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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nucleosidanaloga
bei der Behandlung von viralen Infektionen. Spezifischer betrifft
sie die Verwendung von 1,3-Oxathiolannucleosidanaloga bei der Behandlung
von Hepatitis, insbesondere Hepatitis B.
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Hepatitis
B ist eine virale Erkrankung, die oral oder parenteral durch verunreinigtes
Material wie Blut und Blutprodukte, verunreinigte Nadeln, durch
Geschlechtsverkehr und vertikal von infizierten oder Trägermüttern auf
ihre Kinder übertragen
wird. In denjenigen Bereichen der Welt, in denen die Erkrankung
häufig
auftritt, führt
die vertikale Übertragung
in einem frühen
Alter zu einem hohen Anteil von infizierten Personen, die chronische
Träger
der Hepatitis B werden. Es gibt geschätzte 280.000.000 Träger von
Hepatitis B auf der ganzen Welt. Gegenwärtig gibt es keine wirksamen
Chemotherapeutika für
die Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen.
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Die
internationalen Patentveröffentlichungen
WO 90/14079 und WO 90/14091, die beide am 29. November 1990 veröffentlicht
wurden, beschreiben bestimmte 2',3'-Didesoxynucleoside
(insbesondere ddG, ddA, ddI und ddC) als bei der Behandlung von
sowohl HIV- als auch HBV-Infektionen wirksam.
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Die
europäische
Patentveröffentlichung
0 382 526A beschreibt eine Reihe von 1,3-Oxathiolannucleosidanaloga
mit antiviraler Aktivität,
insbesondere einer Aktivität
gegen HIV, den Verursacher von AIDS. Wir haben nun gefunden, dass
bestimmte der Verbindungen, die in EP 0 382 526A beschrieben sind,
sowohl in vitro als auch in vivo gegen das Hepatitis-B-Virus wirksam
sind.
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Die
internationale Patentveröffentlichung
WO 92/15308 mit dem Titel "Use
of 5-fluoro-2'-deoxy-3'-thia-cytidine for
the treatment of Hepatitis B" offenbart,
dass 5-Fluor-2'-desoxy-3'-thiacytidin (FTC)
und physiologisch funktionelle Derivate davon eine hochwirksame
Aktivität
gegen HBV aufweisen. WO 92/15308 bildet Teil des Standes der Technik
gemäß Art. 54(3)
EPÜ.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung der
Formel (I) oder eines annehmbaren Derivats davon zur Verwendung
bei der Herstellung ei nes Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis-B-Infektion
zur Verfügung
worin Z S, S=O oder SO
2 ist;.
R
1 Wasserstoff
oder ein Acyl ist;
R
2 ist,
R
3 ausgewählt
ist aus Wasserstoff, unsubstituiertem C
1-6-Alkyl
und mit einem Heteroatom substituiertem C
1-6-Alkyl;
R
4 und R
5 jeweils
unabhängig
voneinander ausgewählt
sind aus Wasserstoff, C
1-6-Alkyl, Brom, Chlor,
Fluor und Iod;
R
6 ausgewählt ist
aus Wasserstoff, CN, Carboxy, Ethoxycarbonyl, Carbamoyl und Thiocarbamoyl;
und
X und Y unabhängig
ausgewählt
sind aus Brom-, Chlor-, Fluor-, Iod-, Amino- und Hydroxygruppen;
vorausgesetzt,
dass R
2 nicht Cytosin oder S-F-Cytosin ist,
wenn Z S ist.
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Unter
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer
Verbindung für
die Herstellung des Medikaments für die Behandlung der Hepatitis-B-Infektion zur Verfügung, die
ausgewählt
ist aus:
cis-2-Benzoyloxymethyl-5-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers,
trans-2-Benzoyloxymethyl-5-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers
und Mischungen davon;
cis-2-Hydroxymethyl-5-(N4'-acetyl-cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers,
trans-2-Hydroxymethyl-5-(N4'-acetyl-cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers
und Mischungen davon;
cis-2-Benzyloyloxymethyl-5-(N4'-acetyl-cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers,
trans-2-Benzyloylmethyl-5-(N4'-acetyl-cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers
und Mischungen davon;
cis-2-Benzyloyloxymethyl-5-(N4'-acetyl-5-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers,
trans-2-Benzyloylmethyl-5-(N4'-acetyl-5-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers
und Mischungen davon;
cis-2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1'-yl)-3-oxo-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers;
cis-2-Hydroxymethyl-5-(thymin-N-1'-yl)-1,3-oxathiolan
in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers;
cis-2-Hydroxymethyl-5-(N,N-dimethylaminomethylencytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan in der
Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen Enantiomers;
und
pharmazeutisch verträgliche
Salze davon.
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Unter
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer
Verbindung für
die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen zur Verfügung, die
ausgewählt
ist aus:
- 1) cis-2-Hydroxymethyl-5-(5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz
davon in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen
Enantiomers;
- 2) trans-2-Hydroxymethyl-5-(5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan oder einem pharmazeutisch
verträglichen Salz
davon in der Form einer racemischen Mischung oder eines einzigen
Enantiomers; und
- 3) Mischungen davon;
mindestens einem anderen therapeutisch
wirksamen antiviralen Mittel; und gegebenenfalls einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger.
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Es
ist für
einen Fachmann offensichtlich, dass dann, wenn R1 eine
Acylgruppe ist, die Verbindungen der Formel (I) Ester sind. Bevorzugte
Ester umfassen eine Carboxylfunktion R-CO-O, bei der die Nichtcarbonylkomponene
R ausgewählt
ist aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl
(z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl,
t-Butyl, n-Butyl), Alkoxyalkyl (z.B. Methoxymethyl), Aralkyl (z.B.
Benzyl), Aryloxyalkyl (z.B. Phenoxymethyl), Aryl (z.B. Phenyl, gegebenenfalls
substituiert mit Halogen, C1-4-Alkyl oder
C1-4-Alkoxy); substituiertem Dihydropyridinyl
(z.B. N-Methyldihydropyridinyl); Sulphonatestern wie Alkyl- oder
Aralkylsulphonyl (z.B. Methansulphonyl); Sulfatestern, Aminosäureestern
(z.B. L-Valyl oder L-Isoleucyl) und Mono-, Di- oder Triphosphatestern.
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Auch
im Umfang solcher Ester enthalten sind Ester, die abgeleitet sind
von polyfunktionellen Säuren wie
Carbonsäuren,
die mehr als eine Carboxylgruppe enthalten, beispielsweise Dicarbonsäuren HO2C(CH2)nCO2H, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10
ist (beispielsweise Bernsteinsäure)
oder Phosphorsäuren.
Verfahren zur Herstellung solcher Ester aus dem entsprechenden Alkohol
sind bekannt; siehe beispielsweise Hahn et al., "Nucleotide Dimers as Anti-Human Immunodeficiency
Virus Agents", Nucleotide
Analogues, Seiten 156-159 (1989) und Busso et al., "Nucleotide Dimers
Suppress HIV Expression In Vitro",
AIDS Research and Human Retroviruses, 4(6), Seiten 449 – 455 (1988).
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Mit
Bezug auf die vorstehend beschriebenen Ester enthält, sofern
nichts anderes angegeben ist, jede vorhandene Alkylkomponente vorteilhafterweise
1 bis 16 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome
und könnte
eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Jegliche in solchen
Estern vorhandene Arylkomponente umfasst vorteilhafterweise eine
Phenylgruppe.
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Insbesondere
können
die Ester ein C1-16-Alkylester, ein unsubstituierter
Benzoylester oder ein Benzoylester, der mit mindestens einem Halogen
(Brom, Chlor, Fluor oder Iod) substituiert ist, C1-6-Alkyl,
gesättigte oder
ungesättigte
C1-6-Alkoxy-,
Nitro- oder Trifluormethylgruppen sein.
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Detaillierter
bedeutet der Begriff "pharmazeutisch
verträgliches
Derivat" jedes pharmazeutisch
verträgliche
Salz einer Verbindung der Formel (I).
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Fachleute
sind sich darüber
im klaren, dass die Verbindungen der Formel (I) modifiziert werden
können,
um pharmazeutisch verträgliche
Derivate davon an funktionellen Gruppen in sowohl der Basiskomponente
als auch dem Oxathiolanring zur Verfügung zu stellen.
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Pharmazeutisch
verträgliche
Salze der Verbindungen der Formel (I) umfassen diejenigen, die von pharmazeutisch
verträglichen,
anorganischen und organischen Säuren
und Basen abgeleitet sind. Beispiele von geeigneten Säuren umfassen
Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Perchlor-,
Fumar-, Malein-, Phosphor-, Glycol-, Milch-, Salicyl-, Bernstein-,
Toluol-p-sulphon-, Wein-, Essig-, Citronen-, Methansulphon-, Ameisen-,
Benzoe-, Malon-, Naphthalin-2-sulphon- und Benzolsulphonsäuren. Obgleich
sie selbst pharmazeutisch nicht verträglich sind, können auch
andere Säuren
wie Oxalsäure
bei der Herstellung von Salzen als Zwischenprodukte beim Erhalten
der erfindungsgemäßen Verbindungen
und ihrer pharmazeutisch verträglichen
Säureadditionssalze
brauchbar sein.
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Salze,
die von geeigneten Basen abgeleitet sind, umfassen Alkalimetall-
(z.B. Natrium-), Erdalkalimetall- (z.B. Magnesium-), Ammonium- und
NR4+- (worin R C1-4-Alkyl ist) Salze.
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Nachstehende
Bezugnahmen auf eine Verbindung gemäß der Erfindung umfassen sowohl
die Verbindung der Formel (I) als auch ihre pharmazeutisch verträglichen
Derivate.
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Wie
für Fachleute
auf der Hand liegt, erstrecken sich hier angegebene Bezugnahmen
auf die Behandlung sowohl auf die Prophylaxe als auch auf die Behandlung
von nachgewiesenen Infektionen oder Symptomen.
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Es
wurde festgestellt, dass die Verbindungen der Formel (I) sowohl
als racemische Mischung als auch als einzelne Enantiomere den Hepatitis-B-Virus
sowohl in vitro als auch in vivo inhibieren.
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Es
ist ersichtlich, dass die Menge einer Verbindung der Erfindung,
die für
die Verwendung bei der Behandlung erforderlich ist, nicht nur mit
der bestimmten gewählten
Verbindung, sondern auch mit dem Verabreichungsweg, der Art des
Zustands, der behandelt wird, und dem Alter und dem Zustand des
Patienten variiert und schließlich
im Ermessen des behandelnden Arztes oder Tierarztes liegt. Im Allgemeinen
liegt eine geeignete Dosis jedoch im Bereich von etwa 0,1 bis etwa
750 mg/kg Körpergewicht
pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 60 mg/kg/Tag, am stärksten bevorzugt
im Bereich von 1 bis 20 mg/kg/Tag.
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Die
gewünschte
Dosis kann in geeigneter Weise in einer einzigen Dosis oder in geteilten
Dosen verabreicht werden, die in geeigneten Intervallen, beispielsweise
als zwei, drei, vier oder mehr Unterdosen pro Tag verabreicht werden.
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Die
Verbindung wird in geeigneter Weise in Einheitsdosisform verabreicht,
sie enthält
beispielsweise 10 bis 1500 mg, in geeigneter Weise 20 bis 1000 mg,
am bequemsten 50 bis 700 mg des Wirkbestandteils pro Einheitsdosisform.
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Idealerweise
sollte der Wirkbestandteil verabreicht werden, um Spitzenplasmakonzentrationen
der Wirkverbindung von etwa 1 bis etwa 75 μM, vorzugsweise etwa 2 bis 50 μM, am stärksten bevorzugt
etwa 3 bis etwa 30 μM,
zu erzielen. Dies kann beispielsweise durch die intravenöse Injektion
einer 0,1 bis 5%igen Lösung
des Wirkstoffs, gegebenenfalls in einer physiologischen Kochsalzlösung, oder
durch die orale Verabreichung als Bolus, der etwa 1 bis etwa 100
mg des Wirkbestandteils enthält,
erreicht werden. Ein gewünschter Blutspiegel
kann durch die kontinuierliche Infusion aufrechterhalten werden,
um etwa 0,01 bis etwa 5,0 mg/kg/Stunde zuzuführen, oder durch intermittierende
Infusionen, die etwa 0,4 bis etwa 15 mg/kg des Wirkbestandteils
enthalten.
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Obgleich
es möglich
ist, dass zur Verwendung bei der Therapie die erfindungsgemäße Verbindung
als rohe Chemikalie verabreicht wird, ist es bevorzugt, den Wirkbestandteil
als pharmazeutische Formulierung darzureichen.
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Die
Erfindung stellt so des weiteren eine pharmazeutische Formulierung
zur Verfügung,
die eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen
Trägern
dafür und
gegebenenfalls andere therapeutische und/oder prophylaktische Bestandteile
umfasst. Der bzw. die Träger
muss bzw. müssen
in dem Sinn "verträglich" sein, dass sie mit
den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich sind und für deren
Empfänger
nicht schädlich sind.
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Pharmazeutische
Formulierungen umfassen diejenigen, die für die orale, rektale, nasale,
topische (einschließlich
bukkale und sublinguale), vaginale oder parenterale (einschließlich intramuskuläre, subkutane und
intravenöse)
Verabreichung geeignet sind oder in einer Form vorliegen, die für die Verabreichung
durch Inhalation oder Insufflation geeignet ist. Die Formulierungen
können
in den Fällen,
in denen es angebracht ist, in geeigneter Weise in getrennten Dosierungseinheiten
dargeboten werden und können
durch ein beliebiges der Verfahren, die in der Pharmazie bekannt
sind, hergestellt werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt des Inverbindungbringens
der Wirkverbindung mit den flüssigen
Trägern
oder fein verteilen Feststoffträgern
oder beiden und dann, falls notwendig, des Formens des Produkts
zu der gewünschten
Formulierung.
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Pharmazeutische
Formulierungen, die für
die orale Verabreichung geeignet sind, können in geeigneter Weise als
getrennte Einheiten wie Kapseln, Gelatinekapseln oder Tabletten,
die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkbestandteils enthalten,
als Pulver oder Körnchen,
als Lösung,
Suspension oder Emulsion dargeboten werden. Der Wirkbestandteil
kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste dargeboten werden. Tabletten
oder Kapseln für
die orale Verabreichung können
herkömmliche
Träger
wie Bindemittel, Füllstoffe,
Gleitmittel, Abbaumittel oder Benetzungsmittel enthalten. Die Tabletten
können
mittels Verfahren, die in der Technik bekannt sind, beschichtet
werden. Orale flüssige
Zubereitungen können
in der Form von beispielsweise wässerigen
oder öligen
Suspensionen, Lösungen, Emulsionen,
Sirups oder Elixieren vorliegen oder können als trockenes Produkt
für die
Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Bindemittel
vor der Verwendung dargeboten werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche
Additive wie Suspensionsmittel, Emulgiermittel, nichtwässerige
Bindemittel (die Speiseöle
umfassen können)
oder Konservierungsmittel enthalten.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch für
die parenterale Verabreichung (z.B. mittels Injektion, beispielsweise
einer Bolusinjektion oder einer kontinuierlichen Infusion) formuliert
werden und können in
einer Einheitsdosisform in Ampullen, vorab gefüllten Spritzen, einer kleinvolumigen
Infusion oder in Mehrdosisbehältern
mit einem zugefügten
Konservierungsmittel dargereicht werden. Die Zusammensetzungen können solche
Formen wie Suspensionen, Lösungen
oder Emulsionen in öligen
oder wässerigen
Bindemitteln haben und können
Formulierungsmittel wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder
Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der Wirkbestandteil
in Pulverform vorliegen, die durch die aseptische Isolierung des
sterilen Feststoffs oder mittels Lyophilisierung aus einer Lösung zur
Konstitution vor dem Gebrauch mit einem geeignete Bindemittel, z.B.
sterilem, pyrogenfreien Wasser, erhalten werden.
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Für die topische
Verabreichung an die Epidermis können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
als Salben, Cremes oder Lotionen oder als transdermales Pflaster
formuliert werden. Salben und Cremes können beispielsweise mit einer
wässerigen
oder öligen
Basis mit der Zugabe von geeigneten Verdickungsmitteln und/oder
Gelatinierungsmitteln formuliert werden. Lotionen können mit
einer wässerigen
oder öligen
Basis formuliert werden und enthalten im Allgemeinen auch ein oder
mehrerere Emulgiermittel, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel,
Suspensionsmittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel.
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Formulierungen,
die für
die topische Verabreichung im Mund geeignet sind, umfassen Pastillen,
die den Wirkbestandteil in einer wohlschmeckendem Basis, üblicherweise
Saccharose und Akaziengummi oder Tragantgummi enthalten; Pastillen,
die den Wirkbestandteil in einer inerten Basis wie Gelatine oder
Glycerin oder Saccharose und Akaziengummi enthalten; und Mundwässer, die
den Wirkbestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten.
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Pharmazeutische
Formulierungen, die für
die rektale Verabreichung geeignet sind, bei denen der Träger ein
Feststoff ist, werden am meisten bevorzugt als Einheits dosiszäpfchen verabreicht.
Geeignete Träger umfassen
Kakaobutter und andere Materialien, die üblicherweise im Stand der Technik
verwendet werden, und die Zäpfchen
können
in geeigneter Weise durch die Mischung der Wirkverbindung mit dem
bzw. den erweichten oder geschmolzenen Träger(n), gefolgt von dem Abkühlen und
Formgeben in Formen, gebildet werden.
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Formulierungen,
die für
die vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Pessare, Tampons, Cremes,
Gels, Salben, Schäume
oder Sprays dargeboten werden, die zusätzlich zu dem Wirkbestandteil
solche Träger
enthalten, die im Stand der Technik als geeignet bekannt sind.
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Für die intranasale
Verabreichung können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
als flüssiges
Spray oder dispergierbares Pulver oder in der Form von Tropfen verwendet
werden.
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Tropfen
können
mit einer wässerigen
oder nichtwässerigen
Basis formuliert werden, die auch ein oder mehrere Dispergiermittel,
Solubilisierungsmittel oder Suspensionsmittel enthält. Flüssige Sprays
werden in geeigneter Weise aus unter Druck gesetzten Packungen zugeführt.
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Für die Verabreichung
mittels Inhalation werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneter Weise
aus einem Insufflator, Zerstäuber
oder einer unter Druck stehenden Packung oder einem anderen geeigneten
Mittel zur Zuführung
eines Aerosolsprays zugeführt.
Unter Druck stehende Packungen können
ein geeignetes Treibmittel wie Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan,
Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid, Stickstoff oder ein anderes
geeignetes Gas umfassen. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols
kann die Dosierungseinheit durch Vorsehen eines Ventils zur Zuführung einer
abgemessenen Menge bestimmt werden.
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Alternativ
können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
für die
Verabreichung mittels Inhalation oder Insufflation die Form einer
trockenen Pulverzusammensetzung, beispielsweise einer Pulvermischung
der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie Lactose oder
Stärke,
annehmen. Die Pulverzusammensetzung kann in einer Einheitsdosierungsform
in beispielsweise Kapseln oder Patronen oder beispielsweise Gelatine- oder
Blisterpackungen dargeboten werden, aus de nen das Pulver mit Hilfe
eines Inhalators oder Insufflators verabreicht werden kann.
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Falls
gewünscht,
können
die vorstehend beschriebenen Formulierungen, die für eine Langzeitwirkung des
Wirkbestandteils geeignet sind, verwendet werden.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können auch
andere Wirkbestandteile wie antimikrobielle Mittel oder Konservierungsmittel
enthalten.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln, beispielsweise
anderen Antiinfektionsmitteln verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere
zusammen mit bekannten antiviralen, antibakteriellen, antimykotischen
oder immunmodulierenden Mitteln verwendet werden.
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Die
Erfindung stellt so unter einem weiteren Aspekt eine Kombination
zur Verfügung,
die eine Verbindung der Formel (I) oder ein physiologisch verträgliches
Derivat davon zusammen mit einem anderen therapeutisch wirksamen
Mittel, insbesondere einem antiviralen, antibakteriellen, antimykotischen
oder immunmodulierenden Mittel, enthält.
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Die
Kombinationen, auf die vorstehend Bezug genommen wird, können in
geeigneter Weise zur Verwendung in der Form einer pharmazeutischen
Formulierung dargeboten werden, und so bilden pharmazeutische Formulierungen,
die eine Kombination, wie vorstehend definiert, aufweisen, zusammen
mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
dafür einen
weiteren Aspekt der Erfindung.
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Die
einzelnen Komponenten solcher Kombinationen können entweder aufeinanderfolgend
oder gleichzeitig in getrennten oder kombinierten pharmazeutischen
Formulierungen verabreicht werden.
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Wenn
eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat davon in Kombination mit einem zweiten therapeutischen Mittel
verwendet wird, das gegen den gleichen Virus wirksam ist, kann die
Dosis jeder Verbindung entweder die gleiche sein oder sich von derjenigen
unterscheiden, wenn die Ver bindung allein verwendet wird. Geeignete
Dosen sind für
Fachleute leicht ersichtlich.
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Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht,
die nicht als eine Beschränkung
der Erfindung auszulegen sind.
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Beispiel 1
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Cis- und trans-2-Benzoyloxymethyl-5-(N4'-acetyl-5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
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5-Fluorcytosin
(4,30 g, 33,3 mMol), Hexamethyldisilazan (25 ml) und Ammoniumsulfat
(120 mg) wurden unter Rückfluss
gekocht, bis sich das Cytosin löste
(3 Stunden), und wurden dann weitere 2 Stunden unter Rückfluss
gekocht. Das Hexamethyldisilazan wurde in vacuo verdampft, und Toluol
(100 ml) wurde dem Rückstand
zugegeben, um die Lösungsmittel
gemeinsam zu verdampfen. Die sich ergebende Lösung, Bis(trimethylsilyl)-fluorcytosin
in Dichlormethan (40 ml), wurde unter Argon einer Lösung von
2-Benzoyloxymethyl-5-acetoxy-1,3-oxathio-lan (8,537 g, 30,3 mMol) in trockenem
Dichlormethan (100 ml) und Molekularsieben (4A, 2 g) zugegeben,
die zuvor unter Argon hergestellt und 20 Minuten auf 0°C gekühlt wurden.
[(Trifluormethansulfonyl)oxy]trimethylsilan (6 ml, 31 mMol) wurde
dieser Mischung bei 0°C
zugegeben, und die sich ergebende Lösung wurde bei 25°C etwa 18
Stunden gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde dann mit 300 ml gesättigter Lösung aus Natriumbicarbonat
behandelt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Filtrat wurde zweimal
mit 300 ml Salzlösung
und einmal mit destilliertem Wasser geschüttelt. Die organische Schicht
wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockenheit verdampft.
Dies ergab ein rohes 5-Fluorcytosinderivat (10,1 g). Rf:0,57
(EtOAc:MeOH 9:1).
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Dieser
Rückstand
wurde im nächsten
Schritt ohne weitere Reinigung acetyliert. Das rohe Material wurde
in trockenem Dichlormethan (120 ml) in einem 500 ml Kolben mit rundem
Boden unter Argon gelöst.
Triethylamin (12,7 ml, 91,9 mMol) und Dimethylaminopyridin (111
mg, 0,9 mMol) wurden der Lösung
zugegeben. Der Kolben wurde dann 1 Stunde in ein Eisbad unter Argon
getaucht. Essigsäureanhydrid
(4,3 ml, 45 mMol), über
Natriumacetat destilliert, wurde mittels einer Spritze in einen
gekühlten
Kolben überführt. Die
Mischung wurde über
Nacht gerührt
und dann sorgfältig
in einen Erlenmeyer-Kolben dekantiert, der gesättigte Natriumbicarbonatlösung enthielt.
Das Produkt wurde dann mit destilliertem Wasser, gefolgt von Salzlösung, gewaschen.
Die Methylenchloridteile wurden getrocknet und unter hohem Vakuum
zur Trockenheit verdampft, was eine acetylierte α/β-Mischung als farblosen Schaum
ergab, der nach dem Trocknen 9,6 g wog. Die Flash-Chromatographie
dieses Materials unter Verwendung von Ethylacetat : Methanol (9:1)
ergab 3,1 g, 7,8 mMol (46%) reines trans-(Benzoyloxymethyl-5-(N4'-acetyl-5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan)
und 3,5 g, 8,9 mMol (30 %) reines cis-(Benzoyloxymethyl-5-(N4'-acetyl-5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan).
trans-Isomer:
Rf:0,65 in Ethylacetat:Methanol 9:1
U.V.:
(MeOH) Lambda max: 309 nm
1H-NMR δ (ppm in
CDCl3)
8,77 (b, 1H; C4'-NH-Ac)
8,06
(m, 2H; aromatisch)
7,70 (d, 1H; C6'-H, J6' F=
6,3 Hz)
7,62 (m, 1H; aromatisch)
7,49 (m, 2H; aromatisch)
6,51
(dd, 1H; C5-H)
5,91 (dd, 1H; C2-H)
4,48 (dd, 2H; C2-CH2OCOC6H5)
3,66
(dd, 1H; C4-H)
3,34 (dd, 1H; C4-H)
2,56 (s, 3H; NH-COCH3)
cis-Isomer:
Rf:0,58 in Ethylacetat:Methanol 9:1
U.V.:
(MeOH) Lambda max:309 nm
1H-NMR δ (ppm in
CDCl3)
8,72 (b, 1H; C4'-NH-Ac)
8,06
(m, 2H; aromatisch)
7,87 (d, 1H; C6'-H, J6F =
6,2 Hz)
7,60 (m, 1H; aromatisch)
7,49 (m, 2H; aromatisch)
6,32
(dd, 1H; C5-H)
5,47 (dd, 1H; C2-H)
4,73 (dd, 2H; C2-CH2OCOC6H5)
3,62
(dd, 1H; C4-H)
3,19 (dd, 1H; C4-H)
2,55 (s, 3H; NH-COCH3)
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Beispiel 2
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Cis- und trans-Hydroxymethyl-5-(5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan
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1,0
g (2,54 mMol) trans-2-Benzoyloxymethyl-5-(N4'-acetyl-5'-fluorcytosin-1'-yl)- 1,3-oxathiolan wurde
1 Stunde in 25 ml methanolischem Ammoniak bei 0° und dann über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Die Mischung wurde unter verringertem Druck verdampft. Der Rückstand
wurde zweimal (2 × 30
ml) mit wasserfreiem Ether pulverisiert. Der feste Rückstand
wurde in absolutem Ethanol umkristallisiert, um 484 mg (1,95 mMol, 77
%) des gewünschten
Produkts trans(Hydroxymethyl-5-(5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan) zu ergeben: Schmelzpunkt
219-221°C;
Rf= 0,21 in Ethylacetat:Methanol (9:1),
was identifiziert wurde durch 1H, 13C-NMR und U.V. Lambda max. (H2O)
280,9 nm.
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1,2
g (3,05 mMol) cis-2-Benzoyloxymethyl-5-(N
4'-acetyl-5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan wurden
1 Stunde in 30 ml methanolischem Ammoniak bei 0°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Die Mischung wurde unter verringertem Druck verdampft. Der Rückstand
wurde zweimal (2 × 30
ml) mit wasserfreiem Ether pulverisiert. Der feste Rückstand
wurde in absolutem Ethanol umkristallisiert, um 655 mg (2,64 mMol,
87 %) reines Produkt cis-(Hydroxymethyl-5-(5'-fluorcytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan)
zu ergeben: Schmelzpunkt 204-206°C;
R
f = 0,21 in Ethylacetat:Methanol (9:1).
Die gewünschte
Verbindung wurde identifiziert mittels
1H,
13C-NMR und U.V. Lambda max (H
2O)
280,9 nm.
trans-Isomer:
1H-NMR δ (ppm in
DMSO-d
6):
7,85 (d, 1H; C
6'-H, J
CF =
7,01 Hz)
7,83 (d, 2H; C
4'-NH
2)
6,30
(dd, 1H; C
5-H)
5,60 (t, 1H; C
2-H)
5,18 (t, 1H; C
2-CH
2-OH)
3,49 (m, 3H; C
2-CH
2OH + C
4H)
3,17
(dd, 1H; C
4-H)
13CNMR
(DMSO-d
6), (Varian XL 300); δ in ppm
cis-Isomer:
1H-NMR δ (ppm
in DMSO-d
6):
8,22 (d, 1H; C
6'-H,
J
CF = 7,26 Hz)
7,843 (d, 2H; C
4'-NH
2)
6,16 (t, 1H; C
5-H)
5,43
(t, 1H; C
2-CH
2-OH)
5,19
(t, 1H; C
2-H)
3,77 (m, 2H; C
2-CH
2OH)
3,35
(dd, 1H; C
4-H)
3,12 (dd, 1H; C
4-H)
13C NMR
(DMSO-d
6)
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Beispiel 3
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Biologische Ergebnisse
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(A)
Neugeborene Enten wurden mit Entenhepatitis B Virus (DHBV) infiziert.
5 bis 7 Tage nach der Infektion wurden den Enten Blutproben entnommen
und mit Bezug auf DHBV-DNS unter Verwendung von Punkthybridisierung
mit einer spezifischen DNS-Sonde entnommen (Mason et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79, Seiten 3997-4001 (1982)). Die Lebern wurden
bei den mit Bezug auf den Punkt-Blot positiven Enten entfernt und
zur Erzeugung von primären
Hepatozytkulturen verwendet, die mit DHBV wie vorher beschrieben
infiziert waren (Tuttleman et al., J. of Virology, 58, Seiten 17-25).
Nach 2 Tagen in der Kultur wurden dem Kulturmedium antivirale Mittel
zugegeben. Die Medien wurden alle 2 Tage gewechselt und die Zellen
wurden zu ausgewählten
Zeitpunkten entfernt und die gesamte DNS wurde extrahiert.
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Die
DNS wurde auf Nitrocellulosepapier getüpfelt und mit einer 32P-markierten DHBV-DNS-Sonde gemäß dem folgenden
Verfahren untersucht. Die DNS von mit DHBV infizierten Hepatozyten
wurde extrahiert und auf einen Nitrocellulosefilter getüpfelt. Die
vorstehend beschriebene 32P-bruchstellentranslatierte
DHBV DNS (pDH-010 = DHBV) Sonde wurde verwendet. Die DNS wurde aus
6 cm Zellkulturschalen zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Plattieren
extrahiert. Bei der Viruskontroll-(VC-) Gruppe wurden die Zellen
nach 2, 6, 8, 10, 14, 18 und 20 Tagen geerntet. Doppelte Proben
wurden für
die Tage 14, 18 und 20 getüpfelt.
Bei den mit Arzneimittel behandelten Gruppen wurden die Zellen an
den Tagen 8, 14 und 20 geerntet. Arzneimittel wurden der Kultur
2 Tage nach dem Plattieren zugegeben und während des Wechselns des Mediums
alle zwei Tage aufrechterhalten. Die gesamte intracelluläre DNS wurde
aus den Zellen unter Verwendung des Standardphenolextraktionsverfahrens
extrahiert. Die Zellen in einer Petrischale mit einem Durchmesser
von 6 cm (etwa 5 × 106 Zellen) wurden in einem Lysepuffer lysiert,
der 0,2 % SDS, 150 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM ED-TA, 5 mM EGTA und 150 mM NaCl enthielt.
Das Zelllysat wurde mit 0,5 mg/ml Pronase E (erhältlich von Sigma) bei 37°C 2 Stunden
verdaut und mittels Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol
proteinisiert, das mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA und 0,1
% 8-Hydroxychinolin gesättigt
war. Konzentriertes Ammoniumacetat (pH 7,0 (2,5 M)) wurde der wässerigen
Phase zugegeben, um eine 0,25 M Ammoniumacetatlösung zu ergeben, und die Nucleinsäuren wurden
mit 2 Volumina von 100%igem Ethanol ausgefällt. Das Pellet der Nucleinsäure wurde
mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Die DNS wurde in einer Lösung gelöst, die
12,5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 30% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau
enthielt. Ein Zwölftel
der DNS-Probe wurde auf die Nitrocellulose für die Punkt-Blot-Analyse getüpfelt.
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Die
getesteten Arzneimittel wurden auf einer Skala von 0 (keine Aktivität) bis ++++
(hohe Aktivität) markiert.
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Die
getesteten Verbindungen waren 1,3-Oxathiolane und zwei bekannte
Inhibitoren von Hepatitis B, 2',3'-Didesoxyguanosin
(ddG) und 2,6-Diaminopurin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid
(ddDAPR) – (europäische Patentveröffentlichung
0 302 760A).
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
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