TW380162B - Process to screen substances with modulating effect on a receptor dependent cellular signal transduction pathway - Google Patents
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Description
第8 1 1 0 9 5 2 7號專利申請荼 中々說昍書修TF.頁（84年9月A)7 B7 五、發明説明（
之保留序列的 TGACGTCA相同 素含有非常類 致序列不同處 1 9 8 8 )。這種 佛波醇酯來活 a 1 . , 1 9 8 7 a 和 蛋白質-蛋白 殊基因上的協 因為訊號傳 徑之間有所諝 脂酶C -訊號傳 應物：系統、也 C 〇 r s [ e t a i . c A Μ P來調節。此序列與迴文的八聚體 或類似（.Μ ο n t: m i n y e t a i , 1 9 9 0 _) 。T R E -要 似的七聚體主題TG AGTCA ，它和CRE-要素一 僅在單獨一個核有Γ酸上（D e u t s c h e t a 1 .， 類似的主題•在大多數由 因中已被確認（A n g e 1 e t: b ; L e e e t a 1 . , 1 9 8 7 .)。周圍的 D M A 序列或 互作甩，症1决定了在特 T R E -主題，或非常 化其轉錄作用的基 濟 .郎 中 央. 準 局 員 工 消 費 合 社 印 製 合訊號 的重覆 訊號傳 如：一 互相作 K·受到 互作用 ，不能 需要 病理學 而言， ，或確 遞途徑 個受體 用，K 影響。 的瓦解 正確地 那些可 状況持 質與其他因子的交 調現象。 遞途徑網的複雜性 的 '' 漏話現象〃， 遞途徑。^'漏話〃 引起其他糸統之影 ，1 9 9 0 ； Houslay， 生理學上所利用的 保各種訊號傳途徑 的各種階段，特別 或受體次單元可與 致於c A Μ P -再加上 ，所Κ可能在訊號傳遞途 例如：腺苷酸環化酶及磷 這個字眼表示影響一個效 響的現象（53350116-19 9 1)。就整合或交互结 漏話現象是為了產生訊號 的聯络。漏話可以發生在 _是在G -蛋白質的階段。例 一個以上的G -蛋白質變體 I P 3 / D A G -階段，兩者鄯可 在細胞中病理學上改變的可能原因為這些交 ，例如：若一特定的受體Μ生埋學上的觀點 與一效應物糸統交互作用。 能發現處理病理學狀況之藥物的分析，這類 別是針對某些受體或受體次單元，而更進一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 c請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 、νδ 線 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（丨) 發明銳明 本發明係關於在人類或動物细胞中，決定物質在受髏依 賴訊號傳遞途徑上之調節作用的方法。 通常為了發現藥理學上之活性物質而嘗試的傳统試驗中 ，是在於發現受試物質在何種程度能夠取代结合於受體的 (己標示）配體（放射性配體試驗）。這類的試驗僅能夠 確認那些會影響已知配體受體结合位置之结合的物質。因 此，這些試驗只涵蓋了該物質的结合，但未包含细胞的功 能性反應，並因此無法辨別結合的物質是否具有競爭或拮 抗的活性。就放射性配體試驗而言，需要相對上大量的受 體，並經常使用從動物姐織分離出、含有受體的膜片段。 這些組織可由含有不同_或異源之受體的數種型式之细胞所 姐成。不論諸如受酶質之類異-源性組合物具有的深遠意 -· _ 義或是一在為得它們對人類专藥理學效用而審査之藥物的 案例中一在人類與動物之間的種別差異，Μ及在對人類受 體和對動物受體之配體结合性質上所造成的差異，可能引 起在說明該结果上的問題。 許多穿透膜訊號傳遞糸统包括下列的膜-结合姐成： a)细胞表面受體；b)鳥嘌呤核苷酸结合的且由GTP-切開的 調節蛋白質，它KG -蛋白質而為人所知，並可被連結在受 體和它的效應物兩者之上；<0所謂的"效應物〃，例如離 子通道或腺苷酸環化酶、鳥嘌·呤核苷酸環化酶，或磷脂酶 〇 這呰所謂的G -蛋白質連結的受體’傳遞完全不同的细胞 -3 ~ \ (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁)ι £ .裝. 訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 第3 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中V說明害修TF苜（84年9闫Ah ax 五、發明説明（） 年月曰匕、 8U. 25補充 - 因此本發明係關於在人類或動物细胞中，測定物質對受 體依賴訊號傳遞途徑之調節效能的方法。此方法的持徵在 於物質對於產生甘油二酯之瞵脂酶的活性方面的調節作用 ，可視需要加上水解作用的參與，持別是對瞵脂酶C -活性 ，或是對於訊號傳遞途徑上在磷脂_ C -活化作用之前或隨 後發生的機制，最好是它對G -蛋白質-連结受體所誘發之 訊號傳遞途徑的調節作用，並藉著培養如下的哺乳動物細 胞來決定之，這種细胞 a) Μ含有一報告者基因和一調節序列的重姐D N A來轉化 ，該調節序列對於由磷脂酶，特別是磷脂酶C之調節 所引起肌醇-1，4 , 5 -三磷酸（I P 3 )和甘油二酯（:D A G ) 濃度的改變有反應，K致於報告者基因的表現藉著 I P 3 / D A G濃度上的改變來調節之，且其更進一步地為 b ) K含有一可編碼產生連结於瞵脂酶-效應物糸統之受 體的序列的重姐D N A來轉化，並K此方式使细胞表現 該受體， 加上待審查之物質，再測定報告者基因產物的濃度： 對I P 3 /' D A G ~濃度改變有反應的重组D A N -或是在後文中將 描述其在對照组细胞之案例上的用途，是對於c A Μ P -濃度 的改變有反應-也是本發明的主題。此重姐D Ν Α在後文中 被稱作 '''感覺D N A ，，。報告者基因依撺下述的事實來加Μ 定義··其表琨產物為可查知的|並藉著潮定與其濃度成比 例的訊號而能加以定量的。 包含在感覺DNA中且對IP3/D/\G濃度的改變有反應的調 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------'裝---------訂丨------ΐ線 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫衣頁) 經濟部令央標準局員工消費合作社印製 83.3.10,000 A6 B6 五、發明説明（2 ) 外訊號之作用，像是光、味道、（胜肽）荷爾蒙、神經傳 遞物質等等；它們在演化上從盡可能遠離地人類到酵母菌 的生物體上已被確認（Dohlman et al. 1991)。幾乎所有 的G-蛋白質-連結受體，在它們的序列中互相具有類似性 ;假設所有的均是Μ類似之局部解剖特徵為基礎，而使它 們共同由7個穿透脂質雙層的厭水性（可能為α-螺旋的 )Η段所姐成。 细胞表面的受體由各種细胞外剌激來辨認適切的配體。 配體接合到受體上而催化了訊號階梯，此訊號階梯Μ異位 三聚體之G -蛋白質的活化作用開始；經過一段長期間的受 體活化作用，而歸於經由受體之各種修改所引起的脫敏作 用。G-蛋白質與活化受_體的交.互作用，引起鳥嘌呤核苷二 磷酸（GDP)的置換，由鳥.嘌吃龙脊三磷酸（GTP)结合在α -次單元上、cx-GTP-複合 < 從'成-異位二聚體上解離 ，並使GTP水解成GDP 。單獨一痼受體可K活化數個G-蛋 白質分子，因此增強了配體结合的現象。其上结合了 GTP 的α -次單元和游離的/0-7-次單元可與效應物進行交互 作用，因此藉著形成所謂的"2级傳信者"而更進一步地 增強該訊號。較小分子的2鈒傳信者，諸如CAMP (環腺苷 酸），由腺苷酸環仡酶的活化作用所誘發、CGMP (環鳥糞 喋呤-5·-單磷酸）*由鳥嘌哼核苷酸環化酶的活化作用來 誘發、或肌酵-1,4,5-三磷酸：（1卩3)和甘油二酯類（9六0) ，由磷脂酶的活化作用誘發，視需要可伴随有諸如磷脂酶 C或磷脂酶D之類的水解酶之參與（Billah et al. -4- 本纸張適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） V* I (請先閱¾背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· 訂· 經濟部中央標準局貝工消費合作社印？¾ 81.9.20,000 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中兮說明喜修IF頁（84年9月如 五、發明説明（
含有一個或多個七聚體的T R E -主題，在下文中被 節序列 稱為'' T R E -要素〃。 包含於感覺D H A ‘中，對c A Μ P濃度 ，含有一涸或多個八聚體的C R Ε -主 改變有反應的調節序列 題，在下文中被稱為> 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CRE-要 含有 a受體 根據 胞。這 以感 细胞， 若待 學效果 的序列 體上病 來處理 體.）。 就本 物質之 對於 爭或拮 在本 G-蛋白 根據 素"。 可編碼 D N A "，: 其他狀 些细胞 MDMA 這些細 審查的 有關時 (根據 理學狀 動物的 I 發明£ 混合物 "調節 抗的作 發明之 質連结 依照本 產生受體的重组D N A序列，在下文中被稱作 況，本發明係關於只 在下文中被稱作'預 和受體D Ν Α來轉化的 胞也是本發明的主題 物質與它們處理人體 >受體D N A最好含有 本發明，此方法最好 況的物質。然而此方 物質，在這種案例中 Μ感覺D N A來轉化的细 備試驗细胞"。 细胞在下文中稱作試驗 〇 上病理學之狀況的藥理 一可編碼產生人類受體 是用來發現適於處理人 法也可Μ用於篩選被用 ，使用相對應的動物受 目的而言， ''物質〃這個字眼包括純物質及 兩者 "作甩則意指在受體依賴訊號傳遞途徑中競 用。 較'佳具體實施例中，细胞Κ 一個可編碼產生 受體的D Ν Α來轉化。 發明之較佳具體實施例的方法，再加上以試 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 >-1----I----1 裝---- (.請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口 ο 線 經濟部中央標準局ίΗ工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（3 ) 1989)，依次完成细胞內的變化。這些變化包括憑藉蛋白 激酶的活化來選擇性地進行蛋白質的磷酸化作用（例如： 憑藉IPS/DAG的PKC 、憑藉cAMP的PKA)、影響某些基因轉 錄的調節作用、细胞骨架的再姐繃，K及莫的去極化作用 。（具有拮抗作用的物質可逆轉由具有競爭作用之物質所 引起的交互作用，在2级傳信者濃度上得到全部或部分的 改變，或者甚至可導致逆轉了機能上的作用）。藉著.這種 訊號傳遞糸统，细胞能夠互相傳訊，並統合它們的發育* 或是由它們所誘發的影響。當結合於G-蛋白質之α -次單 元的GT'P被水解形成GDP時，便再建立了不活化形式的 G-蛋白質。 Μ磷脂酶的活化作用、其反-應產物為DAG者，或K腺苷 酸環化酶姐合成的特定訊號傳=〗睡途徑，在下文中KDAG作 為其終產物而被稱為Λ磷脂訊號·傳遞途徑(或、、磷脂 酶效應物系統〃），或是、'腺苷酸環化酶訊號傳逓途徑" (或"腺苷酸環化酶效應物糸統"）。 在哺乳類中，已發現大約100個不同的〇_蛋白質-结合 受體（它們有些結'合相同的配體）。例如：直到現在，己 確認出5種不同挪茸鹼的受體次型式，8個>乂上不同的醫 上腺素功能受體、至少5個不同的5 -羥色胺受體和4個不 同的視蛋白受體。對喋呤類、_蠶索（b〇mbesin)、血管舒緩 激妝、凝血酶、組織胺、多巴K、頰依可素（ecosin〇id) 、後葉加壓素、諸如GHRH (、、生長荷爾蒙釋放荷爾蒙"） 及生長激素釋放抑制因子之類的胜肽荷爾蒙有反應的受體 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 (請先閲請背面之注意事項再頌寫本頁) 裝！-----?τ------J--------'1. 第8 1 1 0 9 5 2 7號專利申請案 中·»說明審修7F W ( 84年9月α)7 Β7 五、發明説明（）
驗物質來處理只用根據步驟a )之重组D N A進行 组细胞（T R E -預備試驗细胞），來發現是否報 -依賴的調節作用。若報告者 C -效應物糸統的受體獨立之調 體出現，而磷脂酶C -效應物糸 體，則藉著T R E -預餚試驗细胞 轉.化的對照 告基因的表 基因的我現 節作兩，或 統的調節作 來查知此調 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
wrJ .T裝 訂 線 經濟部中央¾準局員工消費合作杜印^ 現可歸因於受體 被歸因為磷脂酶 是若有内源性受 用是依賴這些受 節作用。. 為了審查試驗 ，以預備試驗綑 感覺D N A含有調 引起的c A Μ P -濃 需要可另外使用 的C R Ε -試驗细胞 C R Ε -試驗细胞 篩選試驗中當作 對被審查物質在 賴調節作用。β在 碼產生連结於腺 受體D Ν Α來進行 備_試驗细胞當作 化酶效應物糸統 胞並視需要也可 照组來使用。 對於（：預備.） 物質在 胞便利 節序列 度改變 K如同 當作對 不僅可 一级受 腺苷酸 這個案 苷酸環 轉化。 對照組 上相同 K轉化 磷脂酶 地完成 >它對 有反應 c -訊號傳 對比試驗 由腺苷酸 (CRE-預 τ r ε -試驗细胞一 遞途徑上的專一性 ，預備 環化酶 備試驗 樣的受 試驗細胞的 之調節作用 细胞.）。若 體加Κ轉化 照I且。 當作對 酶質細 環化酶 例中， 化_效 在這樣 細胞。 照姐细胞 胞來使用 訊號傳遞 CRE-試驗 應物糸統 的篩選試 若需要則 的受體，來轉化 T R Ε -試驗细胞， 來使用 ，此篩 途徑上 细胞以 上之受 驗中， Κ連结 的 T R Ε -可當作 ，也可Κ在 選試驗係針 的受體-依 一含有可編 體的序列的 使用C R Ε -預 在腺苷酸環 預備試驗細 進一步的對 試驗细胞的產製而言，不Μ內源性來表現 -12 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 2Q7公釐） 83.3.10,000 A6 B6 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 五、發明説明u ) 和受體次型式之生長群已經被純種化並標示出特徵 (Dohlman etal., 1991， Simon et al.， 1991; TIPS 受 體命名法補充，1991; Doods和Von Meel, 1991)。對相 同配體有反應的不同型式或次型式之受體，可依據它們所 誘發的细胞內反應為基礎*從彼此之間加以區別。這些特 殊的受體次型式可與各種效應物系統連结，並可調節不同 的離子通道。因此單獨一種受體次型式（可能在相同細胞 或在不同的细胞中）可連结在超過一種的效應物上，且數 種受體次型式可活化相同的效應物，產生了錯線複雜的訊 號傳遞網。此外，G -蛋白質與效應物的特徵化顯示亦需藉 多種類的基因來將其詳加說明。已確認了大多數的G -蛋白 質、各種型式的腺苷酸《化酶·.，及諸如磷脂酶C和A2之類 的磷脂酶。G-蛋白質依賴·的離=子通道也可被细分成不同的 - ——. 蛋白質家族。目前不清楚Μ何Γ種標準來決定G -蛋白質之異 源性群體與效應物蛋白質之間交互作用的專一性、特定受 體如何被連结到特定的G -蛋白質變體、它們如何形成自動 的巡迴路線、Μ什麽方式使這些訊號的巡迴路線互相進行 交互作用，Μ及在细胞分化的期間如何重新再形成它們。 如此被活化的轉錄因子（例如GREB蛋白質、API蛋白質 )與調節DHA要素CRE (CRE要:素，、、cAMP反應的要素"） 或TRE (TRE=、、TPA反應的要素：/ : TPA =佛波醇-12-肉Μ蔻 酸-13 -乙酸=佛波醇酯）交互作用，這束縛住CREB和API :許多基因的轉錄受到在5’-側面區域含有如同調節要素 P - . (請先閱-Λ?背面之注意事項再塡寫本頁) -丨裝. 訂.
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第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中IT說明喜修IF苜（84年9月aV 五、發明説明（
經濟部t央標準局g工消費合作社印製 諸如報告者基因、報告者基因的啟動子，以及 調節序列之類。為了容許調節啟動'子的調節序 同的報告者基因進行無性繁殖，有某些策輅， 動子或故動群之前，或在報告者基因之前存放 性繁殖位。 為了選擇適合的報告者基因，其指導前題必 較佳的、無放射線活性，並具有高度敏感性的 法。 在本發明的範圍内_*使用任何滿足下列條件 因理論上是可能的： 當使用化學發光的受酶質時，可測出具有高 性磷酸酶，但它具有許多哺乳動物细胞相對上 琨此酵素的缺點。因此它通常被用在那些不表 稍微表現它的細胞株上來作為報告者基因。 /3 -半乳糖苷酸和<6 -葡萄糖苷酸酶基因的 能夠切開相對應的甲基缴形基（m e t h y丨u m b e 1 1 i 乳糖苷或-葡，萄糖苷酸，形成螢光集團：.利用 螢光分析來監視這些酵素反應（Wi e i a n d e t a 1 Kricka,1988)°. M相對高敏感性而被公認可被查知氯黴素-(C A T :)的表現，但此分析法待別具有其為放射 不易自動化的缺點（.H a r t m a η η , 1 9 9 1 )。 在本發明的範圍内，最好使用可編碼產生光 (Photinus Pyralis)之蟲蜜光素酶的基因（De 選擇標記的 列或各種不 例如：在啟 併入的複無 須提供一種 自動化分析 的報告者基 敏感性的鹼 會強烈地表 現它或只有 表現產物， f e r y 1 )-半 已經建立的 .,1 9 8 5； 乙醜轉移_ 線活性的且 螟 Wet e t -----------ff -裝---- (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂---------線 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 第8 1 1 0 9 5 2 7號專利申請荼 中々說昍書修TF.頁（84年9月A)7 B7 五、發明説明（
之保留序列的 TGACGTCA相同 素含有非常類 致序列不同處 1 9 8 8 )。這種 佛波醇酯來活 a 1 . , 1 9 8 7 a 和 蛋白質-蛋白 殊基因上的協 因為訊號傳 徑之間有所諝 脂酶C -訊號傳 應物：系統、也 C 〇 r s [ e t a i . c A Μ P來調節。此序列與迴文的八聚體 或類似（.Μ ο n t: m i n y e t a i , 1 9 9 0 _) 。T R E -要 似的七聚體主題TG AGTCA ，它和CRE-要素一 僅在單獨一個核有Γ酸上（D e u t s c h e t a 1 .， 類似的主題•在大多數由 因中已被確認（A n g e 1 e t: b ; L e e e t a 1 . , 1 9 8 7 .)。周圍的 D M A 序列或 互作甩，症1决定了在特 T R E -主題，或非常 化其轉錄作用的基 濟 .郎 中 央. 準 局 員 工 消 費 合 社 印 製 合訊號 的重覆 訊號傳 如：一 互相作 K·受到 互作用 ，不能 需要 病理學 而言， ，或確 遞途徑 個受體 用，K 影響。 的瓦解 正確地 那些可 状況持 質與其他因子的交 調現象。 遞途徑網的複雜性 的 '' 漏話現象〃， 遞途徑。^'漏話〃 引起其他糸統之影 ，1 9 9 0 ； Houslay， 生理學上所利用的 保各種訊號傳途徑 的各種階段，特別 或受體次單元可與 致於c A Μ P -再加上 ，所Κ可能在訊號傳遞途 例如：腺苷酸環化酶及磷 這個字眼表示影響一個效 響的現象（53350116-19 9 1)。就整合或交互结 漏話現象是為了產生訊號 的聯络。漏話可以發生在 _是在G -蛋白質的階段。例 一個以上的G -蛋白質變體 I P 3 / D A G -階段，兩者鄯可 在細胞中病理學上改變的可能原因為這些交 ，例如：若一特定的受體Μ生埋學上的觀點 與一效應物糸統交互作用。 能發現處理病理學狀況之藥物的分析，這類 別是針對某些受體或受體次單元，而更進一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 c請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 、νδ 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第3 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中·»說明喜锪TF W (' 84年9凋） Β7五、發明説明（)….Ί修正 84. 9. 无 存在的S Η -基進行氧化作用，Μ及在發光反應的期間，蟲 螢光素酶必然產生的失活作用。Κ 0 . 1到50克/升之間的 濃度來使用DTT.，最好是1克/升：ΒΜΕ則Μ 0 . 1到50毫 升/升之間的濃度來加人，最好是4毫升/升。 為了使此發光反應穩定並増強，可以額外地使用三瞵酸 納（N a Τ Ρ Ρ )，並以在0 . 0 0 5到5克/升之間的濃度，最好 是0.2克/升來加入。利用焦磷酸納來代替三磷酸鈉也是 可能的。 使用適當的清潔劑，諸如三通X - 1 0 0 ( T r> i t ο η X - 1 0 0 )、 吐溫2 0 ( Τ w e e η 2 0 )或3 0、Ν Ρ 4 0、Β r i j或其類似物來溶解細 胞。K 0 . 0 1到5 之間的濃度來使用三通X - 1 0 0 ，較佳的是 0 . 1 :¾ . 當構築感覺D !丨ί\時，在控制姐成之情況下，最好是能K 一個或多個接在前的T R Ε -或C R Ε -調節要素來調節的弱啟 動子要素的控制之下，放置報告基因--藉著暫時性地轉化 帶有不同慼覺DNA質體结構的細胞，一方面改變報告者基 因，另一方面改變控制序列《再對其敏感性來審查報告者 基因產物的大小，決定出最合適的感覺D Ν Α结構。.諳熟此 藝者熟知在持定之哺乳動物細胞中適宜用於表現的控制序 夕fj _ ;可從有關的文獻中ί.例如：L a n d s c h u i z e t a i .,. 1 9 8 8 , 1 u「n e r和；Γ j U n , 1 9 8 9 )開始進行選擇，再依據前述 容易完成的暫時轉移感染之賁驗，可縮小或改良這些選擇 品。適當啟動子的實例為/3 -血球蛋白敔動子及1’ K -啟動子 :若需要則修改已知的天然或合成啟動子，例如：將它們縮 .(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 、\=σ 線 - 2 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（6 ) 步地它特別影響單獨一種特殊的受體依賴訊號傳遞途徑。 早已經被發展出的分析法，係利用經由基因的表現’可 査出在受體依賴訊號傳遞途徑上物質之調節活性的作用： 由King et al., 1990所描述的一種分析糸統，Μ訊號 傅遞途徑發生影響為基礎，使用酒酵母菌 (SafiaharonivcftR p.RrRvisiae)的連结於G -蛋白質之·信息、素 受體，其中在酵母菌上藉著比色法來測定使競爭上有效之 化合物结合到已經轉移感染於酵母细胞中之受體時的反應 。為了這個目的|將修改過的/5 -腎上腺受體基因Μ存在 於酵母菌品系中之哺乳動物G-蛋白質一次單元-Gs# *在 可由半乳糖誘等之GAL1-啟動子的控制之下（為達成高表 現率）來進行共同轉移扇染，此酵母菌品糸含有一個在對 信息素有反應之FUS-啟動·子的[控制之下被穩定地整合在基 -- . 因姐中的報告者基因（卢-考·乳糖苷酶）。此糸统提供篩 選其競爭结果會活化/9 -半乳糖苷酶之物質的機會•這個 活化作用Μ簡單的、依據顔色改變的自動分析法來測定。 然而此系統的缺點為從它的複合系統分離出的人類蛋白質 ，在酵母菌细胞中的效用•不能導出任何關於人類细胞中 之過程的絕對结論。此外•在酵母菌细胞中的這個系統需 要能夠與人類受體互相作用之適當G -蛋白質次單元的共同 轉移感染作用。此系統不能使用較高等细胞中固有的訊號 傳遞糸統，並因此使得在該糸「統中對受體有活性之物質的 功能分析出現問題。 Montmayeur和Borelli, 1991,所描述的分析法系根據經 -8 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .y .裝· 訂. 本紙張尺及適用中國國家標準（CNS)甲4规格（21〇 X 297公笼） 81.9.20,000 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中々說明書修ΙΗ頁（84·年9月；^ B7 修{F 五、發明説明（） 年月女' iU· Q 25 補允^ - 經濟部令央標準局員工消費合作社印製 造（包括含有調節序列的表現控制序列），這時另一個質 體則含有選擇標記基因構造。 適當之選擇標記基因構造的實例為質體P R S V n e 〇、 pSl/2neo、pRS Vgpt、PS V2gpt ，可在相關的手冊（洌如： "無性繁殖之載體〃）中找到它們的结構。若使用分開的 質體，則细胞要用兩個質體來共同轉移感染•並依據標記 來選擇细胞。選擇標記的存在導出該细胞也含有報告者基 因结構的结論，因為已知位在D N A片段上彼此不是天然連 结的兩個基因，其共同-轉化作用經常會導致兩個共同轉 化基因的表現（Wi η n a c k er , 1 9 8 5 )。 關於在試驗過程中要使用的測定系統，改良測量訊號最 大限度之變化與正常值之間的比例是較明智的 > 最好是經 由改變感覺D N 的结構，例如：藉著對啟動子之排列進行 構造上的更改。而背景訊號最好低至能查知具有高度敏感 性之報告者基因表琨的誘導作用，.但在同時，背景訊號也 必須高到足K使其能決定關於負對照姐的查知界限。 對於受體㈣A结構，基本上應用與對感覺D N A结構一樣 的考量，除了受體序列最好在一強有力之組成敢動子的控 制之下被置入。同樣地在受體D N A的案例中，若需要也可 將編碼產生受體和優勢選擇標記的序列放置在兩個分.開的 質體上，以此二質體來共同轉化细胞。 藉著傳統轉移感染的方法（：參見冽如：P 〇 t t e r e t al., 1984； Feigner et al., 1987 )，來完成 M 感覺 D H 或受體D N A對细胞的轉移感染，較佳的方法為電孔法 -23 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝 、\=口 線 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 經濟部中央標準局®；工消CH合作社印製 A6 B6 五、.發明説明（7 ) 由G-蛋白質-連結受體（使用D2-受體類和/S -腎上腺素 功能受體）之活化作用，來影響腺苷酸環化酶訊號傳遞途 徑。所使用的受體在胸腺核苷激酶（TK)的控制之下，轉化 含有氯徽素-乙醯轉移酶基因（CAT)來當作報告者基因的 人類细胞。前面接著的啟動子是一合成的寡去氧核苷酸序 列，它含有對cAMP有反應的啟動子要素（、、CAHP反應的要 素〃 CRE)。依據CAT-活性，有可能証明對於已知會.活化 腺苷酸環化酶的/9 -醫上腺素功能受體而言Μ競爭方式來 活化的化合物*能引起CAT-活性上劑量-依賴性的增加。 在與抑制腺苷酸環化酶之多巴胺受體的共同轉移感染作用 之後，此活性再降回。這顯示了 cAMP-引起報告者基因的 表現，可Μ劑量-依賴询方式_，正向及負向地調節。 此分析法受限於測定由〇 AMf^濃度來調節的基因表現；它 不容許測定IP3/DAG調節的^因'表.現。由漏話引起在腺苷 酸環化酶與瞵脂酶C -訊號傳遞途徑之間的交互作用，不能 以此種分析法査知，或僅能部分地査知。 本發明的目的是提供一種適於篩選依賴受體。調節磷脂 酶訊號傳遞途徑之物質的方法，特別是對磷脂酶C -訊號傳 遞途徑。這些包括结合在受體之配骽結合位置的物質、具 有異位活性的物質，K及對於配體結合位置有非競爭性活 動的物質。更特定而言，本發明準備提供一種可被自動化 、並因此適合篩選高產最物質的方法，且此方法也使得針 對槩理學上有活性之物質的內涵，來研究諸如來自生物體 的萃取物之類的物質之複合混合物成為可能。 -9 -
It - (請先閲¾背面之注意事項再塡寫本頁) f -------裝—------可-----ί 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中1Γ說明害孩FFW (84年9月Α7 B7 五、發明説明（
經濟部十央標準局員工消費合作社印製 圖Η冃鏹 圖 1 ： 質 體 P A D n e 〇的结構 圔 2 ： 質 體 P A D n e ο T K结構上在 PCR 之 後 的 Bg 1 I I - Bam HI 片 段 圖 3 ： 質 體 P A D n e ο Τ Κ 圖 4 A ： 質 體 pADneoTKl u c ί 圖 4B ： 質 體 pADneoBG 1 u c i 圖 5 ： 質 體 pRc/RSVA Nae I 之 结構 圖 6 ： 質 體 pRc/RSVne 〇之結構 圖 7 . 質 體 pADneo2BG 1 u c i 之 結構 圖 8 ： 含 有 3個C R E -要素的寡 核苷 酸 序 列 圖 9 ： 質 體 pADneo2-6C-BGL的 结構 含 有 6 個 CRE -要 素 圖 10 ： 質 體 pHEBo 圖 11 ·· 質 體 P290 圖 12： 質 體 pAHygCMVl 圔 13 ： 質 體 pAHygCMV2 圖 14 ： 質 體,ρΒΗ 1 ucl . 3 λ* 圖 15 ： 質 體 P A D n e o (1 . 3 I C A M ) 1 u c i 含 有 I C A Μ - 1 基因的 5 ^ 端 調節序列 圖 16 ·· 質 體 P A D n e ο (' 3 T R E ) B G 1 u c i 含有I C A Μ - 1 基.因的 3 個 T R E -要素 圖 17 ： mi- 貝 體 P A D - C Μ V 2 - 5 Η T 2 > 含有 編 碼 產 生 5ΗΤ2 (5 -羥 色 胺 2 )受體的序列 圖 18 ： 質 體 P A D - C Μ V 2 ·· D 1 ，含 有可 編 碼 產 生多巴 胺 -32 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 第3 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中V說明害修TF苜（84年9闫Ah ax 五、發明説明（） 年月曰匕、 8U. 25補充 - 因此本發明係關於在人類或動物细胞中，測定物質對受 體依賴訊號傳遞途徑之調節效能的方法。此方法的持徵在 於物質對於產生甘油二酯之瞵脂酶的活性方面的調節作用 ，可視需要加上水解作用的參與，持別是對瞵脂酶C -活性 ，或是對於訊號傳遞途徑上在磷脂_ C -活化作用之前或隨 後發生的機制，最好是它對G -蛋白質-連结受體所誘發之 訊號傳遞途徑的調節作用，並藉著培養如下的哺乳動物細 胞來決定之，這種细胞 a) Μ含有一報告者基因和一調節序列的重姐D N A來轉化 ，該調節序列對於由磷脂酶，特別是磷脂酶C之調節 所引起肌醇-1，4 , 5 -三磷酸（I P 3 )和甘油二酯（:D A G ) 濃度的改變有反應，K致於報告者基因的表現藉著 I P 3 / D A G濃度上的改變來調節之，且其更進一步地為 b ) K含有一可編碼產生連结於瞵脂酶-效應物糸統之受 體的序列的重姐D N A來轉化，並K此方式使细胞表現 該受體， 加上待審查之物質，再測定報告者基因產物的濃度： 對I P 3 /' D A G ~濃度改變有反應的重组D A N -或是在後文中將 描述其在對照组细胞之案例上的用途，是對於c A Μ P -濃度 的改變有反應-也是本發明的主題。此重姐D Ν Α在後文中 被稱作 '''感覺D N A ，，。報告者基因依撺下述的事實來加Μ 定義··其表琨產物為可查知的|並藉著潮定與其濃度成比 例的訊號而能加以定量的。 包含在感覺DNA中且對IP3/D/\G濃度的改變有反應的調 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------'裝---------訂丨------ΐ線 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫衣頁) 經濟部令央標準局員工消費合作社印製 83.3.10,000 經濟部_央標準局員工消費合作社印製 第8 11 Ο 9 5 2 7號專利申請案 Φ V銳Bfl喜修iF苜(84年9月λ7 Β7 五、發明説明（：年月^赍手 84 9. 25補充 ' -D α -受體的序列 圖19Α: 質體pAHyg-NK2，含有編碼產生ΝΚ2-受體的序列 圔1 9 B : 質體p A H y g - 5 Η T 2，含有編碼產生5 Η T 2 -受體的序 列 圖20: 在细胞株Α549、HeLa及C0S-7中，由ΤΡΑ對 T R E -感覺-D N A ( p Β Η 1 u c 1 . 3 )的誘導作用 圖2 1 A : 年H e L a细胞中，由T P A引起但不會由佛斯寇林引 起對TRE-感覺-DNA(pBH1cu 1·3)的誘導作用 圖2 1 Β : 在C 0 S - 7 -细胞中，由Τ Ρ Α引起但不會由佛斯寇林 引起對TRE -感覺- DNA(pBH1uc 1.3)的誘導作用 圖22: 在细胞株/\549、HeLa及C0S 7中，由TPA引起但 不會由佛斯寇林引起對TRE-感覺-DNA (pADneo (3 T R E ) B G U c i )的誘導作用 圖23A: 在C0S 7-细胞中，由TPA引起對TRE-感覺的 誘導作用，此T R E -感覺D N A中含有3画或6個 T R E -要素，且彼此之間有不同的間隔 圖23B: 在冉5,4 9-细胞中，由了？&引起對了1^-感凳〇^的 誘導作用，在此TRE -感覺DNA中’含有3個或6 個T R E -要素，且彼此之間有不同的間隔 圖2 4 : 在C 0 S 7 -细胞中，藉著使競爭上有作用的物.質结 合到蠅輦鹼Μ 3 -受體上，對T R E -感覺D Η A (p A D n e ο ( 3 T R E ) B G 1 u c i )所引起的誘導作用 圖2 5 : ί\)藉著將具有競爭性作用的物質，與以5 H g 體D Μ A來轉化的C 0 S 7 -細胞上的5 Η T 2 -受髏·结合 -33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） 83.3.1〇*〇00 {請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝---------訂-------〇Γ線 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中兮說明喜修IF頁（84年9月如 五、發明説明（
含有一個或多個七聚體的T R E -主題，在下文中被 節序列 稱為'' T R E -要素〃。 包含於感覺D H A ‘中，對c A Μ P濃度 ，含有一涸或多個八聚體的C R Ε -主 改變有反應的調節序列 題，在下文中被稱為> 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CRE-要 含有 a受體 根據 胞。這 以感 细胞， 若待 學效果 的序列 體上病 來處理 體.）。 就本 物質之 對於 爭或拮 在本 G-蛋白 根據 素"。 可編碼 D N A "，: 其他狀 些细胞 MDMA 這些細 審查的 有關時 (根據 理學狀 動物的 I 發明£ 混合物 "調節 抗的作 發明之 質連结 依照本 產生受體的重组D N A序列，在下文中被稱作 況，本發明係關於只 在下文中被稱作'預 和受體D Ν Α來轉化的 胞也是本發明的主題 物質與它們處理人體 >受體D N A最好含有 本發明，此方法最好 況的物質。然而此方 物質，在這種案例中 Μ感覺D N A來轉化的细 備試驗细胞"。 细胞在下文中稱作試驗 〇 上病理學之狀況的藥理 一可編碼產生人類受體 是用來發現適於處理人 法也可Μ用於篩選被用 ，使用相對應的動物受 目的而言， ''物質〃這個字眼包括純物質及 兩者 "作甩則意指在受體依賴訊號傳遞途徑中競 用。 較'佳具體實施例中，细胞Κ 一個可編碼產生 受體的D Ν Α來轉化。 發明之較佳具體實施例的方法，再加上以試 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 >-1----I----1 裝---- (.請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口 ο 線 第3 1丨Ο 9 5 2 7號專利申請案 中々說明害修TF百（34年9 $ ) Β7 五、發明説明 9. 2 5 年爲 a 修正. 性）的拮抗劑 在下表中提mi.中_所奮胸fc物質之作用 A 2 3 1 8 7 C a 2 +離子載體 阿樸嗎啡（A ρ 〇 m 〇 r p h i n e .) 多巴胺受體的競#物 阿托品 (Atropine) 蠅簞鹼受體的拮抗劑（非專一性的 溴麥.角環狀（B r 〇 m 〇 c r y p t i η ) 多巴胺-受體的競物 碳醯膽鹼（C a r b a c h ο 1 ) 蠅簟鹼受體的競爭物 氯氮平（C 1 o z a p i η )多巴胺-受體（ 雙 丁醯環腺苷酸（d i b u t y r y 卜 c A Μ P :) (: d b c A Μ P ) 可通過细胞膜的c A Μ P衍生物 度巴明 （.Dopamine.) 多巴胺受體的競#物 三氟曝噸（F 1. u p e n t h i X ο 1 ') 多巴胺受體（.D x -專一性：）的拮抗劑 .(請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝 佛斯寇林（F o r s k ο 1 i η .) 氟哌唾醇（H a 1 o p e r i d ο 1 ) I β Μ X 凱特色寧（Ketanserin) 腺苷酸環化_的剌激劑（增加c A Μ P ) 多巴胺受體ί D 2 -專一性）的拮抗劑 磷酸二酯酶之抑制劑（累積c A Μ P :) 羥色胺受體（5 - Η T 2 -專一性）的拮 •訂 經濟部令央標準局員工消費合作杜印¾ P M A (； T P A ) 蛋白質激_ C的活化_，刺激 ' I P 3 / D A G . SC Η 23390 多巴胺-受體U) i -專一性.）的拮抗劑 5-羥色胺（5-HT) 5-羥色胺+受髏的競爭物 虫累環咲哌®嗣（S p i r 〇 p e r i ci ο 1 ) (=螺環呋哌唾銅（S p i p e r ο n ))拮抗劑 - 3 6 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 線 第8 1 1 0 9 5 2 7號專利申請案 中·»說明審修7F W ( 84年9月α)7 Β7 五、發明説明（）
驗物質來處理只用根據步驟a )之重组D N A進行 组细胞（T R E -預備試驗细胞），來發現是否報 -依賴的調節作用。若報告者 C -效應物糸統的受體獨立之調 體出現，而磷脂酶C -效應物糸 體，則藉著T R E -預餚試驗细胞 轉.化的對照 告基因的表 基因的我現 節作兩，或 統的調節作 來查知此調 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
wrJ .T裝 訂 線 經濟部中央¾準局員工消費合作杜印^ 現可歸因於受體 被歸因為磷脂酶 是若有内源性受 用是依賴這些受 節作用。. 為了審查試驗 ，以預備試驗綑 感覺D N A含有調 引起的c A Μ P -濃 需要可另外使用 的C R Ε -試驗细胞 C R Ε -試驗细胞 篩選試驗中當作 對被審查物質在 賴調節作用。β在 碼產生連结於腺 受體D Ν Α來進行 備_試驗细胞當作 化酶效應物糸統 胞並視需要也可 照组來使用。 對於（：預備.） 物質在 胞便利 節序列 度改變 K如同 當作對 不僅可 一级受 腺苷酸 這個案 苷酸環 轉化。 對照組 上相同 K轉化 磷脂酶 地完成 >它對 有反應 c -訊號傳 對比試驗 由腺苷酸 (CRE-預 τ r ε -試驗细胞一 遞途徑上的專一性 ，預備 環化酶 備試驗 樣的受 試驗細胞的 之調節作用 细胞.）。若 體加Κ轉化 照I且。 當作對 酶質細 環化酶 例中， 化_效 在這樣 細胞。 照姐细胞 胞來使用 訊號傳遞 CRE-試驗 應物糸統 的篩選試 若需要則 的受體，來轉化 T R Ε -試驗细胞， 來使用 ，此篩 途徑上 细胞以 上之受 驗中， Κ連结 的 T R Ε -可當作 ，也可Κ在 選試驗係針 的受體-依 一含有可編 體的序列的 使用C R Ε -預 在腺苷酸環 預備試驗細 進一步的對 試驗细胞的產製而言，不Μ內源性來表現 -12 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 2Q7公釐） 83.3.10,000
第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 84 9. 25 无 中々·銳明害锪IF亘（84年9月Λ7 ~~ ~ "ΒΤ 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 794-854 聚無性繁殖位置 8 5 4- 1 55 2 S V 4 0 t插人序列和聚腺苷酸化作用訊號 1 5 5 3 - 1 7 3 6倉鼠（H a m s t e r ) D H F R基因的5 ’端-非編碼區 1 7 3 7 - 2 2 6 1 Ε Β V o r i Ρ 部份的序列 2 2 6 2 - 2 8 5 6帶有聚腺脊酸化作用訊號的H S V胸腺核苷激酶 之3 ’端非-編碼區 2 8 5 7 - 3 9 1 2潮黴素β磷酸轉移酶基因 3.9 1 3 - 4 1 6 1 H S V胸腺核苷激酶故動子 4162-6531 PBR322載體成分 6 5 3 2 - 6 6 2 3從各種無性繁殖的方法，特別是從ρ 1 i n k 3 2 2 (M a n i a t i s e t a 1 . 1 9 8 2 )所形成的連接子序列 質體P A H y g C Μ V 2的核苷酸序列則顯示於序列識別號·· 3 7 中。它與P A H y g C Μ 1/1不同之處僅在於聚無性繁殖位置的地 區；P A H y g C Μ V 2中在位置8 5 6處的胞嘧啶，相當於 P A H y g C Μ V 1中在位置8 4 9處的胞嘧啶。 實例2 帶有可由佛波醇酯（T P A )來誘導之要素（T R Ε -感 覺D Η A)的報告者質體之搆造方法 »«% 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 為了细胞間黏著分子I C A Μ - 1而對人類基因之1，3 0 0個鹼 基的5 _端-側面連接區域所進行的無性繁殖及刪除分析， 已顯示出此片段 · i )在肺臟腺癌细胞株A 549 CATCC CCL 185)中，可被 T Ρ A誘發，但不能用佛斯寇林來活化，且 ii )含有一個具有D Η A序列T G A T T C A的T Ρ A反應要素 (T R E ) ( V 〇 r a b e r g e r e t a 1 . , 1 9 9 1 ):這個含有三個縱向 -4 7 - 83.3.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（11 目前討論之受體的细胞是較佳的，因為Μ報告者基因表現 的改變為基礎之受體本身的内源性表現，會發出干擾測定 结果的訊號。然而，倘若能確定這些细胞會強烈地過度表 現外源性受體，以致於內源性表現在經過與那些外源性表 現的比較後是可Μ忽略地小，且不影響測定之結果時，不 排除使用那些Κ内源性來表現受體的细胞。為了看出细胞 對於根據本發明之方法是否基本上適於作為一（預備）試 驗细胞，例如：它不表現或僅稍微表現該特定受體，對於 此點需測定由試驗物質對於在磷脂酶C-效應物糸统上調節 的影響，可使用某種程序，例如：將哺乳動物细胞Κ TRE-感覓-DN Α來轉化，接著Μ已知能活化所討論之受體的 物質加Κ處理。如果此_细胞對.這種處理沒有反應，或僅作 有限度的反應，則它可被.視為=基本上適合當作試驗细胞來 使用。（就測驗细胞而言，^了得到它們在當作C R Ε -試驗 细胞時的適用性，Μ類似的方法來测驗這些细胞，不同的 是使用CRE -感覺DNA )。其他可能看出细胞是否會表現該 受體的方法為利用分子生物學的方法，直接測定該表現反 應，例如：利用PCR (聚合酶連鎖反應）或北方墨點法 (Northern blots) ° (請先間讀背面之注念事項再塡寫本頁)❿ .丨裝- 、1Γ. 經濟部中央標準局tw工消费合作社印製 驗此 試因 Λ—/ , 備胞 預细 ί驗 化試 來產 式多 型地 同能 不可 多儘 許於 的適 體.們 受它 以使 能此 .可因 儘並 了， 為胞 细 的细 性始· 源起 內揮 無選 其來 因， 好式 最型 ’體 言受 .而的 製論 產討 的所 胞現 细表 驗少 試能 }可 備儘 預或 /ί\ , 於現。 對表胞 尽'.氏張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐) 81.9.20,00
經濟部令央樣準局員工消費合作社印製 排列之T R E -要素的1 , 3 Ο 0個鹼基長I C A Μ - 1 Η段或核苷酸群 ，因此而被用來建造可藉Τ Ρ Α來誘發其蟲螢光素海基因的 載體。 a )質體p Β Η 1 u c 1 . 3之製備 質體Ρ Β Η 1 u c 1 . 3 (圖1 4 .)含有位在蟲螢光素酶基因之前 、1，3 0 0個鹼基長的I C Α Μ - 1基因調節區域。它的製餚方法 已由 Voraberger e. t ai., 1991 描述過了。 b )質體 p A D n e 〇 (1 . 3 I C A Μ ) 1 u c i ( T R E -感覺-D N A )之製備 利用質體P A D n e ο 2 B G 1 u c i (參見實例1 )，苜先藉著用限 制酶S a 1 I和Η丨n d I I I切開此質體，來除去冷-血球蛋白啟 動子，經由加入全部4種的d N T P s和K 1 e η 〇 w酶，把此質體 的D Ν Α末端弄鈍，最後藉著Τ 4 - D N A -連结酶的加入再連结 質體。這個沒有Θ -血球蛋白啟動子的質體被命名為 P A D n e 〇 2 1 u c i ，然後用N 〇 t I及Κ ρ η I將它切開，再一次以 Notl 和 ΚρηΙ切除質體 Bluese「ipt KS (參見 Voraberger et a 1…1 9 9 1)上的1 , 3 0 0個鹼基長之I C A Μ - I Η段，並將其連 结到P A D n e 〇 2 1 u c i内。這個質體被命名為p A D n e 〇 ( 1 . 3 工C A Μ ) 1 u c i (圖1 5 .)，它含有在蟲螢光素酶基因之前的 I C A Μ - 1調節及故動子·區。 c)質體 PADneo(3TRE:)BGluci(TRE-感覺 DNA)的製備. 藉著插入編碼產生限制位置Κ Ρ η I、B g i II和X h ο I的合成 寡核苷酸，其後跟隨著3個連績的TRE-序列、質體 pADne〇2BGluci之/3-血球蛋白放動子的5’端，來製餚此 質體。為J要這樣做’如實例1所述，將寡核替酸E Β I - -4 8 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 A6 ________.._B6_ 五、發明説明（12 ) 較佳的是使用在會增加IPs/DAG-濃度之物質的剌激作用 之後，顯示對TRE-調節的報告者基因有強烈表現的细胞， 或是在會增加cAMP-含量之物質的刺激作用之後，顯示出 對CRE-調節的報告者基因有強烈表現的預備試驗细胞。為 了獲得經藥物作用之後，细胞上的間題受體能有效地連結 在磷脂酶C-訊號傳遞途徑的試驗细胞，首先利用將哺乳軌 物细胞Μ含有一或多個TRE-要素的感覺DN/U預備試驗:细胞 )進行轉化來研究哺乳動物细胞在作為試驗细胞上的適用 性。此預備試驗细胞以感覺DNA來轉化之後，一方面用會 引起或剌激cAMP-澹度增加的物質來處理（例如：用佛斯 寇林（forskolin))，另一方面以會引起或剌激Ip3/DAG -湄 度增加的物質來處理Γ例如.：·用T P A)。如果只有在用 TPA處理時细胞放出訊號，但=在Μ彿斯寇林處理時不放出 - _ 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 訊號，則它滿足對ip3/dag濃;-度上改變之專一性反應的初 步要件，也就是說，此细胞內的表現沒有漏話現象（對於 CRE -試驗細胞使用對應的程序，該CRE -預備試驗细胞會對 佛斯寇林有反應）。更要Μ便利地方式來審査此種預備試 驗细胞，了解受體被引入時是否將會發生生理學上、、正確 "的連结，Μ及是否將會因此而啟動訊號傳遞途徑；恃别 對此事件而言的首要條件為該细胞含有特定針對此受體的 G -蛋白質變體（或是在功能上可取代受體-專一性G -蛋白 質變賵的G -蛋白質變體）。為j這類的調査，例如，將預 備試驗细胞Μ所討論的受腊來轉化，再用已知的配體來處 理並測試之，看看是否有發生報告者基因表現的調節作用 -14- 本纸张尺度適用中國园家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公轻） 81.9.20,000 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 由寸雜flfl雲锪7F酉（糾年9月入7 B7 五、發明説明（ )年月曰心—i 84. Q Μ補充 經濟部中央^準局員工消費合作社印^ CACTCGAGTAGATCTGGTACCTGC-3，）、EB 1 -3790 (序列識別號 ：34) (S'-TCGACAGGCTAAGCTTGAATCACQGTCTACACCGCGCT- A A C C G G C C A G G C T A A G C T T G ή /\ T C A C G G T C T A C A C - 3，.）與互補的寡 核苷酸 E B I - 3 7 9 1 (序列識別號：35)(5'-00下(;/〇'1'(：/\<^(：- TTAGCCTGGCCGGTTAGCGCGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCT-G - 3 ’）來製備 p A D n e o ( 3 x T R E d 3 4 ) B G 1 u c i ; 為了獲f帶有6個T R E -要素的相對應質體，將適切之帶 有3個T R E -要素的質體以N 〇 t I和X h ο I切開，並再次與相對 應的寡核脊酸連结。由於此寡核苷酸的結構，结果得到具 有相等間隔之T R E -要素的複製品。將所得的質體命名為 P A D n e 〇 ( 6 X T R E d 1 6 ) B G 1 u c i ' p A D n e o ( 6 x T R E d 2 1) B G 1 u c i > pADneo((5xTREd24)BGluci 和 pADneo(6xTRE34)BGliJci 實例3 G -蛋白質連結受體的無性繁殖與表現質體（：受體 D N A )的製備
藉著篩選cDNA庫並使之在表現載體PAD-CMV1或？;^-C Μ V 2 ( E P - A 3 9 3 4 3 8 )内進行無性繁殖，來獲得所討論的人 類 5-HT2-受體.之 cDNA a )含有編碼產生人類5 - Η 了2 -受體之序列的無性繁殖糸之分 離Μ帶有一包含老鼠5 - Η Τ 2 -受體序列（J u 1 ί u s e t a 1 .,'1 9 9 0 ； P r ί t c h e 11 e t a 1 · , 1 9 8 8 )之無性繁殖 '糸的 2 . Z A P 載體（S t r· a t a g e n e 9 3 6 2 0 5 ) ，i衣據異種同源性來篩選人類 海馬c D N A庫，分離出一無性繁殖糸並定出這個包含於質體 P B U e s c r i p t S K中的插入物之序列。以序列識別號：1反序 列識別號：2提出所得的D N A序列和従它衍生出的胺基酸序 -51 - 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局Η工消费合作社印製 A6 ___B6 五、發明説明（13 ) 對於在本發明範圍內使用细胞的適當性而言’更重要的 條件是.在細胞作為預備試驗细胞（只Μ感覺DNA進行轉化 )並又作為試驗細胞（Κ感覺DNA和受體DNA進行轉化） 時，從其有效性之角度來看該细胞的穗定性。為7測試细 胞的穩定性（發育能力，外來基因進入基因姐中的穩定整 合作用），在完全相同的情況下，經過一段長時間，用預 備試驗细胞會影W2級傳信者之澹度的物質來處理） 和試驗細胞（Μ受體配體來處理）來完成實驗，並審査此 结果的可再生性。 適用细胞的實例為CHO("中國倉鼠卵巢〃细胞株）、 COS(猴子腎臓细胞株）、A549 (人類肺癌细胞株）以及 JEG-3(人類絨毛膜癌细胞株）.：；的#些细胞株。 根據本發明所使用的預備&驗细.胞，一方面對於製備含 有受體DNA的試驗细胞而言是當作起始物質，另一方面它 們在根據本發明的方法中，為了檢査是否訊號可以被歸因 於經由試驗物質對訊號傳遞途徑的受體依賴之調節作用， 而被當作對照姐细胞來使用。如果此物質在試驗细胞中引 發訊號，而在作為對照姐來使用的預備試驗细胞中不引發 訊號，則由此訊號可知報告者基因表現的調節作用是限於 受體依賴性的。即使對照姐細胞也發出訊號，該物質（也 )影響到訊號傳遞途徑中一受_ -獨立性的步驟；這個相 對應於此訊號的對照姐測最值，必須從試驗细朐所獲得的 測最值中扣除。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發） 81.9.20,000 C請先閱請背面之注意事項再增寫本頁) 裝· 訂· A6 B6 經濟部中央標準局資工消费合作社印製 五、發明説明（14 ) 最好將感覺DNA放置於能在適當的宿主生物體中以高複 製數最被進行複製之質體上，K太腸程莆龄佳，並且在轉 移感染到哺乳動物钿胞中之後再整合至宿主的基因姐内， 在調節要素的控制之下*容許報告者基因的表現。它最好 是一種往返載體，含有報告者基因（感覺DNA)的表現盒 子（cassette)和一個哺乳動物细胞的可選擇標記，K及至 少一個大腸桿菌.中用來複製與選擇的複製起點和一個標記 0 為了產製含有可穩定地被整合在细胞株之基因姐中的感 覺DNA之永久细胞株，載體需含有一優勢選擇標記。特定 選擇標記的使用並沒有標準，例如：使用新徽素磷酸轉移 酶（neo)的基因，此酵秦對抗生素類的基因素 (genet icin) (G-418)能產生拆^ 性（Southern 和 Berg, ” — 一 1 982)、DHFR -缺乏細胞使用的:rDHFR-基因（二氫葉酸遒原 酶）、黃嘌呤素-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶（gpt)的基 因，此酶提供對徽酚酸的抗藥性（Mulligan和Berg, 1981)，或使用潮徽素（hygromycin)-B-鱗酸轉移酶基因 (hph; Gritz和Davies, 1983)，均是可能的。揲縱選擇 標記基因之啟動子的實例是SV 40早期啟動子、巨细胞病 毒之啟動子（CMV-啟動子）、單純疱疹病毒之胸腺核苷激 酶基因的啟動子（TK-啟動ΐ.)、勞氏肉瘤病毒（RSV)長 末端重複段（LTR)。為了使質k能符合因特殊用途所產生 之任何不同的需要，例如：使用不同细胞株的结果，最好 將質體裝配成能簡單地交換或改變那些個別的重.要要素· -16- (請先閲坊背面之注念事項再塌寫本！) % 丨裝· 訂_
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第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中IT說明喜修IF苜（84年9月aV 五、發明説明（
經濟部t央標準局g工消費合作社印製 諸如報告者基因、報告者基因的啟動子，以及 調節序列之類。為了容許調節啟動'子的調節序 同的報告者基因進行無性繁殖，有某些策輅， 動子或故動群之前，或在報告者基因之前存放 性繁殖位。 為了選擇適合的報告者基因，其指導前題必 較佳的、無放射線活性，並具有高度敏感性的 法。 在本發明的範圍内_*使用任何滿足下列條件 因理論上是可能的： 當使用化學發光的受酶質時，可測出具有高 性磷酸酶，但它具有許多哺乳動物细胞相對上 琨此酵素的缺點。因此它通常被用在那些不表 稍微表現它的細胞株上來作為報告者基因。 /3 -半乳糖苷酸和<6 -葡萄糖苷酸酶基因的 能夠切開相對應的甲基缴形基（m e t h y丨u m b e 1 1 i 乳糖苷或-葡，萄糖苷酸，形成螢光集團：.利用 螢光分析來監視這些酵素反應（Wi e i a n d e t a 1 Kricka,1988)°. M相對高敏感性而被公認可被查知氯黴素-(C A T :)的表現，但此分析法待別具有其為放射 不易自動化的缺點（.H a r t m a η η , 1 9 9 1 )。 在本發明的範圍内，最好使用可編碼產生光 (Photinus Pyralis)之蟲蜜光素酶的基因（De 選擇標記的 列或各種不 例如：在啟 併入的複無 須提供一種 自動化分析 的報告者基 敏感性的鹼 會強烈地表 現它或只有 表現產物， f e r y 1 )-半 已經建立的 .,1 9 8 5； 乙醜轉移_ 線活性的且 螟 Wet e t -----------ff -裝---- (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂---------線 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 A6 B6 經濟部中央標芈局員工消費合作社印製 五、發明説明¢6 ) al. 198 7)來當作報告者基因。此酵素所具有的優點為利 用它的受酶質蟲螢光素，與ATP的追加，使它引起高量的 生物發光，且可利用已確立的自動化操作之方法來測定這 種生物發光，而且這種酵素不是由哺乳動物细胞内源性地 產生。不僅如此，蟲螢光素酶在活體.內更具有相對上而言 較短的半衰期*且即使在高濃度下也沒有毒性 (Hartmann, 1991； Brasier et al., 1989) ° 依據生物發光而來的螢火蟲蟲螢光素酶活性之測定法* 是測定酵素最敏感的方法之一。因此並鑑於在正常哺乳動 物细胞中蟲螢光素酶活性的缺乏，此酵素特別適合在基因 調節的研究中作為報告者基因（Subramani和DeLuca, 1987) ° - . 測定蟲螢光素酶活性的.一％缺黑是：在完成最大限度之 光線產生的理想反應狀況卞，:=%線訊號具有不佳的穩定性 (DeLuca et al., 1979)。這意味著最好在添加了帶有發 光反應所需之成分的受酶質溶液之後，在直接測定所產生 之光線的測定装置上測定蟲螢光素酶的活性。在報告者基 因的研究中，其他測定蟲螢光素酶活性的問題為為了釋出 此酵素而進行的细胞溶解作用’這使得此項工作需要更多 的步驟（Brasier et al.， 1989)。 根據其他的狀況’因此本号明亦關於測定在细胞培養中 表現出之蟲螢光素酶活性的試卿。 根據本發明之試劑’它使得直接以單一的步驟來測定在 细胞培養中表現出蟲螢光素酶之活性成為可能。此試驗一 -18- (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁)\ -丨裝. 訂_ 丨線· 本紙張A度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（21〇 X 297公货） 81.10.20,000 A6 ______B6_ 五、發明説明（Π ) 方面由清潔劑來溶解细胞，而另一方面它含有蟲螢光素酶 反應所需要的受酶質。依據此試劑，與其被選用物質的含 量•獲得特別持久的光線訊號，使得在加入試驗後於2到 20分鐘的期間内能夠測定蟲螢光素酶的活性。而且在它準 備-到-使用的狀態下，此試驗能維持至少一週的穗定性 。此試劑由基本緩衝溶液所構成，它含有諸如麥黃酮、 HEPES 、甘胺醯甘胺酸、磷酸鹽、三羥甲基胺基甲烷 (Tr is)之類的適當緩衝物質，較佳的是麥黃酮（Leach和 Webster, 1986)。緩衝液的出值在6到9的範圍内，最好 是在7到8之間。而且K在10到0 . 1克/升之間的濃度將 鎂鹽，最好是水合硫酸鎂（MgS〇4，7H2〇)，加至此緩衝液 中，較佳的濃度是4克7升。_蟲螢光素晦反應所#的受酶 質，最好K下列濃度存在.：f - 從0 . 05到5克/升，最好是克/升的腺核苷三磷酸 (ΑΤΡ);從0:001到〇.1克/升，最好是0.015克/升的 蟲螢光素。此緩衝液可額外地含有複合形式物，像是乙二 胺四乙酸二納鹽（EDTA)，Μ約0.2克/升的含量存在。 較佳的基本緩衝液（加上蟲螢光素晦的受酶質）由25毫 莫耳/升麥黃嗣、0.5毫莫耳/升EDTA、16.3毫莫耳/升 MgS(K· 7Η20 、1.2 奄箅耳 / 升 ATP ，Μ 及 0.05 毫奠耳 / 升蟲螢光素納鹽所姐成。 _ 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 為了使蟲螢光素酶安定，使用諸如二硫蘇糖醇（DTT)或 /3 -锍基乙醇之類的溫和有機遨原劑’單獨或Μ與其他堪 原劑一起的混合物型式來使用。這類遛原劑預防此酵素上 -19- 81.10.20,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第3 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中·»說明喜锪TF W (' 84年9凋） Β7五、發明説明（)….Ί修正 84. 9. 无 存在的S Η -基進行氧化作用，Μ及在發光反應的期間，蟲 螢光素酶必然產生的失活作用。Κ 0 . 1到50克/升之間的 濃度來使用DTT.，最好是1克/升：ΒΜΕ則Μ 0 . 1到50毫 升/升之間的濃度來加人，最好是4毫升/升。 為了使此發光反應穩定並増強，可以額外地使用三瞵酸 納（N a Τ Ρ Ρ )，並以在0 . 0 0 5到5克/升之間的濃度，最好 是0.2克/升來加入。利用焦磷酸納來代替三磷酸鈉也是 可能的。 使用適當的清潔劑，諸如三通X - 1 0 0 ( T r> i t ο η X - 1 0 0 )、 吐溫2 0 ( Τ w e e η 2 0 )或3 0、Ν Ρ 4 0、Β r i j或其類似物來溶解細 胞。K 0 . 0 1到5 之間的濃度來使用三通X - 1 0 0 ，較佳的是 0 . 1 :¾ . 當構築感覺D !丨ί\時，在控制姐成之情況下，最好是能K 一個或多個接在前的T R Ε -或C R Ε -調節要素來調節的弱啟 動子要素的控制之下，放置報告基因--藉著暫時性地轉化 帶有不同慼覺DNA質體结構的細胞，一方面改變報告者基 因，另一方面改變控制序列《再對其敏感性來審查報告者 基因產物的大小，決定出最合適的感覺D Ν Α结構。.諳熟此 藝者熟知在持定之哺乳動物細胞中適宜用於表現的控制序 夕fj _ ;可從有關的文獻中ί.例如：L a n d s c h u i z e t a i .,. 1 9 8 8 , 1 u「n e r和；Γ j U n , 1 9 8 9 )開始進行選擇，再依據前述 容易完成的暫時轉移感染之賁驗，可縮小或改良這些選擇 品。適當啟動子的實例為/3 -血球蛋白敔動子及1’ K -啟動子 :若需要則修改已知的天然或合成啟動子，例如：將它們縮 .(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 、\=σ 線 - 2 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 短成啟動子功能上所需要的最小序列。若需要亦可使用會 被cAMP或IP3/DAG誘發的基因之調節序列，此基因含有啟 動子及調節要素（Montminy et. a〗.，1990，Deutsch et al.，1988)，例如：ICAM-1基因的V端調節序列。 通常憑經驗來選擇感覚D ΝΑ内所含有的調節序列（ CRE-或TRE要素，包括其側面相接的序列），從由文獻上 得知的要素（參見例如：Montminy et al., 1990， Deutsch et al.，1988)開始，Μ預備實驗來審査選出的 調節序列，在特定的細胞系統方面，它對於提供敏感到能 査出的報告者基因之可誘導性上的適用性。包括其側邊相 .接之序列的適當調節要素之實例為生長激素釋畋抑制因子 、、影響血管之腸胜狀（v"asoactive intestimal peptide) "、巨细胞病毒加強子、·牛白Γ血-病病毒之長末端重複段 (BLV LTR) (CRE-要素），Μ鸯-ICAM-l、膠原酶、副甲狀腺 荷爾蒙（TRE-要素）諸序列。如果在天然序列中所含有的 TRE -或CRE -主題沒有完全一致的序列，藉著調換一個或更 多的核苷酸，可Μ將它們，和視需要選用鄰近它們的序列 加Κ改變。 這些調節要素（TRE-或CRE-要素）及與它們側面相接的 序列，可由合成方法來產製，或可Μ是天然來源的。若使 用的是一種已知其會依據細_型式來對cAP Μ或/或 I P 3 / D A G反應的天然序列（k a r:i η , 1 9 8 9 )，則可藉著用例 如ΤΡΑ和佛斯寇林來處理預備試驗细胞，如同對此序列反 應產生的2级傅信者之審査方式一樣地在此種預備試驗细 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發） silo.?n non 請 先 閱 面 之 注 意
S 頁 裝 訂 線 五、發明説明C20 A6 B6 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 胞中審査該序列。 感覺DNA可能含有一或多個CRE-要素再加上一或多個的 TRE-要素。利用這種感覺DNA ，將^出一種或另一種訊號 傳遞途徑獨自的活化作用，或兩涸訊號傳遞途徑平行發生 的活化作用。 為了強化IP3/DAG及/或cAMP在報告者基因表現上的調 節效果，可視需要選用含有縱向排列之數個調節的CRE-及 /或TRE-序列的结構。此調節序列最好含有3到12個 TRE-及/或CRE-要素。當排列结構中的各個要素時，選擇 TRE-及/或CRE-要素彼此之間相關的間隔，要.能夠確定轉 錄因子可結合在CRE-或TRE-要素上。K預備試驗靠經驗來 決定調節TR E -或CR E -要_素彼此-之間最合適的間隔，此間隔 也可用空間排列（steric -ar r-ΣΤί g_ement)的光線來決定，那 也可K是依照其他影響轉錄作-用之調節D N A要素而來的間 隔，例如：依照TATA -盒子。這些TRE -或CRE -要素及/或與 側面相接的序列可Μ是完全相同或至少有部分不同的’對 於縱向排列的结構而言，後者的具體實胞例是較佳的。 因與CRE-或TRE-要素側面相接的序列，也已經被發琨會 影響CRE-或TRE-要素的調節性，所Κ最好使用此序列，特 別在其直接郧近之處•這些序列天然地圍繞在特定調節要 素的周圍（Montminy e t a 1 . , 19 9 0, Deutsch e t a 1 ., 1 9 8 8 )。憑經驗來決定這些序=列或其排列方式。 選擇作用所使用的感贽DNA之要素及標記基因可能被發 現在兩個分開的質艄上’當其中一個含有報告者基因之構 -22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 2E)7公釐） 81.10.20.000 讀 背 之 注 項 再 塡 頁 裝 訂 線 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中々說明書修ΙΗ頁（84·年9月；^ B7 修{F 五、發明説明（） 年月女' iU· Q 25 補允^ - 經濟部令央標準局員工消費合作社印製 造（包括含有調節序列的表現控制序列），這時另一個質 體則含有選擇標記基因構造。 適當之選擇標記基因構造的實例為質體P R S V n e 〇、 pSl/2neo、pRS Vgpt、PS V2gpt ，可在相關的手冊（洌如： "無性繁殖之載體〃）中找到它們的结構。若使用分開的 質體，則细胞要用兩個質體來共同轉移感染•並依據標記 來選擇细胞。選擇標記的存在導出該细胞也含有報告者基 因结構的结論，因為已知位在D N A片段上彼此不是天然連 结的兩個基因，其共同-轉化作用經常會導致兩個共同轉 化基因的表現（Wi η n a c k er , 1 9 8 5 )。 關於在試驗過程中要使用的測定系統，改良測量訊號最 大限度之變化與正常值之間的比例是較明智的 > 最好是經 由改變感覺D N 的结構，例如：藉著對啟動子之排列進行 構造上的更改。而背景訊號最好低至能查知具有高度敏感 性之報告者基因表琨的誘導作用，.但在同時，背景訊號也 必須高到足K使其能決定關於負對照姐的查知界限。 對於受體㈣A结構，基本上應用與對感覺D N A结構一樣 的考量，除了受體序列最好在一強有力之組成敢動子的控 制之下被置入。同樣地在受體D N A的案例中，若需要也可 將編碼產生受體和優勢選擇標記的序列放置在兩個分.開的 質體上，以此二質體來共同轉化细胞。 藉著傳統轉移感染的方法（：參見冽如：P 〇 t t e r e t al., 1984； Feigner et al., 1987 )，來完成 M 感覺 D H 或受體D N A對细胞的轉移感染，較佳的方法為電孔法 -23 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝 、\=口 線 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 B6 五、發明説明（22 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) (electroporation)、磷酸鈣沈澱法及脂感染法 (lipofection)。 —般而言，為了得到預備試驗细胞，首先K感覺DNA來 轉化細胞，然後Μ受體DNA來轉化預備試驗細胞而產生試 驗细胞。 最好改良感覺DNA的结構，使它藉著預備試驗或試驗细 胞的簞一特定效應物系統能達到最大的可誘導性，此目的 是要在經由其他效應物糸統時只得到最低限度的可誘導性 。因此TRE-試驗细胞最好是專一地對Μ受體依賴方式來調 節磷脂酶C -訊號傳遞途徑之物質有反應。為了排除試驗物 質的受體獨立之影響，如同已經解釋過的，將相對應的 TRE-預備試驗细胞與此物質平_行處理。為了使宣告物質在 碟脂酶C -效應物系統上的專c性滅為可能，可視需要來完 成一作為負對照姐的測定「中'將預備試驗细胞KCRE-感 覺DNA來轉化，並額外地將由此而衍生出的試驗细胞Κ同 樣的受審査受體來轉化。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 為了監視由已發現之物質來審査的關於受體（或受體次 單元）在鱗脂酶C -訊號傅遞途徑上之影響的專一性，必需 在Μ其他不同受體轉化的TRE -預備試驗细胞上，用該物質 加Μ處理而便利地完成更進一步的對照試驗。若一物質僅 容許特定地影锻一個受體，則它鼷於與藥物之專一性有關 的實例，而此物質僅能調節這「一個受體。 為了得到TRE-試驗细胞，適合用在TRE-預備試驗细胞之 轉移感染作用中的受體，是那些能夠與磷脂酶C-訊號傳遞 -24- film 9A ΠΛΠ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公饪、 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23 ) 途徑連结的任何受體。這些受體包括：αι-型的α -腎上 腺受體（腎上腺素）-受體、血管收縮素受體、心房利納 尿的（atrionatriuretic)胜肽.受體、蠶素受體、（血管） 舒緩激肽受體、縮膽囊肽及促胃酸激素受體、內皮素 (endothel in)受體、促進新陳代謝之激態胺基酸受髏、姐 纈胺受體（HJ、5-羥色胺受體（5-HTlc、5-HT2)、白三烯 素受體（LTB4、LTDd、蠅蕈鹼之乙醢膽鹼受體（}^、M3、 MB)、神經胜肽Y-受體（也稱PYY、NPP)、神經牽張素 (n e u r 〇 t e.n.s丨η _)受體、P A F (血小板活化因子）受體、類前 •列腺素（prostanoid)受體（ΕΡα-s、FP、TP)、卩2嘌呤受體 (P2伽偶）、（血管）加速激肽（tachykinin)受體（NIU、 2、3)、血管加壓素及催產素受體（ViA、V1B、0T)、凝血 酶受體等等。這些受體中.許纪也可與其他像是腺苷酸環化 .酶之類的效應物連结。上述體和其他適合的受體，K 及其上連结了受體的效應物，可在專家文獻中找到；摘要 則可在Tips受體命名補充（the TiPS Receptor Nomenclature Supplement), 1991 中找到0 會活化磷脂酶C ，並因此可被用於本發明有關受酶質细 胞轉移感染作用之範圍内的非G -蛋白質連结受體，其實例 為下列族群中的一員：FGF -受體、胰島素受體、PDGF-受 體、EGP-受體等等（丨丨 Hrich^Schlessinger，1990)。 能夠連结在腺苷酸環化酶效.應物糸統上，並可為了獲得
體： 受括 的包 胞例 细實 驗其 試。 備到 預找 E-中 R 1 C 9 染19 感， 移充 轉補 來名 用命 被體 而受 胞PS 细Ti 驗在 試能 E-也 R 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁- i裝- 訂， •線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（24) 腺嘌呤核苷（Αι、A2)的受體、腎上腺素（卢-及〇(2-型） 受髏、多巴胺（D〇_、D21( = D2A) 、D2S(D = 2B))受體、組織 胺酸（H2-型）受體、5-羥色胺（5-ΗΤα 5-HT1D-型、. 5-HT4)受體、乙醯膽鹼（Μ2-^Μ4-型）受體以及腦髓苷 的受體。 (若欲使用的受體尚未經無性繁殖，或其cDN Α不能用在 相對應的載體上時，可藉著例如：在cD AN或基因姐銀行中 篩選並將其無性繁殖，來獲得此種受體DNA 。） 若受體以負面性地連结在腺苷酸環化酶（例如：M2-或 M4-型的乙醯膽鹼受體，神經胜肽Y-受體），也就是說此 受體的活化作用導致CAMP-澹度降低，則如下法適當地測 定cAMP -濃度上的降低Γ將细胞Μ試驗物質來處理，若它 是主動競爭的物質，則活.化受=體-，结果為c AMP-量的降低 。同時或可能在稍後，Μ已&會增加cAMP-湄度的物質來 處理此细胞。相反地，也可能先增加cAMP-湄度，然後再 完成细胞與被審査物質一起的培養過程。（cAMP-量的增加 ，可藉著例如：使用佛斯寇林直接來完成之，或是間接地 藉著將细胞Μ對正性連结於腺苷酸環化酶之受體具有競爭 作用的物質來處理而完成。此受體是内源性受體或用來使 细胞共同轉化的受體。）如同對照姐，Μ全同的培養狀況 來供給一平行的試驗，其中Μ測定cAMP-濃度上的增加。 對應於cAMP-湄度降低的訊號「值差異•可Μ被歸因為該物 質的活性；即為受體依賴性腺苷酸環化酶活性降低的程度 。如果天然存在於該细胞中之c AMP-湄度非常低，且因而 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 ----------------------裝-------玎-------線 -· ; ί 、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)f A6 B6 五、發明説明（25). 使該濃度的降低不能由 苷酸環化酶連結作用對 受體的活化調節了腺 ，磷脂酶C-訊號傳遞途 使甩於本發明的範圍內 湄度上的改變有反應（ TRE-要素的轉錄因子被 酸環化酶效應物糸統也 由漏話產生此訊號或部 在细胞用受體DNA的 用已知的放射線活性標 來審査此正性無性繁殖 藉著斯高恰德墨點法 Pharmacology, 1991) 的數量。 一無性繁殖糸所具有 那些選自含有受體DNA 度。（如果受體數量過 的連结反應產生，除了 測定儀器査知*則必須K負性的腺 受體活化作用進行間接的測定。 苷酸環化酶效應物糸統，除此之外 徑，特..S!L藉著漏話作用，也可K被 。若感覺-DNA受體只會對IP3/DAG TRE-感覺DHA)，則只有在結合於 活化時，才會產生訊號。是否腺苷 是以平行地方式被活化，與是否經 分訊號是不相關的。 轉化作用之後，使用例如：其中利 示競爭物及拮抗物的结合分析法， ^糸對於·該受體的表現反應。 (S-catEtiard blots) (Human 可測考-‘個细胞中受體在分子方面 的受體數目最好儘可能精確地符合 之穩定轉化细胞中生理上的受體濃 多.，則可能有不完全的及非專一性 專一性的連结之外，非專一性連結 一 I 請/ I 先I 閲 f 讀 背-I 之 注 $ 項 再 頁 裝 訂 線 經濟部中央標準局S工消费合作社印製 反應也可出現，並可能在同時活化了其他的效應物系統。 若受體數最太少’則訊號可韩會過低而無法κ測定方法檢 出° ) 受鵂或受髁次單元可以被轉移感染到兩個不同的預備試 驗细胞中，其中之一對IP 3'/DAG濮度有反應*同時另一個 一 27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20.000 五、發明説明（26 ) A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 則對cAMP-濃度有反應。 個效應物糸統有專一性的 酸瑁化酶效應物糸統來看 徑而被專一性地活化，這 會增加cAMP或IP3/DAG濃 處理，例如：氟斯寇林及 可將细胞僅Μ感覺DHA來 的轉化反應，要不然也可 項案例中，培養液不應含 已經確定此细胞僅對佛斯 下，用CRE-試驗细胞重覆 分析。）藉著比較在特_定 對IP3/DAG和cAMP有反應 特定受體（次型）所獲得 可被歸因為漏話作用，以 個的影響需放置多少訊號 針對其可能的藥理學活 的物質，為天然或合成的 合物均是可能的（例如： 特定而言，純物質可Μ是 査知濃度的最大可能範圍 地應用於细胞上。憑經驗 知的受體競爭物來處理特 出受體基因表現的誘導作 (對等使用的 感覺D Ν Α來檢 出它是否裝著 種檢査方法是 度或是會剌激 TPA 。為了進 轉化，在這種 與受體DHA進 有任何會活化 寇林反應，則 M TRE/受體-的TRE-细胞及 的試^姻胞中 的^-料，.使確 及對於兩個效 成為可能。 性而Κ根據本 物質，且使用 蔬菜萃取物、 低分子的合成 ，Κ 一糸列地 細胞，係以對另 査，例 cAMP- 經由將 濃度增 行這些 案例中 行共同 受體的 必須在 轉化细 特定的 ，使用 認何種 應物糸 如：用腺苷 訊號傳遞途 细胞分別以 加的物質來 預備試驗， 不需要穩定 轉化；在後 物質。萬一 相同的狀況 胞所完成的 CRE-細胞與 特定物質及 程度的訊號 統中單獨一 發明之方法來審査 純物質或物質的混 發酵液等等）。更 有機化合物。為了 稀釋將此物質便利 間，例如藉著以已 ，並從可再現地測 來決定培養時 定的試驗细胞 用，來決定此時刻。一般在此時 -28 本紙張尺度適用中國园家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.10.20.000 請 先 閲 背 之 注 意 事 項 再 塡 頁 裝 訂 綠 五、發明説明（27) A6 B6 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 終止培養時間*且通常總共至少一個小時。試驗细胞的絕 對數目不需吹毛求疵。细胞的數目將特別依賴測定訊號的 檢查限制，Μ及細胞所在的生長階段，藉著將细胞均一地 分布在試驗單位的技術上可能性來決定底限。若使用具有 96孔的微量滴定盤，則细胞數目將為例如：毎試驗單位約 20,000到約200,000個细胞，但若測定的訊號足夠敏感， 且能確實地來分布細胞，則细胞數目可較少一些。使细胞 進行試驗時其所在的生長階段，係依據起始细胞的细胞-型式-特定性質；而且藉特殊的受體預先加Κ決定（依據 生長階段，在不同的受體上可Μ不同方式來活化相同的效 應物系銃，或活化成不同的強度）；因此用預備試驗，藉 著測定受體基因在不同"生長階-段之預備試驗细胞及試驗细 胞上的表現動力學，也可-憑經I驗-來決定细胞的生長階段及 數量。 上.-- 在本發明範圍中，已經有可能証明：M TR Ε -感覺DaM來 轉化的不同細胞（TRE-預備試驗細胞）會對已知能剌激 DAG之物質的增加有反應（此增加即相當於由磷脂酶C -的 活化作用所引起细胞在DAG-含量上的增加），其中包括報 告者基因的表現，在此期間瑄些细胞對使c AMP-增加的物 質沒有反應。（此感貨DNA含有作為調節要素的1 , 300個 鹼基之人類ICAM-1基因的5’竭側面相接區(佃胞間黏著分 子1)，它含有TRE -要素，或_縱向排列之ICAM-1基因的大 部份TRE-要素）。當K特定地連結於磷脂酶C-訊號傅遞途 徑的受體（使用人類5-HT2受體、神經激肽2-受體及人類 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準_(CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 請 先 閲 讀 背 © 之 注 意 事 項 再 塡 頁 裝 訂 線 A6 B6 五、發明説明（28 ) M3-受體）來轉化TR.E-預備試驗细胞時，並經受體競爭物 處理之後，測定出蟲螢光素酶基因的表現；這種由競爭物 傳達的的誘導作用，可藉著加入拮抗劑來使之停止。另一 方面，若磷脂酶C -連结受體在對CAMP有反應的預備試驗细 胞中被表現出來，則此作用不會被査覺。 在本發明的範圍内，也顯示出在MCRE-感覺- DNA轉化的 CHO-细胞（CRE-預備試驗細胞）中，只藉著會增加cAMP濃 度的物質來增加CRE-調節受體基因的表現。此種利用會引 起或剌激IP3/DAG-濃度上的増加之物質對CRE-預備試驗细 胞的處理，不產生蟲螢光素酶表現的誘導作用，而K對多 巴銨或蠅輦鹼乙醯膽鹼受體為競爭物之物質來處理也不產 生誘導作用。後者的结-果顯示.：細胞不會内源性地表現這 些受體。當K正性地連结-於隨，備環化酶效應物糸统的受 體（使用多巴胺1K-受體）考移感染CRE -預備試驗細胞 時，用對MDi-受體而言為競爭物者來誘導蟲螢光素的表 現，並藉著拮抗劑再度停止此誘導作用是可能的。 經濟部中央標準局®工消費合作社印製 藉著本發明的幫肋，可提供對所準備的物質一種敏感且 多功能的方法，此物質在细胞中以受體依賴方式特定地影 繼一訊號傅遞途徑。.藉著根據本發明之方法所發現的物質 ’對治療有關於訊喊傳遞途徑功能不良之疾病的藥物發展 上可作為有肋益的引導物質，其後並可對它們藥理學上的 性質進行更進一步地研究，例如：利用原始细朐進行第二 次篩選，並僅可在那樣之後，才對動物進行臨床試驗。因 此藉著使用根撺本發明的方法，將大大地減少所需動物的 81.10.20,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（29 A6 B6 數目。 根據本發明的方法，在细胞培養容器 96孔的微量滴定盤，試驗物質溶液的裝 步驟，遲有測量方面，也具有能夠使之 ，例如：當使用蟲螢光素酶作為報告者 用發光計，而由自動機械來完成。因此 ，適用於具有高生產能力、具有試驗可 例如：每週有2 0 0 0個物質或物質的混合 藉著根據本發明之方法的幫助，使得 質及對於配體结合位置有非競爭性活性 此糸統更佳的儍點為：對於一特定的 细胞內訊號傳逓途徑，名具有.數種物質 處，較有希望査知調節特定訊^傳遞途 與可使用大量受體和受體次聖：·有關的糸 統能夠就不同型式的需要而被用來發現 質。藉著有計劃地選擇特定的受體和受 本發明的糸統，也使得在不同的细胞糸 之間主要的專一性來區別成為可能’例 和周圃神經系统。 藉著根撺本發明之方法的幫助’也可 理學上或生化上具有特徴且曰知配艄的 的裝填 載、培 成為自 基因之 根據本 能性的 物需要 査知異 的物質 多階段 介入的 徑的最 統多變 藥理學 體次型 統中以 如：中 ，例如有 養及沖洗的 動化的優點 產物時，利 發明的方法 篩選計劃， 篩選。 位作用的物 成為可能。 受體依賴性 可能方式之 佳變數。而 性，使此系 上的活性物 ，這種根據 關鍵性機制 樞神經糸統 能無性繁殖出在藥 受體。將與cDNA或 請， 先 閲 I 背- 之 注 事 項 再 3 Λ 裝 訂 線 經濟部中央標準局β工消費合作社印製 預之 的了 應化。 對活現 相被表 至而的 化用體 轉作受 子合該 縱结表 操體代 .的配.來 始由璃 開經表 起體的 1 受因 庫在基 因。者 基内告 之株報 池胞著 些細藉 那驗便 自試， 來備後 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20.000 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 中1Γ說明害孩FFW (84年9月Α7 B7 五、發明説明（
經濟部十央標準局員工消費合作社印製 圖Η冃鏹 圖 1 ： 質 體 P A D n e 〇的结構 圔 2 ： 質 體 P A D n e ο T K结構上在 PCR 之 後 的 Bg 1 I I - Bam HI 片 段 圖 3 ： 質 體 P A D n e ο Τ Κ 圖 4 A ： 質 體 pADneoTKl u c ί 圖 4B ： 質 體 pADneoBG 1 u c i 圖 5 ： 質 體 pRc/RSVA Nae I 之 结構 圖 6 ： 質 體 pRc/RSVne 〇之結構 圖 7 . 質 體 pADneo2BG 1 u c i 之 結構 圖 8 ： 含 有 3個C R E -要素的寡 核苷 酸 序 列 圖 9 ： 質 體 pADneo2-6C-BGL的 结構 含 有 6 個 CRE -要 素 圖 10 ： 質 體 pHEBo 圖 11 ·· 質 體 P290 圖 12： 質 體 pAHygCMVl 圔 13 ： 質 體 pAHygCMV2 圖 14 ： 質 體,ρΒΗ 1 ucl . 3 λ* 圖 15 ： 質 體 P A D n e o (1 . 3 I C A M ) 1 u c i 含 有 I C A Μ - 1 基因的 5 ^ 端 調節序列 圖 16 ·· 質 體 P A D n e ο (' 3 T R E ) B G 1 u c i 含有I C A Μ - 1 基.因的 3 個 T R E -要素 圖 17 ： mi- 貝 體 P A D - C Μ V 2 - 5 Η T 2 > 含有 編 碼 產 生 5ΗΤ2 (5 -羥 色 胺 2 )受體的序列 圖 18 ： 質 體 P A D - C Μ V 2 ·· D 1 ，含 有可 編 碼 產 生多巴 胺 -32 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 經濟部_央標準局員工消費合作社印製 第8 11 Ο 9 5 2 7號專利申請案 Φ V銳Bfl喜修iF苜(84年9月λ7 Β7 五、發明説明（：年月^赍手 84 9. 25補充 ' -D α -受體的序列 圖19Α: 質體pAHyg-NK2，含有編碼產生ΝΚ2-受體的序列 圔1 9 B : 質體p A H y g - 5 Η T 2，含有編碼產生5 Η T 2 -受體的序 列 圖20: 在细胞株Α549、HeLa及C0S-7中，由ΤΡΑ對 T R E -感覺-D N A ( p Β Η 1 u c 1 . 3 )的誘導作用 圖2 1 A : 年H e L a细胞中，由T P A引起但不會由佛斯寇林引 起對TRE-感覺-DNA(pBH1cu 1·3)的誘導作用 圖2 1 Β : 在C 0 S - 7 -细胞中，由Τ Ρ Α引起但不會由佛斯寇林 引起對TRE -感覺- DNA(pBH1uc 1.3)的誘導作用 圖22: 在细胞株/\549、HeLa及C0S 7中，由TPA引起但 不會由佛斯寇林引起對TRE-感覺-DNA (pADneo (3 T R E ) B G U c i )的誘導作用 圖23A: 在C0S 7-细胞中，由TPA引起對TRE-感覺的 誘導作用，此T R E -感覺D N A中含有3画或6個 T R E -要素，且彼此之間有不同的間隔 圖23B: 在冉5,4 9-细胞中，由了？&引起對了1^-感凳〇^的 誘導作用，在此TRE -感覺DNA中’含有3個或6 個T R E -要素，且彼此之間有不同的間隔 圖2 4 : 在C 0 S 7 -细胞中，藉著使競爭上有作用的物.質结 合到蠅輦鹼Μ 3 -受體上，對T R E -感覺D Η A (p A D n e ο ( 3 T R E ) B G 1 u c i )所引起的誘導作用 圖2 5 : ί\)藉著將具有競爭性作用的物質，與以5 H g 體D Μ A來轉化的C 0 S 7 -細胞上的5 Η T 2 -受髏·结合 -33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） 83.3.1〇*〇00 {請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝---------訂-------〇Γ線 A6 B6 五、發明説明（32 ) 後，對TRE-感鱟-DNA(pBH1uc 1.3)的誘導作用 B)對於K5HT2-受體DHA轉化之COS 7细胞上的 5 Η T2-受體，具有競爭性作用的物質’無法引發 CRE-感覺DHAipBHluc 1.3)的誘導作用 圖26: A)會受TPA引發，但不能由對K多巴胺-受體 DNA轉化之COS 7細胞上的多巴胺h-受體，具 競爭性作用的物質來引發針對TRE-感覺 -DNA(pBH1uc 1.3)的誘導作用。 B)由佛斯寇林藉著將具有競爭性作用之物質，與 利用多巴胺-D1-受體-DNA來轉化之COS 7-细胞上 的多巴胺-D1-受體结合，對CRE-感覺-DMA (pADneo 2-C6'-BGL) -的誘導作用 . 圖27 : 在TRE-預備試驗_细_-A20及表現人類神經激肽 2受體的TRE-試驗啤胞株NK2-122中，對轟螢光 素酶表現的誘導作用 圖28.: 藉著HK2-專一性競爭物，對蟲螢光素酶誘導作用 的動力學 圖29A: 依據由神經激肽引起的人類神經激狀2-受體之活 性，所得的蟲螢光素酶活性的劑最-活性曲線 圓29B: 依據由對神經激肽受體而言為競爭物之物質引起 的人類神經激肽2-受體之活性，所得的蟲螢光累 酶活性之劑蠆活性曲_線 圖30: 由NK2 -専一拮抗物引起，對神經激肽a之競爭活 性的抑制作用 -34 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（33 ) 圖31: 在能表現出5HT2-受體的試驗細胞株中，5-羥色 胺·誘導的蟲螢光素酶表琨之動力學 圖32 : 蟲螢光素酶活性的劑量-活性曲線，按照人類 -受體，對競爭物引起的活化作用之函數 圖33: Μ各種改變cAMP-或IP3/DAG濃度或在濃度方面 刺激使之變化的物質，或Μ受體-專一的競爭物 ，對CRE-預備試驗細胞（MpADneo 2-C6-BGL穩 定轉化出的CH0 -细胞）的處理 圖34: 由佛斯寇林引起的在CRE -預備試驗细胞中蟲螢光 素酶基因活化轉錄作用的劑量活性曲線 圖35A: CH0-细胞中蟲螢光素酶誘導作用的動力學，按照 佛斯寇林之劑·量的函數 圖35B: CrtO-细胞中，蟲.營危案酶之誘導作用的動力學， 按照佛斯寇林劑量还i數（EDs〇 (50¾有效劑量） 的大小） 圖3 6 : Μ各種物質對K C R E -感覺I) N A和K多巴胺-D α -受 體D H Α來轉化的C Η 0 -預備試験和試驗细胞所進行 的處理 圖37Α、37Β及38Α、38Β:蟲螢光素酶活性的劑最活性曲線 ，按照多巴胺-D, -受體之活化作用的函數 _ 39 A、39Β :蟲螢光素酶活的劑最活性曲線，按照多巴 胺-D5-受骽之活化作湎的函數 圖40 : 為了測定蟲螢光素酶的活性而改良的試劑 藉著下列的茛例來更完全地解釋本發明： -35-
- - ΙΓ· ,(請_先閲讀背·面之注意事項再塡寫本頁〕AC i裝. 訂. ¾ 線. 本纸張K度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20 000 第3 1丨Ο 9 5 2 7號專利申請案 中々說明害修TF百（34年9 $ ) Β7 五、發明説明 9. 2 5 年爲 a 修正. 性）的拮抗劑 在下表中提mi.中_所奮胸fc物質之作用 A 2 3 1 8 7 C a 2 +離子載體 阿樸嗎啡（A ρ 〇 m 〇 r p h i n e .) 多巴胺受體的競#物 阿托品 (Atropine) 蠅簞鹼受體的拮抗劑（非專一性的 溴麥.角環狀（B r 〇 m 〇 c r y p t i η ) 多巴胺-受體的競物 碳醯膽鹼（C a r b a c h ο 1 ) 蠅簟鹼受體的競爭物 氯氮平（C 1 o z a p i η )多巴胺-受體（ 雙 丁醯環腺苷酸（d i b u t y r y 卜 c A Μ P :) (: d b c A Μ P ) 可通過细胞膜的c A Μ P衍生物 度巴明 （.Dopamine.) 多巴胺受體的競#物 三氟曝噸（F 1. u p e n t h i X ο 1 ') 多巴胺受體（.D x -專一性：）的拮抗劑 .(請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝 佛斯寇林（F o r s k ο 1 i η .) 氟哌唾醇（H a 1 o p e r i d ο 1 ) I β Μ X 凱特色寧（Ketanserin) 腺苷酸環化_的剌激劑（增加c A Μ P ) 多巴胺受體ί D 2 -專一性）的拮抗劑 磷酸二酯酶之抑制劑（累積c A Μ P :) 羥色胺受體（5 - Η T 2 -專一性）的拮 •訂 經濟部令央標準局員工消費合作杜印¾ P M A (； T P A ) 蛋白質激_ C的活化_，刺激 ' I P 3 / D A G . SC Η 23390 多巴胺-受體U) i -專一性.）的拮抗劑 5-羥色胺（5-HT) 5-羥色胺+受髏的競爭物 虫累環咲哌®嗣（S p i r 〇 p e r i ci ο 1 ) (=螺環呋哌唾銅（S p i p e r ο n ))拮抗劑 - 3 6 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 線 五、發明説明（35) SKF-38393 A6 B6 (5-htla -受體〉多巴胺受體） 多巴胺-受體（Da-專一性）的拮抗劑 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例1 在晡乳動物细胞中報告者基因表現所用之基本載 體的製備 a)質體pADneo的構造方法 由質體 pBIuescript SK+(Short et al.，1 988; Strata gene, La Jolla, CA)及 pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA:分類號碼 No. V7 5 0-20)的一部分，在：ϋ 稈爾中製備含有複製起點（ori)及對安比西林抗藥性 (Amp, /3 -内醢胺酶）之選擇標記的質體。這個基因間的 M13區域，使得在以協助者噬菌體（例如R408或M13K07; Stratagene)轉化之细售的超_感染作用中*促進質體DNA 的排列順序和突變之後製傅T單锻的質體DNA成為可能的 。然而，在SV40早期啟動子（jv/ 40)及SV 40聚腺苷酸化 作用訊號（SV40 poly(A))的轉錄控制之下，也存在有新徽 素-磷酸轉移酶的基因（neo)。 KHind ϋ 使質體pBluescript SK+形成直線《，並將 100微毫克的DNA置於100微升PCR混合物（Saiki et al.， 1988)(反應介質：50mM KC1、 10mM ρΗ8·3之 Tris-Cl 、1.5raM MgCU、0.01：Κ(ν/ν 重量 / 體積比）明膠 、四種去氧核苷三磷酸（dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP)各 0. 2mM ;每〗〇〇微升2.5單位—Taq聚合酶）中。所使用的 引子由合成的寡核苷酸E B I -〗7 3 0 (序列識別號：3 ) (5 ' -r,fiAATTCGCGCCCTGTAGCGGCG-3 ')及 E B I - 2 1 3 4 (序列識 -37- 本紙張尺渡適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公势） 8L10.20.000 請- 先 閲 讀 背. 面 之 注 裝 訂 線 A6 B6 五、發明説明（36 ) 刖號：4) (5 ’ - CACTGAACJLCJIMXAGCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCC-3，）各 50微微莫耳組成。5分鐘後完成1〇次循環Μ上的在94T： PCR中之變性反應（循環條件：在94¾需40秒、55Τ需 45秒、72t：需 5 分鐘，Perkin Elmer· Cetus熱循環器）。 寡核苷酸與Ml 3之基因間區域或帶有/3 -内醸胺酶之調節 者基因的複製起點（ori)的側面相接。同時在〇ri之一端 產生X hoi-切開位置，在另一端產生EcoRI -切開位置（寡 核苷酸序列中下標線的部分）。藉著用笨-氯仿的萃取作 用，除去反應混合物中的蛋白質，再用乙醇將DNA沈澱。 MXhoI及EcoRI切開所得的DNA ，在瓊脂糖凝膠中進行電 泳之後，分離出2,200领鹼基-的片段。 MEcoRI和Sail雙重地·切敵赁體PRC/CMV ，在瓊脂糖凝 膠中以電泳法分開並分離出食SV40-啟動子、neo-基因 及SV40 P〇ly(A)-訊號的1,500個鹼基片段。在14t：下， 將100微毫克2,200個鹼基的載體DNA ，加上2到3倍量 的1 , 500個鹼基之插人DNA ，M T4 DNA連结酶一起隔夜培 養，而後太陽桿菌..J Μ 1 0 1細胞便能勝任於撿出已經轉化並 選出有安比西林抗藥性的DNA (Chung和Miller，1988) 。 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 從所得的無性繁殖糸，藉著各種限制酶的切開作用，來分 .析質體D N A並將其特徴化。具有想要之结構的質體被命名 為 pADneoi 圖 1) 。_ b )笱體p A D n e ο T i(的構造方法 在質體pADneo中插入單純疱疹病毒I型（HSV-I)之胸腺 _ 3 8 - 81.10.20,000 本紙張A度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公辁） 五、發明説明（37 ). A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 核苷激酶基因的啟動子區域，其K側面貼近兩個聚無性繁 殖（polyc丨.oning)之位置而相接。如同TK-啟動子的前驅 物，使用質體pXl(Wagner et al., 1981)，則藉著在5'-端處延長擴大引子所產生的聚無性繁殖位置，不需再補充 前驅物。使100微毫克的質體pXl與寡核苷酸EB 1 -2983 ( 序列試別號：5) (5 ’ - GACTTClliAJLCJLGCGGCCGCCTCGAGGGTA- CCGTTAACGTCGACAAACCCCGCCCAGCGTCTTG-3')和 EBI-2984 ( 序列識別號：6) (5 ' - GACTTC(LQJJLCiLQ_AGCTCACTAGTTCTAGA- AAGCTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGC-3’）各 50微微莫耳一起接受 2 0次PCR循環（循環條件：在94 υ需40秒、55 Ό需45秒、 72¾需1分鐘）。在利用苯/氯仿之萃取作用移除了 Tag 聚合酶，和DKA的乙醇枕殺反-應後，MBamHI及Bglll切 開末端（下加標線的序列.).，:I經電泳後由瓊脂糖凝膠上分 離出200個鹼基的片段（圖然後將此DNA與Μ BamHI-直線化的質體pADneo連结起來，並轉化女腸捏菌 JM1 01 。所得到的質體，在與neo-基因一樣的方位含有 TK-啟動子，它被命名為pADneoTK (圖 3)。為了無性繁 殖出調節啟動子的調節序列，它在TI(啟動子的5’端處含有 Notl、Xhol、Kpnl、Hpal和Sail的奇妙切開位置，而為了 報告者基因的插入，在TK-啟動子的3'端處則含有丨nndll 、Xbal、Spal、SacI及BaraHI_的奇妙切開位置。 c)質體pADneoTkluci的構造方法 將帶有 SV40 poly(A)區的光頓(Photinus pvralis)蟲 螢光素酶之基因從質體PSV2 3 2AL-ΑΔ5’ （De Wet et 39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.10.20,000 請 先 閱 讀 背 意 事 項 再 場 裝 訂 線 A6 B6 五、發明説明（38 ) al.， 1987) 、 pBHluc(Voraberger et al.，’ 1991)的衍生 物分離出來，它就像一 2,500個鹼基的11丨11〇1111-83111111-片 段。WHindlll和BamHI雙重地切開pADneoTi(，並與來自 質髏？(^】11<:的2,500個鹼基之}1丨11〇1111-83«^1片段相連結 。在大腸圼菌J Μ 101的轉化作用之後，所得到的具有想要 结構之質體，被命名為pADneoTKluci (圖4Α)。此質體在 哺乳動物细胞内，於TK-啟動子的控制之下|容許蟲螢光 素酶的表現。 d) 質體pADneoBG 1 uc i的構造方法 為了改良報告者基因的誘導能力，用最小的兔子/9 -血 球蛋白基因之啟動子序列來代替TK-啟動子。M Sail及 Hindlll雙重地切開質^IpADneoTKluci，並從琪脂糖凝膠 分離出載體成份。利用合成的IS ·核苷酸E B I - 3 1 8 2 (序列識 別號：7) (5’-CACTTCGGATCCG立G-CTCACTAGTTCTAGAAAGCTTG ACGCTGTTAAGCGGGTCGC-3')及 EBI-3184 (序列試別號：8) (5'-AGCTTGTAAGCAGCAGCTGCAGTGCTCTGCCTTTTATGCCCAAGG -3 ’）製備出與S a 1 I和H i n d I I I之可並存端Μ側面相連的 -血球蛋白啟動子。藉著與Τ4-寡核苷酸激酶和ATP —起 培養|在5’端處將這兩個寡核苷酸磷酸化，接著與上述的 載體連结。在太腸稈爾J 0 1的轉化之後，所獲得含有正 確序列之質體被命名為pADnepBGluci (圖4B)。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 e) 質體 pRc/RSVA Nael 和 pRC/_RSVneo 的構造方法 為了在容許帶有SV40複製起點之質體進行複製的细胞株 中使用感覺-DNA (例如：Cos-7(ATCC CRL1651)和 -4 0 - 本紙張A度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（39) '293 (ATCC CRL1 573 ))，想要對於以其他啟動子（例如： 勞氏肉瘤病毒（RSV)之長终端重覆段）來取代SV40啟動子 的其他细胞株進行比較研究，對這個SV40啟動子而言，上 文中描述之質體上的neo基因係在它的控制之下。 為了製備n e〇-基因新的表現盒子，製備下述的質體 pRc/RSVA Hael 和pRC/RSVneo° 用 Nael切開質體 pRc/RSV(Invitrogen，San Diego, (：/\;目錄號碼：7780-20)，從瓊脂糖凝膠中分離出3,800 個鹼基的載體片段，並將其再連结。接著再刪除帶有 neo-基因的1,600個鹼基片段。所得的質體叫做pRc/RSV △Nael (圆5 ) 0 KHindlll和Xbal雙'重地切-開pRc/RSVANae，並藉著接 下來用聚合酶.的Oehow片段（Klenov酶）於四 種去氧核苷酸均存在之下進行;-處浬，將D N A末端弄鈍。 MEcoRV和BstBI雙重地切開質體pADneo ，也藉著後續 的利用K】enow酶進行處理，將DNA末端弄鈍，分離出含有 neo -基因之860個鹼基的DNA片段。在與上述的載體連 结並轉化之後，所得的具有想要结構之質體叫做 pRc/RSVneo (圖6)。此質體在RSV啟動子和牛生長荷爾 蒙（b G Η )的聚腺苷酸化作用訊號，K及S V 4 0的轉錄控制之 下，含有neo -基因。 .. f)質聘p/\Dneo2BGluci的構堦冶法 將pADneoBGluci的表現盒子：SV40啟動子- neo基因 -SV40 poly(A)訊號用來自質體pRC/RSVneo的表現盒子： -41 請 先 閲 之 注 項 再 填 頁 裝 訂
線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（40 ) RSV啟動子- neo基因- bGH poly(A)來取代之。 MXhoI切開質體pRC/RSVneo，並用Klenow酶將DHA末端 弄鈍。將由寡核苷酸EBI-3286 (序列試別號：9) (5'-TC- GATGCGGCCGCGACTTCAG-3')和 EBI-3286 (序列識別號： 10) (5 ' -CTG AAGTCGCGr,nnnCA-3 ')製備出的 X h ο I - N o 11 -改 編子與切下來的pRC/RSVneo DNA連结。Μ此種方式， Xhol-切開的位置會被破壞，並會插入一個Hot I位置（下 有標線的）。在加熱使D N A -連结酶失活之.後，以H r u I和 Notl雙重地切開這個DNA ，並從瓊脂糖凝膠分離出1,540 個鹼基的Η段。此DNA Η段含有RSV-neo-bGH-polyU)-盒 子。 KEcoRI特定地切開'質體pADneoBGluci，用Klenow海將 末端弄直，然後再用Not I.來tfc-從瓊脂糖凝膠中分離出 4,900個鹼基的長DNA片€將.其與上述的1,540個鹼 基之Nrul-Notl-H段連结。在大腸捍菌__的轉化作用之後， 得到了具有想要之结構的質體，被命名為pADne〇2BGlUCi (圖 7)。 g)具有由cAMP調節之要素（CRE-感覺-DNA)的報告者質體 之構造方法 為控制感资DNA對於IP3/DAG(包拮TRE -要素）任何可能 的横向敏感性，要在各種CRE -要素的控制之下放置蟲螢光 素酶受體基因的表現盒子。根1«已特徴化的CRE-要素之性 質（Μ ο n t m i n y e t a 1 . , 1 9 9 0 )來選擇C R E -序列。所選出的 CRE -序列是一方面具有完整8個鹼基長、迴文的一致序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公楚：） 8L10.20.000 I.--------裝------，玎-------線 -! ... (諳先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)〈 ：，，，'11 ____B6_ 五、發明説明（41 ) * TGACGTCA，另一方面，如果可能的話，不再具有GC-配對 之姐合的那些CRE-序列，它顯示出對於在周圍序列中 Spl-轉錄因子之辨認序列（CCGCCC或GGGCGG)的相似性。 許多CRE-序列Μ縱向排列來使用，是為了強化cAMP的調節 作用。如果完全相同的序列出現數次重複作用，則需用不 同CRE-序列之姐合Μ避免在無性繁殖及大腸捍菌之穩定性 方面的不利影響。 藉著在質體pADne〇2BGlUci之/3-血球蛋白啟動子的 5’端插入合成的寡核苷酸，來產生具有3個連續CRE-序列 的兩種質體（pADneo2-C3BVC-BGL和 pADneo2-C3SVC-BGL)， 再藉著混合這些質體而製備出具有6個CRE-序列的質體 pADneo2-C6-BGL ° " 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 利用兩對帶有互補D N A .末端二之寡核苦酸的連结作用來產 製三聯的CRE-序列（圖8)。上將寡.核苷酸EBI-348 9 (序列 試別號：11) (5'GGCAGCTGACGTCACTGTCTGGTGC-3')與 EBI-3491 (序列識別號：12) (5’-CTCCTTGGCTGACGTCAG-TAGAGAGATCCCATGGC-3')各20微微莫耳，在37C下培養於 帶有15個單位聚核驻酸-激酶的15微毫升激酶緩衝溶液（ 70mM, pH 7.6 的 Tris-HCl; lOmM MgCU、5πιΜ 二硫蘇糖醇 、2mM ATP)中1小時，再加熱（在95tT下5分鐘）使酵素 失活。Μ相同的方法，將甚椅苷酸EB 1 -3490 (序列識別號 :13) W-CTCTACTGACGTCAGC—CAAGGAGGTACd')及 EBT-3494 (序列識號別：14) (5’-CGTCATACTGTGACGTCT-TTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAG-3·)的 5·端碟酸化。 -43- 81.10.20,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（42) A6 B6 經濟部中央標準局W工消費合作社印製 將等莫耳量之不含5’端-磷酸根的互補寡核苷酸，與已 經璘酸化過的寡核苷酸混合：EB I - 3 49 3 (序列識別號： 1.5) (5V-GGCCGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGC -3’）與 EBI-3489; EBI-3491 (序列識別號：16) (5，-CTCCTTGGCTGACGTCAGTAGAGAGATCCCATGGC-3，）與 EBI-3490; EBI-3493 (序列識別號：17) (5'-TCGACTCC-CATTGACGTCAATGGGOTGTCTGAAAGACGTCACAGTATGACGQCCATCG GATCT-3')與EBI-3494，並於5610下額外再培養5分鐘。 將10微微奠耳目前已成為雙股寡核苷酸對的 EBI-3489/EBI-3492 和 EBI-3493/EBI-3493 ，於 14¾ 下培 養於帶有1.單位T4 DHA-連結酶的30微毫升連結緩衝溶液 (70bM、pH 7.6 之 Tris-HCl ; l〇mM MgCU、5mM 二硫蘇糖. 醇、1 m M A T P )中過夜，接著fc於？Ot：下使酵素失活分鐘 。在3 7 Ή下於帶有1. 5單位之聚」-核脊酸-激酶的50微毫升激 酶緩衝溶液中，使已連结的寡核苷酸對在5’端處進行磷酸 化作用1小時。 以同樣的方法將寡核苷酸對EBI-3490/EBI-3491和 EBI-3493/EBI-3494連結在一起，然後進行磷酸化作用。 將100微毫克已經用Notl和Ball雙重切開過的質體 PAI)ne〇2BGlUCi ，與0.2微微箅耳已連結好的由 EBI-3489 /3 492/3493/3494姐_成之寡核脊酸複合物，於 221下一起培養於帶有1單位^ DNA_連结酶的20微奄升 連結緩衝溶液中4小時，然後轉化太腸-捍爾-J Μ 1 0 1 °從這 種方法所獲得的質體進行序列分析，而具有想要结構的質 .44 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公发） 81.10.20,000 請 先 讀 背 面.. 之 注 意 事 項 再 i 裝 訂 ，：rrv.、 線 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) 體被命名為pADneo2-C3BVC-BGL (圖9)。此質體含有3 個CRE-序列，係衍生自牛白血病病毒的LTR(BLV)、影響血 管的腸胜肽（VIP)，以及巨细胞病毒啟動子（CMV)。（質 體名係依據這些序列，因此縮寫成WBVC"。） 同樣地，Μ已經由ΚρηΙ和Sail雙重切開pADneo2BGLuci 的質體載體，來無性繁殖EBI-3490/3491/3493/3494之寡 核苷酸複合物，並獲得質體pADneo2-C3SVC-BGL (圖9)。此 質體含有3個CRE-序列，係衍生自生長激素釋放的抑制因 子（Soib)、VIP及CMV 。（質體名亦依據這些序列，並縮寫 為、、SVC〃 〇 ) 為了製備具有6個CRE-序列的質體，WBamHI和Sail雙 重地切開質體pADneo2-T3BVCTBGL ，並從瓊脂糖凝膠分離 出3，8 0 0個鹼基的載體成.份。二另奴BamHI和Xhol雙重地切 - -β— _ 開質體pADneo2-C3SVC-BGL，上而分.離出 2,700 個鹼基的插 入物。連结這兩個DNA Η段，並轉化t腸揑菌。因此獲得 了具有想要結構的質體，被命名為pADneo2-C6-BGL (圖9 )° ' h)在具有潮撇素B抗藥性標記的哺乳動物细胞中，用於基 因表現之基本載體的製備 為了基因或cDNA的表琨，在CMV啟動子/促進子的轉錄 控制和對於潮徽素B抗藥性的選擇作用之下，產製從表現 質體 PAD-CMV1 與 pAD CMV2(EP-_A 393 438)M 及 PHE Bo (Sugden et a丨.1985 )起始的質體。 將含有細菌性潮徽素-B-磷酸轉移酶基因（Gritz* "45- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •丨裝· 訂· 線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 經濟部中央標準局®:工消費合作社印製 A6 ______B6_ 五、發明説明（44 ) Davies 1 983)的質體 pHE Bo(Sugden et al. 1985;圖 10) ，在HSV胸腺核苷激酶啟動子（McknUht 1980)的轉錄控 制之下，K Clal切開，用KUnow酶補滿DNA末端後，再用 B a m Η I切開。使此載體進行無性繁殖，得到一帶有C Μ V啟 動子/促進子序列（Stinski和Roehr 1985)與質體ρ290 ( 覼11)的760個鹼基之BamHI-Hindlll Η段（BamHI末端 KKIenow酶填滿）。 切除質體P290的Spel-EcoRVH段，此Η段含有CMV啟動 子和EBV or i Ρ 。M Bg Π I切開質體οΑί-CMVl，藉由 Klenov酶將DIU末端弄鈍後，接著再用S pel來切。經凝膠 鈍化出來的1,600個鹼基DNA片段含有CMV啟動子、聚無 性繁殖位置、SV40接合粒以及-P〇Iy(A)訊號，將它與上文 描述的P290載體部份連结在一起所得到的質體被命名為 pAhygCMVl (圖 12) 〇 - K同樣的方法把Spel-BslIlH段從質體PAD-CMV2中分離 出，並使其與P 2 9 0 S p e I - E c o R V載體部份連结。所得到的 質體被命名為pAHygCMV2(圖13)，它所含有的聚無性繁殖 位置在與pAHygCMV2中此位置存在之處相反的方向。 質體pAHygCMVl.的完整核苷酸序列，被顯示於序列識別 號：36中。 質體pAHygCMVl上的片段（提供鹼基之編號）相當於下 列的序列： 1 -767 CMV啟動子 768-785 T7啟動子 -46- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂·
.線. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)曱4规格（210 X 297公釐） 81.10.20,000
第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 84 9. 25 无 中々·銳明害锪IF亘（84年9月Λ7 ~~ ~ "ΒΤ 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 794-854 聚無性繁殖位置 8 5 4- 1 55 2 S V 4 0 t插人序列和聚腺苷酸化作用訊號 1 5 5 3 - 1 7 3 6倉鼠（H a m s t e r ) D H F R基因的5 ’端-非編碼區 1 7 3 7 - 2 2 6 1 Ε Β V o r i Ρ 部份的序列 2 2 6 2 - 2 8 5 6帶有聚腺脊酸化作用訊號的H S V胸腺核苷激酶 之3 ’端非-編碼區 2 8 5 7 - 3 9 1 2潮黴素β磷酸轉移酶基因 3.9 1 3 - 4 1 6 1 H S V胸腺核苷激酶故動子 4162-6531 PBR322載體成分 6 5 3 2 - 6 6 2 3從各種無性繁殖的方法，特別是從ρ 1 i n k 3 2 2 (M a n i a t i s e t a 1 . 1 9 8 2 )所形成的連接子序列 質體P A H y g C Μ V 2的核苷酸序列則顯示於序列識別號·· 3 7 中。它與P A H y g C Μ 1/1不同之處僅在於聚無性繁殖位置的地 區；P A H y g C Μ V 2中在位置8 5 6處的胞嘧啶，相當於 P A H y g C Μ V 1中在位置8 4 9處的胞嘧啶。 實例2 帶有可由佛波醇酯（T P A )來誘導之要素（T R Ε -感 覺D Η A)的報告者質體之搆造方法 »«% 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 為了细胞間黏著分子I C A Μ - 1而對人類基因之1，3 0 0個鹼 基的5 _端-側面連接區域所進行的無性繁殖及刪除分析， 已顯示出此片段 · i )在肺臟腺癌细胞株A 549 CATCC CCL 185)中，可被 T Ρ A誘發，但不能用佛斯寇林來活化，且 ii )含有一個具有D Η A序列T G A T T C A的T Ρ A反應要素 (T R E ) ( V 〇 r a b e r g e r e t a 1 . , 1 9 9 1 ):這個含有三個縱向 -4 7 - 83.3.10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐）
經濟部令央樣準局員工消費合作社印製 排列之T R E -要素的1 , 3 Ο 0個鹼基長I C A Μ - 1 Η段或核苷酸群 ，因此而被用來建造可藉Τ Ρ Α來誘發其蟲螢光素海基因的 載體。 a )質體p Β Η 1 u c 1 . 3之製備 質體Ρ Β Η 1 u c 1 . 3 (圖1 4 .)含有位在蟲螢光素酶基因之前 、1，3 0 0個鹼基長的I C Α Μ - 1基因調節區域。它的製餚方法 已由 Voraberger e. t ai., 1991 描述過了。 b )質體 p A D n e 〇 (1 . 3 I C A Μ ) 1 u c i ( T R E -感覺-D N A )之製備 利用質體P A D n e ο 2 B G 1 u c i (參見實例1 )，苜先藉著用限 制酶S a 1 I和Η丨n d I I I切開此質體，來除去冷-血球蛋白啟 動子，經由加入全部4種的d N T P s和K 1 e η 〇 w酶，把此質體 的D Ν Α末端弄鈍，最後藉著Τ 4 - D N A -連结酶的加入再連结 質體。這個沒有Θ -血球蛋白啟動子的質體被命名為 P A D n e 〇 2 1 u c i ，然後用N 〇 t I及Κ ρ η I將它切開，再一次以 Notl 和 ΚρηΙ切除質體 Bluese「ipt KS (參見 Voraberger et a 1…1 9 9 1)上的1 , 3 0 0個鹼基長之I C A Μ - I Η段，並將其連 结到P A D n e 〇 2 1 u c i内。這個質體被命名為p A D n e 〇 ( 1 . 3 工C A Μ ) 1 u c i (圖1 5 .)，它含有在蟲螢光素酶基因之前的 I C A Μ - 1調節及故動子·區。 c)質體 PADneo(3TRE:)BGluci(TRE-感覺 DNA)的製備. 藉著插入編碼產生限制位置Κ Ρ η I、B g i II和X h ο I的合成 寡核苷酸，其後跟隨著3個連績的TRE-序列、質體 pADne〇2BGluci之/3-血球蛋白放動子的5’端，來製餚此 質體。為J要這樣做’如實例1所述，將寡核替酸E Β I - -4 8 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 A6 B6 五、發明説明（47) 3677 (序列識別號：18) (5'-GGCCGCAGGTACCAGATCTACT-CGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCTGTAGAC-3,)- EBI-3671 (序列識別號：19)(5'-0(：1'丁0/^1^冉0001'(：1^(：/\(：1^0/^1'-AGATCTGGTACCTGC-3 ' )、EBI-3678 (序列識別號：20) (5'-TCGACTAAGCTTGAATCACGGTCTACAGCTAAGCTTGAATCACGG-TCTACAGCTM-31)及 EBI- 3672 (序列識別號：21) (5'- CGTGATTCAAGCTTAGCTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAG-3')锁酸化 ，再將等莫耳量的互補寡核苷酸EBI-3677與EBI-3771，K 及EBI-3 678與EBI-3672彼此相加。MNotl和Sail切開載體 PADne〇2BGlUCi ，再將等莫耳量的已切開質體 PADneo2BGluci 、寡核苷酸對EBI-3677/3671及寡核苷酸 對EBI-3672/3678混合'在一起.，並加人T4-DNA-連结酶使 它們彼此連結。所得的質.體接Γ受-分析後，含有想要的3個 TRE -序列之質體被命名為pA D_fre.o (3TRE)BGluci (圖16)。 d)質體 pADneo(nTREdx)BGluci的製備 這些質體含有η個TRE-要素，這些TRE-要素彼此之間的 間隔相當於X個鹼基。利用下列的寡核苷酸，如c )所述來 製備質體 pADne〇(3xTREdl6)BGIuci 、 pADneo(3xTREd21)BGluci, pADneo(3xTREd24)BGluci和 pADneo(3xTREd34)BGluci ： 以 R1U-3775 (序列識別號：2_2)(5’-00(^0〇六00了六(^六^ TCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTC/TAGCTTAGTGTAGAd’）與互補 的寡核苷酸Ε β - 3 (5 7 1 (參見上文）、E B I - 3 7 7 6 (序列識別號 :23) (5'-TCGACCTTGAATCACGGTCTACACTAAGCTTGAATCAC- -49- ' 本纸张尺度適用中國國家標芈（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 (請先閲始背面之注念事項再塡寫本頁) --裝， 訂. 經濟部中央標準局KK工消f合作社印製 Αβ Β6 五、發明説明（48) . GGTCTACACTAA-3’）與互補的寡核苷酸EBI-3777 (序列識別 號：24) (5'-CGTGATTCAAGCTTAGTGTAGACCGTGATTCAAGG-3')來製備 PADneo(3xTREdl6)BGluci; KEBI-3771 (序列識別號：25) (5’-GGCCGCAGGTACCAGA-TCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTG-3*)與互補的 寡核苷酸EB-3671 (參見上文）、EBI-3772 (序列識別號 > :26)(5'-TCGACTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCAGGCTAAGCTT-GAATCACGGTCTACACCAGGCTAA-3 ’）與互補的寡核苷酸 ElJ-3774 (序列識別號：27)(5'-0下0丁六0/\(^0了0/\11^六/^-CTTAGCCTGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGD來製備 pADneo (3xTREd21)BG1uc ί ； MEBI-3 780 (序列識別雖：28)(5'-00(^0(：/^01^(^六0八-TCTACTCGAGTGTAGACCGTGA-TTCrSGCTTAGCCTGGCGGTGTAGAC-3 ')與互補的寡核苷酸E B I - 3f 7>8 (-序列識別號：2 9 ) (5'-CCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACTCGAGTAGATCTGGTAC CTGC-3’）、 EBI-3779 (序列識別號：30) (5’-CGTGATTCA AGCTTAGCCTGGCGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTG-3')與互 補的寡核苷酸EBI-3781 (序列識別號：31) (5'-TCGACA-GGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCGCCAGGCTAAGCTTGAATCAC-GGTCTACACCG-31)來製備 PADneo(3xTREd24)BGluci ; MEBI-3786 (序列識別號：3_2)(5’-〇〇(^0[^〇〇丁八(：(：/\〇/\- tctactcgagtgtagaccgtgattca'agcttagcctggccggttagcg- CGGTGTAGAC-3’）與互補的寡核苷酸EBI-3782 (序列識別號 ：33) (5'-CGCGCTAACCGGCCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTA- 本紙張尺度適用中园國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） (請先閲讀背面之注意求項再塡寫本頁) -丨裝. 訂· 經濟部中失標準局员工消费合作社印製 81.9.20,000 第8 1 1 Ο 9 5 2 7號專利申請案 由寸雜flfl雲锪7F酉（糾年9月入7 B7 五、發明説明（ )年月曰心—i 84. Q Μ補充 經濟部中央^準局員工消費合作社印^ CACTCGAGTAGATCTGGTACCTGC-3，）、EB 1 -3790 (序列識別號 ：34) (S'-TCGACAGGCTAAGCTTGAATCACQGTCTACACCGCGCT- A A C C G G C C A G G C T A A G C T T G ή /\ T C A C G G T C T A C A C - 3，.）與互補的寡 核苷酸 E B I - 3 7 9 1 (序列識別號：35)(5'-00下(;/〇'1'(：/\<^(：- TTAGCCTGGCCGGTTAGCGCGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCT-G - 3 ’）來製備 p A D n e o ( 3 x T R E d 3 4 ) B G 1 u c i ; 為了獲f帶有6個T R E -要素的相對應質體，將適切之帶 有3個T R E -要素的質體以N 〇 t I和X h ο I切開，並再次與相對 應的寡核脊酸連结。由於此寡核苷酸的結構，结果得到具 有相等間隔之T R E -要素的複製品。將所得的質體命名為 P A D n e 〇 ( 6 X T R E d 1 6 ) B G 1 u c i ' p A D n e o ( 6 x T R E d 2 1) B G 1 u c i > pADneo((5xTREd24)BGluci 和 pADneo(6xTRE34)BGliJci 實例3 G -蛋白質連結受體的無性繁殖與表現質體（：受體 D N A )的製備
藉著篩選cDNA庫並使之在表現載體PAD-CMV1或？;^-C Μ V 2 ( E P - A 3 9 3 4 3 8 )内進行無性繁殖，來獲得所討論的人 類 5-HT2-受體.之 cDNA a )含有編碼產生人類5 - Η 了2 -受體之序列的無性繁殖糸之分 離Μ帶有一包含老鼠5 - Η Τ 2 -受體序列（J u 1 ί u s e t a 1 .,'1 9 9 0 ； P r ί t c h e 11 e t a 1 · , 1 9 8 8 )之無性繁殖 '糸的 2 . Z A P 載體（S t r· a t a g e n e 9 3 6 2 0 5 ) ，i衣據異種同源性來篩選人類 海馬c D N A庫，分離出一無性繁殖糸並定出這個包含於質體 P B U e s c r i p t S K中的插入物之序列。以序列識別號：1反序 列識別號：2提出所得的D N A序列和従它衍生出的胺基酸序 -51 - 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 83.3.10,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
A6 ____；_B6 五、發明説明（50) 列。拿'人類5-HT2-受體的胺基酸序列與公佈的老鼠 5- HTz -受體之胺基酸序列（Julius et al.，1990) _來比較 ，结果在這兩個胺基酸序列之間有90¾ ~致。 b) 在表現載體PAD-CMV2上進行5-HT2-受體序列的傳代無性 繁殖 MEcoRI切開表現載體PAD-CMV2，藉著加人全部4種的 dNTPs和Klen〇w酶將DNA末端弄純後，再KBamHI切開此 載體。把5_HT2-受體連结到此載體之中，用Sraal和BaraHI 切除質體pBluescript ，.因此而得到的無性繁殖糸命名為 pAD-CMV2-5-HT2 (圖 17)。 c) 在表現載體PAD-CMV2中進行多巴胺-Da -受體序列的無性 繁殖 — . 質體pH Da-gem，它含有在pCEM-Blue質體載體 (Promega)(Zhou et al., 19史0)上.3000個驗基的人類多巴 胺D,-受體序列之EcoRI-SacI片段，MEcoRI和BamHT將 其雙重地切開，並分離出這個3,000個鹼基的DNA-插入物 。KEcoRI和BamHI雙重地切開表現質體pAD-CMV2(EP -A 393 438) ，Μ理想的方式無性繁殖此3000個鹼基的 經消部中央標準局S工消费合作社印製 (請先閲itvJ背面之注意事項再塡寫本頁) 裝- 受體Η段，使得多巴胺Da-受體在巨细胞病毒（CMV) 啟動子/促進子要素的控制之下進行轉錄作用。所得到的 質聘被命名為？&0-〔1^2:丨)1(毆18)。 d) 在表現載體pAHygCMVl中進-行NK2-或5HT2-受體序列的 傅代無性繁殖 利用限制酶sa 1 I和Notl切下質體pB luescr ipt-NK2上的 -52- 本纸张尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 A6 B6 經濟部中央標準局3工消费合作社印製 五、發明説明（51) 人類NK2.-受體之cDNA，這個含有NK2-受體cDHA的質體在質 體載體 pBluescript SK+(Stratagene.) (Gerard et al. ,1990)之中，使此cDNA在表現載體pAHwCMVI (參見實例1 h))中進行傳代無性繁殖，而所得的質體被命名為 pAH：yg-NK2(圖 19A)。 切下上述之載體pAD-CMV2-5HT2中的5-HT2-受體，如同 一 Xbal-Clal Η段，並在載體pAHyg-CMV2 (參見實例1 h))中進行無性繁殖，所得到的结構被命為PAHyg-5HT2 ( 圖 1.9B)。 實例4 在三種不同的預備試驗细胞株中，由TPA對TRE-.感覺DNA的誘導作用 M-TRE-感覺DAN(pBHluci 1..3)將下列的细胞暫時轉移感 染：人類肺癌细胞株A549.UT泛6 CCL 185)、人類子宮頸癌 细胞株HeLa(ATCC CCL 子.腎臟细胞株C0S-7 (ATCC CRL 1651)，藉著在 RPMI-1640 培養液（Gibco)中 混合A549-及C0S-7細胞，並將HeLa细胞置於MEM培養液 (Gibco)中，每個.案例均加人含ΐ〇χ遇熱失活之胎牛血清 (FCS)的Ear丨e’sBSS(Gibco)，並在37tC、5¾C02中培養 此涓合物。每次轉移感染作用的有1 X ] 〇 7個细胞，利用胰 蛋白酶將這呰細胞從培養盤的表丽分離下來，並在周圃溫 度下K〗200rpm離心5分鐘（Heraeus Minifuge)，用5毫 升不含血清的掊養液沖洗一次、以1 2 〇 〇 r p m離心5分鐘， 再懸浮於1毫升不含血清的培養液中。然後將细胞與250 微克/毫升DEAE-葡聚糖、5微克質體DNA和50微克/毫 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· 訂.
本紙張尺度適用中國國家標iMCNS)甲4規格（210 X 2耵公货） 81.9.20,000 A6 B6 五、發明説明（52) 升氮喹混合，在37 t：培養30分鐘，用不含FCS的培養液沖 洗一次後，再加入10毫升新鲜並含有血清的培養液，在 37t：下培養過夜。然後更換培養液，並在4小時之後以 10微毫克TPA/每毫升培養液或K20tfM佛斯寇林來誘導细 胞。在另外1 8個小時之後，以P BS冲洗這些细胞，利用橡 膠刮刀將其從培養盤上分離，在周圍溫度下K 1200rpm離 心5分鐘（Heraeus Minifuge)。加人100微毫升溶解緩衝 溶液（1$三通父-：1.00(1>!1：(^)、251^,?117.8之甘醯胺甘胺 酸、15mM MgCU、4mM EDTA及lmM DDT)溶解這些细胞，將 此溶胞產物離心5分鐘，並將上清液移至乾淨的試管中。 藉著加入30微升之上清液於3 50微升分析緩衝溶液（ 25mM PH7.8 之甘醯胺甘胺酸、_5mM ATP、15mM MgS〇4)中， 將試管放置於發光計Luma.t 9 EKJ llBerthold)內，並注人 - -=—^ 300微升注人緩衝溶液（0.2 (蟲螢光素，20mM、pH 7.8之甘醯胺甘胺酸）開始該反應，而完成蟲螢光素酶的 分析（De Wet et a〗·，1985)。光放射的測量時間為10分 鐘。 a)可由TPA但不能由佛斯寇林引發對於pBHIuc 1.3的誘導 作 用 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 如上述方法，藉著質體ρ Β Η 1 u c 1 · 3的加入來暫時地轉移 感染细胞株Α549、HeLa及C0Sr7 ，再由ΤΡΑ的加人而誘發 這呰細咆。只進行轉移感染卻木加以誘發的细胞係用來當 作對照姐。在特定的培養時間之後，將細胞溶解並完成蟲 螢光素梅的分析。實驗的结果顯示於圖20中，並顯示出在 -54- 81.9.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（21〇 χ 297公發） A6 B6 五、發明説明（53) 受試細胞中質體Ρ Β Η 1 u c ] · 3可被誘導達1 〇倍以上。 Vorabergep et a丨.，1991則顯示了在Α549细胞中的此種 结構不能被佛斯冠林所誘發。為了証實對HeLA及C0S-7細 胞有同樣的效果，在另外的實驗中再度以pBHluc 了.3轉移 感染這些细胞，並用TPA或佛斯冠林加K誘導，再K未經 .誘導的細胞作為對照組。此實驗的結果’如圖21A和218 中所見，顯示HeLa和C0S-7细胞也可被TPA誘導’但不能 被佛斯寇林誘導。 b) M TPA但不能Μ佛斯寇林對PADneo (3TRE)BG1UC〗的誘導 作用 藉著加人質體pADneo(3TRE)BGluci使細胞株A543、
HeLA和C0S-7被暫時地W移感染，再加人TPA或佛斯寇林 來誘導之。再度使用僅進行轉=移感染，但不予Μ誘導的细 胞作為負對照姐。於特定的培;-養時間之後，將细胞溶解並 完成蟲螢光素酶分析。實驗的结果顯示於圖22中，並表示 只含有ICAM-1基因之TRE-要素的載體*可在受試细胞中由 Τ Ρ Α誘導，但不能被佛斯寇林誘導。 c) MTPA但不能以佛斯冠林對質體pADneo(nTREdx) B G 1 u c i的誘導作用 藉著加人質體 pADneo(3xTREdl6)BGluci 、 pADneo(3xTREd21)BGluci ' pADneo(3xTREd24)BGluci ^ pADneo(3xTREd34)BGluci ^ pADneo(6xTREdl6)BGluci -pAI)neo(fixTRRd2nBGluci、pADneo(6xTREd24)BGluci 或 pADneo(fixTREd34>BG丨uci ，將細胞株 COS-7 和 A549暫時轉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公發） (請先閲¾背面之注意事項再塡寫本頁) —裝. ,ΐτ. 經濟部中央標準局Μ工消费合作社印製 81.9.20,000 五、發明説明（54) A6 B6 經濟部中央標準局符工消费合作社印製 移感染，並加入TP A或佛斯寇林來誘導之。再次使用只經 轉移感染但未經誘導的細胞作為負對照姐。在特定培養期 間之後將細胞溶解，並完成蟲螢光素酶分析。實驗之结果 顯示於圖23A和23B中，並且証實了 i )利用TPA對於具 有6個TRE-要素之結構體的誘導作用，比對具有3個 TRE-要素之結構體更大（沒有任何結構體可被佛斯冠林誘 導），Μ及ii )當TRE-要素的間隔較小時，利用TPA對於 這種具有6個TRE-要素之结構體的誘導作用會比當'TRE-要 素之間隔較大時高。 實例5 TRE-感覺-DNA的受體調節之誘導作用 為了証實倘若细胞株在表面表現出經由G-蛋白質與磷脂 酶C-效應物糸統連接的受體，-並在適當時機加人受體-專 一性競爭物時，也可誘導能被ΤΓΡ1\誘導的感覺-DNA，故利 用TRE-感覺-DNA和受體DNA來共同.轉移慼染C0S-7細胞。 使用C0S-7細胞和含有SV40複製起點的受體DNA ，使得受 體- DNA高複製量的自動複製作用成為可能，並因此容許在 細胞表面有高比例的受體暫時性之表現。除了轉移感染 TRE-感镫DNA和受體-DNA各5微克之外，利用實例4中描 述的DEAE-葡聚糖法來完成此共同轉移感染反應。在一糸 列的試驗中，隔夜培養並更換培養液之後，在平行的實驗 姐中加入受體專一性競爭物，.或競爭物與競爭的拮抗劑， 或是作為正對照姐的TP Α 。再〗欠使用未經誘導的細胞作為 負對照組。在1 8小時的培養之後，如筲例4中所描述的方 法將細胞溶解並完成蟲螢光素酶分析。 5 6 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 (請先閲¾背面之注¾事項再填寫本页) ------裝 I-—ί.π-----
經濟部中央標準局tiq工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（55) a) 藉著结合一有競爭作用的物質到蠅輦鹼M3-受體上，對 pADneo(3TRE)BG]uci引起的誘導作用 藉著加感覺-DNA pADneo(3TRE)BGluci和含有位於 fikayama/Berg pCD表現載體.（Okayama和 Berg, 1983)上之 人類蠅簟鹼M3-受體之序列的受體- DNA PCD-M3 (Buckley et a]., 1989)，來共同轉移感染C0S-7细胞。 利用】·）10微毫克/毫升TPA(Sigma P8139)、ii) ImM碳 醢膽鹼（Sigma, C4382)、iii) ImM碳醸膽鹼和10/zM阿托 品（$丨81〇3/\0132)呶及^)111^碳醯膽鹼和20//1<阿托品 來完成誘導作用。在培養皮细胞的溶解作用之後，蟲螢光 素酶分析之结果顯示於圖24，並証實了蟲螢光素酶的表現 ’受TPA也受碳醯膽鹼、一種_挪輦鹼受體的競爭物，所誘 導。這種由競爭物引起的誘奪Γ作用，可藉著選擇性拮抗劑 阿托品的同時加入來妨礙之. b) 藉著將有競爭作用之物質结合至5-羥色胺- 5HT2-受體上 ，對pBHlucl.3 ，但不會對p/\Dneo2-C6-BGL引起的誘導 作用. 藉著加入感镫- DNA pBHlucl.3和含有位於表現載體 p A D - C Μ V 2上之人類5 Η T 2 -受體之序列的受體D H A pAD-CMV2-5HTZ (參見實例3)，來共同轉移感染C0S-7细胞 。以i ) 1 0微毫克/每毫升培養液的T P A ( S i g m a P 8 1 3 9 )、 ii ) 10 " M 5 -羥色胺-順丁烯-二酸α -甲酯（R B I研究生 化股份有限公長（RBI Reserch Biochemicals Incorporated) M-110)，和 Hi) 10/iM 5 -羥色胺-順丁稀 -57- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公垃） 81.9.20,〇〇〇 (請先閱讀背面之注意事項再堪寫本頁) —裝· 、π_ A6 B6 五、發明説明（56) 二酸α -·甲酯與1〇 w Μ凱特色寧-酒石酸鹽（RBI S-006) 來完成誘導作用。在培養與溶解细胞之後，蟲螢光素酶分 析之结果顯示於圖25 A ，並証實蟲螢光素酶的表現受ΤΡΑ 也受5-羥色胺-順丁烯二酸α -甲酯、一種5-HT2-受體的 競爭物，所誘導。藉著選擇性競爭物凱特色寧-酒石酸鹽 的同時加入而妨礙了由競爭物所調節的誘導作用。在平行 的實驗中，藉著含有6個CRE -要素之感覺DNA pADneo2-C6-BGL和受體 DNA pAD-CMV2-5HT2 的加入將 C0S-7細胞共同轉移感染。Μ i ) 20/uM佛斯寇林 (Sigma P8139) 、ii) 10/iM 5-經色胺-順丁 烯二酸 α- 經濟部中央標準4s只工消赀合作社印製 甲酯（RBI Μ-110)，和iii) lOwM 5-羥色胺-順丁烯二酸 α-甲酯與lOwM凱特泡寧--酒石酸鹽（RBI S-006)完成 此誘導作用。在培養並溶解IEC胞之後，蟲螢光素酶分析之 结果顯示於圖25B中，並証賁;-.了蟲螢光素酶的表現確實受 佛斯寇林誘導，但不受5 - Η T2 -受體競爭物、5 -羥色胺-順 丁烯二酸α-甲酯誘導。從Μ上的结果，依據5-ΗΤ2 -受體 ，當然只有對IPWDAG有反應的調節要素（TRE)，而非對 cAMP有反應的調節要素（CRE)被選擇性地活化。 c)藉著使有競爭作用之物質结合到多巴胺-(Η-受體上，對 pA[)neo2-C6-BGL而不對pBHIuc 1.3引起的誘導作用 藉著加入感覺D N A ρ β丨彳丨u c .3和含有位於表現載體 P A D - C Μ V 2上之人類多巴胺-D卜矣’體之序列的受體D N A pAD-CMV2-D1(參見實例3)，將C0S-7細胞共同轉移感染。 Mi ) 10 微毫克 / 毫升 TPA(Sigma P8139) ii) 20wM 佛 -58- 本紙張尺·度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（2ί0 X 297公發） 81.9.20,000 A6 B6 五、發明説明（57) 斯寇林（Sigma P8139) 、ffi) 1/zM阿撲嗎啡（RBI D-004) 和 iv) 1/zM阿撲嗎啡與 1//M SCH 23390 UBI D-054)來完 成誘導作用。在培養並溶解细胞之後’將蟲營光素酶分析 之结果顯示於圖26A)中，並証實了蟲螢光素酶基因的表現 ，確實受TPA誘導，但不受D1-受體之競爭物阿撲嗎啡誘 導。在平行的實驗中，藉著加入含有6個CRE-要素的感覺 DNA pADneo2-C6-BGL和受體 DNA PAD-CMV2-D1 來共同轉移 感染⑶S-7细胞並誘導之。在培養並溶解细胞之後，將蟲 螢光素酶分析之結果顯示於画26B)中，並証實蟲螢光素酶 的表規受佛斯寇林也受阿樸嗎啡誘導。藉著選擇性拮抗劑 SCH2 3 390的同時加人，妨礙此種由競爭物調節的誘導作用 。從以上的结果，多巴胺-D 1 受體當然只選擇性地活化對 腺苷酸瓌化酶訊號傳遞途徑有=反應的調節要素（CRE)，但 - - 不活化對磷脂酶C-訊號傳遞途;-徑有反應的調節要素（TRE) 0 實例6 a)依據细胞内IP3/DAG濃度來表現蟲螢光素酶之重姐 A 5 4 9細胞株的開發 經濟部中與標準局HX消费合作社印製 在細胞株A549内暫時性轉移感染的實驗中，藉著TPA的 加入，已經T R E -感胬-D N A p Β Η 1 u c 1 · 3誘導達1 〇倍以上。 (宵例4 a )。為了產製對於砍據I P 3 / D A G -訊號傅遞途徑之 肓接或由受體調節的調節作用_來影煺蟲螢光素酶基因之表 現的物質而言圼穩定的（預備）試驗细胞株，利用如下描 述的雷孔法K質體p B丨丨丨u c 1. . 3和選擇質體p R S V n e 〇同時轉 81.9.20,000 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. .麵 本纸張又度適用中國园家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發） 經濟部中央標準局3工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（58) 移感染A.549细胞：在移除培養液之後利用胰蛋白酶/PBS溶 液將細胞由表面分開，再懸浮於培養液中以250 xg沈降5 分鐘。以不含血清的RPMI-16 40培養液（Gibco)冲洗這些 細胞，再度離心後Ml.25X107個細胞/毫升之密度將其 懸浮於不含血清的-1 640中。取0.8毫升细胞懸浮液 與20微克pBHluc 1.3和2微克pRSVneo混合。這兩種質體 均預先以BamHI弄成直線形。利用PG200 ProgenetorE之 電孔法儀器（Hoefer Scientific Instruments)M 270 伏 特、1080微法拉第、1000毫秒的單一電流脈衝來完成此轉 移感染作用。然後K與10¾胎牛血清混合過的rpmi-1640 培養液稀釋細胞，並K每90毫米培養盤含2到5X107個细 胞的密度來播種。從轉夥感染·後的那天起，使细胞在選擇 培養液（富含1 0 ί：透析過·的胎Γ牛重清、盤尼西林G - N a ( 100單位/毫升）、鏈黴素（;-5.0單_位/毫升）及800微克 /毫升之基因素（G-41.8, Gibco-BRL)的RPMI-1640)中生長 Ο 於轉移感染後1 5到2 0天，將個別的细胞無性繁殖糸移至 9 6孔微量滴定盤中，並更進一步培養。藉著加入TPA來測 試G-418 -抗藥性無性繁殖糸之蟲螢光素酶表現的可誘導性 。將大約含40 , 000個細胞之各個無性繁殖糸，K重覆6次 之程序播稀於經組織培養法（H i c r 〇丨i t e TM, D y n a t e c h L a b o r a t 〇 r ί e s )塗覆過、每孔 > 為2 0 0微升的不透光9 6孔 微罱滴定盤中，並培養於3 7 C過夜。三種混合物K 1 0微毫 克TP A/毫升處理，再繼續培養8小時。然後移去培養液， -60- (請先間"背面之注念事項再填窝本頁) i裝. --δ _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 A6 B6 五、發明説明（59) 並Μ P B S·沖洗細胞兩次。將每姐细胞取置於1 5 0微升的溶 解緩衝溶液（20mM麥黃酮、0.5mM EDTA、0.54mM三聚磷酸 納 ' 6 . 5mM DTT、1 6 . 3 tn M MgS〇4 · 7H20、0.1% 三通 X_l〇〇 、：l.2mM ATP、0.05niM ρΗ7·8之蟲螢光素）中，並在96孔 發光計（ML-1000, Dynatech)上測定蟲螢光素酶的活性。 選出细胞無性繁殖糸A40來進行更進一步的實驗，因為它 顯示可測量的蟲螢光素酶活性之基本含量相當於由TP A誘 導出的1 5到20倍。 b)按照人類神經激肽2 -受體活化的函數來表現蟲螢光素酶 之重姐A549試驗細胞株的開發 此宵驗說明連结在磷脂酶C-訊號傳遞途徑上之人類神經 激肽2(ΝΚ2)-受體的試崩細胞·株之製備。這種試驗細胞株 使得藉測定蟲螢光素酶之活性-來確認依賴受體而調節細 - ·=—. 胞內ip3/dag濃的物質成為可;-能。- 如a ) K下的描述，藉著利用預先K B g丨I I弄成直線形的 質體p/\Hyg-NK2之電孔法，來轉移感染預備試驗细胞株 A20 。從轉移感染後那天起，使細胞在選擇培養液中生長 ，就像细胞株A20所使用的，再額外加入1 50微克/毫升 潮徽素B(SUma)。如a)K下的描述，為了蟲螢光素酶活性 的誘導作用對各個無性繁殖糸進行測試。然而於此案例中 ，使用神經激肽A (1 w M , S i g na )代替TP A來當作誘導物。 在反覆的實驗中，無性繁殖糸\20/ΝΚ2-122顯示了在神經 激肽2 -受體的活化作用之後，蟲螢光素酶活性有5到7倍 的誘導作用。 -61- 本紙張尺度適用中國园家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） (請先閲¾背面之注&事項再增寫本頁) 裝. 訂, 經濟部中夾標準局Κ工消费合作社印製 81.9.20,000 A6 B6 五、發明説明（60) (請先閲;«背面之注意事項再塡寫本|}) 如圖2·7所示，在預備試驗细胞株A20也在NK2-試驗细胞 株Α20/ΝΚ2-122中，増加蟲螢光素酶的表現僅可經由 TP3./DAG-訊號傳遞途徑，但不能藉著增加細胞內CAMP濃度 。然而，在這兩種細胞株中，依據其劑量可藉TP A將蟲螢 光素酶之活性誘至高達1 8倍的最大量，但佛斯寇林（腺苷 酸環化酶的剌激物）卻不會造成任何蟲螢光素酶活性的誘 導作用。 —裝· 在試驗細胞株A20/NK2-122中，由NK2 -專一性競爭物 NKA GR64349(lwM, Neosystem S.A.)引起之蟲螢光素酶 誘導作用的動力學被顯示於圖28中。在7到8小時的誘導 期間之後，'測到最大量蟲螢光素酶活化反應。另一方面， 在细胞株A20中，並不锥藉著-加人NK2-競爭物GR 64349來 誘導蟲螢光素酶活性。這件裏二意妹著預備試驗细胞株A20 未含有任何内源性的NK2-受％分子·，且因此對於NK2-試驗 細胞株而言是一適當的對照姐细胞株。 圖29A表示蟲螢光素酶活性的劑量活性曲線，係按照人 類神經激狀2受體之活化對神經激肽的函數。细胞株 A20/NK2-122中神經激肽（SUma)相對上之有效性： 經濟部中央標準局®:工消费合作社印製 HKA> 神經邁定 Uneuromedin K)(NMfO> 物質 P(SP)，符合 得自受體结合研究之文獻中早已描述過的資料。細胞株 A20不受這三種（血管）加速激肽的任一種所誘導，這葸 味著此钿胞株不含任何内源性_神經激肽受體。一糸列競爭 物的劑最-依賴活性已顯示於圖2 9 B中，埴些競爭物特別 針對三種神經激妝之一，為：NK1:GR73632 (Neosystera 81.9.20,000 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)曱4規格（210 X 297么1 ) B6 五、發明説明（61) 經濟部中火標準局3工消#合作社印製 s. A. )、BIIC 1223 ([/3 -丙胺酸 4、肌胺酸 〇 (Sar)、甲酿 胺酸（〇2)”]SP(4-ll)); NK2: GR 64349 (Neosystem S.A·)，BIIC 1219([/3-丙胺酸 8]NKA(4_1〇)); NK3:[甲 基苯丙胺酸 7]NMK(Bachem Feinchemikal ien AG)。 在细胞株A20/NK2-1.22中神經激肽A的競爭作用，可藉 著NK2-專一性括抗劑（GR83074、 GR87389、 GR94800, Neosystem S.A.)的加人來抑制（圖30)。為了瑄個問題 ，將细胞同時Μ不變量的神經激肽A(50nM)和逐漸增加用 最的拮抗劑來處理。另一方面，高濃度的NK1-專一性拮抗 劑（也就是BIBO 2020( 士順- 3- (2 ·甲氧苄胺基）-2 -二笨甲 基喹寧環），P7492(Peninsula Lab.))或 NK3 -專一性括抗 劑 iH-9290，Bachem Feincheraikanen AG)也是有效的 (P7492> BIBO 2020 >H-9-2 905^ - c)按照人類5HT2-受體活化的;-函數.來表現蟲螢光素酶之 A549細胞株的開發 人類5HT2-受髑是連结於磷脂酶C -訊號傳遞途徑之受體 的另一個實例。因此為了建立一種能夠發現可調節5HT2-受體之物質的試驗细胞株，在本案例中，TRE -细胞株A20 也適宜當作起始細胞株來使用。 為了這個目的，藉著如a)之下所描述的電孔法，將已用 B g 1 U弄成直線狀的質體p A H y s - 5 Η T 2轉移感染到細胞株 Α20内，並使细胞在選擇培養/液中生畏。在加人5丨ΓΓ2-專 一性競爭物5 -羥色胺順丁烯二酸α -甲酯（1 〇 // Μ，研究生 化股份有限公司）之後，就蟲螢光素酶活性的可誘導性來 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公鏟） 81.9.20,000 f請先閱於+、背面之注念事项再場·萬本頁'-· 丨裝- -ij6- 經濟部中央標準局發工消资合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明（62) 檢驗有潮徽素B抗藥性的細胞無性繁殖糸，並選出無性繁 殖糸A20/5HT2-11來進行更進一步的實驗，在此無性繁殖 糸中，測出4到5倍的誘導作用。 在試驗细胞株A20/5HT2-11中由5-羥色胺引起之蟲螢光 素酶-誘導作用的動力學，顯示於圖31中。如圖28，蟲螢 光素酶活性在6個小時的誘導期間會持續往上增加。因此 對於測試有競爭或拮抗作用的物質，6到8小時的誘導期 間是足夠了。在細胞株A20中，加入5 -羥色胺不能誘導蟲 螢光素酶的活性。這意味著預備試驗细胞株A20不含任何 內源性的5HT2-受體分子，並因此對於5HT2-試驗细胞株 而言為一適當的對照姐细胞株。 圖32A顯示了蟲螢光素酶活_性的劑量-活性曲線|就像 是人類5HT2-受體之活性·對競嘲的函數。和預期的一樣 ，此活性曲線對5 -羥色胺及5JI T- 2 -.受體競爭物5 -羥色胺順 丁烯二酸有選擇性，而與5ΗΤ1Α -受體競爭物δΟΗ-DPAT (研 究生化股份有限公司）和丁螺旋嗣（b u s ρ ί r ο n e )不同。 也能夠藉著5 Η T2 -專一性拮抗劑螺環呋哌啶酮和米安塞 林（m i a n s e r i n e )(研究生化股份有限公司）的加入來抑制 在細胞株A20/5HT2-1.1中5-羥色胺的競爭活性（圓32B)。 為了這個問題，以一定最的5-羥色胺（l.w M)及逐漸增加用 最的桔抗劑同時處理此细胞。_ 實例7 — a )按照钿胞內c A Μ P - ·濃度的函數來表現蟲螢光素酶之重驵 中_倉鼠卵巢（CHO)細胞株（CRE-細胞株）的開發 _ 6 4 一 (請先閱$•背面之注意事項再塡寫本頁) .裝. 訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公辁） 81.9.20,000 A6 B6 五、發明説明（63) 為了針對正在研究中、藉著其與受體分子之間的交互作 用可直接或間接影響细胞内cAMP含量的物質，來製備（預 備）試驗细胞株，將中國倉鼠卵巢細胞株CH0-DXB11'( Urlaub和 Chasin,1980)M 感覓 DNA pADneo2-C6-BGL轉移感 染。 在補充了 10%胎牛血清（Sebak)、次黃嘌呤（l〇〇w M)、 胸腺核苷（16WM)、盤尼西林G納（100單位/毫升）和 鏈徽素（50單位/毫升）的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培養液1640 (Gibco)中培養親代细胞株 CH0-DXB11 。在進行轉移感染作用的前一天，將細胞移置 於新鲜的培養液中。 依據電孔法如下述方式完成·轉移感染··在移出培養液之 後，利用胰蛋白酶/ P B S使细胞二從隶面分離下來，再懸浮於 - ·<.—. 培養液中，並M 250xg離心5丨-分鐘使其形成小球。以HBS (10毫升CH7.4之HEPES、150mM Nacl)冲洗细胞，再以離 心法使其形成小球。將细胞K 1 X 1 〇 7個细胞/毫升的密度 懸浮於HBS中。取0.8毫升细胞懸浮液與20微克以Seal弄 成直線形之質體pADne〇2-C6-BGL的DNA混合，並移至電孔 培養盤内。使用PG200 Progenetor II之電孔法儀器 f Η 〇 e f e r Scientific Instruments, San Francisco, 經濟部中央標準局S工消费合作社印製 CA)，以32〇伏特、1 〇8〇微法拉第、1 000毫紗的單一電流 脈衝來完成轉移感染作用。在]隹行了電孔法之後，κ上述 培養液稀釋細胞，並Μ每9 0毫米培養盤含2 0 , 0 0 0個细胞的 最播種，於37Ρ下過夜培養。從轉移感染後的那天起，Μ -6 5 - 81.9.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公楚） A6 B6 五、發明説明（64) 選擇培着液（用10¾胎牛血清、次黃嘌呤（100wM)、胸腺 核苷（16WM)、盤尼西林G納（100單位/毫升）、鏈徽素 (50單位/毫升）及700微克/毫升之基因素（G-418， Gibco-BRL)來補充的RPMI 1640培養液）培養這些细胞’ 其後再K目視法檢査钿胞的生畏狀況。 在轉移感染後7到10天，已形成的各個細胞無性繁殖系 被移到具有24孔的细胞培養盤中，並繼續培養。針對由腺 眢酸環化酶的活化作用而引起蟲螢光素酶表現的可誘導性 ，測試25個分離的具G-4 18抗藥性之细胞無性繁殖糸。 在6孔细胞培養盤的每孔中，四重播種的含有300,000 個细胞的各個無性繁殖系，並在37 1C下培養24小時。每種 無性繁殖糸各取兩組细胞，M 佛斯冠林處理，並在 3 7 Ή下繼續培養5小時。然後$所有的细胞中移出培養液 - _ ，M PBS沖洗细胞。用U三通3 = 10.0溶解细胞，並在 Bert.hold Lumet LB 9501發光計（Brasier et al·, 1989 )中測定蟲螢光素酶的活性。選出细胞無性繁殖糸C6-13 來進行更進一步的實驗，因為它有最高的蟲螢光素酶活性 基本量，同時也受佛斯寇林引起很高的可誘導性。 將細胞株CHO C6-13的细胞K各種會改變细胞内CAMP或 I P 3 / D A G濃度，或刺激湄度上之改變的物質處理3個小時 ，也以會影響上述訊號傳遞機_制之受體-專一性競爭物來 處理。如圖3 3所示，在细胞株έ Η 0 C 6 - 1 3中僅能藉著增加 c A Μ Ρ之物質，諸如佛斯寇林（腺苷酸環化酶的剌激物）、 雙丁醢環腺苷酸（可通過細胞膜的環腺苷酸衍生物）及異 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） (猜先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
裝1Tf G 經濟部中央標準局ta工消费合作社印製 81.9.20,000 經濟部中央標準局®:工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（65) 丁基甲基黃嘌時（IBMX，磷酸二酯酶-抑制劑）之類，來 增加蟲螢光素酶的表現。而佛波醇酯PMA、Ca2--離子載斉豊 A23 1 87和多巴胺受體的競爭性化合物（阿樸嗎啡、溴麥肖 環肽）、蠅輦鹼乙醯膽鹼受體的競爭性化合物（碳醯膽驗 )Μ及5-羥色胺，都不能完成蟲螢光素酶活性上任何有意 義的改變。這意味著细胞株CHO C6-13中蟲螢光素酶的表 現，只能由cAMP-濃度上的改變來調節，而不由 IP3/DAG -湄度上的改變來調節，更進一步地說，此细胞不 含任何生物學上可査知的多巴胺、蠅葷鹸或5-羥色胺型式 之cAMP-刺激受體。 藉著佛斯寇林引起的cAMP-濃度上增加，對於蟲螢光素 酶基因的轉錄活化作用之劑量.活性曲線，如圖34中所示： 在20 Μ佛斯寇林處產生.最大^誘導作用。在更高湄度的 佛斯寇林處，蟲螢光素酶誘導^作用.的降低，顯示 此現象 係因為佛斯寇林本身的或過高cAMP含量的毒性影響。由 TBMX所引起的磷酸二酯酶之抑制作用，係歸因於它降低了 已形成cAMP的分解作用，结果增加了 CAMP含量K及同時存 在之腺苷酸環化酶的活化作用。以IBMX來處理，對蟲螢光 素酶報告者基因的最大誘導作用，並沒有重大的影響，這 意味著在經由20 « Μ佛斯冠林所得到的CAMP濃度下已能達 到具有最大活化限度的轉錄作用。利用I BMX使此劑量-活 性曲線依照相同大小而被移轉細佛斯寇林濃度較低之處， 此規象清楚地証實了 cAMP的累積作用係憑藉抑制負有分解 c A Μ P責任的酵素。 本紙ί艮尺度適用中國國木標準（CNS)甲4規格（210 X 297公楚) 81.9.20,000 〈請先閲^背面之注念事項再頌'寫本頁) _裝· 訂. Α6 Β6 經濟部中央標準局3工消費合作社印製 五、發明説明（66) 蟲榮光毒酶-誘導作用的動力學係按照佛斯寇林劑量的 函數’顯示於圖35A中，表示以佛斯寇林刺激後6〇分鐘， 可査知蟲營光素酶活性的增加。蟲螢光素酶表現的整個誘 導作用在2.5個小時後完成，並且直到佛斯寇林刺激後4 小時也不會改變。雖然蟲螢光素酶誘導作用的絕對量一直 增加到2.5小時為||；，但50¾有效劑量（EDso)在經佛斯寇 林處理的期間實際上維持不變（圖35B)。 b)按照人類多巴胺- D1-受體活化的函數來表現蟲螢光素酶 之重組CH0 -試驗細胞株的開發 本實例類似下面的實例8 ，証實了 （對照姐）CRE -試驗 细胞的製備，也適用於針對調節特定受體，最好是人類腺 苷酸環化酶-連結受體乏物質.的细胞篩選糸統。利用人類 多巴胺ΙΠ -受體序列來產製受13撞DH A 。 如同a ) Μ下所描述的，利甩;-電孔.法和預先KPspI弄成直 線的質體pAD-CMV2:D1 ，將具有上述特徵的细胞株CH0 C6-13轉移感染。從轉移感染後的那天起，在選擇培養液 中培養瑄些細胞，此選擇培養液係依照二氫葉酸遨原酶 (DHFR)(不含核苷酸的培養液a-MEM(G;bco))、10¾透析 過的眙牛血清（S e b a k )、盤尼西林G納（1 0 0單位/毫升 )、鏈徽素（50簞位/毫升）、700微克/毫升之基因素 (G - 4 1 8 , G i b c 〇 - B R丨.），並從那_時之後以目視檢査細胞的生 長。在如上述之6孔细胞培養裔中，長出2 4個各自分開的 细胞無性繁殖糸，並在Μ 1 〇 v Μ阿撲嗎啡（多巴胺受體的 競爭物）處理後4小時，就蟲螢光索酶活性上的增加’测 —6 8 - (請先閲讀背面之注意事項再增寫本頁) "-1-·. ν i裝， 訂. 本紙張尺度適用中國园家標準（CNS)中4规格（210 X 297公發） 81.9.20.00° Α6 Β6 五、發明説明（67) 試這些细胞，並與未處理的细胞相比較。在反覆的實驗中 ，無性繁殖糸CHO 13D1-38於多巴胺D1-受體的活化之後 ，在蟲螢光素酶活性方面表規出最高量的增加。 為了在具有高生產率的自動篩選糸統中使用試驗细胞株 ，使用每盤上含96孔的微量滴定盤是有益處的。為此目的 而將 60,000 個细胞（CHO C6-13 或 CH013D1-38) K 每孔 20微升的量播種於經姐織培養塗覆的不透光微量滴定盤 (Microl it eTM，Dyna tech Laboratories)中，在下過 夜培養。然後將各種化學物質加進這些细胞中，並培養一 段特定長度的時間（通常為3個小時）。移出培養液之後 ，M PBS沖洗細胞，在1%三通Χ-100中將细胞溶解，再於 96孔的發光計（ML-100(T, Dynatech)中测定蟲螢光素酶之 活性（圖36) 。 ΖΓ - 按照人類多巴胺D1-受體-栝化作用函數的蟲螢光素_ 活性之劑量活性曲線顯示於圖37A及37B中，而在圖38A 和38B中將其繪成微量滴定盤的格式，並表示出曲線上每 一點的4次獨立測最之平均值；標準偏差約為153：。 與在預備試驗细胞株CHO C6-13中得自佛斯寇林之蟲螢 光素齡誘導作用的動力學（實例7a))相似地，在多巴胺 D 1 -受骽試驗细胞株C Η 0〗3 1) 1 - 3 8中，Μ阿樸嗎啡進行 1Η -受體的剌激作用之後一小時，測定蟲螢光素酶活性的 增加（圖37Α)。最大的蟲螢光素酶活化作用於刺激2.5個 小時之後達到，並維持不變直到4個小時。在使用佛斯寇 林之腺苷酸環化酶的直接活化作用後，以動力學進行比較 -69- 本紙張又度適用中國.國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝- *1Τ_ 經濟部中夾標準局S工消費合作社印製 81.9.20,000 A6 B6 經濟部中夾標準局3工消費合作社印製 五、發明説明（68) (圖35/0，導致我們推斷決定速率的步驟在蟲螢光素酶報 告者基因的轉錄和轉譯作用處，而非由活化受體對腺苷酸 環化酶的剌激作用。 圖37B是為了決定阿樸嗎啡之EDeo值而加Μ修飾的測量 記錄，其中在以競爭物進行受體刺激反應的期間，顯示不 具有EDS。值的明顯依存在關係。 圖38A則顯示因使用競爭物（阿樸嗎啡）之D卜受體活 化作用而來的報告者基因之誘導作用，可用拮抗劑K受體 -依賴方式來加K妨礙。為此目的在播種試驗细胞於微量 滴定盤之後24小時，使細胞與拮抗劑混合，並於其後立刻 加入定量的阿樸嗎啡（终濃度1//M)，如圖37A所示的完 成蟲螢光素酶報.告者基因之最.大誘導作用。為了模倣其中 Μ不變溶劑之形式較適切地提$試驗物質的篩選方法，在 - . 本實驗中使用終濃度為U的01^ 0。- 使用於此試驗程序中之物質的有效程度，與依據受體結 .合研究之文獻中所描述的資料非常相關。 圖38Β顯示了以其他形式記錄的相同數值（與作為對照 姐之全同且未經處理的细胞相比，蟲螢光素酶有X-倍的誘 導作用），以及另外的競爭物溴麥角環肽之劑量-依賴活 性。在溴麥角環狀最高湄度（]〇〇wM)處，蟲螢光素酶誘導 作用的逆轉規象，可歸因於溴麥角環狀本身的細胞毒性， 或是為溶解溴麥角瑁肽所必需扣低pH值。 啻例8 a )按照细胞內c A Μ P -濃度之函數來表現蟲螢光素酶的重姐 -70- (請先閱¾背面之;±意事项再填寫本頁) #L:. _裝· 訂· 本纸張尺度適用中國园家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 A6 B6 五、發明説明（69) 中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株（CRE -细胞株）之開發 為了製備用來測試會藉著與受體分子交互作用而直接或 間接影響細胞內cAMP-含量之物質的（預備）試驗细胞， K感覺DNA PADneo2-C12-TKL來轉化中國倉鼠卵巢细胞株 CH〇-DXBll(lir]aub 和 Chasin，1980)。（此質體與實例 1 )中所描述的pADneo2-C6-BGL不同之處在於含有6個 CRE-要素之片段為雙重的，並以TK-啟動子取代/5 -血球 蛋白啟動子（參見實例1 b))。為了完成這項事情，以類 似的已經切下並含有TK-啟動子的片段來取代Sal I-HinciIIT-/3-血球蛋白-啟動子-Η 段（Mcknight, 1980 ))° 將親代细胞株C Η 0 - D )ΓΒ 11培.養於Μ 1 0 %胎牛血清 (S e h a k )、次黃嘌呤（10 0 // MdT··—胸腺核苷（16/ζΜ)、盤尼 西林G納（〗00箪位/毫升）_；-，和鏈徽素（50單位/毫升 充過的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培 養液〗.640(Gibco)中。在進行轉移感染的前一天，將细胞 於置於新鮮的焙養液中。 經濟部中央桴準局员工消費合作社印製
如賁例7 a )來完成轉移感染作用及細胞無性繁殖糸的測 試。選出細胞無性繁殖系C12-32K進行更進一步的賁驗’ 因它出現最高蟲螢光素酶活性的基本量.，同時具有由佛斯 寇林而來非常高的可誘導性V b )桉照人類多巴胺D 5 -受體活.化的函數來表現蟲螢光素酶 之電姐C Η 0 -試驗細胞株的開發 本實例（類似前面的茛例7 ) Μ實例說明（對照組） -71- 本紙張又度適用中园國家標準（CNS) ΐ 4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 經濟部中央標準局ts工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（ CRE -試驗細胞之製備，它也適用在對於調節特定的，最好 是人類腺苷酸環化酶連結受體之物質的细胞篩選糸統。利 用人類多巴胺- D5-受體序列來製備受體DNA 。 將稍早已特徵化的細胞株CHO C1 2-32如a) K下之描述， 使用雷孔法Μ先前用20微克StuI弄直的質體pad-CMV1:D5 來轉移感染。（質體pAD-CMV1:D5係藉著將PhD5-gem的 1,600鹼基之Sall-Xbal-片段，它含有人類D5-受體基因 的密碼區（Grandy et al.，1991_),連结到也已經被切開的 人類載體PAD-CMV1之内。）從轉移感染後的那天起，將细 胞培養在選擇培養液中，此選擇係根據二氫葉酸還原酶 (DHFR)(不含核有：酸之培養液a-MEM(Gibc〇) 、10¾透析 過的胎牛血清（Sebak)、盤尼西林G納（1〇〇單位/毫升 )，和鏈黴素（5 0單位/毫升；3~ 700微克/毫升之基因 - 素（G - 4 1 8，（H h c 〇 - B R L ) ’其後以.目視檢査细胞的生長。 如上所述’使2 4個各自分開的细胞無性繁殖糸在6孔细胞 培養盤上生長，並在K〗0 w Μ阿樸嗎啡（多巴胺受體的競 爭物）處理後4小時’針對與未經處理的细胞相比之下在 蟲螢光素酶活性上的任何增加來測試细胞。在反覆的實驗 中，無性繁殖糸CHO 32D5-39在多巴胺05-受體活化之後 ，於蟲螢光素酶活性上出現最高的增加量。 圓39Α顯示經由使用競爭物_ (阿樸嗎啡）之05-受體活 化作用的報告者基因之誘導作南，可藉著拮抗劑Κ劑量-依賴方式來加Κ妨礙。為了完成此事，在將試驗细胞播種 於微慑滴定盤中之後24小時，使其與拮抗劑混合，之後立 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) %「 -----裝-l·---------£--- A6 B6 五、發明説明（71) (請先閲¾背面之注意事項再塡寫本頁) 刻加入-定量的阿樸嗎啡（终濃度O.lwM)，並完成蟲螢 光素酶報告者基因最大限度的誘導作用，如圖39A所示。 這些實驗的结果顯示於圖39B。 在此試驗程序所使用之物質的有效程度，與依據受體结 合研究之文獻中所描述的資料非常相關。 實例9用於測定蟲螢光素酶活性之試劑的開發 •裝. 測定出改變ATP 、蟲螢光素、MgS04· 7H2〇 、二硫蘇糖 醇（DTT);S-巯基乙醇（BME)、三聚磷酸納（NaTPP)、三通 X-100之濃度和在獲得蟲螢光素酶測定訊號時之出值的影 響（表2 )。在表1中顯示出Μ相當於最佳基礎緩衝溶液 之濃度存在的保留成分。利用在加入試劑後三分鐘所獲得 的測量值來進行比較Γ依照所.獲得最大測量訊號的百分比 來表示）。 · 訂. 圖40顯示在用於蟲螢光素蜂侧定訊號之基礎緩衝溶液中 加入/3 -锍基乙醇和/或三聚磷酸鈉的影響（實心正方形 :基礎緩衝溶液；空心正方形：加入4微升/毫升/3 -蹄 基乙醇；實心圓圈：加入0.2毫克/毫升三聚瞵酸納；空 心圓圈：加入4微升/毫升/3 -锍基乙醇和0.2毫克/毫 升三聚磷酸納）。所有的實驗均使用由Dynatech公司製造 ，標示名稱為“<:「〇146，11000的發光計。 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 -73- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公辁） 81.9.20.000 A6 B6 五、發明説明（72) 表 1 物質 微毫莫耳/升 分子量 克/升 麥黃嗣* 25 179 4.48 EDTA 0.5 372 0.186 MgS(U.7H20 16.3 246 4.0 ATP 1 . 2 605 0.726 蟲榮光素納鹽 0.05 302 0.015 DTT 6.5 154 1 .0 NaTTP 0.54 368 0.2 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 三-（羥甲基）甲基-甘胺酸 三通）(-100:1毫升/升。以1付！^0[1將出值調至7.8。 -丨裝- 經濟部中央標準局員工消赀合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公坌） 81.9.20,000 五、發明説明（73) 19 90.〇 'n6 π·〇 〇0 16Γ0 A6 B6 ζ φ 006sd eCJO I寸.1 SI 〇ε.ί 經濟部中央標準局貝工消CH合作社印製 s/w)sii?-dlv
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£9 Q· L 黯Bi4<I«^ Ducu 81.9.20,000 (請先閲請背.面之注意事項再塡寫本頁) .裝， -s· A6 B6 五、發明説明（74) 6 參考文獻：
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Met Asp lie Leu Cys Glu Glu Asn 1 — - 5 ACT TCT TTG AGC TCA ACT ACG 7VAC TCC CTA ATG CAA TTA AAT GAT GAC 279
Thr Ser Leu Ser Ser Thr Thr Asn Ser Leu Met Gin Leu Asn Asp Asp 10 15 20 ACC AGG CTC TAC AGT ΛΛΤ GAC TTT AAC TCC GGA GAA GCT AAC ACT TCT 327
Thr Arg Leu Tyr ser Asn Asp Phe Asn Ser Gly Glu Ala Asn Thr ser 25 30 35 40 GAT GCA TTT AAC TGG ACA GTC GAC TCT GAA ΑΛΤ CGA ACC AAC CTT TCC 37 5
Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp Ser Glu Asn Arg Thr Asn Leu ser 45 50 55 經濟部中央標準局與工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) TGT GAA GGG TGC CTC TCA CCG TCG TGT CTC TCC TTA CTT CAT CTC CAG 423 cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser Cys Leu-Ser Leu Leu His Leu Gin 6〇 65 70 · GAA ΛΛΑ AAC TGG TCT GCT TTA CTG ACA GCC GTA GTG ATT ATT CTA ACT 471
Glu Lys Asn Trp ser Ala Leu Leu Thr Ala Val Val lie He Leu Thr 75 80 85 -81- 本紙張又度適用中园國家標準（CNS)甲4也格（210 X 297公货） 81.9.20,000 B6 五、發明説明（S〇) ATT GCT GGA AAC ΑΤΑ CTC GTC ATC ATG GCA GTG TCC CTA GAG AAA AAG lie Ala Gly Asn lie Leu Val lie Met Ala Val ser Leu Glu Lys Lys 90 95 100 519 CTG CAG ΑΛΤ GCC AQC AAC ΤΛΤ TTC CTG ATG TCA CTT GCC ATA GCT GAT Leu Gin Asn Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala lie Ala Asp 105 110 · 115 120 567 ATG CTG CTG GGT TTC CTT GTC ATG CCC GTG TCC ATG TTA ACC ATC CTG Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met Pro Val Ser Met Leu Thr lie Leu ' 125 130 135 615 ΤΛΤ GGG TAC CGG TGG CCT CTG CCG AGC AAG CTT. TGT GCA GTC TGG ATT Tyr Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro Ser Lys Leu cys Ala Val Trp lie 140 145 150 663 TAC CTG GAC GTG CTC TTC TCC ACG GCC TCC ATC ATG CAC CTC TGC GCC Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser lie Met His Leu Cys Ala 155 160 165 711 ATC TCG CTG GAC CGC TAC GTC GCC ATC CAG ΑΛΤ CCC ATC CAC CAC AGC lie ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala lie G4n Asn Pro lie His His Ser • . 170 175 . _ 180 759 CGC TTC AAC TCC AGA ACT AAG GCA TTT CTG AAA ATC ATT GCT GTT TGG Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala Phe Leu Lys lie lie Ala Val Trp 185 190 195 200 807 ACC ΑΤΛ TCA GTA GGT ATA TCC ATG CCA ATA CCA GTC TTT GGG CTA CAG 855 Thr lie Ser Val Gly lie Ser Met Pro lie Pro Val Phe Gly Leu Gin 205 210 215 GAC GAT TCG AAG GTC TTT AAG GAG GGG AGT TGC ΤΤΛ CTC GCC GAT GAT 903 Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu Gly Ser Cys Leu Leu Ala Asp Asp 220 225 230 經濟部中夾標準局3工消費合作社印製 AAC TTT GTC CTG ATC GGC TCT TTT GTG TCA TTT TTC ATT CCC TTA ACC Asn Phe Val Leu lie Gly Ser Phe Val ser Phe Phe He Pro Leu Thr 235 240 245 ATC ATG GTG ATC ACC TAC TTT CTA ACT ATC AAG TCA CTC CAG AAA GAA lie Met Val lie Thr Tyr Phe Leu Thr .lie Lys Ser Leu Gin Lys Glu 250 255 260 -82- 951 999 81.9.20.000 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297 ;釐） A6B6 經濟部中央標準局3工消"合作社印製 五 、發明説明（81) - GCT ACT TTG TGT GTA AGC GAT CTT GGC ACA CGG GCC AAA TTA GCT TCT 1047 Ala Thr Leu Cys Val ser Asp Leu Gly Thr Arg Ala Lys Leu Ala Ser 265 270 275 280 TTC AGC TTC CTC CCT CAG AGT TCT TTG TCT TCA GAA AAG CTC TTC CAG 1095 Phe Ser Phe Leu Pro Gin Ser Ser Leu Ser Ser Glu Lys Leu Phe Gin 285 290 295 CGG TCG ATC CAT AGG GAG CCT GGG TCC TAC ACA GGC AGG AGG ACT ATG 1143 - Arg Ser •lie His Arg Glu Pro Gly Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr Met 300 305 310 i \ CAG TCC ATC AGC ΑΛΤ GAG CAA AAG GCA TGC AAG GTG CTG GGC ATC GTC 1191 Gin ser lie Ser Asn Glu Gin Lys Ala Cys Lys Val Leu Gly lie Val 315 320 325 TTC TTC CTG TTT GTG GTG ATG TGG TGC CCT TTC TTC ATC ACA AAC ATC 1239 Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp Cys Pro Phe Phe lie Thr Asn lie 330 335 - - 340 ATG GCC GTC ATC TGC AAA GAG TCC TGC aSt GAG GAT GTC ATT GGG GCC & 1287 Met Ala Val He Cys Ly s Glu Ser Cys Afn •Glu Asp Val lie Gly Ala 345 350 * 355 360 CTG CTC ΛΑΤ GTG TTT GTT TGG ATC GGT TAT CTC TCT TCA GCA GTC AAC 1335 Leu Leu Asn val Phe Val Trp lie Gly Tyr Leu Ser ser Ala Val Asn 365 370 375 CCA CTA GTC TAC ACA CTG TTC AAC AAG ACC TAT AGG TCA GCC TTT TCA 1383 Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Tyr Arg Ser Ala Phe Ser 380 385 390 CGG TAT ATT CAG TGT CAG TAC AAG GAA hAC .AAA ΛΑΛ CCA TTG CAG TTA 1431 Arg Tyr lie Gin Cys Gin Tyr Lys Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gin Leu 395 400 405 ATT ΤΤΛ GTG AAC ACA ATA CCG GCT TTG GCC TAC AAG TCT AGC CAA CTT 1479 lie Leu Val Asn Thr lie Pro Ala Leu Ala Tyr Lys Ser set Gin Leu 410 415 - 83- 420 面 之- 注 項 再 塡 頁 t 裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 五、發明説明（82 ) A6 B6 經濟部中夾標準局S 4消费合作社印製 CAA ATG GGA CAA ΑΑΛ AAG ΛΛΤ TCA AAG CAA GAT GCC AAG ACA ΛΟΑ. GAT 1527 Gin Met Gly Gin Lys Lys Asn Ser Lys Gin Asp Ala Lys Thr Thr Asp 425 "430 435 440 ΑΛΤ GAC TGC TCA ATG GTT GCT CTA GGA AAG CAG CAT TCT GAA GAG GCT . 1575 „ Asn Asp cys Ser Met Val Ala Leu Gly Lys Gin His Ser Glu Glu Ala 445 450 455 TCT ΑΑΛ GAC AAT AGC GAC GGA GTG AAT GAA AAG GTG AGO TGT GTG TGATAGGCTA 1630 ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val Asn Glu Lys Val Ser Cys Val “ 460 465 470 (2)關於序列識別號：2的知識： (i )序列特徵： 钩長度：471個胺基酸 (B型式：胺基'酸 Ο局部解剖學：·直線Γ形-(ii )分子型式：蛋白質 ，--(iii )序列識別號：2的序列圖： Met Asp He Leu cys Glu Glu Asn Thr ser Leu ser ser Thr Thr Asn - 15 10 15 Ser Leu Met Gin Leu Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe 20 25 30 - Asn Ser Gly Glu Ala Asn Thr ser Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp 35 40 45 Ser Glu Asn Arg Thr Asn Leu ser cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser 50 55 60 - 8 4 _ 本纸银尺·度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 (請汜«_讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· 訂. A6B6 五、發明説明（83 )
Cys Leu ser Leu Leu His Leu Gin Glu Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu 65 70 75 80
Thr Ala Val Val lie lie Leu Thr lie Ala Gly Asn He Leu Val lie 85 90 · 95
Met Ala val Ser Leu Glu hys Lys Leu Gin Asn Ala Thr Asn Tyr Phe 100 105 110
Leu* Met Ser Leu Ala lie Ala Asp Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met 115 * ** 120 125
Pro Val Ser Met Leu Thr lie Leu Ty'r Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro 130 135 140
Ser Lys Leu cys Ala val Trp lie Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr 145 150 155 160
Ala Ser lie Met His Leu cy.s Ala He Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala 165 170 175
He Gin Asn Pro lie His His SeT Arg*Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala 180 1-β5" 190
Phe'Leu Lys lie lie Ala Val Trp Thr lie ser Val Gly lie Ser Met 195 200 205
Pro lie Pro Val Phe Gly Leu Gin Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu 210 215 220
Gly ser cys Leu Leu Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu lie Gly Ser Phe 225 ' 230 235 240 經濟部中失標準局負工消費合作社印製
Val Ser Phe Phe lie Pro Leu Thr lie Met Val He Thr Tyr Phe Leu 245 ^ 250 255
Thr He Lys Ser Leu Gin Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu 260 265 270
Gly Thr Arg Ala Lys Leu Ala Ser Phe ser Phe Ley pro Gin ser Ser 275 280 285 -8 5 - 81.9.20,000 (請先閲-贵面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國固家標準（CNS〉甲4規格（210 x 297公货〉 A6 B6 經濟部中典櫺準局Μ工消費合作社印製 五、發明説明（84 ) Leu ser Ser Glu I>ys l»eu Phe Gin Arg Ser lie His Arg Glu Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr Met Gin Ser lie Ser Asn Glu Gin Lys 305 31〇 315 320 Ala Cys Lys Val Leu Gly lie Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp 325 330 * 335 Cys Pro Phe Phe He Thr Asn^Ile Met Ala Val He Cys Lys Glu Ser 340 345 ： 350 Cys Asn Glu Asp Val lie Gly Ala Leu Leu Asn Val Phe val Trp lie 355 360 365 Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Val Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn 370 375 380 Lys Thr Tyr Arg ser Ala Phe Ser Arg Tyr lie Gin cys Gin Tyr Lys 385 390 一 _ 395 400 1= · Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gin Leu ILe .Leu Val Asn Thr lie Pro Ala 405 410 415 Leu Ala Tyr Lys Ser Ser Gin Leu Gin Met Gly Gin Lys Lys Asn Ser 420 425 430 Lys'Gin Asp Ala Lys Thr Thr Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Lea 435 440 445 Gly Lys Gin His ser Glu Glu Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val 450 455 460 Asn Glu Lys Val Ser Cys Val ' 465 470 -86- 本纸張尺度適用中國园家標準（CNS)甲4规格（21〇 X 297公轮） 81.9.20,000 (請先閱is背面之注念寧項再塡寫本頁) -I.裝 1 訂· 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 A6 _'_B6_ 五、發明説明（85 ) (2)關於序列識別號：3的知識： (i )序列特徵： (A)長度：23個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 〇局部解部學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號：3的序列圖： GGAATTCGCG CCCTGTAGCG GCG 23 ⑵關於序列識別號：4的知識： (i )序列特徵： •A)長度：37個飴基對-(B型式：核酸 ·=Γ - Ο股型：單股 _r . - Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號·· 4之序列圖： CACTGAACTC GAGCAGCTGC GTTGCTGGCG TTTTCC 37 ⑵關於序列識別號：5的知識： (i )序列特徵： ㈧長度：64個鹼基對_ ©型式：核酸 ' Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公楚） 81.9.20,000 (請先間讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝- -1T* A6 B6 五、發明説明（86 ) (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i)序列識別號：5的序列圖： GACTTCAGAT CTGCGGCCGC CTCGAGGGTA CCGTTAACGT CGACAAACCC CGCCCAGCGT 60 CTTG 64 ⑵關於序列識別號：6的知識： (i )序列特徵： ㈧長度：56涸鹼基對 ©型式：核酸 . 〇股型：單股 .〇局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成袖寡去.氧核糖核苷酸 (X Π序列識別號：6的-序列I® GACTTCGGAT CCGAGCTCAC TAGfTCTAGA AAGCTTGACG CTGTTAAGCG GGTCGC 56 ⑵關於序列識別號：7的知識： (i )序列特徵： 經濟部中央棕準局只工消费合作社印製 (A)長度：56個鹼基對 ⑭型式：核酸 〇股型：單股 〇局部解剖學：直綴形 (ii )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號：7的序列圖：
GACTTCGGAT CCGAGCTCAC TAGTTCTAGA AAGCTTGACG 81.9.20,000 (請先閲垃背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 本紙强^^適用中關家標準（CNS)甲後格（210 X 297战） A6 B6 五、發明説明（87 ) CTGTTAAGCG GGTCGC 56 (2)關於序列識別號：8的知識： (i )序列特徵： ㊇畏度：45個鹼基對 ©型式：核酸 •Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核《酸 (X ί )序列識別號：8的序列圖：
AGCTTGTAAG CAGCAGCTGC AGTGCTCTGC CTTTTATGCC CAAGG 45 ⑵關於序列識別號：9別知識-: (i )序列特徵： 二~ _ (A)長度：2 1個鹼基賢--(B型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號：9的序列圖： TCGATGCGGC CGCGACTTCA G 21 經濟部中央標準局爲工消费合作社印製 ⑵關於序列識別號：1 〇的知鞾： (i )序列特微： ^ (A)長度：1 7個鹼基對 ©型式：核酸 -89 - 81.9.20,000 (請先閲-背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. - 以, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局R工消费合作社印製 A6 _'_B6_ 五、發明説明（88 ) • <〇股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X Π序列識別號：1 0的序列圖： CTGAAGTCGC GGCCOCA 17 ⑵關於序列識別號：1 1的知識： (i )序列特徵： ㊇長度：25個鹼基對 ©型式：核酸· Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成询寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：1 1的序？1C圃" GGCAGCTGAC GTCACTGTCT GGT^C- - 25 ⑵關於序列識別號：1 2的知識： (i )序列特徵： W長度：35個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號：1 2的序列ill : CTCCTTGGCT GACGTCAGTA GAGAGATCCC ATGGC 35 ⑵關於序列識別號：1 3的知識： -90 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .τί 丨裝， 訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（89 ) (i )序列特徵： ㈧長度：27個鹼基對 Θ型式：核酸 〇股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：1 3的序列圖： CTCTACTGAC GTCAGCCAAG GAGGTAC 27 ⑵闞於序列識別號：14的知識： (i )序列特徵： 构長度：47個鹼基對 ©型式：核酸― 〇股型：單股- 亡-〇局部解剖學：直線^形-(Π )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：1 4的序列圖： CGTCATACTG TGACGTCTTT CAGACACCCC ATTGACGTCA ATGGGAG 47 (2)關於序列識別號：1 5的知識： (i )序列特徴： •A)長度：4 1個鹼基對. ©型式：核酸 ' Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 -91 - 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（2丨0 X 297公釐） 81.9.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -丨裝. '^. 五、發明説明（90 ) A6 B6 經浒部中央標準局KC工消费合作社印製 (ii )分子型式： 合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號 :1 5的序列圖： GGCCGCACCA GACAGTGACG TCAGCTGCCA GATCCCATGG C 41 (3)關於序列識別號 :1 6的知識： (i )序列特徵： (A)長度： 35個鹼基對 ©型式： 核酸 Ο股型： 單股 Ο局部解 剖學：直線形 (ii )分子型式： 合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號 :1 6的序列圖： CTCCTTGGCT GACGTCAGT'A GAG AGATCCC ATGGC 35 ⑵關於序列識別號 :17的知識- (i )序列特徵： 妁長度： 63個鹼基對 (B型式： 核酸 <〇股型： 單股 〇局部解 剖學：直線形 (Π )分子型式： 合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號 :1 7的序列圖： TCGACTCCCA TTGACGTCAA TGGGGTGTCT GAAAGACGTC ACAGTATGAC GGCCATGGGA 一 60 TCT 63 ⑵關於序列識別號 :1 8的知識： -92- 本紙张尺度適用中國园家標準（CNS)甲4規格（2i0 X 297公姥） (請先閲¾背面之注念事項再塡寫本頁) .丨裝. *δτ, 81.9.20,000 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 A6 ____B6 五、發明説明（91 ) (ί )序列特徵： <Α)長度：57個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號：1 8的序列圖： GGCCGCAGGT ACCAGATCTA CTCGAGTGTA GACCGTGATT CAAGCTTAGC TGTAGAC 57 ⑵關於序列識別號：1 9的知識： (i )序列特徵： (A)長度’· 41個Μ基對-(B型式：核酸 ·. -Γ -Ο股型：單股 二- Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：1 9的序列圖： GCTTGAATCA CGGTCTACAC TCGAGTAGAT CTGGTACCTG C 41 ⑵關於序列識別號：2 〇的知識： (i )序列特徴： <A)長度：5 6個鹼基對_ ©型式：核酸 _ Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 -93 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝. 訂. A6 B6 五、發明説明（92 ) (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X ί )序列識別號·· 20的序列圖： TCGACTAAGC TTGAATCACG GTCTACAGCT AAGCTTGΑΑΤ CACGGTCTAC AGCTTAA 56 ⑵關於序列識別號：21的知識： (i )序列特徵： 妁長度：40個鹼基對 ©型式：核酸 〇股型：單股 . 〇局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i)序列識別號：2Γ的序列圖： CGTGATTCAA GCTTAGCTGT AGACTGTGAT TCAAGCTTAG 40 (2)關於序列識別號：22的知識;·:--(i )序列特徵： ㈧長度：56個鹼基對 (B型式：核酸 〇股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (xi)序列識別號：22的序列圖： GGCCGCAGGT ACC AGATCTA CTCG AGTGTA GACCGTGATT CAAGCTTAGT GTAGAC 56 ⑵關於序列識別號：2 3的知識： -94 一 本纸張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） (請先閲¾背面之注念求項再塡窝本页) .1裝. 訂. 經濟部中央標準局tw工消#合作社印製 81.9.20,000 經濟部中夾標準局Μ工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（93 ) (i )序列特徵： (A)長度：50個鹼基對 ⑭型式：核酸 <〇股型：簞股 〇局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：2 3的序列圖·· TCGACCTTGA ATCACGGTCT ACACTAAGCT TGAATCACGG TCTACACTAA 50 ⑵關於序列識別號：2 4的知識： (i )序列特徵： ㈧長度：35個餹基對. (B型式：核酸 二- - W—- Ο股型：單股 _r . - 〇局部解剖學：直線形. (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：24的序列圖： CGTGATTCA A GCTTAGTGTA GACCGTGATT CAAGG 35 ⑵關於序列識別號：2 5的知識： (i )序列特徵： W長度·· 53個鹼基對_ 0型式：核酸 ^ Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 .(請先閲讀背面之注念事項再塡寫本頁) i裝_ .11_ 經濟部中央標準局8工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（94 ) (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i)序列識別號：2 5的序列圖·· GGCCGCAGGT ACCAGATCTA CTCGAGTGTA GACCGTGATT CAAGCTTAGC CTG 53 ⑵關於序列識別號：2 6的知識： (i )序列特徵： <A)長度：64個鹼基對 ©型式：核酸 〇股型：單股 〇局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (>? i)序列識別號：2 6%序列.圖：
TCGACTA'AGC TTG AATCACG ^TCrffC^CCA GGCTAAGCTT - ·»— 一 GAATCACGGT CTACACCAGG ,- - -60 CTAA 64 ⑵關於序列識別號：2 7的知識： (i )序列特徴： ㈧長度：52個鹼基對 ©型式：核酸 . Ο股型：單股 〇局部解剖學：直線_形 (ii)分子型式：合成的寡去氣核糖核苷酸 (X i )序列識別號：2 7的序列圖：
GTGTAGACCG TGATTCAAGC TTAGCCTGGT GTAGACCGTG -96- 本紙張又度適用中國國家標準（CMS) f 4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 (請先閱ΐί背面之注意事項再塡·冩本頁) 丨裝- 訂_ 經濟部中央標準局t«工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（95 ) ATTCAAGCTT AG 52 ⑵關於序列識別號：2 8的知識： (i )序列特徵： (A)長度：64個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X Π序列識別號：2 8的序列圖： GGCCGCAGGT ACCAGATCTA CTCGAGTGTA GACCGTGATT CAAGCTTAGC CTGGCGGTGT 60 AGAC ' 64 ⑵關於序列識別號：2 9的知識TT ~ (i )序列特徵： _r -- 長度：50個鹼基對 ©型式··核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：2 9的序列画： CCAGGCTAAG CTTGAATCAC GGTCTACACT CGAGTAGATC TGGTACCTGC 50 ⑵關於序列識刖號：3 0的知識： (i )序列特徵： - 9 7 - 本紙張適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 (請先閲¾背面之注意事項再塡寫本頁) •裝. 訂. A6 B6 五、發明説明如） (A)長度：51個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：3 0的序列圖： CGTGATTCAA GCTTAGCCTG GCGGTGTAGA CCGTGATTCA AGCTTAGCCT G 51 ⑵關於序列識別號：31的知識： (i )序列特徵： 旳長度：6 5個鹼基對 ©型式：核酸~ Ο股型：單股 〇局部解剖學：直％形.. (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：3 1的序列圖： TCGACAGGCT AAGCTTGAAT CACGGTCTAC ACCGCCAGGC TAAGCTTGAA TCACGGTCTA 60 CACCG 65 ⑵關於序列識別號：3 2的知識： (i )序列特徵： _ (A)長度：7 4個鹼基對^ (B型式：核酸 Ο股型：單股 一 9 8 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公焓
(請先閲讀背面之注意事項再填A .裝- 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 81.9.25.000 五、發明説明（97 ) A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 Ο局部解剖學：直線形 (Π )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：32的序列圖： GGCCGCAGGT ACCATATCTA CTCGAGTGTA GACCGTGATT CAAGCTTAGC CTGGCCGGTT 60 A^GCGCGGTGT AG AC 7 4 ⑵關於序列識別號：3 3的知識： (i )序列特徵： 构長度：62個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學…直線.形 (Π)分子型式：合成的·寡去I*艰糖核苷酸 - -—. (X i )序列識別號：3 3的序歹1]_-圖：. CGCGCTAACC GGCCAGGCT-A AGCTTGAATC ACGGTCTACA CTCGAGTAGA TCTGGTACCT 60 GC 62 ⑵關於序列識別號：34的知識： (i )序列特It : ㈧長度：7 3個鹼基對 Θ型式：核酸 _ Ο股型：單股 ^ Ο局部解剖學：直線形 (ii )分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 99- 衣紙張尺廋適用中國國定標準（CNS)甲4邦格（210 X 2Q7公 81.9.25.000 請： 先 閲 讀 背‘ 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 頁 裝 訂 % A6 B6 經濟部中央標準局MK.工消費合作社印製 五、發明説明（98) (X i )序列識別號：3 4的序列圖： T C G A C A G G C T AAGCTTGAAT C A C G G T C T A C ACCGCGCTAA CCGGCCAGGC TAAGCTTGAA 60 TCACGGTCTA CAC 73 ⑵闢於序列識別號：3 5的知識： (i )序列特徵： 趵長度：61個鹼基對 ©型式：核酸 ’ Ο股型：單股 〇局部解剖學：直線形 (ii)分子型式：合成的寡去氧核糖核苷酸 (X i )序列識別號：3 5啲序列_圖： CGTGATTCAA GCTTAGCCTG -GCCS^T-TAGC GCGGTGTAGA CCGTGATTCA AGCTTAGCCT : - - 60 G 61 ⑵關於序列識別號：3 6的知識： (i )序列特徵： ㈧長度：6623個鹼基對 ©型式：核酸 Ο股型：單股 Ο局部解剖學：環賊 (ii )分子型式：質體-D N A ^ (X i )序列識別號：3 6的序列圖： -100 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公公 81.9.25.000 (請先閲讀背面之注意事項再填义 i裝. 訂·
A6B6 五、發明説明纪9 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 AATCAATATT GGCAATTAGC CATATTAGTC ATTGGTTATA TAGCATGAAT CAATATTGGC 60 TATTGGCCAT TGCATACGTT GTATCTATAT CATAATATGT * ACATTTATAT TGGCTCATGT 120 CCAATATGAC CGCCATGTTG ACATTGATTA TTGACTAGTT ATTAATAGTA ATCAATTACG 180 GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC 240 CCGCCTGGCT GACCGCCCAA CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC 300 ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATtGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT 360 GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT 420 GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT 480 TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC 540 ATCAATGGGC GTGGATAGCG GTTTGAGTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC 600 GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT'CAAG6GGACT - «—, TTCCAAAATG TCGTAACAAC 660 TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA TATAAGCAGA 720 GCTCTCTGGC TAACTAGAGA ACCCACTGCT TACTGGCTTA TCGAAATTAA TACGACTCAC 780 TATAGGGAGA CCCAAGCTTC TGCAGGTCGA CATCGATGGA TCCGGTACCT CGAGCGGCCG 840 CGAATTCTCT AGAGGATCTT TGTGAAGGAA CCTTACTTCT GTGGTGTGAC ATAATTGGAC 900 AAACTACCTA CAGAGATTTA AAGCTCTAAG GTAAATATAA AATTTTTAAG TGTATAATGT 960 GTTAAACTAC TGATTCTAAT TGTTTGTGTA TTTTAGATTC CAACCTATGG AACTGATGAA 1020 TGGGAGCAGT GGTGGAATGC CTTTAATGAG GAA^ACCTGT TTTGCTCAGA AGAAATGCCA 1080 TCTAGTGATG ATGAGGCTAC TGCTGACTCT CAACATTCTA CTCCTCCAAA AAAGAAGAGA 1140 AAGGTAGAAG ACCCCAAGGA CTTTCCTTCA GAATTGCTAA GTTTTTTGAG TCATGCTGTG 1200 -101- (請先間讀背面之注意事項再填寫 ! 丨裝- 奸· 本紙張尺度適用中國國京橒準（CNS)甲4梘払的7么、益、 81.9.25.000 A6 B6 五、發明説明（1〇0 TTTAGTAATA GAACTCTTGC TTGCTTTGCT ATTTACACCA CAAAGGAAAA AGCTGCACTG 1260 CTATACAAGA AAATTATGGA AAAATATTTG ATGTATAGTG CCTTGACTAG AGATCATAAT 1320 CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT 1380 GPJKCCTGhAA CATAAAATGA ATGCAATTGT TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA 1440 TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA 1500 ' · TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTGGA TCAATTCTGA 1560 AAAACTAGCC TTAAAGACAG ACAGCTTTGT TCTAGTCAGC CAGGCAAGCA TATGTAAATA 1620 AAGTTCCTCA GGGAACTGAG GTTAAAAGAT GTATCCTGGA CCTGCCAGAC CTGGCCATTC 1680 ACGTAAACAG AAGATTCCGC CTCAAGTTCC GGTTAACAAC AGGAGGCAAC GAGATCATCG 1740 CTGTTCCTTA GGACCCTTTT ACTAACCCTA ATTC^ATAGC ATATGCTTCC CGTTGGGTAA 1800 - =—. C^TATGCTAT TGAATTAGGG TTAGTCTGGA TAGTAT-ATAC TACTACCCGG GAAGCATATG 1860 CTACCCGTTT AGGGTTAACA AGGGGGCCTT ATAAACACTA TTGCTAATGC CCTCTTGAGG 1920 GTCCGCTTAT CGGTAGCTAC ACAGGCCCCT CTGATTGACG TTGGTGTAGC CTCCCGTAGT 1980 CTTCCTGGGC CCCTGGGAGG TACATGTCCC CCAGCATTGG TGTAAGAGCT TCAGCCAAGA 2040 GTTACACATA AAGGCAATGT TGTGTTGCAG TCCACAGACT GCAAAGTCTG CTCCAGGATG 2100 AAAGCCACTC AGTGTTGGCA AATGTGCACA TCCATTTATA AGGATGTCAA CTACAGTCAG 2160 AGAACCCCTT TGTGTTTGGT CCCCCCCCGT GTCACATGTG GAACAGGGCC CAGTTGGCAA 2220 GTTGTACCAA CCAACTGAAG GGATTACATG CACTGCCCCG CGTGAGCAAT ACAAAACAAA 2280 AGCGCTCCTC GTACCAGCGA AGAAGGGGCA GAGATGCCGT AGTCAGGTTT AGTTCGTCCG 2340 GCGGCGCCAG AAATCCGCGC GGTGGTTTTT GGGGGTCGGG GGTGTTTGGC AGCCACAGAC 2400 -102- 先 閲 讀 面 之 注 意 事 項 再 塡 窝Ϊ 裝 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作.社印製 五、發明説明（101 ) GCCCGGTGTT .CGTGTCGCGC CAGTACATGC GGTCCATGCC CAGGCCATCC AAAAACCATG 2460 1 1 請 Λ." 1 1 GGTCTGTCTG CTCAGTCCAG TCGTGGACCT GACCCCACGC AACGCCCAAA AGAATAACCC 2520 κ» 閲 1 讀 I CCACGAACCA TAAACCATTC CCCATGGGGG ACCCCGTCCC taacccacGg GGCCCGTGGC 2580 背- 面 1 1 1 之 1 1 TATGGCGGGC TTGCCGCCCC GACGTTGGCT GCGAGCCCTG GGCCTTCACC CGAACTTGGG 2640 ^ 注 l 意 1 事 l GGTTGGGGTG GGGAAAAGGA AGAAACGCGG GCGTATTGGC CCCAATGGGG TCTCGGTGGG 2700 項 1 - 再 1 GTATCGACAG AGTGCCAGCC CTGGGACCGA ACCCCGCGTT TATGAACAAA CGACCCAACA 2760 填 1 CCCGTGCGTT TTATTCTGTC TTTTTATTGC CGTCATAGCG CGGGTTCCTT CCGGTATTGT ♦ 2Q20 J\ 1 CTCCTTCCGT GTTTCAGTTA GCCTCCCCCA TCTCCCGATC CCTATTCCTT TGCCCTCGGA 2880 1 1 CGAGTGCTGG GGCGTCGGTT TCCACTATCG GCGAGTACTT CTACACAGCC ATCGGTCCAG 2940 1 1 裝 ACGGCCGCGC TTCTGCGGGC GATTTGTGTA CGCCCGACAG TCCCGGCTCC GGATCGGACG 3000 1 I ATTGCGTCGC ATCGACCCTG CGCCCAAGCT GCATCATCGA AATTGCCGTC AACCAAGCTC 3060 TGATAGAGTT GGTCAAGACC AAfGCGGAGC - e—. ATATACGCCC GGAGCCGCGG CGATCCTGCA 3120 訂 AGCTCCGGAT GCCTCCGCTC GAAGTAGCGC GTCTGCTGCT CCATACAAGC CAACCACGGC 3180 CTCCAGAAGA AGATGTTGGC GACCTCGTAT TGGG7VATCCC CG7VACATCGC CTCGCTCCAG 3240 TCAATGACCG CTGTTATGCG GCCATTGTCC GTCAGGACAT TGTTGGAGCC GAAATCCGCG 3300 TGCACGAGGT GCCGGACTTC GGGGCAGTCC TCGGCCCAAA GCATCAGCTC ATCGAGAGCC 3360 ' . 1 TGCGCGACGG ACGCACTGAC GGTGTCGTCC ATCACAGTTT GCCAGTGATA CACATGGGGA 3420 - 1 ! TCAGCAATCG CGCATATGAA ATCACGCCAT GTAGTGTATT GACCGATTCC TTGCGGTCCG 3480 — 1 AATGGGCCGA ACCCGCTCGT CTGGCTAAGA TCGGCCGCAG CGATCGCATC CATGGCCTCC 3540 ... 1 1 1 GCGACCGGCT GCAGAACAGC GGGCAGTTCG GTTTCAGGCA GGTCTTGCAA CGTGACACCC 3600 1 1 1 TGTGCACGGC GGGAGATGCA ATAGGTCAGG CTCTCGCTGA ATTCCCCAAT GTCAAGCACT 3660 1 1 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公分） 81,9.25.000 五、發明説明（102 ) A6 B6 經 濟 部 中 央 標 準 局 貝 工 消 費 合 作 社 印 製 TCCGGAATCG GGAGCGCGGC CGATGCAAAG TGCCGATAAA CATAACGATC TTTGTAGAAA 3720 CCATCGGCGC AGCTATTTAC CCGCAGGACA TATCCACGCC CTCCTACATC GAAGCTGAAA 3780- GCACGAGATT CTTCGCCCTC CGAGAGCTGC ATCAGGTCGG AGACGCTGTC GAACTTTTCG 3840 ATCAGAAACT TCTCGACAGA CGTCGCGGTG AGTTCAGGCT TTTTCATATC TCATTGCCCC 3900 CGGACGAGGA TCTGCGGCAC GCTGTTGACG CTGTTAAGCG GGTCGCTGCA GGGTCGCTCG 3960 GTGTTCGAGG GCACACGCGT CACCTTAATA TGCGAAGTGG ACCTGGGACC GCGCCGCCCC 4020 GACTGCATCT GCGTGTTCGA ATTCGCCAAT GACAAGACGC TGGGCGGGGT TTGTGTCATC 4030 ATAGAACTAA AGACATGCAA ATATATTTCT >» TCCGGGGACA CCGCCAGCAA ACGCGAGCAA 4140 CGGGCCACGG GGATGAAGCA GGGCGGCACC TCGCTAACGG ATTCACCACT CCAAGAATTG 4200 GAGCCAATCA ATTCTTGCGG AGAACTGTGA ATGCGCAAAC CAACCCTTGG CAGAACATAT 4260 CCATCGCGTC CGCCATCTCC AGCAGCCGCA CGCGtTCGCAT - s—. CTCGGGCAGC GTTGGGTCCT 4320 GGCCACGGGT GCGCATGATC GTGCTCCTGT CGTTGAGGAC CCGGCTAGGC TGGCGGGGTT 4380 GCCTTACTGG TTAGCAGAAT GAATCACCGA TACGCGAGCG AACGTGAAGC GACTGCTGCT 4440 GCAAAACGTC TGCGACCTGA GC^ACAACAT GAATGGTCTT CGGTTTCCGT GTTTCGTAAA 4500 GTCTGGAAAC GCGGAAGTCA GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG 4560 GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA 4620 GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC 4680 CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC 4740 AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG 4800 TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC 4860 -1 0 4 - 請: 先 閲讀 背' 之 注 意事 項 再填 寫， 訂 本紙張尺度洎用中國圃宏樘準甲4拥这iwn V 8Ί .^.^5 000 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（103 ) . CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG CTGTAGGTAT 4920 ... CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC CCCCGTTCAG 4980 CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT ^GACACGAC 5040 TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT 5100 ' gctacagAgt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca CTAGAAGGAC AGTATTTGGT 5160-e ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTT'C GGAAATIAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC 5220 ▲ AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTT(iCA TACGCGCACA 5220 AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC 5340 GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC 5400 CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAAT-CA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT 5460 GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA-CCTSTCTCAG CGATCXGTCT ATTTCGTTCA 5520 - =— TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATA/rCTACGA TACGGGAGGG CTTACCATCT 5580 GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA 5640 ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC 5700 ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG 5760 CGCAACGTTG TTGCCATTGC TGCAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT TGGTATGGCT 5820 TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT GTTGTGCAAA 5880 aAagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA . 5940 TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC 6000 TTTTCXGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG 6060 AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AACACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA 6120 -105- 請先閲 讀背 面 之 注意 事項再塡 太紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公兑） 81.9.25,000 五、發明説明（104) A6B6 GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT ACCGCTGTTG 6180 AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC .6240 ^ ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG 6300 - GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT 6360 CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA 6420 GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG TCTAAGAAAC CATTATTATC 6480 e ATGACATTAA CCTATAAAAA TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTCGTCTTCA AGAATTCTCA 6540- TGTTTGACAG CTTATCGATC- CGGCCAACGG TGTTGCCATT GCTGCAGGCG CAGAGCTGGT 6600
AGGTATGGAA GATCTATACA GTG 6623 先 閲 讀 背面之注 意 事 項 再 塡 裝 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (2)關於序列識別號：3 7的知聲.:. (i )序列特徵： (A)長度：6630個鹼基對 <0型式：核酸 Ο股型：單股 〇局部解剖學：環狀 (ii )分子型式：質體-D N A (X i )序列識別號：3 7的序列圖 106- 本紙張尺廑通用中圃國K橒準（CNS)甲4梘格（210 X 297公炷 81.9.25.000 訂
A6Ββ 五、發明説明Ρ孓） AATCAATATT GGCAATTAGC CATATTAGTC ATTGGTTATA TAGCATG^AT CAATATTGGC 60 TATTGGCCAT TGCATACGTT GTATCTATAT CATAATATGT ACATTTATAT TGGCTCATGT 120 CCAATATGAC CGCCATGTTG ACATTGATTA TTGACTAGTT ATTAATAGTA ATCAATTACG 180 GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC 240 t CCGCCTGGCT GACCGCCCAA CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC 300 ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT 360 GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT 420 GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT 480 TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC 540 - v^_ ATCAATGGGC GTGGATAGCG GTTTGACTCA CGGGG=ATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC 600 —· - · GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC 660 TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA TATAA.GCAGA 720 (請先閱1?背面之注.-6事項再塡.寫本頁) 丨裝 訂_
經濟部中央標準局員工消費合作社印«
I 本紙張尺度適用中囷國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公;^〉 五、發明説明（10与 A6B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 GCTCTCTGGC TAACTAGAGA ACCCACTGCT TACTGGCTTA TCGAAATTAA TACGACTCAC 780 TATAGGGAGA CCCAAGCTCT AGAGAATTCG CGGCTCGAGG TACCGGATCC ATCGATGTCG 840 ACCTGCAGAA GCTTGCTAGA GGATCTTTGT GAAGGAACCT TACTTCTGTG GTGTGACATA 900 ATTGGACAAA CTACCTACAG AGATTTAAAG CTCTAAGGTA AATATAAAAT TTTTAAGTGT 960 ATAATGTGTT AAACTACTGA TTCTAATTGT * TTGTGTATTT TAGATTCCAA CCTATGGAAC 1020 TGATGAATGG GAGCAGTGGT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AACCTGTTTT GCTCAGAAGA 1080 AATGCCATCT AGTGATGATG AGGCTACTGC TGACTCTCAA CATTCTACTC CTCCAAAAAA '1140 GAAGAGAAAG GTAGAAGACC CCAAGGACTT TCCTTCAGAA TTGCTAAGTT TTTTGAGTCA 1200 TGCTGTGTTT AGTAATAGAA CTCTTGCTTG CTTTGCTATT TACACCACAA AGGAAAAAGC 1260 TGCACTGCTA TACAAGAAAA TTATGGAAAA ATATTTGATG TATAGTGCCT TGACTAGAGA 1320 TCATAATCAG CCATACCACA TTTGTAGAGG .TTTTftCTTGC TTTAAAAAAC CTCCCACACC 1380 TCCCCCTGAA CCTGAAACAT AAAATGAATG CAATTGTTGT TGTTAACTTG TTTATTGCAG 1440 CTTATAATGG ΤΤΑΟΑΛΛΤΛΛ AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT 1500 CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGGATCA 1560 ATTCTGAGAA ACTAGCCTTA AAGACAGACA GCTTTGTTCT AGTCAGCCAG GCAAGCATAT 1620 GTAAATAAAG TTCCTCAGGG AACTGAGGTT AAAAGATGTA TCCTGGACCT GCCAGACCTG 1680 - GCCATTCACG TAAACAGAAG ATTCCGCCTC AAGTTCCGGT TAACAACAGG AGGCAACGAG 1740 ATCATCGCTG TTCCTTAGGA CCCTTTTACT AACCCTAATT CGATAGCATA TGCTTCCCGT 1800 TGGGTAACAT ATGCTATTGA ATTAGGGTTA GTCTGGATAG TATATACTAC TACCCGGGAA 1860 .. GCATATGCTA CCCGTTTAGG GTTAACAAGG GGGCCTTATA AACACTATTG CTAATGCCCT 1920 CTTGAGGGTC CGCTTATCGG TAGCTACACA GGCCCCTCTG ATTGACGTTG GTGTAGCCTC 1980 -107- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000
___________________________裝------^------------------------ '^一' f ί清先閲绩背面之注意事項再填良llrK) C
I A6 __B6_ 五、發明説明（107) CCGTAGTCTT CCTGGGCCCC TGGGAGGTAC ATGTCCCCCA GCATTGGTGT AAGAGCTTCA ' 2040 GCCAAGAGTT ACACATAAAG GCAATGTTGT GTTGCAGTCC ACAGACTGCA AAGTCTGCTC 2100- CAGGATGAAA GCCACTCAGT GTTGGCAAAT GTGCACATCC ATTTATAAGG ATGTCAACTA 2160 CAGTCAGAGA ACCCCTTTGT GTTTGGTCCC CCCCCGTGTC ACATGTGGAA CAGGGCCCAG 2220 TTGGCAAGTT GTACCAACCA ACTGAAGGGA TTACATGCAC TGCCCCGC6T GAGCAATACA 2280 AAACAAAAGC GCTCCTCGTA CCAGCGAAGA AGGGGCAGAG ATGCCGTAGT CAGGTTTAGT 2340 TCGTCCGGCG GCGCCAGAAA TCCGCGCGGT GGTTTTTGGG GGTCGGGGGT GTTTGGCAGC 2400 *·· · CACAGACGCC CGGTGTTCGT GTCGCGCCAG TACATGCGGT CCATGCCCAG GCCATCCAAA 2460 AACCATGGGT CTGTCTGCTC AGTCCAGTCG TGGACCTGAC CCCACGCAAC GCCCAA7VAGA 2520 ATAACCCCCA CGAACCATAA ACCATTCCCC ATGGGGGACC CCGTCCCTAA CCCACGGGGC 2580 CCGTGGCTAT GGCGGGCTTG CCGCCCCGAC GTTGGCTGCG AGCCCTGGGC CTTCACCCGA 2640 ACTTGGGGGT TGGGGTGGGG AAAAGGAAGA AACGCGGGCG TATTGGCCCC AATGGGGTCT 2700 CGGTGGGGTA TCGACAGAGT GCCAGCCCTG GGACCGAACC CCGCGTTTAT GAACAAACGA 2760 CCCAACACCC GTGCGTTTTA TTCTGTCTTT TTATTGCCGT CATAGCGCGG GTTCCTTCCG 2820 GTATTGTCTC CTTCCGTGTT TCAGTTAGCC TCCCCCATCT CCCGATCCCT ATTCCTTTGC 2880 CCTCGGACGA GTGCTGGGGC GTCGGTTTCC ACTATCGGCG AGTACTTCTA CACAGCCATC 2940 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 GGTCCAGACG GCCGCGCTTC TGCGGGCGAT TTGTGTACGC CCGACAGTCC CGGCTCCGGA 3000 TCGGACGATT GCGTCGCATC GACCCTGCGC CCAAGCTGCA TCATCGAAAT TGCCGTCAAC 3060 CAAGCTCTGA TAGAGTTGGT CAAGACCAAT GCGGAGCATA TACGCCCGGA GCCGCGGCGA 3120 TCCTGCAAGC TCCGGATGCC TCCGCTCGAA GTAGCGCGTC TGCTGCTCCA TACAAGCCAA 3180 CCACGGCCTC CAGAAGAAGA TGTTGGCGAC CTCGTATTGG GAATCCCCGA ACATCGCCTC 3240 _ 1 0 8 - 五、發明説明（10幻 A6B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 GCTCCAGTCA ATGACCGCTG TTATGCGGCC ATTGTCCGTC AGGACATTGT TGGAGCCGAA 3300 ATCCGCGTGC ACGAGGTGCC GGACTTCGGG GCAGTCCTCG GCCCAAAGCA TCAGCTCATC 3360 GAGAGCCTGC GCGACGGACG CACTGACGGT GTCGTCCATC ACAGTTTGCC AGTGATACAC 3420 ATGGGGATCA GCAATCGCGC ATATGAAATC ACGCCATGTA GTGTATTGAC CGATTCCTTG 3480 CGGTCCGAAT GGGCCG^J\CC CGCTCGTCTG GCTAAGATCG GCCGCAGCGA TCGCATCCAT 3540 GGCCTCCGCG ACCGGCTGCA GAACAGCGGG CAGTTCGGTT TCAGGCAGGT CTTGCAACGT 3600 GACACCCTGT GCACGGCGGG AGATGCAATA GGTCAGGCTC TCGCTGAATT CCCCAATGTC 3660 AAGCACTTCC GGAATCGGGA GCGCGGCCGA TGCAAAGTGC CGATAAACAT AACGATCTTT 3720 GTAGAAACCA TCGGGGCAGC TATTTACCCG CAGGACATAT CCACGCCCTC CTACATCGAA. 3780 GCTGAAAGCA CGAGATTCTT CGCCCTCCGA GAGCTGCATC AGGTCGGAGA CGCTGTCGAA 3840 CTTTTCGATC AGAAACTTCT CGACAGACGT* CGCGGTGAGT TCAGGCTTTT TCATATCTCA 3900 TTGCCCCCGG ACGAGGATCT GCGGCACGCT —-- . GTT<?ACGCTG TTAAGCGGGT CGCTGCAGGG 3960 TCGCTCGGTG TTCGAGGCCA CACGCGTCAC CTTAATATGC GAAGTGGACC TGGGACCGCG 4020 CCGCCCCGAC TGCATCTGCG TGTTCGAATT CGCCAATGAC AAGACGCTGG GCGGGGTTTG 4080 TGTCATCATA GAACTAAAGA CATGCAAATA TATTTCTTCC GGGGACACCG CCAGCAAACG 4140 CGAGCAACGG GCCACGGGGA TG/UKGCAGGG CGGCACCTCG CTAACGGATT CACCACTCCA 4200 \ AGAATTGGAG CCAATCAATT CTTGCGGAGA ACTGTGAATG CGCAAACCAA CCCTTGGCAG 4260 AACATATCCA TCGCGTCCGC CATCTCCAGC AGCCGCACGC GGCGCATCTC GGGCAGCGTT 4320 GGGTCCTGGC CACGGGTGCG CATGATCGTG CTCCTGTCGT TGAGGACCCG GCTAGGCTGG 4380 CGGGGTTGCC TTACTGGTTA GCAGAATGAA TCACCGATAC GCGAGCGAAC GTGAAGCGAC 4440 -109- «1 Ο 9ς ΛΛΛ (請先閲讀背面之注意事項再填寫貝) 丨裝. 訂· »ΙΛ7ί· IΓα 五、發明説明（10气） A€B6 TGCTGCTGCA AAACGTCTGC GACCTGAGCA ACAACATGAA TGGTCTTCGG TTTCCGTGTT 4500 TCGTAAAGTC TGGAAACGCG GAAGTCAGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT 4560 GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT 4620 .. ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC 4680 CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA 4740 GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA 4800 CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC 4860. CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG 4920 TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC 4980 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCbA ACCCGGTAAG 5040 ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGXAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT 5100 ·· .. ... - ..-. AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT 5160 請: 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 塡 ή 裝 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG 5220 ATCCGGCAAA CA7VACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC 5280. GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA 5340 GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC 5400 CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGA-AGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC 5460 TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT 5520 TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT 5580 气· ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT 5640 ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC 5700 110 «Ί Q 9.R ηπη
I A6 B6 五、發明説明（1丨〇) CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA 5760 TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG 5820 TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT 5880 GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC 5940 AGTGTTATCA CTCATGGXTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT 6000 AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC XACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG 6060 GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC 6120 TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC 6180 GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT 624〇- TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA*AACft^GAAGG CAAAATGC.CG CAAAAAAGGG 6300 . 一· - · AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATA'CTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG 6360 CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ΛΤΑΟΛΤΛΤΤΤ GAATGTATlT AGAAAAATAA 6420 ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG ^AAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT 6460 TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA 6540 ATTCTCATGT TTGACAGCTT ATCGATCCGG CCAACGGTGT TGCCATTGCT GCAGGCGCAG 6600 請: 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 塡 寫q 1 只 裝 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作，社印製
AGCTGGTAGG TATGGAAGAT CTATACAGTG 6630 111 81.9.25.000 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公
Claims (1)
- 第81 109527號專利申請案 中寸補充說明害（8.?玍1 a ) 洁加奮例 實洌6d) 按照人類神經激呔受體Ml活化之函數表現蟲螢光素酶之A549细胞 株的開發： 人類NK1受體cDNA(Gerard et al., 1991)選殖入表現載體pAHyg CMV1(見圖12)中，得構築PAHyg-NKl ，轉形入A20細胞及測試其Μ物 質Ρ對蟲螢光素酶之誘導。轉感染入Α20细胞株後測試其Μ物質·Ρ對 蟲螢光素酶之誘導。 三種選殖株，即 Α20/Ν1Π-1，Α20/ΝΠ-10及 Α20/ΝΚ1-12 Μ 物質 Ρ 為 具誘導性 > 約8倍。此等選殖株於受體-結合分析中測試。此三種選 殖株均顯示預期之结合特性，物質P(SP)>神經激肽Α(ΝΚΑ)>神經激肽 Β(ΝΚΒ)，對 SP 具 IC5〇 值約 InM 。選殖株 Α20/ΝΚ1-1 及 i\20/NKl-12 各進 一步傳代選殖Μ分離純細胞株。對各傳代選殖株作函數分析， A20/HK1-1A 及 Α20/ΝΚ1-12Α ΝΚ-1 示於圖 Α 及圖 Β。 物質P誘導之蟲螢光素酶表規HK1-拮抗劑B1B02020 ( = CP96.345)及 EXIF10( = FK838)存在下圼依劑量反應方式被抑制，且只有部份被 NK1-拮抗劑GR82334.(見圖C )抑制^NK-2-專一性拮抗劑（H1258 * GR94800)及NK3-專一性拮抗劑H9290不會防止蟲螢光素酶活性 <激動 剌激性。 類似於A20/NK2-122 ，使用PKC抑制劑stauroporin及H-7則顯示 NK1-受體與磷酸脂質酶C (Phospholipase C)訊號傳遞途徑徑偶合， 如圖D所示。_ HW\0330.G-第81 109527號專利申請案 中寸補充說明害（8.?玍1 a ) 洁加奮例 實洌6d) 按照人類神經激呔受體Ml活化之函數表現蟲螢光素酶之A549细胞 株的開發： 人類NK1受體cDNA(Gerard et al., 1991)選殖入表現載體pAHyg CMV1(見圖12)中，得構築PAHyg-NKl ，轉形入A20細胞及測試其Μ物 質Ρ對蟲螢光素酶之誘導。轉感染入Α20细胞株後測試其Μ物質·Ρ對 蟲螢光素酶之誘導。 三種選殖株，即 Α20/Ν1Π-1，Α20/ΝΠ-10及 Α20/ΝΚ1-12 Μ 物質 Ρ 為 具誘導性 > 約8倍。此等選殖株於受體-結合分析中測試。此三種選 殖株均顯示預期之结合特性，物質P(SP)>神經激肽Α(ΝΚΑ)>神經激肽 Β(ΝΚΒ)，對 SP 具 IC5〇 值約 InM 。選殖株 Α20/ΝΚ1-1 及 i\20/NKl-12 各進 一步傳代選殖Μ分離純細胞株。對各傳代選殖株作函數分析， A20/HK1-1A 及 Α20/ΝΚ1-12Α ΝΚ-1 示於圖 Α 及圖 Β。 物質P誘導之蟲螢光素酶表規HK1-拮抗劑B1B02020 ( = CP96.345)及 EXIF10( = FK838)存在下圼依劑量反應方式被抑制，且只有部份被 NK1-拮抗劑GR82334.(見圖C )抑制^NK-2-專一性拮抗劑（H1258 * GR94800)及NK3-專一性拮抗劑H9290不會防止蟲螢光素酶活性 <激動 剌激性。 類似於A20/NK2-122 ，使用PKC抑制劑stauroporin及H-7則顯示 NK1-受體與磷酸脂質酶C (Phospholipase C)訊號傳遞途徑徑偶合， 如圖D所示。_ HW\0330.G- 第81109527號專利申請案 A8 中文申請專利範圍修正本（88年10月） cl '*"""**'*"" * «ί _ 11 I Ml" lauumKJx.J") 8 公 口 /丁 圍 年_月日 88.10. 0 4 U!:: 補充: 1 . 2 . 3 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一種測定一物質在人類或動物细胞中對受體砍賴訊號傳 遞途徑之調節作用之方法，其特徵在該物質對瞵脂_ C 之活性，或對經由與訊號傳遞途徑偶合之受體引發的訊 號傳遞途徑之磷脂酶C活化作甩前或後的饈制的調節作 用之測定，除藉著將下述的哺乳動物细胞與受測物質一 起培養及測定該報告者基因產物的濃度： a)該哺乳動物细胞Μ含有一個報告基因和含一或多個 TR Ε元素的調節序列（此調節序列會對約經磷脂_ C活 性之調節作用引起之肌醇-1 , 4 , 5 -三磷酸（I Ρ 3 )和甘油二 酯（D A G )之濃度變化有反應，因此能由I P 3 / D A G之濃度 變化來調節報告者基因的表現）的重組感覺DNA轉形； 且該哺乳動物细胞可更進一步地， b )以一重组受體D N A轉形，其重姐受體D N A含有編碼G -蛋白質偶合受體的序列（其與磷脂酶C效應物糸统偶 合），因此該细胞能夠表現該受.體。 根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵在b )中所定義 的重姐受體D N A含有編碼人類受體的序列。 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵更在於僅 K a )中所定義之重组感覺D Μ A轉形之哺乳動物细胞與受 測物質在相同的條件下一起培養，及測定報告者基园產 物的濃度。 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該重姐感覺DNA 另外Μ含有一個報告者基因及含i或多個C R E元素的調 節序列此調節序列對約由腺苷酸環化酶之調節作用所引 起的cAMP之濃度變化有反應，故能藉著cAMP之濃度改變 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準_( CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------4= '裝------訂 賁例6c) 按照人類神經激肽受體NK3活化之函數表現蟲螢光素酶之A549细胞 株之開發。 人類M3受體Μ下列方式選殖：製造相對應於人類受體序列 (Takahashia et al., 1992; Huang et al.，1992)之寡核；酸以筛 檢存有HK3受體之cDNA庫。對應於表現序列（exons) 2至5之編碼區域 可由人類胎盤cDNA庫中M PCR分離出。不同之傳代選殖株予K聯結及 傳代選殖成表現載體pAHyg CMV1，得到構築pAHyg-HK3 。所得ΝΚ3序 列與已公開發表之序列一致。在轉感染入A20细胞株後測試K神經邁 定K (neuromedin K, NMK)對蟲螢光素酶之誘導。 三種選殖株，即 A20/NK3-5/3，A20/NK3-8/3 及 A20/NK3-17/3MNMK 為具誘導性約8倍。對二選殖株，A20/NK3-8/3及A20/NK3-17/3之函 數分析如圖E及F所示，且具有預期之特性，NMK>NKA>SP。此三種選 殖株最近進一步傳代選殖而得純细胞選殖株。 所得受測细胞株分別K神經激肽物質P (SP)，神經激肽A (NKA)及 神經邁定K (NMK)之刺激具有6至10倍.之蟲螢光素酶活之誘導性。建 立下列選殖株為受測细胞株。 A20/M1-12K 具效力順序： SP>NKA>NMK A20/NK2-122具效力順序： NKA>NMK>>SP A20/NK3-17/3具效力順序： HMK>NKA>SP 三種神經激呔對此三種神經激肽受體受測细胞株之效力順序與所公 開發表之數據一致。 實例6f) 按照人類5-羥色胺受體5-叮1。活化之函數表現蟲營光素酶之A549细 胞株之開發： ^ HWX0330.G 人類5-HTic受體使用由已公開發素之cDNA序列（Saltzman et al, 199Γ)衍.生之引子選殖出。由人類海馬體分離之總RNA中藉PCR得一 選殖株。人類5-HTlc受體cDNA選殖入表現載體pAHyg CMV2，得受體 pAHyg 5-HTlc (圖G )並定序。該序列與所公開發表之序列一致但除了 無聲（胺基酸不變）ACT— ACA (Thr 369)之改變Μ外。該質體轉形入 Α20細胞内及測試選出之選殖株由5-羥色胺對蟲螢光素酶之誘導作用 Ο 兩選殖株，即A2〇/5HTlc-ll及A20/5HT1C-14對5-羥色胺具誘導性， 約4倍。圖Η顯示细胞株A20/5HT1C-14對各5-羥色胺受體激動劑之依 劑量反應。天然之配位體5-羥色胺及5-HT2-激動劑cx -甲基5-羥色胺 順丁烯二酸鹽對剌激蟲螢光素酶表現最有效，然而 8-〇[]-〇卩&1'(5-111'：^-專一）及51111131:「丨卩1：3“（5-1]1'115-專一）誘導蟲螢光 ' 素酶活性，在非常高濃度下仍只達次最大效果。 不同拮抗劑對5-羥色胺誘導之蟲螢光素酶之表現之影響可就兩細胞 株A20/5HT1C-14及A20/5HT2-11 (其含5-HTlc受體或5-HT2受體）平行測 試。结果可參考圖J。於5-HTlc受體細胞株，5-羥色胺引誘導之蟲 蠻光素酵表現因5-HTic括抗劑mesulergine之存在而呈依劑量反應方 -式被抑制，然而相同化合物在5-HT2受體表現细胞中較不具效力。比 較上，5-HT2拮抗劑sPiPerone當與5-HTlc表現细胞比較時具大於兩 級量之較有效性。相反地，函數分析顯示拮抗劑mianserine在 5-HT2及5-HTlc表現细胞上具相等有效性。多巴胺（Dopamine) D1專一 性拮抗劑SCH 23390及5-HTiA-專一性激動劑spiroxatrine不會阻礙 對蟲螢光素酶Μ激動劑誘導之刺激作用，如預期者。令人感興趣者， 5-ΗΤ1Α -專一激動劑bUSPirone不會抑制5-羥色胺誘導之蟲螢光素酶 表現’然而似乎對表現5-HT2受體之細胞更具選擇性。 HW\0330.G_ 類似於A20/5HT2-11，使用PKC抑制劑staurosporin及H-7顯示在已 建立之受測细胞株中5-HTlc受體與PLC訊號傳遞途徑偶合，如圖K所 示0 所得受測細胞株具有K 5-羥色胺刺激對蟲螢光素酶活性之誘導作用 ，4至6倍。下列選殖株建立為受測細胞株： A20/5HT2-11具效力順序：spiperoneSmianserineSmesulergine A20/5HTic-14具效力順序：mesuiergine>mianserine>Spiperone HWX0330.G 第81109527號專利申請案 A8 中文申請專利範圍修正本（88年10月） cl '*"""**'*"" * «ί _ 11 I Ml" lauumKJx.J") 8 公 口 /丁 圍 年_月日 88.10. 0 4 U!:: 補充: 1 . 2 . 3 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一種測定一物質在人類或動物细胞中對受體砍賴訊號傳 遞途徑之調節作用之方法，其特徵在該物質對瞵脂_ C 之活性，或對經由與訊號傳遞途徑偶合之受體引發的訊 號傳遞途徑之磷脂酶C活化作甩前或後的饈制的調節作 用之測定，除藉著將下述的哺乳動物细胞與受測物質一 起培養及測定該報告者基因產物的濃度： a)該哺乳動物细胞Μ含有一個報告基因和含一或多個 TR Ε元素的調節序列（此調節序列會對約經磷脂_ C活 性之調節作用引起之肌醇-1 , 4 , 5 -三磷酸（I Ρ 3 )和甘油二 酯（D A G )之濃度變化有反應，因此能由I P 3 / D A G之濃度 變化來調節報告者基因的表現）的重組感覺DNA轉形； 且該哺乳動物细胞可更進一步地， b )以一重组受體D N A轉形，其重姐受體D N A含有編碼G -蛋白質偶合受體的序列（其與磷脂酶C效應物糸统偶 合），因此該细胞能夠表現該受.體。 根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵在b )中所定義 的重姐受體D N A含有編碼人類受體的序列。 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵更在於僅 K a )中所定義之重组感覺D Μ A轉形之哺乳動物细胞與受 測物質在相同的條件下一起培養，及測定報告者基园產 物的濃度。 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該重姐感覺DNA 另外Μ含有一個報告者基因及含i或多個C R E元素的調 節序列此調節序列對約由腺苷酸環化酶之調節作用所引 起的cAMP之濃度變化有反應，故能藉著cAMP之濃度改變 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準_( CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------4= '裝------訂 六、申請專利範圍 來調節報告者基因的表現的重組感覺D N 轉形之哺乳動 物细胞與受測物質一起培養，再測定再報告者基因產物 的濃度。 5 . 根據申請專利範圍第4項之方法，其特徵還有K含C R E 元素的重组感覺D N A和b )中所定義之重姐受體D N A轉形之 細胞與受測物質一起培養，並測定報告者基因產物的濃 度，該重姐受體D N A含有編碼與Μ含T R E元素的重組感覺 D Ν Α轉形之细胞相同之受體的序列。 6. 根據申請專利範圍第4項之方法，其特徵還在於將重組 受體D Ν A轉形的细胞與受測物質一起培養，並測定報告 者基因產物的濃度，該重姐受體D Ν A含有編碼與腺苷酸 環化酶效應物系統偶合之受體的序列並以此種方式可使 细胞表現該受體。 7 . 根據申請專利範圍第1項之方法/其特徵在於此方法被 用來當作一種篩選分析法，其中該受測物質為許多物質 中的一個，與預定數目的哺乳動物细胞在預先決定的條 件下一起培養，並測定報告者基因產物的濃度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其特徵在於一種試劑 的存在下測定作為報告者基因產物之蟲螢光素酶，此試 劑含有適用於溶解細胞的清潔劑、具有pH 6到9的緩衝 溶液、鎂鹽，腺核苷三磷酸、蟲螢光素、一種溫和的有 機遷原劑，並視需要含有三聚磷酸納和/或焦磷酸納。 9 . 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該緩衝溶液具pH 7 . 8，該鎂鹽為硫酸鎂，及該有機還原劑為三硫蘇糖醇 和/或/?-薙基乙醇。 . 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
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