DE69332512T2 - Enzymatische Hydrolyse von Proteinen - Google Patents
Enzymatische Hydrolyse von ProteinenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
- Es sind verschiedene Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen bekannt, die sich beispielsweise durch die Wahl des Substrats, des Enzyms, des Hydrolysegrads und/oder des gewünschten Peptidprofils unterscheiden. Wenn beispielsweise aus Gründen der Assimilation des Hydrolysats durch die Darmschleimhaut ein relativ genau definiertes Peptidprofil, insbesondere ein enges Oligopeptidprofil angestrebt wird, umfassen die bekannten Hydrolyseverfahren im Allgemeinen mindestens einen Schritt der Filtration oder Siebung des Hydrolysats.
- So beschreibt EP 226 221 beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung von hypoallergenen Peptiden mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und 6000 durch einen oder mehrere Schritte der enzymatischen Proteinhydrolyse, die jeweils unkontinuierlich in einem Fermentationsbehälter durchgeführt werden und jeweils mit einem Ultrafiltrationsschritt enden.
- US 4 212 889 beschreibt ein Verfahren zur Solubilisierung von Fischproteinen, bei dem man kontinuierlich eine Mischung aus Fischfleisch und Enzym über eine Anlage führt, die mehrere in Reihe angeordnete Hydrolysebehälter umfasst.
- EP-A-0 322 589 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Molkeprotelznhydrolysats und eines hypoallergenen Nahrungsmittels, bei dem man ein Molkeprodukt enzymatisch in zwei getrennten Hydrolyseschritten hydrolysiert, wobei das Hydrolysat der ersten Hydrolyse so thermisch behandelt wird, dass die nach der ersten Hydrolyse intakt gebliebenen Proteine denaturiert werden und der zweiten Hydrolyse unterzogen werden können, so dass das Hydrolysat nach der zweiten Hydrolyse frei von Allergenen, wie Proteinen, Proteinfragmenten oder Makropeptiden mit einem Molekulargewicht über 10.000 ist.
- Ziel der Erfindung ist es, ein Hydrolyseverfahren zu schaffen, das kontinuierlich durchgeführt wird und die Wirksamkeit einer diskontinuierlichen Hydrolyse im Behälter erreichen oder verbessern kann und die Herstellung eines Proteinhydrolysats mit einem genau definierten und reproduzierbaren Hydrolysegrad und/oder Peptidspektrum gestattet.
- Zu diesem Zweck unterzieht man in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen ein Proteinhydrolysat einer kontinuierlichen Hydrolyse mit einem proteolytischem Enzym, führt einen ersten, relativ kurzen Schritt der enzymatischen Hydrolyse im Behälter unter Rühren und einen zweiten, relativ langen Schritt der enzymatischen Hydrolyse im Rohr durch, führt den ersten Schritt während 10-60 Minuten durch, indem man den pH-Wert und die Temperatur auf Werte einstellt, die für die Aktivität des Enzyms günstig sind, führt den zweiten Schritt während 1-8 h durch, indem man die Temperatur auf einen Wert einstellt, der gleich der Temperatur des ersten Schritts oder höher ist, und nimmt den zweiten Hydrolyseschritt in einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohr vor.
- Die Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens weist einen doppelwandigen Hydrolysebehälter mit Rührvorrichtung auf, der stromauf mit einer Substratdosiervorrichtung und mit einer Enzymdosiervorrichtung verbunden ist und stromab mit mindestens einem Hydrolyserohr verbunden ist, wobei das Hydrolyserohr mit statischen Mischerelementen ausgerüstet ist und relativ große Abmessungen besitzt und der Behälter relativ kleine Abmessungen besitzt.
- Man hat festgestellt, dass es auf diese Weise möglich ist, vorzugsweise kontinuierlich mit einer guten Wirksamkeit und einer guten Reproduzierbarkeit ein Proteinhydrolysat herzustellen, dessen Hydrolysegrad und/oder Peptidspektrum genau definiert sind.
- Dank dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung ist es insbesondere möglich, mit einem Behälter mit relativ kleinen Abmessungen, den man vollständig füllen kann, ohne Kopfraum bestehen zu lassen, und mit einem Rohr mit relativ großen Abmessungen zu arbeiten. Man kann also kontinuierlich einen relativ kurzen ersten Schritt durchführen, das heißt einen Anfangsschritt der Hydrolyse in einem relativ kleinen Behälter, und einen relativ langen zweiten Schritt, das heißt einen Schritt der Beendigung der Hydrolyse in einem Rohr mit einem relativ großen Volumen. Auf diese Weise kann die Reaktionszeit, mit anderen Worten, die Verweilzeit des Substrats im Gesamtvolumen, das von der Summe des Volumens des Behälters und des Volumens des Rohrs dargestellt wird, beispielsweise über Dosierpumpen genau und einfach gesteuert werden.
- Wenn man zum Vergleich eine Hydrolyse in einem einzigen großen Hydrolysebehälter durchführen möchte, kann die Verweilzeit eines Hydrolysateinzelvolumens nicht genau definiert werden. Dies trifft für eine diskontinuierliche Hydrolyse zu, wobei beispielsweise die für die Herstellung von bestimmten pH- und/oder Temperaturbedingungen und auch zum Entleeren des Behälters erforderlichen Zeiten nicht vernachlässigbar sind. Dies trifft jedoch um so mehr bei einer kontinuierlichen Hydrolyse zu, bei der nur eine mittlere Verweilzeit definiert werden kann. Selbst in einem Verfahren, wie es in der oben genannten Schrift US 4 212 889 beschrieben wird, kann die Verweilzeit kaum genau definiert werden.
- Dagegen hat sich herausgestellt, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Verweilzeit eines Hydrolysateinzelvolumens bemerkenswert genau definiert werden kann, da der Strom des Hydrolysats im Hydrolyserohr, das vorzugsweise mit statischen Mischerelementen ausgerüstet ist, eine sehr flache Front aufweisen kann. In der vorliegenden Beschreibung definiert man einen Hydrolysegrad über die Nichtproteinstickstoffmenge (NPN), die als Prozentsatz des nicht mit 13%-iger Trichloressigsäure ausfällbaren Gesamtstickstoffs bestimmt wird.
- Die Stickstoffgehalte werden durch die Methode Kjeldahl bestimmt.
- Die Aminostickstoffgehalte (freies alpha-NH&sub2;) werden durch Reaktion mit Ninhydrin nach alkalischer Hydrolyse bestimmt.
- Der Abfall von exogenem Serotonin, das mit Tritium (³H-Serotonin) markiert ist, wird an normalen Mastozyten der Peritonealhöhle der Ratte nach der von R. Fritsche und M. Bonzon in Int Arch Allerg Immunol 93, 289-293 (1990), beschriebenen Methode getestet.
- Die ELISA-Inhibitionstests werden mit spezifischen Kaninchenantikörpern für Beta-lactoglobulin (BLG), Rinderserumalbumin (BSA) und Casein (CAS) durchgeführt. Die Empfindlichkeit der Methode, mit anderen Worten, die Konzentrationsgrenze der Erfindung beträgt 20 ng/ml.
- Die Analysen durch Hochleistungs-Flüssigchromatografie (HPLC- Tests, Peptidprofile) werden bei nicht denaturierenden Bedingungen auf Gel auf Siliziumbasis Type TSK-G2000-SW der Firma Toyo Soda, dessen Trennbereich sich von 500 bis 50000 Dalton erstreckt, in einer Säule BIOSIL SEC-125 der Firma BIORAD durchgeführt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in -% der Oberflächenverteilung der Peaks, abgelesen bei 220 nm in Phosphatlösung 0,1 M + NaCl 0,4 M bei pH 6,80.
- Die Analysen durch Polyacrylamidgelzonenelektrophorese (SDS- PAGE-Tests) werden nach der von Laemmli in Nature 227, 680 und folgende (1970), beschriebenen Methode durchgeführt.
- Die Lysin-Blockierung wird durch HPLC bestimmt und in % blockiertes Lysin, bezogen auf das Gesamtlysin des Hydrolysats ausgedrückt.
- Unter "statischen Mischerelementen" kann man Kreuzelemente oder gewellte Lamellen aus Metall oder Kunststoff verstehen, die sich kreuzen oder ineinander greifen und den von diesem Rohr umgrenzten Raum in eine Vielzahl von Kanälen unterteilen, die sich kreuzen, indem sie in der Achse des Rohrs fortschreiten. Derartige Elemente werden beispielsweise von der Firma Sulzer A.G., CH-8401 Winterthur, unter der Bezeichnung SMV, SMX oder SMXL vertrieben.
- Es sei darauf hingewiesen, dass in der vorliegenden Beschreibung diese mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohre systematisch mit einem doppelten Mantel versehen sind, auch wenn dies nicht erwähnt wird.
- Zur Durchführung des Verfahrens kann man als Proteinsubstrat jedes an Proteinen reiche Nahrungsmittelausgangsmaterial verwenden, wie beispielsweise Mehl oder Grieß von Kernen oder von Presskuchen von Ölpflanzen, Hefen oder Nahrungsmittelbakterien, gehacktes Tier- oder Fischfleisch oder Milch oder Milchderivate in Form von Teilchen in wässriger Suspension oder von wässriger Suspension.
- Das Proteinsubstrat ist vorzugsweise ein Molkesubstrat, das die Molkeproteine enthält, insbesondere Süßmolke der Käseherstellung oder Sauermolke der Kaseinherstellung, so, wie es ist, oder in entmineralisierter oder von Lactose befreiter, flüssiger oder rekonstituierter Form.
- Das Enzym wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Trypsin, Chymotrypsin, Pancreatin, bakteriellen Proteasen, Pilzproteasen und ihrem Mischungen besteht.
- Man kann das proteolytische Enzym und das Substrat in einem Verhältnis von einer Enzymmenge mit einer Aktivität von 0,1 - 12 Anson-Einheiten (AU) auf 100 g Trockenmasse des Substrats mischen.
- Man führt den ersten Hydrolyseschritt während 10-60 min durch, indem man den pH-Wert und die Temperatur auf Werte einstellt, die für die Aktivität des Enzyms günstig sind, und man führt den zweiten Hydrolyseschritt während 1-8 h durch, indem man die Temperatur auf einen Wert einstellt, der gleich der Temperatur des ersten Schritts oder höher als dieser ist, und zwar insbesondere um 0-10ºC.
- Man kann Zwischenschritte oder ergänzende Schritte vorsehen, und zwar insbesondere beispielsweise einen Vormischschritt vorzugsweise in dem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohr; einen Schritt der thermischen Denaturierung vor, während oder nach dem ersten Hydrolyseschritt, und zwar insbesondere mit Hilfe eines Wärmetauschers oder in einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohr; einen oder mehrere Schritte der Enzyminaktivierung, insbesondere nach dem zweiten Hydrolyseschritt, und zwar insbesondere mit Hilfe eines Wärmetauschers und/oder einer Dampfeinspritzvorrichtung und/oder eines mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohrs; und/oder einen Kühlschritt insbesondere nach einem Denaturierungsschritt, und zwar insbesondere mit Hilfe eines Wärmetauschers oder vorzugsweise in einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohr.
- Man kann das Enzym in einem oder vorzugsweise in zwei Schritten inaktivieren, wobei ein erster Schritt, genauer gesagt, einer Selbstverdauung des Enzyms entspricht, und ein zweiter Schritt, genauer gesagt, einer Sterilisation entspricht.
- Man kann den zweiten Hydrolyseschritt im Rohr in mindestens zwei Teile teilen, die in mindestens zwei in Reihe geschalteten Rohren durchgeführt werden. In diesem Fall kann man zwischen zwei aufeinander folgenden Rohren eine pH-Einstellung vornehmen und/oder Enzym zusetzen.
- Für die pH-Einstellung/en verwendet man vorzugsweise ein geeignetes Reagenz, und zwar entweder ein alkalisches Reagenz, wie KOH, NaOH oder Ca(OH)&sub2;, oder ein saures Reagenz, wie HCl oder HPO&sub4;.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wählt man als Enzym eine bakterielle alkalische Protease, insbesondere die, die von Bacillus licheniformis erzeugt wird und von der Firma Novo unter der Bezeichnung "Alcalase" vertrieben wird, und zwar insbesondere beispielsweise "Alcalase 0.6 L" oder "Alcalase 2.4 L".
- Man hat festgestellt, dass man mit dieser bevorzugten Ausführungsform ein Hydrolysat erhalten kann,. das einen besonders hohen NPN und eine besonders geringe Allergenität aufweist.
- Zu diesem Zweck kann man diesem ersten Hydrolyseschritt bei einem pH von 7,0-10,0 bei 50-80ºC, vorzugsweise bei 63- 73ºC, und den zweiten Hydrolyseschritt bei einem pH von 6,5- 8,0 bei 55-80ºC, vorzugsweise bei 65-73ºC durchführen. Man kann vor dem ersten Hydrolyseschritt oder zwischen den beiden Hydrolyseschritten einen Schritt der thermischen Denaturierung bei 80-120ºC, vorzugsweise bei 85-95ºC, während 30 s bis 10 min. vorzugsweise während 4-6 min durchführen. Dann kann man das Enzym durch einen Schritt der Selbstverdauung bei 70- 110ºC, vorzugsweise 85-90ºC während 10 s bis 20 min. vorzugsweise während 2-8 min. inaktivieren, worauf ein Sterilisationsschritt bei 110-150ºC, vorzugsweise bei 120-130ºC, während 5 s bis 5 min. vorzugsweise während 30 s bis 2 min. folgt.
- Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wählt man als Enzym eine Kombination, die einerseits aus einer bakteriellen alkalischen Protease besteht, wie sie insbesondere von Bacillus licheniformis erzeugt wird und von der Firma Novo unter der Bezeichnung "Alcalase", insbesondere "Alcalase 0,6 L" oder "Alcalase 2,4 L", vertrieben wird, und andererseits aus einem Pankreasenzym, beispielsweise insbesondere Trypsin.
- Bei dieser anderen bevorzugten Ausführungsform kann man zwei Substraten, insbesondere zwei Molkesubstrate, jeweils einer getrennten Hydrolyse mit dem einen dieser beiden Enzyme gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unterziehen, und zwar bis zu einem gemeinsamen Schritt, vorzugsweise bis zu einem gemeinsamen Schritt der Sterilisation, der auf zwei getrennte Selbstverdauungsschritte der beiden verschiedenen Enzyme folgt. Man kann auch ein und dasselbe Substrat nacheinander der Einwirkung des einen und dann des anderen dieser beiden Enzyme aussetzen. Man hat nämlich festgestellt, dass ein Hydrolyseprodukt beispielsweise von Molkeproteinen, das durch diese Kombination erhalten wird, eine besonders gute Lagerstabilität aufweisen kann.
- Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Pankreasenzym, insbesondere Trypsin, kann man insbesondere im Rahmen der oben erwähnten Kombination in vorteilhafter Weise die in der EP 322 589 beschriebenen pH- und Temperaturbedingungen verwenden.
- Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist einen Hydrolysebehälter mit doppeltem Mantel und mit einer Rührvorrichtung auf, der stromauf mit einer Substratdosiervorrichtung und mit einer Enzymdosiervorrichtung verbunden ist und stromab mit mindestens einem Hydrolyserohr verbunden ist, das mit statischen Mischerelementen ausgerüstet ist.
- Bei dieser Vorrichtung kann das Rohr vertikal angeordnet sein, wobei sein unteres Ende mit dem Behälter verbunden ist und sein oberes Ende in eine Austrittsleitung ausmündet. Es kann auch horizontal oder in jeder anderen Stellung angeordnet sein. Es besitzt vorzugsweise eine Länge von mehr als dem Vierfachen seines Durchmessers.
- Die Substratdosiervorrichtung und die Enzymdosiervorrichtung weisen jeweils einen Versorgungsbehälter auf, der über eine Zumesspumpe mit dem Hydrolysebehälter verbunden ist. Die Vorrichtung kann außerdem eine Reganzdosiervorrichtung aufweisen, die einen Versorgungsbehälter besitzt, der mit dem Hydrolysebehälter über eine Zumesspumpe verbunden ist, die durch einen pH-Messer gesteuert wird.
- Die Vorrichtung kann auch mehrere mit statischen Mischerelementen ausgerüstete Hydrolyserohre aufweisen, die stromab des Behälters durch Verbindungsleitungen in Reihe geschaltet sind, die stromaufwärts mit der Enzymdosiervorrichtung und mit der Reagenzdosiervorrichtung verbunden sein können.
- Man kann auch ein mit statischen Mischerelementen ausgerüstetes Rohr zwischen der Enzymdosiervorrichtung, der Substratdosiervorrichtung und/oder der Reganzdosiervorrichtung und dem Behälter vorsehen:
- Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Nachstehenden unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung beschrieben, die zwei Ausführungsbeispiele dieser Vorrichtung zeigt. In dieser Zeichnung zeigen:
- Fig. 1 eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform der Vorrichtung mit einem Behälter und einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Rohr,
- Fig. 2 eine schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform der Vorrichtung mit einem Behälter und mehreren mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Hydrolyserohren.
- Wie Fig. 1 zeigt, besitzt die Vorrichtung einen Hydrolysebehälter 1 mit doppeltem Mantel 2 und einer durch einen Motor 4 angetriebenen Rührvorrichtung 3. Dieser Behälter ist durch einen Deckel 5 dicht geschlossen, durch welchen verschiedene Leitungen und die Achse der Rührvorrichtung 3 hindurchtreten.
- Der Hydrolysebehälter 1 ist stromauf durch eine Leitung 6 mit einer Substratdosiervorrichtung 7-11, durch eine Leitung 12 mit einer Enzymdosiervorrichtung 13-17 und durch eine Leitung 18 mit einer Reagenzdosiervorrichtung 19-24 verbunden.
- Die Substratdosiervorrichtung besteht aus einem Behälter 7 zur Versorgung mit Substrat mit doppeltem Mantel 8 und einer Rührvorrichtung 9, die durch einen Motor 10 angetrieben wird. Der Behälter 7 ist mit dem Hydrolysebehälter 1 über die in der Leitung 6 vorgesehene Zumesspumpe 11 verbunden.
- Die Enzymdosiervorrichtung besitzt einen Behälter 13 zur Versorgung mit Enzym mit doppeltem Mantel 14 und einer Rührvorrichtung 15, die durch einen Motor 16 angetrieben wird. Der Behälter 13 ist mit dem Hydrolysebehälter 1 über die in der Leitung 12 angeordnete Zumesspumpe 17 verbunden.
- Die Reagenzdosiervorrichtung besitzt einen Behälter 19 zur Versorgung mit Reagenz, der mit dem Hydrolysebehälter 1 über eine in der Leitung 18 angeordnete Zumesspumpe 20 verbunden ist. Diese Zumesspumpe 18 wird durch einen pH-Messer 21 gesteuert, dessen Messelektrode 24 durch den Deckel 5 hindurch in den Behälter 1 eintaucht und der elektrisch (unterbrochene Linie 23) mit einer nicht dargestellten elektronischen Vorrichtung zur Steuerung der Pumpe 20 verbunden ist.
- Der Hydrolysebehälter 1 ist stromab mit einem Hydrolyserohr 25 mit doppeltem Mantel 26 verbunden, das mit statischen Mischerelementen 27 ausgerüstet ist, die aus ineinander geschachtelten Kreuzelementen aus Metall oder Kunststoff bestehen. Der Behälter 1 ist mit dem Rohr 25 durch eine Leitung verbunden, in der ein Dreiwegeventil 29 vorgesehen ist, das für die Durchführung von Hydrolysatentnahmen aus dem Behälter bestimmt ist. Das Rohr 25 ist vertikal angeordnet, wobei sein unteres Ende mit dem Behälter 1 verbunden ist und sein oberes Ende in eine Austrittsleitung 30 mündet.
- Die Temperatur eines in jedem der doppelten Mäntel umlaufenden Fluids wird durch eine Vorrichtung reguliert, die bei dem Hydrolysebehälter 1 symbolisch mit 31, bei dem Behälter 7 mit 32, bei dem Behälter 13 mit 33 und bei dem Rohr 25 mit 34 dargestellt ist.
- In Fig. 2 sind die Elemente dieser zweiten Ausführungsform der Vorrichtung, die den Elementen der ersten Ausführungsform gemäß Fig. 1 entsprechen, mit denselben Bezugszahlen versehen.
- Bei dieser zweiten Ausführungsform besitzt die Vorrichtung mehrere Hydrolyserohre 25, 35, 36, die mit statischen Mischerelementen 27, 37, 38 ausgerüstet sind und stromab des Hydrolysebehälters 1 durch Verbindungsleitungen 39, 40 in Reihe geschaltet sind, die stromaufwärts mit dem Enzymversorgungsbehälter 13 durch Leitungen 41, 42 verbunden sind, die in die Leitung 12 münden, in welcher die Zumesspumpe 17 angeordnet ist.
- Diese Verbindungsleitungen 39, 40 sind ferner stromaufwärts mit dem Reagenzversorgungsbehälter 19 über Leitungen 43, 44 verbunden, die in die Leitung 18 münden, in welcher die Zumesspumpe 20 angeordnet ist.
- Bei dieser zweiten Ausführungsform der Vorrichtung ist ferner ein mit statischen Mischerelementen ausgerüstetes Mischrohr 45 zwischen der Enzymdosiervorrichtung, der Substratdosiervorrichtung und der Reagenzdosiervorrichtung und dem Hydrolysebehälter 1 vorgesehen.
- Die verschiedenen Behälter zur Versorgung mit Enzym, Substrat und Reagenz sind mit diesem Rohr 45 durch Leitungen 46, 47, 48 verbunden, in denen die Zumesspumpe 29, die Zumesspumpe 11 bzw. die Zumesspumpe 20 angeordnet ist.
- Die nachstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Prozentsätze und Anteile beziehen sich darin auf das Gewicht.
- Man führt das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer ähnlichen Vorrichtung durch, wie sie unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben wurde, in der der Hydrolysebehälter ein Volumen von 30 l besitzt und das mit statischen Mischerelementen ausgerüstete Hydrolyserohr ein Volumen von 180 l bei einer Höhe von 3 m besitzt.
- Als Substrat verwendet man ein teilweise entmineralisiertes Molkeproteinkonzentrat mit einem Trockenmassegehalt von 20% und folgenden Gehalten (in Prozent der Trockenmasse): etwa 23% Proteine, 1,9% Fett, 73% Lactose und 1,3% Aschen.
- Man verwendet als Enzym Schweinetrypsin mit einer Aktivität von 3 AU/g in einer Menge von 1 g Enzym auf 100 g Trockenmasse des Substrats, das heißt 3 AU pro 100 g Trockenmasse des Substrats.
- Man verwendet als Reagenz 2N KOH.
- Zunächst füllt man den Hydrolysebehälter mit Substrat, mischt darin das Enzym und lässt das Hydrolyseverfahren unkontinuierlich während 15 min bei pH 7,3 und 60ºC anlaufen, worauf das hydrolysierte Substrat einen NPN von 40% aufweist.
- Dann führt man den Prozess kontinuierlich mit einem solchen Durchsatz weiter, dass die mittlere Verweilzeit des Substrats im Hydrolysebehälter 30 min und die Verweilzeit des Hydrolysats im Rohr 3 h beträgt. Man erhält in dem Hydrolysebehälter eine Temperatur von 60ºC und einen pH von 7,3 aufrecht. Im Rohr erhält man eine Temperatur von 60ºC aufrecht und lässt den pH-Wert driften, so dass er von selbst von 7,3 am Eintritt auf etwa 6,9 am Austritt abnimmt.
- Das Hydrolysat besitzt einen NPN von 65% am Austritt des Rohrs.
- Wenn man zum Vergleich eine Hydrolyse desselben Substrats mit demselben Enzym in demselben Verhältnis Enzym/Substrat diskontinuierlich in einem Behälter von 200 l mit pH 7,3 und 60ºC während etwa 7 h durchführt, erhält man ein Hydrolysat mit einem NPN von 60%.
- Man geht auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 vor, wobei man jedoch bei drei verschiedenen Versuchen das Nutzvolumen des Hydrolysebehälters so ändert, dass das nach dem Durchgang des Substrats durch den Behälter erhaltene NPN 15, 35 bzw. 45% beträgt.
- Man erhält dabei am Austritt des Rohrs Hydrolysate mit NPN von 59, 63 bzw. 66%.
- Zum Vergleich erhält man unter denselben Bedingungen bei diskontinuierlichem Betrieb im Behälter und zwar bei pH 7,3 und 60ºC, mit einem Substrat mit 20% Trockenmasse und einer Enzymmenge mit einer Aktivität von 3 AU pro 100 g Trockenmasse des Substrats in etwa 7 h einen NPN von 60%.
- Mit anderen Worten, mit dem vorliegenden Verfahren erhält man bei kontinuierlichem Betrieb einen höheren NPN als den, den man im diskontinuierlichen Betrieb erhalten würde, wenn das Substrat am Eintritt des Rohrs einen NPN über etwa 35% aufweist.
- Man geht auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 vor, wobei man jedoch im Behälter anstelle von pH 7,3 und 60ºC einen pH-Wert von 7, 8 und eine Temperatur von 55 W aufrecht erhält.
- Man erhält am Austritt des Rohrs ein Hydrolysat mit einem NPN von 70%.
- Man führt das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer Vorrichtung durch, die ähnlich wie die in Bezugnahme auf Fig. 2 beschriebene Vorrichtung ausgebildet ist.
- Man verwendet als Substrat ein Molkeproteinkonzentrat mit einem Trockenmassegehalt von 33%, wovon 7,5% Proteine sind.
- Als Enzym verwendet man eine bakterielle alkalische Protease, die durch Bacillus licheniformis produziert wird und von der Firma Novo unter der Bezeichnung "Alcalase 2.4 L" vertrieben wird, die eine Aktivität von 2,4 AU/g besitzt. Man verwendet dieses Enzym in einer Gesamtmenge von 4-8,6%, bezogen auf das Protein, das sind 2,2-4,7 AU auf 100 g Trockenmasse des Substrats.
- Man verwendet als Reagenz 2N KOH.
- Nachdem man den Prozess in geeigneter Weise angefahren hat, führt man ihn kontinuierlich weiter. Der Substratdurchsatz und die Abmessungen der Rohre und des Hydrolysebehälters sind so bestimmt, dass die Verweilzeiten des Substrats oder des Hydrolysats betragen: 5-10 min in einem vor dem Hydrolysebehälter vorgesehenen Vormischrohr, das mit statischen Mischerelementen ausgerüstet ist, 5-8 min in einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten thermischen Denaturierungsrohr, das zwischen dem Vormischrohr und dem Hydrolysebehälter in Reihe geschaltet ist, 25-40 min im Hydrolysebehälter (erster Hydrolyseschritt), 15-25 min in einem mit statischen Mischerelementen ausgerüstetem erstem Rohr A, das auf den Hydrolysebehälter folgt (Rohr A des 2. Hydrolyseschritts), 15-25 min in einem zweiten, mit statischen Mischerelementen ausgerüstetem Rohr B (Rohr B des zweiten Hydrolyseschritts), 0-100 min in einem dritten, mit statischen Mischerelementen ausgerüstetem Rohr C (Rohr 2 im 2. Hydrolyseschritt), 5-20 min in einem mit statischen Mischerelementen ausgerüstetem Inaktivierungsrohr, das nach dem Rohr C in Reihe geschaltet ist, und 5- 15 min in einen mit statischen Mischerelementen ausgerüstetem Kühlrohr.
- Man teilt die Enzymgesamtmenge in vier Teile, und zwar in einen ersten Teil von 5-15% der Gesamtmenge, der dem Substrat im Vormischrohr beigemischt wird, einen zweiten Teil von 30- 40% der Gesamtmenge, der dem Substrat im Hydrolysebehälter beigemischt wird, einen dritten Teil von 20-30% der Gesamtmenge, die dem Substrat im Rohr A beigemischt wird, und einen vierten Teil von 20-30% der Gesamtmenge, der dem Substrat im Rohr B beigemischt wird.
- Man stellt den pH des Substrats auf 7,3 ein, und zwar bis zu diesem Rohr B, von dem an man den pH driften lässt.
- Die Temperatur wird im Vormischrohr auf 75ºC, im thermischen Denaturierungsrohr auf 85ºC, im Hydrolysebehälter auf 70ºC, im Rohr A und im Rohr B auf 71ºC, im Inaktivierungsrohr auf 80- 105ºC und im Kühlrohr auf 2-8ºC eingestellt.
- Man gewinnt das auf diese Weise erzeugte Hydrolysat hinter dem Kühlrohr.
- Man führt das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer ähnlichen Vorrichtung aus, wie sie in Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben wurde, bei der der Hydrolysebehälter ein Volumen von 2,8 l und das mit statischen Mischerelementen ausgerüstete Hydrolyserohr ein Volumen von 11,6 l auf einer Länge von etwa 5 m besitzt.
- Man verwendet als Substrat ein Molkeproteinsubstrat mit einem Trockenmassegehalt von 33%, wovon 7,5% Proteine sind.
- Man verwendet als Enzym Alcalase 2.4 L in einer Gesamtmenge von 6,3%, bezogen auf das Protein, das heißt 3,4 AU auf 100 g Trockenmasse des Substrats.
- Man verwendet als Reagenz 2N KOH,
- Man füllt zuerst den Behälter mit Substrat, mischt das Enzym bei und startet den Hydrolyseprozess diskontinuierlich bei pH 7,3 und bei 70ºC während 25 min.
- Dann führt man den Prozess kontinuierlich mit einem solchen Durchsatz weiter, dass die Gesamtverweilzeit des Hydrolysats in der Vorrichtung 240 min beträgt (47 min im Behälter und 193 min im Rohr). Man erhält im Behälter eine Temperatur von 70ºC und einen pH von 7,3 aufrecht. Im Rohr erhält man eine Temperatur von 70ºC aufrecht und lässt den pH driften, so dass er von selbst von etwa 7,3 am Eintritt auf etwa 6,72 am Austritt abnimmt.
- Man entnimmt und analysiert Proben am Austritt des Rohrs zu den Zeiten 0, 60, 120 und 180 min. und zwar gerechnet ab 240 min nach Ingangbringen des kontinuierlichen Prozesses. Die pH- Werte und die Aminostickstoffgehalte dieser Proben sind in der nachstehenden Tabelle I angeführt, in der auch die entsprechende Menge von KOH angeführt ist, die verwendet wird, um den pH im Hydrolysebehälter auf 7,3 zu halten. Tabelle I
- Die in g/h angegebenen KOH-Mengen entsprechen einem mittleren Verbrauch von 44,375 g pro 1 des Hydrolysebehälters bei einer Verweilzeit von 47 min.
- Man stellt in dieser Tabelle I fest, dass die am Hydrolysat gemessenen Merkmale sich praktisch nicht ändern, und zwar gleichgültig, zu welchem Zeitpunkt Proben am Austritt des Rohrs entnommen und analysiert werden. Man stellt auch durch Polyacrylamidgelzonen-Elektrophorese (SDS-Page-Methode) fest, dass das vorteilhafte Peptidprofil dieser Proben, vermehrt um kleine Peptide, ebenfalls bemerkenswert konstant bleibt.
- Zum Vergleich unterzieht man dasselbe Substrat einer enzymatischen Hydrolyse mit demselben Enzym in demselben Verhältnis Enzym zu Substrat bei diskontinuierlichem Betrieb in einem Behälter von 2 l bei 70ºC und einem auf 7,3 konstant gehaltenen pH während 47 min. Nach diesen ersten 47 min lässt man den pH driften. Man entnimmt und analysiert Proben zur Zeit 47 min nach Beginn der Hydrolyse und dann zu verschiedenen Zeiten bis zu 240 min und darüber hinaus. Diese Proben besitzen die in der nachstehenden Tabelle II angegebenen pH-Werte und Aminostickstoffgehalte. Tabelle II
- Die KOH-Menge, die verwendet wird, um den pH während der ersten 47 min auf 7,3 zu halten, beträgt 45,5 g pro 1 des Behälters.
- Man stellt in Tabelle II fest, dass die Merkmale, die an dem diskontinuierlich im Behälter erhaltenen Hydrolysat gemessen werden, sich schnell ändern, und zwar auch nach der Zeit von 240 min. die der Verweilzeit im kontinuierlichen Prozess in dem im vorliegenden Beispiel 5 verwendeten Gerät entspricht.
- Dies zeigt einen der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem keine Änderung des Produkts befürchtet werden muss, die mit der Änderung vergleichbar ist, die während der zum Leeren des Behälters in einem diskontinuierlichen Verfahren erforderlichen Zeit auftritt.
- Man führt das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer ähnlichen Vorrichtung durch, wie sie unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben wurde, bei welcher der Hydrolysebehälter ein Volumen von 5 l und das mit statischen Mischerelementen ausgerüstete Hydrolyserohr ein Volumen von 9,6 l auf einer Länge von etwa 5 m besitzt.
- Man verwendet als Substrat ein Molkeproteinsubstrat mit einem Trockenmassegehalt von 33%, wovon 7,5% Proteine sind.
- Man verwendet als Enzym Alcalase 2.4 L in einer Gesamtmenge von 8% vom Protein, das sind 4, 4 AU auf 100 g Trockenmasse des Substrats. Von diesen 8% werden 2% im Hydrolysebehälter verwendet und 6% am Eintritt des Rohrs zugesetzt.
- Man verwendet als Reagenz 2N KOH.
- Bei zwei getrennten Tests füllt man zuerst den Behälter mit Substrat, mischt Enzym bei und startet den Hydrolyseprozess diskontinuierlich bei pH 7,3 und bei zwei verschiedenen Temperaturen, und zwar 72,5 und 74ºC, während 40 min.
- Man führt dann jeden Prozess kontinuierlich mit einem solchen Durchsatz weiter, dass die Gesamtverweilzeit des Hydrolysats in der Vorrichtung 116 min beträgt (40 min im Behälter und 76 min im Rohr). Bei jedem der beiden Tests erhält man in dem Behälter Temperaturen von 72,5ºC bzw. 74ºC und einen pH-Wert von 7,3 aufrecht. Man erhält im Rohr eine Temperatur von 72ºC aufrecht und lässt in diesem den pH driften.
- Die auf diese Weise erhaltenen Hydrolysate, die den Temperaturen von 72,5ºC und 74ºC im Behälter entsprechen, haben NPN- Gehalte von 97,2% bzw. 91,4% und erfordern die Verwendung von einer jeweiligen Menge von 205 g/h und 198 g/h KOH, um den pH im Behälter auf 7,3 zu halten. Man beobachtet ferner durch Polyacrylämidgelzonen-Elektrophorese (SDS-Page-Methode), dass sie ein relativ enges Peptidprofil aufweisen.
- Man unterzieht ein Molkeproteinkonzentrat mit einem Trockenmassegehalt von 33%, wovon 7,5% Proteine sind, einer enzymatischen Hydrolyse mit Alcalase 2.4 L in einer Gesamtmenge von 4% vom Protein, was 2,2 AU auf 100 g Trockenmasse des Substrats ausmacht, kontinuierlich in einem Behälter von 5 l bei 70ºC während 200 min und bei pH-Werten von 6,4, 6,8, 7,3 bzw. 7,8 in vier verschiedenen Versuchen.
- Die dabei erhaltenen Hydrolysate haben NPN-Gehalte zwischen 80 und 83% und erfordern die Verwendung von KOH-Mengen in g/h von jeweils 33,4, 50; 1, 60,2 bzw. 77,2; um ihren pH auf 6,4, 6,8, 7,3 bzw. 7, 8 zu halten. Sie besitzen ferner Aminostickstoffgehalte von 0,17, 0,20, 0,21 bzw. 0,22%. Ferner stellt man durch SDS-Page-Test fest, dass sie ein relativ breites Peptidprofil aufweisen.
- Man führt das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer ähnlichen Vorrichtung durch, wie sie unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben wurde, in welcher der Hydrolysebehälter ein Volumen von 2,8 l und das mit statischen Mischerelementen ausgerüstete Hydrolyserohr ein Volumen von 11,6 l auf einer Länge von etwa 5 m besitzt.
- Man verwendet als Substrat ein Molkeproteinkonzentrat mit einem Trockenmassegehalt von 33%, wovon 7,5% Proteine sind.
- Man verwendet, als Enzym Alcalase 2.4 L in einer Gesamtmenge von 7% vom Protein, was 3,8 AU auf 100 g Trockenmasse des Substrats ausmacht. Von diesen 7% werden 2% in dem Behälter verwendet und 5% werden am Eintritt des Rohrs zugesetzt.
- Man verwendet als Reagenz 2H KOH.
- Man füllt zunächst den Behälter mit Substrat, mischt das Enzym bei und startet den Hydrolyseprozess diskontinuierlich bei pH 7,8 und 70ºC während 25 min.
- Dann führt man den Prozess kontinuierlich mit einem solchen Durchsatz weiter, dass die Verweilzeit des Hydrolysats 45 min im Behälter und 170 min im Hydrolyserohr beträgt, das heißt insgesamt 215 min. Man erhält im Behälter eine Temperatur von 70ºC und einen pH von 7,8 aufrecht. Man erhält im Rohr eine Temperatur von 70ºC aufrecht und lässt den pH driften, so dass er selbst von selbst etwa 7,8 am Eintritt bis etwa 6,67 am Austritt abnimmt.
- In einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Inaktivierungsrohr, das am Austritt des Hydrolyserohrs in Reihe geschaltet ist, inaktiviert man das Hydrolysat während 18 min bei 90ºC. In einem mit statischen Mischerelementen ausgerüsteten Kühlrohr, das stromab des Inaktivierungsrohrs in Reihe geschaltet ist, kühlt man das Hydrolysat auf Raumtemperatur.
- Am Austritt des Kühlrohrs entnimmt und analysiert man Proben, die den Zeiten 0, 60, 120, 180 und 240 min entsprechen, gerechnet am Austritt des Hydrolyserohrs ab 215 min nach Ingangtreten des kontinuierlichen Prozesses. Diese Proben zeigen die pH-Werte, Aminostickstoffgehalte, Lysin-Blockierungen und NPN-Gehalte, die in der nachstehenden Tabelle III angeführt sind, in der auch die entsprechende KOH-Menge angegeben wird, die verwendet wird, um den pH-Wert im Hydrolysebehälter auf 7,8 zu halten. Tabelle III
- In dieser Tabelle III stellt man fest, wie man auch in Tabelle I von Beispiel 5 sieht, dass die am Hydrolysat gemessenen Merkmale sich praktisch nicht ändern, und zwar gleichgültig, zu welchem Zeitpunkt man am Austritt des Hydrolyserohrs von ihm Proben entnimmt und analysiert.
- Man testet ferner das Peptidprofil und die hypoallergenen Eigenschaften des Produkts, das bei den Bedingungen gemäß dieses Beispiels erhalten wird, indem es den HPLC-, ELISA- und ³H- Serotonin-Tests unterzogen wird, deren Ergebnisse weiter unten in den Tabellen V, VI und VII angeführt sind.
- Zum Vergleich unterzieht man 160 kg desselben Substrats einer enzymatischen Hydrolyse mit demselben Enzym in einer Gesamtmenge von 7% vom Protein diskontinuierlich in einem Hydrolysebehälter bei 70ºC. Von diesen 7% Enzym werden 2% für einen ersten Teil der Hydrolyse bei pH 7,8 während 45 min verwendet, nach denen man den pH driften lässt. Nach 60 min setzt man die restlichen 5% Enzym zu und führt die Hydrolyse bei 70ºC und einem driftenden pH bis 215 min und darüber hinaus weiter.
- 120 min nach Beginn der Hydrolyse zieht man 20 kg Hydrolysat ab. Dasselbe nimmt man nach 150, 180, 200, 250, 300 und 360 min vor. Während des Betriebs entnimmt man nach 215 min eine Probe für die Analyse.
- Die den verschiedenen Entnahmen und Proben entsprechenden Hydrolysate werden sofort inaktiviert (in einem Wärmeaustauscher, 18 min bei 90ºC), dann auf Raumtemperatur gekühlt (in einem Wärmetauscher) und analysiert. Ihre pH-Werte, Aminostickstoffgehalte (% von Pulver mit 97% Trockenmasse), Lysinblockierungen und NPN-Gehalten sind in der nachstehenden Tabelle IV angeführt. Tabelle IV
- In dieser Tabelle IV stellt man genauso wie in der Tabelle II des Beispiels V fest, dass die Merkmale, die an dem diskontinuierlich im Hydrolysebehälter enthaltenen Hydrolysat gemessen werden, sich schnell ändern, und zwar auch nach den 215 min. die der Verweilzeit im kontinuierlichen Prozess in der im vorliegenden Beispiel 8 verwendeten Vorrichtung entsprechen.
- Dies bestätigt einen der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem keine Entwicklung des Produkts befürchtet werden muss, die mit der Entwicklung vergleichbar ist, die während der zum Entleeren des Behälters in einem diskontinuierlichen Verfahren erforderlichen Zeit auftritt.
- Man testet auch das Peptidprofil und die hypoallergenen Eigenschaften des bei den Bedingungen gemäß dem vorstehenden Vergleichsbeispiel erhaltenen Produkts zum Zeitpunkt 215 min. indem es den HPLC-, ELISA- und ³H-Serotonin-Tests unterzogen wird, deren Ergebnisse im Nachstehenden in den Tabellen V, VI und VII angeführt sind.
- Ähnliche Tests führt man an dem Produkt durch, das im Behälter kontinuierlich bei den einen pH-Wert von 7,3 entsprechenden Bedingungen des Vergleichsbeispiels (i) erhalten wird, und nimmt diese ebenfalls in die nachstehenden Tabellen V, VI und VII auf. Tabelle V Peptidprofil (HPLC-Test)
- Die Ergebnisse der Tests gemäß dieser Tabelle V zeigen deutlich, dass ein kontinuierlich im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hydrolysat ein mindestens ebenso enges und ebenso auf die kleinen Peptide zentriertes Peptidprofil wie ein zum Vergleich im Behälter diskontinuierlich erhaltenes Hydrolysat besitzen kann. Tabelle VI ELISA-Inhibitionstest Tabelle VII ³H-Serotonin-Abfall-Test
- Die Ergebnisse der Tests gemäß dieser Tabellen VI und VII zeigen, dass ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hydrolysat mindestens ebenso hypoallergen wie ein zum Vergleich diskontinuierlich im Behälter erhaltenes Hydrolysat sein kann.
- Man führ das erfindungsgemäße Verfähren auf die in Beispiel 6 beschriebene Weise bei den Bedingungen aus, die einer Temperatur von 72,5ºC im Behälter entsprechen. Das Rohr ist in neun Segmente unterteilt. Zwischen zwei aufeinander folgenden Segmenten werden im Maße des Fortschreitens der Hydrolyse im kontinuierlichen Prozess nach Anläufen im diskontinuierlichen Betrieb Proben entnommen. Proben werden am Austritt des Rohrs im selben. Rhythmus entnommen, sobald die Dauer der kontinuierlichen Hydrolyse die Zeit erreicht, die der Verweilzeit des Produkts im Rohr entspricht.
- Man bestimmt den Aminostickstoffgehalt der Proben. Man teilt jeden dieser Gehalte durch den Gleichgewichtsgehalt, auf den das Hydrolysat zustrebt. In einem Koordinatensystem trägt man auf der Ordinate die erhaltenen Quotienten und auf der Abszisse die Quotienten der Zeiten der Probeentnahmen an, geteilt durch die Verweilzeit des Hydrolysats in der Vorrichtung.
- Man erhält eine S-Kurve, die von der Abszisse 0,8 an ansteigt, die Vertikale der Abszisse 1,0 bei zwei Drittel ihres Höchstwertes schneidet und ihren Höchstwert erreicht, mit anderen Worten, die Horizontale der Ordinate 1,0 berührt, bei der Vertikalen der Abszisse 1, 2.
- Zum Vergleich führt man denselben Test aus, indem man jedoch ein leeres Rohr verwendet, das im übrigen dieselben Abmessungen wie das mit statischen Wischerelementen ausgerüstete Rohr besitzt.
- Man entnimmt Proben bei denselben Bedingungen, ermittelt dieselben Quotienten und zeichnet die entsprechende Kurve auf dieselbe Weise.
- Man erhält eine S-Kurve, die von der Abszisse 0,6 an ansteigt, die Vertikale der Abszisse 1,0 bei der Hälfte ihres Höchstwertes schneidet und ihren Höchstwert, und zwar 1,0, erst jenseits der Vertikalen der Abszisse 1,8 erreicht.
- Dies zeigt noch zwei weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, und zwar einerseits die Schnelligkeit, mit der ein stationärer Betrieb erreicht werden kann, und andererseits die Homogenität, die das Hydrolysat am Austritt aus der Vorrichtung aufweist.
Claims (11)
1. Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen, bei
dem man ein Proteinsubstrat einer kontinuierlichen Hydrolyse
mit einem proteolytischen Enzym unterzieht, einen ersten,
relativ kurzen Schritt der enzymatischen Hydrolyse im Behälter
unter Rühren und einen zweiten, relativ langen Schritt der
enzymatischen Hydrolyse im Rohr durchführt, den ersten Schritt
während 10-60 min durchführt, indem man den pH-Wert und die
Temperatur auf Werte einstellt, die für die Aktivität des
Enzyms günstig sind, den zweiten Schritt während 1-8 h
durchführt, indem man die Temperatur auf einen Wert einstellt, der
gleich der Temperatur des ersten Schritts oder höher ist, und
den zweiten Hydrolyseschritt in einem mit statischen
Mischerelementen ausgerüsteten Rohr vornimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat ein an
Proteinen reiches Nahrungsmittelausgangsmaterial ist,
insbesondere Mehl oder Grieß von Kernen oder von Presskuchen von Öl-
pflanzen, Hefen oder Nahrungsmittelbakterien, Tierfleisch oder
gehackter Fisch oder Milch oder Milchderivate in Form von
Teilchen in wässriger Suspension oder von wässriger
Suspension.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Proteinsubstrat ein
Molkesubstrat ist, das Molkeproteine enthält, insbesondere
Süßmolke der Käseherstellung oder Sauermolke der
Kaseinherstellung, so, wie SIE ist, oder in entmineralisierter oder von
Lactose befreiter, flüssiger oder rekonstituierter Form.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das proteolytische Enzym
aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Trypsin, Chymotrypsin,
Pancreatin, bakteriellen Proteasen, Pilzproteasen und ihren
Mischungen besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man das proteolytische
Enzym und das Substrat in einem Verhältnis von einer
Enzymmenge mit einer Aktivität von 0,1-12 AU auf 100 g Trockenmasse
des Substrats mischt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man den zweiten Schritt
ausführt, indem man die Temperatur auf einen Wert einstellt,
der gleich der Temperatur des ersten Schritts oder um 0-10ºC
höher ist.
7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch
1, die einen Hydrolysebehälter mit Rührvorrichtung aufweist,
der stromauf mit einer Substratdosiervorrichtung und mit einer
Enzymdosiervorrichtung verbünden ist und stromab mit
mindestens einem Hydrolyserohr verbunden ist, wobei das
Hydrolyserohr mit statischen Mischerelementen ausgerüstet ist und
relativ große Abmessungen besitzt und der Behälter relativ kleine
Abmessungen besitzt.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der das Rohr vertikal
angeordnet ist, wobei sein unteres Ende mit dem Behälter
verbunden ist und sein oberes Ende in eine Austrittsleitung
ausmündet.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der die
Substratdosiervorrichtung und die Enzymdosiervorrichtung jeweils einen mit dem
Hydrolysebehälter verbundenen Versorgungsbehälter aufweisen.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, die außerdem eine
Reagenzdosiervorrichtung aufweist, die einen Versorgungsbehälter
besitzt, der mit dem Hydrolysebehälter über eine Zumesspumpe
verbunden ist, die durch einen an den Hydrolysebehälter
angeschlossenen pH-Messer gesteuert wird:
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, die mehrere mit statischen
Mischerelementen ausgerüstete Hydrolyserohre aufweist, die
stromab des Behälters über Verbindungsleitungen in Reihe
geschaltet sind, die stromauf mit der Enzymdosiervorrichtung und,
mit der Reagenzdosiervorrichtung verbunden sind.
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