ES2202366T3 - Sistemas celulares que presentan interaccion especifica de pares de union de peptidos. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE RELACIONA CON NUEVAS CELULAS HUESPED MODIFICADAS, QUE EXPRESAN PROTEINAS HETEROLOGAS FUSIONADAS, Y CON METODOS DE ENSAYO DE MUESTRAS QUE POSEEN UNA ACTIVIDAD LIGANTE DE PEPTIDOS; DONDE LA CELULA HUESPED MODIFICADA COMPRENDE: (A) UNA SECUENCIA GENETICA QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA DE FUSION HETEROLOGA, COMPRENDIENDO DICHA PROTEINA UN PRIMER PEPTIDO DE UN PAR DE UNION DE PEPTIDOS, O UN SEGMENTO DE DICHO PRIMER PEPTIDO, QUE ESTA UNIDO, BIEN A UN DOMINIO DE UNION DEL ADN, BIEN A SU CORRESPONDIENTE DOMINIO DE ACTIVACION TRANSCRIPCIONAL DE UNA PROTEINA DE ACTIVACION TRANSCRIPCIONAL; (B) UNA SECUENCA GENETICA QUE CODIFICA PARA PARA UNA PROTEINA DE FUSION HETEROLOGA, COMPRENDIENDO DICHA PROTEINA UN SEGUNDO PEPTIDO DEL PAR DE UNION DE PEPTIDOS CITADO EN (A), O UN SEGMENTO DEL MISMO, UNIDO BIEN A UN DOMINIO DE UNION DEL ADN, BIEN A SU CORRESPONDIENTE DOMINIO DE ACTIVACION TRANSCRIPCIONAL, NO HABIENDO SIDO EMPLEADOS EL UNO O EL OTRO EN (A); UN GEN MARCADOR ASOCIADO OPERATIVAMENTE CON LA PROTEINA DE ACTIVACION TRANSCRIPCIONAL, O UNA PORCION DEL MISMO; (D) OPCIONALMENTE, UNA DELECION O MUTACION EN EL ADN CROMOSOMICO DE LA CELULA HUESPED, PARA LA PROTEINA DE ACTIVACION TRANSCRIPCIONAL, SI ESTA PRESENTE EN LA CELULA HUESPED SELECCIONADA.

Description

Sistemas celulares que presentan interacción específica de pares de unión de péptidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a células que expresan proteínas de fusión heterólogas y a métodos de cribado de compuestos que presentan actividad de unión a péptidos; en el que los métodos emplean las nuevas células de la presente invención.

Antecedentes de la invención

La unión específica de un par de péptidos entre sí desencadena un enorme número de funciones en una célula viva. Por ejemplo, la unión específica de un ligando a un receptor de superficie sirve de desencadenante de respuestas celulares a muchas señales externas. En los mamíferos, las células responden a una gran variedad de hormonas peptídicas circulantes, a menudo a través de receptores con un dominio único transmembranal. Está perfectamente aceptado que la superfamilia del receptor de citocinas ilustra los diversos aspectos de la función celular, así como de las respuestas fisiológicas. Revisiones recientes de la función del receptor de citocinas han puesto de manifiesto diferentes estequiometrías proteicas ligando-receptor, que incluyen tanto interacciones entre 2 proteínas (ligando/receptor) (Cunningham et al., 1991; Staten et al., 1993) como entre 3 proteínas (ligando/receptor/receptor o ligando/receptor/transductor) (Young, 1992; Taga y Kishimoto, 1992; Mui y Miyajima, 1994). Los detalles de dichas asociaciones entre proteínas se han investigado utilizando métodos in vitro, que son, a menudo, laboriosos, (Fuh et al., 1992; 1993; Davis et al., 1993) dado que no se ha dispuesto de sistemas de expresión genética maleables. La presente invención se refiere a nuevos sistemas hospedadores modificados, que pueden utilizarse para estudiar dichas interacciones entre proteínas, siendo dichos nuevos sistemas significativamente menos laboriosos.

Los sistemas recientemente publicados en la materia se refieren a un sistema "de 2 híbridos" descrito por Fields y Song, 1989 y también por Chein et al., 1991. El sistema "de 2 híbridos" implica interacciones diferenciales entre los dominios, separables, de unión a ADN y de activación del activador transcripcional de levadura, Gal4. Se expresan proteínas heterólogas en forma de proteínas híbridas fusionadas con cualquiera de las mitades de Gal4 (véase la Figura 1; Fields y Song, 1989; Chein et al., 1991 para un análisis del sistema de 2 híbridos). La interacción productiva de las proteínas heterólogas sitúa en proximidad inmediata las dos mitades de la proteína Gal4, activando la expresión de un gen indicador medible. Hasta la fecha, se ha descrito la utilidad de dichos sistemas de 2 híbridos para determinar si la secuencia de un primer péptido de prueba dado presenta actividad de unión a la secuencia conocida del segundo péptido; en el que se desconoce la afinidad del péptido de prueba por el péptido conocido. Los estudios que han hecho uso de dicho sistema se han dirigido a analizar proteínas intracelulares, tales como factores de transcripción, e interacciones entre las quinasas y sus proteínas diana (Yang et al., 1992; Durfee et al., 1993; Li et al., 1994).

Las células modificadas de la presente invención y los nuevos métodos que incorporan dichas células suponen un avance significativo en el estudio y descubrimiento de análogos de péptidos, incluidos análogos de ligandos y análogos de receptores. Hasta el momento, nadie ha desarrollado un sistema de cribado eficaz y específico para investigar estos temas. Mediante el empleo en la célula de un par de péptidos que se unen, de los que se desconoce la afinidad de unión, la presente invención permite la investigación de pares de péptidos que se unen, tales como un ligando y un receptor, en el que los péptidos se unen por interacciones extracelulares. La presente invención crea ventajas exponenciales para el descubrimiento compuestos que pueden interaccionar como ligandos para receptores o transductores específicos. Los posibles ligandos incluyen, sin limitarse a los mismos, hormonas de mamíferos, siendo sus receptores los correspondientes péptidos extracelulares que se unen a ligandos. Es más, la presente invención describe la utilización de sistemas celulares que expresan múltiples proteínas heterólogas, incluidas las dos proteínas de fusión heterólogas para determinar la unión específica y reversible entre el ligando y el receptor. La interacción específica de la unión descrita anteriormente se detecta fácilmente por un cambio medible en el fenotipo celular, por ejemplo, la proliferación en medio selectivo.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a células hospedadoras modificadas para la expresión de proteínas de fusión heterólogas. Las nuevas células hospedadoras modificadas comprenden:

a) una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga; comprendiendo dicha proteína de fusión un primer péptido de un par de péptidos que se unen, o un segmento de dicho primer péptido, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional;

b) una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un segundo péptido del par de péptidos que se unen en (a), o un segmento de dicho segundo péptido, fusionado bien con un dominio de unión a ADN o con su correspondiente dominio de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en (a);

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c) un gen indicador asociado funcionalmente con la proteína de activación transcripcional, o con una porción de la misma.

d) opcionalmente, una deleción o mutación en el ADN cromosómico de la célula hospedadora de levadura para la proteína de activación transcripcional, si está presente en la célula hospedadora, siendo dicha célula hospedadora capaz de expresar por lo menos dos proteínas de fusión heterólogas y por lo menos un gen indicador, y en la que los péptidos del par de péptidos que se unen interaccionan entre sí por medio de actividad extracelular en su ambiente natural.

Estas células hospedadoras modificadas de la presente invención pueden utilizarse para determinar la interacción de una muestra de prueba con un péptido seleccionado de un par de péptidos que se unen; por ejemplo, la célula puede utilizarse para determinar la interacción de una muestra de prueba con un ligando o receptor seleccionados.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a nuevas células modificadas y a métodos de cribado que indican la interacción de una muestra de prueba con un péptido y receptor seleccionados, mediante un cambio reconocible en el fenotipo. La célula manifiesta el cambio en el fenotipo solamente en presencia de un compuesto de prueba que tiene afinidad de unión por un péptido del par de péptidos que se unen, por ejemplo, afinidad de unión por un ligando o por su receptor.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a nuevas células y métodos de cribado que permiten determinar a qué péptido, de un par de péptidos que se unen, se une una muestra de prueba.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a nuevas células que expresan tres o más componentes heterólogos para el estudio de asociaciones multiproteicas entre tres o más péptidos (por ejemplo, tales como el estudio de la dimerización dependiente del ligando).

Términos definidos

El término par de péptidos que se unen se refiere a cualquier par de péptidos que tienen una afinidad de unión conocida, y cuya secuencia de ADN es conocida o puede deducirse. Los péptidos del par de péptidos que se unen deben manifestar unión preferente entre sí, en vez de por cualesquiera otros componentes de la célula modificada.

El término péptido, tal como se utiliza en el sumario anterior y en la presente memoria, significa cualquier péptido, polipéptido o proteína, a no ser que se indique otra cosa. Como se ha señalado anteriormente, los péptidos de un par de péptidos que se unen pueden ser un ligando y su correspondiente receptor, o un ligando y cualquier péptido que tenga una afinidad de unión conocida por el ligando.

Heterólogo, tal como se utiliza en el sumario anterior y en la presente memoria, significa péptidos que (1) no se expresan por la célula hospedadora presente en la naturaleza o (2) se expresan por la célula hospedadora modificada por un método de expresión distinto del método expresión por el que la célula hospedadora expresaría normalmente el péptido.

A no ser que se indique otra cosa, el término receptor, tal como se utiliza en la presente memoria, engloba los términos receptor_{r}, receptor soluble, transductor y proteína que se une. En realizaciones preferidas de la invención, el receptor empleado es un receptor o receptor soluble, siendo el receptor el más preferido.

Receptor_{r}, tal como se utiliza en la presente memoria, significa proteínas de la membrana plasmática que se unen a moléculas específicas, tales como factores de crecimiento, hormonas o neurotransmisores, y a continuación transmiten una señal al interior de la célula que provoca una respuesta específica de la célula. Esta definición incluye proteínas transmembranales unitarias.

Receptor soluble significa un forma no transmembranal de un receptor, que es capaz de unirse al ligando. Se trata de receptores liberados de una célula, bien por proteólisis o por corte y empalme alternativo del ARNm.

Proteína que se une significa proteínas que demuestran afinidad de unión por un ligando específico. Las proteínas que se unen pueden producirse a partir de genes independientes y distintos. Para un ligando dado, las proteínas que se unen se producen a partir de genes específicos que son distintos del dominio de unión al ligando del receptor o de su receptor soluble.

Transductor significa una molécula que permite la conversión de un tipo de señal en otra, y la molécula es fácilmente reconocida como un transductor por uno o más de los péptidos de un par de péptidos que se unen, por ejemplo, un transductor para un grupo ligando/receptor.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático de una célula que expresa, a partir de plásmidos independientes, dos proteínas de fusión heterólogas (siendo una el ligando fusionado con el dominio de activación de una proteína de activación transcripcional y siendo la otra proteína de fusión un receptor fusionado con el dominio de unión a ADN de la proteína de activación transcripcional). La Figura muestra la expresión de las dos proteínas de fusión y la unión del ligando y del receptor, que junta el dominio de unión y el dominio de activación, reconstituyendo la proteína de activación transcripcional. Una vez que la proteína de activación transcripcional se reconstituye y se ancla por medio del dominio de unión a ADN al sitio que contiene las Secuencias de Activación Corriente Arriba (UAS), se inicia la transcripción del gen indicador (HIS3).

La Figura 2, contiene fotografías de placas que muestran los resultados de los experimentos de proliferación realizados en el ejemplo 1 con las cepas CY722, CY723, CY724 y CY781 en medio no selectivo y medio selectivo, fotografías A y B, respectivamente.

La Figura 3, es un diagrama esquemático de un modelo de dímero, en el que el ligando se une a un sistema de receptor doble. El diagrama esquemático muestra una célula que expresa proteínas a partir de tres plásmidos independientes. Dos proteínas de fusión heterólogas (siendo una proteína de fusión un primer receptor fusionado con el dominio de activación de una proteína de activación transcripcional y siendo la otra proteína de fusión un segundo receptor fusionado con el dominio de unión a ADN de la proteína de activación transcripcional) se expresan y el ligando libre (es decir, el ligando que no está fusionado con ninguno de los dos dominios de la proteína de activación transcripcional) se expresa a partir de un tercer plásmido. La figura muestra la expresión de las dos proteínas de fusión y la unión del ligando libre y las dos fusiones de receptores que junta el dominio de unión y el dominio de activación, reconstituyendo la proteína de activación transcripcional. Una vez que la proteína de activación transcripcional se reconstituye y se ancla por medio del dominio de unión a ADN al sitio que contiene las Secuencias de Activación Corriente Arriba (UAS), se inicia la transcripción del gen indicador (HIS3).

La Figura 4, es una fotografía de una placa de cultivo obtenida con las cepas CY846 y CY847 del Ejemplo 3, que muestra la estimulación, dependiente del ligando, de la dimerización del receptor.

Descripción detallada de la invención

La célula de la presente invención emplea una célula hospedadora. Una célula hospedadora eficaz para su utilización en la presente invención requiere simplemente que esté definida genéticamente, con el objeto de dirigir la expresión apropiada de proteínas de fusión heterólogas, indicador(es) y cualquier otra manipulación genética deseada. La célula hospedadora puede ser cualquier célula eucariótica, de vertebrado o que no sea de vertebrado. La célula hospedadora puede ser una célula de mamífero. En realizaciones más preferidas la célula hospedadora es una célula de levadura. En realizaciones preferidas alternativas la célula hospedadora de levadura es Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe o Pichia pastoris.

La célula hospedadora emplea por lo menos dos genes para la expresión independiente de dos proteínas de fusión heterólogas. Una de estas proteínas de fusión comprende un primer péptido de un par de péptidos que se unen, o un segmento de dicho primer péptido, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN, o a su correspondiente dominio de activación transcripcional, de una proteína de activación transcripcional. Una segunda proteína de fusión que comprende el segundo péptido del par de péptidos que se unen, o un segmento del mismo. El segundo péptido está fusionado bien con un dominio de unión a ADN o bien con su correspondiente dominio de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en la primera proteína heteróloga de fusión. La actividad de unión entre los péptidos de los pares de péptidos que se unen se verifica utilizando un gen indicador, que está asociado funcionalmente con la proteína de activación transcripcional empleada en las dos proteínas de fusión.

La proteína de activación transcripcional puede variar ampliamente, siempre y cuando los dominios de unión a ADN y los dominios de activación sean conocidos o puedan deducirse con los métodos científicos disponibles. La proteína de activación transcripcional puede ser cualquier proteína que tenga dos componentes, un componente de unión a ADN y un componente de activación, en el que la proteína de activación transcripcional contiene una hélice alfa ácida, para la activación de la transcripción. Preferiblemente, la proteína de activación transcripcional se selecciona a partir de Gal4, Gcn4, Hap1, Adr1, Swi5, Ste12, Mcm1, Yap1, Ace1, Ppr1, Arg81, Lac9, Qa1F, VP16, LexA, receptores nucleares que no son de mamífero (por ejemplo, el de ecdisona) o receptores nucleares de mamífero (por ejemplo, los de estrógeno, andrógenos, glucocorticoides, mineralocorticoides, ácido retinoico y progesterona; véase también Picard et al., 1990). Preferiblemente, la proteína de activación transcripcional es una proteína de levadura, y más preferiblemente, la proteína de activación transcripcional de levadura se selecciona a partir de Gal4, Gcn4, lac9 o Adr1. Hay que señalar que puede utilizarse cualquier proteína que se una al ADN y que funcione con un dominio de activación. El dominio de unión a ADN de una proteína de activación transcripcional puede sustituirse por una proteína que se une al ADN, si las secuencias de reconocimiento asociadas funcionalmente al gen indicador se construyen adecuadamente. Ejemplos de proteínas que no son de levadura, que se unen al ADN, son los receptores de esteroides de mamíferos y la LexA bacteriana (véase Wilson et al., 1990)

El gen indicador se selecciona generalmente de modo que pueda verificarse la unión de los dominios de la proteína de activación transcripcional mediante técnicas conocidas y sencillas. Preferiblemente, el gen indicador se selecciona atendiendo a su coste, facilidad de medición de su actividad y baja actividad de fondo (es decir, la actividad puede determinarse a niveles de expresión del gen indicador relativamente bajos debido a una alta relación señal/fondo y/o una actividad, en ausencia de inducción, relativamente baja o inexistente). El indicador puede ser cualquier indicador cuya actividad pueda detectarse por cualquier medio disponible. Ejemplos de indicadores que pueden utilizarse en la presente invención son genes indicadores seleccionados a partir del grupo de:

a) lacZ, gen de la luciferasa, gen de la proteína fluorescente verde, CAT.

b) genes que complementan auxótrofos, tales como HIS, URA, LEU, ARG, MET, ADE, LYS, TRP.

c) gen que confiere resistencia a antibióticos, tal como neo^{r}, KAN.

d) genes que confieren sensibilidad a un producto químico, tales como CYH2, CAN1 (resistencia a la canavanina). En muchas realizaciones puede ser conveniente que el gen indicador impida la proliferación (CYH2). Preferiblemente, la actividad del gen indicador se indica por métodos colorimétricos o fluorescentes y/o midiendo la proliferación de las células de levadura.

Como se ha señalado anteriormente, el péptido empleado en la célula modificada es un péptido de un par de péptidos que se unen, cuya secuencia de ADN es conocida, así como la secuencia del segundo péptido del par de péptidos que se unen. Los péptidos pueden ser también péptidos de un complejo de péptidos que se unen, que contiene dos o más péptidos que se unen entre sí para formar el complejo de unión. Los péptidos del par de péptidos que se unen pueden ser un ligando específico y un receptor correspondiente, o cualesquiera otros péptidos que se unen entre sí preferentemente, tales como subunidades de una enzima.

Una de las ventajas significativas de la presente invención es el descubrimiento de que la célula que emplea los dominios de unión a ADN y de activación de una proteína transcripcional puede utilizarse para verificar la unión de péptidos de un par de péptidos que se unen mediante interacción extracelular. Ciertamente, si se desea, pueden también utilizarse péptidos que se unen mediante interacción intracelular en cualquiera de las nuevas células modificadas y métodos de la presente invención. El péptido puede provenir de una célula de mamífero o de una célula que no sea de mamífero. Una de las realizaciones más importantes de la presente invención se refiere a la aplicación de nuevas células modificadas y de los correspondientes métodos de cribado de la presente invención para el estudio de numerosas interacciones entre péptidos de mamíferos. Los péptidos de mamíferos incluyen interacciones ligando/receptor de mamíferos, tales como interacciones hormona/receptor. Ejemplos de hormonas peptídicas que pueden utilizarse en la presente invención son péptidos seleccionados, pero sin limitarse a los mismos, a partir de uno de los siguientes grupos: (a) el grupo formado por citocinas, interleucinas, factores de crecimiento hematopoyéticos, insulina, factores de crecimiento similares a la insulina, hormona de crecimiento, prolactina, interferones y factores de crecimiento; (b) ligandos para receptores acoplados a proteínas G; (c) ligandos para receptores que no son de vertebrados; (d) ligandos para receptores con actividad guanilil-ciclasa; (e) ligandos para receptores con actividad tirosina-fosfatasa.

En realizaciones alternativas, el péptido es un factor de crecimiento seleccionado a partir de factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento del endotelio vascular, factor de necrosis tumoral, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, eritropoyetina, factor de Steel, lactógeno placentario y factor de crecimiento transformante \beta.

En varias realizaciones preferidas, la hormona peptídica es un ligando para un receptor acoplado a proteínas G, tal como el factor liberador de la hormona de crecimiento, secretina, péptido inhibidor vasoactivo, glucagón, tirotropina, interleucina-8, hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante de los folículos (FSH).

En realizaciones alternativas adicionales, el péptido empleado es un péptido que no es de vertebrados, tal como los seleccionados a partir del grupo formado por sistemina vegetal y péptidos de diferenciación de insectos. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el péptido se selecciona a partir del grupo formado por péptidos de mamífero, y más preferiblemente, hormonas peptídicas de mamífero.

Hay que destacar asimismo que tipos específicos de receptores también pueden ser un péptido de un par de péptidos que se unen o complejo de péptidos que se unen. Ejemplos de varios receptores son los seleccionados a partir de uno de los siguientes grupos: (a) una molécula de adhesión celular; (b) una molécula inmunomoduladora, de reconocimiento o presentación del antígeno, u otros péptidos relacionados. Ejemplos de moléculas de adhesión celular son ICAM, VCAM, ECAM, fibronectina, integrina, selectina y fibrinógeno. Ejemplos de una molécula inmunomoduladora, de reconocimiento o presentación del antígeno, son el complejo receptor de los linfocitos T, complejo receptor de los linfocitos B, receptores de Fc, complejo principal de histocompatibilidad de clase I, complejo principal de histocompatibilidad de clase II, CD4, CD8, CD27, CD30, complejo MAC.

Hay que señalar asimismo que pueden utilizarse tipos específicos de transductores como un péptido de un par de péptidos que se unen o de un complejo de péptidos que se unen. Las proteínas transductoras empleadas pueden ser cualquier proteína transductora que se una por lo menos a uno de los péptidos del par de péptidos que se unen o del complejo de péptidos que se unen. Las proteínas transductoras incluyen gp130, kh97, AIC2A, AIC2B.

Por lo menos una de las proteínas de fusión heterólogas puede expresarse por transformación de una célula de levadura con un plásmido de replicación autónoma capaz de expresar la proteína de fusión; o, preferiblemente, las proteínas de fusión heterólogas se expresan por transformación de una célula de levadura con un plásmido de replicación autónoma capaz de expresar la proteína de fusión, aunque pueden expresarse por modificación cromosómica.

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Como se ha señalado, los métodos de cribado de la presente invención están diseñados para detectar la capacidad de una muestra de prueba de afectar a la unión de un par de péptidos que se unen, por ejemplo, la interacción ligando-receptor. Básicamente, el método comprende determinar la actividad del gen indicador al añadir una muestra de prueba a una célula hospedadora modificada de la presente invención, en condiciones adecuadas para detectar la actividad en presencia de una muestra, o en una condición en la que la célula hospedadora modificada manifiesta dicha actividad solamente en presencia de una muestra que presenta interacción de unión con el par de péptidos que se unen. Preferiblemente, la actividad del gen indicador se determina midiendo un cambio en el fenotipo seleccionado, que correlaciona directamente con la actividad del indicador.

Las nuevas células modificadas de la presente invención se aplican fácilmente a varios métodos de cribado para determinar la capacidad de unión de una muestra de prueba. La muestra de prueba puede ser un péptido, que tiene preferiblemente una longitud de aproximadamente dos aminoácidos, o un compuesto químico no peptídico. La muestra de prueba no peptídica incluye compuestos, complejos y sales, así como muestras de productos naturales, tales como extractos vegetales y materiales obtenidos a partir de caldos de fermentación. La células hospedadoras modificadas se cultivan en condiciones adecuadas para la proliferación, con el objeto de estudiar el efecto de una muestra de prueba en la interacción de unión del par de péptidos que se unen. La células hospedadoras modificadas se colocan en un medio de cultivo, que preferiblemente contiene agar, aplicándose la muestra de prueba en la superficie del medio de cultivo. El medio de cultivo es preferiblemente un medio líquido convencional compuesto de reactivos de cultivo y agua, tal como medio sintético de levaduras (YSM comercializado por BIO101 (véase también Rose et al., Methods in Yeast Genetics, 1990).

Una de las realizaciones de la presente invención se refiere a una célula hospedadora y a un método de cribado que indica la interacción de un compuesto de prueba con un par seleccionado de péptidos que se unen, por un cambio reconocible en el fenotipo. Esta célula hospedadora modificada manifiesta el cambio en el fenotipo solamente en presencia del compuesto de prueba que tiene afinidad de unión por uno de los péptidos del par de péptidos que se unen. Esta célula hospedadora se designa en la presente memoria sistema de "rescate". Normalmente, se manifiesta una respuesta celular cuando interaccionan los dos dominios de la proteína de activación transcripcional. Sin embargo, en un sistema de rescate una indicación positiva del cambio en el fenotipo no tiene lugar cuando interaccionan los dos dominios de la proteína de activación transcripcional. Una indicación positiva del cambio en el fenotipo tienen lugar sólo cuando una muestra de prueba interrumpe la interacción de los dos dominios de la proteína de activación transcripcional. En un sistema de rescate, una célula hospedadora modificada es capaz de expresar por lo menos dos proteínas de fusión heterólogas. Además, la célula hospedadora comprende: un gen indicador asociado funcionalmente con la proteína de activación transcripcional; en el que dicho gen indicador impide la manifestación de un fenotipo específico en un medio selectivo, debido a la expresión de la proteína de activación transcripcional, o de una porción de la misma. Una mutación en el ADN cromosómico de la célula hospedadora permite la inversión del fenotipo detectable, en el medio selectivo, en ausencia de la expresión del gen indicador. Si es necesario, hay una deleción o mutación en el ADN cromosómico de la célula hospedadora para una proteína de activación transcripcional, con el objeto de que la activación transcripcional suceda sólo cuando tenga lugar la interacción productiva del par seleccionado de moléculas que se unen. Sólo cuando una muestra de prueba interrumpe la interacción de los dos dominios de la proteína de activación transcripcional, proliferará o sobrevivirá la célula modificada, o manifestará otro fenotipo seleccionado. Preferiblemente, el fenotipo corresponde a la proliferación celular.

Una vez que se utiliza un método de cribado, como se ha descrito anteriormente, para determinar si una muestra de prueba interacciona con, o, en vez de ello, altera, la unión al péptido observada en ausencia de una muestra de prueba, se emplea un cribado secundario para determinar la afinidad específica de unión de la muestra de prueba, es decir, a qué péptido, del par de péptidos que se unen, se une la muestra de prueba. El cribado secundario emplea las nuevas células de la presente invención, estando las células adaptadas para manifestar un fenotipo, o cambio fenotípico, solamente en presencia de una muestra de prueba que se une a un péptido del par de péptidos que se unen. Uno de los métodos preferidos para determinar las características específicas de unión de la muestra de prueba implica el empleo de células que contienen un número de copias eficaz (relativamente alto) de cualquiera de las proteínas de fusión que contienen uno de los péptidos. Un número de copias eficaz es cualquier número de copias suficiente para permitir la determinación de la unión específica de la muestra de prueba. Preferiblemente, el número de copias del gen es por lo menos aproximadamente 5, y preferiblemente, oscila de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, siendo el más preferido el número de copias superior. La otra proteína de fusión se mantiene a un nivel relativamente bajo (1 a aproximadamente 2 copias por célula), bien mediante su integración en un cromosoma celular o bien utilizando secuencias cromosómicas centroméricas en el plásmido de expresión. Si se utiliza un alto número de copias de un primer péptido en una célula de la presente invención, la célula será más sensible a la presencia de la muestra de prueba que se une al segundo péptido del par de péptidos que se unen, ya que la cantidad limitante del segundo péptido determina el nivel de la actividad del gen indicador (es decir, el cambio observado en el fenotipo). Y viceversa, si se utiliza un alto número de copias de un gen que codifica el segundo péptido de un par de péptidos que se unen, la célula será más sensible a la presencia de una muestra de prueba que se une al primer péptido, ya que la cantidad limitante del segundo péptido determina el nivel de la actividad del gen indicador (es decir, el cambio observado en el fenotipo). Una comparación directa de los efectos de un compuesto de prueba en los fenotipos de las dos cepas (receptor

\may{3}

ligando frente a ligando

\may{3}

receptor) demuestra la interacción proteica específica del compuesto. Como se ha examinado anteriormente, los genes que expresan los péptidos, así como el gen indicador, se expresan preferiblemente por transformación de la célula de levadura con un plásmido de replicación autónoma.

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Otra célula hospedadora de la presente invención se refiere a células que pueden utilizarse para estudiar ligandos peptídicos que emplean receptores dobles o un receptor y un transductor para la activación o transmisión de una señal de la unión de los componentes de múltiples péptidos que se unen, es decir, tres o más componentes de péptidos que se unen.

La dimerización del receptor es una primera etapa fundamental para la transducción de señales en ciertas clases de receptores. Las estructuras de los dímeros de receptores pueden estar compuestas de unidades idénticas de receptores (ejemplos: receptor de insulina, receptor de IGF-I, receptor de PDGF, receptor del dominio de inserción de la quinasa (KDR), o del receptor del factor estimulante de colonias (CSF)-I) o de unidades no idénticas de receptores (ejemplo: IL-6R+gp130; receptor híbrido de insulina-IGF-I; LIF+gp130; CNTF+gp130; varios receptores de interferón).

Los componentes de una célula hospedadora modificada para la verificación de la actividad de unión de un péptido que tiene un sistema de "receptor doble" son los siguientes: la secuencia génica (a) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga; comprendiendo dicha proteína de fusión un péptido de un complejo de múltiples péptidos que se unen, o un segmento de dicho péptido, que está conectado bien al dominio de unión a ADN o a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional; y la secuencia génica (b) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga; comprendiendo dicha proteína de fusión un segundo péptido de dicho complejo de múltiples péptidos que se unen, o un segmento de dicho receptor, fusionado bien con un dominio de unión a ADN o con su correspondiente dominio de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en (a). La célula hospedadora modificada para el estudio de un complejo de múltiples péptidos que se unen, tales como un sistema de receptor doble, también comprende un gen indicador apropiado y mutaciones cromosómicas para el análisis específico de la interacción entre péptidos (ligando/receptor) como se describe más adelante. Se puede expresar un tercer péptido (por ejemplo, un ligando) para establecer un control para el análisis comparativo o competitivo.

Como se ha señalado anteriormente, para el estudio de complejos de múltiples péptidos que se unen, es decir, proteínas de orden superior que contienen tres o más péptidos, se puede utilizar también la célula hospedadora modificada de la presente invención para expresar tres o más péptidos. En el caso de un complejo de tres péptidos que se unen, cualesquiera dos de los péptidos pueden fusionarse con los dos componentes de la proteína de activación transcripcional. Por ejemplo, para estudiar la interacción de un ligando que interacciona por medio de la dimerización del receptor, se pueden expresar los receptores como proteínas de fusión, expresando el ligando en forma de proteína que no es de fusión. Este sistema de célula hospedadora puede aplicarse también al estudio de complejos multiproteicos de enzimas. Para cualquier complejo de múltiples péptidos que se unen, se pueden identificar nuevos péptidos que interaccionan con el complejo mediante la expresión de nuevas proteínas a partir de secuencias al azar de ADN complementario (por ejemplo, una genoteca de ADNc) fusionadas con uno de los dominios de una proteína de activación transcripcional. En semejante sistema, uno de los péptidos conocidos del complejo de péptidos que se unen está fusionado con el otro dominio de la proteína de activación transcripcional mientras que otras unidades del complejo de péptidos que se unen se expresan en forma de péptidos que no son de fusión. Hay que señalar además, que el número de péptidos expresados por la célula hospedadora modificada debería estar limitado sólo por los medios de detección disponibles y por la capacidad de la célula hospedadora.

Los métodos de cribado pueden utilizarse para identificar compuestos que interaccionan con cualquier par de péptidos que se unen, por ejemplo, cualquier receptor y/o ligando. Asimismo, este sistema de célula modificada con un gen indicador para crear un sistema de cribado puede aplicarse a cualquier interacción proteína-proteína para descubrir nuevos compuestos que alteran la interacción. Ejemplos específicos son: a) proteína-quinasas involucradas en cánceres pueden insertarse en el sistema para el cribado rápido de nuevos compuestos que bloquean la interacción quinasa-diana y, por tanto, pueden servir como agentes terapéuticos anticancerígenos excepcionales; b) proteínas de la cubierta vírica, tales como las glucoproteínas del virus de la inmunodeficiencia humana, y sus correspondientes proteínas receptoras de la superficie celular, tales como CD4, pueden insertarse en el sistema para el cribado rápido de compuestos que alteran esta interacción, y pueden servir como agentes antivíricos: c) las dos subunidades del enzima ribonucleótido-reductasa de Plasmodium pueden expresarse en el sistema para detectar compuestos que impiden esta asociación específica entre proteínas y, por tanto, pueden servir como nuevos agentes antipalúdicos.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar varios aspectos de la presente invención. No deben considerarse como limitantes de la invención.

Ejemplo 1 Interacción ligando-receptor específica y reversible

Los genes que codifican proteínas de fusión se generan clonando las secuencias de ADN de la hormona del crecimiento (GH) y del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) en plásmidos que contienen la región que codifica los dominios de Gal4. Se construyen fusiones del dominio de unión a ADN (Gal4) en pAS2, que se describe en Wade Harper et al. Las fusiones del dominio de activación génica (Gal4) se construyen en pACT-II, que es idéntico a pACT (descrito en Durfee et al., 1993), con la salvedad de que tiene una modificación en la región de clonación múltiple. En el sitio Bg1 II se inserta la siguiente secuencia: Bg1 II-epítopo de hemaglutinina-NdeI-NcoI-SmaI-BamHI-EcoRI-XhoI-Bg1 II, adaptada de la secuencia del sitio de clonación múltiple de pAS2 (Wade Harper et al., 1993). El ADNc que codifica el péptido maduro de la GH porcina se genera utilizando técnicas estándar de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase Finney, 1993).

Los oligonucleótidos preparados en un sintetizador de oligonucleótidos ABI se diseñan conforme a la secuencia publicada del ADNc de la GH (véase Su y El-Gewely, 1988). Un oligonucleótido 5' de 30 bases contiene un sitio NcoI (5'-CATGCCATGGAGGCCTTCCCAGCCATGCCC 3' y un oligonucleótido 3' de 27 bases contiene un sitio BamHI (5'-CGGGATCCGCAACTAGAAGGCACAGCT-3'). El ADNc de la GH se genera utilizando una genoteca lambda gt11 de hipófisis porcina, como fuente de molde. Se obtiene un fragmento de 540 pb, se liga al vector pCR II (Invitrogen Corp.), se confirman los recombinantes por digestión con enzimas de restricción, y el ADN se produce como se describe en Maniatus et al., 1982. La secuencia de ADNc se confirma por reacción de terminación de la cadena con didesoxinucleótidos marcados con cromóforos, utilizando reactivos y protocolos de Perkin-Elmer Cetus Corp. y un secuenciador automático ABI 373A. El ADNc de la GH se clona direccionalmente en pACT-II haciendo uso de los sitios NcoI y BamHI. El ADNc que codifica el dominio extracelular del GHR se genera utilizando métodos estándar de PCR. Un oligonucleótido 5' de 33 bases que contiene un sitio NcoI (5'-CATGCCATGGAGATGTTTCCTGGAAGTGGGGCT-3') y un oligonucleótido 3' de 39 bases que contiene un codón de terminación, seguido por un sitio NcoI (5'-CATGCCATGGCCTACCGGAAATCTTCTTCACATGCTGCC-3') se utilizan para generar un fragmento de 742 pb que codifica los aminoácidos 1-247 del GHR de rata (Baumbach et al., 1989). Este ADNc del GHR se clona en el vector pCRII como se ha descrito previamente, y después se subclona en el sitio NcoI del vector pAS2. El ADN de los vectores finales recombinantes se utilizan para transformar la cepa o cepas de levadura por el método de acetato de litio (Rose et al., 1990).

Se prepara una levadura hospedadora (Y190) que contiene un gen indicador UAS_{GAL}-HIS según el procedimiento descrito en Wade Harper et al., 1993. El genotipo de la cepa Y190 es MATa leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3d200 ade2-101 gal4 gal80 URA3::GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 cyh^{r}. La cepa Y190 se transforma con ambas construcciones de fusión como con una sola construcción de fusión, junto con el vector opuesto que no contiene secuencias heterólogas. Se comprueba que todas las cepas presentan la misma proliferación en medio no selectivo (Figura 2A). La proliferación de estas cepas se analiza a continuación en medio selectivo (es decir, un medio de cultivo exento de un aminoácido que se sintetiza por activación del gen indicador). Sólo la cepa que contiene ambas proteínas híbridas (CY722) es capaz de proliferar, mientras que las cepas que contienen sólo la fusión del ligando o la del receptor no proliferan (CY724 y CY723, respectivamente; Figura 2B). Se siembran dos muestras independientes de cada cepa en medio sintético que contiene glucosa al 2%, base de nitrógeno para levaduras, sulfato de amonio, adenina 0,1 mM y 3-aminotriazol 60 mM (placa B) o en el mismo medio enriquecido con histidina (placa A). La placa A se incuba a 30ºC durante tres días; la placa B durante cinco días. Estos resultados demuestran que GH y GHR pueden mediar la activación, dependiente de Gal4, del gen indicador en una interacción que indica la unión del ligando con el receptor.

Ejemplo 1A Ligando libre (GH) competidor expresado en presencia de las proteínas de fusión GH y GHR

Para corroborar la unión aparente de la GH a su receptor en el ambiente foráneo de un núcleo de levadura, se modifica el sistema para añadir un tercer plásmido que dirige la expresión de ligando "libre" y demostrar que el péptido de GH compite con la proteína de fusión GH-Gal4, neutralizando la interacción de 2 híbridos mostrada en el ejemplo 1. La cepa Y190 original (Wade Harper et al., 1993) se cultiva en un medio que contiene ácido 5-fluoroorótico, para seleccionar derivados que pierdan de modo espontáneo el gen URA3 (véase Rose et al., 1990). La cepa resultante, denominada CY770, se utiliza en todos los experimentos que estudian los efectos de la proteína expresada al mismo tiempo que el tercer componente (es decir, el tercer plásmido). El ADNc que codifica la GH se genera por métodos de PCR utilizando un oligonucleótido 5' de 38 bases que contiene un sitio EcoRI (5'-CCGAATTCAAAATGGCCTTCCCAGCCATGCCCTTGTCC-3' y un oligonucleótido 3' de 26 bases que contiene un sitio HindIII (5'CCAAGCTTCAACTAGAAGGCACAGCT-3' para la subclonación subsiguiente en el vector pCUP. pCUP es un vector de expresión inducible en levaduras derivado de pRS316 (Hill et al., 1986). Brevemente, este vector se construye insertando el extremo 3' del gen PGK de levadura (a partir de pPGK; Kang et al., 1990) en la región de clonación de pRS316 en forma de fragmento BamHI-SalI, para que sirva como terminador transcripcional. Con este plásmido, se amplifica la región del promotor CUP1 (Butt et al., 1984) por PCR, en forma de fragmento SacI-EcoRI y se inserta en los sitios correspondientes del plásmido, para crear pCUP. El plásmido de expresión de GH (GH-pCUP) se utiliza a continuación junto con los constructos de fusión de GH y GHR para cotransformar la cepa CY770, para generar CY781. La expresión simultánea de GH libre con las proteínas de fusión de GH y GHR (CY781) demuestra bloquear la proliferación celular dependiente de GH-GHR en medio selectivo (Figura 2B). Este experimento tipifica un ensayo de competición in vivo y demuestra la reversibilidad de la interacción ligando-receptor observada.

Ejemplo 1B Unión de la hormona peptídica prolactina (PRL) y de su receptor

Para ampliar y validar esta tecnología se desarrolló un sistema similar utilizando la hormona peptídica prolactina (PRL) y su receptor. La prolactina está relacionada estructuralmente con la GH, y el receptor de prolactina (PRLR) es también un miembro de la superfamilia del receptor de citocinas. A diferencia de lo que sucede con la GH humana, la GH de animales inferiores a los primates no se une fácilmente al PRLR (Young y Bazer, 1989); ni tampoco se une fácilmente la PRL al GHR (Leung et al., 1987). Se genera la PRL madura porcina en forma de fusión con el dominio de activación GAL4. Se diseñan oligonucleótidos para la PRL porcina (obtenida a partir de Genbank X14068), y se utilizan para generar la hormona proteica PRL madura porcina a partir de una genoteca lambda gt11 de hipófisis porcina, utilizando métodos estándar de PCR. Un oligonucleótido 5' de 31 bases incluye un sitio EcoRI (5'-CGGAATTCTGCCCATCTGCCCCAGCGGGCCT-3') y corresponde a las secuencias que codifican los aminoácidos 1-7. Un oligonucleótido 3' de 30 bases contiene un sitio EcoRI (5'-GAATTCACGTGGGCTTAGCAGTTGCTGTCG-3') y corresponde a una región de ADNc situada en posición 3' respecto del codón de terminación endógeno. Se obtiene un fragmento de 600 pb, se liga al vector pCR II y se confirma por digestión con enzimas de restricción y análisis de las secuencias. El ADNc de la PRL se clona en pACT-II por medio del sitio EcoRI.

El dominio extracelular del receptor porcino de la PRL (PRLR) se genera en forma de fusión con el dominio de unión a ADN de GAL4. Se diseñan oligonucleótidos basados en la secuencia del PRLR de ratón (Davis y Linzer, 1989) Un oligonucleótido 5' de 31 bases contiene un sitio SmaI (5'-TCCCCCGGGGATGTCATCTGCACTTGCTTAC-3') mientras que el oligonucleótido 3' de 31 bases contiene un codón de terminación seguido por un sitio SalI (5'TCCGTCGACGGTCTTTCAAGGTGAAGTCATT-3'). Estos oligonucleótidos flanquean el dominio extracelular del PRLR, que codifica los aminoácidos 1-229. Se utiliza una genoteca lambda gt11 de hipófisis porcina como fuente de molde. Utilizando métodos estándar de PCR, se genera un fragmento de 687 pb, se liga al pCRII, y se confirma la secuencia nucleotídica. El ADNc del PRLR se clona en el vector pAS2 haciendo uso de los sitios de restricción SmaI y SalI.

La cepa Y190 se transformó con los plásmidos de expresión de las fusiones de PRL o PRLR, bien separados (CY727 o CY728, respectivamente) o juntos (CY726). Las células que expresan tanto las fusiones de PRL como las de PRLR son capaces de proliferar en medio selectivo, mientras que no son capaces de proliferar las cepas que contienen sólo la fusión del ligando o la del receptor. Estos resultados reflejan los observados en el sistema GH-GHR en los ejemplos anteriores y demuestran la utilidad general del sistema de 2 híbridos para la investigación de la unión de ligandos a los miembros de esta superfamilia de receptores.

Ejemplo 1C Confirmación adicional de la especificidad ligando-receptor para el nuevo sistema de célula hospedadora de levadura

Se desarrollan cepas adicionales para evaluar la especificidad ligando-receptor. Se transforman cepas URA menos, que expresan las proteínas de fusión GH y GHR, con pCUP o PRL-pCUP; mientras que las cepas que expresan las proteínas de fusión de PRL y de PRLR se transforman con pCUP o PRL-pCUP. Brevemente, se construye PRL-pCUP de modo similar al descrito para el caso de GH-pCUP. El ADNc de PRL se genera por PCR, utilizando un oligonucleótido 5' de 33 bases con un sitio EcoRI (5'-GAATTCAAAATGCTGCCCATCTGCCCCAGCGGG-3') y el oligonucleótido 3' del ejemplo 1B. El fragmento resultante se introduce en pCUP por medio del sitio EcoRI. Como se ha demostrado en los Ejemplos anteriores, una cepa que expresa las fusiones de GH y de GHR sin competidores prolifera en medio selectivo y esta proliferación se suprime al coexpresar la GH libre. El experimento con prolactina produce resultados similares, que confirman la especificidad de la unión del ligando con el receptor en la célula de levadura. Una cepa que porta las fusiones de PRL y de PRLR (CY787) es capaz de proliferar en medio selectivo y esta proliferación se suprime por expresión de la PRL libre (CY786; Tabla 1).

Para verificar la selectividad del GHR, una cepa que contiene las fusiones de GH y de GHR se transforma con PRL-pCUP. Esta cepa prolifera en medio selectivo (CY785; Tabla 1). Estos datos indican que la unión de la GH a su receptor en este sistema puede neutralizarse de modo eficaz por la unión de un exceso de GH (CY751) pero no por la unión del péptido relacionado PRL (CY755). Los resultados de los experimentos anteriores, en los que se expresan tres proteínas heterólogas, ilustran la especificidad de la interacción ligando-receptor(es) en el sistema de la presente invención.

TABLA 1 Lista de cepas y resultados del bioensayo^{a}

Denominación	Fusión AD^{b}	Fusión BD^{c}	pCUP^{d}	Proliferación^{e}
CY700	-	-	-	0
CY722	GH	GHR	-	+
CY723	vector	GHR	-	0
CY724	GH	vector	-	0
CY726	PRL	PRLR	-	+
CY770	-	-	-	0
CY781	GH	GHR	GH	0
CY784	GH	GHR	vector	+

TABLA 1 (continuación)

Denominación	Fusión AD^{b}	Fusión BD^{c}	pCUP^{d}	Proliferación^{e}
CY785	GH	GHR	PRL	+
CY786	PRL	PRLR	PRL	0
CY787	PRL	PRLR	vector	+

^{a} Todas las cepas de levadura provienen de la cepa Y190 (Wade Harper et al. 1993). El genotipo es MATa gal4 gal80 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3,112 URA3::GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 cyh^{r}. Las cepas con denominaciones de números iguales o superiores a 770 no tienen el gen URA3::GAL-lacZ. Un guión indica que una cepa no contiene el plásmido señalado ^{b} Las fusiones AD son derivados de pACT; GH o PRL fusionada con el dominio de activación de Gal4. ^{c} Las fusiones BD son derivados de pAS2; los dominios extracelulares de los receptores de GH o PRL fusionados con el dominio de unión a ADN de Gal4. ^{d} pCUP indica péptidos expresados a partir del plásmido pCUP. ^{e} Resumen de los resultados del bioensayo. Cada cepa se cultiva en medio selectivo durante 3 a 5 días a 30ºC, y después se mide la proliferación celular, indicada por un signo más.

Ejemplo 2 Cribado de compuestos que alteran la interacción ligando-receptor

Se construyen plásmidos de bajo número de copias, que expresan las proteínas de fusión GHR- o GH-Gal4 (pOZ153 y pOZ152, respectivamente) para reducir la expresión de estas proteínas. Además, se construye un nuevo gen indicador que impide la proliferación celular en medio selectivo, a no ser que se suprima la expresión. Para construir el plásmido de expresión con la fusión de GHR, un fragmento de restricción SacI-BamHI que contiene un promotor constitutivo de levadura y secuencias GAL4 se aísla a partir de pAS1 (Durfee et al., 1993) y se clona en pUN30 (Elledge y Davis, 1988). El dominio extracelular del GHR se fusiona a continuación con GAL4, ligándolo en forma de fragmento NcoI, como se ha descrito en el ejemplo 1, para crear pOZ153. Con el objeto de preparar la construcción de expresión de la GH de fusión, se aísla la región GH-Gal4 completa, con las secuencias del promotor y de terminación del plásmido descrito en el ejemplo 1, en forma de fragmento PvuI-SalI. Este segmento de ADN se clona en pUN100 (Elledge y Davis, 1988), para generar pOZ152. Se construye un gen indicador aislando la región que codifica CYH2 de levadura y conectándola funcionalmente con el promotor GAL en un plásmido de expresión de levadura. Brevemente, la región del promotor GAL1 se inserta en YEp352 (Hill et al., 1986) en forma de fragmento EcoRI-BamHI de 685 pb. Las secuencias CYH2 se amplifican por PCR, utilizando oligonucleótidos cebadores (5'-GGATCCAATCAAGAATGCCTTCCAGAT-3' y 5'-GCATGCGTCATAGAAATAATACAG-3') y pAS2 como molde. El producto de PCR se digiere con BamHI más SphI y se clona en los sitios correspondientes en el vector YEp352-GAL. Estos plásmidos se utilizan para transformar la cepa de levadura CY770, que lleva una mutación en el gen cyh2 cromosómico, que hace que la cepa sea resistente al inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida. La presencia de los tres plásmidos es necesaria para conferir sensibilidad a la cicloheximida (cyh^{s}).

La cepa (CY857) que contiene los plásmidos con las fusiones del ligando y del receptor, más el plásmido indicador, forma la base de un simple cribado primario de compuestos que alteran la unión de la GH a su receptor. La cepa CY857 se incluye en medio estándar de cultivo de levaduras, que contiene 10,0 \mug/ml de cicloheximida. Debido a que la interacción ligando/receptor dirige la expresión del gen indicador CYH2, la cepa es cyh^{s} y, por tanto, incapaz de proliferar. Se añaden compuestos químicos a este medio de prueba. Los compuestos que alteran la unión GH-GHR se identifican por la proliferación de células que circundan el compuesto, debido a que en ausencia de expresión de CYH2 las células se hacen resistentes a la cicloheximida presente en el medio.

Cribado secundario para determinar la diana de la muestra

La alteración de la unión del ligando con el receptor en este ensayo puede provenir de la reacción del compuesto con el componente de fusión del receptor o del ligando. La diana específica del nuevo compuesto se determina mediante un simple ensayo secundario utilizando cepas que sobreexpresan una de las proteínas de fusión. La cepa CY858 expresa un gran exceso de la fusión GHR-GAL4, debido a que la construcción se mantiene en las células a un alto número de copias (pOZ149), mientras que la fusión de GH (pOZ152) se mantiene a niveles similares a los de la cepa base (CY857). Y viceversa, la cepa CY859 expresa un gran exceso de la fusión GH-GAL4 debido a que la construcción se mantiene en las células a un alto número de copias (pKY14), mientra que la fusión GHR (pOZ153) se mantiene a niveles similares a los de la cepa base (CY857). Los compuestos que rescatan la proliferación en el cribado primario utilizando CY857 (fusiones de GH y GHR expresadas con plásmidos de bajo número de copias) se ensayan a continuación de la misma manera, utilizando CY858 (GHR>>GH) o CY859 (GH>>GHR) como cepa de prueba. Por ejemplo, cuando la unión del ligando con el receptor se inhibe por un compuesto que reacciona con el GHR, el cribado secundario demostrará un cambio detectable en el fenotipo medido. El análisis secundario del compuesto de rescate en la cepa CY858, que sobreexpresa la fusión de GHR, produce una menor proliferación en presencia del compuesto que la observada en el caso de CY859. Este cambio detectable en el fenotipo medido tiene lugar debido a que la superabundancia de GHR capta el compuesto, aumentando de este modo la expresión de CYH2 e inhibiendo la proliferación celular. CY859 produce un cambio detectable similar al caso de CY857, debido a que la proteína de fusión GHR es limitante. Un compuesto que interacciona con el ligando de fusión demuestra un cambio inverso en el fenotipo medido en este ensayo secundario.

Ejemplo 3 Demostración de la dimerización del receptor dependiente del ligando

Las interacciones entre múltiples proteínas (por ejemplo; ligando-receptor-receptor) se investigan con el sistema ampliado que expresa una tercera proteína utilizando el siguiente esquema.

Una unidad del dímero del receptor se genera como una proteína de fusión bien con el dominio de unión a ADN o de activación de Gal 4. La otra unidad del dímero del receptor se genera como una proteína de fusión con el correspondiente dominio de unión a ADN o de activación de Gal, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado para la primera fusión. El gen que codifica el ligando se expresa a partir de tercer plásmido y se produce en forma de ligando libre (no de fusión). La interacción de las proteínas de fusión tiene lugar sólo en presencia de ligando (véase la Figura 3).

La interacción del factor de crecimiento de las células del endotelio vascular (VEGF) con el dominio de unión al ligando de su correspondiente receptor (KDR, receptor que contiene el dominio de inserción de la quinasa) se describe como ejemplo de este sistema. El KDR es un receptor con actividad tirosina-quinasa, y se ha sugerido que la formación de dímeros (1 ligando-2 receptores) es importante para la función del receptor inducida por hormonas. El ADNc que codifica el dominio del ligando de KDR (Terman et al., 1991) se aísla en forma de fragmento Nco I-BamHI y se clona en ambos vectores pACT-II y pAS2. El ADNc que codifica la proteína madura del VEGF se genera utilizando técnicas estándar de PCR. Se diseñan oligonucleótidos a partir de la secuencia publicada (véase Tischer et al., 1991). Un oligonucleótido 5' de 34 bases que contiene un sitio EcoRI (5'-CGGAATTCGAAGTATGGCACCCATGGCAGAAGGA-3') y un oligonucleótido 3' de 28 bases que contiene un sitio EcoRI (5'-CGGAATTCGGATCCTCATTCATTCATCA-3') se utilizan para generar un fragmento de 450 pb que codifica la proteína madura, que se clona en el sitio EcoRI de pCUP. El ADN de los vectores recombinantes finales se utiliza para transformar la levadura por medio del método de acetato de litio, para generar las cepas apropiadas.

La cepa hospedadora de levadura (CY770) se transforma con KDR-pACT-II, KDR-pAS2 y VEGF-pCUP, para generar la cepa CY846; o se transforma tanto con las fusiones del receptor como con pCUP, para generar la cepa CY847. Además, tanto KDR-pACT-II como KDR-pAS2 se utilizan para transformar juntos (CY845) o por separado (CY843 o CY844) o se utiliza VEGF-pCUP por separado (CY841), para generar cepas testigo. Se analiza la proliferación de las cepas en medio selectivo. La cepa (CY846) que expresa el ligando VEGF más las dos proteínas de fusión del receptor presenta una considerable proliferación en medio selectivo, en comparación con la cepa CY847, que no expresa el ligando VEGF (véase la Figura 4). Estos resultados demuestran que las células eficaces de la presente invención pueden utilizarse para estudiar la dimerización del receptor dependiente de ligando.

Ejemplo 4 Cribado de compuestos que actúan como ligandos en un sistema de receptor dimérico

La dimerización (oligomerización) de unidades del receptor es a menudo una importante primera etapa en la activación de receptores tales como los de los factores de crecimiento, citocinas y otros descritos anteriormente. El nuevo sistema celular descrito en el ejemplo 3 puede aplicarse al descubrimiento de nuevos compuestos que estimulan (o bloquean) la dimerización del receptor. Tales nuevos compuestos que interaccionan pueden servir como agentes terapéuticos eficaces para trastornos patológicos asociados a estos receptores.

Se generan plásmidos que expresan la unidad o unidades del dímero del receptor en forma de proteínas de fusión, como se ha descrito en el ejemplo 3. La cepa (CY845) que contiene las fusiones KDR-pACT-II y KDR-pAS2 sirve como ejemplo de un simple cribado primario de receptores que presentan estructura dimérica. La cepa CY845 se incluye en medio sintético con agar carente de histidina (Rose et al., 1990). Los compuestos de prueba se aplican en la superficie de este medio de prueba. Los compuestos químicos que inducen la interacción de las dos fusiones del receptor (en ausencia de ligando) dan lugar a la reconstitución del activador transcripcional endógeno, que está conectado a un gen indicador, tal como HIS3. La reconstitución se identifica por la proliferación de células que rodean el compuesto.

Publicaciones citadas anteriormente

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Claims (41)

1. Célula hospedadora de levadura o de mamífero, que comprende:

a)

una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga; comprendiendo dicha proteína de fusión un primer péptido de un par de péptidos que se unen, o segmento de dicho primer péptido, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional;

b)

una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un segundo péptido del par de péptidos que se unen en (a), o un segmento del mismo, fusionado con un dominio de unión a ADN o con su correspondiente dominio de activación transcripcional, ninguno de los cuales ha sido empleado en (a);

c)

un gen indicador asociado funcionalmente con la proteína de activación transcripcional, o con una porción de la misma.

d)

opcionalmente, una deleción o mutación en el ADN cromosómico de la célula hospedadora de levadura para la proteína de activación transcripcional, si está presente en la célula hospedadora seleccionada;

en la que dicha célula hospedadora es capaz de expresar por lo menos dos proteínas de fusión heterólogas y por lo menos un gen indicador, y en la que los péptidos del par de péptidos que se unen interaccionan entre sí por medio de actividad extracelular en su ambiente natural.

2. Célula hospedadora según la reivindicación 1, en la que dicha célula de levadura se selecciona a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe o Pichia pastoris.

3. Célula hospedadora según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el par de péptidos que se unen se selecciona a partir del grupo formado por péptidos de mamífero.

4. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el par de péptidos que se unen se selecciona a partir del grupo formado por péptidos que no son de mamífero.

5. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el par de péptidos que se unen se selecciona a partir del grupo formado por ligandos y un receptor correspondiente.

6. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que un péptido del par de péptidos que se unen es una hormona.

7. Célula hospedadora según la reivindicación 6, en la que un péptido del par de péptidos que se unen se selecciona a partir del grupo formado por hormonas peptídicas de mamífero.

8. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de activación transcripcional se selecciona a partir de (a) Gal4, Gcn4, Hap1, Adr1, Swi5, Ste12, Mcm1, Yap1, Ace1, Ppr1, Arg81, Lac9, Qa1F, VP16, LexA o (b) receptores nucleares de mamífero.

9. Célula hospedadora según la reivindicación 8, en la que dicha proteína de activación transcripcional es una proteína de activación transcripcional de levadura.

10. Célula hospedadora según la reivindicación 9, en la que dicha proteína de activación transcripcional de levadura es GAL4, Gcn4, Adr1 o lac9.

11. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el gen indicador se selecciona a partir del grupo formado por:

a)

lacZ, gen de la luciferasa, gen de la proteína fluorescente verde, cloranfenicol-acetiltransferasa

b)

genes que complementan auxótrofos,

c)

genes que confieren resistencia a antibióticos, y

d)

genes que confieren sensibilidad a un producto químico.

12. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que por lo menos una de las proteínas de fusión heterólogas se expresa por transformación de una célula de levadura con un plásmido de replicación autónoma capaz de expresar dicha proteína de fusión.

13. Célula hospedadora según la reivindicación 12, en la que las proteínas de fusión heterólogas se expresan por transformación de una célula de levadura con un plásmido de replicación autónoma capaz de expresar dicha proteína de fusión.

14. Célula hospedadora según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en la que por lo menos un péptido del par de péptidos que se unen se selecciona a partir de uno de los siguientes grupos:

(a)

grupo formado por citocinas, interleucinas, factores de crecimiento hematopoyéticos, insulina, factores de crecimiento similares a la insulina, hormona del crecimiento, prolactina, interferones y factores de crecimiento;

(b)

ligandos para receptores acoplados a proteínas G;

(c)

ligandos para receptores que no son de vertebrados;

(d)

ligandos para receptores con actividad guanilil-ciclasa;

(e)

ligandos para receptores con actividad tirosina-fosfatasa.

15. Célula hospedadora según la reivindicación 14, en la que el péptido es un factor de crecimiento seleccionado a partir del grupo formado por factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento del endotelio vascular, factor de necrosis tumoral, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, eritropoyetina, factor de Steel, lactógeno placentario y TGF.

16. Célula hospedadora según la reivindicación 15, en la que por lo menos un péptido del par de péptidos que se unen es un transductor.

17. Célula hospedadora según la reivindicación 16, en la que el transductor se selecciona a partir del grupo formado por gp130, kh97, AIC2A y AIC2B.

18. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que por lo menos un péptido del par de péptidos que se unen es un receptor seleccionado a partir de uno de los siguientes grupos:

(a)

una molécula de adhesión celular; y

(b)

una molécula inmunomoduladora, de reconocimiento o presentación del antígeno

19. Célula hospedadora según la reivindicación 18, en la que el receptor es una molécula de adhesión celular seleccionada a partir de ICAM, VCAM, ECAM, fibronectina, integrina, selectina y fibrinógeno.

20. Célula hospedadora según la reivindicación 19, en la que el receptor es una molécula inmunomoduladora, de reconocimiento o presentación del antígeno, seleccionada a partir del complejo receptor de los linfocitos T, complejo receptor de los linfocitos B, receptores Fc, complejo principal de histocompatibilidad de clase 1, complejo principal de histocompatibilidad de clase 2, CD4, CD8, CD27, CD30, complejo MAC.

21. Célula hospedadora según la reivindicación 14, en la que un péptido del par de péptidos que se unen es un ligando para receptores acoplados a proteínas G.

22. Célula hospedadora según la reivindicación 21, en la que el ligando para receptores acoplados a proteínas G se selecciona a partir del factor liberador de la hormona de crecimiento, secretina, péptido inhibidor vasoactivo, glucagón, interleucina-8, hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de los folículos (FSH) y tirotropina.

23. Célula hospedadora según la reivindicación 14, en la que el péptido que no es de vertebrados se selecciona a partir del grupo formado por sistemina vegetal y péptidos de diferenciación de insectos.

24. Método para detectar la capacidad de una muestra de prueba de afectar a la interacción de unión de un par de péptidos que se unen, comprendiendo dicho método:

determinar la actividad del gen indicador tras añadir una muestra de prueba a la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 en condiciones adecuadas para detectar dicha actividad en presencia de dicha muestra o en una condición en la que la célula hospedadora presenta dicha actividad solamente en presencia de una muestra que presenta interacción de unión de un par de péptidos que se unen.

25. Método según la reivindicación 24, en el que la actividad del gen indicador se determina midiendo un fenotipo seleccionado, que depende de la actividad del indicador.

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26. Célula hospedadora según la reivindicación 1, en la que el gen indicador (c) está asociado funcionalmente con una proteína de activación transcripcional de levadura, en la que dicho gen indicador impide, en un medio selectivo, la manifestación de un fenotipo detectable en presencia de la expresión de la proteína de activación transcripcional de levadura, o de una porción de la misma; y en la que la célula hospedadora comprende además:

(e)

opcionalmente, una deleción o mutación en el ADN cromosómico de la célula hospedadora que permite la manifestación del fenotipo seleccionado en el medio seleccionado en ausencia de la expresión del gen indicador del plásmido (c), si es necesario que el gen indicador (c) sea la única fuente de actividad medida.

27. Método para detectar la capacidad de una muestra de prueba de afectar a la interacción de un par de péptidos que se unen, comprendiendo dicho método:

observar un cambio en el fenotipo medido de una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 tras añadir una muestra de prueba a dicha célula hospedadora; cultivándose dicha célula en condiciones adecuadas para detectar un fenotipo seleccionado en presencia de una muestra de prueba, o cultivándose en una condición en la que dicha célula presenta el fenotipo solamente en presencia de una muestra de prueba que presenta interacción con el par de péptidos que se unen.

28. Método para determinar si una muestra de prueba presenta interacción con un péptido de un par de péptidos que se unen, comprendiendo dicho método:

(a)

añadir una muestra de prueba a una célula hospedadora de levadura o de mamífero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y comparar la manifestación del fenotipo seleccionado en presencia y en ausencia de la muestra de prueba;

en el que célula hospedadora está adaptada para manifestar un cambio en el fenotipo solamente en presencia de una muestra de prueba que se une solamente a un péptido del par de péptidos que se unen.

29. Método según la reivindicación 28, en el que dicho método emplea una célula hospedadora que comprende:

a)

una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer péptido de un par de péptidos que se unen, o segmento de dicho primer péptido, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional, en el que el gen que codifica dicho primer péptido está presente en un número de copia eficaz.

b)

una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un segundo péptido del par de péptidos que se unen en (a), o un segmento de dicho segundo péptido, fusionado bien con un dominio de unión a ADN o bien con su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en (a);

c)

un gen indicador asociado funcionalmente con la proteína de activación transcripcional, o con una porción de la misma; y

d)

una deleción o mutación en el ADN cromosómico de la célula hospedadora de levadura para la proteína de activación transcripcional.

30. Método según la reivindicación 29, en el que por lo menos una de las proteínas de fusión heterólogas se expresa por transformación de una célula hospedadora con un plásmido de replicación autónoma capaz de expresar dicha proteína de fusión.

31. Método según la reivindicación 29, en el que el gen indicador se expresa por transformación de una célula hospedadora con un plásmido de replicación autónoma capaz de expresar dicho gen indicador.

32. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que la secuencia génica (a) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión una de dos moléculas receptoras para un péptido, o segmento de dicho receptor, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional; y la secuencia génica (b) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión el otro receptor para el péptido, o un segmento de dicho receptor, fusionado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en (a).

33. Célula hospedadora según la reivindicación 32, en la que el gen en (a) codifica una proteína de fusión heteróloga; comprendiendo dicha proteína de fusión un transductor para un péptido, o segmento de dicho transductor, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional.

34. Célula hospedadora según la reivindicación 33, en la que el transductor se selecciona a partir de gp130, KH97, AIC2A y AIC2B.

35. Método para detectar la capacidad de una muestra de prueba de funcionar como ligando para un receptor, que comprende:

determinar el nivel de actividad del gen indicador de la célula hospedadora según la reivindicación 33 tras añadir una muestra de prueba a dicha célula en condiciones adecuadas para detectar dicha actividad.

36. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que la secuencia génica (a) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un péptido de un complejo de múltiples péptidos que se unen, o segmento de dicho péptido, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional; y la secuencia génica (b) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un segundo péptido de dicho complejo de múltiples péptidos que se unen, o un segmento de dicho receptor, fusionado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en (a).

37. Método para detectar la capacidad de una muestra de prueba de funcionar como un péptido componente de un complejo de múltiples péptidos que se unen, comprendiendo dicho método:

determinar el nivel de actividad del gen indicador de la célula hospedadora según la reivindicación 36 tras añadir una muestra de prueba a dicha célula en condiciones adecuadas para detectar dicha actividad.

38. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que la secuencia génica (a) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un péptido de un complejo de múltiples péptidos que se unen, o segmento de dicho péptido, que está conectado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional; y la secuencia génica (b) es una secuencia génica que codifica una proteína de fusión heteróloga, comprendiendo dicha proteína de fusión un segundo péptido de dicho complejo de múltiples péptidos que se unen, o un segmento de dicho receptor, fusionado bien a un dominio de unión a ADN o bien a su correspondiente dominio de activación transcripcional de una proteína de activación transcripcional, siendo cualquiera de ellos que no se haya empleado en (a);

en la que dicha célula hospedadora comprende, como en (e), por lo menos una secuencia génica que codifica un péptido;

en la que dicha célula hospedadora es capaz de expresar dichos péptidos.

39. Célula hospedadora según la reivindicación 38, en la que por lo menos uno de los componentes (a), (b) o (e) es una secuencia génica correspondiente a una genoteca de ADN complementario.

40. Célula hospedadora según la reivindicación 39, en la que el componente (b) es una secuencia génica correspondiente a una genoteca de ADN complementario.

41. Método para determinar la capacidad de una proteína al azar de funcionar como un componente de un complejo de múltiples péptidos que se unen, comprendiendo dicho método:

determinar el nivel de actividad del gen indicador de la célula hospedadora según la reivindicación 40 tras la expresión de la proteína al azar a partir de la genoteca de ADN en condiciones adecuadas para detectar dicha actividad.