CN114369578A - 用于检测多巴胺d3靶点化合物生物学活性的细胞系和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的细胞系，所述细胞系包括编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸以及编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸。本发明还公开了一种使用所述细胞系检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的方法。本发明的细胞系可快速、准确、高效的检测多巴胺D3靶点治疗药物的生物学活性。此外本发明检测方法无需复杂的仪器或操作步骤，便可完全满足针对多巴胺D3受体的小分子化合物的生物学活性检测。

Description

用于检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的细胞系和方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种包括编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸和编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸的用于检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的细胞系；本发明还涉及一种使用所述细胞系检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的检测方法。
背景技术
多巴胺能系统在神经调节中起着重要的作用，如运动控制、动机、奖赏、认知功能、母性和生殖行为。多巴胺(Dopamine)是一种神经递质，通过酪氨酸的连续羟基化和脱羧化在神经元末梢产生，并通过囊泡单胺转运体2装载到突触囊泡中胞吐释放。释放的多巴胺可以被多巴胺转运蛋白重新摄取，也可以被儿茶酚-O-甲基转移酶和突触前单胺氧化酶降解。多巴胺与位于靶细胞膜上的多巴胺受体结合，从而发挥作用。
多巴胺受体属于GPCRs超家族，主要包括D1、D2、D3、D4和D5五种类型。其中，D1和D2是大脑中表达最多的多巴胺受体，并且它们几乎不在同一细胞中同时表达。根据多巴胺受体的结构和药理特性，它可分为两大类：D1类受体，包括D1和D5；D2类受体，包括D2、D3和D4。所有的多巴胺受体都是代谢型受体，其中D1和D5受体与Gαs/olf蛋白偶联，刺激第二信使cAMP的产生；D2、D3和D4受体与Gαi/o蛋白偶联，抑制细胞内cAMP的生成。
D1受体主要表达于尾壳核(CPu)，伏隔核(Acb)，视束(OT)，脑皮层(Cx)和杏仁核。D5受体和D1受体相比表达局限，仅在海马，外侧乳头体核和下丘脑束旁核表达。D2受体主要在脑的CPu，OT和Acb中表达，在黑质和腹侧被盖部(VTA)也有表达，这些区域发出多巴胺纤维，提示D2受体有突触前定位。相反，D1类受体只有广泛的突触后定位。在脑外，D2受体还定位于视网膜，肾脏，血管系统和垂体。D3受体的分布仅限于Callija岛，隔核，下丘脑和丘脑，以及小脑中的某些区域。D3受体还分布于黑质致密部，提示它也存在突触前定位。在前额叶皮层，杏仁核，嗅球，海马，丘脑和中脑可见D4受体的mRNA高度表达。
目前，对于多巴胺受体激活的信号转导途径主要包括有：对腺苷酸环化酶的激活，或抑制钙信号的调控。D1类受体正性调控环磷酸腺苷(cAMP)的水平。进一步激活蛋白激酶A(PKA)，PKA磷酸化细胞质和细胞核因子，调控细胞代谢包括离子通道功能，使跨膜G蛋白偶联受体去敏感化，导致细胞神经递质释放。D2类受体普遍抑制腺苷酸环化酶(AC)活动。首先在垂体和纹状体细胞发现D2类受体抑制cAMP水平。D2受体通过偶联信号通路抑制AC，并可被百日咳毒素(PTX)阻断。D3受体在几个细胞株中抑制内源性cAMP水平，但抑制程度低于D2受体。有报道，D4受体抑制视网膜和一些细胞株的cAMP的聚集。
大量研究表明D3受体与情绪、认知、精神、运动控制等关系密切。对精神分裂症患者的尸检研究表明，患者中脑边缘区和纹状体D3密度升高程度显著，而给予抗精神分裂药物治疗的患者，其D3表达相对正常；D3基因第一外显子Ser9gly的多态性与精神分裂症发病率密切关联；D3基因敲除小鼠在精神分裂症动物模型中的研究表明，区别于D2阻断，D3拮抗剂可有效避免运动障碍等EPS副反应的发生；选择性阻断D3受体而较少作用于D2受体，有助于改善认知功能。根据以上研究结果，多巴胺D3受体迅速成为抗精神分裂症新药研究的潜在靶点，国内外学术界普遍认为药物选择性作用于D3，不仅有利于患者认知功能改善，且其疗效尤其是避免不良反应方面将较之D2靶点药物更具优势。上述假设不断推动D3与精神分裂症相关病理机制的研究和D3靶点药物研发。
目前筛选多巴胺靶点药物最常用的方法是通过HTRF技术检测化合物作用于体后细胞内cAMP水平的变化，以D1、D2受体为例，D1受体属于Gs偶联的GPCR，这类受体例如包括有DRD1(Homo sapiens(human)、Dop1R1(Drosophila melanogaster(fruit fly)、BmDopR1(silkworm)和BmDopR2(silkworm)等，当这些D1受体被配体激活时，其信号快速向下游传递，并且通过检测细胞内第二信使cAMP的改变可以很容易反应配体的内在活性(如激动剂、部分激动剂以及拮抗剂)；D2受体属于Gi偶联的GPCR，当激动剂作用于D2受体后，细胞内cAMP水平显著降低，以此筛选出对D2受体具有生物学活性的化合物。然而，尽管D3受体与D2受体具有很高的同源性，但是激动剂作用于D3受体却仅能引起很小的cAMP水平改变，从而导致信号难以被准确检测。此外，从一些文献的报道可以看出，尽管D3受体过表达细胞系可以很好地用于进行配体结合实验，但是与其他Gi偶联的GPCR不同，其下游偶联的信号通路变化很难被检测到(如第二信使cAMP的改变)，且尚不清楚引起这种差异的原因(JPET315:1278-1287,2005)。
目前，还有研究者发现D2类受体激动后，尽管细胞内的cAMP水平变化不大，但是却能引起细胞分裂增加，从而通过细胞数目的变化反映化合物的效果，但是这种方法通量不高、不够灵敏且耗时，未能得到广泛的应用。综上所述，目前尚未有一种能检测D3靶点药物活性的方法，因此，这就影响了人们对D3和其他的多巴胺受体的特异性功能的区分，从而使针对D3靶点药物的开发受阻，因此针对D3靶点的药物检测仍是目前新药研发中急需解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中缺乏检测针对多巴胺D3靶点药物生物学活性的方法的缺陷，本发明提供了一种细胞系及利用其来检测靶向多巴胺D3的检测方法。
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
在描述本发明的蛋白质，核苷酸序列和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法，方案，细胞系，载体和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不是限制本发明的范围。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数形式。本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则本发明的实施将采用蛋白质化学和生物化学，分子生物学，微生物学和重组DNA技术的常规技术，它们在本领域技术范围内。
本发明人为了解决上述问题经过认真研究后提供了一种新的细胞系，该细胞系是能稳定表达多巴胺D3受体和CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的CHO-K1细胞，将其作为细胞模型能用来准确高效的检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性。
此外，本发明人基于以上细胞系成功开发出一种多巴胺D3靶点化合物生物学活性的检测方法，利用该细胞系与候选药物接触，测定细胞所表达的荧光素酶水平的变化，计算出候选药物的相对化学发光单位，通过得到候选药物的剂量效应曲线从而计算得到其生物活性数据。
该检测方法的原理如下：通过将该细胞系(即本发明的包括(a)编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸；以及(b)编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸的细胞系)与候选药物接触，只要候选药物是具有多巴胺D3受体激动活性的化合物，与多核苷酸(a)表达的多巴胺D3受体蛋白结合后，将抑制细胞内腺苷酸环化酶活性，使细胞内cAMP水平降低，从而降低蛋白激酶A(PKA)磷酸化水平。当PKA磷酸化水平下降后，相应的，与多核苷酸(b)中具有启动子功能的CRE转录调控元件结合的磷酸化CREB水平也降低，抑制其下游荧光素酶基因的表达，从而降低最终检测体系中的荧光信号水平。因此，最终通过表现出的荧光信号水平的降低来计算得到候选药物的生物活性。
细胞系
本发明第一个方面提供了一种用于检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的细胞系，包括(a)编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸；以及(b)编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸。
术语“多核苷酸”是指DNA或RNA。其中多核苷酸(核酸、基因)为“编码”所需要的蛋白质的多核苷酸(核酸、基因)。此处“编码”是指使所需要的蛋白质在具备其活性的状态下表达；此外，“编码”包含将所需要的蛋白质用连接的结构序列(外显子)编码，或由介导序列(内含子)编码的两者的含义。
作为本发明多核苷酸(a)以可用于表达多巴胺D3受体蛋白的状态包含在细胞中，具体是指将多核苷酸(a)置于细胞适宜的转录调控区内，特别是在适当的启动子控制下的状态，对于合适的启动子本发明对此并没有特别限制，只要它在含有多核苷酸(a)和(b)的细胞中具有启动子活性即可。可以是任意已知的启动子，例如在哺乳动物细胞中，可以使用病毒启动子如CMV启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、UbC启动子等。
由多核苷酸(a)编码的多巴胺D3受体蛋白可以衍生自各种生物，可以是哺乳动物或非哺乳动物，优选哺乳动物，例如大鼠、小鼠、斑马鱼、灵长类动物等；其中更优选人或啮齿类动物的细胞。
对于本发明中(a)编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸序列，其中所述的多巴胺D3受体蛋白可以是具有经修饰的氨基酸序列的蛋白或是具有未经修饰的氨基酸序列的蛋白，前提是只要不损害通过与多巴胺D3受体蛋白结合使细胞内cAMP量减少的功能。这种修饰可以是在多巴胺D3受体蛋白的已知功能结构域或已知功能结构域以外的位点上发生氨基酸被取代、缺失或插入，可以是1～20个，优选为1～5个，更优选为1～3个任意数量的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列。通常编码具有经修饰的氨基酸序列的多巴胺D3受体的DNA以具有与生俱来的碱基序列的DNA为基础，可使用常用的定点诱变、PCR法合成。
多巴胺D2类受体期望是具有完整的腺苷酸环化酶和钙信号传导途径。对于多巴胺D2类受体包括多巴胺D2受体、多巴胺D3受体、多巴胺D4受体，这些受体均具有完整的腺苷酸环化酶信号传导途径，尤其适用于本发明的功能细胞系，即均可作为用于检测多巴胺D2类靶点化合物生物学活性的细胞系使用，其中，优选多巴胺D2类受体选自多巴胺D3受体或多巴胺D4受体。而其中尤其重要的是目前仍然未有任何针对于多巴胺D3靶点的化合物生物学活性检测的细胞系被成功开发。
在一种优选的实施方式中，所述(a)编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸序列为SEQID NO.1。
在一个优选的实施方案中，所述多巴胺D3受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个优选的实施方案中，所述(a)中编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸序列为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。例如，当在SEQ ID NO:1进行一个或多个密码子优化时，经过优化的多核苷酸序列与SEQ ID NO:1将具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
CRE转录调控元件可以控制下游基因的表达，是许多细胞外和细胞内信号的会聚点，可以具有已知的突变，本发明对其来源不做任何限定。
作为荧光素酶，本发明优选通过将CRE转录调控元件可操作地连接到荧光素酶基因上，能使检测过程中发生的转录、翻译以及最终活性等信号易于测量，从而能快速指示。荧光素酶基因可以以融合基因的形式包含在构建体中，例如与包括所需转录调节序列或表现出其他所需特性的基因融合。
以多巴胺D3受体为例，一般认为多巴胺信号转导经由cAMP、蛋白激酶A(PKA)以及cAMP响应元件结合蛋白(CREB)通路来介导。多巴胺结合至多巴胺D3受体抑制胞内腺苷酸环化酶活性，导致cAMP水平降低，cAMP水平降低会使PKA磷酸化水平降低，继而底物CREB的磷酸化水平随之降低，CREB是碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域DNA-结合蛋白大家族中的一个成员。最终经由CRE可操作地连接的荧光素酶基因的转录和表达降低，从而抑制最终检测体系中荧光信号的水平。在这个过程中，CREB通过转换多巴胺信号以调控荧光素酶基因表达最终使本发明的细胞系发挥关键作用。
对于本发明中(b)编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸序列，可以基于已知信息确定。本发明对其来源不做任何限定，可以使用任意市售产品。
在一个优选的实施方案中，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一个优选的实施方案中，所述(b)中，编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸序列为SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。例如，当在SEQ ID NO:2进行一个或多个密码子优化时，经过优化的多核苷酸序列与SEQ ID NO:2将具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
对于本发明的细胞系，常用真核细胞作为宿主细胞，可以是源自原代细胞，或是源自于转化和/或永生化的细胞系，可以是本领域普通技术人员已知的由于前述受体而改变了cAMP水平的任何细胞。
术语“宿主细胞”指的是能够复制载体和/或表达由载体所编码的异源基因的原核或真核细胞。术语“载体”被用来指载体核酸分子，在其中能够插入核苷酸序列以便将其导入能被复制的细胞。核苷酸序列可以是外源的，即意味着其对于载体被导入的细胞来说是外来的或与细胞中的序列同源的但是在宿主细胞核酸的位置通常并没有发现该序列。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、以及人工染色体(例如YACs)。这些载体有些可以购买得到，或是本领域技术人员通过标准的重组技术构建得到。
尤其适合本发明的细胞系优选哺乳动物细胞，更优选人或啮齿类动物的细胞。在这些细胞中从减少背景信号的观点出发进一步优选CHO细胞。此外，考虑到多核苷酸(a)编码的多巴胺D3受体蛋白的功能性表达和高表达，即以获得较高的信号窗口的观点考虑，优选CHO细胞，更优选CHO-K1细胞。
对于本发明的多巴胺D3受体优选采用福司可林(Forskolin，简称FSK)，一种腺苷酸环化酶激动剂，预先激活细胞以刺激腺苷酸环化酶用以产生内源性cAMP进而提高信号窗口，然而通过实验发现激活后的cAMP响应取决于特定细胞或细胞系中存在的腺苷酸环化酶同种型，发明人通过验证发现HEK-293细胞并不适用于本发明，原因可能与其表达腺苷酸环化酶同种型有关。
除了上述的多核苷酸(a)和多核苷酸(b)序列以外，其他的序列亦可包含在本发明细胞系的多核苷酸(a)和/或多核苷酸(b)中，这些序列例如包括Myc标签、GST标签、His标签等，通过将含有这种抗性基因的(a)和/或多核苷酸(b)导入细胞后，有利于筛选纯化和培养细胞。
在一种优选的实施方式中，所述细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C2021240。
细胞系的构建
将多核苷酸(a)和多核苷酸(b)引入宿主细胞中的方法可以是已知的任一种方法，例如包括转染法、磷酸钙法、电穿孔法、粒子珠轰击法、使用病毒的方法等，具体方法的选择一般取决于被转化的细胞类型，以及进行转化所处的具体环境；对于本发明细胞系优选转染法，进一步优选选自电穿孔转染法、脂质体转染法或钙离子转染法中的任一种。在把多核苷酸(a)和多核苷酸(b)导入细胞中之后，一般需要对细胞进行培养，正常培养温度为37℃，培养时间通常可以是为1～24h。
对于导入后的状态本发明对此无任何限制，可以是以质粒的形式存在于细胞中，也可以是直接被整合到基因组中。转入的多核苷酸(a)和多核苷酸(b)可以在同一个质粒上或在不同的质粒上，所述质粒中还包含有编码对抗抗性药物的基因，转染后的细胞通过加入相对应的抗性药物进行筛选。
本发明第二个方面提供了上述的细胞系的构建方法，优选步骤包括：(1)用编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸序列转染宿主细胞以产生转化的宿主细胞，(2)将CRE融合的荧光素酶质粒过表达到该转化的宿主细胞中即得。
上述的“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入到宿主细胞中。
在本发明细胞系的构建方法的步骤(1)中，所得到的转化的宿主细胞可以是通过转染法制备得到，也可以是通过市售得到；例如可市售得到的此类转化的宿主细胞包括但不限于：购买自PerkinElmer的CHO-K1/D3、HEK-293/D3等，优选PerkinElmer的CHO-K1/D3。
在本发明细胞系的构建方法的步骤(2)中，所述CRE融合的荧光素酶质粒可以通过常规方法制备得到，也可以是通过市售得到；例如可市售得到的此类转化的宿主细胞包括但不限于：购买自Promega的CS186804pNL(NlucP/CRE/Hygro)、BPS bioscience的CRE/CREBReporter Kit等，优选Promega的CS186804pNL(NlucP/CRE/Hygro)。
本发明第三个方面提供上述细胞系在检测选自针对多巴胺D3靶点的小分子化合物、单克隆抗体或其中和抗体、Fc融合蛋白之一或其组合中的应用。
对于以上针对多巴胺D3靶点的小分子化合物、多肽、蛋白质、聚糖、核酸、单克隆抗体或其中和抗体、Fc融合蛋白，可以是天然存在的，也可以是人工制造的；可以是有生物学活性的，也可以是无生物学活性的，只要是可用于检验筛选多巴胺D3靶点的候选药物的任一种即可。
作为小分子化合物，例如可列举包括激动剂、拮抗剂、反向激动剂、超级激动剂、正向变构剂、反向变构剂、沉默变构剂、变构配体或类似物等。
本发明还提供了上述细胞系在检测预防和/或治疗哺乳动物与多巴胺D3受体相关的神经精神类疾病药物中的应用。
在一些实施方式中，所述神经精神类疾病为精神分裂症、精神分裂症谱群疾病、急性精神分裂症、慢性精神分裂症、NOS精神分裂症、精神分裂样人格障碍、分裂型人格障碍、妄想性精神障碍、精神病、精神障碍、短时精神障碍、分享性精神障碍、躯体疾病所致精神障碍、药物诱发精神病、心理情感障碍、侵犯性、精神错乱、帕金森精神病、刺激性精神病、图雷特综合症、器官或NOS精神病、癫痫、精神激动、创伤后精神紧张性障碍、行为错乱、神经变性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、运动障碍、亨廷顿病、痴呆、情感障碍、焦虑症、情感性精神病、抑郁症、严重抑郁性障碍、情绪不良、双相性精神障碍、躁狂症、季节性情感性精神病、注意力缺陷障碍、注意力不足过动症、强迫性神经失调、眩晕、癫痫、疼痛、神经性疼痛、神经性疼痛易感状态、炎性疼痛、纤维肌痛、偏头痛、认知损伤、运动障碍、下肢不宁综合症、多发性硬化症、睡眠障碍、睡眠呼吸暂停、嗜眠发作、白天睡眠过多、时差反应、药物的嗜睡副作用、失眠、物质滥用依赖性、成瘾、进食障碍、性功能障碍、高血压、呕吐、Lesche-Nyhane病、Wilson病、自闭症、亨廷顿舞蹈病和经前焦虑中的一种或多种。
检测方法
本发明第四个方面提供了一种多巴胺D3靶点化合物生物学活性的检测方法，步骤包括：(1)制备不同浓度梯度的供试品，将其分别与前述的细胞系接触；(2)测定各细胞系表达的荧光素酶水平变化；(3)计算供试品的生物活性，其中所述供试品为多巴胺D3靶点候选药物溶液。
供试品的生物学活性反映了供试品对多巴胺D3靶点的功能，这里的供试品可以是激动剂或拮抗剂或无活性的任一种待检测的候选药物。
多巴胺D3受体属于Gi偶联的GPCR受体(G蛋白偶联受体)，目前检测GPCR信号的方法主要有两种，一是检测细胞内cAMP的水平，二是检测细胞内钙流的瞬间释放。对于Gi偶联的GPCR受体，常在过表达该GPCR的细胞株中再过表达Gα15蛋白，在细胞内构建类似于Gq的信号通路，通过检测钙流的瞬间释放来检测GPCR是否被激动或者拮抗。
发明人在研究能准确检测多巴胺D3受体激动剂生物活性的细胞系时，也曾尝试过在转染过D3的宿主细胞中过表达Gα15蛋白，通过检测该细胞内钙流来检测候选药物活性，但遗憾的是并未成功；在之后的研究中，发明人通过将CRE融合的荧光素酶质粒过表达到转染过多巴胺D2类受体的宿主细胞中，尤其是构建得到本发明的细胞系，即该细胞系为能稳定表达多巴胺D3受体和CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的CHO-K1细胞时，通过检测细胞内cAMP的水平，实验得到该细胞系具有较高的信号窗口，同时具有较好的稳定性及可重复性，可用于准确检测多巴胺D3受体激动剂的生物活性。
在开始检测前可以对已构建好的本发明的细胞系进行培养，使细胞代数在2～4代之间；随后将P2～P4的细胞种于细胞培养板中，控制细胞数目为5000～20000个/孔，优选10000个/孔。孵育过程中所用的细胞培养板的材质和类型均可依据需要调整，本发明对此不作任何限定。通常可使用标准384孔板，每孔20μL细胞悬液；培养温度为37℃。
在本发明检测方法的步骤(1)中，制备不同浓度梯度的供试品，将其与本发明的细胞系接触；优选供试品为多巴胺D3靶点候选药物溶液，浓度梯度为2～20倍稀释梯度，可以选择3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍等。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(1)中，在供试品与细胞系充分接触后，进一步添加福司可林溶液处理细胞系。这里的充分接触是给与一定时间让候选药物与细胞系受体充分结合，接触时间不宜过短，通常接触时间≥10min，优选10～30min，例如10min、15min、20min、25min等。
福司可林(Forskolin，简称FSK)是腺苷酸环化酶的激活剂，添加福司可林的目的是预先激活以刺激腺苷酸环化酶并产生cAMP，使内源性cAMP水平升高有利于提高信号窗口。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(1)中福司可林溶液的终浓度为0.2～0.6μM；例如0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55等；
优选地，所述福司可林溶液的终浓度为0.3～0.5μM，更优选地，所述福司可林溶液的终浓度为0.4μM。
通过研究发明人发现福司可林溶液的浓度大小会直接影响细胞内cAMP水平进而导致信号窗口发生变化，在福司可林溶液的终浓度为0.3～0.5μM，尤其是优选0.4μM时表现出显著增强的信号窗口。通过实验推测得出：例如靶点是D3受体的细胞，如果福司可林浓度过大，对腺苷酸环化酶的激活作用会超过激动剂对腺苷酸环化酶的抑制作用，显示不出信号窗口。同样，如果福司可林浓度过小，使得细胞内cAMP的水平太低，那化合物的降cAMP作用也无法显现。终浓度是指实验操作结束时的最终浓度。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(2)为用荧光素酶检测试剂盒测定供试组各细胞系表达的荧光素酶水平变化，并与阳性对照组比较；其中所述阳性对照组与供试组的区别在于将供试品多巴胺D3靶点候选药物溶液替换为多巴胺溶液。
在一种优选的实施方式中，所述检测方法还包括设置高对照(High control，简写HC)和低对照(Low control，简写LC)，所述高对照(High control，简写HC)设置为添加Forskolin溶液，低对照(Low control，简写LC)设置为添加福司可林和多巴胺混合溶液。
应当理解的是，所述High control和Low control各组中所添加溶液体积应保持一致，不同浓度溶液常用缓冲溶液配制。
在一些实施方式中，所述High control和Low control各组中福司可林溶液的终浓度可以是任意浓度，优选0.2～0.6μM，更优选0.3～0.5μM，最优选0.4μM。
在一些实施方式中，所述Low control中多巴胺溶液的终浓度为激动效果达100％后的任意浓度，优选≥10nM，更优选10nM～10μM，例如10nM、1μM、2μM、5μM、10μM，从节约试剂角度更优选10nM～1μM。
当测定细胞系的cAMP水平时，可以使用以下四个不同测试条件的组来测试：
第一组为阳性对照组，包含多巴胺和福司可林溶液，作为检验实验有效性的控制品，同时也作为供试组检测结果的对照。第二组为供试组，包含候选药物和福司可林溶液。第一组和第二组依据制备的多巴胺和候选药物溶液的浓度梯度对应设置多个平行实验，依据试验结果拟合得到阳性对照组和供试组的剂量效应曲线从而计算得出其生物活性。其中在第一组和第二组中，多巴胺和候选药物溶液的浓度梯度为2～20倍稀释梯度，通常可以选择3倍、5倍、8倍、10倍等。在第一组和第二组中的福司可林溶液的终浓度为0.2～0.6μM，优选0.3～0.5μM，更优选0.4μM。
第三组和第四组是作为反映信号窗口的常规对照组，同时用以计算候选药物的相对化学发光单位。第三组为High control(HC)，含有福司可林试剂，用来提高内源性cAMP水平。第四组为Low control(LC)，包含福司可林和多巴胺溶液。其中在第三组和第四组中，福司可林溶液的终浓度为0.2～0.6μM，优选0.3～0.5μM，更优选0.4μM；在第四组中的多巴胺的终浓度≥10nM，优选10nM～10μM，更优选10nM～1μM。
本发明第五个方面提供了一种多巴胺D3靶点化合物生物学活性的检测方法，步骤包括：
(1)将共表达多巴胺D3受体和CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的CHO-K1细胞种于细胞培养板中，控制细胞数目为5000～20000个/孔；
(2)分别制备阳性对照品和供试品溶液，设置稀释浓度梯度，其中阳性对照品为多巴胺溶液；
(3)向细胞中加入步骤(3)中配制的多巴胺溶液及供试品溶液，37℃细胞培养箱孵育15～30min后再加入终浓度为0.2～0.6μM的福司可林溶液，将细胞置于37℃细胞培养箱继续孵育3～6h；所述检测过程中的High control设置为添加0.2～0.6μM福司可林溶液，Low control设置为添加0.2～0.6μM福司可林和≥10nM的多巴胺溶液；
(4)用荧光素酶检测试剂盒检测细胞内荧光素酶水平变化，用酶标仪读取相应的化学发光单位，以多巴胺D3靶点候选药物的浓度为横坐标，相对化学发光单位为纵坐标，通过拟合得到候选药物的剂量效应曲线并计算其生物活性。
具体的说，优选多巴胺D3靶点化合物生物学活性的检测方法，步骤包括：
(1)将共表达多巴胺D3受体和CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的CHO-K1细胞种于细胞培养板中，控制细胞数目为5000～20000个/孔，例如10000/孔；
(2)分别制备阳性对照品和供试品溶液，设置稀释浓度梯度，其中阳性对照品为多巴胺溶液；
(3)细胞过夜生长，然后向细胞中加入步骤(3)中配制的多巴胺溶液及供试品溶液，37℃细胞培养箱孵育15min后再加入终浓度为0.4μM的福司可林溶液，将细胞置于37℃细胞培养箱继续孵育4h；所述检测过程中的High control设置为添加0.4μM福司可林溶液，Low control设置为添加0.4μM福司可林和10nM～1μM的多巴胺溶液；
(4)用荧光素酶检测试剂盒检测细胞内荧光素酶水平变化，用酶标仪读取相应的化学发光单位，以多巴胺D3靶点候选药物的浓度为横坐标，相对化学发光单位为纵坐标，通过拟合得到候选药物的剂量效应曲线并计算其生物活性。
上述的相对化学发光单位用Activity％表示，Activity％通过如下公式计算得到：Activity％＝100-(Rg-Rl)/(Rh-Rl)*100，式中Rg为酶标仪所测定的供试组的化学发光单位，Rl为酶标仪所测定的low control(LC)组的化学发光单位，Rh为酶标仪所测定的highcontrol(HC)组的化学发光单位。应当理解的是如果是平行多组试验时，式中Rg、Rl、Rh为各组试验结果的平均值。
数据分析由graphpadprism 8.0软件完成，通过软件将候选药物的相对化学发光单位与浓度进行四参数拟合得到剂量效应曲线，计算得到其生物活性EC50。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的细胞系能被用来快速、准确、高效的针对多巴胺D3靶点治疗药物的生物学活性检测。本发明的检测方法具有专属性好、特异性强、准确度高、操作简单快速、信号窗口高、重复性好等特点。此外本发明检测方法无需复杂的仪器或操作步骤，能够完全满足针对多巴胺D3受体的小分子化合物的生物学活性检测。
生物材料保藏信息
本发明所述细胞系的保藏信息具体如下：
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学；
保藏日期：2021.9.14；
保藏编号：CCTCC NO:C2021240；
分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/D3/Nlucp/CRE。
附图说明
图1为DA-D3R化合物的剂量效应曲线图；
图2为7-OH-DPAT-D3R化合物的剂量效应曲线图。
具体实施方式
下面通过实验例对本发明进行具体的描述，以下实验例只能用于本发明做进一步说明，并不能理解为本发明保护的限制，该领域的专业技术人员根据上述发明的内容作出的非本质的改正和调整，仍属于本发明的保护的范围。
如无其他说明实验例中的实验试剂、耗材、仪器均如下所述：
1)实验试剂
Figure BDA0003447464530000131
Figure BDA0003447464530000141
2)实验耗材
名称 批号 厂家
ProxiPlate-384Plus 8310-19411 PerkinELmer
3)实验仪器
名称 型号 厂家
细胞计数仪 BioTech Countstar Countstar
Milli-Q IQ 7000 Millipore
离心机 TDZ5-WS Cence
Envision 2105 PerkinElmer
4)实验细胞/质粒
细胞/质粒名称 批号 厂家
CHO-K1/D3 1988471 PerkinElmer
Nlucp/CRE/Hygro CS186804 Promega
实验例1
实验例1设计为对HEK293/D3细胞的功能验证。
1.1实验目的
构建HEK293/D3细胞，并对其激活后的cAMP响应进行验证。
1.2冻存细胞信息
细胞名称 代数 细胞数量(M)
HEK293/D3 P1 3.0x10<sup>6</sup>
1.3实验步骤
一、构建HEK293/D3细胞
(1)将HEK293细胞用胰酶消化后重新种板至6孔板中，每孔1x105个细胞，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中生长过夜；
(2)从液氮中取出一管D3受体慢病毒，置于冰上解冻，待解冻后1000转瞬离使粘附在管壁上的溶液沉至管底；HEK293细胞的适宜感染MOI为5，根据细胞的铺板细胞数目以及慢病毒的滴度计算所需的慢病毒体积；
(3)从细胞培养箱中取出HEK293细胞，为其更换新鲜的生长培养基，然后向培养基中加入一定体积的D3受体慢病毒，使MOI为5；轻轻摇晃6孔板，使慢病毒分布均匀，随后将6孔板置于细胞培养箱中继续生长过夜；第二天为细胞更换新鲜的生长培养基，随后将细胞置于培养箱中细胞生长24小时；
(4)从培养箱中取出HEK293细胞，镜下观察细胞状态；使用含筛选抗生素的生长培养基进行筛选(此处的筛选抗生素为嘌呤霉素，浓度为0.6μg/ml)；随后每天更换含抗生素的筛选培养，直至未感染D3受体慢病毒的细胞全部被杀死，剩余的细胞即为感染了D3受体慢病毒的细胞(即HEK293/D3 pool细胞)；将HEK293/D3 pool细胞扩大培养，然后进行功能验证。
二、HEK293/D3细胞的功能效果验证
(1)实验缓冲液配置：用ddH2O将5×stimulation buffer(cAMP Gi Dynamic kit)稀释成1×stimulation buffer，并加入终浓度为0.5mM的IBMX，混匀备用；
(2)取冻存的HEK293/D3细胞在37℃水浴锅中解冻，将细胞悬液加到含10mL HBSS缓冲液的离心管中，1000rpm离心5分钟；
(3)弃去上清，沉淀用适量的实验缓冲液重悬，取20μL用细胞计数仪计数；
(4)取适量的HEK293/D3细胞悬液稀释到最终细胞量为1000个/孔；
(5)共设置4个实验组，前两组分别添加stimulation buffer，后两组分别添加等体积的终浓度为10μM Dopamine；1000rpm离心1分钟，封板孵育15分钟，每组平行8次；
(6)Forskolin共设置2个不同浓度各自转移到实验板，终浓度依次为0.5和0.25μM；1000rpm离心1分钟；综上所述4个实验组中前两组分别添加有前述不同浓度的Forskolin，后两组分别添加有不同浓度的Forskolin和10μM Dopamine；
(7)封板室温孵育45分钟；
(8)加5μL的cAMP-d2溶液(原液按照1：20用裂解缓冲液稀释)到实验板中，1000rpm离心1分钟；
(9)然后再加5μL的Anti-cAMP-Cryptate溶液(原液按照1：20用裂解缓冲液稀释)到实验板中，1000rpm离心1分钟；
(10)实验板置于室温避光孵育1小时；
(11)使用Envision酶标仪进行读板得到HTRF signal；激发光320nm，发射光620nm和665nm。
1.4结果与分析
表1 HEK293/D3细胞在多巴胺激动下的cAMP响应
Figure BDA0003447464530000161
注：表格中FSK表示Forskolin，DA表示Dopamine，HTRF signal反映cAMP浓度，HTRFsignal值越大表明cAMP浓度越低，反之则越高；将各试验组的HTRF signal读值与标准曲线进行换算后可得到表格中的cAMP浓度。
从结果来看，HEK293/D3细胞在Forskolin刺激下产生了较高浓度的cAMP，而同时加入Forskolin和Dopamine反而提高了cAMP浓度，这与D3受体的功能相反，提示HEK-293细胞不具有多巴胺D2类受体蛋白正常的cAMP响应，证明HEK293/D3细胞不适用。
实验例2
实验例2设计为对CHO-K1/D3细胞的功能效果验证。
2.1实验目的
使用冻存的CHO-K1/D3细胞对其激活后的cAMP响应进行验证。
2.2冻存细胞信息
细胞名称 代数 细胞数量(M)
CHO-K1/D3 P4 3.0x10<sup>6</sup>
2.3实验步骤
(1)实验缓冲液配置：用ddH2O将5×stimulation buffer稀释成1×stimulationbuffer，并加入终浓度为0.5mM的IBMX，混匀备用；
(2)取冻存的CHO-K1/D3细胞在37℃水浴锅中解冻，将细胞悬液加到含10mL HBSS缓冲液的离心管中，1000rpm离心5分钟；
(3)弃去上清，沉淀用适量的实验缓冲液重悬，取20μL用细胞计数仪计数；
(4)取适量的CHO-K1/D3细胞悬液稀释到最终细胞量为10000个/孔；
(5)共设置6个实验组，前三组分别添加stimulation buffer，后三组分别添加等体积的终浓度为10μM Dopamine；1000rpm离心1分钟，封板孵育15分钟，每组平行3次；
(6)Forskolin共设置3个不同浓度各自转移到实验板，终浓度依次为0.5、0.25和25μM；1000rpm离心1分钟；综上所述6个实验组中前三组分别添加有前述不同浓度的Forskolin，后三组分别添加有不同浓度的Forskolin和10μMDopamine；
(7)封板室温孵育45分钟；
(8)加5μL的cAMP-d2溶液(原液按照1：20用裂解缓冲液稀释)到实验板中，1000rpm离心1分钟；
(9)然后再加5μL的Anti-cAMP-Cryptate溶液(原液按照1：20用裂解缓冲液稀释)到实验板中，1000rpm离心1分钟；
(10)实验板置于室温避光孵育1小时；
(11)使用Envision酶标仪进行读板得到HTRF signal；激发光320nm，发射光620nm和665nm。
2.4结果与分析
表2 CHO-K1/D3细胞在多巴胺激动下的cAMP响应
Figure BDA0003447464530000181
注：表格中FSK表示Forskolin，DA表示Dopamine，HTRF signal反映cAMP浓度，HTRFsignal值越大表明cAMP浓度越低，反之则越高。
从结果来看，CHO-K1/D3细胞在Forskolin刺激下产生了较高浓度的cAMP，而同时加入Forskolin和Dopamine并没有抑制cAMP的产生，说明CHO-K1/D3细胞无法获得或只能获得非常弱的D3受体蛋白的cAMP响应，这将导致无法准确检测，证明CHO-K1/D3细胞不适用。
实验例3
实验例3设计为对CHO-K1/AC5/D3细胞的功能效果验证。
3.1实验目的
使用重组的D3质粒和AC5质粒转染CHO-K1细胞，构建稳定表达D3受体的细胞株，并对其激活后的cAMP响应进行验证。
3.2细胞信息
重组质粒名称 靶标受体基因 筛选抗性 供应商
ADCY5_OHu11265C_pcDNA3.1/Hygro(+) ADCY5 Hygromycin 金瑞斯
DRD3_pcDNA3.1(+)-C-6His-G418 NCBI Reference Sequence:NM_000796.6 Neomycin/G418 金瑞斯
3.3实验步骤
一、构建CHO-K1/AC5/D3细胞
(1)细胞传代：将CHO-K1细胞从液氮罐中取1支，在37℃水浴锅中迅速解冻，使用预热的培养基重悬后1000rpm离心5分钟，去除上清，细胞沉淀用适量培养基重悬放在15cm培养皿中培养进行传代操作；
(2)Lipo3000转染：使用培养的细胞进行铺板(6孔板)，CHO-K1细胞按照4x105个/孔铺板，每孔2mL；取3.75μL Lipo3000加到125μL Opti-MEM培养基中，涡旋混匀(2-3s)；按照下面表格中的比例用125μL Opti-MEM培养基稀释质粒混匀后，再加入5μL P3000TM试剂并充分混匀；
Figure BDA0003447464530000191
将稀释好的质粒加到稀释的Lipo3000中并轻轻混匀，室温静置15分钟，将转染试剂-质粒混合物缓慢滴加到对应孔中并轻轻摇匀，置于培养箱中培养过夜；
(3)抗性筛选：使用0.8mg/mL G418+150ug/mL Hygromycin B的培养基筛选；得到pool细胞，进行传代并铺6块96孔板(质粒量AC5：D3＝1:1和1:2各3块板)挑取单克隆细胞。
二、CHO-K1/AC5/D3细胞的功能效果验证
(1)化合物准备：参考化合物Dopamine稀释成2mM备用；
(2)实验缓冲液配置：用ddH2O将5×stimulation buffer稀释成1×stimulationbuffer，并加入终浓度为0.5mM的IBMX，混匀备用；
(3)使用胰酶消化细胞，待细胞完全消化后使用培养基终止，取部分细胞悬液加到含10mL HBSS缓冲液的离心管中，1000rpm离心5分钟；
(4)弃去上清，沉淀用适量的stimulation buffer重悬，取20μL用细胞计数仪计数；
(5)取适量的细胞悬液稀释到最终每孔3000个细胞；
(6)共设置20个实验组，前十组分别添加stimulation buffer，后十组分别添加等体积的终浓度为10μM Dopamine；1000rpm离心1分钟，封板孵育15分钟，每组平行3次；
(7)Forskolin共设置10个不同浓度各自转移到实验板，终浓度依次为0、0.065、0.25、0.5、1、2.5、5、12.5、25和500μM；1000rpm离心1分钟；综上所述20个实验组中前十组分别添加有前述不同浓度的Forskolin，后十组分别添加有不同浓度的Forskolin和10μMDopamine；
(8)加5μL的cAMP-d2溶液(原液按照1：20用裂解缓冲液稀释)到实验板中，1000rpm离心1分钟；
(9)然后再加5μL的Anti-cAMP-Cryptate溶液(原液按照1：20用裂解缓冲液稀释)到实验板中，1000rpm离心1分钟；
(10)实验板置于室温孵育1小时；
(11)使用Envision酶标仪进行读板得到HTRF signal；激发光320nm，发射光620nm和665nm。
3.4结果与分析
表3 CHO-K1/AC5/D3(1:1,3000cell/well)细胞在多巴胺激动下的cAMP响应
Figure BDA0003447464530000201
表4 CHO-K1/AC5/D3(1:2,3000cell/well)细胞在多巴胺激动下的cAMP响应
Figure BDA0003447464530000202
注：表格中FSK表示Forskolin，DA表示Dopamine，HTRF signal反映cAMP浓度，HTRFsignal值越大则表示cAMP浓度越低，反之则越高；Assay Window表示信号窗口，通过如下计算公式得到：Assay Window＝Hl/Hh，式中Hl为酶标仪所测定的low control(LC)的HTRFsignal平均值，Hh为酶标仪所测定的high control(HC)的HTRF signal平均值。
从结果来看，CHO-K1/AC5/D3细胞在Forskolin刺激下产生了较高浓度的cAMP，而同时加入Forskolin和Dopamine并没有显著抑制cAMP的产生，Assay Window结果均在1左右，说明CHO-K1/AC5/D3细胞无法获得或只能获得非常弱的D3受体蛋白的cAMP响应，这将导致无法准确检测，证明CHO-K1/AC5/D3细胞不适用。
实验例4
实验例4设计为对CHO-K1/D3/Gα15稳转株细胞的功能效果验证。
4.1实验目的
使用Gα15慢病毒感染CHO-K1/D3细胞，构建稳定表达D3/Gα15的细胞，并对其激活后的cAMP响应进行验证。
4.2细胞信息
重组质粒名称 靶标受体基因 筛选抗性 供应商
pLVX-GNA15-hygro Gα15 潮霉素B 金瑞斯
4.3实验步骤
一、构建CHO-K1/D3/Gα15稳转株细胞
(1)细胞铺板：从培养箱中取出CHO-K1/D3细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；使用吸液泵吸去培养基，贴壁缓慢加入5mL PBS，轻轻摇匀；吸去PBS，加入1mL 0.05％胰酶，37℃孵育2min；在显微镜下观察细胞形态，当细胞全部变圆后即消化完成。加入5mL生长培养基终止消化，用移液器轻轻吹散细胞，细胞悬液转移到15mL离心管中；取出20μL细胞悬液在细胞计数仪上计数；按照5×105细胞/孔进行铺板，每孔2mL培养基，轻轻摇匀；室温放置30～60分钟后置于5％CO2、37℃的培养箱培养过夜；
(2)慢病毒感染：从-80℃冰箱中取出100μL病毒，置于冰上解冻。准备足量的感染培养基(含8μg/ml polybrene的培养基，不含抗生素)；待病毒解冻后，750rpm离心20～30s。按滴度加入不同体积的病毒至感染培养基，使MOI(感染复数)分别为5，10，20，终体积为1.5毫升，混匀；使用吸液泵吸去培养基，贴壁缓慢加入混匀的病毒，空白对照孔加入等体积的感染培养基，轻轻摇匀；置于5％CO2、37℃的培养箱继续培养24小时(根据细胞状态决定是否更换培养基)；
(3)细胞传代：从培养箱中取出细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，显微镜观察细胞生长情况，显示各组细胞密度达到80％以上，因此进行细胞传代；使用吸液泵吸去培养基，然后向各孔加入2毫升预热PBS，轻轻漂洗后弃去PBS，再向各孔计入0.5毫升0.25％胰酶，37摄氏度消化3分钟；显微镜下观察消化程度，当细胞均变圆漂浮后加入2毫升含抗生素筛选培养基终止消化；然后将细胞消化液传至10cm培养皿中，在皿盖做好标记，然后添加含400ug/ml G418，100g/ml潮霉素B的筛选培养基进行阳性细胞筛选；将细胞置于5％CO2、37℃的培养箱继续培养；
(4)抗性筛选：从培养箱中取出细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；使用吸液泵吸去感染培养基，然后加入筛选培养基继续筛选阳性细胞；将细胞继续置于5％CO2、37℃的培养箱培养24小时，重复多次筛选挑取CHO-K1/D3/Gα15稳转株pool细胞。
二、CHO-K1/D3/Gα15稳转株细胞的功能效果验证
(1)细胞铺板：从培养箱中取出细胞，去除培养基后加入适量PBS润洗细胞；去除PBS后加入适量的胰酶消化细胞；在显微镜下观察，待细胞完全分离后加入适量的培养基终止消化，轻轻吹散细胞，细胞悬液转移到50mL离心管中，1000rpm离心5分钟；弃去上清，加入适量生长培养基重悬(不含筛选抗生素的F12+10％FBS)，轻轻吹散；取出20μL使用细胞计数仪进行计数；细胞稀释到最终每孔细胞数量为20000个；将细胞板置于5％CO2、37℃的培养箱培养16-24小时；
(2)检测试剂准备：
250mM的probenecid溶液配制：取1mL的实验缓冲液加入到含有77mg粉末的管中，涡旋振荡溶解；
2×荧光探针溶液配制：取1瓶荧光探针干粉平衡至室温，加入10mL的实验缓冲液和200μL的250mM probenecid溶液，涡旋后静置5分钟确保完全溶解，然后再涡旋；
(3)化合物准备：配置5×浓度Dopamine(50μM)，使最高点起始浓度为10μM，将化合物加在化合物板中，每孔30μL；DMSO浓度不高于3％；
(4)细胞准备：从培养箱中取出细胞，加入20μL配制好的2×荧光探针溶液，37℃孵育50分钟然后室温平衡10分钟；
(5)信号测试：将细胞板和化合物板放置到仪器内，运行读板的程序；从化合物板中转移10μL到细胞板中，并读取荧光信号。
4.4结果与分析
本次实验发现MOI为5、10、20的3个CHO-K1/D3/Gα15稳转株pool细胞在多巴胺刺激下并没有释放钙流，证明CHO-K1/D3/Gα15细胞不适用。
实验例5
实验例5设计为对CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞的功能效果验证。
5.1实验目的
构建稳定表达Nlucp/CRE的CHO-K1/D3细胞系，并对其激活后的cAMP响应进行验证。
5.2细胞信息
细胞名称 生长培养基 代数
CHO-K1/D3 F12,400ug/ml G418 P2
5.3实验步骤
一、构建CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞
(1)细胞铺板：从培养箱中取出细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；使用吸液泵吸去培养基，贴壁缓慢加入5mL PBS，轻轻摇匀；吸去PBS，加入1mL 0.05％胰酶，37℃孵育3min；在显微镜下观察细胞形态，当细胞全部变圆后即消化完成。加入5mL生长培养基终止消化，用移液器轻轻吹散细胞，细胞悬液转移到15mL离心管中；取出20μL细胞悬液在细胞计数仪上计数。按照1×105细胞/孔进行铺板，每孔1mL培养基，轻轻摇匀；室温放置30～60分钟后置于5％CO2、37℃的培养箱培养过夜；
(2)质粒转染：从培养箱中取出细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；更换新鲜的生长培养基，每孔700μL；使用Lipo3000转染试剂配制转染体系，如下表：
Figure BDA0003447464530000231
Figure BDA0003447464530000241
转染试剂孵育完成后，将其加至指定的细胞孔中，在板盖做好标记；将细胞继续置于5％CO2、37℃的培养箱培养过夜；
(3)抗性筛选：使用含F12+10％FBS+200ug/ml HygroB+400ug/ml G418的培养基筛选；得到pool细胞，将其用胰酶消化后传代至10cm培养皿中继续培养，用于功能验证。
二、CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞的功能效果验证
(1)细胞铺板：从培养箱中取出细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；将细胞用胰酶消化后计数，使用不含抗生素的生长培养基将细胞稀释至10000cell/well，将细胞板750转/min瞬离后继续置于5％CO2、37℃的培养箱培养过夜；
(2)使用Tecan向细胞板中分别添加终浓度5、0.5、0.05μM的Dopamine溶液，随后将细胞板在1000转下离心1分钟，待其与细胞37℃孵育15～30分钟后，在细胞板中继续添加预先设置的0.5μM的forskolin，设置为Low control(LC)；High control(HC)处理步骤与Lowcontrol的不同之处在于未添加Dopamine溶液，其余均和同Low control(LC)一致；
(3)将细胞板在1000转/min下瞬离后继续置于5％CO2、37℃继续孵育4小时，然后室温平衡细胞板10～15分钟，用荧光素酶检测试剂盒(Promega，货号：N1110)检测细胞内荧光素酶水平变化，酶标仪读取相应的化学发光单位。
5.4结果与分析
表5 CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞在多巴胺激动下的cAMP响应
Figure BDA0003447464530000242
注：表格中FSK表示Forskolin，DA表示Dopamine；Assay Window表示信号窗口，通过如下计算公式得到：Assay Window＝Rh/Rl，Inhibition通过如下计算公式得到：Inhibition＝(Rh-Rl)/Rh*100，式中Rh为酶标仪所测定的high control(HC)的化学发光单位，Rl为酶标仪所测定的lowcontrol(LC)的化学发光单位；Inhibition数值结果表示表示加入一定浓度的DA后，LC值相比于HC降低的比例。
从结果来看，本次试验成功构建了CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞，且实验得到该细胞信号窗口值接近2倍(未减去背景值计算得到)，提示CHO-K1/D3/Nlucp/CRE具有多巴胺D2类受体蛋白正常的cAMP响应，说明该细胞可用于检测多巴胺D3靶点化合物。
实验例6
实验例6设计为对CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞的检测方法优化实验。
6.1实验目的
使用冻存的CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞对其检测方法中采用的Forskolin浓度进行优化。
6.2细胞信息
Figure BDA0003447464530000251
6.3实验步骤
(1)细胞铺板：从培养箱中取出CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；将细胞用胰酶消化后计数，使用不含抗生素的生长培养基将细胞稀释至0.5x106个/ml，然后按每孔20μL的体积将细胞种至384顶读板中(即10000cell/well)，将细胞板750转/min瞬离后继续置于5％CO2、37℃的培养箱培养过夜；
(2)使用Tecan向细胞板中添加1μM的Dopamine溶液，随后将细胞板在1000转下离心1分钟，待其与细胞37℃孵育15～30分钟后，在细胞板中继续添加预先设置的不同浓度的forskolin，浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μM，设置为Low control(LC)；High control(HC)处理步骤与Low control的不同之处在于未添加Dopamine溶液，其余均和同Lowcontrol(LC)一致；
(3)将细胞板在1000转下/min瞬离后继续置于5％CO2、37℃继续孵育4小时，然后室温平衡细胞板10～15分钟，用荧光素酶检测试剂盒(Promega，货号：N1110)检测细胞内荧光素酶水平变化，酶标仪读取相应的化学发光单位。
6.4结果与分析
表6 CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞在不同浓度Forskolin中的cAMP响应
Figure BDA0003447464530000261
注：表格中FSK表示Forskolin，DA表示Dopamine；Assay Window表示信号窗口，通过如下计算公式得到：AssayWindow＝Rh/Rl，式中Rh为酶标仪所测定的high control(HC)的化学发光单位，Rl为酶标仪所测定的low control(LC)的化学发光单位。
从结果来看，参照实验例5Forskolin浓度为0.5μM时，信号窗口不到2倍，本实验降低Forskolin浓度后，结果显示在Forskolin为0.4μM和0.3μM FSK浓度时，信号窗口接近3倍左右(未减去背景值计算得到)，说明Forskolin为0.4μM时能获得最佳的信号窗口。
实验例7
实验例7设计为对CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞的检测方法的准确度检验实验。
7.1实验目的
使用冻存的CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞对多巴胺D3靶点化合物进行生物学活性评价，即检测DA-D3R和7-OH-DPAT-D3R的对D3受体的激动活性，评价该方法的可行性和准确性。
7.2细胞信息
Figure BDA0003447464530000262
7.3实验步骤
(1)细胞铺板：从培养箱中取出细胞，用75％酒精擦拭培养皿表面，放于生物安全柜中；将细胞用胰酶消化后计数，使用不含抗生素的生长培养基将细胞稀释至0.5x106个/ml，然后按每孔20微升的体积将细胞种至384顶读板中(即10000cell/well)，将细胞板750转/min瞬离后继续置于5％CO2、37℃的培养箱培养过夜；
(2)分别制备8个不同浓度的DA-D3R、7-OH-DPAT-D3R溶液，设置稀释浓度梯度；
(3)使用Tecan向细胞板中添加预先设置的不同浓度的DA和7-OH-DPAT溶液，每种溶液均为10nM起始稀释8个浓度点，随后将细胞板在1000转下离心1分钟，待DA和7-OH-DPAT化合物与细胞37℃孵育15分钟后，在细胞板中继续添加终浓度为0.4μM的forskolin；按照实验例5或6的操作同时设立High control和Low control组，其中High control组仅添加终浓度为0.4μM的forskolin溶液，Low control组添加0.4μM的forskolin和10nM的DA。
(4)将细胞板750转/min瞬离后继续置于5％CO2、37℃继续孵育4小时，然后室温平衡10～15分钟，用荧光素酶检测试剂盒(Promega，货号：N1110)检测细胞内荧光素酶水平变化，酶标仪读取相应的化学发光单位，以DA、7-OH-DPAT的浓度为横坐标，相对化学发光单位为纵坐标，通过拟合得到候选药物的剂量效应曲线并计算其生物活性EC50。
7.4结果与分析
本次试验拟合得到的DA-D3R、7-OH-DPAT-D3R剂量效应曲线分别见图1、图2；表7为针对多巴胺D3靶点药物生物活性检测方法的准确度评价结果，Activity％表示相对化学发光单位，Activity％通过如下公式计算得到：Activity％＝100-(Rg-Rl)/(Rh-Rl)*100，式中Rg为酶标仪所测定的供试组的化学发光单位，Rl为酶标仪所测定的low control(LC)的化学发光单位，Rh为酶标仪所测定的high control(HC)的化学发光单位。数据分析由graphpadprism 8.0软件完成，以DA-D3R、7-OH-DPAT-D3R的浓度为横坐标，相对化学发光单位为纵坐标，将这两种候选药物的相对化学发光单位与浓度进行四参数拟合得到剂量效应曲线(见图1和2)，软件分析计算得到DA-D3R、7-OH-DPAT-D3R的生物活性EC50。
表7针对多巴胺D3靶点药物生物活性检测方法的准确度评价结果
Figure BDA0003447464530000271
Figure BDA0003447464530000281
从上表中的结果和图1～2可以看出DA-D3R、7-OH-DPAT-D3R的EC50值均与文献报道一致，表明CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞系具有较高准确性，能满足对多巴胺D3靶点化合物的检测要求。
实验例8
实验例8设计为对CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞的检测方法的重复性检验实验。
8.1实验目的
使用冻存的CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞对多巴胺D3靶点化合物生物活性进行检测，并评价该方法的重复性。
8.2细胞信息
Figure BDA0003447464530000282
8.3实验步骤
对多巴胺激动剂采用与实验例7相同的实验步骤分别在不同时间段重复操作并计算多巴胺激动剂的EC50。
8.4结果与分析
表8针对多巴胺D3靶点药物生物活性检测方法的重复性评价结果
实验时间 DA-D3R EC50值 Assay Window(均减去背景值计算)
20210305 1.281nM 5.36
20210331 2.342nM 4.12
20210428 1.582nM 4.36
20210609 1.380nM 4.29
注：表格中Assay Window表示信号窗口，通过如下计算公式得到：Assay Window＝Rh/Rl，式中Rh为酶标仪所测定的high control(HC)的化学发光单位，Rl为酶标仪所测定的low control(LC)的化学发光单位，其中化学发光单位均为减去背景值后得到。
从结果来看，经过多次检测，阳性化合物多巴胺(DA)的EC50值一致性很好，检测窗口也稳定在4～5倍，表明该CHO-K1/D3/Nlucp/CRE细胞功能稳定，可重复性较好，说明该细胞可用于准确快速检测多巴胺D3靶点候选药物。
以上所述仅是本发明的实验例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实验例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实验例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 上海枢境生物科技有限公司
江苏恩华药业股份有限公司
<120> 用于检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的细胞系和方法
<130> 20211222
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1202
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcatctc tgagccagct gagtggccac ctgaactaca cctgtggggc agagaactcc 60
acaggtgcca gccaggcccg cccacatgcc tactatgccc tctcctactg cgcgctcatc 120
ctggccatcg tcttcggcaa tggcctggtg tgcatggctg tgctgaagga gcgggccctg 180
cagactacca ccaactactt agtagtgagc ctggctgtgg cagacttgct ggtggccacc 240
ttggtgatgc cctgggtggt atacctggag gtgacaggtg gagtctggaa tttcagccgc 300
atttgctgtg atgtttttgt caccctggat gtcatgatgt gtacagccag catccttaat 360
ctctgtgcca tcagcataga caggtacact gcagtggtca tgcccgttca ctaccagcat 420
ggcacgggac agagctcctg tcggcgcgtg gccctcatga tcacggccgt ctgggtactg 480
gcctttgctg tgtcctgccc tcttctgttt ggctttaata ccacagggga ccccactgtc 540
tgctccatct ccaaccctga ttttgtcatc tactcttcag tggtgtcctt ctacctgccc 600
tttggagtga ctgtccttgt ctatgccaga atctatgtgg tgctgaaaca aaggagacgg 660
aaaaggatcc tcactcgaca gaacagtcag tgcaacagtg tcaggcctgg cttcccccag 720
caaaccctct ctcctgaccc ggcacatctg gagctgaagc gttactacag catctgccag 780
gacactgcct tgggtggacc aggcttccaa gaaagaggag gagagttgaa aagagaggag 840
aagactcgga attccctgag tcccaccata gcgcccaagc tcagcttaga agttcgaaaa 900
ctcagcaatg gcagattatc gacatctttg aagctggggc ccctgcaacc tcggggagtg 960
ccacttcggg agaagaaggc aacccaaatg gtggccattg tgcttggggc cttcattgtc 1020
tgctggctgc ccttcttctt gacccatgtt ctcaataccc actgccagac atgccacgtg 1080
tccccagagc tttacagtgc cacgacatgg ctgggctacg tgaatagcgc cctcaaccct 1140
gtgatctata ccaccttcaa tatcgagttc cggaaagcct tcctcaagat cctgtcttgc 1200
tg 1202
<210> 2
<211> 4947
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>

Claims (11)

1.一种用于检测多巴胺D3靶点化合物生物学活性的细胞系，其特征在于，包括(a)编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸；以及(b)编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为哺乳动物细胞，优选为CHO细胞；更优选为CHO-K1细胞。
3.如权利要求2所述的细胞系，其特征在于，所述多巴胺D3受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述(a)中，编码多巴胺D3受体蛋白的多核苷酸的序列为SEQ ID NO:1；和/或，所述(b)中，编码由CRE转录调控元件控制表达的荧光素酶的多核苷酸的序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1～3中任一项所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C2021240。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的细胞系在检测选自针对多巴胺D3靶点的小分子化合物、单克隆抗体或其中和抗体、Fc融合蛋白之一或其组合中的应用。
6.一种如权利要求1～4中任一项所述的细胞系在检测预防和/或治疗哺乳动物与多巴胺D3受体相关的神经精神类疾病药物中的应用。
7.一种多巴胺D3靶点化合物生物学活性的检测方法，其特征在于，步骤包括：(1)制备不同浓度梯度的供试品，将其分别与权利要求1～4中任一项所述的细胞系接触；(2)测定各细胞系表达的荧光素酶水平变化；(3)计算供试品的生物活性，其中所述供试品为多巴胺D3靶点候选药物溶液。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在供试品与细胞系充分接触后，进一步添加福司可林溶液处理细胞系。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述福司可林溶液的终浓度为0.2～0.6μM；
优选地，所述福司可林溶液的终浓度为0.3～0.5μM；更优选地，所述福司可林溶液的终浓度为0.4μM。
10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)为用荧光素酶检测试剂盒测定供试组各细胞系表达的荧光素酶水平变化，并与阳性对照组比较；其中所述阳性对照组与供试组的区别在于将供试品多巴胺D3靶点候选药物溶液替换为多巴胺溶液；
优选地，还包括设置高对照和低对照，所述高对照设置为添加福司可林溶液，低对照设置为添加福司可林和多巴胺混合溶液；
更优选地，所述细胞系中的细胞数目为5000～20000个/孔，优选10000个/孔。
11.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述供试品与所述细胞系接触后，在37℃培养箱孵育15～30min后加入福司可林溶液，置于37℃细胞培养箱继续孵育3～6h；和/或，所述检测过程中的高对照设置为添加终浓度为0.2～0.6μM，优选0.3～0.5μM，更优选0.4μM福司可林溶液；和/或，所述检测过程中的低对照设置为添加终浓度为0.2～0.6μM，优选0.3～0.5μM，更优选0.4μM福司可林溶液和≥10nM、优选10nM～10μM，更优选10nM～1μM的多巴胺溶液。
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