデーピース（Ｄａｖｉｅｓ）、　Ｊ、、１９８３．　Ｇｅｎｅ　２５．１７９−１８８ハートマン（ｈｒｔｍａｎｎ）、Ａ、、１９９１．　ＢｉｏＴｅｃ　５．４０−４５ホースレー（Ｉ（ｏｕｓｌａｙ）、Ｄ、、　ハング（Ｈｕａｎｇ）、　Ｋ、　Ｎ、、リベリ（Ｌｉｖｅｌｌｉ）、Ｔ、Ｊ、、アクセル（Ａｘｅｌ　）、　Ｒ，およびジェセル（Ｊｅｓｓｅｌｌ）、ＴＪＬ、１９９０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

カリシ（ｈｒｉｎ）、Ｉｔ、１９８９、ＴＩＧ　５．６５−６７キング（Ｋｉｎｇ）、に、ドールマン（Ｄｏｈｌｍａｎ）、　Ｈ，Ｇ、、ソーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ）、　Ｊ、、キャロン（Ｃａｒｏｎ）、ｌ１ＬＧ、およびレフコウィッッ（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｘ）、　Ｒ，Ｊ、、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ２５０、　１２１−１２３クリ力（Ｋｒｉｃｋａ）ル、Ｊ、、　１９８８．　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂ；ｉｏｃｈｅｍ、　１７５．１４−２１リーチ（Ｌｅａｃｈ）、　Ｆ、　Ｒ，およびウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）、　Ｊ、　Ｊ、、１９８６．生化学発光および化学発光、バートＢ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３３．５１−７０リー（Ｌｅｅ）、Ｗ、、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌυ、Ｐ、およびジャン（Ｔｊｉａｎ）、Ｒ，、１９８７，Ｃｅ１１４９、７４１−７５２ランドシュルツ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ）、Ｗ、Ｈ，、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、　Ｐ、　Ｆ、およびマクナイ）（ＭｃＮｉｇｈｔ）、Ｓ、Ｌ、、１９８ｇ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．　１７５９−１９６４マニアチス（Ｍａｎｊａｔｉｓ）、Ｔ、　、フリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、ε、Ｆ、およびサンプルーフ（Ｓａｆｆｌｂｒｏｏｋ）、Ｊ、、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、：Ｉ−ルドスブリングハーバー、コールドスプリングハーバ−・ラボラトリーズマクナイト（ＭｃＮｉｇｈｔ）、　Ｓ、　Ｌｌ、　１９８０．　Ｎｕｃｅｉｃ　Ａｃ；ｉｄｓ　Ｒｅｓ、　８．５９４９−５９６４モントメーヤー（Ｍｏｎｔｓａｙｅｕｒ）、　Ｊ、−Ｐ、およびボレリ（Ｂｏｒｒｅｌｌｉ）、Ｅ、、　１９９１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．３１３５−３１５９モントミニ（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ）、Ｍ、Ｒ，、ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）、　Ｇ、んおよびヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）、に、Ｌ、　１９９０．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　１３．１８５ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）、Ｒ，およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、Ｐ、、　１９８１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７８、２０７２−２０７６オカヤｖ（Ｏｋａｙａｍａ）、　Ｈ，およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、Ｐ、、　１９８３．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３．２８０−２ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）、Ｈ，、ウェア（Ｗｅｉｒ）、Ｌ、およびレダー（Ｌｅｄｅｒ）、Ｐ、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１．７１６１ブリチエツト（Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ）等、１９８８．　ＥＩｉ０３０　Ｊｏｕｒｎａｌ　７．４１３５ −４１４０サイキ（Ｓａｉｋｉ　）、　Ｒ，Ｋ、、ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）、　Ｄ、　Ｈ，、ストラフエル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）、Ｓ、。

シャーフ（Ｓｃｈａｒｆ）、Ｓ、Ｊ、　、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ　）、　Ｒ，、ホーン（Ｈｏｒｎ）、Ｇ、Ｔ、　、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）、に、Ｂ、およびア７リッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、Ｈ，Ａ、　１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９゜サソン・コルク（Ｓａｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓ　ｉ　）、　ｐ、、ランワン（Ｒａｎｓｏｎｅ）、　Ｌ、　Ｊ、およびベルマ（Ｖｅｒｍａ）。

ＩＫ、　１９９０．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５．４２７−４３１シヨート（Ｓｈｏｒｔ）等　、１９８８．　Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１．５５２１−５５４０サイモン（Ｓｉｍｏｎ）、　Ｉｔ　１．、ストラスマン（Ｓｔｒａｔｔｕｍｎｎ）、　Ｍ、　Ｐ、およびガータム（Ｇａｕｔａｍ）、Ｎ、、　１９９１．５ｃｉｅｎｃｅ　２５２．８０２−８０８サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、　Ｐ、およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、Ｐ、、　１９８２．　Ｊ、　Ｍｏ１．Ａ９ｐ１．Ｇｅｎ、　１．３２７スチンスキ（Ｓｔｊｎｓｋｉ　）、　Ｍ、　Ｆ、およびロア（Ｒｏｅｈｒ）、Ｔ、Ｊ、、　１９８５．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５５．４３ P サブラｖ二（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　）、　ｓ、およびデル力（ＤｅＬｕｃａ）、Ｋ　、　１９８７．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、原則および方法、Ｊ、　Ｋ、セドｏ−（Ｓｅｄｌｏｗ）ｉ！、プレナム・プレス、ニューヨーク、バンド１０．７５−８９サグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）、　Ｂ、　、　？−シュ（Ｍａｒｓｈ）、　Ｋ、およびイエーツ（Ｙａｔｅｓ）、Ｊ、、　１９８５．　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　５．４１０−４１３ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）、　Ｒ，およびジャン（Ｔｊｉａｎ）、Ｒ，、１９８９，５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．１６８９−１６９４ウルリツヒ（υｌ１ｒｉｃｈ）、　Ａ、およびシュレジンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）、Ｊ、、　１９９０．　Ｃｅ１１６１、２０３−２１２アーローブ（ｔｌｒ　１ａｕｂ　）、　Ｇ、およびカジン（Ｃｈａｓｉｎ）、　Ｌ、ん、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓモ堰B ＵＳＡ　７７、４．２１６−４２２０ボラバーガー（１１０ｒａｂｅｒｇｅｒ）、　Ｇ、等、１９９１．　Ｊ、　Ｉｍｎｕｎｏｌ、１４７．２７７７ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ　）、　ｔ　、＋、　、シャープ（Ｓｈａｒｐ）、　Ｊ、＾、およびサマース（Ｓｗｅｒｓ　）、　Ｗ、　Ｃ，。

１９８１、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８．１４４１−１４４５ウイーランド（Ｗｉｅｌａｎｄ）、　Ｅ、等、１９８５．　Ａｒｚｔｌ、　Ｌａｂ、　３１．２０３−２１４ウイナγ力−ｆｆｉｎｎａｃｋｇｒ）Ｊ、Ｌ、、　＋９８５．　Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｌｏｎｅ、　Ｅｊｎｅ　Ｅｊｎｆ’ｈｒｕｎｇｉｎ　■ ｉｅ　Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、　ＶＣＨＶｅｒｌａｇｓｇｅｓ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、　２６４ゾウ（Ｚｈｏｕ　）、　Ｑ、−Ｙ、、グランディ（Ｇｒａｎｄｙ）、　Ｄ、　Ｋ、　、サンビ（Ｔｈａｍｂ　ｉ　）＋　Ｌ、　、クシュナー（Ｋｕｓｈｎｅｒ）、　Ｊ、　Ａ、　、ファンドル（ｖａｎ　Ｔｏｌ　）、　Ｈ，Ｈ，Ａ４．　、　コーン（Ｃｏｎｅ）、　Ｒ，、ブリブノー（Ｐｒｉｂｎｏｗ）、　Ｄ、　、サロン（Ｓａｌｏｎ）、　Ｊ、、ブンゾー（Ｂｕｎｚａｗ）、　Ｊ、　Ｒ，、およびシベリ（Ｃｉｖｅｌｌｉ）、０．、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４７．７７６−８０Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　：　Ｖｌｒ１章、編集ボーウェルス（Ｐｏｕｗｅｌｓ）、アンガーボークＣＥｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ）、プレー？　−（Ｂｒａａｎｅｒ）　、：Ｌルセビア版、アムステルダム、二Ｈｕｍａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ−Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ−Ｔｏ−Ｃ１ｉｎｉｃａｌ、　２章：作用部位：レセプター、編集ウィンガード（Ｗｉｎｇａｒｄ）、　Ｌ、　Ｂ、　、プロディー（Ｂｒｏｄｙ）、Ｔ、Ｊ　ラーナー（Ｌａｒｎｅｒ）、　Ｊ、およびシュワルツ（Ｓｃｈ日ｒｔｚ）、＾、、　モスビー　イヤー・ブック社、セントルイス、１９９１ＴｉＰｓ：　Ｒｅｃｅｐｊｏｒ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１９９１配列データ（２）　ＳＥＯＩＱ　ＮＯ：Ｉの情報：（１）ｖりの特徴：（Ａ＋　長さ＝１６コＯ塩基（Ｂ）　配列タイプ：核酸（Ｃ１ｉｌ！Ｓ！：　一本鎮　−− （Ｄ）トポロジー：線状（工１）　分子型：　ＣＤＮＡ（ｘｉｌ　１ａＪＩｌｓＥｏ　ＩＤ　Ｎｏ：　Ｉ　：Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｓｉｒ　Ｔｎｒ　Ｔｈ、ｒ　２Ｍｍ、　ｓ＠？Ｌａｕ　１４ｅｔ　Ｇ１．ｎ　ｆ、ｅｕ　ｋ北Ａｓｐλｓ■ ＴＭ　Ａｒｇ　ｒ−ｅｕ　Ｔｙｒ　５４：　Ａｓｒ＋　＝ｐ　？：ｅ　ＡＭ−５ｅ？　ＣｒＶ　ＱｉＵ　Ａｌａ　ＡＭ：’＋　Ｔｈｒ　ｓｉ■ ｉｇ−２＜Ｆｉσ　７Ｆｉｇ−１０Ｆｉｇ、１１Ｆｉｇ、　１２Ｆｉｇ、１３Ｆｉｇ、　１４Ｆｉｇ、　］５ルシフェラーゼＦｉｇ、　＋６Ｆｉｇ−１７ＨＦＲ１１ｇ、１８Ｆｉｇ−１９ＡＦｉｇ、１９ＢＦｉｇ−２０Ｆｉｇ、２１誘導物なし　＋ホルスコリン　÷ＴＰＡ誘導物なし　＋ホルスコリン　÷ＴＰＡＦｉｇ、２２Ａ５４９　ＨｅＬａ　ＣＯ５−７Ｆ工ｇ、２３ＡＦｉｇ、　２３３Ｆｉｇ、２４Ｆｉｇ、２５Ｆｉｇ−２６Ｆｉｇ−２７Ｆｉｇ、２ｇ時間（時間）Ｆｉｇ−２９Ａ ±を頁井−Ｇτ乙（１ｒＦｉｇ、２９Ｂ＊Ｖ粁μｍ〇τ乙／：／ｌ／Ｆｉｇ−３０アンタゴニスト〔Ｍ〕Ｆｉｇ、　３１時間［ｈ］Ｆｉｇ、　３ＺＡ讃＃泊井−Ｇτｃｒ：１ｒＦｉｇ−３２Ｂ＊稍繍ニーＧτ乙／′：１ｒＦｉｇ、　３３ルシフェラーゼ誘導Ｆｉｇ−３４鮎第ニーＧτＬ／：１（Ｆｉｇ−３５Ａ１０口４Ｑｘ＋ｎ］８Ｆｉｇ−３５Ｂ（％）ま鯵■井−４丁乙／：４／Ｆｉｇ−３ｂルシフェラーゼ誘導ロ　り　ｏ、ＬＬ″１　ロ　いロ　噴　−−へ　ｃ−４００Ｆｉｇ、　３７Ａｎ］８Ｆｉｇ、　３７Ｂ（％）士鯵ｇμｍ９Ｉ乙４１（Ｆｉｇ、３８ＡＦｉｇ−３８８鯵垢ａ−６τｔ／：１ｒＦｉ９−　３９ＡＦｉｇ−３９８Ｆｉｇ、４０居甫某榔ｍ平成　年　月　日２発明の名称　レセプター依存細胞シグナル誘導経路に関する調節効果を存する物質のスクリーニング法ふ補正をする者事件との関係　出　願　人４、代理人５、補正命令の日付　平成６年１１月２９日６、補正の対象　明細書（５６〜５７頁）及び請求の範囲（７３〜７７頁）の翻訳文７、補正の内容　別紙のとおり明細書（５６〜５７頁）及び請求の範囲（７３〜７７頁）の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告ＥＰ　９２０２７１８Ｓ＾　６６Ｂ７０国際調査報告国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，８識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｒ１：９１）（７２）発明者　シュトラトワ　クリスチャンオーストリア　ア−１０１０ウィーン　シエリングガッセ　３−９ッテンフェルトガッセ　９２−２−２０＞　ＦＩ（Ｃ１２Ｎ　５１００　ＢＣＬ　２　Ｒ１：９１）一トホッフスガッセ　４５３（７２）発明者　シェファー　レナーテオーストリア　ア−１１４０ウィーン　ペンツィンゲルシュトラーセ　３０−４

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトまたは動物細胞におけるレセプター依存シグナル誘導経路に関する物質の調節効果を測定する方法であって、シグナル誘導経路に共役しているレセプターによって開始するシグナル誘導経路におけるホスホリパーゼの活性化またはホスホリパーゼの活性化を促進するメカニズムに関する物質の調節効果を、ａ）レポーター遺伝子の発現がＩＰ３／ＤＡＧ濃度の変化によって調節されるように、ホスホリパーゼ活性の調節によってもたらされるイノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の濃度変化に応答する調節遺伝子及びレポーター遺伝子を含む組み換えＤＮＡでトランスホームした、また、さらに、（ｂ）細胞がレセプターを発現するようにホスホリパーゼ・エフェクターと共役しているレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームした、哺乳類細胞をテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子生産物の濃度を計測することによって測定することを特徴とする方法。２．前記ｂ）で定義された組み換えＤＮＡがヒトのレセプターをコードすることを特徴とする請求項１記載の方法。３．前記ａ）で定義された組み換えＤＮＡが、ホスホリパーゼＣの調節によってもたらされるＩＰ３およびＤＡＧの濃度変化に応答する調節配列を含み、かつ、前記ｂ）で定義された組み換えＤＮＡがＧプロテイン共役レセプターをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。４．前記ｂ）で定義された組み換えＤＮＡでのみトランスホームした哺乳類細胞を同一の条件下でテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子生産物の濃度を測定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。５．前記レポーター遺伝子の発現がｃＡＭＰ濃度変化によって調節されるように、レポーター遺伝子およびアデニレート・シクラーゼの調節によってもたらされるｃＡＭＰの濃度変化に応答する調節配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームした哺乳類細胞をテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子生産物の濃度を測定することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。６．ｃＡＭＰに応答する組み換えＤＮＡおよびＩＰ３／ＤＡＧに応答する組み換えＤＮＡでトランスホームした細胞と同様のレセプターをコードする配列を含む前記ｂ）で定義された組み換えＮＡでトランスホームした細胞をテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子生産物の濃度を測定することを特徴とする請求項５記載の方法。７．前記細胞がレセプターを発現するようにアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムに共役するレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームした細胞をテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子生産物の濃度を測定することを特徴とする請求項５記載の方法。８．前記テスト物質が、所定数の哺乳類細胞を所定の条件でインキュベートする複数の物質の内の１つであり、レポーター遺伝子生産物の濃度を測定するスクリーニング法として使用することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。９．前記細胞を分解するのに適した界面活性剤を含む試薬の存在下、ｐＨが６乃至９、望ましくはｐＨ７．８であって、マグネシウム塩、望ましくは硫酸マグネシウム、アデノシン三リン酸、ネシフェリン、ジチオスレイトールおよび／またはβ−メルカプトエタノール等の穏やかな有機性還元剤、および場合によってはトリポリリン酸ナトリウムおよび／またはピロリン酸ナトリウムを含むバッファ中でレポーター遺伝子生産物としてルシフェラーゼを測定することを特徴とする請求項８記載の方法。１０．前記細胞を分解するのに適した界面活性剤を含み、バッファがｐＨが６乃至９、望ましくはｐＨ７．８であって、マグネシウム塩、望ましくは硫酸マグネシウム、アデノシン三リン酸、ネシフェリン、ジチオスレイトールおよび／またはβ−メルカプトエタノール等の穏やかな有機性還元剤、および場合によってはトリポリリン酸ナトリウムおよび／またはピロリン酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項９記載の方法を行うための試薬。１１．レポーター遺伝子および哺乳類細胞における発現が該遺伝子と機能的に連結されている発現コントロール配列を含む組み換えＤＮＡであって、該発現コントロール配列がホスホリパーゼＣの調節によってもたらされるＩＰ３およびＤＡＧの濃度変化に応答する調節配列を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項記載の方法で使用するのに適した組み換えＤＮＡ。１２．天然に存在する調節配列を含むことを特徴とする請求項１１記載の組み換えＤＮＡ。１３．ＩＰ３／ＤＡＧで誘導しうる遺伝子の５′調節配列を含むことを特徴とする請求項１２記載の組み換えＤＮＡ。１４．ＩＣＡＭ−１遺伝子の５′調節配列を含むことを特徴とする請求項１３記載の組み換えＤＮＡ。１５．前記調節配列が合成的に生産されたものであることを特徴とする請求項１１記載の組み換えＤＮＡ。１６前記調節配列がＩＰ３／ＤＡＧの調節に応答する複数の調節要素を互いに間隔をおいて含むことを特徴とする請求項１５記載の組み換えＤＮＡ。１７．３個乃至１２佃の調節要素を含むことを特徴とする請求項１６記載の組み換えＤＮＡ。１８．前記調節要素および／またはそれらの間に存在する配列領域の少なくともいくつかが互いに異なることを特徴とする請求項１６または１７記載の組み換えＤＮＡ。１９．ＩＣＡＭ−１遺伝子のＴＲＥ要素を含むことを特徴とする請求項１７または１８記載の組み換えＤＮＡ。２０．６個のＩＣＡＭ−１遺伝子のＴＲＥ要素を含むことを特徴とする請求項１７または１８記載の組み換えＤＮＡ。２１．レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする請求項１１乃至２０のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡ。２２．マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項１１乃至２１のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡ。２３．請求項１１乃至２２のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡでトランスホームした哺乳類細胞。２４．前記細胞がレセプターを発現するように、ホスホリパーゼＣエフェクター・システムと共役するレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項２３記載の哺乳類細胞。２５．前記組み換えＤＮＡがヒトのレセプターをコードする配列を含むことを特徴とする請求項２４記載の哺乳類細胞。２６．前記組み換えＤＮＡがＧ−プロテイン共役レセプターをコードする配列を含むことを特徴とする請求項２４または２５記載の哺乳類細胞。２７．前記発現コントロール配列がホスホリパーゼＣの調節によって起こるＩＰ３およびＤＡＧの濃度変化に応答する調節配列を含むことを特徴とする請求項２６記載の哺乳類細胞。２８．前記細胞を５−ＨＴ１０−および５−ＨＴ２−型のセロトニン・レセプター、トロンビン・レセプター、ニューロペプチドＹ−レセプター、ニューロキニン・レセプター、ＰＡＦ−レセプター、アンジオテンシン・レセプター、Ｍ１− 、Ｍ２−およびＭ５−型のムスカリン性アセチルコリン・レセプターからなる群から選択されるレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームすることを特徴とする請求項２９記載の哺乳類細胞。２９．レポーター遺伝子および哺乳類細胞における発現が該遺伝子と機能的に連結している発現コントロール配列を含む組換えＤＮＡであって、該発現コントロール配列がアデニレート・シクラーゼの調節によってもたらされるｃＡＭＰの濃度の変化に応答する調節配列を含むことを特徴とする請求項５乃至９のいずれか１項記載の方法で使用するのに適した組み換えＤＮＡ。３０．発現コントロール配列が合成的に生産されることを特徴とする請求項２９記載の組み換えＤＮＡ。３１．調節配列が互いに間隔をおいてｃＡＭＰの調節に応答する複数の調節要素を含むことを特徴とする請求項３０記載の組み換えＤＮＡ。３２．３個乃至１２個の前記調節要素を含むことを特徴とする請求項３１記載の組み換えＤＮＡ。３３．前記調節要素および／またはそれらの間に存在する配列領域の少なくともいくつかが互いに異なることを特徴とする請求項３１または３２記載の組み換えＤＮＡ。３４．レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする請求項２９乃至３３のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡ。３５．マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項２９乃至３４のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡ。３６．請求項２９乃至３５のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡでトランスホームした哺乳類細胞。３７．前記細胞がレセプターを発現するように、ホスホリパーゼＣエフェクター・システムと共役するレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項３６記載の哺乳類細胞。３８．前記細胞を５−ＨＴ１０−および５−ＨＴ２−型のセロトニン・レセプター、トロンビン・レセプター、ニューロペプチドＹ−レセプター、ニューロキニン・レセプター、ＰＡＦ−レセプター、アンジオテンシン・レセプター、Ｍ１− 、Ｍ３−およびＭ３−型のムスカリン性アセチルコリン・レセプターからなる群から選択されるレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームすることを特徴とする請求項３７記載の哺乳類細胞。３９．前記細胞がレセプターを発現するようにアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムに共役したレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項３６記載の哺乳類細胞。４０．Ｍ２−およびＭ４−型のムスカリン性アセチルコリン・レセプター、Ｄ１ −、Ｄ２１−、Ｄ２０−、およびＤ３−型のドーパミン・レセプター、５−ＨＴ１Ａ−および５−ＨＴ１Ｄ−型のセロトニン・レセプターおよびＡ１−およびＡ２−型のアデノシン・レセプターからなる群から選択されるレセプターをコードする配列を含む組み換えＤＮＡでトランスホームされていることを特徴とする請求項３９記載の哺乳類細胞。【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４７１アミノ酸（Ｂ）配列タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：タンパク質（ｘｉ）配列：ＳＥＯ　ＩＤ　ＮＯ：２：【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２３塩基（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列の特徴：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３７塩基（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６４塩基（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５６塩基（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５６塩基（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７：【配列があります】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４５塩基（Ｂ）配列タイプ：核酸（Ｃ）鎖型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：発明の詳細な説明