JPH0686639A - タン白の酵素加水分解方法および装置 - Google Patents

タン白の酵素加水分解方法および装置

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JPH0686639A
JPH0686639A JP5083449A JP8344993A JPH0686639A JP H0686639 A JPH0686639 A JP H0686639A JP 5083449 A JP5083449 A JP 5083449A JP 8344993 A JP8344993 A JP 8344993A JP H0686639 A JPH0686639 A JP H0686639A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 十分に規定され、再現性のあるペプチドプロ
フィルを得ることができるタン白の酵素加水分解方法お
よび装置。 【構成】 タン白加水分解酵素およびタン白基質を混合
し、第1加水分解工程は攪拌タンクで行ない、第2加水
分解工程は静置混合要素を設置した管で行なう。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はタン白の酵素加水分解方
法およびこの方法の実施装置に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】各種
既知の酵素加水分解方法があり、これらは例えば、基
質、酵素、加水分解の程度、および/または所要のペプ
チドプロフィルの選択で相互に異る。例えば、比較的良
く規定されたペプチドプロフィル、特に狭いオリゴペプ
チドプロフィルが腸粘膜による加水分解物の同化の理由
で必要である場合、既知加水分解方法は一般に少なくと
も1回の加水分解物の濾過または選別工程を含む。
【0003】例えば、EP226,221号明細書は各
工程は不連続的に発酵タンクで行ない、そして各工程は
限外濾過工程で終結する1つ以上のタン白酵素加水分解
工程により2000〜6000の範囲の分子量を有する
アレルギー発現性のないペプチド製造方法を記載する。
【0004】米国特許第4,212,889号明細書は
魚肉および酵素の混合物を連続連結した数個の加水分解
タンクを含む装置に連続的に通す魚タン白可溶化方法を
記載する。
【0005】本発明により提示された問題は加水分解方
法を供することであり、この方法は好ましくは連続的に
行なってタンク内の不連続加水分解効率を等しくし、ま
たは一層高めることができ、および加水分解および/ま
たはペプチドスペクトルの十分に規定されかつ再現度合
いを有するタン白加水分解物を得ることができる。
【0006】
【課題を解決するための手段】このため、タン白基質を
タン白加水分解酵素により加水分解処理する本発明のタ
ン白酵素加水分解方法は、攪拌タンク内の第1酵素加水
分解工程および管内の第2酵素加水分解工程を含む。好
ましい態様では、本発明方法は連続的に行ない、第2酵
素加水分解工程は静置混合要素を備えた管内で行なう。
【0007】同様に、本発明方法の実施装置は、基質計
量ユニットおよび酵素計量ユニットに上流で連結し、少
なくとも1個の加水分解管に下流で連結する二重ジャケ
ットの攪拌加水分解タンクを含む。好ましい態様では、
管は静置混合要素を設置する。
【0008】こうして加水分解および/またはペプチド
スペクトルの十分に規定された度合いを有するタン白加
水分解物を高効率および再現しうる、好ましくは連続的
方法で製造できることが分かった。
【0009】本発明方法および装置により、特に上部空
隙を残さずに完全に満たすことができる比較的小容積の
タンクおよび比較的大容積の管により作業できる。こう
して比較的小タンクで第1の比較的短かい工程、すなわ
ち加水分解開始工程および比較的大容量管で第2の比較
的長い工程、すなわち加水分解完了工程を好ましくは連
続して行なうことができる。反応時間、すなわち、タン
ク容量および管容量の合計により表わされる全容量の基
質の滞留時間は正確かつ簡単な方法で、例えば容量ポン
プにより調整できる。
【0010】比較のため大容量の1個の加水分解タンク
で加水分解を行なうことが望ましい場合、単位容量の加
水分解物の滞留時間は正確に規定できない。例えば、一
定pHおよび/または温度条件を定着させ、さらにタン
クを空にするのに必要な時間をかなり要する場合、これ
は不連続加水分解で真実である。しかし、平均滞留時間
を規定することのみができる場合、同じことは連続加水
分解で一層真実である。上記米国特許第4,212,8
89号明細書に記載のタイプの方法においてさえ、滞留
時間は一層正確に規定することはほとんどできない。
【0011】対照的に、本発明方法および装置では、単
位容量の加水分解物の滞留時間は非常に正確な方法で、
非常に平らなフロントを有する、好ましくは静置混合要
素を設置した、加水分解管を通る加水分解物の流れを規
定できることが分かった。
【0012】本明細書では、加水分解度は13%トリク
ロロ酢酸により沈澱できない全窒素%として測定された
非タン白態窒素(NPN)量により規定される。窒素含
量はケルダール法により測定される。アミン態窒素(遊
離α−NH2 )含量はアルカリ加水分解後ニンヒドリン
との反応により測定される。
【0013】トリチウム標識外因性セロトニン(セロト
ニン−3 H)を使用するセロトニン緩和はR.Frit
scheおよびM.BonzonがInt.Arch.
Allerg.Immunol.93, 289〜29
3(1990)に記載の方法によりラットの腹腔の正常
の肥満細胞で行なう。
【0014】ELISA阻害試験はβ−ラクトグロブリ
ン(BLG)、牛血清アルブミン(BSA)およびカゼ
イン(CAS)の特異的ウサギ抗体により行なう。方法
の感度、すなわち濃度検出限界は20ng/mlであ
る。
【0015】高性能液体クロマトグラフィ分析(HPL
C試験、ペプチドプロフィル)はタイプTSK−G20
00−SWシリカ(東洋曹達製品)、分画範囲はBio
rad BIOSIL SEC−125カラムで500
〜50,000ダルトンである、をベースとするゲルで
非変性条件下で行なう。結果は0.1Mリン酸塩溶液+
0.4M NaCl中でpH6.80で220nmのピ
ークの読みの表面分布%で表わす。
【0016】ポリアクリルアミドゲル中のゾーン電気泳
動による分析(SDS−PAGE試験)はLaemml
iがNature 227、680以下(1970)に
記載の方法により行なう。リシンの遮断はHPLCによ
り測定され、加水分解物の全リシンに対し遮断リシン%
として表わす。
【0017】「静置混合要素」とは波動性交差部材また
は金属またはプラスチック小片であると解され、これら
は交差し、または相互に連動し、そして管の軸に沿って
進行する複数の交差通路中に管により規定される空間を
分割する。このタイプの要素はSulzer A.
G.,CH−8401 WinterthurによりS
MV、SMXまたはSMXLの名称で市販させる。
【0018】最後に、静置混合要素により供される管は
特記しない場合でさえ二重ジャケットを組織的に設置す
ることを認識することは重要である。
【0019】本発明方法はタン白基質として油糧種実ま
たはケーキの粉末またはペースト、食品級酵母または細
菌、動物または魚類の細切肉、または乳または乳誘導
物、例えば水性サスペンジョンの粒子または水性サスペ
ンジョンのようなタン白の豊富な任意の出発材料を使用
して行なうことができる。
【0020】タン白基質はホエイタン白を含有するホエ
イ基質、特にチーズ製造からのスイートホエイまたはカ
ゼイン製造からの酸ホエイが好ましく、これらはそのま
ま、またはミネラルを除去して、または乳糖を含まない
液体または再構成形である。
【0021】別の好ましい態様では、酵素はトリプシ
ン、キモトリプシン、パンクレアチン、細菌プロテアー
ゼ、かびプロテアーゼおよびその混合物から成る群から
選択する。タン白加水分解酵素および基質は0.1〜1
2アンソンユニット(AU)活性/100g基質乾物を
有する酵素量で混合できる。
【0022】第1加水分解工程は酵素の活性に有利な値
に調整したpHおよび温度で10〜60分行なうことが
好ましく、一方第2加水分解工程は第1工程の温度に等
しいか、またはより高い、特に0〜10℃高い温度で1
〜8時間行なうことが好ましい。
【0023】中間または補充工程、特に静置混合要素を
設置した管で行なうことが好ましい予備混合工程;第1
加水分解工程前、中間、または後に特に熱交換機または
静置混合要素を設置した管を使用する熱変性工程;特に
第2加水分解工程後、特に熱交換機および/または蒸気
噴射機および/または静置混合要素を設置した管を使用
する1つ以上の酵素失活工程;および/または特に変性
工程後、特に例えば熱交換機または好ましくは静置混合
要素を設置した管を使用して行なう冷却工程を含むこと
ができる。
【0024】酵素は1または好ましくは2工程で失活で
きる。第1工程は一層正確には酵素の自己消化に相当
し、第2工程は一層正確には滅菌に相当する。
【0025】タンク内の第1加水分解工程は少なくとも
2部に分割して連続連結した少なくとも2個のタンクで
行なうこともできる。同様に、管内で行なう第2加水分
解工程は少なくとも2部に分割して連続連結した少なく
とも2個の管で行なうことができる。後者の場合、pH
調整および/または酵素の添加は2個の連続管の間で行
なうことができる。pH調整に対し、例えばKOH、N
aOHまたはCa(OH)2 のようなアルカリ性、また
はHClまたはH3 PO4 のような酸性の適当な反応体
を使用することが好ましい。
【0026】本発明方法の好ましい一態様では、酵素は
細菌性アルカリプロテアーゼ、特にBacillus
licheniformisが生産し、「アルカラー
ゼ」、特に例えば「アルカラーゼ0.6L」または「ア
ルカラーゼ2.4L」の名称でノボ社が市販するもので
ある。この好ましい態様では、特に高いNPNおよび特
に低減したアレルギー発現性を有する加水分解物を得ら
れることが分かった。
【0027】このため、第1加水分解工程は7.0〜1
0.0のpH値および50〜80℃、好ましくは63〜
73℃で行ない、一方第2加水分解工程は6.5〜8.
0のpH値および55〜80℃、好ましくは65〜73
℃で行なう。熱変性工程は第1加水分解工程後または2
つの加水分解工程間で30秒〜10分、好ましくは4〜
6分、80〜120℃、好ましくは85〜95℃の温度
で行なうことができる。次に酵素は10〜20分、好ま
しくは2〜8分、70〜110℃、好ましくは85〜9
0℃で行なう自己消化工程、その後5秒〜5分、好まし
くは30秒〜2分、110〜150℃、好ましくは12
0〜130℃で行なう滅菌工程により失活させることが
できる。
【0028】本発明方法の別の好ましい態様では、使用
酵素は一方では特にBacillus licheni
formisが生産し、「アルカラーゼ」、特に「アル
カラーゼ0.6L」または「アルカラーゼ2.4L」の
名称でノボ社が市販する細菌アルカリ性プロテアーゼ、
および他方では膵臓酵素、例えば特にトリプシンの組み
合せである。
【0029】好ましい他の態様では、2つの基質、特に
2つのホエイ基質は共通の工程、好ましくは共通の滅菌
工程まで本発明方法によりこれら2種の酵素のうちの1
種により別別に加水分解し、その後2種の異る酵素の2
つの別別の自己消化工程にそれぞれ別別にかけることが
できる。同じ基質は連続してこれらの2種の酵素のうち
の1種の作用に、次にもう1種の作用にかけることもで
きる。これはこの組み合せにより得た、例えばホエイタ
ン白加水分解生成物は特にすぐれた貯蔵安定性を示しう
ることが分かったためである。
【0030】膵臓酵素、特に上記組み合せの特に例えば
トリプシンにより本発明方法を実施するために、EP3
22589号明細書に記載のpHおよび温度条件は有利
に使用できる。
【0031】本発明実施装置は上流で基質計量ユニット
および酵素計量ユニットに、下流で静置混合要素を設置
した少なくとも1個の加水分解管に連結する二重ジャケ
ット攪拌加水分解タンクを含む。
【0032】この装置では、管は垂直配置し、その下端
はタンクに連結し、その上端は排出管中に開口できる。
また水平に、または任意の他の位置に配置することもで
きる。好ましい態様では、直径の4倍の大きさの長さを
有する。
【0033】別の好ましい態様では、基質および酵素計
量ユニットは容量ポンプにより加水分解タンクに連結し
た供給容器を含む。装置はpHメータにより調整した容
量ポンプを経て加水分解タンクに連結する供給容器を含
む反応体計量ユニットも含む。
【0034】装置は1個のタンクの代りに連続連結した
数個のタンクを含むことができる。特にそのタンクのう
ちの1つは予備加水分解タンクとして使用することがで
きる。装置は上流で酵素計量ユニットおよび反応体計量
ユニットに連結できる連結管によりタンクの下流で連続
連結する静置混合要素を設置した数個の加水分解管を含
むこともできる。静置混合要素を設置した管は酵素、基
質および/または反応体計量ユニットとタンク間、また
は装置が数個のタンクを含む場合2個の連続タンク間で
あっても供することもできる。
【0035】本発明方法実施装置は3例の態様を説明す
る図面を引用して以下に詳細に記載する。図1は1個の
タンクおよび静置混合要素を設置した1個の管を含む装
置の第1態様を図示する。図2は1個のタンクおよび静
置混合要素を設置した数個の加水分解管を含む装置の第
2態様を図示する。図3は2個のタンクおよび静置混合
要素を設置した数個の加水分解管を含む装置の第3態様
を図示する。
【0036】図1を引用すると、本装置は二重ジャケッ
ト2およびモータ4により駆動される攪拌機3を有する
加水分解タンク1を含む。タンクは各種パイプおよび攪
拌機3の軸が通るカバー5により流体の洩らない仕方で
密閉する。加水分解タンク1はパイプ6により基質計量
ユニット7−11に、パイプ12により酵素計量ユニッ
ト13−17に、そしてパイプ18により反応体計量ユ
ニット19−24に上流で連結する。基質計量ユニット
は二重ジャケット8およびモータ10により駆動される
攪拌機9を有する基質供給容器7を含む。容器7はパイ
プ6に連結した容量ポンプ11により加水分解タンク1
に連結する。酵素計量ユニットは二重ジャケット14お
よびモータ16により駆動される攪拌機15を有する酵
素供給容器13を含む。容器13はパイプ12に連結し
た容量ポンプ17により加水分解タンク1に連結する。
反応体計量ユニットはパイプ18に連結した容量ポンプ
20により加水分解タンク1に連結した反応体供給容器
19を含む。容量ポンプ20は測定電極24がカバー5
を通ってタンク1中に浸漬し、ポンプ20を調整する電
子装置(図示せず)に電気的に連結する(鎖線23)p
Hメータ21により調整する。
【0037】加水分解タンク1は相互に連動する金属ま
たはプラスチックの横木から成る静置混合要素27を設
置し、二重ジャケット26を有する加水分解管25に下
流で連結する。タンク1は加水分解物試料をタンクから
取り出しうるように設計した三方バルブ29に連結する
パイプにより管25に連結する。管25は垂直に配置さ
れ、その下端はタンク1に連結し、その上端は排出パイ
プ30中に開口する。各二重ジャケット中に循環する流
体温度はタンク1に対し31で、容器7に対し32で、
容器13に対し33で、および管25に対し34で、記
号で示した装置により調整する。
【0038】図2では、図1に示した第1態様の要素に
相当する装置の第2態様の要素は同じ参照数字により示
す。この第2態様では、装置は静置混合要素27,3
7,38を設置し、容量ポンプ17に連結するパイプ1
2に再結合するパイプ41,42により酵素供給容器1
3に上流で連結する連結管39,40を経てタンク1の
下流で連続連結する数個の加水分解管25,35,36
を含む。連結パイプ39,40は容量ポンプ20を連結
するパイプ18に再結合するパイプ43,44により反
応体供給容器19にも上流で連結する。
【0039】本発明装置のこの第2態様では、静置混合
要素を設置した混合管45は酵素、基質および反応体計
量ユニットとタンク1間に再び供される。各種酵素、基
質および反応体供給容器は容量ポンプ49および容量ポ
ンプ11および20をそれぞれ連結するパイプ46,4
7および48により管45に連結する。
【0040】図3では、図1および図2に示す最初の2
態様の要素に相当する装置のこの第3態様の要素は再度
同じ引用数字で示す。この第3態様では、装置は静置混
合要素を設置し、加水分解タンク1の下流で連続連結す
る数個の加水分解管25,35,36,50を含む。加
水分解タンクは第2タンク、この場合予備加水分解タン
ク51に、静置混合要素を設置した変性管52を経て上
流で連結する。
【0041】この第3態様では、予備加水分解タンク5
1は上流で基質および反応体供給容器7および19に連
結し、一方酵素供給容器13はそれぞれパイプ56,1
2および41により予備加水分解タンク51、加水分解
タンク1および加水分解管25および35を連結するパ
イプ39に下流で連結する。この態様では、静置混合要
素を設置し、最後の加水分解管50の下流で連続連結す
る失活管53,54および冷却管55が再び供される。
【0042】本発明方法は次例により説明し、例中部お
よび%は重量による。例1 本発明方法は図1に記載のものと同様の装置で行なう。
この場合、加水分解タンクは30リットルの容積を有
し、静置混合要素を設置した加水分解管は高さ3mに対
し180リットルの容積を有する。使用基質は部分脱ミ
ネラルホエイタン白濃縮物で、乾物含量20%、および
約23%のタン白、1.9%の脂肪、73%の乳糖およ
び1.3%の灰分の各含量(乾物基準%)を有する。3
AU/gの活性を有する豚トリプシンを100gの基質
乾物につき1g酵素量で、すなわち100gの基質乾物
に対し3AUで酵素として使用する。2N KOHを反
応体として使用する。タンクは最初に基質を満たし、酵
素に混合後不連続加水分解方法をpH7.3、60℃で
15分開始し、その後加水分解基質は40%のNPNを
有する。次に方法は、タンク内の基質の平均滞留時間が
30分であり、管内の加水分解物の滞留時間は3時間で
あるような割合で連続的に再開始する。60℃の温度お
よび7.3のpHはタンクで維持する。60℃の温度は
管に維持し、pHは管の入口で約7.3から管の出口で
約6.9に自然に下がるように浮動できる。加水分解物
は管を出るとき65%のNPNを有する。比較として、
同じ基質を約7時間7.3のpH、60℃で200リッ
トルタンクで同じ酵素対基質比で同じ酵素により不連続
的に加水分解する場合、60%のNPNを有する加水分
解物が得られる。
【0043】例2 3つの別の試験中タンクの有効容積は、基質をタンクに
通した後得られるNPNがそれぞれ15、35および4
5%であるように変更することを除いて、手順は例1記
載のものと同じである。59、63および66%の各N
PNを有する加水分解物をこうして管の出口で得る。比
較では、60%のNPNはタンクで不連続的に同じ条件
下で、すなわち、7.3のpH、60℃で、乾物含量2
0%を有する基質および100g基質乾物につき3AU
の活性を有する酵素量により約7時間で得られる。換言
すれば、基質が管の出口で35%以上のNPNを有する
場合不連続的に得られるものより高いNPNを本方法に
より連続的に得ることができる。
【0044】例3 7.3に対し7.8のpH値および60℃に対し55℃
の温度をタンク内に維持することを除いて、手順は例1
記載のものと同じである。70%のNPNを有する加水
分解物を管の出口で得る。
【0045】例4 本発明方法は図2に記載したものと同様の装置を使用し
て行なう。7.5%のタン白を含む乾物含量33%を有
するホエイタン白濃縮物を基質として使用する。使用酵
素はBacillus licheniformisが
生産し、2.4AU/gの活性を有する「アルカラーゼ
2.4L」の名称でNovo会社により市販される細菌
アルカリ性酵素である。2N KOHを反応体として使
用する。反応は適当に開始後、連続的に再開始する。基
質処理量および、管およびタンクの寸法は基質または加
水分解物の滞留時間が静置混合要素を設置したタンクの
前の予備混合管でそれぞれ5〜10分、予備混合管およ
びタンク間で連続連結する静置混合要素を設置した熱変
性管で5〜8分、タンク(第1加水分解工程)で25〜
40分、タンクの後の静置混合要素を設置した第1管A
(第2加水分解工程の管A)で15〜25分、静置混合
要素を設置した第2管B(第2加水分解工程の管B)で
15〜25分、静置混合要素を設置した第3管C(第2
加水分解工程の管C)で0〜100分、管Cの残部に連
続連結した静置混合要素を設置した失活管で5〜20分
および静置混合要素を設置した冷却管で5〜15分であ
るように決定する。酵素の全量は4部に分割する。すな
わち、全量の5〜15%の第1部は予備混合管で基質と
混合し、全量の30〜40%の第2部はタンクで基質と
混合し、全量の20〜30%の第3部は管Aで基質と混
合し、そして全量の20〜30%の第4部は管Bで基質
と混合する。基質のpH値は管Bまで7.3に調整し、
それ以後pHは浮動する。温度は予備混合管で75℃
に、熱変性管で85℃に、タンクで70℃に、管Aおよ
び管Bで71℃に、失活管で80〜105℃に、そして
冷却管で2〜8℃に調整する。こうして製造した加水分
解物は冷却管後に集める。
【0046】例5 本方法は図3に記載のものと同様のタイプの装置を使用
して行なう。7%のタン白を含む乾物含量28%を有す
るホエイタン白濃縮物を基質として使用する。アルカラ
ーゼ2.4Lをタン白基準で2〜6%の総量で、すなわ
ち100gの基質乾物につき1.2〜3.6AUで酵素
として使用する。2N KOHを反応体として使用す
る。方法は適当に開始後、連続的に再開始する。基質処
理量および、管およびタンクの寸法は連続工程が次のよ
うに行なわれるように決定する。予備加水分解タンクの
前の静置混合要素を設置した予備混合管では、総量33
%の酵素を8.7のpH、10℃で基質と混合する。第
1加水分解工程の第1相は65℃で15分予備加水分解
タンクで行なう。予備加水分解タンクと加水分解タンク
間で連続連結した静置混合要素を設置した熱変性管で
は、温度は5分間92℃に上げ、次いで65℃に冷却す
る。加水分解タンクでは、総量の残りの66%の酵素を
添加し、第1加水分解工程の第2相はpH7.4、65
℃で45分行なう。静置混合要素を設置し、タンクの下
流で連結する3個の管では、第2加水分解工程は65℃
で195分、すなわち各管で65分行なう。pHは各管
の入口で7.5に調整し、次に浮動する。3個の加水分
解管後に連続連結する静置混合要素を設置した失活管で
は、酵素を87℃で5分自己消化させる。失活管後連続
連結した蒸気注入加熱ユニットでは、加水分解物は12
5℃で1分滅菌する。次に加水分解物は冷却後集める。
【0047】例6 本方法は図1に記載したものと同様の装置を使用して行
ない、加水分解タンクは2.8リットルの容積を有し、
静置混合要素を設置した加水分解管は約5mの長さに対
し11.6リットルの容積を有する。7.5%のタン白
を含む乾物含量33%を有するホエイタン白濃縮物を使
用する。アルカラーゼ2.4Lを酵素としてタン白基準
で全量6.3%で、すなわち100gの基質乾物につき
3.4AUで使用する。2N KOHを反応体として使
用する。タンクは最初に基質を満たし、酵素と混合後、
不連続加水分解方法は7.3のpH、70℃で25分開
始する。次に方法は装置内の加水分解物の全滞留時間が
240分(タンクで47分、管で193分)であるよう
な割合で連続的に開始する。70℃の温度および7.3
のpHをタンクで維持する。70℃の温度は管で維持
し、pHは管の入口で約7.3から管の出口で約6.7
2に自然に下がるように浮動させる。試料は連続方法の
出発後240分から計算して0、60、120および1
80分に管の出口で分析用に採取する。これらの試料は
表1に示すpH値およびアミン窒素含量を示し、表中タ
ンクのpHを7.3に保持するために使用したKOHの
相当量も示す。
【表1】 表 1 時 間 pH アミン窒素 KOH (分) (%) (g/h) 0 6.71 0.26 124 60 6.72 0.25 123 120 6.73 0.26 125 180 6.71 0.26 125 g/hで示したKOH量は47分の滞留時間に対しタン
ク1リットルにつき44,375gの平均消費に相当す
る。加水分解物の特徴は管の出口から採取した分析用試
料についてほとんど時間に関し変動しないことが表1か
ら分かる。これらの試料の有利なペプチドプロフィル、
大部分が小ペプチドで、非常に一定であることもポリア
クリルアミドゲル(SDS−PAGE方法)でゾーン電
気泳動により証明することもできる。比較のため、同じ
基質を同じ酵素により、同じ酵素対基質比で不連続的に
2リットルタンクで70℃で、7.3に保持したpHで
47分間酵素加水分解した。これらの最初の47分後、
pHは浮動させる。試料は加水分解の開始から数えて4
7分後、次いで240分まで、および240分を超えて
各種時間に分析用に採取した。これらの試料は表2に示
すpH値およびアミン窒素含量を有する。
【表2】 表 2 時 間 pH アミン窒素 (分) (%) 47 7.30 0.21 67 7.0 0.22 140 6.77 0.24 197 6.75 0.27 240 6.72 0.26 300 6.68 360 6.65 最初の47分中pHを7.3に保持するために使用した
KOH量は45.5g/lタンクである。表2からタン
クで不連続的に得た加水分解物の特徴は急速に、例6で
使用した装置で連続的滞留時間に相当する240分後に
再び変動することが分かる。これは不連続方法でタンク
を空にするのに要する時間中発生するものと対比しうる
生成物の発現の危険がない本発明方法の利点の1つを実
証する。
【0048】例7 本方法は例1に記載のものと同様の装置を使用して行な
い、この場合加水分解タンクは5リットルの容積を有
し、静置混合要素を設置した加水分解管は約5mの長さ
に対し9.6リットルの容積を有する。7.5%タン白
を含む乾物含量33%を有するホエイタン白濃縮物を基
質として使用する。アルカラーゼ2.4Lは酵素として
タン白基準で8%の総量、すなわち100gの基質乾物
につき4.4AUで使用する。これらの8%のうち、2
%はタンクで使用し、6%は管の入口で添加する。2%
KOHを反応体として使用する。2つの別の試験では、
タンクに最初に基質を満たし、酵素と混合後、不連続加
水分解方法はpH7.3、および72.5℃および74
℃の2つの異る温度で40分出発する。次に各方法は装
置内の加水分解物の全滞留時間は116分(タンクで4
0分および管で76分)であるような割合で連続的に再
開始する。72.5℃および74℃の各温度および7.
3のpHは各2試験でタンクに維持する。72℃の温度
は管で維持し、pHは浮動させる。タンクで72.5℃
および74℃の温度に相当するこうして得た加水分解物
は97.2%および91.4%のそれぞれのNPNを有
し、タンクのpHを7.3に維持するために205g/
時間および198g/時間の各量のKOHの使用が必要
であった。さらに、ポリアクリルアミドゲル(SDS−
PAGE法)中のゾーン電気泳動によりこれらは比較的
狭いペプチドプロフィルを有することが分かる。比較の
ため、同じ基質をタン白基準で4%の全量で、すなわち
100gの基質乾物につき2.2AUでアルカラーゼ
2.4Lにより、5リットルのタンクで70℃、および
6.4、6.8、7.3および7.8の各pH値で4つ
の別の試験で連続的に200分酵素加水分解する。こう
して加水分解物は80〜83%のNPNを有し、pH値
を6.4、6.8、7.3および7.8に維持するため
に33.4、50.1、60.2および77.2のKO
H(g/時間)の各量の使用を必要とした。さらに、こ
れらは0.17、0.20、0.21および0.22%
の各アミン窒素含量を有する。SDS−PAGE試験に
よりこれらは比較的広いペプチドプロフィルを有するこ
とが分かる。これは連続酵素加水分解により得た、低度
の加水分解および比較的広いペプチドプロフィルを有す
る生成物と比較することにより高度の加水分解および比
較的狭いペプチドプロフィルを有する生成物を得ること
ができる限りにおいて本発明方法の別の利点を実証す
る。
【0049】例8 本方法は図1に記載のものと同様の装置を使用して行な
い、この場合加水分解タンクは2.8リットルの容積を
有し、静置混合要素を設置した加水分解管は約5mの長
さに対し11.6リットルの容積を有する。7.5%の
タン白を含む乾物含量33%を有するホエイタン白濃縮
物を基質として使用する。アルカラーゼ2.4Lは酵素
としてタン白基準で7%の全量で、すなわち100gの
基質乾物につき3.8AUで使用する。これらの7%の
うち、2%はタンクで使用し、5%は管の入口で添加す
る。2N KOHは反応体として使用する。タンクに最
初に基質を満たし、酵素と混合後、不連続加水分解方法
をpH7.8、70℃で25分間出発させる。次に方法
は、加水分解物の滞留時間はタンクで45分および加水
分解物管で170分、すなわち全体で215分であるよ
うな割合で連続的に再開始する。70℃の温度および
7.8のpHはタンクで維持する。70℃の温度は管で
維持し、pHは管の入口で約7.8から管の出口で約
6.67に自然に低下するように浮動させる。静置混合
要素を設置し、加水分解管の出口と連続連結する失活管
では、加水分解物は90℃で18分失活させる。静置混
合要素を設置し、失活管の下流で連続連結する冷却管で
は、加水分解物は環境温度に冷却する。冷却管の出口
で、試料は連続方法の出発後215分から加水分解管の
出口で数えて0、60、120、180および240分
で分析用に採取する。これらの試料は表3で示すpH
値、アミン窒素含量、リシン遮断、およびNPNを有す
る。表中、タンクで7.8のpHを維持するために使用
するKOHの相当量も示す。
【表3】 表 3 時 間 pH アミン態窒素 KOH リシン遮断 NPN (分) (%) (g/h) (%) (%) 0 6.67 0.26 125 16.3 95 60 6.68 0.25 124 16.2 96 120 6.67 0.26 128 16.3 94 180 6.67 0.27 124 16.2 95 240 6.67 0.26 127 16.1 96 表3から、例6の表1からと同様に加水分解物の特徴
は、加水分解管の出口で試料を採取した時間に関係なく
ほとんど変動しないことが分かる。本例条件下で得た生
成物のペプチドプロフィルおよび低アレルギー発現性は
HPLC、エリザおよびセロトニン−3 H試験を行な
い、その結果は表5、6および7に示す。比較のため、
160kgの同じ基質はタン白基準で7%の全量の同じ
酵素によりタンクで70℃で不連続酵素加水分解する。
これらの7%の酵素のうち、2%は最初の加水分解相に
対しpH7.8で45分使用し、その後pHは浮動させ
る。60分後、残りの5%の酵素を添加し、加水分解は
70℃および浮動pHで215分まで、および超えて継
続する。20kgの加水分解物は加水分解の初めから数
えて120分後に取り出す。さらに20kg量を15
0、180、200、250、300および360分後
に採取する。試料は215分の加水分解後分析用に採取
する。各種採取物および試料に相当する加水分解物は直
ちに失活させ(熱交換機で90℃18分)、次いで環境
温度に冷却し(熱交換機で)、分析する。これらは表4
に示すpH値、アミン窒素含量(97%乾物を含有する
粉末基準%)、リシン遮断およびNPNを有する。
【表4】 表 4 時 間 pH アミン態窒素 リシン遮断 NPN (分) (%,粉末) (%) (%) 60 7.56 120 6.97 0.60 15.3 150 6.87 0.63 17.2 90 180 6.82 0.66 18.2 94 200 6.80 0.68 18.3 95 215 6.80 0.68 18.9 95 250 6.79 0.69 19.4 96 300 6.77 0.71 19.5 96 360 6.76 0.74 19.6 97 表4から、例6の表2からと同様に、タンクで不連続的
に得た加水分解物の特徴は例8で使用した装置で連続滞
留時間に相当する215分後に再び急速に変動すること
が分かる。
【0050】これは不連続方法でタンクを空にするのに
要する時間中発生するものに匹敵しうる生成物の発現の
危険がない本方法の利点の1つを確証する。上記比較例
の条件下で得られる生成物のペプチドプロフィルおよび
低アレルギー発現性は生成物をHPLC、エリザおよび
セロトニン−3 H試験により215分後に試験する。そ
の結果は表5、6および7に示す。類似試験は例7と比
較のために提示したpH7.3に相当する条件下でタン
クで連続的に得た生成物に対し行なう。結果は表5、6
および7に示す。
【表5】 表 5 ペプチドプロフィル(HPLC試験) 生成物 Kダルトンで表わした分子量限界内の範囲のペプチド% >14 14−6 6−3.5 3.5−1.0 <1 例 8 5 7 9 30 49 比 較 4 7 10 31 48 (不連続タンク) 比 較 21 13 9 24 33 (連続タンク) 表5に示す試験結果は、本発明方法により連続的に得た
加水分解物は、比較に対し不連続タンクで得た加水分解
物と少なくとも同じ狭い、小ペプチドに集中したペプチ
ドプロフィルを有することができるが、連続タンクで比
較に対し得た加水分解物は大きなペプチドの方向に移動
した非常に広いペプチドプロフィルを有することを明示
する。
【表6】 表 6 ELISA阻害試験 生成物 タン白gにつきμg抗原で表わした残留抗原性 BLG BSA CAS 例 8 53 20 150 比 較 41 7 141 (不連続タンク) 比 較 111 >1000 319 (連続タンク)
【表7】 表 7 セロトニン−3 H緩和試験 生成物 gタン白当量につき緩和に対しμgのBLG当量 で表わした残留抗原性 例 8 20 比 較 5 (不連続タンク) 比 較 50 (連続タンク) 表6および7に示す試験結果は、本発明方法により得た
加水分解物は不連続タンクで比較に対し得た加水分解物
と少なくとも同じ低アレルギー発現性であることができ
るが、連続タンクで比較に対し得た加水分解物は低アレ
ルギー発現性ではないことを説明する。
【0051】例9 本方法はタンクで72.5℃の温度に相当する条件下で
例7記載と同様に行なう。管は9部分に分割する。試料
は連続加水分解が不連続開始相後進行する時2つの連続
部分間で採取する。試料は連続加水分解期間が管内の生
成物の滞留時間に相当する時間に達する場合同じ間隔で
管の出口で採取する。試料のアミン窒素含量を測定す
る。これらの各含量は加水分解物が向かう方向の平衡含
量で割る。座標システム上に、得た商を縦座標上にプロ
ットし、一方装置の加水分解物の滞留時間で割った試料
採取時間の商は横座標にプロットする。横座標0.8か
ら交差し、その最高値の2/3で横座標1.0の垂直線
と交差し、そしてその最高値に達する、換言すれば横座
標1.2の垂直線で縦座標1.0の水平線に接触する、
S字形曲線が得られる。比較のため、試験は使用管が空
であり、さらに静置混合要素を設置した管と同じ寸法を
有することの他は同様に行なう。試料を同じ条件下で採
取し、同じ商が確定し、相当する曲線が同様に描かれ
る。横座標0.6から交差し、その最高値の1/2で横
座標1.0の垂直線と交差し、最高値、すなわち1.0
に横座標1.8の垂直線を越えて到達するだけのS字曲
線が得られる。これは本発明方法の別の2つの利点、す
なわち一方では急速に定常状態が定着でき、他方では装
置から出る加水分解物の均質性が定着できることを実証
する。
【図面の簡単な説明】
【図1】1個のタンクおよび静置混合要素を設置した1
個の管を含む装置の説明図である。
【図2】1個のタンクおよび静置混合要素を設置した数
個の加水分解管を含む装置の説明図である。
【図3】2個のタンクおよび静置混合要素を設置した数
個の加水分解管を含む装置の説明図である。
【符号の説明】
1 加水分解タンク 2 二重ジャケット 3 攪拌機 4 モータ 5 カバー 6 連結パイプ 7 基質供給容器 8 二重ジャケット 9 攪拌機 10 モータ 11 容量ポンプ 12 連結パイプ 13 酵素供給容器 14 二重ジャケット 15 攪拌機 16 モータ 17 容量ポンプ 18 連結パイプ 19 反応体供給容器 20 容量ポンプ 21 pHメータ 24 電極 25 加水分解管 26 二重ジャケット 27 静置混合要素 29 三方バルブ 30 排出パイプ 31 ジャケットの流体温度調整装置 32 ジャケットの流体温度調整装置 33 ジャケットの流体温度調整装置 34 ジャケットの流体温度調整装置 35 加水分解管 36 加水分解管 37 静置混合要素 38 静置混合要素 39 連結パイプ 40 連結パイプ 41 連結パイプ 42 連結パイプ 43 連結パイプ 44 連結パイプ 45 混合管 46 連結パイプ 47 連結パイプ 48 連結パイプ 49 容量ポンプ 50 加水分解管 51 予備加水分解タンク 52 変性管 53 失活管 54 失活管 55 冷却管 56 連結パイプ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A23J 3/20 C12P 21/06 8214−4B (72)発明者 ニクロ メイステル スイス国グロスホエシェステテン,モシュ ベルグベグ 20 (72)発明者 アルベール ランカン スイス国ローザンヌ,エペエフエル,ジェ ニ シミク セアシュベ (番地なし) (72)発明者 ロベール デュスタン ウド スイス国ローザンヌ,アブニュー デシャ ラン 63 (72)発明者 アルフレッド ウペイ スイス国イヴェルドン,リュ アルディマ ン 24ベ

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 タン白基質を攪拌タンク内の第1酵素加
    水分解工程および管内の第2酵素加水分解工程を含むタ
    ン白加水分解酵素により加水分解することを特徴とす
    る、タン白の酵素加水分解方法。
  2. 【請求項2】 第2加水分解工程は静置混合要素を設置
    した管で行なう、請求項1記載の連続酵素加水分解方
    法。
  3. 【請求項3】 基質はタン白の豊富な出発材料、特に油
    糧種実またはケーキの粉末またはペースト、食品級酵母
    または細菌、動物または魚の細切肉、または乳または水
    性サスペンジョンの粒子の乳誘導物または水性サスペン
    ジョンである、請求項1記載の方法。
  4. 【請求項4】 タン白基質はホエイタン白を含有するホ
    エイ基質、特にチーズ製造から出るスイートホエイまた
    はカゼイン製造から出る酸ホエイで、そのまままたは脱
    ミネラルまたは乳糖を含まない、液体または再構成形で
    ある、請求項1記載の方法。
  5. 【請求項5】 タン白加水分解酵素はトリプシン、キモ
    トリプシン、パンクレアチン、細菌プロテアーゼ、かび
    プロテアーゼおよびその混合物から成る群から選択す
    る、請求項1記載の方法。
  6. 【請求項6】 タン白加水分解酵素および基質は100
    gの基質乾物につき0.1〜12AUの活性を有する酵
    素量で混合する、請求項1記載の方法。
  7. 【請求項7】 第1工程は酵素の活性に有利な値に調整
    したpHおよび温度で10〜60分行ない、第2工程は
    第1工程の温度に等しいか、またはより高い、特に0〜
    10℃高い値に調整した温度で1〜8時間行なう、請求
    項1記載の方法。
  8. 【請求項8】 上流で基質計量ユニットおよび酵素計量
    ユニットに連結し、下流で少なくとも1個の加水分解管
    に連結する攪拌加水分解タンクを含むことを特徴とす
    る、請求項1記載の方法を実施する装置。
  9. 【請求項9】 加水分解管は静置混合要素を設置する、
    請求項8記載の装置。
  10. 【請求項10】 管は垂直に配置され、その下端はタン
    クに連結し、その上端は出口パイプ中に開口する、請求
    項9記載の装置。
  11. 【請求項11】 基質および酵素計量ユニットはそれぞ
    れ加水分解タンクに連結した供給容器を含む、請求項9
    記載の装置。
  12. 【請求項12】 さらにタンクに連結したpHメータに
    より調整する容量ポンプを経由し加水分解タンクに連結
    した供給容器を有する反応体計量ユニットを含む、請求
    項11記載の装置。
  13. 【請求項13】 静置混合要素を設置し、上流で酵素計
    量ユニットおよび反応体計量ユニットに連結する連結パ
    イプを経由し、タンクの下流で連続連結する数個の加水
    分解管を含む、請求項12記載の装置。
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