JP3468523B2 - ガゼインキナーゼ▲ｉ▼と相互作用するタンパク質に関連する方法および物質 - Google Patents
ガゼインキナーゼ▲ｉ▼と相互作用するタンパク質に関連する方法および物質Info
- Publication number
- JP3468523B2 JP3468523B2 JP51972295A JP51972295A JP3468523B2 JP 3468523 B2 JP3468523 B2 JP 3468523B2 JP 51972295 A JP51972295 A JP 51972295A JP 51972295 A JP51972295 A JP 51972295A JP 3468523 B2 JP3468523 B2 JP 3468523B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- protein
- dna
- hrr25
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、一般に、以下に「TIHプロテイン」と称す
る、カゼインキナーゼＩのイソ体と相互作用するタンパ
ク質の同定、および当該タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドの単離に関する。
る、カゼインキナーゼＩのイソ体と相互作用するタンパ
ク質の同定、および当該タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドの単離に関する。
プロテインキナーゼは、翻訳後の細胞代謝の酵素調節
機能を呈する。一旦活性化されると、これら酵素はATP
から基質タンパク質へ燐酸塩を移行させ、基質分子の特
性に影響を及ぼすように作用する。そこには、セリン／
スレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ、多重あるいは
二重特異性キナーゼ、およびヒスチジンキナーゼを含む
４つの主要なクラスに分類されている〔Hunter et al.,
Meth.Enzymol.200:3−37（1991）〕。
機能を呈する。一旦活性化されると、これら酵素はATP
から基質タンパク質へ燐酸塩を移行させ、基質分子の特
性に影響を及ぼすように作用する。そこには、セリン／
スレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ、多重あるいは
二重特異性キナーゼ、およびヒスチジンキナーゼを含む
４つの主要なクラスに分類されている〔Hunter et al.,
Meth.Enzymol.200:3−37（1991）〕。
キナーゼによって優先的に燐酸化した基質のアミノ酸
残基に加えて、特定のクラスへの酵素の振り分けは、一
次構造、調節サブユニットの必要性、第二メッセンジャ
ーの必要性、および特異的な生物化学的活性に基づいて
いる。Hunter et al.,上掲、およびHanks and Quinn,Me
th.Enzymol.200:38−62（1991）を参照のこと。
残基に加えて、特定のクラスへの酵素の振り分けは、一
次構造、調節サブユニットの必要性、第二メッセンジャ
ーの必要性、および特異的な生物化学的活性に基づいて
いる。Hunter et al.,上掲、およびHanks and Quinn,Me
th.Enzymol.200:38−62（1991）を参照のこと。
セリン／スレオニンタンパクキナーゼは、酵素の調節
態様ならびに活性酵素の四級構造に基づいて、さらに酵
素の科に分類されている〔Edelman et al.,Ann.Rev.Bio
chem.56:567−613（1987）〕。セリン／スレオニンタン
パクキナーゼ科に属する酵素は、燐酸化する基質、認識
する特異的燐酸化部位、調節の態様、および亜細胞分布
に関して差異をつけることができる。例えば、プロテイ
ンキナーゼＡ（PKA）は、燐酸化した残基であるＳ
（Ｐ）を含む認識／燐酸化配列Ｒ−Ｒ−Ｘ−Ｓ（Ｐ）−
Ｙ（配列番号:1）〔Pearson and Lemp,Meth.Enzymol.20
0:62−81（1991）〕で目標とする基質を燐酸化する。PK
Aの活性は、（Hubbard and Cohen,T.I.B.S.18:172−17
7,1993にて報告されたアンカータンパク質あるいはAKAP
sと称する）サブユニットを目標とすることで局在化で
きる。一方で、カゼインキナーゼＩ（CK I）科に属する
酵素は、基質タンパク質の酸性残基の近傍のセリンとス
レオニンを認識および燐酸化する。酵母、ラット、ウシ
およびヒトのイソ体でのカゼインキナーゼＩ活性をコー
ドする遺伝子は構造的に同様であり、また、以下に「HR
R25−様」タンパク質と称する、原型S.cerevisiae CK I
タンパク質、HRR25と比較した場合にイソ体は、触媒領
域と35％、時には50％を超える相同性（同一性）を示し
た。この同一性の程度は、任意に選択した二つのプロテ
インキナーゼにて認められた25％の相同性を遙かに凌ぐ
ものである〔Hanks and Quinn、上掲〕。HRR25 DNA配列
は、Hoekstra et al.,science 253:1031−1034（1991）
に;Robinson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）89:28
−32（1992）での酵母配列YCK2およびYCK1にそれぞれ対
応する、酵母CK I1およびCK I2のDNA配列は、Wang,et a
l.,J.Mol.Biol.Cell,3:275−286（192）に；ウシCK I
α、CK Iβ、CK IγおよびCK IδDNA配列の一部とCK I
α相同体のDNA配列の全長が、Rowles,et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.（USA）88:9548−9552（1991）に；ラットC
K IδDNA配列の全長がGraves,et al.,J.Biol.Chem.268:
6394−6401（1993）に；そして、ヒト赤血球CK IαDNA
配列の一部が、Brockman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）89:9454−9458（1992）に開示されている。
態様ならびに活性酵素の四級構造に基づいて、さらに酵
素の科に分類されている〔Edelman et al.,Ann.Rev.Bio
chem.56:567−613（1987）〕。セリン／スレオニンタン
パクキナーゼ科に属する酵素は、燐酸化する基質、認識
する特異的燐酸化部位、調節の態様、および亜細胞分布
に関して差異をつけることができる。例えば、プロテイ
ンキナーゼＡ（PKA）は、燐酸化した残基であるＳ
（Ｐ）を含む認識／燐酸化配列Ｒ−Ｒ−Ｘ−Ｓ（Ｐ）−
Ｙ（配列番号:1）〔Pearson and Lemp,Meth.Enzymol.20
0:62−81（1991）〕で目標とする基質を燐酸化する。PK
Aの活性は、（Hubbard and Cohen,T.I.B.S.18:172−17
7,1993にて報告されたアンカータンパク質あるいはAKAP
sと称する）サブユニットを目標とすることで局在化で
きる。一方で、カゼインキナーゼＩ（CK I）科に属する
酵素は、基質タンパク質の酸性残基の近傍のセリンとス
レオニンを認識および燐酸化する。酵母、ラット、ウシ
およびヒトのイソ体でのカゼインキナーゼＩ活性をコー
ドする遺伝子は構造的に同様であり、また、以下に「HR
R25−様」タンパク質と称する、原型S.cerevisiae CK I
タンパク質、HRR25と比較した場合にイソ体は、触媒領
域と35％、時には50％を超える相同性（同一性）を示し
た。この同一性の程度は、任意に選択した二つのプロテ
インキナーゼにて認められた25％の相同性を遙かに凌ぐ
ものである〔Hanks and Quinn、上掲〕。HRR25 DNA配列
は、Hoekstra et al.,science 253:1031−1034（1991）
に;Robinson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）89:28
−32（1992）での酵母配列YCK2およびYCK1にそれぞれ対
応する、酵母CK I1およびCK I2のDNA配列は、Wang,et a
l.,J.Mol.Biol.Cell,3:275−286（192）に；ウシCK I
α、CK Iβ、CK IγおよびCK IδDNA配列の一部とCK I
α相同体のDNA配列の全長が、Rowles,et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.（USA）88:9548−9552（1991）に；ラットC
K IδDNA配列の全長がGraves,et al.,J.Biol.Chem.268:
6394−6401（1993）に；そして、ヒト赤血球CK IαDNA
配列の一部が、Brockman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）89:9454−9458（1992）に開示されている。
S.cerevisiaeプロテインキナーゼHRR25は、CK I科の
中でも特等付けが進んだイソ体の一つである〔Hoekstr
a、上掲〕。HRR25遺伝子の変異は、細胞周期の遅延化、
DNA鎖損傷の適切な修復の阻害、特徴的な形態の変化を
含む様々な欠陥を招くことになる。これら欠陥の本質
は、HRR25および他のCK Iイソ体が、細胞の成長におい
て重要な役割を果たす、ことを意味するものである。
中でも特等付けが進んだイソ体の一つである〔Hoekstr
a、上掲〕。HRR25遺伝子の変異は、細胞周期の遅延化、
DNA鎖損傷の適切な修復の阻害、特徴的な形態の変化を
含む様々な欠陥を招くことになる。これら欠陥の本質
は、HRR25および他のCK Iイソ体が、細胞の成長におい
て重要な役割を果たす、ことを意味するものである。
健康状態あるいは疾患時でのタンパク質の燐酸化とプ
ロテインキナーゼの重要性は、特定のキナーゼの発現が
首尾よく進行しない場合、例えば、ABLチロシンキナー
ゼ遺伝子に隣接するように制限部位領域（BCR）遺伝子
を位置させる転座から生じた慢性骨髄性白血病が、活性
化したプロテインキナーゼを含む融合タンパク質をもた
らす場合〔Bishop et al.,Cell 64:235−288（1991）の
論評を参照のこと〕の証拠になる。加えて、Mos〔Watso
n et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）79:4078−4082
（1982）〕、Src〔Anderson et al.,Mol.Cell.Biol.5:1
122−1129（1985）〕、およびRaf〔Bonner et al.,Nuc
l.Acids Res.14:1009−1015（1986）〕のような多くの
腫瘍遺伝子もプロテインキナーゼである。
ロテインキナーゼの重要性は、特定のキナーゼの発現が
首尾よく進行しない場合、例えば、ABLチロシンキナー
ゼ遺伝子に隣接するように制限部位領域（BCR）遺伝子
を位置させる転座から生じた慢性骨髄性白血病が、活性
化したプロテインキナーゼを含む融合タンパク質をもた
らす場合〔Bishop et al.,Cell 64:235−288（1991）の
論評を参照のこと〕の証拠になる。加えて、Mos〔Watso
n et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）79:4078−4082
（1982）〕、Src〔Anderson et al.,Mol.Cell.Biol.5:1
122−1129（1985）〕、およびRaf〔Bonner et al.,Nuc
l.Acids Res.14:1009−1015（1986）〕のような多くの
腫瘍遺伝子もプロテインキナーゼである。
たいていのプロテインキナーゼは、in vivoにて、生
理学的刺激に応答して変化する様々な基質を燐酸化する
〔Edelman,et al.,上掲〕。非生理学的基質に対する活
性を含めて、多くのプロテインキナーゼにin vitroで特
異的に認められる広範囲な基質は、これら酵素の特異性
を制御するための細胞の機構がin vivoに存在するはず
であることを示唆している。これらキナーゼを支配する
調節機構ならびに健康状態あるいは疾患時でのキナーゼ
の特異的役割を理解するためには、基質、調節タンパク
質、およびキナーゼと相互作用する局在化／目標タンパ
ク質の同定が必要となる。
理学的刺激に応答して変化する様々な基質を燐酸化する
〔Edelman,et al.,上掲〕。非生理学的基質に対する活
性を含めて、多くのプロテインキナーゼにin vitroで特
異的に認められる広範囲な基質は、これら酵素の特異性
を制御するための細胞の機構がin vivoに存在するはず
であることを示唆している。これらキナーゼを支配する
調節機構ならびに健康状態あるいは疾患時でのキナーゼ
の特異的役割を理解するためには、基質、調節タンパク
質、およびキナーゼと相互作用する局在化／目標タンパ
ク質の同定が必要となる。
このように、当該技術分野では、カゼインキナーゼＩ
に属する酵素と相互作用するタンパク質を同定し、そし
て、そのアミノ酸と、それをコードするDNA配列に関し
て相互作用するタンパク質を特徴付けることが待望され
ている。かような情報は、タンパク質の大規模生産をも
たらし、キナーゼを自然に産生する細胞の同定を許容
し、そしてキナーゼとの特異的な反応性を示す抗体の生
成の途を開くであろう。さらに、これらプロテインキナ
ーゼの基質、調節、および局在化の解明を進めること
で、正常細胞ならびに腫瘍細胞の成長の理解に寄与し、
異常細胞および／または腫瘍細胞の成長阻害に有用な治
療薬の開発に必須の情報を提供するであろう。
に属する酵素と相互作用するタンパク質を同定し、そし
て、そのアミノ酸と、それをコードするDNA配列に関し
て相互作用するタンパク質を特徴付けることが待望され
ている。かような情報は、タンパク質の大規模生産をも
たらし、キナーゼを自然に産生する細胞の同定を許容
し、そしてキナーゼとの特異的な反応性を示す抗体の生
成の途を開くであろう。さらに、これらプロテインキナ
ーゼの基質、調節、および局在化の解明を進めること
で、正常細胞ならびに腫瘍細胞の成長の理解に寄与し、
異常細胞および／または腫瘍細胞の成長阻害に有用な治
療薬の開発に必須の情報を提供するであろう。
本願発明の一態様にて、本願発明は、TIHプロテイン
と命名された、CK Iイソ体〔すなわち、S.cerevisiae H
RR25カゼインキナーゼＩと触媒領域にてHRR25と少なく
とも35％を超えるアミノ酸配列相同性を有するHRR25様
プロテインキナーゼ〕と相互作用するタンパク質を同定
し、そして、TIHプロテインをコードするポリヌクレオ
チドを単離するための方法を提供する。
と命名された、CK Iイソ体〔すなわち、S.cerevisiae H
RR25カゼインキナーゼＩと触媒領域にてHRR25と少なく
とも35％を超えるアミノ酸配列相同性を有するHRR25様
プロテインキナーゼ〕と相互作用するタンパク質を同定
し、そして、TIHプロテインをコードするポリヌクレオ
チドを単離するための方法を提供する。
その好ましい方法によれば、以下の工程、すなわち、
ａ）DNA結合領域と活性化領域を含む転写要素によって
調節されたプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を
含むDNA構築体で適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 ｂ）CK Iイソ体の一部あるいは全部と、転写要素のDNA
結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含む第一融合
体をコードする第一ハイブリッドDNA配列を宿主細胞に
て発現し、 ｃ）CK Iイソ体が結合したと推定されるタンパク質の一
部あるいは全部と、第一融合体には含まれていない転写
要素のDNA結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含
む第二融合体をコードする第二ハイブリッドDNA配列の
ライブラリーを宿主細胞にて発現し、 ｄ）宿主細胞でのレポーター遺伝子生成物の生成を検出
することで、特定の宿主細胞における、CK Iイソ体が結
合したタンパク質のCK Iイソ体への結合を検出し、およ
び ｅ）特定の宿主細胞からCK Iイソ体が結合したタンパク
質をコードする第二ハイブリッドDNA配列を単離する、
工程を含むものである。
調節されたプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を
含むDNA構築体で適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 ｂ）CK Iイソ体の一部あるいは全部と、転写要素のDNA
結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含む第一融合
体をコードする第一ハイブリッドDNA配列を宿主細胞に
て発現し、 ｃ）CK Iイソ体が結合したと推定されるタンパク質の一
部あるいは全部と、第一融合体には含まれていない転写
要素のDNA結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含
む第二融合体をコードする第二ハイブリッドDNA配列の
ライブラリーを宿主細胞にて発現し、 ｄ）宿主細胞でのレポーター遺伝子生成物の生成を検出
することで、特定の宿主細胞における、CK Iイソ体が結
合したタンパク質のCK Iイソ体への結合を検出し、およ
び ｅ）特定の宿主細胞からCK Iイソ体が結合したタンパク
質をコードする第二ハイブリッドDNA配列を単離する、
工程を含むものである。
この方法の他の態様では、CK Iイソ体とCK Iイソ体が
結合したと推定されるタンパク質とが、転写要素の領
域、すなわち、転写領域のアミノ末端ならびにカルボキ
シ末端に融合するよう順序を変えることも意図されてい
る。この方法での好ましい態様では、プロモーターはle
xAプロモーターであり、DNA結合領域はlexA DNA結合領
域であり、活性化領域はGAL4活性領域であり、レポータ
ー遺伝子はlacZ遺伝子であり、そして、宿主細胞は酵母
宿主細胞である。
結合したと推定されるタンパク質とが、転写要素の領
域、すなわち、転写領域のアミノ末端ならびにカルボキ
シ末端に融合するよう順序を変えることも意図されてい
る。この方法での好ましい態様では、プロモーターはle
xAプロモーターであり、DNA結合領域はlexA DNA結合領
域であり、活性化領域はGAL4活性領域であり、レポータ
ー遺伝子はlacZ遺伝子であり、そして、宿主細胞は酵母
宿主細胞である。
この方法の変法では、CK Iイソ体とCK Iと相互作用す
るタンパク質との間での相互作用を阻害する小さな分子
の同定を許容する。小さな分子阻害剤を同定するための
好ましい方法によれば、以下の工程、すなわち、 ａ）DNA結合領域と活性化領域を含む転写要素によって
調節されたプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を
含むDNA構築体で適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 ｂ）CK Iイソ体の一部あるいは全部と、転写要素のDNA
結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含む第一融合
体をコードする第一ハイブリッドDNA配列を宿主細胞に
て発現し、 ｃ）公知のCK Iイソ体が結合したとタンパク質の一部あ
るいは全部と、第一融合体には含まれていない転写要素
のDNA結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含む第
二融合体をコードする第二ハイブリッドDNA配列を宿主
細胞にて発現し、 ｄ）阻害剤と推定される化合物を細胞に接触せしめ、お
よび ｅ）調節化合物無しでレポーター遺伝子生成物を生成し
た場合と比較して、異なるレポーター遺伝子生成物を生
成せしめる調節化合物を同定する、工程を含むものであ
る。
るタンパク質との間での相互作用を阻害する小さな分子
の同定を許容する。小さな分子阻害剤を同定するための
好ましい方法によれば、以下の工程、すなわち、 ａ）DNA結合領域と活性化領域を含む転写要素によって
調節されたプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を
含むDNA構築体で適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 ｂ）CK Iイソ体の一部あるいは全部と、転写要素のDNA
結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含む第一融合
体をコードする第一ハイブリッドDNA配列を宿主細胞に
て発現し、 ｃ）公知のCK Iイソ体が結合したとタンパク質の一部あ
るいは全部と、第一融合体には含まれていない転写要素
のDNA結合領域あるいは活性化領域のいずれかを含む第
二融合体をコードする第二ハイブリッドDNA配列を宿主
細胞にて発現し、 ｄ）阻害剤と推定される化合物を細胞に接触せしめ、お
よび ｅ）調節化合物無しでレポーター遺伝子生成物を生成し
た場合と比較して、異なるレポーター遺伝子生成物を生
成せしめる調節化合物を同定する、工程を含むものであ
る。
CK Iイソ体に結合するタンパク質を検出するための本
発明による他の同定方法は、以下の工程、すなわち、 ａ）タンパク質に結合したものと推定されるCK Iイソ体
と対応レセプターと顕著で特異的なアフィニティー結合
できるリガンドとの間にある融合体をコードするハイブ
リッドDNA配列で適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 ｂ）適切な条件下で、そのハイブリッドDNA配列を宿主
細胞にて発現し、 ｃ）宿主細胞にて発現した融合タンパク質を、固定化し
た形態で、融合タンパク質を特異的な対応レセプターに
曝すことで固定化し、 ｄ）CK Iイソ体を固定化した融合タンパク質に接触し、
および ｅ）CK Iイソ体に特異的な試薬を用いて、融合タンパク
質に結合したCK Iイソ体を検出する、工程を含むもので
ある。
発明による他の同定方法は、以下の工程、すなわち、 ａ）タンパク質に結合したものと推定されるCK Iイソ体
と対応レセプターと顕著で特異的なアフィニティー結合
できるリガンドとの間にある融合体をコードするハイブ
リッドDNA配列で適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 ｂ）適切な条件下で、そのハイブリッドDNA配列を宿主
細胞にて発現し、 ｃ）宿主細胞にて発現した融合タンパク質を、固定化し
た形態で、融合タンパク質を特異的な対応レセプターに
曝すことで固定化し、 ｄ）CK Iイソ体を固定化した融合タンパク質に接触し、
および ｅ）CK Iイソ体に特異的な試薬を用いて、融合タンパク
質に結合したCK Iイソ体を検出する、工程を含むもので
ある。
この方法の実施にあたって好ましいリガンド／対応レ
セプターの組み合わせとしては、グルタチオン−Ｓ−転
移酵素／グルタチオン、赤血球凝集素／赤血球凝集素に
特異的な抗体、ポリヒスチジン／ニッケル、およびマル
トースが結合したタンパク質／アミロースがある。
セプターの組み合わせとしては、グルタチオン−Ｓ−転
移酵素／グルタチオン、赤血球凝集素／赤血球凝集素に
特異的な抗体、ポリヒスチジン／ニッケル、およびマル
トースが結合したタンパク質／アミロースがある。
また、本発明は、TIHタンパク質に固有のCK Iおよび
／またはHRR25−結合特性を有するTIHタンパク質および
その変異体（すなわち、削除、付加あるいは置換類似
体）をコードする新規の精製および単離したポリヌクレ
オチド（例えば、センス鎖ならびにアンチセンス鎖双方
を含む、DNA配列ならびにRNA転写物）を提供する。本発
明の好ましいDNA分子は、cDNA、ゲノミックDNA、および
全部あるいは部分的に化学合成されたDNA分子を含む。
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号:3（TIH1）、５
（TIH2）および７（TIH3）それぞれのポリペプチドをコ
ードする配列番号:2（TIH1）、４（TIH2）および６（TI
H3）に記載のDNA分子である。さらに、一つ以上の相同
あるいは異種転写調節要素に機能的に結合した配列をコ
ードするTIHポリペプチドを含む組換えプラスミドおよ
びウィルスDNA構築物（発現用構築体）も提供される。
／またはHRR25−結合特性を有するTIHタンパク質および
その変異体（すなわち、削除、付加あるいは置換類似
体）をコードする新規の精製および単離したポリヌクレ
オチド（例えば、センス鎖ならびにアンチセンス鎖双方
を含む、DNA配列ならびにRNA転写物）を提供する。本発
明の好ましいDNA分子は、cDNA、ゲノミックDNA、および
全部あるいは部分的に化学合成されたDNA分子を含む。
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号:3（TIH1）、５
（TIH2）および７（TIH3）それぞれのポリペプチドをコ
ードする配列番号:2（TIH1）、４（TIH2）および６（TI
H3）に記載のDNA分子である。さらに、一つ以上の相同
あるいは異種転写調節要素に機能的に結合した配列をコ
ードするTIHポリペプチドを含む組換えプラスミドおよ
びウィルスDNA構築物（発現用構築体）も提供される。
本発明の他の態様として、TIHポリペプチドあるいは
その変異体を発現する本発明のDNA配列で形質転換ある
いは形質変換した原核あるいは真核宿主細胞が提供され
る。本発明の宿主細胞は、TIHポリペプチドの大規模生
産に特に有用であり、宿主細胞あるいは宿主細胞を成長
せしめた培地から単離することができる。
その変異体を発現する本発明のDNA配列で形質転換ある
いは形質変換した原核あるいは真核宿主細胞が提供され
る。本発明の宿主細胞は、TIHポリペプチドの大規模生
産に特に有用であり、宿主細胞あるいは宿主細胞を成長
せしめた培地から単離することができる。
本発明によって、精製および単離したTIHポリペプチ
ド、ポリペプチド断片およびその変異体も提供される。
好ましいTIHポリペプチドは、配列番号:3（TIH1）、５
（TIH2）および７（TIH3）に記載のものである。本発明
による新規のTIHおよびTIH変異体は、自然界から単離物
として取得できるが、好ましくは、本発明の宿主細胞を
用いた組換え手法により生成される。
ド、ポリペプチド断片およびその変異体も提供される。
好ましいTIHポリペプチドは、配列番号:3（TIH1）、５
（TIH2）および７（TIH3）に記載のものである。本発明
による新規のTIHおよびTIH変異体は、自然界から単離物
として取得できるが、好ましくは、本発明の宿主細胞を
用いた組換え手法により生成される。
組換え生成および／または単離後の処置に見合うよう
に選択した宿主細胞を変更することで、翻訳後処置にて
TIHポリペプチドの変異体が得られる。本発明の変異TIH
ポリペプチドは、一つ以上のアミノ酸が削除あるいは置
換され、（１）損失を伴わずに、好ましくは、TIHポリ
ペプチドに特異的な生物学的特性あるいは生物化学的特
徴が改善され、あるいは（２）特徴的なタンパク質／タ
ンパク質の相互作用が特異的に解消された類似体を含
む。
に選択した宿主細胞を変更することで、翻訳後処置にて
TIHポリペプチドの変異体が得られる。本発明の変異TIH
ポリペプチドは、一つ以上のアミノ酸が削除あるいは置
換され、（１）損失を伴わずに、好ましくは、TIHポリ
ペプチドに特異的な生物学的特性あるいは生物化学的特
徴が改善され、あるいは（２）特徴的なタンパク質／タ
ンパク質の相互作用が特異的に解消された類似体を含
む。
TIHポリペプチドと特異的な免疫反応性を示す抗体基
質（例えば、モノクローナルならびにポリクローナル抗
体、一本鎖抗体、キメラ抗体、CDR−移植した抗体な
ど）も、本発明に包含される。抗体基質は、例えば、TI
Hポリペプチドをコードする相同性あるいは非相同性の
ポリヌクレオチドの免疫発現スクリーニングを介して、
TIHポリペプチドを精製および単離する上で有用であ
る。TIHポリペプチドに特異的な抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞系も、本発明に包含される。モノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマを得るための技術は、
当該技術分野で周知のものである。精製したTIHポリペ
プチドあるいはその変異株で動物を免疫処置した後に、
ハイブリドーマ細胞系は生成する。
質（例えば、モノクローナルならびにポリクローナル抗
体、一本鎖抗体、キメラ抗体、CDR−移植した抗体な
ど）も、本発明に包含される。抗体基質は、例えば、TI
Hポリペプチドをコードする相同性あるいは非相同性の
ポリヌクレオチドの免疫発現スクリーニングを介して、
TIHポリペプチドを精製および単離する上で有用であ
る。TIHポリペプチドに特異的な抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞系も、本発明に包含される。モノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマを得るための技術は、
当該技術分野で周知のものである。精製したTIHポリペ
プチドあるいはその変異株で動物を免疫処置した後に、
ハイブリドーマ細胞系は生成する。
本発明でのDNAおよびアミノ酸配列の開示を通じて寄
与した情報の科学的価値は、明らかである。その例の一
つとして、酵母TIHポリペプチドをコードするゲノミッ
クDNAの知識は、酵母ポリペプチドの相同体を検出する
ための、他の種のcDNAあるいはゲノミックDNAのスクリ
ーニングを許容する。DNA/DNAおよび／またはDNA/RNAハ
イブリダイゼーションおよびPCR増幅を含むスクリーニ
ング手法は、当該技術分野にて標準のものであり、酵母
TIHポリペプチドの対応異種体の単離ならびにこれら相
同体を発現する細胞型の決定において有用である。
与した情報の科学的価値は、明らかである。その例の一
つとして、酵母TIHポリペプチドをコードするゲノミッ
クDNAの知識は、酵母ポリペプチドの相同体を検出する
ための、他の種のcDNAあるいはゲノミックDNAのスクリ
ーニングを許容する。DNA/DNAおよび／またはDNA/RNAハ
イブリダイゼーションおよびPCR増幅を含むスクリーニ
ング手法は、当該技術分野にて標準のものであり、酵母
TIHポリペプチドの対応異種体の単離ならびにこれら相
同体を発現する細胞型の決定において有用である。
本発明のDNAおよびアミノ酸配列は、キナーゼ／タン
パク質相互作用に活発に関与するTIHエピトープ、なら
びにかような相互作用を調節するエピトープの解析も可
能とする。プロテインキナーゼ−タンパク質基質の相互
作用、プロテインキナーゼ−調節サブユニットの相互作
用、および／またはプロテインキナーゼ−タンパク質局
在分子の相互作用を、防ぎ、阻害し、あるいは模倣する
これらエピトープに特異的な薬剤（例えば、抗体、ペプ
チド、あるいは小分子）の開発も本発明に包含される。
これら薬剤を含む治療用組成物は、健康な状態ならびに
疾患状態、例えば、癌およびウィルス関連疾患での細胞
成長を含めた、CK I/TIHタンパク質の相互作用を調節す
る上で有用である。
パク質相互作用に活発に関与するTIHエピトープ、なら
びにかような相互作用を調節するエピトープの解析も可
能とする。プロテインキナーゼ−タンパク質基質の相互
作用、プロテインキナーゼ−調節サブユニットの相互作
用、および／またはプロテインキナーゼ−タンパク質局
在分子の相互作用を、防ぎ、阻害し、あるいは模倣する
これらエピトープに特異的な薬剤（例えば、抗体、ペプ
チド、あるいは小分子）の開発も本発明に包含される。
これら薬剤を含む治療用組成物は、健康な状態ならびに
疾患状態、例えば、癌およびウィルス関連疾患での細胞
成長を含めた、CK I/TIHタンパク質の相互作用を調節す
る上で有用である。
本願発明は、一般に、CK Iイソ体と相互作用するタン
パク質の同定のための方法に関し、TIHポリペプチドを
コードする遺伝子の単離と特徴付けに関する以下の実施
例において記載されている。具体的には、実施例１に
は、ジハイブリッド・スクリーニング法を用いた、酵母
ゲノミックライブラリーからの、TIHポリペプチドをコ
ードするDNA配列の単離を記している。実施例２は、TIH
ポリペプチドと様々な酵母CK Iイソ体の間での相互作用
に関する。実施例３は、変異体とその断片を含む酵母CK
Iイソ体とキナーゼの間での相互作用に関する。実施例
４は、TIHポリペプチドとヒトのCK Iイソ体の間での相
互作用の分析を記している。実施例５は、本発明のTIH
ポリペプチドをコードする全長のゲノミックDNA配列の
単離を記している。実施例６は、酵母でのTIHノックア
ウト変異体の構築を記している。実施例７は、アフィニ
ティー精製とウェスターンブロッティング法を用いた、
S.cerevisiae HRR25/TIHポリペプチドの相互作用の分析
を記している。実施例８は、TIH1と酸化的に損傷を受け
たヌクレオチドの分解に関与し、よって精製の精度が向
上したものと同定された酵素との間の、アミノ酸レベル
での比較を示している。
パク質の同定のための方法に関し、TIHポリペプチドを
コードする遺伝子の単離と特徴付けに関する以下の実施
例において記載されている。具体的には、実施例１に
は、ジハイブリッド・スクリーニング法を用いた、酵母
ゲノミックライブラリーからの、TIHポリペプチドをコ
ードするDNA配列の単離を記している。実施例２は、TIH
ポリペプチドと様々な酵母CK Iイソ体の間での相互作用
に関する。実施例３は、変異体とその断片を含む酵母CK
Iイソ体とキナーゼの間での相互作用に関する。実施例
４は、TIHポリペプチドとヒトのCK Iイソ体の間での相
互作用の分析を記している。実施例５は、本発明のTIH
ポリペプチドをコードする全長のゲノミックDNA配列の
単離を記している。実施例６は、酵母でのTIHノックア
ウト変異体の構築を記している。実施例７は、アフィニ
ティー精製とウェスターンブロッティング法を用いた、
S.cerevisiae HRR25/TIHポリペプチドの相互作用の分析
を記している。実施例８は、TIH1と酸化的に損傷を受け
たヌクレオチドの分解に関与し、よって精製の精度が向
上したものと同定された酵素との間の、アミノ酸レベル
での比較を示している。
実施例１
CK Iイソ体と相互作用する細胞成分を、酵母での転写
用のトランスアクティベーターを再構築するジハイブリ
ッドスクリーニング法によって同定した。〔同様の「２
−ハイブリッド」分析を当初は、Fields and Song,Natu
re,340:245−246（1989）にて、そして最近では、Yang
et al.,Science 257:681−682（1992）およびVojtek et
al.,Cell,74:205−214（1993）に記載されている。〕
この分析にて、「バイト」要素（すなわち、CK Iイソ
体）は、転写要素（例えば、lexAタンパク質）のDNA結
合領域に融合され、そして「プレイ」要素（すなわち、
CK I相互作用タンパク質）は、転写要素（例えば、GAL
4）のトランスアクティベーター領域に融合する。融合
タンパク質をコードする組み換えDNAは、転写要素に認
識されるプロモーター調節要素（例えば、lexA DNA結合
部位）に融合するレポーター遺伝子を含む宿主細胞にて
発現される。プレイ融合タンパク質のバイト融合タンパ
ク質への結合は、GAL4トランスアクティベーション領域
とlexA DNA結合領域を伴い、β−ガラクトシダーゼレポ
ーター遺伝子に隣接するlexA DNA結合部位を伴う複合体
との相互作用を許容し、転写用のトランスアクティベー
ターを再構築し、そして、β−ガラクトシダーゼ活性を
生成する。この方法の他の態様として、「プレイ」要素
は、GAL4のDNA結合領域と、GAL4のトランスアクティベ
ーション領域への融合によって検出および分析した「バ
イト」要素に融合できる。同様に、この方法に他の態様
は、「バイト」と「プレイ」要素の転写要素領域への融
合、すなわち、「バイト」と「プレイ」要素が、転写要
素領域のアミノ末端あるいはカルボキシ末端に融合され
る順序の変更を含む。
用のトランスアクティベーターを再構築するジハイブリ
ッドスクリーニング法によって同定した。〔同様の「２
−ハイブリッド」分析を当初は、Fields and Song,Natu
re,340:245−246（1989）にて、そして最近では、Yang
et al.,Science 257:681−682（1992）およびVojtek et
al.,Cell,74:205−214（1993）に記載されている。〕
この分析にて、「バイト」要素（すなわち、CK Iイソ
体）は、転写要素（例えば、lexAタンパク質）のDNA結
合領域に融合され、そして「プレイ」要素（すなわち、
CK I相互作用タンパク質）は、転写要素（例えば、GAL
4）のトランスアクティベーター領域に融合する。融合
タンパク質をコードする組み換えDNAは、転写要素に認
識されるプロモーター調節要素（例えば、lexA DNA結合
部位）に融合するレポーター遺伝子を含む宿主細胞にて
発現される。プレイ融合タンパク質のバイト融合タンパ
ク質への結合は、GAL4トランスアクティベーション領域
とlexA DNA結合領域を伴い、β−ガラクトシダーゼレポ
ーター遺伝子に隣接するlexA DNA結合部位を伴う複合体
との相互作用を許容し、転写用のトランスアクティベー
ターを再構築し、そして、β−ガラクトシダーゼ活性を
生成する。この方法の他の態様として、「プレイ」要素
は、GAL4のDNA結合領域と、GAL4のトランスアクティベ
ーション領域への融合によって検出および分析した「バ
イト」要素に融合できる。同様に、この方法に他の態様
は、「バイト」と「プレイ」要素の転写要素領域への融
合、すなわち、「バイト」と「プレイ」要素が、転写要
素領域のアミノ末端あるいはカルボキシ末端に融合され
る順序の変更を含む。
S.cerevisiae HRR25 CK Iプロテインキナーゼと相互
作用するタンパク質をコードする遺伝子を同定するため
に、酵母GAL4活性化領域とS.cerevisiaeゲノミック断片
（「プレイ」要素）との間の融合体をコードするプラス
ミドライブラリーを、HRR25（「バイト」要素）に融合
したE.coli lexA遺伝子を含んだDNA結合領域ハイブリッ
ドとの相互作用に関してスクリーニングした。酵母TRP1
遺伝子、２μ複製開始点、およびE.coli lexA DNA結合
領域（アミノ酸１〜202）の発現を駆動する酵母ADH Iプ
ロモーターを含むプラスミドpBTM116（SUNY社のBartel
およびFieldsから寄贈された）にて融合体を構築した。
作用するタンパク質をコードする遺伝子を同定するため
に、酵母GAL4活性化領域とS.cerevisiaeゲノミック断片
（「プレイ」要素）との間の融合体をコードするプラス
ミドライブラリーを、HRR25（「バイト」要素）に融合
したE.coli lexA遺伝子を含んだDNA結合領域ハイブリッ
ドとの相互作用に関してスクリーニングした。酵母TRP1
遺伝子、２μ複製開始点、およびE.coli lexA DNA結合
領域（アミノ酸１〜202）の発現を駆動する酵母ADH Iプ
ロモーターを含むプラスミドpBTM116（SUNY社のBartel
およびFieldsから寄贈された）にて融合体を構築した。
LexA::HRR25融合遺伝子を含んだプラスミドpBTM116::
HRR25を数工程を経て構築した。開始メチオニンとHRR25
の第二アミノ酸をコードするDNA配列を、Bio−Rad社
（リッチモンド、カリフォルニア州）のMutaGene変異用
キットを用いた特定部位の突然変異誘発により、Sma I
制限部位に変換した。HRR25のDNA配列を、配列番号:8に
記載した。突然変異のために用いたオリゴヌクレオチド
を以下に示し、Sma I部位には下線を付した。
HRR25を数工程を経て構築した。開始メチオニンとHRR25
の第二アミノ酸をコードするDNA配列を、Bio−Rad社
（リッチモンド、カリフォルニア州）のMutaGene変異用
キットを用いた特定部位の突然変異誘発により、Sma I
制限部位に変換した。HRR25のDNA配列を、配列番号:8に
記載した。突然変異のために用いたオリゴヌクレオチド
を以下に示し、Sma I部位には下線を付した。
Sma Iで消化した後、得られた改変したHRR25遺伝子
を、lexA::HRR25融合体を生成するために、プラスミドp
BTM116のSma I部位に連結した。
を、lexA::HRR25融合体を生成するために、プラスミドp
BTM116のSma I部位に連結した。
バイトおよびプレイ融合タンパク質の間の相互作用
が、lacZの転写を指示するlexA結合部位を有する酵母レ
ポーター株CTY10−5d（遺伝子型＝MATa ade2 trp1−901
leu2−3,112 his3−200 gal4 gal80 URA3::lexA op−l
acZ.）［Luban,et al.,Cell 73:1067−1078（1993）］
にて検出された。CTY10−5d株は、酢酸リチウムが介在
した形質転換により、まず、プラスミドpBTM116::HRR25
により形質転換した［Ito,et al.,J.Bacteriol.153:163
−168（1983）］。そして、得られた形質転換体を、プ
ラスミドpCAD［Chien,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci（US
A）21:9578−9582（1991）］にてGAL4融合体として調製
したプレイ酵母ゲノミックライブラリーで形質転換し、
HRR25との相互作用に関して、ライブラリーから発現し
たタンパク質をスクリーニングした。ニトロセルロース
膜にレプリカ培養し、液体窒素で急速凍結して複製した
コロニーを溶解し、青色発色基質である５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−gal）と共に溶解したコロニーをインキュベートする
ことで、β−ガラクトシダーゼ発現に関して総計50,000
個の二重形質転換体を分析した。β−ガラクトシダーゼ
活性を、0.002％の濃度のＸ−galを含んだＺ緩衝液（0.
06M Na2HPO4、0.04M NaH2PO4、0.01M KCl、0.001M MgSO
4、0.05M β−メルカプトエタノール）を用いて測定し
た〔Guarente,Meth.Enzymol.101:181−191（1983）］。
1M炭酸ナトリウム上にフィルターを浮かせることで反応
を停止し、陽性コロニーは深青色によって同定された。
が、lacZの転写を指示するlexA結合部位を有する酵母レ
ポーター株CTY10−5d（遺伝子型＝MATa ade2 trp1−901
leu2−3,112 his3−200 gal4 gal80 URA3::lexA op−l
acZ.）［Luban,et al.,Cell 73:1067−1078（1993）］
にて検出された。CTY10−5d株は、酢酸リチウムが介在
した形質転換により、まず、プラスミドpBTM116::HRR25
により形質転換した［Ito,et al.,J.Bacteriol.153:163
−168（1983）］。そして、得られた形質転換体を、プ
ラスミドpCAD［Chien,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci（US
A）21:9578−9582（1991）］にてGAL4融合体として調製
したプレイ酵母ゲノミックライブラリーで形質転換し、
HRR25との相互作用に関して、ライブラリーから発現し
たタンパク質をスクリーニングした。ニトロセルロース
膜にレプリカ培養し、液体窒素で急速凍結して複製した
コロニーを溶解し、青色発色基質である５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−gal）と共に溶解したコロニーをインキュベートする
ことで、β−ガラクトシダーゼ発現に関して総計50,000
個の二重形質転換体を分析した。β−ガラクトシダーゼ
活性を、0.002％の濃度のＸ−galを含んだＺ緩衝液（0.
06M Na2HPO4、0.04M NaH2PO4、0.01M KCl、0.001M MgSO
4、0.05M β−メルカプトエタノール）を用いて測定し
た〔Guarente,Meth.Enzymol.101:181−191（1983）］。
1M炭酸ナトリウム上にフィルターを浮かせることで反応
を停止し、陽性コロニーは深青色によって同定された。
HRR25/DNA結合領域融合タンパク質（バイト構築体）
の存在に依存するレポーター株を青色に染める、ライブ
ラリー融合プラスミド（プレイ構築体）を同定した。各
ライブラリープラスミドの融合部位に近接する配列を、
GAL4領域からDNAを伸長することで決定した。使用した
プライマーの配列を以下に示した。
の存在に依存するレポーター株を青色に染める、ライブ
ラリー融合プラスミド（プレイ構築体）を同定した。各
ライブラリープラスミドの融合部位に近接する配列を、
GAL4領域からDNAを伸長することで決定した。使用した
プライマーの配列を以下に示した。
SequenaseバージョンIIキット（US Biochemicals社、
クリーブランド、オハイオ州）あるいはABI373A配列解
析機（Applied Biosystems社、フォスター シティー、
カリフォルニア州）による自動DNA解析機によって、DNA
配列を決定した。
クリーブランド、オハイオ州）あるいはABI373A配列解
析機（Applied Biosystems社、フォスター シティー、
カリフォルニア州）による自動DNA解析機によって、DNA
配列を決定した。
四つのライブラリー・クローンが同定され、それがコ
ードするタンパク質を、HRR25様プロテインキナーゼイ
ソ体と相互作用する目標としての意味から、TIHタンパ
ク質１〜４と命名した。TIH1クローン挿入体のTIH1部分
は、配列番号:2の1528〜2580位のヌクレオチドに対応
し;TIH2クローン挿入体のTIH2部分は、配列番号:4の261
1〜4053位のヌクレオチドに対応し;TIH3クローン挿入体
のTIH3部分は、配列番号:6の248〜696位のヌクレオチド
に対応し；そして、TIH4クローン挿入体のTIH4部分は配
列番号:11に記載されたものであり、配列番号:28の1763
〜2305位のヌクレオチドに対応する。TIH遺伝子のDNA配
列解析に基づいて、TIH1とTIH3が、GenBank（1993年７
月８日）に登録されたいずれの断片とも符合しないこと
から、新規の配列であると決定された。TIH2配列は、デ
ータベースに登録された、同定された機能を有しない酵
母の読取枠に類似するものであると同定された。（GenB
ank受託No.Z23261、読取枠YBL0506）TIH4は、GAL4とキ
ナーゼ様タンパク質KIP2のカルボキシ末端部分の間にあ
る融合タンパク質である。KIP2は、キナーゼ様の微小管
に基づいたモーター領域を含む、高度な保存領域を有し
ている〔Roof,et al.,J.Cell.Biol.118（１）:95−108
（1992）〕。対応するTIH1からTIH3のゲノミッククロー
ンの全長の単離を、実施例５に記した。
ードするタンパク質を、HRR25様プロテインキナーゼイ
ソ体と相互作用する目標としての意味から、TIHタンパ
ク質１〜４と命名した。TIH1クローン挿入体のTIH1部分
は、配列番号:2の1528〜2580位のヌクレオチドに対応
し;TIH2クローン挿入体のTIH2部分は、配列番号:4の261
1〜4053位のヌクレオチドに対応し;TIH3クローン挿入体
のTIH3部分は、配列番号:6の248〜696位のヌクレオチド
に対応し；そして、TIH4クローン挿入体のTIH4部分は配
列番号:11に記載されたものであり、配列番号:28の1763
〜2305位のヌクレオチドに対応する。TIH遺伝子のDNA配
列解析に基づいて、TIH1とTIH3が、GenBank（1993年７
月８日）に登録されたいずれの断片とも符合しないこと
から、新規の配列であると決定された。TIH2配列は、デ
ータベースに登録された、同定された機能を有しない酵
母の読取枠に類似するものであると同定された。（GenB
ank受託No.Z23261、読取枠YBL0506）TIH4は、GAL4とキ
ナーゼ様タンパク質KIP2のカルボキシ末端部分の間にあ
る融合タンパク質である。KIP2は、キナーゼ様の微小管
に基づいたモーター領域を含む、高度な保存領域を有し
ている〔Roof,et al.,J.Cell.Biol.118（１）:95−108
（1992）〕。対応するTIH1からTIH3のゲノミッククロー
ンの全長の単離を、実施例５に記した。
実施例２
相互作用の特異性と、CK Iイソ体とTIHタンパク質と
の間の相互作用領域を研究するために、変異体、HRR25
イソ体断片、あるいはlexA DNA結合領域に融合した他の
酵母（NUF1およびHhp1）CK Iイソ体を含むバイト構築体
を、ジハイブリッド分析における転写の活性化強度に関
して試験した。
の間の相互作用領域を研究するために、変異体、HRR25
イソ体断片、あるいはlexA DNA結合領域に融合した他の
酵母（NUF1およびHhp1）CK Iイソ体を含むバイト構築体
を、ジハイブリッド分析における転写の活性化強度に関
して試験した。
プラスミド構築体
触媒的に不活性なHRR25プロテインキナーゼを含んだ
プラスミドを構築するために、HRR25〔DeMaggio et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）89（15）:7008−7012
（1992）〕の第38位（ATP結合部位）でのリシンからア
ルギニンへの変異をコードするHRR25 DNAを、標準的な
特定部位の突然変異誘発法によって生成した。得られた
DNAを、突然変異用のオリゴヌクレオチド； BamH I部位（下線部）を挿入した下流のオリゴヌクレ
オチド； を用いて、HRR25 ATGの前にSma I制限部位（配列番
号:12の下線部）を挿入するPCR反応によって増幅した。
プラスミドを構築するために、HRR25〔DeMaggio et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）89（15）:7008−7012
（1992）〕の第38位（ATP結合部位）でのリシンからア
ルギニンへの変異をコードするHRR25 DNAを、標準的な
特定部位の突然変異誘発法によって生成した。得られた
DNAを、突然変異用のオリゴヌクレオチド； BamH I部位（下線部）を挿入した下流のオリゴヌクレ
オチド； を用いて、HRR25 ATGの前にSma I制限部位（配列番
号:12の下線部）を挿入するPCR反応によって増幅した。
反応には、200mM Tris−HCl（pH8.2）、100mM KCl、6
0mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％ Triton X−100、0.
5μＭプライマー、100ngテンプレート、200μM dNTPお
よび2.5単位のポリメラーゼを用いた。この反応を、30
サイクル実施した。反応を94℃で４分間の処置から開始
し、すべてのサイクルを、変性のために94℃で１分間、
アニーリングのために50℃で２分間、および伸長のため
の72℃で４分間の処置を含むようにした。
0mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％ Triton X−100、0.
5μＭプライマー、100ngテンプレート、200μM dNTPお
よび2.5単位のポリメラーゼを用いた。この反応を、30
サイクル実施した。反応を94℃で４分間の処置から開始
し、すべてのサイクルを、変性のために94℃で１分間、
アニーリングのために50℃で２分間、および伸長のため
の72℃で４分間の処置を含むようにした。
得られた増幅生成物をSma Iで消化し、HRR25配列の5'
端に融合したlexA配列をコードするpBTM116::HRR25K→
Ｒと称するプラスミドを生成するために、pBTM116のSma
I部位に連結した。
端に融合したlexA配列をコードするpBTM116::HRR25K→
Ｒと称するプラスミドを生成するために、pBTM116のSma
I部位に連結した。
HRR25の触媒領域断片をコードするpBTM116プラスミド
を構築するために、開始ATGとHRR25 DNAの第二コドンの
代わりにSma I部位を、また、（配列番号:8の）1161位
のヌクレオチドあるいはHRR25の397位のアミノ酸にBamH
I部位をもたらすように、特定部位の突然変異誘発を二
度行った。5'Sma I制限部位（下線部）をもたらす突然
変異用のオリゴヌクレオチドは； 3'あるいは下流に、BamH I部位（下線部）を397位に
挿入するために用いたオリゴヌクレオチドは； 得られた生成物をSma I−BamH Iで消化し、（配列番
号:8の第２位〜第1168位のヌクレオチドに相当する）HR
R25触媒領域をコードする断片を、HRR25配列の5'端に融
合したlexA配列をコードするpBTM116::HRR25キナーゼ領
域と称するプラスミドを生成するために、同じ酵素で線
状化したプラスミドpBTM116にサブクローニングした。
を構築するために、開始ATGとHRR25 DNAの第二コドンの
代わりにSma I部位を、また、（配列番号:8の）1161位
のヌクレオチドあるいはHRR25の397位のアミノ酸にBamH
I部位をもたらすように、特定部位の突然変異誘発を二
度行った。5'Sma I制限部位（下線部）をもたらす突然
変異用のオリゴヌクレオチドは； 3'あるいは下流に、BamH I部位（下線部）を397位に
挿入するために用いたオリゴヌクレオチドは； 得られた生成物をSma I−BamH Iで消化し、（配列番
号:8の第２位〜第1168位のヌクレオチドに相当する）HR
R25触媒領域をコードする断片を、HRR25配列の5'端に融
合したlexA配列をコードするpBTM116::HRR25キナーゼ領
域と称するプラスミドを生成するために、同じ酵素で線
状化したプラスミドpBTM116にサブクローニングした。
HRR25の非触媒領域断片を含むpBTM116プラスミドを構
築するために、以下のオリゴヌクレオチド； を用いた特定部位の突然変異誘発によって、第885位
のヌクレオチド（第295位のアミノ酸）にSma I部位（下
線部）を導入した。
築するために、以下のオリゴヌクレオチド； を用いた特定部位の突然変異誘発によって、第885位
のヌクレオチド（第295位のアミノ酸）にSma I部位（下
線部）を導入した。
得られた生成物をSma IとBamH Iで消化し、（配列番
号:8の第885位〜第1485位のヌクレオチドに相当する）H
RR25非触媒領域をコードする断片を、HRR25配列の5'端
に融合したlexA配列をコードするpBTM116::非触媒と称
するプラスミドを生成するために、同じ酵素で線状化し
たプラスミドpBTM116にサブクローニングした。
号:8の第885位〜第1485位のヌクレオチドに相当する）H
RR25非触媒領域をコードする断片を、HRR25配列の5'端
に融合したlexA配列をコードするpBTM116::非触媒と称
するプラスミドを生成するために、同じ酵素で線状化し
たプラスミドpBTM116にサブクローニングした。
プラスミドpBTM116中のCK IのS.cerevisiae NUF1イソ
体を用いて融合体を構築するために、オリゴヌクレオチ
ド； を用いて、NUF1 DNA（配列番号:17）の開始ATGと第二
コドンの代わりに特定部位の突然変異誘発によって、Sm
a I部位（下線部）を導入した。
体を用いて融合体を構築するために、オリゴヌクレオチ
ド； を用いて、NUF1 DNA（配列番号:17）の開始ATGと第二
コドンの代わりに特定部位の突然変異誘発によって、Sm
a I部位（下線部）を導入した。
得られた生成物をSma IとBamH Iで消化し、NUF1配列
の5'端に融合したlexA配列をコードするpBTM116::NUF1
と称するプラスミドを生成するために、同じ酵素で線状
化したプラスミドpBTM116にNUF1断片を連結した。
の5'端に融合したlexA配列をコードするpBTM116::NUF1
と称するプラスミドを生成するために、同じ酵素で線状
化したプラスミドpBTM116にNUF1断片を連結した。
プラスミドpBTM116中のCK IのS.pombe Hhp1イソ体を
用いて融合体を構築するために、オリゴヌクレオチド； を用いて、Hhp1 DNA（配列番号:19）の開始ATGと第二
コドンの代わりに特定部位の突然変異誘発によって、Sm
a I部位（下線部）を導入した。
用いて融合体を構築するために、オリゴヌクレオチド； を用いて、Hhp1 DNA（配列番号:19）の開始ATGと第二
コドンの代わりに特定部位の突然変異誘発によって、Sm
a I部位（下線部）を導入した。
得られた生成物をSma IとBamH Iで消化し、Nhp1配列
の5'端に融合したlexA配列をコードするプラスミドpBTM
116::Hhp1を生成するために、同じ酵素で線状化したプ
ラスミドpBTM116にHhp1断片を連結した。
の5'端に融合したlexA配列をコードするプラスミドpBTM
116::Hhp1を生成するために、同じ酵素で線状化したプ
ラスミドpBTM116にHhp1断片を連結した。
分 析
野性型ならびに変異型CK Iイソ体と本発明のTIHタン
パク質との間のタンパク質／タンパク質相互作用レベル
を測定するために、イソ体とTIHタンパク質のすべての
組み合わせを含む酵母株ができるように標準的な酵母交
配法を用いた。pBTM116に基づいたプラスミドをコード
するすべてのCK Iイソ体を、酢酸リチウムが介在した形
質転換法により酵母へ形質転換され、形質転換体をSD−
トリプトファン培地（Bio101、ラヨラ、カリフォルニア
州）にて選抜した。pBTM116に基づいた形質転換のため
に用いた酵母株CTY10−5dは、タイプαと交配した。実
施例１に記載したpGADに基づいたプラスミドがコードす
るすべてのTIHタンパク質は、酢酸リチウムを用いた方
法により酵母へ形質転換され、形質転換体をSD−ロイシ
ン培地にて選抜した。
パク質との間のタンパク質／タンパク質相互作用レベル
を測定するために、イソ体とTIHタンパク質のすべての
組み合わせを含む酵母株ができるように標準的な酵母交
配法を用いた。pBTM116に基づいたプラスミドをコード
するすべてのCK Iイソ体を、酢酸リチウムが介在した形
質転換法により酵母へ形質転換され、形質転換体をSD−
トリプトファン培地（Bio101、ラヨラ、カリフォルニア
州）にて選抜した。pBTM116に基づいた形質転換のため
に用いた酵母株CTY10−5dは、タイプαと交配した。実
施例１に記載したpGADに基づいたプラスミドがコードす
るすべてのTIHタンパク質は、酢酸リチウムを用いた方
法により酵母へ形質転換され、形質転換体をSD−ロイシ
ン培地にて選抜した。
pGADに基づいた形質転換のために用いた酵母株は、タ
イプａと交配した。このMATa株はCTY10−5dと同系であ
り、これは、酢酸リチウムが介在した形質転換法によ
り、プラスミドpGALHO〔Jenson and Herskowitz、Meth.
Enzymol.194:132−146（1991）〕を用いてHO遺伝子を導
入し、交配タイプの相互変換を起こすためにガラクトー
スでHO遺伝子を誘発し、そして、変換した交配タイプを
有する誘発体を単離するために株を非選択的に成長させ
ることで構築した。
イプａと交配した。このMATa株はCTY10−5dと同系であ
り、これは、酢酸リチウムが介在した形質転換法によ
り、プラスミドpGALHO〔Jenson and Herskowitz、Meth.
Enzymol.194:132−146（1991）〕を用いてHO遺伝子を導
入し、交配タイプの相互変換を起こすためにガラクトー
スでHO遺伝子を誘発し、そして、変換した交配タイプを
有する誘発体を単離するために株を非選択的に成長させ
ることで構築した。
pBTM116に基づいたプラスミドとpGADに基づいたプラ
スミドとの間の対合する組み合わせを構築するために、
対向する交配タイプの酵母株をYEPD培地（Bio101）の交
差パターン上にレプリカ培養し、18時間にわたって交配
させた。pBTM116タイプならびにpGADタイププラスミド
の双方を含んだ細胞を選択するために、SD−ロイシン、
SD−トリプトファン培地にて二度目のレプリカ培養を行
って二倍体細胞を選択した。単離した二倍体をSD−ロイ
シン、SD−トリプトファン液体培地にて、２×107細胞/
mlの細胞密度にまで成長させ、β−ガラクトシダーゼ活
性によって測定した、キナーゼと相互作用するタンパク
質の相互作用のレベルを、Ｚ緩衝液の0.1mlに懸濁した
２×106個の細胞に、３滴のクロロホルムと50μｌの0.1
％ SDS、次いで、発色基質であるｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシドの0.2mlを加えることで溶解した
細胞を用いて決定した。0.5mlの1M炭酸ナトリウムを加
えることでβ−ガラクトシダーゼ分析を終了し、その活
性を、Milton Roy分光光度計（ロチェスター、ニューヨ
ーク州）を用いて420nmでの吸光度で測定した。この分
析にて、タンパク質／タンパク質相互作用の程度は、β
−ガラクトシダーゼ活性のレベルと直接的に比例してい
た。β−ガラクトシダーゼ活性の相対値を、表１に示し
た。表中、＜５の値はβ−ガラクトシダーゼ活性のレベ
ルがバックグラウンドに及ぶものでなく、また10の値は
容易に検出できる活性のレベルであることを示してい
る。数値は、ベクターのみの対照によって標準化されて
いる。
スミドとの間の対合する組み合わせを構築するために、
対向する交配タイプの酵母株をYEPD培地（Bio101）の交
差パターン上にレプリカ培養し、18時間にわたって交配
させた。pBTM116タイプならびにpGADタイププラスミド
の双方を含んだ細胞を選択するために、SD−ロイシン、
SD−トリプトファン培地にて二度目のレプリカ培養を行
って二倍体細胞を選択した。単離した二倍体をSD−ロイ
シン、SD−トリプトファン液体培地にて、２×107細胞/
mlの細胞密度にまで成長させ、β−ガラクトシダーゼ活
性によって測定した、キナーゼと相互作用するタンパク
質の相互作用のレベルを、Ｚ緩衝液の0.1mlに懸濁した
２×106個の細胞に、３滴のクロロホルムと50μｌの0.1
％ SDS、次いで、発色基質であるｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシドの0.2mlを加えることで溶解した
細胞を用いて決定した。0.5mlの1M炭酸ナトリウムを加
えることでβ−ガラクトシダーゼ分析を終了し、その活
性を、Milton Roy分光光度計（ロチェスター、ニューヨ
ーク州）を用いて420nmでの吸光度で測定した。この分
析にて、タンパク質／タンパク質相互作用の程度は、β
−ガラクトシダーゼ活性のレベルと直接的に比例してい
た。β−ガラクトシダーゼ活性の相対値を、表１に示し
た。表中、＜５の値はβ−ガラクトシダーゼ活性のレベ
ルがバックグラウンドに及ぶものでなく、また10の値は
容易に検出できる活性のレベルであることを示してい
る。数値は、ベクターのみの対照によって標準化されて
いる。
この結果は、HRR25プロテインキナーゼとTIH遺伝子と
の間の顕著な相互作用を示している。さらに、相互作用
においては活性なプロテインキナーゼが必要であり、ま
た、TIHタンパク質と相互作用するHRR25の領域は、HRR2
5のプロテインキナーゼ領域に局在しているようであ
る。本発明のTIHタンパク質も、他のCK Iイソ体と相互
作用した。例えば、TIH3がNUF1と、そして、TIH2とTIH3
がHhp1と相互作用した。
の間の顕著な相互作用を示している。さらに、相互作用
においては活性なプロテインキナーゼが必要であり、ま
た、TIHタンパク質と相互作用するHRR25の領域は、HRR2
5のプロテインキナーゼ領域に局在しているようであ
る。本発明のTIHタンパク質も、他のCK Iイソ体と相互
作用した。例えば、TIH3がNUF1と、そして、TIH2とTIH3
がHhp1と相互作用した。
実施例３
HRR25変異体（hrr25）は染色体分離欠陥を示し、また
キネシンが染色体分離に関与しているので、実施例２に
記載のCK Iバイト融合体といくつかの異なるキネシンと
の相互作用を研究した。今日までに、酵母のキネシン科
には、KIP1（Roof,et al.,前出）、KIP2（Roof,et al.,
前出）、CIN8〔Hoyt et al.,J.Cell.Biol.11（１）:109
−120（1992）〕およびKAR3〔Meluh et al.,Cell 60
（６）:1029−1041（1990）〕と命名されたタンパク質
が含まれる。プレイ・キネシン融合プラスミドを構築す
るために、KIP1、KIP2、CIN8およびKAR3のゲノミックク
ローンをまず単離し、GAL4のトランスアクティベート領
域を含むプラスミドpGADへサブクローニングした。CK I
バイト融合体と実施例１に記載のTIH4プレイ融合体（pG
AD::TIH4）との相互作用についても同時に検討した。
キネシンが染色体分離に関与しているので、実施例２に
記載のCK Iバイト融合体といくつかの異なるキネシンと
の相互作用を研究した。今日までに、酵母のキネシン科
には、KIP1（Roof,et al.,前出）、KIP2（Roof,et al.,
前出）、CIN8〔Hoyt et al.,J.Cell.Biol.11（１）:109
−120（1992）〕およびKAR3〔Meluh et al.,Cell 60
（６）:1029−1041（1990）〕と命名されたタンパク質
が含まれる。プレイ・キネシン融合プラスミドを構築す
るために、KIP1、KIP2、CIN8およびKAR3のゲノミックク
ローンをまず単離し、GAL4のトランスアクティベート領
域を含むプラスミドpGADへサブクローニングした。CK I
バイト融合体と実施例１に記載のTIH4プレイ融合体（pG
AD::TIH4）との相互作用についても同時に検討した。
プラスミド構築
以下の二つのプライマー；
を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからKIP1配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付け（Boehringer Mannheim社、インディアナポリス、
インディアナ州）によって32Pで標識付けし、そして、
コロニーハイブリダイゼーションによってプラスミドpR
S200（ATCC 77165）にて構築した酵母ゲノミックライブ
ラリーをスクリーニングするために用いた。６×SSPE
（20×SSPEは、175.3g/塩化ナトリウム、27.6g/NaH2P
O4.H2である）、7.4g.l EDTA、pH7.4、100μg/mlサケ精
子DNA、５×Denhardts試薬（50×Denhardts試薬とは、
５％フィコール、５％ポリビニルピロリドン、５％ウシ
血清アルブミンである）、0.1％ SDS、および５％デキ
ストラン硫酸ナトリウムにて、65℃で、18時間、ハイブ
リダイゼーションを行った。フィルターを、0.1×SSP
E、１％ SDSで４回洗浄した。
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付け（Boehringer Mannheim社、インディアナポリス、
インディアナ州）によって32Pで標識付けし、そして、
コロニーハイブリダイゼーションによってプラスミドpR
S200（ATCC 77165）にて構築した酵母ゲノミックライブ
ラリーをスクリーニングするために用いた。６×SSPE
（20×SSPEは、175.3g/塩化ナトリウム、27.6g/NaH2P
O4.H2である）、7.4g.l EDTA、pH7.4、100μg/mlサケ精
子DNA、５×Denhardts試薬（50×Denhardts試薬とは、
５％フィコール、５％ポリビニルピロリドン、５％ウシ
血清アルブミンである）、0.1％ SDS、および５％デキ
ストラン硫酸ナトリウムにて、65℃で、18時間、ハイブ
リダイゼーションを行った。フィルターを、0.1×SSP
E、１％ SDSで４回洗浄した。
各洗浄を、65℃で、30分間の洗浄とした。KIP1コード
配列（配列番号:23）の開始および終了部位にBamH I部
位を導入するために、実施例２に記載したように、特定
部位の突然変異誘発を２度行った。Muta−gene突然変異
誘発用キット、バージョン２（BioRad）を用いて、突然
変異誘発を行った。KIP1 ATGと第二コドンに代えて、Ba
mH I部位（下線部）を導入するためのオリゴヌクレオチ
ドは； また、停止コドン（小文字アルファベット部分）とBa
mH I部位（下線部）をコードするヌクレオチドは； 得られたKIP1生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::KIP1と命名した。以下の二つのプライマー； を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからKIP2配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付けによって32Pで標識付けし、そいて、コロニーハイ
ブリダイゼーションによってプラスミドYCp50（ATCC 37
415）にて構築した酵母ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするために用いた。
配列（配列番号:23）の開始および終了部位にBamH I部
位を導入するために、実施例２に記載したように、特定
部位の突然変異誘発を２度行った。Muta−gene突然変異
誘発用キット、バージョン２（BioRad）を用いて、突然
変異誘発を行った。KIP1 ATGと第二コドンに代えて、Ba
mH I部位（下線部）を導入するためのオリゴヌクレオチ
ドは； また、停止コドン（小文字アルファベット部分）とBa
mH I部位（下線部）をコードするヌクレオチドは； 得られたKIP1生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::KIP1と命名した。以下の二つのプライマー； を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからKIP2配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付けによって32Pで標識付けし、そいて、コロニーハイ
ブリダイゼーションによってプラスミドYCp50（ATCC 37
415）にて構築した酵母ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするために用いた。
KIP1について行ったのと同様にして、ハイブリダイゼ
ーションと洗浄を行った。KIP2コード配列（配列番号:2
8）の開始および終了部位にBamH I部位を導入するため
に、特定部位の突然変異誘発を２度行った。KIP2 ATGと
第二コドンに代えて、BamH I部位（下線部）を導入する
ためのオリゴヌクレオチドは； また、BamH I部位（下線部）をコードするヌクレオチ
ドは； 得られたKIP2生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::KIP2と命名した。以下の二つのプライマー； を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからCIN8配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付けによって32Pで標識付けし、そして、コロニーハイ
ブリダイゼーションによってプラスミドpRS200（ATCC 7
7165）にて構築した酵母ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするために用いた。
ーションと洗浄を行った。KIP2コード配列（配列番号:2
8）の開始および終了部位にBamH I部位を導入するため
に、特定部位の突然変異誘発を２度行った。KIP2 ATGと
第二コドンに代えて、BamH I部位（下線部）を導入する
ためのオリゴヌクレオチドは； また、BamH I部位（下線部）をコードするヌクレオチ
ドは； 得られたKIP2生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::KIP2と命名した。以下の二つのプライマー； を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからCIN8配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付けによって32Pで標識付けし、そして、コロニーハイ
ブリダイゼーションによってプラスミドpRS200（ATCC 7
7165）にて構築した酵母ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするために用いた。
KIP1について行ったのと同様にして、ハイブリダイゼ
ーションと洗浄を行った。CIN8コード配列（配列番号:3
3）の開始および終了部位にBamH I部位を導入するため
に、特定部位の突然変異誘発を２度行った。CIN8 ATGと
第二コドンに代えて、BamH I部位（下線部）を導入する
ためのオリゴヌクレオチドは； また、BamH I部位（下線部）と停止コドン（小文字ア
ルファベット部分）をコードするヌクレオチドは； 得られたCIN8生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::CIN8と命名した。以下の二つのプライマー； を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからKAR3配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付けによって32Pで標識付けし、そして、コロニーハイ
ブリダイゼーションによってプラスミドpRS200（ATCC 7
7165）にて構築した酵母ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするために用いた。
ーションと洗浄を行った。CIN8コード配列（配列番号:3
3）の開始および終了部位にBamH I部位を導入するため
に、特定部位の突然変異誘発を２度行った。CIN8 ATGと
第二コドンに代えて、BamH I部位（下線部）を導入する
ためのオリゴヌクレオチドは； また、BamH I部位（下線部）と停止コドン（小文字ア
ルファベット部分）をコードするヌクレオチドは； 得られたCIN8生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::CIN8と命名した。以下の二つのプライマー； を用いて、S.cerevisiaeゲノミックDNAからKAR3配列
を増幅した。増幅した断片を、ランダムプライムラベル
付けによって32Pで標識付けし、そして、コロニーハイ
ブリダイゼーションによってプラスミドpRS200（ATCC 7
7165）にて構築した酵母ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするために用いた。
KIP1について行ったのと同様にして、ハイブリダイゼ
ーションと洗浄を行った。KAR3コード配列（配列番号:3
8）の開始および終了部位にBamH I部位を導入するため
に、特定部位の突然変異誘発を２度行った。KAR3 ATGと
第二コドンに代えて、BamH I部位（下線部）を導入する
ためのオリゴヌクレオチドは； また、BamH I部位（下線部）と停止コドン（小文字ア
ルファベット部分）をコードするヌクレオチドは； 得られたKAR3生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::KAR3と命名した。
ーションと洗浄を行った。KAR3コード配列（配列番号:3
8）の開始および終了部位にBamH I部位を導入するため
に、特定部位の突然変異誘発を２度行った。KAR3 ATGと
第二コドンに代えて、BamH I部位（下線部）を導入する
ためのオリゴヌクレオチドは； また、BamH I部位（下線部）と停止コドン（小文字ア
ルファベット部分）をコードするヌクレオチドは； 得られたKAR3生成物をBamH Iで消化し、GAL4配列の下
流直下のpGADへクローニングし、このプラスミドをpGA
D::KAR3と命名した。
酢酸リチウムが介在した形質転換によりプレイプラス
ミドで酵母を形質転換し、そして、実施例２に記載した
ようにして、形質転換体を、酵母株をコードするCK Iイ
ソ体と交配させた。CK Iイソ体/TIHを含む株のβ−ガラ
クトシダーゼ活性を、Ｚ緩衝液の0.1mlに懸濁した２×1
06個の細胞に、３滴のクロロホルムと50μｌの0.1％ SD
S、次いで、発色基質であるｏ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトシドの0.2mlを加えることで溶解した細胞
を用いて決定した。0.5mlの1M炭酸ナトリウムを加える
ことでβ−ガラクトシダーゼ分析を終了し、その活性
を、Milton Roy分光光度計（ロチェスター、ニューヨー
ク州）を用いて420nmでの吸光度で測定した。この分析
において、タンパク質／タンパク質相互作用の程度は、
β−ガラクトシダーゼ活性のレベルと直接的に比例して
いた。この分析の結果を、β−ガラクトシダーゼ活性の
単位として、表２に示した。
ミドで酵母を形質転換し、そして、実施例２に記載した
ようにして、形質転換体を、酵母株をコードするCK Iイ
ソ体と交配させた。CK Iイソ体/TIHを含む株のβ−ガラ
クトシダーゼ活性を、Ｚ緩衝液の0.1mlに懸濁した２×1
06個の細胞に、３滴のクロロホルムと50μｌの0.1％ SD
S、次いで、発色基質であるｏ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトシドの0.2mlを加えることで溶解した細胞
を用いて決定した。0.5mlの1M炭酸ナトリウムを加える
ことでβ−ガラクトシダーゼ分析を終了し、その活性
を、Milton Roy分光光度計（ロチェスター、ニューヨー
ク州）を用いて420nmでの吸光度で測定した。この分析
において、タンパク質／タンパク質相互作用の程度は、
β−ガラクトシダーゼ活性のレベルと直接的に比例して
いた。この分析の結果を、β−ガラクトシダーゼ活性の
単位として、表２に示した。
この結果は、HRR25が、四つのすべての酵母キネシン
ならびにTIH4と相互作用できることを示している。キネ
シンKIP2とCIN8がHRR25の触媒領域と相互作用する一方
で、キネシンKIP1とKAR3がキナーゼ不活性化HRR25なら
びにHRR25の非触媒領域と相互作用することは、キナー
ゼ／基質の相互作用が、酵素活性による強力な結合を介
して進行していることを示唆している。
ならびにTIH4と相互作用できることを示している。キネ
シンKIP2とCIN8がHRR25の触媒領域と相互作用する一方
で、キネシンKIP1とKAR3がキナーゼ不活性化HRR25なら
びにHRR25の非触媒領域と相互作用することは、キナー
ゼ／基質の相互作用が、酵素活性による強力な結合を介
して進行していることを示唆している。
加えて、HRR25は、KIP2、あるいはTIH4がKIP2に対応
しているのでTIH4のカルボキシ末端部分と相互作用する
ことを、この結果は示している。
しているのでTIH4のカルボキシ末端部分と相互作用する
ことを、この結果は示している。
実施例４
ヒトCK Iイソ体が、本発明のTIHタンパク質と相互作
用するか否かを決定するための分析も行った。二つのヒ
トCK Iイソ体、CK Iα３（CK Iα3Hu）およびCK Iδ（C
K IδHu）を、この分析に用いるために選抜した。pAS::
CK Iα３とpAS::CK Iδを生成するために、先にプラス
ミドpAS〔Durfee,et al.,Genes and Development 7:555
−569（1993）〕に挿入したGAL4 DNA結合領域に、ヒトC
K I遺伝子を融合した。
用するか否かを決定するための分析も行った。二つのヒ
トCK Iイソ体、CK Iα３（CK Iα3Hu）およびCK Iδ（C
K IδHu）を、この分析に用いるために選抜した。pAS::
CK Iα３とpAS::CK Iδを生成するために、先にプラス
ミドpAS〔Durfee,et al.,Genes and Development 7:555
−569（1993）〕に挿入したGAL4 DNA結合領域に、ヒトC
K I遺伝子を融合した。
具体的には、CK Iα3Huイソ体をコードするDNA（配列
番号:41）を、CK Iα3Huの開始メチオニンと第二コドン
の代わりにNde I部位（下線部）を設けるために、以下
のヌクレオチド； を用いて特定部位の突然変異誘発を行い、得られたDN
AをNde Iで消化し、そして、GAL4配列の下流直下に位置
するプラスミドpASのNde I部位に連結した。
番号:41）を、CK Iα3Huの開始メチオニンと第二コドン
の代わりにNde I部位（下線部）を設けるために、以下
のヌクレオチド； を用いて特定部位の突然変異誘発を行い、得られたDN
AをNde Iで消化し、そして、GAL4配列の下流直下に位置
するプラスミドpASのNde I部位に連結した。
CK IδHu DNA（配列番号:43）を、BamH I部位を含ん
だ突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドプライマーを用
いてCK IδcDNAを増幅することで、pASに導入した。下
線部で示したBamH I部位を含み、開始メチオニンと第二
コドンが置換された、ここで使用したオリゴヌクレオチ
ドは； 反応には、200mM Tris−HCl（pH8.2）、100mM KCl、6
0mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％ Triton X−100、0.
5μＭプライマー、100ngテンプレート、200μM dNTPお
よび2.5単位のポリメラーゼを用いた。この反応を、30
サイクル実施した。反応を94℃で４分間の処置から開始
し、すべてのサイクルを、変性のために94℃で１分間、
アニーリングのために50℃で２分間、および伸長のため
の72℃で４分間の処置を含むようにした。得られた増幅
生成物をBamH Iで消化し、プラスミドpAS::CK Iδを生
成するために、GAL4配列の下流直下にBamH I消化したpA
Sに連結した。
だ突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドプライマーを用
いてCK IδcDNAを増幅することで、pASに導入した。下
線部で示したBamH I部位を含み、開始メチオニンと第二
コドンが置換された、ここで使用したオリゴヌクレオチ
ドは； 反応には、200mM Tris−HCl（pH8.2）、100mM KCl、6
0mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％ Triton X−100、0.
5μＭプライマー、100ngテンプレート、200μM dNTPお
よび2.5単位のポリメラーゼを用いた。この反応を、30
サイクル実施した。反応を94℃で４分間の処置から開始
し、すべてのサイクルを、変性のために94℃で１分間、
アニーリングのために50℃で２分間、および伸長のため
の72℃で４分間の処置を含むようにした。得られた増幅
生成物をBamH Iで消化し、プラスミドpAS::CK Iδを生
成するために、GAL4配列の下流直下にBamH I消化したpA
Sに連結した。
酢酸リチウムが介在した形質転換により得られたバイ
トプラスミドで酵母を形質転換し、そして、実施例２に
記載したようにして、形質転換体を酵母株をコードする
TIHと交配させた。
トプラスミドで酵母を形質転換し、そして、実施例２に
記載したようにして、形質転換体を酵母株をコードする
TIHと交配させた。
Hybond−Ｎ0.45Uフィルター（Amersham社、アーリン
トンハイツ、イリノイ州）で細胞をレプリカ培養し、そ
のフィルターにて、30℃で、18時間、細胞を成長させ、
液体窒素にてフィルターを凍結させることでコロニーを
溶解し、そして、0.002％ X−galを含むＺ緩衝液を浸し
たワットマンの濾紙でそのフィルターをインキュベート
することで、CK Iα3HuあるいはCK IδHuを含む/TIHを
含んだ株のβ−ガラクトシダーゼ活性を検出した。
トンハイツ、イリノイ州）で細胞をレプリカ培養し、そ
のフィルターにて、30℃で、18時間、細胞を成長させ、
液体窒素にてフィルターを凍結させることでコロニーを
溶解し、そして、0.002％ X−galを含むＺ緩衝液を浸し
たワットマンの濾紙でそのフィルターをインキュベート
することで、CK Iα3HuあるいはCK IδHuを含む/TIHを
含んだ株のβ−ガラクトシダーゼ活性を検出した。
フィルターを1Mの炭酸ナトリウムに浸すことで反応を
停止し、そして、β−ガラクトシダーゼ活性によるＸ−
galの発色による青色の呈色に関して、タンパク質／タ
ンパク質の相互作用を評価した。青色の呈色に関する視
覚的スクリーニングにより決定されたこの分析の結果
を、以下の表３に示した。
停止し、そして、β−ガラクトシダーゼ活性によるＸ−
galの発色による青色の呈色に関して、タンパク質／タ
ンパク質の相互作用を評価した。青色の呈色に関する視
覚的スクリーニングにより決定されたこの分析の結果
を、以下の表３に示した。
これら結果は、本発明のTIHタンパク質とCK Iイソ体
との間の相互作用が、酵母イソ体に限定されないことを
示唆している。CK IδHuは、TIH2と相互作用した。よっ
て、CK I/TIHの相互作用は、ヒトCK Iとその同種TIHタ
ンパク質との間でも生ずるものと考えられる。
との間の相互作用が、酵母イソ体に限定されないことを
示唆している。CK IδHuは、TIH2と相互作用した。よっ
て、CK I/TIHの相互作用は、ヒトCK Iとその同種TIHタ
ンパク質との間でも生ずるものと考えられる。
実施例５
酵母TIH1、TIH2およびTIH3タンパク質をコードするゲ
ノミッククローンの全長を、酵母ゲノミックライブラリ
ーから単離した。ゲノミッククローンを同定するため
に、実施例１に記載したTIH1、TIH2およびTIH3融合遺伝
子を含むpGADプラスミドから、放射標識したPCR断片を
調製した。このクローンを増幅するために用いた一方向
性オリゴヌクレオチドの配列は； であった。PCR反応には、200mM Tris−HCl（pH8.
2）、100mM KCl、60mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％
Triton X−100、0.5μＭプライマー、100ngテンプレー
ト、200μM dNTPおよび2.5単位のポリメラーゼを用い
た。この反応を、30サイクル実施した。
ノミッククローンの全長を、酵母ゲノミックライブラリ
ーから単離した。ゲノミッククローンを同定するため
に、実施例１に記載したTIH1、TIH2およびTIH3融合遺伝
子を含むpGADプラスミドから、放射標識したPCR断片を
調製した。このクローンを増幅するために用いた一方向
性オリゴヌクレオチドの配列は； であった。PCR反応には、200mM Tris−HCl（pH8.
2）、100mM KCl、60mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％
Triton X−100、0.5μＭプライマー、100ngテンプレー
ト、200μM dNTPおよび2.5単位のポリメラーゼを用い
た。この反応を、30サイクル実施した。
最初の５サイクルでは、それぞれ50μCiの32P−dCTP
と32P−dTTPを使用した。６サイクル目の開始にあたっ
て、非放射標識したdCTPとdTTPを、それぞれ最終濃度が
200μＭになるまで添加した。反応を94℃で４分間の処
置から開始し、すべてのサイクルを、変性のために94℃
で１分間、アニーリングのために50℃で２分間、および
伸長のための72℃で４分間の処置を含むようにした。次
に、得られたPCR生成物を、コロニーハイブリダイゼー
ションでのスクリーニングのためにプローブとして用い
た。
と32P−dTTPを使用した。６サイクル目の開始にあたっ
て、非放射標識したdCTPとdTTPを、それぞれ最終濃度が
200μＭになるまで添加した。反応を94℃で４分間の処
置から開始し、すべてのサイクルを、変性のために94℃
で１分間、アニーリングのために50℃で２分間、および
伸長のための72℃で４分間の処置を含むようにした。次
に、得られたPCR生成物を、コロニーハイブリダイゼー
ションでのスクリーニングのためにプローブとして用い
た。
TIH1ゲノミッククローンの全長を、YCp50プラスミド
ライブラリー（ATCC 37415）から単離した。TIH2および
TIH3ゲノミッククローンの全長を、λゲノミックライブ
ラリー〔Riles,et al.,Genetics 134:81−150（199
3）〕から単離した。YCp50ライブラリーのスクリーニン
グのためのハイブリダイゼーションを、６×SSPE（20×
SSPEは、175.3g/塩化ナトリウム、27.6g/NaH2PO4.H2で
ある）、7.4g.l EDTA、pH7.4、100μg/mlサケ精子DNA、
５×Denhardts試薬（50×Denhardts試薬とは、５％フィ
コール、５％ポリビニルピロリドン、５％ウシ血清アル
ブミンである）、0.1％ SDS、および５％デキストラン
硫酸ナトリウムにて、65℃で、18時間、ハイブリダイゼ
ーションを行った。フィルターを、0.1×SSPE、１％ SD
Sで４回洗浄した。各洗浄を、65℃で、30分間の洗浄と
した。λライブラリーのスクリーニングのためのハイブ
リダイゼーション条件は、１×HPB（0.5M 塩化ナトリウ
ム、100mM Na2HPO4、5mM Na2EDTA）、１％サルコシルナ
トリウム、100μg/ml子牛胸腺DNAにて、64℃で、18時間
とした。フィルターを、15秒間で二回、15分間で一回、
および15秒間で一回、すべて室温で、1mM Tris−HCl（p
H8.0）にて洗浄した。TIH1、TIH2およびTIH3ゲノミック
クローンの配列を、ABI 373A配列解析機（Applied Bios
ystems社）を用いた自動DNA解析によって決定した。TIH
1、TIH2およびTIH3ゲノミッククローンの全長に関して
決定されたヌクレオチド配列を、配列番号:2、４および
６それぞれに、また、TIH1、TIH2およびTIH3の推定アミ
ノ酸配列を、配列番号:3、５および７それぞれに記載し
た。データベースの検索は実施例１の結果と符合するも
のであり、新規タンパク質をコードしたTIH1とTIH3は、
GenBankデータベースのいずれのタンパク質とも有意の
相同性を示さなかった。
ライブラリー（ATCC 37415）から単離した。TIH2および
TIH3ゲノミッククローンの全長を、λゲノミックライブ
ラリー〔Riles,et al.,Genetics 134:81−150（199
3）〕から単離した。YCp50ライブラリーのスクリーニン
グのためのハイブリダイゼーションを、６×SSPE（20×
SSPEは、175.3g/塩化ナトリウム、27.6g/NaH2PO4.H2で
ある）、7.4g.l EDTA、pH7.4、100μg/mlサケ精子DNA、
５×Denhardts試薬（50×Denhardts試薬とは、５％フィ
コール、５％ポリビニルピロリドン、５％ウシ血清アル
ブミンである）、0.1％ SDS、および５％デキストラン
硫酸ナトリウムにて、65℃で、18時間、ハイブリダイゼ
ーションを行った。フィルターを、0.1×SSPE、１％ SD
Sで４回洗浄した。各洗浄を、65℃で、30分間の洗浄と
した。λライブラリーのスクリーニングのためのハイブ
リダイゼーション条件は、１×HPB（0.5M 塩化ナトリウ
ム、100mM Na2HPO4、5mM Na2EDTA）、１％サルコシルナ
トリウム、100μg/ml子牛胸腺DNAにて、64℃で、18時間
とした。フィルターを、15秒間で二回、15分間で一回、
および15秒間で一回、すべて室温で、1mM Tris−HCl（p
H8.0）にて洗浄した。TIH1、TIH2およびTIH3ゲノミック
クローンの配列を、ABI 373A配列解析機（Applied Bios
ystems社）を用いた自動DNA解析によって決定した。TIH
1、TIH2およびTIH3ゲノミッククローンの全長に関して
決定されたヌクレオチド配列を、配列番号:2、４および
６それぞれに、また、TIH1、TIH2およびTIH3の推定アミ
ノ酸配列を、配列番号:3、５および７それぞれに記載し
た。データベースの検索は実施例１の結果と符合するも
のであり、新規タンパク質をコードしたTIH1とTIH3は、
GenBankデータベースのいずれのタンパク質とも有意の
相同性を示さなかった。
実施例６
TIHタンパク質の活性を特徴付けし、HRR25のシグナル
経路へのTIHタンパク質の関与を決定するために、染色
体TIH1欠失変異株を相同組換えにより構築した。
経路へのTIHタンパク質の関与を決定するために、染色
体TIH1欠失変異株を相同組換えにより構築した。
具体的には、ゲノミックTIH1遺伝子を含む1.7kbのSal
I−BamH I断片を、プラスミドpBluescript II SK（Str
atagene社、ラヨラ、カリフォルニア州）にサブクロー
ニングすることで、TIH1変異体を構築した。0.5kbのTIH
1遺伝子（配列番号:2の第1202位〜第1635位のヌクレオ
チド）を削除するために、得られたサブクローンをEcoR
VとPst Iで消化し、この領域に、S.cerevisiae LEU2遺
伝子を含んだ2.2kbのSma I−Pst I断片を連結した。得
られたプラスミド構築体から単離したDNAは、プラスミ
ドを線状化するためにBamH Iで消化し、この試料10μｇ
を、HRR25に関してLeu2+に対してヘテロ接合性である二
倍体酵母株Mat a/Matα ade2/ade2 can1/can1 his3−1
1,15/his3−11,15 leu2−3,112/leu2−3,112 trp1−1/t
rp1−1 ura3−1/ura3−1HRR25/hrr25::URA3）を形質転
換するために用いた。酢酸リチウムで媒介した方法を用
いて形質転換を行い、形質転換体をSD−ロイシン培地
（Bio101）にて選抜した。線状化したDNAによる酵母の
形質転換は、相同組換えと遺伝子置換をもたらした〔Ro
thstein,Meth.Enzymol.194:281−301（1991）〕。安定
なLeu+コロニーを、胞子形成培地（Bio101）にレプリカ
培養し、30℃で、５日間成長させた。４つの切開器具
〔Sherman and Hicks,Meth.Enzymol.194:21−37（199
1）〕を用いて、胞子をYEPD培地（Bio101）にて切開
し、分離した単一胞子を発芽させ、３日間コロニーを成
長せしめた。
I−BamH I断片を、プラスミドpBluescript II SK（Str
atagene社、ラヨラ、カリフォルニア州）にサブクロー
ニングすることで、TIH1変異体を構築した。0.5kbのTIH
1遺伝子（配列番号:2の第1202位〜第1635位のヌクレオ
チド）を削除するために、得られたサブクローンをEcoR
VとPst Iで消化し、この領域に、S.cerevisiae LEU2遺
伝子を含んだ2.2kbのSma I−Pst I断片を連結した。得
られたプラスミド構築体から単離したDNAは、プラスミ
ドを線状化するためにBamH Iで消化し、この試料10μｇ
を、HRR25に関してLeu2+に対してヘテロ接合性である二
倍体酵母株Mat a/Matα ade2/ade2 can1/can1 his3−1
1,15/his3−11,15 leu2−3,112/leu2−3,112 trp1−1/t
rp1−1 ura3−1/ura3−1HRR25/hrr25::URA3）を形質転
換するために用いた。酢酸リチウムで媒介した方法を用
いて形質転換を行い、形質転換体をSD−ロイシン培地
（Bio101）にて選抜した。線状化したDNAによる酵母の
形質転換は、相同組換えと遺伝子置換をもたらした〔Ro
thstein,Meth.Enzymol.194:281−301（1991）〕。安定
なLeu+コロニーを、胞子形成培地（Bio101）にレプリカ
培養し、30℃で、５日間成長させた。４つの切開器具
〔Sherman and Hicks,Meth.Enzymol.194:21−37（199
1）〕を用いて、胞子をYEPD培地（Bio101）にて切開
し、分離した単一胞子を発芽させ、３日間コロニーを成
長せしめた。
ヘテロ接合性のTIH1とHRR25変異株のランダム減数分
離によって、４つのコロニーのタイプが検出された。親
株に含まれていたhrr25削除変異体は、HRR25遺伝子の酵
母URA3遺伝子での置換によるものであり、TIH1変異体は
LEU2での置換によるものである。URA3とLEU2は、それぞ
れウラシルおよびロイシン原栄養株であることを示す。
コロニータイプは、変異株の分離により以下の遺伝子
型、すなわち、（ｉ）野性型細胞は、HRR25 TIH1、（i
i）HRR25変異体は、hrr25::URA3 TIH1、（iii）TIH1変
異体は、HRR25 tih1::LEU2、および（iv）HRR25 TIH1二
重変異体は、hrr25::URA3 tih1::LEU2へと分類される。
酵母変異体欠陥に関する、標準的な生理学的分析を行っ
た〔Hoeskstra,et al.,前出〕。
離によって、４つのコロニーのタイプが検出された。親
株に含まれていたhrr25削除変異体は、HRR25遺伝子の酵
母URA3遺伝子での置換によるものであり、TIH1変異体は
LEU2での置換によるものである。URA3とLEU2は、それぞ
れウラシルおよびロイシン原栄養株であることを示す。
コロニータイプは、変異株の分離により以下の遺伝子
型、すなわち、（ｉ）野性型細胞は、HRR25 TIH1、（i
i）HRR25変異体は、hrr25::URA3 TIH1、（iii）TIH1変
異体は、HRR25 tih1::LEU2、および（iv）HRR25 TIH1二
重変異体は、hrr25::URA3 tih1::LEU2へと分類される。
酵母変異体欠陥に関する、標準的な生理学的分析を行っ
た〔Hoeskstra,et al.,前出〕。
TIH1削除変異体は、緩慢な成長速度、DNA修復欠陥、
および異常型の細胞形態を含んだHRR25での変異と同一
の表現型を示し、このことは、TIHタンパク質が、HRR25
と同じ経路あるいは同様の効果を奏する経路に関与して
いることを意味している。さらに、tih1 hrr25二重変異
体は、生存不能であった。
および異常型の細胞形態を含んだHRR25での変異と同一
の表現型を示し、このことは、TIHタンパク質が、HRR25
と同じ経路あるいは同様の効果を奏する経路に関与して
いることを意味している。さらに、tih1 hrr25二重変異
体は、生存不能であった。
実施例７
CK IプロテインキナーゼとTIHタンパク質との間の相
互作用のジハイブリッドスクリーン解析を確認するため
に、相互作用を検出するための生物化学的方法を作成し
た。この方法は、相互作用に関わる一成分のアフィニテ
ィー精製に基づくものであり、アフィニティー精製した
混合物中の相互作用成分の存在を検出するためのウェス
ターンブロッティング法が続く。TIH2遺伝子は、グルタ
チオンアガロース（Pharmacia社、アップサラ、スゥエ
ーデン）でアフィニティー精製できる、TIH2/グルタチ
オン−Ｓ−転移酵素（GST）融合タンパク質を構築する
ために用いた。他の有用なリガンド／カウターリセプタ
ーの組み合わせには、例えば、感化ウィルス赤血球凝集
素〔Field et al.,Mol.Cell Biol.8（５）:2159−2165
（1988）〕／赤血球凝集素特異性抗体（Berkeley Antib
ody社、リッチモンド、カリフォルニア州）、ポリヒス
チジン／ニッケルアフィニティークロマトグラフィー
（Novagen社、マジソン、ウィスコンシン州）、および
マルトース結合タンパク質／アミロースクロマトグラフ
ィー（New England Biolabs社、ビバリー、マサチュー
セッツ州）などがある。
互作用のジハイブリッドスクリーン解析を確認するため
に、相互作用を検出するための生物化学的方法を作成し
た。この方法は、相互作用に関わる一成分のアフィニテ
ィー精製に基づくものであり、アフィニティー精製した
混合物中の相互作用成分の存在を検出するためのウェス
ターンブロッティング法が続く。TIH2遺伝子は、グルタ
チオンアガロース（Pharmacia社、アップサラ、スゥエ
ーデン）でアフィニティー精製できる、TIH2/グルタチ
オン−Ｓ−転移酵素（GST）融合タンパク質を構築する
ために用いた。他の有用なリガンド／カウターリセプタ
ーの組み合わせには、例えば、感化ウィルス赤血球凝集
素〔Field et al.,Mol.Cell Biol.8（５）:2159−2165
（1988）〕／赤血球凝集素特異性抗体（Berkeley Antib
ody社、リッチモンド、カリフォルニア州）、ポリヒス
チジン／ニッケルアフィニティークロマトグラフィー
（Novagen社、マジソン、ウィスコンシン州）、および
マルトース結合タンパク質／アミロースクロマトグラフ
ィー（New England Biolabs社、ビバリー、マサチュー
セッツ州）などがある。
GST::TIH2融合タンパク質を構築するために、TIH2遺
伝子の5'および3'未満を、DNA増幅に基づいた変異方法
によって修飾した。増幅するオリゴヌクレオチドを、サ
ブクローニングを容易にするために、Xba IおよびHind
III部位に導入した。増幅のために用いた、制限部位に
下線を付した、オリゴヌクレオチドは； 反応には、200mM Tris−HCl（pH8.2）、100mM KCl、6
0mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％ Triton X−100、0.
5μＭプライマー、100ngテンプレート、200μM dTNP、
および2.5単位のポリメラーゼを用いた。この反応を、3
0サイクル実施した。反応を94℃で４分間の処置から開
始し、すべてのサイクルを、変性のために94℃で１分
間、アニーリングのために50℃で２分間、および伸長の
ための72℃で４分間の処置を含むようにした。
伝子の5'および3'未満を、DNA増幅に基づいた変異方法
によって修飾した。増幅するオリゴヌクレオチドを、サ
ブクローニングを容易にするために、Xba IおよびHind
III部位に導入した。増幅のために用いた、制限部位に
下線を付した、オリゴヌクレオチドは； 反応には、200mM Tris−HCl（pH8.2）、100mM KCl、6
0mM（NH4）2SO4、15mM MgCl2、１％ Triton X−100、0.
5μＭプライマー、100ngテンプレート、200μM dTNP、
および2.5単位のポリメラーゼを用いた。この反応を、3
0サイクル実施した。反応を94℃で４分間の処置から開
始し、すべてのサイクルを、変性のために94℃で１分
間、アニーリングのために50℃で２分間、および伸長の
ための72℃で４分間の処置を含むようにした。
得られた増幅生成物をXba IおよびHind IIIで消化
し、その断片を、ガラクロース誘発可能なGST遺伝子を
有するプラスミドpGEXKGを含むGSTにサブクローニング
して、pGEXKG::TIH2を生成せしめた。このプラスミド
は、TIH2配列の上流近傍に融合したGST配列に加えて、
酵母の形質転換のためのURA3とLEU2の選択が可能なマー
カーを含んでいる。そして、プラスミドpGEXKG::TIH2
を、酢酸リチウムが媒介した形質転換で酵母株W303〔Wa
llis et al.,Cell 58:409−419（1989）〕を形質転換
し、Ura+形質転換体をSD−URA培地（Bio101）にて選択
した。GST::TIH2融合タンパク質を単離するために、100
mlのSD−URA培地に形質転換した酵母を接種し、そし
て、ガラクトースの存在下で１×107細胞/mlの密度まで
成長せしめた。遠心分離によって細胞をペレット化し、
溶解緩衝液〔10mM燐酸ナトリウム、pH7.2、150mM塩化ナ
トリウム、１％ Nonidet P−40、１％ Trasylol（Miles
社）、1mMジチオトレイトール、1mMベンザミジン、1mM
フェニルメチルスルフォニルフロリド、5mM EDTA、１μ
g/mlペプスタチン、２μg/mlペプスタチンＡ、１μg/ml
ロイペプチン、100mMバナジウム酸ナトリウム、および5
0mMフッ化ナトリウム〕で洗浄し、1ml溶解緩衝液で再懸
濁し、そして、10gのガラスビーズで５分間攪拌して溶
解した。粗溶解物を、100,000×ｇで、30分間遠心分離
することで清澄化した。50％のスラリー化グルタチオン
アガロース（Pharmacia社）の50μｌを抽出物に添加
し、混合物を、１時間インキュベートした。
し、その断片を、ガラクロース誘発可能なGST遺伝子を
有するプラスミドpGEXKGを含むGSTにサブクローニング
して、pGEXKG::TIH2を生成せしめた。このプラスミド
は、TIH2配列の上流近傍に融合したGST配列に加えて、
酵母の形質転換のためのURA3とLEU2の選択が可能なマー
カーを含んでいる。そして、プラスミドpGEXKG::TIH2
を、酢酸リチウムが媒介した形質転換で酵母株W303〔Wa
llis et al.,Cell 58:409−419（1989）〕を形質転換
し、Ura+形質転換体をSD−URA培地（Bio101）にて選択
した。GST::TIH2融合タンパク質を単離するために、100
mlのSD−URA培地に形質転換した酵母を接種し、そし
て、ガラクトースの存在下で１×107細胞/mlの密度まで
成長せしめた。遠心分離によって細胞をペレット化し、
溶解緩衝液〔10mM燐酸ナトリウム、pH7.2、150mM塩化ナ
トリウム、１％ Nonidet P−40、１％ Trasylol（Miles
社）、1mMジチオトレイトール、1mMベンザミジン、1mM
フェニルメチルスルフォニルフロリド、5mM EDTA、１μ
g/mlペプスタチン、２μg/mlペプスタチンＡ、１μg/ml
ロイペプチン、100mMバナジウム酸ナトリウム、および5
0mMフッ化ナトリウム〕で洗浄し、1ml溶解緩衝液で再懸
濁し、そして、10gのガラスビーズで５分間攪拌して溶
解した。粗溶解物を、100,000×ｇで、30分間遠心分離
することで清澄化した。50％のスラリー化グルタチオン
アガロース（Pharmacia社）の50μｌを抽出物に添加
し、混合物を、１時間インキュベートした。
アガロースを、エッペンドルフのマイクロ遠心分離で
10秒間遠心し、上清を除去し、そして、ペレットを含む
アガロースを燐酸緩衝化した生理食塩水（PBS）で洗浄
した。ペレットを、２×プロテインゲル試料緩衝液の50
μｌで再懸濁し、２分間煮沸し、そして、その12.5μｌ
を10％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ゲル分
画したタンパク質を、Immobilon−Ｐ膜（Millipore社、
ベッドード、マサチューセッツ州）に、エレクトロブロ
ッティングによって移し、そして、HRR25に対して調製
したウサギ抗体〔DeMaggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA）89:7008−7012（1992）〕を用いて膜をプロー
ブすることで、HRR25は検出された。ウェスターンブロ
ット法を、アルカリ性フォスファターゼ接合した第二抗
体と発色剤（BioRad）を用いて免疫反応に適合するよう
に調製した。
10秒間遠心し、上清を除去し、そして、ペレットを含む
アガロースを燐酸緩衝化した生理食塩水（PBS）で洗浄
した。ペレットを、２×プロテインゲル試料緩衝液の50
μｌで再懸濁し、２分間煮沸し、そして、その12.5μｌ
を10％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ゲル分
画したタンパク質を、Immobilon−Ｐ膜（Millipore社、
ベッドード、マサチューセッツ州）に、エレクトロブロ
ッティングによって移し、そして、HRR25に対して調製
したウサギ抗体〔DeMaggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA）89:7008−7012（1992）〕を用いて膜をプロー
ブすることで、HRR25は検出された。ウェスターンブロ
ット法を、アルカリ性フォスファターゼ接合した第二抗
体と発色剤（BioRad）を用いて免疫反応に適合するよう
に調製した。
ゲルの写真を図１に示し、図において、約58kDのHRR2
5タンパク質は、TIH2タンパク質に関連して検出されて
いる。
5タンパク質は、TIH2タンパク質に関連して検出されて
いる。
実施例８
同定したTIH1タンパク質の新規性を確認するために、
すでに報告されたタンパク質配列のデータベースの検索
を行った。TIH1（配列番号:3の第128位〜第161位のアミ
ノ酸）、ヒトHum80DP（第31位〜第63位のアミノ酸）〔S
akumi et al.,J.Biol.Chem.268:23524−23530（199
3）〕、E.coli MutT（第32位〜第64位のアミノ酸）〔Ak
iyama et al.,Mol.Gen.Genet.206:9−16（1989）〕、ウ
ィルスC11（第122位〜第154位のアミノ酸）〔Strayer e
t al.,Virol.185:585−595（1991）〕、およびウィルス
VD10（第122位〜第154位のアミノ酸）〔Strayer et a
l.,（1991）、前出〕のそれぞれのアミノ酸配列の一部
を記載した、図２にあるように、配列の比較によれば、
酸化的に損傷を受けたヌクレオチドを細胞核から除去す
る上で活発に関与する酵素に関連した特徴配列をTIH1は
含んでおり、これがDNA複製の適合性を向上せしめてい
ることを示している。この活性を備えた酵素は、原核細
胞、真核細胞およびウィルスを含む多様な生物体にて同
定されている〔Koonin,Nucl.Acids Res.21:4847（199
3）〕。
すでに報告されたタンパク質配列のデータベースの検索
を行った。TIH1（配列番号:3の第128位〜第161位のアミ
ノ酸）、ヒトHum80DP（第31位〜第63位のアミノ酸）〔S
akumi et al.,J.Biol.Chem.268:23524−23530（199
3）〕、E.coli MutT（第32位〜第64位のアミノ酸）〔Ak
iyama et al.,Mol.Gen.Genet.206:9−16（1989）〕、ウ
ィルスC11（第122位〜第154位のアミノ酸）〔Strayer e
t al.,Virol.185:585−595（1991）〕、およびウィルス
VD10（第122位〜第154位のアミノ酸）〔Strayer et a
l.,（1991）、前出〕のそれぞれのアミノ酸配列の一部
を記載した、図２にあるように、配列の比較によれば、
酸化的に損傷を受けたヌクレオチドを細胞核から除去す
る上で活発に関与する酵素に関連した特徴配列をTIH1は
含んでおり、これがDNA複製の適合性を向上せしめてい
ることを示している。この活性を備えた酵素は、原核細
胞、真核細胞およびウィルスを含む多様な生物体にて同
定されている〔Koonin,Nucl.Acids Res.21:4847（199
3）〕。
HRR25酵素活性が、放射能によって損傷を受けたDNAの
修復に関与することが示されたが、その修復過程でのHR
R25の役割は未だ不明である。TIH1が損傷を減退させる
能力を備えた酵素と同様のアミノ酸配列を有していると
いう事実は、DNA修復過程にて、TIH1が同様にHRR25と相
互作用することを示すものである。HRR25とTIH1との間
の相互作用を妨げ、あるいは解消する能力のある阻害化
合物は、目標とした癌および抗ウィルス療法において特
に有用であろう。癌様細胞あるいはウィルス感染した細
胞への阻害剤の誘導は、細胞での複写性変異率を向上せ
しめ、結果として、誘発した細胞の自滅の可能性をも高
めることになる。加えて、目標とした阻害剤の誘導は、
従来の化学療法および／または放射能療法を用いた癌様
細胞あるいはウィルス感染した細胞の治療において、向
上した感度を選択的に付与し、結果として、化学療法お
よび／または放射能療法での治療指数を向上せしめるで
あろう。
修復に関与することが示されたが、その修復過程でのHR
R25の役割は未だ不明である。TIH1が損傷を減退させる
能力を備えた酵素と同様のアミノ酸配列を有していると
いう事実は、DNA修復過程にて、TIH1が同様にHRR25と相
互作用することを示すものである。HRR25とTIH1との間
の相互作用を妨げ、あるいは解消する能力のある阻害化
合物は、目標とした癌および抗ウィルス療法において特
に有用であろう。癌様細胞あるいはウィルス感染した細
胞への阻害剤の誘導は、細胞での複写性変異率を向上せ
しめ、結果として、誘発した細胞の自滅の可能性をも高
めることになる。加えて、目標とした阻害剤の誘導は、
従来の化学療法および／または放射能療法を用いた癌様
細胞あるいはウィルス感染した細胞の治療において、向
上した感度を選択的に付与し、結果として、化学療法お
よび／または放射能療法での治療指数を向上せしめるで
あろう。
図面の簡単な説明
図１は、S.cerevisiae HRR25カゼインキナーゼＩとア
フィニティー精製したTIH2との関連を示すウェスターン
ブロットを示す図である。
フィニティー精製したTIH2との関連を示すウェスターン
ブロットを示す図である。
図２は、TIH1と異常型ヌクレオチドの除去に関与する
ことが知られた酵素との間のアミノ酸比較を示す図であ
る。
ことが知られた酵素との間のアミノ酸比較を示す図であ
る。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ディマジオ、アンソニー、ジェイ．
ホークストラ、マール、エフ．
（ii）発明の名称：カゼインキナーゼＩと相互作用す
るタンパク質に関連する方法および物質 （iii）配列の数:53 （iv）連絡先住所： （Ａ）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェース
ティン、マレー アンドボーラン （Ｂ）番地:6300シアーズ タワー、233エス．ワッ
カー ドライブ （Ｃ）都市名：シカゴ （Ｄ）州名：イリノイ （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号:60606−6402 （ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体：フロッピー ディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース＃
1.0、バージョン＃1.25 （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US 08/184,605 （Ｂ）出願日:21−１月−1994 （viii）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ノーランド、グレタ イー （Ｂ）登録番号:35,302 （Ｃ）参照／事件番号:27866/32437 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（312）474−6300 （Ｂ）ファックス：（312）474−0448 （Ｃ）テレックス:25−3856 （２）配列番号:1の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:5アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:1 （２）配列番号:2の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2625塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （Ａ）配列を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:796..2580 （xi）配列：配列番号:2 （２）配列番号:3の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:595アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:3 （２）配列番号:4の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:6854塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （Ａ）配列を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:2050..4053 （xi）配列：配列番号:4 （２）配列番号:5の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:688アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:5 （２）配列番号:6の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2814塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （Ａ）配列を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..696 （xi）配列：配列番号:6 （２）配列番号:7の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:232アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:7 （２）配列番号:8の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:1485塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:8 （２）配列番号:9の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:9 （２）配列番号:10の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:10 （２）配列番号:11の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:543塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:11 （２）配列番号:12の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:35塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:12 （２）配列番号:13の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:13 （２）配列番号:14の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:14 （２）配列番号:15の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:15 （２）配列番号:16の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:16 （２）配列番号:17の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3628塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:17 （２）配列番号:18の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:18 （２）配列番号:19の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2468塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:19 （２）配列番号:20の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:20 （２）配列番号:21の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:21 （２）配列番号:22の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:22 （２）配列番号:23の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:5093塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:23 （２）配列番号:24の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:24 （２）配列番号:25の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:25 （２）配列番号:26の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:26 （２）配列番号:27の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:27 （２）配列番号:28の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2870塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:28 （２）配列番号:29の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:29 （２）配列番号:30の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:30 （２）配列番号:31の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:31 （２）配列番号:32の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:26塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:32 （２）配列番号:33の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3883塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:33 （２）配列番号:34の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:34 （２）配列番号:35の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:53塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:35 （２）配列番号:36の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:36 （２）配列番号:37の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:37 （２）配列番号:38の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3466塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:38 （２）配列番号:39の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:39 （２）配列番号:40の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:40 （２）配列番号:41の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2385塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:41 （２）配列番号:42の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:42 （２）配列番号:43の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3505塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:43 （２）配列番号:44の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:44 （２）配列番号:45の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:45 （２）配列番号:46の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:46 （２）配列番号:47の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:47 （２）配列番号:48の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:48 （２）配列番号:49の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:49 （２）配列番号:50の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:50 （２）配列番号:51の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:51 （２）配列番号:52の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:52 （２）配列番号:53の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:53
るタンパク質に関連する方法および物質 （iii）配列の数:53 （iv）連絡先住所： （Ａ）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェース
ティン、マレー アンドボーラン （Ｂ）番地:6300シアーズ タワー、233エス．ワッ
カー ドライブ （Ｃ）都市名：シカゴ （Ｄ）州名：イリノイ （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号:60606−6402 （ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体：フロッピー ディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース＃
1.0、バージョン＃1.25 （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US 08/184,605 （Ｂ）出願日:21−１月−1994 （viii）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ノーランド、グレタ イー （Ｂ）登録番号:35,302 （Ｃ）参照／事件番号:27866/32437 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（312）474−6300 （Ｂ）ファックス：（312）474−0448 （Ｃ）テレックス:25−3856 （２）配列番号:1の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:5アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:1 （２）配列番号:2の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2625塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （Ａ）配列を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:796..2580 （xi）配列：配列番号:2 （２）配列番号:3の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:595アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:3 （２）配列番号:4の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:6854塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （Ａ）配列を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:2050..4053 （xi）配列：配列番号:4 （２）配列番号:5の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:688アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:5 （２）配列番号:6の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2814塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （ix）配列の特徴： （Ａ）配列を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..696 （xi）配列：配列番号:6 （２）配列番号:7の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:232アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:7 （２）配列番号:8の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:1485塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:8 （２）配列番号:9の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:9 （２）配列番号:10の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:10 （２）配列番号:11の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:543塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:11 （２）配列番号:12の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:35塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:12 （２）配列番号:13の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:13 （２）配列番号:14の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:14 （２）配列番号:15の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:15 （２）配列番号:16の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:16 （２）配列番号:17の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3628塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:17 （２）配列番号:18の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:18 （２）配列番号:19の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2468塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:19 （２）配列番号:20の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:20 （２）配列番号:21の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:21 （２）配列番号:22の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:22 （２）配列番号:23の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:5093塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:23 （２）配列番号:24の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:24 （２）配列番号:25の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:25 （２）配列番号:26の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:26 （２）配列番号:27の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:27 （２）配列番号:28の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2870塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:28 （２）配列番号:29の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:29 （２）配列番号:30の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:30 （２）配列番号:31の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:31 （２）配列番号:32の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:26塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:32 （２）配列番号:33の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3883塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:33 （２）配列番号:34の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:34 （２）配列番号:35の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:53塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:35 （２）配列番号:36の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:36 （２）配列番号:37の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:37 （２）配列番号:38の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3466塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号:38 （２）配列番号:39の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:39 （２）配列番号:40の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:40 （２）配列番号:41の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2385塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:41 （２）配列番号:42の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:42 （２）配列番号:43の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3505塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:43 （２）配列番号:44の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:44 （２）配列番号:45の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:45 （２）配列番号:46の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:46 （２）配列番号:47の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:47 （２）配列番号:48の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:48 （２）配列番号:49の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:49 （２）配列番号:50の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:50 （２）配列番号:51の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:51 （２）配列番号:52の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:52 （２）配列番号:53の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:33アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:53
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:865
Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｎ 9/12 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(56)参考文献 Ｘｉａｏｌｕ Ｙａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓ
ｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｔｗｏ−Ｈｙ
ｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，米国，1992年 ７月31日，Ｖｏｌ.
257，680−682
Ｍｅｒｌ Ｆ．Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，ＨＲＲ25，ａ Ｐｕｔａｔ
ｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ
ｆｒｏｍ Ｂｕｄｄｉｎｇ Ｙｅａｓ
ｔ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ Ｄａｍａｇｅｄ
ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国，1991
年 ８月30日，Ｖｏｌ．253，1031−
1034
Ｂａｒｔ Ｓｃｈｅｒｅｎｓ，ｅｔ
ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ｏｆ ａ 32560 ｂｐ Ｓｅｇ
ｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｌｅｆｔ Ａ
ｒｍ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅ ＩＩ．，ＹＥＡＳＴ，米国,
1993年，Ｖｏｌ．９，1355−1371
Ｘｉｎ−Ｓｈｅｎｇ Ｃｈｅｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ ｈ
ｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ 12−ｌｉ
ｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ．．．，Ｅｕｒ.
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1993年，Ｖｏ
ｌ．214，845−852
Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｆｉｅｌｄ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ａ ＲＡＳ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ
Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ．．．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，米国，1988年,
Ｖｏｌ．８ Ｎｏ．５，2159−2165
堀越弘毅ら，工学のための遺伝子工
学，日本，講談社サイエンティフィッ
ク，1992年10月 １日，183−185
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
Ｐｕｂｍｅｄ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＪＩＣＳＴファイル
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＯ
ＩＳ)
Claims (6)
- 【請求項１】CK Iイソ体に結合するタンパク質を検出す
る方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｅ）、すなわ
ち； （ａ）CK Iイソ体に結合すると思われるタンパク質と、
特異的なカウターリセプターにアフィニティー結合する
ことができるリガンドとの融合体をコードするハイブリ
ッドDNA配列で、適切な宿主細胞を形質転換あるいは形
質変換し、 （ｂ）当該宿主細胞にて当該ハイブリッドDNA配列を、
適切な条件下で発現し、 （ｃ）固定化形式で当該融合タンパク質を当該特異的な
カウターリセプターに曝すことによって、当該宿主細胞
から融合タンパク質を固定化し、 （ｄ）CK Iイソ体を、当該固定化した融合タンパク質に
接触せしめ、および （ｅ）当該CK Iイソ体に特異的な試薬を用いて、当該融
合タンパク質に結合した当該CK Iイソ体を検出する、 工程を含む、ことを特徴とするCK Iイソ体に結合するタ
ンパク質を検出する方法。 - 【請求項２】前記CK Iイソ体が、S.cerevisiae HRR25で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記リガンドが、グルタチオン−Ｓ−転移
酵素であり、かつ前記カウターリセプターが、グルタチ
オンである請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】前記リガンドが、赤血球凝集素であり、か
つ前記カウターリセプターが、赤血球凝集素に特異的な
抗体である請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】前記リガンドが、ポリヒスチジンであり、
かつ前記カウターリセプターが、ニッケルである請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項６】前記リガンドが、マルトース結合タンパク
質であり、かつ前記カウターリセプターが、アミロース
である請求項１または２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18460594A | 1994-01-21 | 1994-01-21 | |
| US08/184,605 | 1994-01-21 | ||
| PCT/US1995/000912 WO1995019988A1 (en) | 1994-01-21 | 1995-01-23 | Materials and methods relating to proteins that interact with casein kinase i |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08509132A JPH08509132A (ja) | 1996-10-01 |
| JP3468523B2 true JP3468523B2 (ja) | 2003-11-17 |
Family
ID=22677596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51972295A Expired - Fee Related JP3468523B2 (ja) | 1994-01-21 | 1995-01-23 | ガゼインキナーゼ▲ｉ▼と相互作用するタンパク質に関連する方法および物質 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5846764A (ja) |
| EP (1) | EP0690874B1 (ja) |
| JP (1) | JP3468523B2 (ja) |
| AT (1) | ATE190984T1 (ja) |
| CA (1) | CA2158749A1 (ja) |
| DE (1) | DE69515743T2 (ja) |
| ES (1) | ES2146749T3 (ja) |
| WO (1) | WO1995019988A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989808A (en) | 1994-06-14 | 1999-11-23 | American Cyanamid Company | Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs |
| US6770446B1 (en) | 1994-06-14 | 2004-08-03 | Wyeth | Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs |
| US6025485A (en) | 1997-02-14 | 2000-02-15 | Arcaris, Inc. | Methods and compositions for peptide libraries displayed on light-emitting scaffolds |
| US5955275A (en) * | 1997-02-14 | 1999-09-21 | Arcaris, Inc. | Methods for identifying nucleic acid sequences encoding agents that affect cellular phenotypes |
| US6623922B1 (en) | 1997-02-14 | 2003-09-23 | Deltagen Proteomics | Methods for identifying, characterizing, and evolving cell-type specific CIS regulatory elements |
| US5989897A (en) * | 1997-03-24 | 1999-11-23 | University Technology Corporation | Yeast silencing genes proteins and methods |
| WO2000036100A1 (en) * | 1998-12-17 | 2000-06-22 | The University Of Western Ontario | Protein kinase targeting protein |
| US6512102B1 (en) | 1998-12-31 | 2003-01-28 | Chiron Corporation | Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I |
| CN1327058A (zh) * | 2000-06-07 | 2001-12-19 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人粘着斑激酶23.43和编码这种多肽的多核苷酸 |
| EP1225181A1 (en) * | 2001-01-12 | 2002-07-24 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Protein expression and structure resolution using specific fusion vectors |
| US6448057B1 (en) * | 2001-03-22 | 2002-09-10 | Applera Corporation | Isolated human casein kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human casein kinase proteins, and uses thereof |
| US20030236188A1 (en) * | 2001-05-03 | 2003-12-25 | Spytek Kimberly A. | Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same |
-
1995
- 1995-01-23 US US08/376,843 patent/US5846764A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-23 CA CA002158749A patent/CA2158749A1/en not_active Abandoned
- 1995-01-23 WO PCT/US1995/000912 patent/WO1995019988A1/en active IP Right Grant
- 1995-01-23 DE DE69515743T patent/DE69515743T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-23 JP JP51972295A patent/JP3468523B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-23 EP EP95909308A patent/EP0690874B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-23 ES ES95909308T patent/ES2146749T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-23 AT AT95909308T patent/ATE190984T1/de active
- 1995-06-06 US US08/468,036 patent/US5728806A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ｂａｒｔ Ｓｃｈｅｒｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ３２５６０ ｂｐ Ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｌｅｆｔ Ａｒｍ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩ．，ＹＥＡＳＴ，米国，１９９３年，Ｖｏｌ．９，１３５５−１３７１ |
| Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＲＡＳ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ．．．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，米国，１９８８年，Ｖｏｌ．８ Ｎｏ．５，２１５９−２１６５ |
| Ｍｅｒｌ Ｆ．Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，ＨＲＲ２５，ａ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｕｄｄｉｎｇ Ｙｅａｓｔ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ Ｄａｍａｇｅｄ ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国，１９９１年 ８月３０日，Ｖｏｌ．２５３，１０３１−１０３４ |
| Ｘｉａｏｌｕ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国，１９９２年 ７月３１日，Ｖｏｌ．２５７，６８０−６８２ |
| Ｘｉｎ−Ｓｈｅｎｇ Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ １２−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ．．．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３年，Ｖｏｌ．２１４，８４５−８５２ |
| 堀越弘毅ら，工学のための遺伝子工学，日本，講談社サイエンティフィック，１９９２年１０月 １日，１８３−１８５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5846764A (en) | 1998-12-08 |
| CA2158749A1 (en) | 1995-07-27 |
| ES2146749T3 (es) | 2000-08-16 |
| WO1995019988A1 (en) | 1995-07-27 |
| DE69515743D1 (de) | 2000-04-27 |
| EP0690874B1 (en) | 2000-03-22 |
| JPH08509132A (ja) | 1996-10-01 |
| EP0690874A1 (en) | 1996-01-10 |
| DE69515743T2 (de) | 2000-11-02 |
| US5728806A (en) | 1998-03-17 |
| ATE190984T1 (de) | 2000-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cyert et al. | Regulatory subunit (CNB1 gene product) of yeast Ca2+/calmodulin-dependent phosphoprotein phosphatases is required for adaptation to pheromone | |
| Xu et al. | Cloning of rat MEK kinase 1 cDNA reveals an endogenous membrane-associated 195-kDa protein with a large regulatory domain. | |
| Wittmann et al. | Interaction of the viral protein genome linked of turnip mosaic potyvirus with the translational Eukaryotic Initiation Factor (iso) 4E ofArabidopsis thalianaUsing the Yeast two-hybrid system | |
| JP4450767B2 (ja) | サイクリックｇｍｐ結合性、サイクリックｇｍｐ特異的ホスホジエステラーゼの材料および方法 | |
| Müller et al. | The MAP kinase kpp2 regulates mating and pathogenic development in Ustilago maydis | |
| Bower et al. | Two members of the thioredoxin-h family interact with the kinase domain of a Brassica S locus receptor kinase. | |
| Adachi et al. | A globular complex formation by Nda1 and the other five members of the MCM protein family in fission yeast | |
| Leatherwood et al. | Interaction of Cdc2 and CdclS with a fission yeast ORC2-like protein | |
| Lauber et al. | The HeLa 200 kDa U5 snRNP‐specific protein and its homologue in Saccharomyces cerevisiae are members of the DEXH‐box protein family of putative RNA helicases. | |
| US5691147A (en) | CDK4 binding assay | |
| JP3091769B2 (ja) | プロテインキナーゼ | |
| JP3354149B2 (ja) | 哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするｄｎａ | |
| WO1998037181A2 (en) | Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein | |
| JP3468523B2 (ja) | ガゼインキナーゼ▲ｉ▼と相互作用するタンパク質に関連する方法および物質 | |
| Riera et al. | Maize protein kinase CK2: regulation and functionality of three β regulatory subunits | |
| US6218142B1 (en) | Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP) | |
| AU730811B2 (en) | AFC1 and RCE1:isoprenylated CAAX processing enzymes | |
| CA2294646A1 (en) | Human catalytic telomerase sub-unit and its diagnostic and therapeutic use | |
| JPH11332586A (ja) | 高活性アルカリ性ホスファタ―ゼ | |
| JP4033490B2 (ja) | ホスファターゼモデュレーター | |
| JPH09509319A (ja) | Ｒｎａ修正酵素およびその使用方法 | |
| Feng et al. | Identification and characterization of Saccharomyces cerevisiae Cdc6 DNA-binding properties | |
| JPH07505057A (ja) | プロテインキナーゼ | |
| Murphy et al. | Identification of amdX, a new Cys‐2–His‐2 (C2H2) zinc‐finger gene involved in the regulation of the amdS gene of Aspergillus nidulans | |
| US5861498A (en) | Nucleotides encoding immunophilin FKBP46 and fragments thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |