LT4230B - Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs - Google Patents
Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs Download PDFInfo
- Publication number
- LT4230B LT4230B LT97-004A LT97004A LT4230B LT 4230 B LT4230 B LT 4230B LT 97004 A LT97004 A LT 97004A LT 4230 B LT4230 B LT 4230B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- peptide
- host cell
- cell
- protein
- binding
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 200
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 121
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 190
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 149
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 101
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 101
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 70
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 35
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims description 22
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 claims description 21
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims description 20
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 19
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 18
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 claims description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 13
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 12
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 6
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 108010045747 interleukin 3 receptor-like molecule Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021809 Chorionic somatomammotropin hormone 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 claims description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 2
- 108010013990 Guanylate Cyclase-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000017178 Guanylate Cyclase-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 claims description 2
- 101150005828 SWI5 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 2
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 claims description 2
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015215 Stem Cell Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 2
- -1 hematopoietic factor Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 claims description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 claims description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 claims description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 claims description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 claims description 2
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 108010050014 systemin Proteins 0.000 claims description 2
- HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N systemin Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)CCC1 HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 claims description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 claims 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 claims 1
- DYUQAZSOFZSPHD-UHFFFAOYSA-N Phenylpropanol Chemical compound CCC(O)C1=CC=CC=C1 DYUQAZSOFZSPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 claims 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 33
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 21
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 101100353517 Caenorhabditis elegans pas-2 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 5
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 5
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 4
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 3
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 3
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 3
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 3
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 3
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 3
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108090000448 Aryl Hydrocarbon Receptors Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N Amitrole Chemical compound NC1=NC=NN1 KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003984 Aryl Hydrocarbon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101150008604 CAN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100490563 Caenorhabditis elegans adr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100001271 Caenorhabditis elegans ahr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010000063 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000016989 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000010682 Fusion Protein Interactions Effects 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102400001066 Growth hormone-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 101800000194 Growth hormone-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101001042362 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 102100021747 Leukemia inhibitory factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000016304 Origin Recognition Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010067244 Origin Recognition Complex Proteins 0.000 description 1
- 241001635529 Orius Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101001075257 Rattus norvegicus Growth hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001109695 Rattus norvegicus Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-M amino sulfate Chemical compound NOS([O-])(=O)=O DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 108010066540 copper thionein Proteins 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- MUJOIMFVNIBMKC-UHFFFAOYSA-N fludioxonil Chemical compound C=12OC(F)(F)OC2=CC=CC=1C1=CNC=C1C#N MUJOIMFVNIBMKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108091009655 growth hormone receptor binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000008606 intracellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002395 mineralocorticoid Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010397 one-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 229940037129 plain mineralocorticoids for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010033419 somatotropin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Mobile Radio Communication Systems (AREA)
Description
Išradimas priklauso naujoms ląstelėms, ekspresuojančioms heterologinius sulietus baltymus, ir būdams atrinkti junginius, turinčius peptidų surišimo aktyvumą; kur būduose naudojamos šio išradimo naujos ląstelės.
Specifinis peptidų poros surišimas vienas prie kito indukuoja gyvoje ląstelėje didžiulį kiekį funkcijų. Pavyzdžiui, specifinis ligando surišimas su paviršiaus receptoriumi v
tarnauja kaip ląstelės reakcijų į daugelį išorinių signalų paleidiklis. Žinduolių ląstelės reaguoja į didelę įvairovę cirkuliuojančių peptidinių hormonų dažnai per atskirus tarpmembraninius domeno receptorius. Pripažinta, jog citokino receptorių grupė iliustruoja įvairius ląstelės funkcijos ir fiziologinės reakcijos aspektus. Nauji citokino receptoriaus funkcijos tyrimai atskleidė skirtingas ligandas-recept orius baltymo stechiometrijas, apimant kaip 2-baltymų (ligandas/receptorius) (Cunningham BC, Ultsch M, De Vos AM, Mulkerrin MG, Clauser KR and JA Wells. (1991) Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule. Science 254:821-825; Staten NR, Byatt JC and GG Krivi. (1993) Ligand-specific dimerization of the extracellular domain of the bovine grovvth hormone receptor. J. Biol. Chem. 268:18467-18473), taip ir 3-baltymų (ligandas/receptorius/receptorius ar ligandas/receptorius/ perdavėjas) tarpusavio sąveiką (Young PR (1992) Protein hormones and their receptors. Curr. Opin. Biotech. 3:408-421; Taga T and T Kishimoto (1993) Cytokine receptors and signal transduction. FASEB J. 7:3387-3396; Mui A and A Miyajima (1994) Cytokine receptors and signal transduction. In: Progress in Growth Factor Research, pp 15-35. Pergamon Press. NY). Tokių baltymo asociacijų sudėtingumas buvo tiriamas in vitro, naudojant dažnai daug darbo reikalaujančius metodus (Fuh G., Cunningham BC, Fukunaga R, Nagata S, Goeddel DV and JA Wells. (1992) Rational design of potent antagonists to the human growth hormone receptor. Science 256:1677-1680; Fuh G, Colosi P, Wood WI and JA Wells. (1993) Mechanism - based design of prolactin 2 LT 4230 B receptor antagonists. J. Biol. Chem. 8:5376-5381; Davis S, Aldrich TH, Stahl N, Pan L, Taga T, Kishimoto T, Ip NY and G Yancopoulos. (1993) LIFR and gp 130 as heterodiinerizing signal transducers of the tripartate CNTF receptor. Science 260:1805-1808). kadangi pasirodė, jog genetinės lengvai formuojamos ekspresijos sistemos buvo netinkamos. Šis išradimas yra nukreiptas j daugelį naujų modifikuotų sistemų, kurios gali būti panaudotos tokiems baltymų tyrimams, tuo labiau, kad naujos sistemos žymiai sumažina darbo sąnaudas.
Neseniai paskelbtos šiuolaikinio lygio sistemos nurodo 2-hibridų sistemą, kaip diskutuota Fields S and O. Song. (1989) A novel genetic system to detect proteinprotein interactions. Nature 340:245-246 ir taip pat Chein, C-T., Bartel, PL., Stemglanz R. and S. Fields (1991) The two-hybrid system: A method to identify and clone genes for proteins that internet with a proteins of interest. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:9578-9582 . 2-hibridų sistema apima įvairiapusę sąveiką tarp atskirų DNR surišimo ir aktyvavimo domenų iš mielių transkripcijos aktyvatoriaus, Gal 4. Heterologiniai baltymai yra ekspresuoti kaip hibridiniai baltymai, sulieti su bet kuria Gal4 dalimi (žiūrėti fig.l; Fields S and O. Song. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340:245-246; Chein, C-T., Bartel, PL., Stemglanz R. and S. Fields (1991) The two-hybrid system: A method to identify and clone genes for proteins that internet with a proteins of interest. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:9578-9582 diskusiją apie 2-hibridų sistemą). Heterologinių baltymų sąveika sukelia Gal4 baltymo dviejų dalių tarpų ryšį, kuris aktyvina geno reporterio ekspresiją. Pagal šiuos duomenis tokios 2-hibridinės sistemos yra naudingos nustatant ar pirmoji duota tiriamųjų peptidų seka turi rišamąjį aktyvumą su jau žinoma antrojo peptido seka; kur tiriamojo peptido afiniškumas žinomam peptidui yra nežinomas. Tyrimai, naudojantys tokią sistemą, pasuko viduląstelinių baltymų, tokių kaip transkripcijos faktoriai ir kinazės-taikinio baltymo, sąveikos tyrimo kriptinri (Young PR (1992) Protein hormones and their receptors. Curr. Opin. Biotech. 3:408-421 ; Durfee T., Becherer K., Chen P-L., Yeh, S-H., Yang Y., Rūburn AE., Lee W-H. and SJ Elledge. (1993) The retinoblastoma protein associated with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes and Devel. 7:555-569 ; Li, JJ and I.
3 LT 4230 B
Herskowitz (1993) Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complexby a one-hybrid system. Science 262:1870-1874).
Naujos modifikuotos šio išradimo ląstelės ir nauji būdai, pagrįsti šių ląstelių panaudojimu, sąlygoja pažangą tiriant ir atrandant peptidų imitatorius, tame tarpe ligandų ir receptorių imitatorius. Iki šiol niekas nesukūrė efektyvios ir specifinės atrankos sistemos šios srities tyrimuose. Naudojant ląstelėje rišamųjų peptidų porą, kuriai jungimosi afiniškumas yra žinomas, šis išradimas leidžia tirti rišamųjų peptidų poras, tokias kaip ligandas ir receptorius, kur peptidai rišasi dėl sąveikos tarp ląstelių. Šis išradimas turi pranašumą atrandant junginius, kurie gali kaip ligandai sąveikauti su specifiniais receptoriais ar perdavėjais. Įskaitant potencialius ligandus, bet neapsiribojant, žinduolių hormonai su receptoriais yra giminingi tarpląsteliniui ligandą rišančiam peptidui. Dar daugiau, šis išradimas aprašo panaudojimą ląstelių sistemų , kurios ekspresuoja gausius heterologinius baltymus, įskaitant du heterologinius sulietus baltymus, specifinio ir grįžtamo ligando ir receptoriaus ryšio nustatymui. Aukščiau aprašyto ryšio specifinė sąveika yra lengvai nustatoma pagal išmatuojamus pakitimus ląstelės fenotipe, pavyzdžiui, augimą ant selektyvios terpės.
Pirma, šis išradimas yra susijęs su naujomis modifikuotomis ląstelėmis šeimininkais, skirtomis heterologinių sulietų baltymų ekspresijai. Naujos modifikuotos ląstelės šeimininkai apima:
a) genų seką, koduojančią heterologinį susilietą baltymą; aukščiau minėtą susilietą baltymą, apimantį pirmą peptidą iš rišamųjų peptidų poros arba segmentą iš anksčiau minėto pirmojo peptido, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišančiojo domeno, arba prie atitinkamo transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno;
b) genų seką, koduojančią heterologinį sulietą baltymą , anksčiau minėtą sulietą baltymą, apimantį antrą peptidą iš rišamųjų peptidų poros iš (a) arba segmentą iš anksčiau minėto antro peptido, prijungto arba prie DNR rišamojo domeno, arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo domeno, kuris nepanaudotas (a);
4 LT 4230 B
c) geną reporterį, efektyviai susietą su transkripcijos aktyvavimo baltymu arba jo dalimi;
d) jei reikia, deleciją arba mutaciją mielių ląstelės šeimininko chromosominėje DNR transkripcijos aktyvavimo baltymui, jei jis ląstelėje šeimininke yra.
Šio išradimo naujos modifikuotos ląstelės šeimininkai gali būti panaudotos nustatyti tiriamų pavyzdžių sąveiką su atrinktu peptidu iš rišamųjų peptidų poros, pavyzdžiui, ląstelė gali būti panaudota tiriamo pavyzdžio sąveikos su atrinktais ligandu arba receptoriumi nustatymui.
.'Antra, čia pateikiamas išradimas susijęs su naujomis modifikuotomis ląstelėmis ir atrankos būdais, kurie nustato tiriamojo pavyzdžio sąveiką su atrinktu peptidu ir receptoriumi pagal atpažįstamus pakitimus fenotipe. Ląstelė rodo fenotipo pakitimus tik esant tiriamam junginiui, turinčiam surišimo afiniškumą peptidui, iš rišamųjų peptidų poros, pavyzdžiui, ryšio afiniškumas ligandui ar jo receptoriui.
Trečia, šis išradimas susijęs su naujomis ląstelėmis ir atranka būdų, leidžiančių nustatyti, prie kurio peptido iš rišamųjų peptidų poros rišasi tiriamasis pavyzdys. Ketvirta, šis išradiams liečia naujas ląsteles, kurios ekspresuoja tris ar daugiau heterologinių komponentų aukštesnės eilės arba polibaltymų asociacijų tarp trijų ar daugiau peptidų tyrimui (pavyzdžiui, tokiam kaip ligando priklausomos dimerizacijos tyrimas).
Terminas rišamųjų peptidų pora apibūdina bet kurią peptidų porą, turinčią žinomą rišimosi afiniškumą, kuriai yra žinoma ar gali būti nustatyta DNR seka. Peptidai iš rišamųjų peptidų poros turi rodyti pirmumą rišimesi vienas su kitu, palyginus su kitais modifikuotos ląstelės komponentais.
Terminas peptidas, kaip panaudotas anksčiau ir bus minimas toliau, apibūdina bet kurį peptidą, polipeptidą arba baltymą, jei tik nenurodyta kitaip. Kaip nurodyta anksčiau, peptidai iš rišamųjų peptidų poros gali būti ligandu ir bet kuriuo peptidu, turinčiu žinomą rišimosi afiniškumą ligandui.
Heterologinis, kaip paminėta aukščiau ir bus naudojama toliau, apibūdina peptidus, kurie (1) neekspresuojami natūraliai sutinkamose ląstelėse šeimininkuose, arba (2) modifikuotos ląstelės šeimininko ekspresuojami kitokiu ekspresijos būdu, negu tas, kuriuo ląstelė šeimininkas normaliai ekspresuotų peptidą.
Jei nenurodyta kitaip, terminas receptorius, kaip vartojama toliau, apima terminus receptoriusr, tirpus receptorius, perdavėjas ir rišamasis baltymas. Šiame išradime receptorius yra naudojama - receptorius arba tirpus receptorius, labiau tinkantis yra receptorius.
ReceptorhiSj., kaip pavartota žemiau, apibūdina plazmos membranos baltymus, kurie suriša specifines molekules, tokias kaip augimo faktoriai, hormonai arba neuromediatoriai, ir po to perduoda signalą tarp ląstelių, kas sukelia ląstelės specifinį atsaką. Tai apima atskirus tarpmembraninius baltymus.
Tirpus receptorius yra tarpmembraninis receptorius, sugebantis surišti ligandą. Šie receptoriai realizuojami iš ląstelės proteolizės keliu arba alternatyviai sujungiant mRNR.
Rišamasis baltymas apibūdina baltymus, kurie demonstruoja rišimosi afiniškumą specifiniam ligandui. Rišamieji baltymai gali būti gauti iš atskirų ir skirtingų genų. Duotam ligandui rišamieji baltymai, gauti iš specifinių genų, yra skirtingi nuo ligandą rišančio receptoriaus arba jo tirpaus receptoriaus domeno.
Perdavėjas apibūdina molekule, kuri leidžia paversti vienos rūšies signalą į kitą. Ši molekulė yra žinoma kaip perdavėjas vienam ar daugiau peptidų iš rišamųjų peptidų poros, pavyzdžiui, perdavėjas ligandas/receptorius grupei.
6 LT 4230 B
Fig. 1 pavaizduota schema ląstelės, kuri ekspresuoja iš atskirų plazmidžių du heterologinius sulietus baltymus (vienas, būdamas ligandu, surištas su transkripcijos aktyvavimo baltymo aktyvavimo domenu; kitas baltymas, būdamas receptoriumi, surištas su transkripcijos aktyvavimo baltymo DNR surišimo domenu. Schema rodo dviejų sulietų baltymų ekspresiją ir ligando bei receptoriaus surišimą, kas suveda kartu rišamąjį domeną ir aktyvavimo domeną, atstatant transkripcijos aktyvavimo baltymą. Kada transkripcijos aktyvavimo baltymas atstatytas ir pritvirtintas DNR rišamojo domeno prie atvirkštinės aktyvavimo sekos vietos, yra inicijuojama geno reporterio (HIS3) transkripcija.
Fig. 2 patalpintos lėkštelių fotografijos, rodančios rezultatus augimo eksperimentų, atliktų pavyzdyje 1 kamienams CY722, CY723, CY724 ir CY781 ant neselektyvios terpės (foto A) ir selektyvios terpės (foto B),
Fig. 3 yra schema dimero modelio, kuriame ligandas prisiriša prie dvigubo receptoriaus sistemos. Scheminė diagrama vaizduoja ląstele, kuri ekspresuoja baltymus iš trijų skirtingų plazmidžių. Yra ekspresuojami du heterologiniai sulieti baltymai (vienas baltymas yra pirmas receptorius, surištas su transkripcijos aktyvavimo baltymo aktyvavimo domenu, ir kitas baltymas yra antras receptorius, surištas su transkripcijos aktyvavimo baltymo DNR rišamuoju domenu) ir laisvas ligandas (t. y. ligandas, kuris nėra surištas nei su vienu iš dviejų transkripcijos aktyvavimo domenų), kuris yra ekspresuojamas iš trečios plazmidės. Fig. 3 rodo dviejų sulietų baltymų ekspresiją bei surišimą laisvo ligando ir dviejų receptorių, kas suveda kartu rišamąjį domeną ir aktyvavimo domeną, atstatant transkripcijos aktyvavimo baltymą. Kai transkripcijos aktyvavimo baltymas yra sukonstruotas ir prikabintas prie DNR rišamojo domeno prie Atvirkštinės Aktyvavimo Sekos (AAS) vietos, yra inicijuojama geno reporterio (HIS3) transkripcija.
Fig. 4 parodytos augimo lėkštelės, gautos kamienams CY846, ir CY847 iš pavyzdžio 3, fotografija, rodanti priklausomą nuo ligando receptorių dimerizacijos stimuliaciją.
Šio išradimo modifikuota ląstelė yra naudojama kaip ląstelė šeimininkas. Efektyvi ląstelė šeimininkas šiame išradime turi būti apibrėžta genetiškai, konstruojant atitinkamą heterologiniu sulietų baltymų ekspresiją, reporterj(ius) ir kitas norimas genetines manipuliacijas. Ląstelė šeimininkas gali būti bet kuri eukariotinė, stuburinių ar bestuburių ląstelė. Ląstelė šeimininkas gali būti žinduolių, o taip pat amfibijų, pavyzdžiui, Xenopus kiaušialąstė. Priimtiniau, kai ląstelė šeimininkas yra grybo, pavyzdžiui, Aspetgillus arba Neurospora ląstelė. Labiausiai tinkamos ląstelės šeimininkai yra mielių, pavyzdžiui, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pornbe arba Pichia pastoris.
Modifikuota ląstelė šeimininkas naudoja mažiausiai du genus atskirai abiejų heterologiniu sulietų baltymų ekspresavimui. Vienas iš šių sulietų baltymų apima pirmą peptidą iš rišamųjų peptidų poros arba jo segmentą, kuris yra prijungtas arba prie DNR rišamojo domeno, arba jį atitinkančio tamskripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno. Antras sulietas baltymas apima antrą peptidą iš rišamųjų peptidų poros arba jo segmentą. Antras peptidas yra pririštas prie DNR rišamojo domeno, jei jis nepanaudotas pirmame heterologiniame sulietame baltyme. Ryšio tarp peptidų iš rišamųjų peptidų poros aktyvumas yra kontroliuojamas panaudojant geną reporterį, kuris operatyviai sujungtas su dviejų sulietų baltymų transkripcijos aktyvavimo baltymu.
Transkripcijos aktyvavimo baltymas gali plačiai varijuoti, tiek kiek DNR rišamieji domenai ir aktyvavimo domenai yra ištirti, ar gali būti nustatyti prieinamais metodais. Transkripciją aktyvuojantis baltymas gali būti bet kuris baltymas, turintis du komponentus, DNR rišamąjį komponentą ir aktyvavimo komponentą, kur tamskripcijos aktyvavimo baltymas transkripcijos aktyvavimui turi rūgščių alfa spiralę. Geriau, kai transkripcijos aktyvavimo baltymas yra atrinktas iš Gal4, Gcn4, Hapl, Adrl, Swi5, Stel2, Mcml, Yapl, Acel, Pprl, Arg81, Lac9, QalF, VP16, LexA, ne žinduolių branduolių receptorių (pavyzdžiui, ekdizono) arba žinduolių branduolių receptorių (pavyzdžiui, estrogeno, androgenų, gliukokortikoidų, mineralkortikoidų, retino rūgšties ir progesterono; žiūrėti Picard D, Schena M and 8 LT 4230 B
KR Yamamoto. (1990) An inducible expression vector for both fission and budding yeast. Gene 86:257-261). Tinkamiau, kai transkripcijos aktyvavimo baltymas yra mielių baltymas, ir dar geriau, jei jis išskirtas iš Gal4, Gcn4 ar Adrl. Reikia pažymėti, jog gali būti panaudotas bet kuris DNR rišamasis baltymas, kuris funkcionuoja su aktyvavimo domenu. DNR rišamasis baltymas gali būti pavaduotas DNR rišamajam domenui transkripcijos aktyvavimo baltymo, jei atpažįstamos sekos, operatyviai asocijuotos su genu reporteriu, yra atitinkamai sukonstruotos. Ne mielių rišamuosius baltymus iliustruoja žinduolių steroidų receptoriai ir bakterinė LexA (žiūrėti Wilson TE, Fahmer TJ, Johnston M and J Milbrandt. (1991) Identification of the DNR binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. Science 252:1296-1300).
Genas reporteris yra parinktas, būtent todėl kad transkripcijos aktyvavimo baltymo rišimosi domenai gali būti reguliuojami plačiai žinomu ir tiesiu metodu. Dažniausiai genas reprteris yra parinktas remiantis jo kaina, jo aktyvumo matavimo nesudėtingumu ir žemu fonu (t.y. aktyvumas gali būti nustatytas esant santykinai žemam reporterio ekspresijos lygiui dėl aukšto signalas/fonas ir/arba santykinai žemo, arba nenustatomo aktyvumo). Reporteriu gali būti bet kuris reporteris, kuriam gali būti nustatytas aktyvumas bet kuriais prieinamais būdais. Reporterius, kurie gali būti panaudoti šiame išradime, iliustruoja genai reporteriai, pasirinkti iš grupių:
a) lacZ, liuciferazės geno, žalio fluorescuojančio baltymo geno, CAT;
b) genų, komplementuojančių auksotrofams, tokiems kaip HIS, URA, LEU, ARG, MET, ADE, LYS, TRF;
c) geno, lemiančio atsparumą antibiotikams, tokiems kaip neor, KAN;
d) genų, lemiančių jautrumą cheminiams preparatams, tokiems kaip CYH2, CAN1 (atsparumas kanavinui). Daugeliu atvejų tai gali būti tinkama genui reporteriui sustabdyti augimą (CYH2). Patogiausia geno reporterio aktyvumą nustatyti kolorimetriniu ar fluorescentiniu būdais ir/arba matuojant mielių ląstelių augimą.
Kaip pažymėta aukščiau, panaudotas modifikuotoje ląstelėje peptidas yra peptidas iš rišamųjų peptidų poros, kuriam yra žinoma DNR seka, kaip ir seka antram peptidui iš rišamųjų peptidų poros. Taigi, peptidais gali būti peptidai iš peptidą rišančio 9 LT 4230 B komplekso, kuris sudarytas iš dviejų ar daugiau peptidų, kurie jungiasi vienas su kitu, suformuodami rišamąjį kompleksą. Peptidai iš rišamųjų peptidų poros gali būti specifinis ligandas ir atitinkamas receptorius arba bet kurie kiti peptidai, kurie pirmiausia rišasi vienas su kitu taip, kaip fermento subvienetai.
Vienas iš svarbių šio išradimo pasiekimų yra aptikimas to, jog modifikuota ląstelė, panaudodama transkripcijos baltymo rišančiuosius ir aktyvaimo domenus, gali būti panaudota reguliuojant rišamuosius peptidus iš rišamųjų peptidų poros, kuri rišasi dėl v
tarpląstelinės sąveikos. Žinoma, jei pageidaujama, peptidai, kurie rišasi dėl viduląstelinės sąveikos, gali būti panaudoti kurioje nors iš naujų modifikuotų ląstelių ir šio išradimo būdų. Peptidai gali būti iš žinduolių ir nežinduoiių ląstelės. Vienas iš svarbesnių šio išradimo pritaikymų yra susijęs su naujų modifikuotų ląstelių ir atitinkamų atrankos metodų panaudojimu tiriant gausias žinduolių peptidų sąveikas. Žinduolių peptidai apima žinduolių ligandas/receptorius sąveikas, tokias kaip hormonas/receptorius sąveika. Peptidinius hormonus, kurie gali būti panaudoti šiame išradime, iliustruoja peptidai, parinkti, bet neapsiribojant, iš vienos šių grupių:
(a) grupės, turinčios citokinų, interleukinų, kraujodaros faktorių, insulino, insulinui panašių augimo faktorių, augimo hormono, prolaktino, interferonų ir angim n faktorių;
(b) ligandų G-baltymų surištiems receptoriams;
(c) ligandų bestuburių receptoriams;
(d) ligandų guanililo ciklazės receptoriams;
(e) ligandų tirozino fosfatazės receptoriams.
Alternatyviame tyrime peptidas yra augimo faktorius (AF), atrinktas iš epiderminio AF, nervų AF, leukemijos inhibitoriaus faktoriaus (LIF), fibroblasto AF, iš trombocitų gauto AF, vaskuliarinio endotelinio AF, auglio nekrozinio faktoriaus, onkoslatino M, cūiarmio neurotropinio faktoriaus (BNF), eritropoetino, Steel faktoriaus, placentinio laktogeno ir transformuojančio ΑΡβ.
Įvairiuose labiau tinkamuose tyrimuose peptidinis hormonas yra ligandas G-baltymo surištam receptoriui, toks kaip augimo hormoną realizuojantis faktorius, sekretinas.
10 LT 4230 B kraujo indų aktyvumą inhibuojantis peptidas, gliukagonas, tyrotropinas, interleukinas-8, luteinizacijos hormonas (LH), folikulą stimuliuojantis hormonas (FSH).
Papildomame alternatyviniame tyrime panaudotas peptidas yra peptidas iš besluburių, toksai kaip tie, parinkti iš grupės, turinčios augalų systemino ir vabzdžių diferenciacijos peptidus. Nors tinkamiau, kai baltymas yra parinkti iš grupės, turinčios žinduolių peptidus, ir dar geriau - žinduolių peptidinius hormonus.
Reikia pažymėti, jog specifiniai receptorių tipai gali būti peptidai iš rišamųjų peptidų poros ir rišamųjų peptidų komplekso. Įvairūs receptoriai parenkami iš vienos šių grupių:
a) ląstelės adhezįjos molekulės;
b) imunomoduliatoriaus, antigeno atpažinimo ar prezentacijos molekulės ir kitų giminingų peptidų.
Ląstelių adhezijos molekules iliustruoja: viduląstelinė adhezijos molekulė (VAM), vaskuliarinė ląstelių adhezijos molekulė (VLAM), tarpląstelinė adhezijos molekulė (TAM), fibronektinas, integrinas, selektiuas ir fibrinogenas. Imunomoduliat orius, antigeno atpažinimo ar prezentacijos molekulės yra: T ląstelių receptorių kompleksas, B ląstelių receptorių kompleksas, Fc receptoriai, pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas 1, pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas 2, CD4, CD8, CD27, CD30, MAC kompleksas.
Taip pat pažymėtina, kad specifiniais perdavėjų tipais gali būti rišamųjų peptidų poros ar rišamųjų peptidų komplekso peptidas. Perduodančiais baltymais gali būti bet kuris perduodantis baltymas, kuris suriša vieną peptidą iš rišamųjų peptidų poros ar rišamųjų peptidų komplekso. Perduodantys baltymai yra gpl30, kh97, AIC2A, AIC2B.
11 LT 4230 B
Dažniausia heterologiniai sulieti baltymai išskiriami transformuojant mielių ląstelę autonomiškai replikuojančia plazmide, gebančia ekspresuoti sulietą baltymą, nors jie gali būti ekspresuojami esant chromosominei modifikacijai.
Kaip pažymėta, šio išradimo atrankos būdai skiriami tiriamojo pavyzdžio poveikio rišamųjų peptidų poros rišimuisi, pavyzdžiui, ligando-receptoriaus sąveikos, stebėjimui. Iš esmės, būdas apima geno reporterio aktyvumo nustatymą pridėjus tiriamąjį pavyzdį į šio išradimo modifikuotą ląstelę šeimininką esant sąlygoms, tinkamoms aktyvumui stebėti, esant pavyzdžiui arba sąlygose, kuriose modifikuota ląstelė šeimininkas turi tokį aktyvumą tiktai dalyvaujant, pavyzdžiui, galinčiam susirišti su rišamųjų peptidų pora. Dažniausiai geno reporterio aktyvumas nustatomas matuojant pasirinkto fenotipo pakitimą, kuris tiesiogiai koreliuoja su geno aktyvumu.
v
Šio išradimo naujos modifikuotos ląstelės lengvai panaudojamos įvairiuose atrankos būduose tiriamojo pavyzdžio gebėjimo surišti nustatymui. Tiriamasis pavyzdys gali būti peptidas, kuris yra apie dviejų amino rūgščių ūgio, arba nėra peptidinis cheminis junginys. Nepeptidinis tiriamasis junginys apima junginius, kompleksus ir druskas, taip kaip ir natūralius produktus, pavyzdžiui, tokius kaip augalų ekstraktai ir medžiagos, gautos iš fermentacijos terpės. Modifikuotos ląstelės šeimininką i auginamos tinkamose augimui sąlygose, kad ištirtų tiriamojo pavyzdžio poveikį rišamųjų peptidų poros rišamumui. Modifikuotos ląstelės šeimininkai patalpinamos į mitybine terpę, kuri dažniausia susideda iš agaro su tiriamuoju pavyzdžiu, esančiu ant mitybinės terpės paviršiaus. Mitybinė terpė dažniausiai yra įprastinė skysta terpė su reagentais augimui (mitybai) ir vandens, kaip antai, mielių sintetinė terpė (YSM gaunama iš BIO101, taip pat žiūrėti Rose MD, Winston F, and P Hieter. (1990) Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Labaratory Press ).
Vienas šio išradimo realizavimo būdų nukreiptas į naują modifikuotą ląstelę šeimininką ir atrankos būdą, kuris parodo tiriamojo junginio sąveiką su pasirinkta rišamųjų peptidų pora pagal atpažįstamą fenotipo pokytį. Si modifikuota ląstelė šeimininkas keičia fenotipą tiktai dalyvaujant tiriamajam junginiui, turinčiam gebą rištis tik su vienu peptidu iš rišamųjų peptidų poros. Ši ląstelė šeimininkas yra 12 LT 4230 B nurodoma kaip sistema gelbėtoja. Paprastai ląstelės atsakas sukeliamas, kai sąveikauja abu transkripcijos aktyvavimo baltymo domenai. Be to, sistemoje gelbėtojuje neįvyksta teigiamas pokylis fenotipe, kai abu transkripcijos aktyvavimo baltymo domenai sąveikauja. Teigiamas pokytis būna tiktai tada, kai tiriamasis pavyzdys nutraukia abiejų transkripcijos aktyvavimo baltymo domenų sąveiką. Sistemoje gelbėtojoje modefikuota ląstelė šeimininkas gali ekspresuoti mažiausiai du heterologinius sulietus baltymus. Be to, ląstelėje šeimininke yra: genas reporteris, efektyviai asocijuotas su transkripcijos aktyvavimo baltymu; kur minėtasis genas reporteris dėl transkripcijos aktyvavimo baltymo ar jo dalies trukdo specifinio fenotipo pasirodymai selektyvioje terpėje. Ląstelės šeimininko chromosominėje DNR mutacija sugrąžina fenotipo pasireiškimą selektyvioje terpėje nesant geno reporterio ekspresijai. Jei reikia, delecija ar mutacija įvykdoma ląstelės šeimininko transkripcijos aktyvavimo baltyme chromosominėje DNR tam, kad transkripcijos aktyvumas pasireikštų tiktai esant produktyviai pasirinktos rišamosios poros sąveikai. Tiktai kai rišamasis pavyzdys nutraukia taniskripcijos aktyvumo baltymo abiejų domenų sąveiką, modifikuota ląstelė augs ar išgyvens, ar pademonstruos kitą atrinktą fenotipą. Dažniausiai fenotipas išreiškiamas ląstelės augimu.
Jei atrankos būdas, kaip aptarta anksčiau, naudojamas nustatyti ar tiriamasis pavyzdys sąveikauja, ar greičiau nutraukia peptidų rišimąsi, stebimą nesant tiriamajam pavyzdžiui, tai antrinė atranka naudojama tiriamojo pavyzdžio specifinei surišimo gebai nustatyti, t.y. prie kokio peptido iš rišamųjų peptidų poros jungiasi tiriamasis pavyzdys. Antrinė atranka naudoja šio išradimo naujas ląsteles, kur ląstelės adaptuojamos sukelti fenotipo pasireiškimą ar fenotipo pakitimą tik esant tiriamajam pavyzdžiui, kurį suriša vienas peptidų iš rišamųjų peptidų poros. Vienas iš bevelijamų būdų tiriamojo pavyzdžio specifinio rišimosi charakteristikų nustatymui apima naudojamas ląsteles, kurios turi efektyvų (santykinai didelį) vieno iš dviejų sulieto baltymo, turinčio vieną iš dviejų peptidų, kopijų skaičių. Efektyvus kopijų skaičius yra bet kuris kopijų skaičius, pakankamas tiriamojo pavyzdžio specifinio rišimosi nustatymui. Dažniausiai genų kopijų skaičius yra mažiausia maždaug 5, dažniausiai svyruoja nuo maždaug 5 iki maždaug 50, labiausiai bevelijama su didesniu kopijų 13 LT 4230 B skaičiumi. Kitas sulietas baltymas palaikomas santykinai žemame lygyje (1 iki maždaug 2 kopijos ląstelei) arba įjungiant į ląstelės chromosomą, ar panaudojant chromosomų ceutromerinę seką ant ekspresuojančios plazmidės. Jei šio išradimo ląstelėje naudojamas pirmojo peptido didelis kopijų skaičius, ląstelė bus jautresnė tiriamajam pavyzdžiui, kuris suriša rišamųjų peptidų poros antrąjį peptidą, kadangi apribojantis antro peptido kiekis nulemia geno reporterio aktyvumo lygį, t.y. stebimas fenotipo pakitimas. Atvirkščiai, jei yra naudojamas geno, koduojančio rišamųjų petidų poros antrąjį peptidą, didelis kopijų skaičius, tai ląstelė bus jautresnė tiriamajam pavyzdžiui, kuris riša pirmąjį peptidą, kadangi apribojantis antrojo peptido kiekis nulemia geno reporterio aktyvumo lygį (t.y. stebimas fenotipo pokytis). Tiesioginis tiriamojo pavyzdžio poveikio abiejų kamienų fenotipui palyginimas (receptorius>>> ligandas atžvilgiu lig andas>>> receptorius) parodo junginio specifinę baltymų sąveiką. Kaip aptarta anksčiau, genai, ekspresuojantys peptidus, taip kaip ir genas reporteris, dažniausia ekspresuoja transformuojant mielių ląstele autonomiškai replikuojančia plazmidė.
Šie išradimo papildomai modifikuota ląstele šeimininkas nukreipta į ląsteles, kurios gali būti panaudotos tirti peptidų ligandus, kurie turi dvejopus receptorius ar receptorių ir perdavėją aktyvinimui ar signalo perdavimui iš daugybinio peptidų surišimo komponenčių, t.y. trijų ar daugiau peptidų surišimo komponenčių, ryšio.
Tam tikros klasės receptoriams receptorių dimerizacija yra kritiškas pirmas žingsnis signalo perdavimui. Dimerinės receptoriaus struktūros gali būti sudarytos iš identiškų receptoriaus subvienetų (pavyzdžiai: insulino receptorius, insulinui panašaus augimo faktoriaus-I (IAF-I) receptorius, iš trombocitų gauto augimo faktoriaus (TAF) receptorius, kinazės inertinio domeno receptorius (KDR) ar koloniją stimuliuojantis faktorius (KSF)-I receptorius), ar nevienodų receptoriaus subvienetų (pavyzdys: IL 6R + gpl30; insulino - IAF - I hibridinis receptorius, LIF+gpl30; BNF+gpl30, įvairūs interferono receptoriai).
14 LT 4230 B
Modifikuotos ląstelės šeimininko komponentės peptido., turinčio dvejopą receptorių sistemą, rišamumo (gebėjimo rištis) kontrolei yra šios: genų seka (a) yar genų seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; minėtasis sulietas baltymas, turintis vieną peptidą iš daugybinio peptidų surišimo komplekso, ar minėtojo peptido segmentą, kuris jungiasi arba su vienu iš DNR rišamuoju domenu, ar jam atitinkančiu transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domenu; ir genų seka (b) yra genų seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; minėtasis sulietas baltymas, turintis antrąjį minėtojo daugybinio peptidų surišimo komplekso peptidą ar segmentą minėtojo receptoriaus, sulieto su vienu iš DNR rišamuoju domenu ar jį atitinkančiu transkripcijos aktyvavimo domenu, bet kuris nenaudojamas punkte (a). Modifikuotoje ląstelėje šeimininke daugybinio peptidų surišimo komplekso, kaip autai, dvejopos receptorinės sistemos tyrimui taip pal yra genas reporteris ir chromosominė mutacija peptido (ligandas/receptorius) sąveikos specifinei analizei, kaip aptarta toliau. Galima ekspresuoti trečiąjį peptidą (pavyzdžiui, ligandą), kad įvertintų lyginamąjį ir konkurentinį tyrimą.
Kaip pažymėta anksčiau, daugybinių peptidų surišimo kompleksų, t.y. aukštesnės eilės baltymų, kurie turi vieną ar daugiau peptidų, tyrimui faktiškai galima naudoti šio išradimo modifikuotą ląstelę šeimininką trijų ar daugiau peptidų ekspresijai. Tripeptidų surišimo komplekso atveju bet kurie du peptidai gali būti sulieti su abiem transkripcijos aktyvavimo baltymo komponentais. Pavyzdžiui, kad ištirtų ligando, kuris veikia per dimerizacijos receptorių, sąveiką, gali būti ekspresuoti receptoriai kaip sulieti baltymai su ligandu, ekspresuotu kaip nesulietas baltymas. Ši ląstelės šeimininko sistema gali būti panaudota polibaltymų fermentų kompleksų tyrimui. Kiekvienam daugybiniam peptidų surišimo kompleksui galima identifikuoti naujus peptidus, kurie sąveikauja su kompleksu ekspresuojant naujus baltymus iš atsitiktinių komplementarių DNR sekų (pavyzdžiui, cDNR bankas), sulietus su vienu iš transkripcijos aktyvavimo domenų. Tokioje sistemoje vienas iš žinomų rišamųjų peptidų komplekso peptidas yra sulietas su kitu transkripcijos aktyvavimo baltymo domenu, tuo metu kai kiti rišamųjų peptidų komplekso elementai ekspresuojami kaip nesulieti peptidai. Toliau pažymima, kad skaičius petidų, ekspresuotu modifikuotos ląstelės šeimininko, bus tik apribotas prieinamais detektavimo būdas ir ląstelės šeimininko pajėgumu.
Nauji atrankos būdai gali būti panaudoti identifikavimui junginių, sąveikaujančių su bet kuria rišamųjų peptidų pora, pavyzdžiui, bet kuris receptorius ir/ar ligandas. Taip pat ši modifikuotų ląstelių sistema su genu reporteriu atrinkimui sukurti gali būti panaudota bet kuriai baltymas-baltymas sąveikai, kad surastų naujus junginius, kurie nutraukia tą sąveiką. Specifiniais pavyzdžiais yra:
a) kinazių baltymai, įterpti į auglį, gali būti patalpinti į sistemą greitam atrinkimui junginių, kurie blokuoja kinazė-taikinys sąveiką, ir tokiu būdu gali būti unikaliais vienetais prieš auglį;
b) virusų apvalkalų baltymai, tokie kaip žmogaus imunodeficito viruso glikoproteinaį, ir atitinkantys ląstelės paviršiaus receptorių baltymai, tokie kaip CD4, gali būti patalpinti į sistemą greitai atrankai junginių, kurie nutraukia šią sąveiką, ir gali būti ant virusiniais agentais;
c) abu Plasmodium ribonukleotidų reduktazės enzymo subvienetai gali būti ekspresuoti sistemoje, kad atrinktų junginius, kurie trukdo šiai specifinei baltymo asociacijai ir tuo būdu gali būti naujais antimaliariniais agentais.
Toliau pateikiami pavyzdžiai yra skirti toliau iliustruoti įvairius šio išradimo aspektus. Jie negali būti aiškintini kaip ribojantys išradimą.
Pavyzdys 1: Specifinė ir grįžtama ligando - receptoriaus sąveika
Genai, koduojantys sulietus baltymus, yra produkuojami klonuojant augimo hormoną (AH) ir augimo hormono receptoriaus (AHR) cDNR sekas į plazmides, turinčias domenui Gal4 kodavimo rajonus. DNR rišamųjų domenų (Gal4) suliejimai įkonstruojami į pAS2, kurios aprašytos Wade Ilarper J. Adami GR, Wei N, Keyomarsk K and SJ Elledge. (1993) The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of GI Cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816. Genų aktyvavimo domenų (Gal4) suliejimai konstruojami į pACT-II, kuri yra tapati pACT (aprašyta Durfee T., Becherer K., Chen P-L., Yeh, S-H., Yang Y., Kilbum AE., Lee W-H. and 16 LT 4230 B
SJ Elledge. (1993) The retinoblastoma protein associated with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes and Devel. 7:555-569), išskyrus modifikacijas su pililinkerių rajonu. Į Bgl II įjungiama tokia seka: Bgl II Hemagliutinino epitopas - NdeI - Ncol - SmaI - BamHI - EcoRI - Xhol - Bgl II, adaptuotą iš polilinkerių sekos pAS2 (Wade Harper J, Adami GR, Wei N, Keyomarsk K and SJ Elledge. (1993) The p21 Cdk-inleracting protein Cipl is a potent inhibitor of GI Cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816). cDNR, koduojanti kiaulės AH subrendusį baltymą, yra produkuojama standartiniu polimerazinės grandinės sintezės (PGS) metodu (žiūrėti Finny M. (1992) The polymerase chain reaction. In: Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15 Eds (FM Ausubel, R Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, J Smith and K Struhl) John Wiley & Sons, NY).
Oligonukleotidai, gauti ABI oligosintezatoriumi, projektuojami pagal paskelbtą kiaulės AH cDNR seką ( žiūrėti Su T-Z and MR El-Geweley. (1988) A multisite directed mutagenesis using T7 DNA polymerase: application for recontructing a mammalian gene. Gene 69:81-89). Trisdešimties bazių 5' oligonukleotide yra Ncol saitas (5'-CATGCCATGGAGGCCTTCCCAGCCATGCCC 3’) ir dvidešimt septynių bazių 3' oligonukleotide yra BamHI saitas (5CGGGATCCGCAACTAGAAGGCACAGCT-3'). AH cDNR generuojama naudojant kiaulės hipofizio lambda gtll banką kaip matricą. 540 bp fragmentas yra gaunamas, surišamas su pCR II vektorių (Invitrogen Corp.), rekombinantai yra patikrinami hidrolizuojant restrikciniais fermentais, ir DNR produkuojama kaip aprašyta Maniatus T, Fritsch EF and J Sambrook. (1982) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. cDNR seka nustatoma spalvine deoksine (dyedeoxy) baigmės reakcija naudojant Perkin-Elmer Cetus Corp. reagentus ή metodiką ir ABI 373A automatinį sekų analizatorių. AH cDNR yra tiesiogiai klonuojama į pACT-II per Ncol ir BamHI saitus. cDNR, koduojanti AHR tarpląstelinį domeną, produkuojama naudojant standartinius PGS metodus. Trisdešimt trijų bazių 5' oligonukleotide yra Ncol saitas (5'CATGCCATGGAGATGTTTCCTGGAAGTGGGGCT-3') ir trisdešimt devynių 17 LT 4230 B bazių oligonukleotide yra baigmės kodonas, einantis po Ncol saito (5CATGCCATGGCCTACCGGAAATCTTCTTCACATGCrGCC-3'), ir naudojami produkuoti 742 bp fragmentui, koduojančiam žiurkės AHR 1 - 247 amino rūgštis (Baumbach WR, Homer D. and JS Logan. (1989) The growth hormone-binding protein in rat serum is an alternatively spliced form of the rat growth hormone receptor. Genes & Devel. 3:1199-1205). Ši AHR cDNR klonuojama į pCRII vektorių, kaip aprašyta anksčiau, ir po to vėl subklonuojama i vektoriaus pAS2 Ncol saitų. Galutinių rekombinantinių vektorių DNR perkeliama ličio acetato metodu (Rose MD, Winston F, and P Hieler. (1990) Melhods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Labaratory Press) į mielių kamieną.
Mielės šeimininkas, (Y190), turinčios UASgjj-HIS geną reporterį, gaunamos pagal metodiką, aprašytą Wade Harper J, Adami GR, Wei N, Keyomarsk K and SJ Elledge. (1993) The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of GI Cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816. Kamieno Y190 genotipas yra MATa leu23, 112 ura3-52 trpl-901 his3d200 ade2-101 gal4 gal80 URA3: :GAL-lacZ FYS2: :GAL-HIS3 cyhr. Y190 kamienas perkeliamas su abiem sulietom konstrukcijomis ar su vienintele sulieta konstrukcija ir priešpriešiniu vektoriumi, neturinčiu heterologinių sekų. Buvo rasta, kad kamienai vienodai auga neselektyvioje terpėje (fig. 2A). Po to šių kamienų augimas buvo tiriamas selektyvioje terpėje (t.y. mitybinė terpė be amino rūgšties, kuri sintezuojama aktyvuojant genui reporteriui). Tiktai kamienas, turintis hibridinius baltymus, (CY722) gali augti, kadangi neauga tiktai kamienas, turintis arba sulietą ligandą ar receptorių (CY724 ir CY723, atitinkamai; fig. 2B). Du kiekvieno kamieno nepriklausomi pavyzdžiai dryželiais užnešami ant sintetinės terpės, turinčios 2 % gliukozės, mielių azotinę bazę, amino sulfato, 0,1 mM adenino ir 60 mM 3-aminotriazolo (B lėkštelė) arba ant tos pačios terpės su histidino priedu (A lėkštelė). A lėkštelė inkubuojama prie 30°C tris dienas, lėkštelė B - penkias dienas. Šie rezultatai rodo, kad AH ir AHR gali būti nuo Gal4 priklausomo geno reporterio aktyvavimo mediatoriais sąveikoje, tokioje kaip ligando-receptoriaus rišimasis.
Pavyzdys la: Konkuriuojančiai ekspresuotas laisvas ligandas (AH) esant AH ir AHR sulietiems baltymams
Kad įvertintų akivaizdų AH prisijungimą prie jo receptoriaus svetimoje mielių branduolio aplinkoje, sistema modifikuojama pridedant trečią plazmidę, esančią laisvo ligando ekspresijos mediatoriumi, kad parodytų, kuris AH peptidas konkuruoja su AH-Gal4 sulietu baltymu, apgręžiant 2-hibrido sąveiką, parodytą pavyzdyje 1. Tėvinis kamienas Y190 (Wade Harper J, Adami GR, Wei N, Keyomarsk K and SJ Elledge. (1993) The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of GI Cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816) auginamas ant terpės, rturinčios 5-F-oroto rūgštį, atrinkti dariniams, kuriuose spontaniškai prarandamas URA3 genas (žiūrėti Rose ΜΌ, Winston F, and P Hieter. (1990) Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Labaratory Press). Galutinis kamienas, pažymėtas CY770, naudojamas visuose eksperimentuose, turinčiuose efektus baltymų, kuriuos ekspresavo konkurentiškai trečias komponentas (t.y., trečia plazmidė). cDNR, koduojanti AH, yra produkuojama PGS metodais naudojant trisdešimt astuonių bazių 5' oligonukleotidų, turintį EcoRI saitą (5CCGAATTCAAAATGGCCTTCCCAGCCATGCCCTTGTCC-3') ir dvidešimt šešių bazių 3’ oligonukleotidų, turintį HindlII saitą (5' CCAAGCTTCAACTAGAAGGCACAGCT-3') paskesniam sublokavimui į vektorių pCUP. pCUP yra indukuotas mielių ekspresijos vektorius, gautas iš pRS316 (Hill JE, Myers AM, Koemer TJ and A Tzagoloff. (1986) Yeast / E.Coli shuttle vectors with multiple uniųue restriction sites. Yeast 2:163-167). Trumpai, šis vektorius konstruojamas įjungiant 3’ mielių PGK geno (iš pPGK; Kang Y-S, Kane J, Kurjan J, Stadel JM and DJ Tipper. (1990) Effects of expression of mammalian G and hybrid mammalian-yeast G proteins on the yeast pheromone response signal transduction pathway. Mol. Cell. Biol. 10:2582-2590) galą į pRS316 klonavimo rajoną kaip BamHI-SalI fragmentą, kad taptų transkripcijos baigmės signalu. Prie šios plazmidės CUP1 promotoriaus rajonas (Butt TR, Sternberg EJ, Gorman JA, Clark P, Hamcr D, Rosenberg M and ST Crooke. (1984) Copper metallothionein of yeast, structure of the gene and regulation of expression. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 81:3332-3336) praplečiamas PGS metodu kaip SacI-EcoRi fragmentas ir įterpiamas į atitinkamus plazmidės saitus pCUP sukūrimui. AH ekspresijos plazmidė (AH-pCUP) yra toliau transformuojama su AH ir AHR sulietomis konstrukcijomis j kamieną CY770, kad produkuotų CY7S1. Laisvo AH ir AH ir AHR sulietų baltymų (CY781) konkurencinė ekspresija rodė nuo AH-AHR priklausomo ląstelės augimo ant selektyvios terpės blokavimą (fig. 2B). Sis eksperimentas patvirtina konkurenciją in vivo ir demonstruoja stebimos ligandas-receplorius sąveikos grįžtamumą.
Pavyzdys 1B: peptidinio hormono prolaktino (PRL) ir jo receptoriaus surišimas Šios technologijos išplėtimui ir įvertinimui buvo ištirta panaši sistema naudojant peptidinį hormoną prolaktiną (PRL) ir jo receptorių. Prolaktinas struktūriškai giminingas AH ir prolaktino receptorius (PRLR) yra taip pat citokinų receptorių grupės narys. Kitaip negu žmogaus AH, subprimatų ALI nelengvai jungia PRLR (Yang KH and FW Bazer (1989) Porcine endometrial prolactin receptors detected by homologous radioreceptor assay. Mol. and Cell. Endocrinol. 64:145-154); PRL neriša lengvai AHR (Leung DW, Spencer SA, Cachianes G, Hammonds G, Collins C, Flenzel WJ, Bamard R, Waters MJ and WI Wood. (1987) Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression. Nature 330:537-543). Subrendęs kiaulės PRL produkuojamas sulietas su GAL4 aktyvavimo domenu. Oligonukleotidai konstruojami pagal kiaulės PRL (gauta iš genų banko Χ14068) ir naudojama produkuoti subrendusį kiaulės baltyminį hormoną PRL iš kiaulės hipofizio lambdos gtll banko naudojant PGS metodus. Trisdešimt vienos bazės 5' oligonukleotidas turi saitą (5'-CGGAATTCTGCCCATCTGCCCCAGCGGGCCT3') ir atitinka sekai, koduojančiai 1-7 amino rūgštis. Trisdešimties bazių oligonukleotidas turi EcoRI saitą (5'GAATTCACGTGGGCTTAGCAGTTGCTGTCG-3') ir atitinka cDNR 3’ rajonui galiniam baigmės kodonui. 600 bp fragmentas yra gaunamas, sujungiamas su pCRII vektoriumi ir patvirtinamas restrikcinių fermentų karpiniais ir bazių sekos analize. cDNR PRL klonuoįama į pACT-II per EcoRI saitą.
Tarpląstelinis kiaulės PRL receptoriaus (PRLR) domenas produkuojamas sulietas su GAL4 DNR rišamuoju domenu. Oligonukleotidai projektuojami remiantis pelną 20 LT 4230 B
PRLR bazių seka (Davis J and DIH Linzer. (1989) Expression of multiple forms of the prolactin receptor in the mouse liver. Mol. Endocrinol. 3:674-680). Trisdešimt vienos bazės 5' oligonukleotide yra SmaI saitas (5'TCCCCCGGGGATGTCATCTGCACTTGCTTAC-3’), tuo metu kai trisdešimt vienos bazės 3' oligonukleotide yra baigmės kodonas, po kurio seka Salį saitas (5TCCGTCGACGGTCTTTCAAGGTGAAGTCATT-3'). Šie oligonukleotidai riboja tarpląstelini PRLR domeną, koduojantį 1-229 amino rūgštis. Kiaulės hipofizio lambda gtll bankas naudojamas kaip matrica. Panaudojus standartinius PGS metodus, 687 bp fragmentas produkuojamas, prijungiamas prie pCRII ir nustatoma nukleotidų seka. cDNR PRLR klonuojamas Į pzAS2 vektorių per SmaI ή Salį restrikcinius saitus.
Kamienas Y190 transformuojamas panaudojus sulietų PRL ar PRLR ekspresijos plazmidės arba pavieniui (CY727 ar CY728, atitinkamai), arba kartu (CY726). Ląstelės, ekspresuojančios tiek PRL, tiek ir PRLR suliejimus, gali augti ant selektyvios terpės, tuo metu kai kamienai, turintys tik jungtinį ligandą ar tiktai v
receptorių, negali. Šie rezultatai atspindi rezultatus, stebėtus AH-AHR sistemoje aukštesniame pavyzdyje, ir nustato bendrą 2-hibridinių sistemų panaudojimą tirti ligandų jungimuisi su šios grupės receptoriais.
Pavyzdys IC: Papildomas ligando-receptoriaus specifiškumo naujai mielių ląstelės šeimininko sistemai patvirtinimas
Papildomi kamienai yra išplėsti tiri i ligando-receptoriaus specifiškumui, URA minus kamienai, ekspresuojantys AH ir AHR sulietus baltymus, transformuojami panaudojant pCUP ar PRL-pCUP; tuo metu kai kamienai, ekspresuojantys PRL ir PRLR sulietus baltymus, transformuojami panaudojant pCUP ar PRL-pCUP. Trumpai, PRL-pCUP konstruojamas būdu, panašiu aprašytam AH-pCUP. PRL cDNR generuojama PGS metodu naudojant trisdešimt trijų bazių 5' nukleotidą su EcoRI saitu (5'-GAATTCAAAATGCTGCCCATCTGCCCCAGCGGG-3') ir iš pavyzdžio 1B 3' oligonukleotidą. Galutinis fragmentas įvedamas į pCUP per EcoRI saitą. Kaip parodyta ankstesniame pavyzdyje, kamienas, ekspresuojantis sulietus AH 21 LT 4230 B ir AHR, be konkurentų auga ant selektyvios terpės, ir šis augimas sustabdomas laisvo AH ekspresija. Eksperimente su prolaktinu gauti panašūs rezultatai, kas patvirtina ligando-receptoriaus rišimosi specifiškumą mielių ląstelėje. Kamienas, turintis sulietus PRL ir PRLR (CY787), gali augti ant selektyvios terpės, ir šį augimą nutraukia laisvos PRL ekspresija (CY786; 1 lentelė).
AHR selektyvumui patikrinti kamienas, turintis sulietus AH ir AHR, v
transformuojamas panaudojant PRL-pCUP. Sis kamienas auga ant selektyvios terpės (CY785, 1 lentelė). Šie duomenys nurodo, kad AH Tįsimasis su jo receptorium šioje sistemoje gali būti efektyviai konkuruojamas perteklinio AH rišimosi, bet ne giminingo PRL peptido rišimosi (CY755). Anksčiau pateiktų trijų heterologinių baltymų ekspresavimo eksperimentų rezultatai iliustruoja ligando-recepoloriaus sąveikos specifiškumą šio išradimo sistemoje.
lentele. Kamienų sąrašas ir biobandymų rezultatai
| Pavadinimas | AD sulietas | BD sulietas | pCLP | Augimas |
| CY700 | - | - | - | 0 |
| CY722 | AH | AHR | - | + |
| CY723 | vektorius | AHR | - | 0 |
| CY724 | AH | vektorius | - | 0 |
| CY726 | PRL | PRLR | - | -r |
| CY770 | - | - | - | 0 |
| CY781 | AH | AHR | Ali | 0 |
| CY784 | AH | AHR | vektorius | + |
| CY785 | AH | AHR | PRL | + |
| CY786 | PRL | PRLR | PRL | 0 |
| CY787 | PRL | PRLR | vektorius | + |
• Visi mielių kamienai yra išvesti iš kamieno Y190 (Wade Harper J, Adami GR, Wei N, Keyomarsk K and SJ Elledge. (1993) The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of GI Cyclindependent kinases. Cell 75:805-816). Genotipas yra MATaga!4gal!80 his3 crpl-90] ad&2-101 ura3-52 22 LT 4230 B leu2~3,112 URA3: :GAL-!acZ LYS2: :GAL-H1S3 cyh. Kamienai, pažymėti skaičiumi lygiu arba didesniu kaip 770, neturi URA3: :GAL-lacZ geno. Brūkšnelis žymi, kad kamienas neturi žymėtos plazmidės.
• AD suliejimai yra pACT dariniai; Ali arba PRL sulieti su Gal4 aktyvavimo domenu.
• D suliejimai yra pAS2 dariniai; AH arba PRL receptorių tarpląsteliniai domenai sulieti su DNR rišimo domenu Gal4.
• pGUP žymi peptidus, ekspresuojamus iš pCUP plazmidės.
• Biobandymų rezultatai trumpai: kiekvienas kamienas auginamas selektyvioje terpėje nuo 3 iki 5 dienų esant 30° C temperatūrai, tada stebimas ląstelės augimas žymimas plius.
Pavyzdys 2: Atranka junginių, nutraukiančių sąveikų lidandas-receptorins
Mažo kopijų skaičiaus plazmidės, ekspresuojančios AHR- ar AH-Gal4 sulietus baltymus (pOZ153 ir pOZ152 atitinkamai), konstruojamos, kad sumažintų šitų baltymų ekspresiją. Be to, naujas genas reporteris yra konstruojamas taip, kad sutrukdytų ląstelių proliferaciją selektyvioje terpėje, jei ekspresija nenutraukta. Kad sukonstruotų AHR suliejimo ekspresijos plazmidė, SacI-BamHI restrikcijos fragmentas, turintis mielių struktūrinį promotorių ir GAL4 sekas, išskiriamas iš pASl (Durfee T., Becherer K., Chen P-L., Yeh, S-H., Yang Y., Kilbum AE., Lee W-H. and SJ Elledge. (1993) The retinoblastoma protein assoeiated with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes and Devel. 7:555-569) ir klonuojamas į pUN30 (Elledge S.T and RW Davis. (1988) A family of versitile centromeric vectors designed for ūse in the secteringshuffle mutagenesis assay in Saccharomyces cerevisiae. Gene 70:303-312). Tada AHR tarpląstelinis domenas suliejamas su GAL4 liguojant kaip Ncol fragmentą, kaip aprašyta pavyzdyje 1, kad sukurtų pOZ153. Kad sukonstruotų AH suliejimo ekspresijos konstrukciją, visas AH-Gal4 rajonas su promotoriaus ir baigmės sekomis yra atskiriamas iš plazmidės, aprašytos pavyzdyje 1, kaip PvuI-SalI fragmentas. Sis DNR segmentas yra klonuojamas į pUNlOO (Elledge SJ and RW Davis. (1988) A family of versitile centromeric vectors designed for ūse in the secteringshuffle mutagenesis assay in Saccharomyces cerevisiae. Gene 70:303312), produkuojantis pOZ152. Genas reporteris yra konstruojamas, atskiriant mielių CYH2 kodavimo rajoną ir tuoj pat prijungiant prie GAL promotoriaus rajono mielių ekspresijos plazmidėje. Trumpai, GALI promotoriaus rajonas įterpiamas į YEp352 (Hill JE, Myers AM, Koemer TJ and A Tzagoloff. (1986) Yeast / E.Coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites. Yeast 2:163-167) kaip 685 bp EcoRIBamHI fragmentas. CYH2 sekos gausinamos PGS būdu naudojant oligonukleotidų pradmenis (5'-GGATCCAATCAAGAATGCCTTCCAGAT-3' ir 5'GCATGCGTCATAGAAATAATACAG-3') ir pAS2 kaip matricą. PGS produktas yra hidrolizuojamas BamHI plius Sphl ir klonuojamas į atitinkamą saitą YEp352GAL vektoriuje. Šios plazmidės transformuojamos į mielių kamieną CY770, kuris turi mutaciją chromosominiame cyh2 gene, lemiančiame kamienui atsparumą baltymų sintezės inhibitoriui cikloheksimidui. Visų trijų plazmidžių buvimas būtinas, kad palygintų jautrumą cikloheksilimidui (cyh·).
Kamienas (CY857), turintis ligando ir receptoriaus suliejimų plazmidės plius plazmidę reporterį, sudaro pagrindą paprastam pirminiam atrinkimui junginių, kurie nutraukia AH rišimąsi su jo receptoriumi. Kamienas CY857 įterpiamas standartinėje mielių mitybinėje terpėje, turinčioje 10,0 pg/ml cikloheksilimido. Dėl to, kad ligando/receptoriaus sąveiką skatina CYH2 geno reporterio ekspresiją, kamienas yra jautrus cikloheksilimidui ir todėl negali augti. Cheminiai junginiai yra patalpinami ant šios tiriamosios terpės. Junginiai, kurie silpnina AH-AHR rišimąsi, yra identifikuojami pagal augimą ląstelių, supančių šį junginį, kadangi nesant CYH2 ekspresijai, ląstelės tampa atspariomis cikloheksilimidui, esančiam terpėje.
Antrinė atranka pavyzdžio taikiniui nustatyti
Ligando receptoriaus rišimosi nutraukimas šiame tyrime gali būti junginio reakcijos ar su receptorium, ar su ligando suliejimo komponentu pasekmė. Naujo junginio specifinis taikinys apsprendžiamas paprastu antriniu tyrimu, naudojant kamienus, perteklinai ekspresuojančius vieną iš sulietų baltymų. Kamienas CY858 ekspresuoja AEIR-GAL4 suliejimus dideliu pertekliumi dėl konstrukcijos, esančios ląstelėse, esant dideliam kopijų skaičiui (pOZ149), tuo metu kai AH-suliejimas (pOZ152) lieka lygyje, panašiame baziniam kamienui (CY857). Priešingai, kamienas CY859 ekspresuoja AH-GAL4 suliejimą didesniu pertekliumi dėl to, kad ši konstrukcija yra 24 LT 4230 B ląstelėse su dideliu kopijų skaičiumi (pKY14), tuo metu kai AHR suliejimas (pOZ153) yra lygyje, panašiame kaip bazinio kamieno (CY857). Junginiai, gelbstintys augimą pirminėje atrankoje naudojant CY857 (AH ir AHR suliejimai, ekspresuoti žemesnių kopijų skaičiaus plazmidžių) yra po to tiriami tokiu pat būdu, naudojant CY858 (AHR»AH) arba CY859 (AH»AHR) kaip tiriamąjį kamieną. Pavyzdžiui, kai ligando-receptoriaus rišimasis yra inhibuojamas junginiu, reaguojančiu su AHR, antrinė atranka pademonstruos stebimą pakeitimą matuojamame fenotipe. Gelbstinčio junginio antrinis tyrimas, atliktas kamienui CY858, kuris perteklinai ekspresuoja AHR suliejimą, rodo mažesnį augimą esant junginiui, negu augimas, stebėtas kamienui CY859. Šis žymus pakitimas matuojamame fenotipe įvyksta todėl, kad AHR perteklius titruoja junginį, dėl to padidėja CYH2 ekspresija ir ląstelės augimo inhibavimas. CY858 rodo žymų pakitimą, analogišką CY857, kadangi AHR sulietas baltymas yra limituojantis. Junginys, sąveikaujantis su ligando suliejimu, rodo priešingą pakitimą matuojamame fenotipe šiame antriniame tyrime.
Pavyzdys 3: Receptoriaus dimerizacijos, priklausomos uuo ligando, parodymas:
Daugybinės baltymų sąveikos (pavyzdžiui, ligandas-receptorius-receptorius) tiriamos išplėstine sistema, kuri ekspresuoja trečią baltymą, naudojant toliau pateiktą schemą.
Vienas receptoriaus dimero vienetas produkuojamas kaip sulietas baltymas ar su Gal4 DNR rišamuoju, ar su aktyvavimo domenu. Receptoriaus dimero kitas vienetas produkuojamas kaip sulietas baltymas su atitinkamu Gal DNR rišamuoju ar aktyvavimo domenu, kas nebuvo naudota pirmajam suliejimui. Genas, koduojantis ligandą, ekspresuojamas trečios plazmidės ir produkuojamas kaip laisvas (nesulietas) ligandas. Sulietų baltymų sąveika įvyksta tik esant ligandui (žiūrėti fig. 3).
Vaskuliarinio endotelio ląstelių augimo faktoriaus (VEAF) sąveika su jo konjugato receptoriaus ligandą rišančiu domenu (KDR, kinazę įterpiantį domeną turintis receptorius) aprašyta kaip pavyzdys šiai sistemai. KDR yra tirozino kinazės receptorius, ir dimero susidarymas (1 ligandas - 2 receptoriai), manoma, yra svarbus 25 LT 4230 B hormono indukuotai receptoriaus funkcijai. cDNR, koduojanti KDR ligando domeną (Terman BI, Carrion ME, Kovach E, Rasmussen BA, Eddy RL and Shaw B. (1991). Identification of a new endothelial cell grovvth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6:1677-1683) izoliuojama kaip Nco I - BamHI fragmentas ή klonuojama į pACT-II ir pAS2 vektorių. cDNR, koduojanti subrendusį baltymą VEGF, yra produkuojama, naudojant standartinį PGS būdą. Oligonukleotidai projektuojami pagal paskelbtą seką (žiūrėti Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva T. Gospodarowicz D, Fiddes JC, and JA Abraham. (1991) The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein fonus are encoded through altemative exon splicing. J. Biol. Chern. 266:11947-11954). Trisdešimt keturių bazių 5' oligonukleotidas, turintis EcoRI saitą (5CGGAATTCGAAGTATGGCACCCATGGCAGAAGGA-3') ir dvidešimt aštuonių bazių 3' olieonukleotidą turintį EcoRI saitą (5CGGAATTCGGATCCTCATTCATTCATCA-3'), naudojamas produkuoti 450 bp fragmentą, koduojantį subrendusį baltymą, ir klonuoti į pCUP saitą EcoRI. Galutinių rekombinantiniu vektorių DNR transformuojama į mieles naudojant ličio acetato būdą, kad produkuotų tinkamą kamieną.
Mielių šeimininko kamienas (CY770) transformuojamas su KDR-pACT-II, KDRpAS2 ir VEGF-pCUP, kad produkuotų kamieną CY846; arba transformuojamas abiem receptorių suliejimais ir pCUP, kad produkuotų kamieną CY847. Be to, ir KDR-pACT-II, ή KDR-pAS2 transformuojami kartu (CY845) ar atskirai (CY843 arba CY844) ar tiktai AūEAF-pCUP (CY841) kaip kontroliniai kamienai. Kamienai tiriami ar jie auga selektyvioje terpėje. Kamienas (CY846), kuris ekspresuoja VEAF ligandą ir abiejų receptorių sulietus baltymus, žymiai labiau auga selektyviose terpėse lyginant su kamienu CY847, kuris neekspresuoja VEAF ligando (žiūrėti fig. 4). Šie rezultatai rodo, kad efektyvios šio išradimo ląstelės gali būti naudojamos, kad ištirtų receptoriaus dimerizaciją, priklausomą nuo ligando.
Pavyzdys 4: Atranka junginių, kurie yra ligandais diinerinių receptorių sistemoje * LT 4230 B
Receptoriaus vienetų dimerizacija (oligomerizacija) dažnai yra svarbus pirmas žingsnis aktyvuojant receptorius, tokius kaip augimo faktoriai, citokinai ir tokius, kurie aprašyti aukščiau. Nauja ląstelių sistema, aprašyta pavyzdyje 3, gali būti pritaikyta atrasti naujiems junginiams, kurie aktyvina (ar blokuoja) receptorių dimerizaciją. Tokie nauji sąveikaujantys junginiai gali būti efektyviais terapiniais agentais polologijoje, susijusioje su šiais receptoriais.
Plazmidės, ekspresuojančios dimerinių receptorių vienetą(us), kaip sulietus baltymus, produkuoja, kaip aptarta pavyzdyje 3. Kamienas (CY845), turintis KDR-pACT-II ir KDR-pAS2 suliejimus, yra paprastos plazmidės atrankos receptoriams, kurie turi dimerinę struktūrą, pavyzdys. Kamienas CY845 patalpinamas sintetinėje agaro terpėje, kurioje yra histidino trūkumas (Rose MD, Winston F, and P Hieter. (1990) Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Labaratory Press). Tiriamasis junginys patalpinamas ant šios tiriamos terpės viršaus. Cheminiai junginiai, kurie stimuliuoja abiejų receptorių suliejimą (nesant ligando) sąveiką, pertvarko endogeninį transkripcijos aktyvatorių, kuris yra sujungtas su genu reporteriu, tokiu kaip HIS3. Pertvarkymas identifikuojamas ląstelių augimu aplink junginį.
Claims (48)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Modifikuota ląstelė šeimininkas, b esiskiri ant i tuo, kad ji apima:a) genų seką, koduojančią heterologinį susilietą baltymą; aukščiau minėtą susilietą baltymą, apimantį pirmą peptidą iš rišamųjų peptidu poros, arba segmentą iš anksčiau minėto pirmojo peptido, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišančiojo domeno, arba prie atitinkamo transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno;b) genų seką. koduojančią heterologinį susilietą baltymą, anksčiau minėtą susilietą baltymą, apimantį antrą peptidą iš rišamųjų peptidų poros iš (a), arba jo segmentą, prijungtą arba prie DNR rišamojo domeno, arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo domeno, kuris nepanaudotas (a);c) geną reporterį, efektyviai susietą su transkripcijos aktyvavimo baltymu, arba jo dalimi;d) jei reikia, deleciją arba mutaciją mielių ląstelės šeimininko chromosominėje DNR transkripcijos aktyvavimo baltymui, jei jis ląstelėje šeimininke yra;be to, minėtas modifikuotas šeimininkas yra gebantis ekspresuoti bent du heterologinius sulietus baltymus ir bent vieną geną reporterį.
- 2. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelė šeimininkas yra eukariotinė ląstelė.
- 3. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelė šeimininkas yra žinduolių arba amfibijų ląstelė.
- 4. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelė šeimininkas yra grybo ląstelė.
- 5. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad grybo ląstelė šeimininkas yra Aspergillus arba Neuropora ląstelė.
- 6. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad grybo ląstelė šeimininkas yra mielių ląstelė.
- 7. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad mielių ląstelė yra parinkta iš Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe arba Pichia pastolis ląstelės.
- 8. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad peptidai iš rišamųjų peptidų poros sąveikoja su kiekvienu kitu per tarpląstelini aktyvumą jų natūralioje aplinkoje.
- 9. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad peptidai iš rišamąjį} peptidų poros sąveikoja su kiekvienu kitu per ląstelės vidaus aktyvumą jų natūralioje aplinkoje.
- 10. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rišamųjų peptidų pora yra parinkta iš grupės, turinčios žinduolių peptidus.
- 11. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rišamųjų peptidų pora yra parinkta iš grupės, turinčios ne žinduolių peptidus.
- 12. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad rišamųjų peptidų pora yra parinkta iš grupės, turinčios ligandų ir atitinkamą receptorių.
- 13. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad vienas peptidas iš rišamųjų peptidų poros yra hormonas.*> LT 4230 B
- 14. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad vienas peptidas iš rišamųjų peptidų poros yra parinktas iš grupės, turinčios žinduolių peplidinių hormonų.
- 15. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas transkripcijos aktyvumo baltymas yra parinktas iš (a) Gal4, Gcn4, Hapl, Adrl, Swi5, Stel2, Mcml, Yapl, Acel, Pprl, Arg81, Lac9, QalF, VP16, LexA arba (b) žinduolių branduolio receptorių.
- 16. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 15 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas transkripcijos aktyvavimo baltymas yra mielių transkripcijos aktyvavimo baltymas.
- 17. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas mielių transkripcijos aktyvavimo baltymas yra GAL4 arba lae9.
- 18. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad genas reporteris yra pasirinktas iš grupių:a) lacZ, liuciferazės geno, žalio fluorescuojančio baltymo geno, chlorono fenikolo acetilo transferazės;b) genų, komplementuojančių auksotrofams;c) genų, lemiančių atsparumą antibiotikams; ird) genų, lemiančių jautrumą cheminiams preparatams.
- 19. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent vienas iš heterologinių sulietų baltymų ekspresuojamas transformuojant mielių ląstelę autonomiškai replikuojančia plazmidę, gebančia ekspresuoti sulietą baltymą.
- 20. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 19 punktą, besiskirianti tuo, kad heterologiniai sulieti baltymai ekspresuojami transformuojant mielių ląstelę autonomiškai replikuojančia plazmidę, gebančia ekspresuoti sulietą baltymą.
- 21. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 19 punktą, besiskirianti tuo, kad ben vienas peptidas iš rišamųjų peptidų poros yra parinktas iš vienos šių grupių:(a) grupės, turinčios citokinų, interleukinu, kraujodaros faktorių, insulino, insulinui panašių augime faktorių, augimo hormono, prolaktino, interferonų ir augimo faktorių;(b) ligandu G-baltymų surištiems receptoriams;(c) ligandu bestuburių receptoriams;(d) ligandu guanililo ciklazės receptoriams;(e) ligandu tirozino fosfatazės receptoriams.
- 22. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 21 punktą, besiskirianti tuo, kad peptidas yra augimo faktorius, atrinktas iš epiderminio AF, nervų AF, leukemijos inhibitoriaus faktoriaus, fibroblasto AF, iš trombocitų gauto AF, vaskuliarinio endotelinio AF, auglio nekrozinio faktoriaus, onkostatino M, ciliarinio neurotropinio faktoriaus, eritropoetino, steel faktoriaus, placentinio laktogeno ir transformuojančio AF.
- 23. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 21 punktą, besiskirianti tuo, kad bent vienas peptidas iš rišamųjų peptidų poros yra perdavėjas.
- 24. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 23 punktą, besiskirianti tuo, kad perdavėjas yra atrinktas iš perduodančių baltymų grupės gpl30, kh97, AIC2A ir AIC2B.
- 25. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad bent vienas peptidas iš rišamųjų peptidų poros yra receptorius, atrinktas iš vienos šių grupių:(a) ląstelės adhezijos molekulės;(b) imunomoduliatoriaus, antigeno atpažinimo ar prezentacijos molekulės.31 LT 4230 B
- 26. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 25 punktą, besiskirianti tuo, kad receptorius yra ląstelių adhezijos molekulė, atrinkta iš viduląstelinės adhezijos molekulės, vaskuliarinės ląstelių adhezijos molekulės, tarpląstelinės adhezijos molekulės, fibronektino, integrino, selektino ii' fibrinogeno.
- 27. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 25 punktą, besiskirianti tuo, kad receptorius yra imunomoduliatorius, antigeno atpažinimo ar prezentacijos molekulė, atrinkta iš T ląstelių receptorių komplekso, B ląstelių receptorių komplekso, Fc receptorių, pagrindinio audinių suderinamumo komplekso 1, pagrindinio audinių suderinamumo komplekso 2, CD4, CD8, CD27, CD30, MAC komplekso.
- 28. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 21 punktą, besiskirianti tuo, kad vienas peptidas iš rišamųjų peptidų poros yra ligandas G-baltymo surištam receptoriui.
- 29. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 28 punktą, besiskirianti tuo, kad ligandas G-baltymo surištam receptoriui yra atrinktas iš augimo hormoną atpalaiduojančio faktoriaus, sekretino, kraujo indų aktyvumą inhibuojančio peptido, gliukagono, interleukino-8, luteinizacijos hormono (LH), folikulą stimuliuojančio hormono (FSH) ir tyrotropino.
- 30. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 11 punktą, besiskirianti tuo, kad bestuburių peptidai yra atrinkti iš grupės, turinčios augalų systemino ir vabzdžių diferenciacijos peptidus.
- 31. Tiriamojo pavyzdžio poveikio rišamųjų peptidų poros rišimosi sąveikai aptikimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima: geno reporterio aktyvumo nustatymą pridėjus tyriamąjį pavyzdį į 1 punkto modifikuotą ląstelę šeimininką esant sąlygoms, tinkamoms aktyvumui stebėti arba sąlygoms, kuriose modifikuota ląstelė šeimininkas turi minėtą aktyvumą tiktai dalyvaujant pavyzdžiui, galinčiam susirišti su rišamųjų peptidų pora.
- 32. Būdas pagal 31 punktą, besiskiriantis tuo, kad geno reporterio aktyvumą nustato matuojant pasirinktą fenotipą, kuris priklauso nuo reporterio aktyvumo.
- 33. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad genas reporteris (c) yra efektyviai susietas su transkripcijos aktyvavimo mielių baltymu; kur minėtas genas reporteris selektyvioje terpėje trukdo stebimo fenotipo pasireiškimui dalyvaujant transkripcijos aktyvavimo mielių baltymui arba jo daliai; ir kai ląstelė šeimininkas be to apima: (e) jei reikia, deleciją arba mutaciją ląstelės šeimininko chromosominėje DNR, leidžiančią pasirodyti atrinktam fenotipui selektyvioje terpėje nedalyvaujant plazmidės (c) geno reporterio ekspresijai, jei reikalaujama, kad genas reporteris (c) būtų vienintelis išmatuoto aktyvumo šaltinis.
- 34. Tiriamojo pavyzdžio poveikio rišamųjų peptidų poros rišimuisi aptikimo būdas, b esiskiriantis tuo, kad minėtasis būdas apima: modifikuotos ląstelės šeimininko pagal 33 punktą matuojamo fenotipo pokyčio stebėjimą įdėjus tiriamąjį pavyzdį į minėtąją modifikuotą ląstelę šeimininką; minėtąją ląstelę, auginamą sąlygose, tinkamose aptikti pasirinktąjį fenotipą, esant tiriamajam pavyzdžiui; arba auginama sąlygose, kuriose minėtoji ląstelė rodo fenotipą tiktai esant tiriamajam pavyzdžiui, sąveikaujančiam su rišamųjų peptidų pora.
- 35. Nustatymo būdas ar tiriamasis pavyzdys sąveikauja su rišamųjįj peptidų poros peptidu; minėtasis būdas apima: (a) tiriamojo pavyzdžio įdėjimą į modifikuotą ląstelę šeimininką ir pasirinktojo fenotipo pasireiškimo esant tiriamajam pavyzdžiui ir nesant tiriamojo pavyzdžio; besiskiriantis tuo, kad minėtoji modifikuota ląstelė šeimininkas pritaikyta pasireikšti paitimui fenotipe tiktai esant tiriamajam pavyzdžiui, kuris rišasi su vienu peptidu iš rišamųjų peptidų poros.
- 36. Būdas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtasis būdas naudoja modifikuotą ląstelę šeimininką, kuris apima:33 LT 4230 Ba) genų seką, koduojančią heterologinį sulietą baltymą; minėtąjį sulietą baltymą, apimantį pirmąjį peptidą iš rišamųjų peptidų poros ar minėtojo pirmojo peptido segmentą, kuris sujuugtas ar su DNR rišamuoju domenu, ar su ji atitinkančiu transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domenu; kur genas, koduojantis minėtąjį pirmąjį peptidą, yra efektyvaus kopijų skaičiaus;b) genų seką, koduojančią heterologinį sulietą baltymą , minėtąjį sulietą baltymą, apimantį antrąjį peptidą iš rišamųjų peptidų poros iš papunkčio (a) ar minėtojo antrojo peptido segmentą, sulietą ar su DNR rišamuoju domenu, ar su jį atitinkančiu transkripcijos aktyvavimo domenu, bet kuriuo nenaudotu (a);c) geną reporterį, efektyviai asocijuotą su transkripcijos aktyvavimo mielių baltymu ar jo dalimi;d) deleciją ar mutaciją transkripcijos aktyvavimo baltymui mielių ląstelės šeimininko chromosominėje DNR.
- 37. Būdas pagal 36 punktą, besiskiriantis Itio, kad mažiausia vienas iš heterologinių sulietų baltymų yra ekspresuojamas transformuojant modifikuotą ląstelę šeimininką autonomiškai replikuojančia plazmide, gebančia ekspresuoti minėtąjį sulietą baltymą.
- 38. Būdas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad genas yra ekspresuojamas transformuojant modifikuotą ląstelę šeimininką plazmide, gebančia ekspresuoti minėtąjį geną reporterį.
- 39. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad genu seka (a) yra seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; minėtas sulietas baltymas, apimantis vieną iš dviejų receptoriaus molekulių peptidų arba minėto receptoriaus segmentą, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišančiojo domeno, arba prie atitinkamo transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno; ir genų seka (b) yra genų seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; aukščiau minėtas sulietas baltymas apima kitą receptorių peptidui arba segmentą iš 34 LT 4230 B minėto receptoriaus, prijungto arba prie DNR rišamojo domeno, arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo domeno, kuris nepanaudotas (a).
- 40. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 39 punktą, besiskirianti tuo, kad genas (a) koduoja heterologinį sulietą baltymą; minėtas sulietas baltymas apima perdavėją peptidui arba minėto perdavėjo segmentą, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišančiojo domeno, arba prie jo atitinkamo transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno.
- 41. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 40 punktą, besiskirianti tuo, kad baltymas nešėjas yra išrinktas iš gpl30, KH97, AIC2A ir AIC2B.
- 42. Tiriamojo pavyzdžio gebos funkcionuoti kaip ligandas receptoriui aptikimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima: modifikuotos ląstelės šeimininko pagal 40 punktą geno reporterio aktyvumo lygio nustatymą pridėjus tiriamąjį pavyzdį į minėtąją ląstelę sąlygose, tinkamose aptikti minėtąjį aktyvumą.
- 43. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad genu seka (a) yra seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; minėtas sulietas baltymas apima vieną peptidą iš daugybinio peptidą surišimo komplekso arba segmentą minėto peptido, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišamojo peptido domeno arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno; ir genų seka (b) yra genų seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; minėtas sulietas baltymas apima antrąjį peptidą iš daugybinio peptidų surišimo komplekso arba segmentą minėto receptoriaus, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišančiojo domeno, arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo domeno, kuris nepanaudotas (a).
- 44. Tiriamojo pavyzdžio gebos funkcionuoti kaip daugybinio peptidų surišimo komplekso peptidų komponentas aptikimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima: modifikuotos ląstelės šeimininko pagal 43 punktą geno reporterio aktyvumo 35 LT 4230 B lygio nustatymą pridėjus tiriamąjį pavyzdį į minėtąją ląstelę sąlygose, tinkamose aptikti minėtąjį aktyvumą.
- 45. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad genu seka (a) yra seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą: minėtas sulietas baltymas apima vieną peptidą iš daugybinio peptidų surišimo komplekso arba segmentą minėto peptido, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišamojo peptido domeno arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo baltymo transkripcijos aktyvavimo domeno; ir genų seka (b) yra genų seka, koduojanti heterologinį sulietą baltymą; minėtas sulietas baltymas apima antrąjį peptidą iš daugybinio peptidų surišimo komplekso arba segmentą minėto receptoriaus, kuris yra prisijungęs arba prie DNR rišančiojo domeno, arba jį atitinkančio transkripcijos aktyvavimo domeno, kuris nepanaudotas (a); kur minėta modifikuota ląstelė šeimininkas toliau apima (e) bent vieną genų seką, koduojančią peptidą; kur modifikuota ląstelė geba ekspresuoti minėtus peptidus.
- 46. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 45 punktą, besiskirianti tuo, kad bent vienas komponentas (a), (b) arba (e) yra genų seka, atitinkanti komplementarų DNR banką.
- 47. Modifikuota ląstelė šeimininkas pagal 46 punktą, besiskirianti tuo, kad (b) yra genų seka, atitinkanti komplementarų DNR banką.
- 48. Atsitiktinai parinkto baltymo gebos funkcionuoti kaip daugybinio peptidų surišimo komplekso komponentas nustatymo būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas būdas apima: modifikuotos ląstelės šeimininko pagal 47 punktą geno reporterio aktyvumo lygio nustatymą atsitiktinai parinkto iš DNR banko baltymo ekspresijos metu sąlygose, tinkamose minėtajam aktyvumui aptikti.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/259,609 US5989808A (en) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT97004A LT97004A (en) | 1997-07-25 |
| LT4230B true LT4230B (en) | 1997-10-27 |
Family
ID=22985626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT97-004A LT4230B (en) | 1994-06-14 | 1997-01-13 | Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5989808A (lt) |
| EP (1) | EP0765389B1 (lt) |
| AT (1) | ATE245189T1 (lt) |
| AU (1) | AU706173B2 (lt) |
| CA (1) | CA2195083A1 (lt) |
| DE (1) | DE69531302T2 (lt) |
| DK (1) | DK0765389T3 (lt) |
| ES (1) | ES2202366T3 (lt) |
| GE (1) | GEP20022619B (lt) |
| IL (1) | IL114118A0 (lt) |
| LT (1) | LT4230B (lt) |
| LV (1) | LV11906B (lt) |
| NZ (1) | NZ287372A (lt) |
| PT (1) | PT765389E (lt) |
| RU (1) | RU2208646C2 (lt) |
| SI (1) | SI9520073B (lt) |
| WO (1) | WO1995034646A1 (lt) |
| ZA (1) | ZA954892B (lt) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7226761B2 (en) * | 1992-11-05 | 2007-06-05 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
| US6972193B1 (en) * | 1993-02-12 | 2005-12-06 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Regulated transcription of targeted genes and other biological events |
| US6891021B2 (en) | 1993-02-12 | 2005-05-10 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Regulated apoptosis |
| US6770446B1 (en) * | 1994-06-14 | 2004-08-03 | Wyeth | Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs |
| US5610015A (en) * | 1995-03-23 | 1997-03-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System to detect protein-RNA interactions |
| NZ306767A (en) * | 1995-04-11 | 2000-03-27 | Univ Johns Hopkins | Method of identifying molecular interactions employing counterselection and at least two hybrid molecules or two hybrid systems |
| US6171800B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-01-09 | Biogen, Inc. | Method of making and binding CAIP polypeptides |
| US5837844A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-17 | Biogen, Inc. | CAIP-like gene family |
| US6423824B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-07-23 | Biogen, Inc. | CAIP-like gene family |
| DE29724617U1 (de) * | 1996-04-26 | 2002-06-13 | Massachusetts Inst Technology | Drei-Hybrid-Kit zur Molekülauswahl |
| EP0907750B1 (en) * | 1996-04-26 | 2002-09-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-hybrid screening assay |
| US6696251B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-02-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| WO1997049808A1 (en) * | 1996-06-27 | 1997-12-31 | Biogen, Inc. | The caip-like gene family |
| FR2761697B1 (fr) * | 1997-04-03 | 1999-05-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines |
| DE19715683C2 (de) * | 1997-04-15 | 1999-11-11 | Max Planck Gesellschaft | Neue Reportervektoren für One-Hybrid und Two-Hybrid Systeme |
| US6787319B2 (en) | 1997-04-16 | 2004-09-07 | American Home Products Corp. | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
| US7005295B1 (en) | 1997-04-16 | 2006-02-28 | Wyeth | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
| DK0977846T3 (da) | 1997-04-25 | 2002-10-14 | Wyeth Corp | Neuronale MORT1-isoformer |
| US6479653B1 (en) | 1997-08-26 | 2002-11-12 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Compositions and method for regulation of transcription |
| JP4296608B2 (ja) * | 1997-08-27 | 2009-07-15 | 田辺三菱製薬株式会社 | Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 |
| US6846627B2 (en) | 1997-10-15 | 2005-01-25 | Diversa Corporation | Screening for novel compounds which regulate biological interactions |
| EP1149920A1 (en) * | 1997-10-15 | 2001-10-31 | Diversa, Inc. | Screening for novel compounds which regulate biological interactions |
| US6261842B1 (en) | 1997-10-23 | 2001-07-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microorganism genomics, compositions and methods related thereto |
| JP2002502585A (ja) * | 1997-11-14 | 2002-01-29 | ロシュ ダイアグノスティックス コーポレイション | 抗原存在下においてエフェクター複合体を形成する可変領域融合ペプチド |
| AU735887B2 (en) | 1998-01-09 | 2001-07-19 | Phylogica Limited | Peptide detection method |
| EP0974649A1 (en) * | 1998-06-22 | 2000-01-26 | Universität Zürich | Screening system |
| US7166475B2 (en) | 1999-02-26 | 2007-01-23 | Cyclacel Ltd. | Compositions and methods for monitoring the modification state of a pair of polypeptides |
| GB9907687D0 (en) * | 1999-04-01 | 1999-05-26 | Kudos Pharm Ltd | Assays methods and means |
| AU4363900A (en) * | 1999-04-21 | 2000-11-02 | Wyeth | Methods for identifying modulators of n-type ion channel inactivation |
| WO2001081548A1 (en) * | 2000-04-24 | 2001-11-01 | Wyeth | Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs |
| AU2001288478B2 (en) | 2000-08-25 | 2006-11-02 | Basf Plant Science Gmbh | Plant polynucleotides encoding prenyl proteases |
| AU2002220275A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Mutated class ii major histocompatibility proteins |
| CA2899360A1 (en) | 2002-08-21 | 2004-04-08 | Revivicor, Inc. | Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| ES2347239T3 (es) | 2002-12-02 | 2010-10-27 | Amgen Fremont Inc. | Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos. |
| WO2005049804A2 (en) * | 2003-11-17 | 2005-06-02 | Georgia Tech Research Corporation | Engineering enzymes through genetic selection |
| EP1544307A1 (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-22 | AXXAM S.r.l. | LAC9 chimeric receptor and uses thereof |
| JP2008507294A (ja) | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 |
| AU2006292827B2 (en) | 2005-08-09 | 2013-02-14 | Revivicor, Inc. | Transgenic ungulates expressing CTLA4-IG and uses thereof |
| CN101365945A (zh) * | 2006-02-07 | 2009-02-11 | 惠氏公司 | 用于鉴别调节诺里蛋白、诺里蛋白模拟物的药剂的物质和方法以及由此鉴别出的药剂 |
| AU2008245696B2 (en) | 2007-04-27 | 2013-11-07 | Pelican Technology Holdings, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| CN101131363B (zh) * | 2007-09-30 | 2010-12-01 | 南京大学 | 一种基于酵母三杂交的小分子化合物检测方法 |
| US10603174B2 (en) | 2015-03-24 | 2020-03-31 | Osiris Therapeutics, Inc. | Compositions comprising meniscal tissues and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5283173A (en) * | 1990-01-24 | 1994-02-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | System to detect protein-protein interactions |
| US5322801A (en) * | 1990-04-19 | 1994-06-21 | The General Hospital Corporation | Protein partner screening assays and uses thereof |
| EP0672131B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-12-17 | The General Hospital Corporation | A novel cell cycle control protein |
| US5512473A (en) * | 1993-01-29 | 1996-04-30 | Brent; Roger | Max-interacting proteins and related molecules and methods |
| US5582995A (en) * | 1993-06-11 | 1996-12-10 | The General Hospital Corporation | Methods of screening for compounds which inhibit the direct binding of Ras to Raf |
| WO1995018380A1 (en) * | 1993-12-30 | 1995-07-06 | The Salk Institute For Biological Studies | Novel uses for gal4-receptor constructs |
| ES2146749T3 (es) * | 1994-01-21 | 2000-08-16 | Icos Corp | Materiales y metodos en relacion con proteinas que interaccionan con la caseina quinasa i. |
| US5525490A (en) * | 1994-03-29 | 1996-06-11 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Reverse two-hybrid method |
| US5691147A (en) * | 1994-06-02 | 1997-11-25 | Mitotix, Inc. | CDK4 binding assay |
-
1994
- 1994-06-14 US US08/259,609 patent/US5989808A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-31 NZ NZ287372A patent/NZ287372A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 DK DK95920689T patent/DK0765389T3/da active
- 1995-05-31 SI SI9520073A patent/SI9520073B/sl not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 PT PT95920689T patent/PT765389E/pt unknown
- 1995-05-31 AU AU26066/95A patent/AU706173B2/en not_active Ceased
- 1995-05-31 CA CA002195083A patent/CA2195083A1/en not_active Abandoned
- 1995-05-31 DE DE69531302T patent/DE69531302T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 RU RU97100776/13A patent/RU2208646C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 GE GEAP19953531A patent/GEP20022619B/en unknown
- 1995-05-31 WO PCT/US1995/006895 patent/WO1995034646A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-31 AT AT95920689T patent/ATE245189T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 ES ES95920689T patent/ES2202366T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 EP EP95920689A patent/EP0765389B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-12 IL IL11411895A patent/IL114118A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-06-13 ZA ZA954892A patent/ZA954892B/xx unknown
-
1997
- 1997-01-13 LT LT97-004A patent/LT4230B/lt not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 LV LVP-97-04A patent/LV11906B/en unknown
-
1999
- 1999-03-08 US US09/263,944 patent/US6251602B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-06 US US09/305,483 patent/US6284519B1/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CUNNINGHAM, B. C. ET AL.: "Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule", SCIENCE, 1991, pages 821 - 825, XP000261650, DOI: doi:10.1126/science.1948064 |
| LI JJ, HERSKOWITZ I.: "Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system", SCIENCE., 1993 |
| S DAVIS ET AL.: "LIFR beta and gp130 as heterodimerizing signal transducers of the tripartite CNTF receptor", SCIENCE, 1993, pages 1805 - 1808 |
| STATEN NR ET AL.: "Ligandspecific dimerization of the extracellular domain of the bovine growth hormone receptor.", J. BIOL. CHEM., 1993, pages 18 - 467 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LV11906B (en) | 1998-06-20 |
| AU2606695A (en) | 1996-01-05 |
| AU706173B2 (en) | 1999-06-10 |
| PT765389E (pt) | 2003-11-28 |
| NZ287372A (en) | 1997-11-24 |
| US6251602B1 (en) | 2001-06-26 |
| US6284519B1 (en) | 2001-09-04 |
| SI9520073B (sl) | 2004-06-30 |
| EP0765389A1 (en) | 1997-04-02 |
| DE69531302T2 (de) | 2004-04-22 |
| ES2202366T3 (es) | 2004-04-01 |
| IL114118A0 (en) | 1995-10-31 |
| SI9520073A (sl) | 1998-02-28 |
| DE69531302D1 (de) | 2003-08-21 |
| WO1995034646A1 (en) | 1995-12-21 |
| LV11906A (lv) | 1997-12-20 |
| ATE245189T1 (de) | 2003-08-15 |
| LT97004A (en) | 1997-07-25 |
| RU2208646C2 (ru) | 2003-07-20 |
| DK0765389T3 (da) | 2003-10-27 |
| US5989808A (en) | 1999-11-23 |
| EP0765389B1 (en) | 2003-07-16 |
| GEP20022619B (en) | 2002-01-25 |
| ZA954892B (en) | 1996-01-30 |
| CA2195083A1 (en) | 1995-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LT4230B (en) | Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs | |
| Young | Yeast two-hybrid: so many interactions,(in) so little time… | |
| EP0371820B1 (en) | Novel receptors: their identification, characterization, preparation and use | |
| Starr et al. | Intracellular receptors use a common mechanism to interpret signaling information at response elements. | |
| Miesfeld | The Structure and Function of Steroid Receptor Protein | |
| US7122305B2 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| WO1997008550A1 (en) | Retinoid x receptors and components of the basal transcription machinery | |
| US20030166143A1 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| Ozenberger et al. | Functional interaction of ligands and receptors of the hematopoietic superfamily in yeast. | |
| Ponticelli et al. | The glutamine-rich activation domains of human Sp1 do not stimulate transcription in Saccharomyces cerevisiae | |
| EP0752477A2 (en) | Expression vectors that produce steroid receptors, steroid receptor chimera, screening assays for steroid receptors and clinical assays using synthesized receptors and receptor vectors | |
| US6673540B1 (en) | Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs | |
| EP1283870A1 (en) | Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs | |
| Yamaguchi et al. | Functional analysis of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator interactions with aryl hydrocarbon receptor in the yeast two-hybrid system | |
| US7037656B2 (en) | Methods and compositions for identifying ligands for nuclear receptors | |
| US20030009022A1 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| AU2003260308B2 (en) | Method for identifying substances | |
| Ozenberger et al. | Investigation of Ligand/Receptor Interactions and the Formation of Tertiary Complexes | |
| WO2003070975A2 (en) | An estrogen receptor alpha construct for use in a yeast 2-hybrid assay | |
| PAUSCH et al. | HETEROLOGOUS G PROTEIN-COUPLED RECEPTORS EXPRESSED IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE: METHODS FOR GENETIC ANALYSIS AND | |
| EP1261871A1 (en) | Methods and compositions for identifying ligands for nuclear receptors | |
| Starr et al. | Intracellular receptors use a common mechanism to interpret |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD9A | Change of patent owner |
Owner name: WYETH HOLDINGS CORPORATION, US Effective date: 20031031 |
|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20110531 |