WO2001064755A2

WO2001064755A2 - Isoxazole gegen virale erkrankungen

Info

Publication number: WO2001064755A2
Application number: PCT/EP2001/001825
Authority: WO
Inventors: Michael Brands; Susanne Nikolic; Peter Eckenberg; Marcus Bauser; Johannes Kaulen; Arnold Paessens; Erwin Graef; Olaf Weber; Stefan Lottmann; Karl-Heinz Schlemmer
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-19
Publication date: 2001-09-07
Also published as: EP1286974A2; US20030187028A1; BR0108723A; MXPA02008418A; AU3739801A; CA2401405A1; TR200201954T2; JP2003526639A; PL365124A1; CN1406233A; WO2001064755A3; KR20020079963A; IL151188A0

Abstract

Isoxazole sind hochwirksame antivirale Mittel. Kombinationen von Isoxazolen, Dihydropyrimidinen und/oder Lamivudin und gegebenenfalls Interferon hemmen die Vermehrung von HBV-Viren besser als bislang bekannte Mittel.

Description

Arzneimittel gegen virale Erkrankungen

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Isoxazole sowie Kombinationen von A) nicht-nukleosidischen Hemmstoffen aus der Klasse der Isoxazole, B) anderen anti- viralen Wirkstoffen wie (i) Dihydropyrimidinen und/oder (ii) Nukleosidanaloga, wie z.B. Lamivudin, und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren, wie z.B. Interferon (bei den Kombinationen handelt es sich um Zwei-, Drei- oder Vierfach-Kombinationen), ein Verfahren zur Herstellung der Isoxazole und Kombinationen und ihre Ver- wendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-

Infektionen.

Unter „Kombinationen" im Sinne der Erfindung werden nicht nur Darreichungsformen, die alle Komponenten enthalten (sog. Fixkombinationen), und Kombi- nationspackungen, die die Komponenten voneinander getrennt enthalten, verstanden, sondern auch gleichzeitig oder zeitlich versetzt applizierte Komponenten, sofern sie zur Behandlung oder Prophylaxe derselben Krankheit eingesetzt werden.

Das Hepatitis-B-Virus gehört zur Familie der Hepadna- Viren. Es verursacht eine akute und/oder eine persistent-progrediente, chronische Erkrankung. Vielfältige andere klinische Manifestationen im Krankheitsbild werden durch das Hepatitis-B- Virus mitverursacht - insbesondere chronische Leberentzündung, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom. Weiterhin kann eine Koinfektion mit dem Hepatitis- Delta- Virus den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen.

Zur Virushemmung sind bereits mehrere Möglichkeiten vorgeschlagen worden:

1. die Hemmung des Virus durch Dihydropyrimidine, die eine starke Reduktion der viralen DNA und des viralen core-Proteins bewirken; 2. die Hemmung der Polymerase des HBV durch Analoga der Substrate dieses Enzyms wie Lamivudin, FTC, Adefovir Dipivoxil, Abacavir, ß-L-FDDC, L- FMAU und BMS 200 475;

3. die Hemmung des HBV durch immunologische Prinzipien, wie z.B. die Behandlung chronischer Hepatitis durch Interferon;

4. die Hemmung durch andere Wirksubstanzen, deren Wirkungsweisen nicht bekannt oder Gegenstand von Spekulationen sind, wie z.B. AT-61 = N-[(lE)-2- Chlor-2-phenyl-l-(l-piperidinylcarbonyl)-ethenyl]-benzamid, das offenbar in den

Vorgang der Verpackung der prägenomischen RNA in die unfertigen core- Partikel eingreift; vgl. King et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 42, 3179 - 3186 (1998);

5. die Stimulierung wirtseigener Immunabwehr, wie z.B. mit Thymosin-α.

Die einzigen für die Behandlung chronischer Hepatitis zugelassenen Mittel sind Interferon und Lamivudin. Allerdings ist Interferon nur mäßig wirksam und hat unerwünschte Nebenwirkungen; Lamivudin ist zwar gut wirksam, aber unter Behandlung kommt es rasch zu einer Resistenzentwicklung, und nach Absetzen der Therapie erfolgt in den meisten Fällen ein Rebound-Effekt. Kombinationen von Interferon mit Lamivudin sind nicht synergistisch wirksam.

Bisherige Therapeutika zur Behandlung HBV-infizierter Patienten, wie z.B. Inter- feron oder Lamivudin, werden als Monotherapie eingesetzt. Aus klinischen Studien ist bekannt, dass Kombinationen beider Hemmstoffe keinen Vorteil bei der Bekämpfung von HB V-Erkrankungen aufweisen.

Für Adefovir Dipivoxil, BMS 200 475 und die anderen oben erwähnten Hemmstoffe liegen noch keine allgemein zugänglichen klinischen Erfahrungen vor. Neue Mittel für eine bessere und wirksame Therapie sind daher wünschenswert.

Aus der WO 99/45908 sind bereits in 3-Stellung unsubstituierte Isoxazole, z.B. Leflunomid (= N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid), mit antiviraler Wirkung, u.a. gegen Hepatitis-Viren, bekannt. Unsere eigenen Untersuchungen mit diesen Verbindungen haben jedoch keine Aktivität gegen das Hepatitis-B-Virus ergeben.

Wie in WO 99/45908 beschrieben, metabolisiert Leflunomid in vivo durch Ring- Öffnung rasch zu N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyano-4-oxobutyramid. Diese Isome- risierung ist nur für Isoxazole möglich, die an dem Kohlenstoffatom, das dem Stickstoffatom des Isoxazolrings benachbart ist, (3-Position) ein Wasserstoffatom tragen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass in 3-Stellung substituierte Isoxazole den

Isoxazolen der WO 99/45908 deutlich überlegen und gegenüber Hepatitis- Viren hochwirksam sind. Weiterhin wurde gefunden, dass Kombinationen von A) Isoxazolen, B) anderen HBV-antiviralen Wirkstoffen und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren die Nachteile des Standes der Technik nicht oder nur noch teilweise aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind also Verbindungen der Formel

woπn R¹ und R² unabhängig voneinander Alkyl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist,

X einen zweibindigen Rest aus der Reihe bestehend aus OY, -N(R⁴)-C(=Y)-, -CH₂- oder eine Gruppe der Formel

-(CH₂)_nC(=Y)-,

n eine ganze Zahl von 1 bis 4,

R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder gegebenenfalls Halogensubstituiertes Alkyl,

Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A Aryl oder 6-gliedriges Hetaryl, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Reste substituiert sind, die unabhängig voneinander aus der Reihe Halogen, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkoxycarbonyl, Aminocarbonylamino, Mono- und Di- alkylamino, Cyano, Amino, Mono- und Dialkylaminocarbonyl - im Falle der Substitution in o-Stellung aus der Reihe Halogen, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio - ausgewählt sind,

bedeuten.

Für die Verbindungen I gilt:

Alkyl und die Alkylteile in Mono- und Dialkylamino sowie in Mono- und Dialkylaminocarbonyl stehen im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl, 2-Ethylhexyl oder n-Octyl. Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.

Alkylthio steht im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkyl- thiorest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methylthio, Ethylthio und Propylthio.

Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B.

Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert.-But- oxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.

Halogen steht im Rahmen der Erfindung für Fluor, Chlor, Brom oder Iod.

Bevorzugtes halogeniertes Alkyl ist Trifluormethyl.

Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Phenyl und Naphthyl.

Hetaryl steht im Rahmen der Erfindung vorzugsweise für Pyridyl oder Pyrimidyl.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin

R und R² unabhängig voneinander gegebenenfalls Halogen- substituiertes C]-C₈

Alkyl,

X einen zweibindigen Rest aus der Reihe C=Y und CH ,

R und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder gegebenenfalls Halogen-sub- stituiertes d-C₆- Alkyl, Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A Phenyl, Pyridyl oder Pyrimidyl, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Reste aus der Reihe Halogen, Cι-C₆- Alkyl, Cι-C₆- Alkoxy, Q-C₆- Alkylthio, C C₆- Alkoxycarbonyl, Carbamoyl, Mono-Ci-C_ό-alkylaminocarbonyl, Di-Cj-C₆- alkylaminocarbonyl, Cyano - im Falle der Substitution in o-Stellung aus der Reihe Halogen, d-C₆- Alkyl, Cι-C₆- Alkoxy, d-C₆- Alkylthio - substituiert sind,

bedeuten.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin

R¹ und R² unabhängig voneinander Cι-C₆- Alkyl oder Trifluormethyl,

X C=Y,

R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder d-C₆- Alkyl, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl,

Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A ein- bis dreifach substituiertes, vorzugsweise 3,4- oder 3,5-disubstituiertes, Phenyl oder Pyridyl, deren Substituenten unabhängig voneinander aus der

Reihe Alkyl, Halogen, CF₃ ausgewählt sind, insbesondere 3-Methyl-4-fluor- und 3-Chlor-4-fluor-phenyl,

bedeuten. Die erfindungsgemäßen Isoxazole können aus dem entsprechenden Säurechlorid 2 durch Umsetzung mit einem Amin HNAR³ hergestellt werden:

(Schema 1)

Die Synthese des heterocyclischen Bausteines 2 kann z.B. in Analogie zu G. Storck, J.E. McMurry, J. Am. Chem. Soc. 1967, 89, 5461 gemäß folgendem Schema erfolgen:

(Schema 2)

Dazu wird z.B. der Ketoester 5 mit Pyrroldin 6 unter wasserentziehenden Bedingungen in den Enaminoester 7 überfuhrt, welcher mit einer aliphatischen Nitro- verbindung in Gegenwart von Base, wie z.B. Triethylamin, und einem wasserent- ziehenden Mittel wie Phenylisocyanat oder Phosphoroxychlorid zum Isoxazol 8 reagiert. Anschließend lässt sich der Ethylester z.B. mit wässriger Natronlauge spalten und die resultierende Säure 9 z.B. durch Behandeln mit Thionylchlorid in das Säurechlorid überfuhren. Die Herstellung von 3-(3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl)-acetylchlorid und -propanoyl- chlorid kann beispielsweise analog der Literatur (J. Org. Chem. 59, 2882-2884 (1994), Ann. Chim. 26 (7), 340 (1902)) erfolgen.

Als Aminkomponente 3 können käufliche Aniline oder heterocyclische Amine verwendet werden.

Als Basen für die Reaktionen der Schemata 1 und 2 können im allgemeinen Natriumoder Lithiumbistrimethylsilylamid; Alkalimetallhydroxide wie Natriumhydroxid, Lithiumhydroxid oder Kaliumhydroxid; Natriumhydrogencarbonat; Natriumhydrid; organische Tri-(Cι-C₆)-alkylamine wie Triethylamin oder Diisopropylethylamin; Heterocyclen wie l,4-Diazabicyclo[5,4,0]-undec-7-en (DBU), Pyridin, Diamino- pyridin, Methylpiperidin oder N-Methylmorpholin, eingesetzt werden.

Bevorzugte Basen für die Reaktionen des Schemas 1 umfassen organische Amine wie Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, die auch Trägergebunden sein können, wie z.B. Morpholinomethyl-Polystyrol.

Bevorzugte Basen für die Reaktionen des Schemas 2 umfassen Lithiumhydroxid, Pyridin, Diisopropylethylamin und Triethylamin.

Zur Synthese der Thioamide (Formel I mit Y = S) können die Amide 4 mit Lawesson-Reagenz (= 2,4-Bis-(4-methoxyphenyl)-l,3,2,4-dithiaphosphetan-2,4-di- sulfid; vgl. R. Shabana et al., Tetrahedron 1980 (36), 3047-3051) behandelt werden; die Reaktion kann in Toluol bei erhöhter Temperatur erfolgen.

Zur Synthese der Harnstoffe [X = -N(R⁴)-C(=Y)- ] kann z.B. 3-Amino-2,5-dimethyl- isoxazol als Ausgangsmaterial eingesetzt werden (A. Pascual, Helv. Chim. Acta 1989 (72), 556-569), das nach Überführung in das Carbamoylchlorid in analoger Weise mit Aminen HNAR³ umgesetzt wird. Die Amine (X = CH₂) sind aus den korrespondierenden, im Schema 1 beschriebenen Carbonsäureamiden durch Reduktion z.B. mit Boran-dimethylsulfid-Komplex zugänglich (J. March, Advanced Organic Chemistry, 4. Aufl., New York 1992, S. 1212).

Die Reaktionen der Schemata 1 und 2 können in inerten organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Diese umfassen gesättigte lineare, verzweigte und cyclische Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, Alkohole wie Methanol, Ethanol oder iso-Propanol, Ether wie Diethylether, 1,4-Dioxan oder Tetrahydrofuran, Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlormethan, 1 ,2-Dichlorethan, Trichlorethan oder Tetrachlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol oder Xylol, dipolare aprotische Lösungsmittel wie Nitromethan, Dimethylformamid oder Acetonitril, oder deren Mischungen. Besonders bevorzugt sind Dichlormethan, Chloroform, 1,2-Dichlor- ethan, Toluol, Ethanol und Dimethylformamid.

Bevorzugte Lösungsmittel für die Reaktionen des Schemas 1 umfassen chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Chloroform, 1,2 -Dichlormethan und Ether wie Tetrahydrofuran. Die Reaktionen des Schemas 2 werden bevorzugt in aromati- sehen Kohlenwasserstoffen wie Toluol, chlorierten Kohlenwasserstoffen wie Dichlormethan, Chloroform, 1,2-Dichlorethan, Ethern wie Tetrahydrofuran oder Alkanolen wie Ethanol durchgeführt.

Die Reaktionen der Schemata 1 und 2 werden im allgemeinen in einem Temperatur- bereich von 0 bis 150, vorzugsweise von 0 bis 90°C durchgeführt. Die Umsetzungen können bei normalem, erhöhtem oder vermindertem Druck durchgeführt werden (z.B. 0,5 bis 5 bar); im allgemeinen arbeitet man bei Normaldruck.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von Ver- bindungen der Formel (I), worin R¹ bis R³ und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

X C=Y oder oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_nC(=Y)-,

Y ein Sauerstoffatom und

n eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeuten,

durch Umsetzung von Säurechloriden der Formel

woπn

R^!und R² sowie X und Y die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

mit Aminen der Formel NHAR³,

worin A und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), worin

R¹ bis R³ und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

X C=Y und

Y ein Schwefelatom bedeuten, durch Behandlung von Verbindungen der Formel (I), worin

R bis R und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

X C=Y und

Y ein Sauerstoffatom bedeuten,

mit Lawessons Reagenz.

R¹ bis R³ und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

X für CH₂ steht,

durch Reduktion von Verbindungen der Formel (I), worin

R bis R und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

X C=Y und

Y ein Sauerstoffatom bedeuten.

R¹ bis R⁴ und A die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X -N(R⁴)-C(=Y)- und Y ein Sauerstoffatom bedeuten,

durch Umsetzung von Verbindungen der Formel

woπn

1 • R und R^~ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

mit Carbonylgruppendonatoren und Aminen der Formel NHAR³,

worin A und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

Der Begriff "Carbonylgruppendonatoren" im Sinne der Erfindung umfasst z.B. Chlorameisensäuretrichlormethylester, Carbonyldiimidazol und Phosgen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbin- düngen der Formel (I), worin

R¹ bis R⁴ und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

X -N(R⁴)-C(=Y)- und

Y ein Schwefelatom bedeuten,

durch Umsetzung von Verbindungen der Formel

woπn

R > 1 u .,n„d,. R r>2 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

mit Thiocarbonylgruppendonatoren und Aminen der Formel NHAR ,

worin A und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

Der Begriff "Thiocarbonylgruppendonatoren" im Sinne der Erfindung umfasst z.B. N,N'-Thiocarbonyldiimidazol und Thiophosgen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kombinationen A) mindestens eines Isoxazols, B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Wirkstoffs, vorzugsweise (i) eines HBV-DNA- bzw. HBV-core-Protein-Inhibitors und oder (ii) eines HBV-Polymerase-Inhibitors, und gegebenenfalls (C) mindestens eines Immunmodulators. Die Erfindung betrifft also Kombinationen von nukleosidischen und nicht-nukleosidischen Hemmstoffen und gegebenenfalls Immunmodulatoren zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen sowie die Verwendung dieser

Kombinationen zur Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen.

Als Isoxazole A kommen die oben beschriebenen Verbindungen I in Frage.

HBV-DNA- bzw. HBV-core-Protein-Inhibitoren B (i) sind solche nicht-nukleosidischen Hemmstoffe, die intra- und extrazellulär die HBV-DNA hemmen und in der Zelle die Halbwertszeit des HBV-core-Proteins mindestens halbieren. Bevorzugte HBV-core-Protein-Inhibitoren B (i) sind z.B. Dihydropyrimidine, wie sie vorzugsweise in den DE-OS 198 17 264 (= WO 99/54 326), 198 17 265 (= WO 99/54 312) und 198 17 262 (= WO 99/54 329) beschrieben sind.

Bevorzugte Dihydropyrimidine B (i) entsprechen beispielsweise der Formel

bzw. deren isomerer Form

und deren Salzen, worin

R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlen- stoffatomen oder Reste der Formeln

oder

bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, Ci-C_ό-Alkoxy, Cι-C₆-Alkoxycarbonyl und Cι-C₆-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch -S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, -S0₂-CF₃ und -A-CH2-R^{1 !} substituiert sind,

woπn

R > 6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,

R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substituiertes

Phenyl, Hydroxy, Cι-C₆-Acyl oder Cι-C₆-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, Cι-C₆-Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,

A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -S0₂ -,

R^{1 ]} Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, Ci- d-Alkyl und Cι-C₆-Alkoxy, substituiert ist,

bedeuten,

R² einen Rest der Formeln -XR¹² oder -NR¹³R¹⁴, woπn

X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,

R Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Cι-C₆-Alkoxycarbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C_j- C₈-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(d- C₄- Alkyl)-, -S- oder -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen,

Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR R substituiert ist,

worin

R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C₆- Alkyl bedeuten,

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C₆- Alkyl oder Cycloalkyl mit

3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,

R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

H₃CO

OCH, oder

Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes CpC₆- Alkylthio, Trifluormethyl oder Pyridyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, Cj-C₆- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, Cι-C₆-

Alkylthio oder Cι-C₆- Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino, Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,

worin a Null oder 1 bedeutet,

R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder d-C₆- Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch Cι-C₆- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, CpC_ö-Alkyl oder Cι-C₆-Alkoxy substituiert sind und/oder d-C₆-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist,

oder

R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,

oder

R gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl

oder

R und R gemeinsam einen Rest der Formel ^"°s/

R Wasserstoff, Cι-C₄- Alkyl, C₂-C₄-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Benzoyl oder C₂-C₆- Acyl, und

R⁵ Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3-fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, d-C₆-Alkoxy, d- C₆-Alkyl, d-C₆- Alkylthio, Carbalkoxy, d-C₆-Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-Cι-C₆-alkylamino substituiert sein können,

bedeuten.

Ganz besonders bevorzugte Dihydropyrimidine B sind die folgenden Verbindungen:

ihre isomeren Formen und ihre Salze.

Die Verbindungen II bzw. Ila schließen die Isomeren der Formeln (II) und (Ila) sowie deren Mischungen ein. Wenn R⁴ Wasserstoff ist, liegen die Isomeren (II) und (Ila) im tautomeren Gleichgewicht vor:

(l) (la)

Die obigen Dihydropyrimidine II bzw. Ila und verschiedene Verfahren zu ihrer Her- Stellung sind aus den DE-OS 198 17 264 (= WO 99/54 326) und 198 17 265 (= WO

99/54 312) bekannt-

Weitere bevorzugte Dihydropyrimidine B (i) entsprechen der Formel

bzw. deren isomerer Form

und/oder deren Salzen, worin

R Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formeln

bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, d-

C₆-A_koxy, Cι-C₆-Alkoxycarbonyl und Cι-C₆-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, -SO₂-CF₃ und -A-CH₂-R^U substituiert sind,

woπn

R⁶ gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,

R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, Hydroxy, Cι-C₆-Acyl oder d-C₆- Alkyl, wobei der Alkylrest seiner- seits durch Hydroxy, d-C₆- Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,

A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -S0₂-,

R¹¹ Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch

Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl,

Cι-C₆- Alkyl und Cι-C₆- Alkoxy, substituiert ist,

bedeuten,

R² einen Rest der Formeln -OR¹² oder -NR¹³R¹⁴,

woπn

R¹² Wasserstoff, C]-C₆- Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C,-C₈-Kohlenwasserstof_τest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heteroketten- glieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(C_rC₄- Alkyl)-, -S- und -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,

woπn

R , 15 und R , 16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C₆-Alkyl bedeuten,

R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C₆- Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, R ,3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

H₃CO

OCH,

oder Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes C₁-C₄-Alkylthio, Trifluormethyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, d-C₆- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, d-C₆- Alkylthio oder d-C₆- Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,

woπn

Null oder 1 bedeutet,

R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder d-C₆- Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C₆- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, d-C₆- Alkyl oder d-C₆- Alkoxy substituiert sind und/oder Cι-C₆- Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist,

oder

R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten, D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

R⁵ Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen

bedeuten.

Die Verbindungen III bzw. Illa können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere) oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Verbindungen III bzw. Illa umfassen also sowohl die Enantiomeren als auch die Diastereomeren sowie deren jeweiligen Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.

Die Dihydropyrimidine III bzw. Illa, welche in 2-Stellung einen gegebenenfalls substituierten Oxazolyl- oder Thiazolylrest enthalten, und verschiedene Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der DE-OS 198 17 262 (= WO 99/54 329) bekannt.

Für die Verbindungen II, Ila, III und lila gilt:

Alkyl per se und die Alkylteile in Mono- und Dialkylamino sowie in Mono- und Di- alkylaminocarbonyl stehen im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl, 2-Ethylhexyl oder n- Octyl.

Alkenyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, tert.Butenyl, n-Pentenyl und n-Hexenyl. Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen steht im Rahmen der Erfindung für Cyclo- propyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, vorzugsweise Cyclopentyl und Cyclo- hexyl.

Acyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten

Acylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Acetyl und Propionyl.

Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkoxy- rest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methoxy, Ethoxy,

Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.

Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert.-But- oxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.

Aralkyl steht im Rahmen der Erfindung für Aralkyl mit vorzugsweise 6 bis 10, insbesondere 6 Kohlenstoffatomen im Arylteil (vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl, insbesondere Phenyl) und vorzugsweise 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2 Kohlenstoff- atomen im Alkylteil, wobei der Alkylteil linear oder verzweigt sein kann. Bevorzugte

Aralkylreste sind Benzyl und Phenethyl.

Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Phenyl und Naphthyl. Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für 5- bis 7-gliedrige Ringe mit vorzugsweise 1 bis 3, insbesondere 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff. Bevorzugte Beispiele umfassen Furyl, Thiophenyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, 1.2.3- und 1.2.4-Triazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, 1.2.3-, 1.3.4-, 1.2.4- und 1.2.5-Oxadiazolyl, Pyrrolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1.3.5-, 1.2.4- und 1.2.3-Triazinyl, 1.2.4-, 1.3.2-, 1.3.6- und 1.2.6-Oxazinyl, insbesondere Pyridyl und Pyrimidyl.

Halogen steht im Rahmen der Erfindung für Fluor, Chlor, Brom oder Iod.

Bevorzugtes halogeniertes Alkyl ist Trifluormethyl.

Die Verbindungen II bzw. Ila und III bzw. Illa können auch als Salze vorliegen. Im Rahmen der Erfindung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevorzugt.

Physiologisch unbedenkliche Salze können Salze der Verbindungen II bzw. Ila und III bzw. Illa mit anorganischen oder organischen Säuren sein. Bevorzugt werden Salze anorganischer Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder Salze organischer Carbon- oder Sulfon- säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoesäure, oder Methansulfonsäure, Ethan- sulfonsäure, Phenylsulfonsäure, Toluolsulfonsäure oder Naphthalindisulfonsäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze der Verbindungen II bzw. Ila und III bzw. Illa sein. Besonders bevorzugt sind z.B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze sowie Ammoniumsalze, die von Ammoniak oder organischen Aminen, wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethylamin, Di- bzw. Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder 2-Phenylethylamin, abgeleitet sind.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kombinationen A) mindestens eines Isoxazols,

B) mindestens (i) eines Dihydropyrimidins und/oder (ii) eines HBV-Polymerase-

Inhibitors und gegebenenfalls

C) mindestens eines Immunmodulators.

Als HBV-Polymerase-Inhibitoren B (ii) im Sinne der Erfindung werden solche Stoffe bezeichnet, die endogenen Polymerase- Assay, das von Ph. A. Furman et al. in Anti- microbial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992) publiziert worden ist, zu einer Hemmung der Bildung eines HBV-DNA-Doppelstranges derart führen, dass sich maximal 50 % der Aktivität des Nullwerts ergeben:

Bevorzugte HBV-Polymerase-Inhibitoren B(ii) umfassen beispielsweise

3TC = Lamivudin = = 4-Amino-l-[(2R-cis)-2-(hydroxymethyl)-l .3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin-2(lH)-on, vgl. EP-PS 382 526 (= US-PS 5 047 407) und WO 91/11186 (= US-PS 5 204466);

Adefovir Dipivoxil =

9- {2-[[Bis[(Pivaloyloxy)-methoxy]-phosphinyl]-methoxy]-ethyl} -adenin, vgl. EP -PS 481 214 (= US-PS 5 663 159 und 5 792 756), US-PS 4 724 233 und 4 808 716;

BMS 200 475 =

[1 S-(l .α,3.α,4.ß)]-2-Amino-l .9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2- methylen-cyclopentyl]-6H-purin-6-on, vgl. EP-PS 481 754 (= US-PS 5 206 244 und 5 340 816), WO 98/09964 und 99/41275;

Abacavir =

(-)-(lS-cis)-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-l- methanol, vgl. EP-PS 349 242 (= US-PS 5 049 671) und EP-PS 434 450 (= US-PS 5 034 394); FTC -

(2R-cis)-4-Amino-5-fluor-l-[2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin- 2(lH)-on, vgl. WO 92/14743 (= US-PS 5 204 466, 5 210 085, 5 539 116, 5 700 937, 5 728 575, 5 814 639, 5 827 727, 5 852 027, 5 892 025, 5 914 331, 5 914 400) und WO 92/18517;

ß-L-FDDC =

5-(6-Amino-2-fluor-9H-purin-9-yl)-tetrahydro-2-furanmethanol, vgl. WO 94/27616

(= US-PS 5 627 160, 5 561 120,5 631 239 und 5 830 881);

L-FMAU = l-(2-Deoxy-2-fluor-ß-L-arabinofuranosyl)-5-methyl-pyrimidin-2.4(lH, 3H)-dion, vgl. WO 99/05157, WO 99/05158 und US-PS 5 753 789.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Isoxazolen (I) und B)(ii) Lamivudin.

Andere bevorzugte HBV-antivirale Mittel B umfassen z.B. Phenylpropenamide der Formel

woπn

R¹ und R² unabhängig voneinander Cι-C -Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und oder Sauerstoff umfassen, bilden, R³-R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, d-C₄- Alkyl, gegebenenfalls substituiertes d-C₄- Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,

R¹³ Wasserstoff, Cι-C₄-Alkyl, Cι-C₇-Acyl oder Aralkyl und

X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes d-C -Alkyl

bedeuten,

und deren Salze.

Diese Phenylpropenamide und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der WO 98/33501 bekannt, auf die hiermit zum Zwecke der Offenbarung Bezug genommen wird. AT-61 ist die Verbindung der obigen Formel, worin X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten.

Bevorzugte Immunmodulatoren C) umfassen beispielsweise sämtliche Interferone wie α-, ß- und γ-Interferone, insbesondere auch α-2a- und α-2b-Interferone, Interleu- kine wie Interleukin-2, Polypeptide wie Thymosin-α-1 und Thymoctonan, Imidazo- chinolinderivate wie ®Levamisole, Immunglobuline und therapeutische Vaccine.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen A) mindestens eines Isoxazols, B) (i) mindestens eines Dihydropyrimidins, (ii) Lami- vudin und gegebenbenfalls C) Interferon.

Die erfindungsgemäßen Kombinationen hemmen die Vermehrung des HBV- Virus unvorhersehbar wesentlich besser als die aus dem Stand der Technik bekannten Mittel oder deren bekannte Kombinationen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationen bietet bei der Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen wertvolle

Vorteile im Vergleich zur Monotherapie mit den Einzelverbindungen, nämlich hauptsächlich eine synergistische antivirale Wirksamkeit, aber auch eine gute Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Kombinationen im Bereich der Toxizität, bei der 50 % der Zellen überleben („Tox-50") - im Vergleich zur Tox-50 der Einzelkomponenten.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Verbindungen (I) bzw. die erfindungsgemäßen Kombinationen in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den Wirkstoff oder die Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 1 bis 30 mg/kg Körpergewicht. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Objekts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem

Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt.

Das Mengenverhältnis der Komponenten A, B und gegebenenfalls C der erfindungsgemäßen Kombinationen kann innerhalb weiter Grenzen schwanken; vorzugsweise beträgt es 5 bis 1000 mg A / 5 bis 500 mg B, insbesondere 10 bis 500 mg A / 20 bis

400 mg B und weiterhin 5 bis 1000 mg A/5 bis 500 mg B und/oder 1 bis 10 Millionen I.E. (internationale Einheiten) C.

Die gegebenenfalls mitzuverwendende Komponente C kann in Mengen von vorzugs- weise insbesondere 2 bis 7 Millionen I.E. etwa dreimal wöchentlich über einen Zeitraum bis zu einem Jahr angewandt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen I bzw. die erfindungsgemäßen Kombinationen können in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen im allgemei- nen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise etwa 0,5 bis 95,

Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein. Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nichttoxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindung (I) oder eine oder mehrere erfindungsgemäße Kombi- nationen enthalten oder die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung (I) oder

Kombinationen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Verbindungen (I) bzw. außer den erfindungsgemäßen Kombinationen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen kann in üblicher Weise nach bekannten Methoden erfolgen, z.B. durch Mischen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.

Die Wirkstoffe können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat. Für diese Applikationswege können die Wirkstoffe in geeigneten Appli- kationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich den oder die Wirkstoffe schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, wie z.B. Tabletten ohne oder mit (z.B. magensaftresistenten) Überzug, Kapseln, Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emul- sionen, Suspensionen und Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikations- formen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten und sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen -lösungen, Sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- und Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, Milch, Pasten, Streupuder oder Implantate.

Die Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies geschieht unter Verwendung inerter nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Hilfsstoffe. Hierzu zählen u.a. Trägerstoffe (z.B. mikrokristalline Cellulose), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglykole), Emulgatoren (z.B. Natriumdodecylsulfat), Dispergiermittel (z.B. Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Biopolymere (z.B. Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxi- dantien wie Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie Eisenoxide) oder Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.

Die Indikationsgebiete für die erfindungsgemäßen Verbindungen (I) und Kombinationen umfassen:

1. die Behandlung von akuten und chronischen Virusinfektionen, die zu einer infektiösen Hepatitis führen können, beispielsweise die Infektionen mit Hepatitis B-Viren; besonders bevorzugt ist die Behandlung von chronischen

Hepatitis-B Infektionen und die Behandlung von akuter Hepatitis-B Virusinfektion;

2. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koinfek- tion mit dem Hepatitis-Delta- Virus; und 3. die Behandlung von Infektionen bei Organtransplantationen, insbesondere bei Lebertransplantationen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die Verbindungen (I) zur Bekämpfung von Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung (I) und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Verbindungen (I) bei der

Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen, insbesondere von Hepatitis B.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die oben definierten Kombinationen zur Bekämpfung von Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der oben definierten Kombinationen und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben definierten Kombinationen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe der oben beschriebenen Erkrankungen, vorzugsweise von Viruserkrankungen, insbesondere von Hepatitis B.

Die Prozentangaben der nachfolgenden Beispiele beziehen sich jeweils, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht. Beispiele

1. Herstellungsbeispiele

Beispiel 1

5-Isopropyl-3-methylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4-fluor-3-methylphenyl)-amid

Eine Lösung von 10,97 g (69,3 mmol) Isobutyrylessigsäureethylester und 4,93 g

(69,3 mmol) Pyrrolidin in 50 ml Toluol wird 3 Stunden in einer Wasserabscheideapparatur zum Rückfluss erhitzt. Anschließend wird das Toluol unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in einer Mischung aus 5,73 g (76,3 mmol) Nitro- ethan, 28 ml (201 mmol) Triethylamin und 120 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wird auf 5°C abgekühlt und tropfenweise mit einer Lösung von 11,7 g (76,3 mmol)

Phosphoroxychlorid in 20 ml Chloroform versetzt. Nach beendeter Zugabe wird 15 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt und auf 100 ml Eiswasser gegossen. Die organische Phase wird abgetrennt, nacheinander mit 6 M Salzsäure, 5 %iger Natronlauge, Wasser und gesättigter wässriger NaCl-Lösung gewaschen und über Natrium- sulfat getrocknet. Abdestillieren des Lösungsmittels und Chromatographie an

Kieselgel (Laufmittel Dichlormethan) ergeben 7,52g (55 %) 5-Isopropyl-3-methyl- isoxazol-4-carbonsäureethylester als farbloses Öl. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-D₆): δ = 1,28 (d, 6H) ppm, 1,31 (t, 3H) ppm, 2,35 (s, 3H) ppm, 3,71 (Quint., 1H) ppm, 4,27 (q, 2H) ppm.

Eine Mischung aus 7,5 g (38,0 mmol) des Esters, 70 ml Ethanol, 20 ml Wasser und 3,04 g (76,1 mmol) Natriumhydroxid wird 2 Stunden zum Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen wird der Hauptteil des Ethanols unter vermindertem Druck abdestilliert. Die wässrige Phase wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und dann mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird mit Petrolether verrührt. Durch Abfiltrieren und Trocknen unter vermindertem Druck werden 5,13 g (80 %) 5-Isopropyl-3-methylisoxazol-4-carbonsäure als farbloser Feststoff isoliert.

1H-NMR (200 MHz, DMSO-D₆): δ = 1,25 (d, 6H) ppm, 2,60 (s, 3H) ppm, 3,39 (Quint., lH) ppm. MS (DCI/NH3): 170 [M+H]⁺.

Zu 2 g (11,8 mmol) der beschriebenen Säure werden 7,03 g (59,1 mmol) Thionyl- chlorid gegeben. Es wird solange unter Rühren zum Rückfluss erwärmt, bis die Gasentwicklung aufhört (ca. 1 Stunde). Das Thionylchlorid wird unter vermindertem Druck entfernt und das resultierende Säurechlorid (braunes Öl) ohne Reinigung weiter umgesetzt.

Eine Mischung aus 56,3 mg (0,3 mmol) des Säurechlorids, 37,5 mg (0,3 mmol) 4- Fluor-3-methylanillin und 2,4 ml 1,2-Dichlorethan wird mit 124 mg Morpholino- methyl-Polystyrol (Belegung 3,69 mmol/g) versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird abfiltriert und mit Dichlormethan gewaschen. Ent- fernen der flüchtigen Bestandteile unter vermindertem Druck ergibt 80 mg (96 %)

5-Isopropyl-3-methylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4-fluor-3-methylphenyl)-amid als farbloser Feststoff.

LC-MS (C18 Säule, 50x2,1 mm, 3,5 μm; Gradient Acetonitril + 0,1 % Ameisensäure [A], Wasser + 0,1% Ameisensäure [B]: bis 4 min A/B=l :9, 4-6 min A/B=9:l; Flussrate 0,5 ml/min; Ionisierung ESI positiv): Rt 4,3 min, m/z 276 [M]⁺. Beispiel 2

3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4-fluor-3-methylphenyl)-amid

Eine Lösung von 2,53 g (18,8 mmol) 4-Fluor-3-methylanilin und 2,88 ml (20,7 mmol) Triethylamin in 30 ml Dichlormethan wird auf 0°C gekühlt und tropfenweise mit einer Lösung aus 3,0 g (18,8 mmol) 3,5-Dimethylisoxazol- carbonsäurechlorid in 10 ml Dichlormethan versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 0°C nachgerührt und anschließend nacheinander mit 1 M Salzsäure, gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter wässriger NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck von den flüchtigen Bestandteilen befreit. Der verbleibende Rückstand wird an Kieselgel (Dichlormethan/Ethylacetat Gradient) chromatographiert. 3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4-fluor-3-methylphenyl)-amid resultiert als farbloser Feststoff (4,0 g, 86 %).

1H-NMR (200 MHz, CDC1₃): δ = 2,30 (s, 3H) ppm, 2,51 (s, 3H) ppm, 2,67 (s, 3H) ppm, 6,97 (t, 1H) ppm, 7,23 (m, 1H) ppm, 7,41 (m, 1H) ppm. MS (DCI/NH₃): 249 (M+H)⁺.

Beispiel 3

3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4-fluor-3-methylphenyl)-thioamid

Eine Mischung aus 100 mg (0,40 mmol) 3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4- fluor-3-methylphenyl)-amid, 80 mg (0,20 mmol) Lawesson- Reagenz und 5 ml Toluol wird 1 Stunde auf 90°C erwärmt. Nach Abdestillieren des Toluols unter vermindertem Druck wird an Kieselgel (Dichlormethan/Ethylacetat Gradient) chromato- graphiert. 3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure-N-(4-fluor-3-methylphenyl)-thioamid resultiert als farbloser Feststoff (106 mg, 100 %).

1H-NMR (200 MHz, DMSO-D₆): δ = 2,26 (s, 3H) ppm, 2,32 (s, 3H) ppm, 2,52 (s, 3H) ppm, 7,22 (t, 1H) ppm, 7,67 (m, 2H) ppm, 11,65 (s, br, 1H) ppm. MS (DCI/NH₃): 265 (M+H)⁺.

Die Verbindungen der nachstehenden Beispiele wurden analog den Beispielen 1 bis 3 synthetisiert.

LCMS-Methoden:

Methode A:

C18 Säule, 150x2,1 mm, 5 μm; Gradient Acetonitril + 0,1% Ameisensäure [A], Wasser + 0,1% Ameisensäure [B]: bis 9 min A/B=T:9, 9-10,1 min A/B=9:l; Flussrate 0,5 ml/min; Ofentemperatur 40°C, UV-Detektion 210-350 nm, Ionisierung ESI positiv

Methode B:

C18 Säule, 50x2,1 mm, 3,5 μm; Gradient Acetonitril + 0,1% Ameisensäure [A], Wasser + 0,1 % Ameisensäure [B]: bis 4 min A/B=l:9, 4-6 min A/B=9:l; Flussrate 0,5 ml/min; Ofentemperatur 40°C, UV-Detektion 208-400 nm, Ionisierung ESI positiv

Methode C:

C18 Säule, 150x2,1 mm, 5 μm; Gradient Acetonitril [A], 0,01 N Salzsäure [B], Wasser [C]: bis 4 min A/B/C=l 0:45:45, 4-9 min A/B/C=90:5:5; Flussrate

0,6 ml/min; Ofentemperatur 40°C, UV-Detektion 210 nm, Ionisierung ESI positiv

Beispiel 32

N-[(3,5-dimethyl-4-isoxazolyl)-methyl]-4-fluor-3-methylanilin

Unter Argon werden 500 mg (2,01 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2 in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei 0°C mit 0,65 g (8,56 mmol, 4,28 ml) Boran- Dimethylsulfid-Komplex versetzt. Anschließend wird 2 h bis zum Sieden erhitzt. Es werden 4,13 ml 1 N Salzsäure zugegeben und 1 weitere Stunde unter Rückfluss gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zugabe von 12,5 ml 0,5 M Natronlauge wird mit Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Es wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel abdestilliert. Anschließend wird der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel (1. Dichlormethan, 2. Cyclohexan : Essigsäureethylester 6:1) gereinigt und umkristallisiert. Die Zielverbindung wird in einer Ausbeute von 54 % (0,253 g) erhalten. MS (EI/POS): 234 [M+H]⁺

1H-NMR (200 MHz, CDC1₃): δ = 2,22 (d, 3H) ppm; 2,27 (s, 3H) ppm; 2,38 (s, 3H) ppm; 3,30 (breites s, IH) ppm; 3,95 (s, 2H) ppm; 6,35 - 6,50 (m, 2H) ppm; 6,85 (t, IH) ppm.

In Analogie zur Vorschrift des Beispiels 32 wird ausgehend von der Verbindung aus Beispiel 30 das folgende Beispiel 33 hergestellt: Beispiel 33

4-Fluor-N-[(5-isopropyl-3-propyl-4-isoxazolyl)-methyl]-3-methylanilin

Ausbeute: 13 %

MS (DCI/NH₃) = 291 [M+H]⁺, 308 [M+NH₄]⁺

1H-NMR (300 MHz, CDC1₃): δ = 0,95 (t, 3H) ppm; 1,33 (d, 6H) ppm; 1,60 - 1,80

(m, 2H) ppm; 2,21 (d, 3H) ppm; 2,70 (t, 2H) ppm; 2,95 - 3,11 (m, IH) ppm; 3,22

(breites s, IH) ppm; 3,95 (s, 2H) ppm; 6,37 - 6,50 (m, 2H) ppm; 6,86 (t, IH) ppm.

Beispiel 34

Stufe A:

3,5-Dimethyl-4-isoxazolamin

In 430 ml Wasser werden 12,00 g (84,44 mmol) 3,5-Dimethyl-4-nitro-isoxazol vorgelegt und mit 106,15 g (1,984 mol) Ammoniumchlorid versetzt. Bei 4°C werden 46,93 g (7,17 mol) Zink innerhalb von 2 h zugegeben, die Reaktionslösung wird mit

Essigsäureethylester versetzt und die organische Phase über Celite filtriert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Lösemittel abdestilliert und die Zielverbindung in einer Ausbeute von 86 % (8,10 g) erhalten. 1H-NMR (300 MHz, CDCI₃): δ = 2,20 (s, 3H) ppm; 2,28 (s, 3H) ppm; 2,51 (breites s, 2H) ppm. Stufe B:

N-(3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl)-N'-(4-fluor-3-methylphenyl)-harnstoff

In 40 ml Dichlormethan werden 1,25 g (10,00 mmol) 3-Methyl-4-fluoranilin gelöst und mit 4,29 g (20,00 mmol) l,8-Bis(dimethylamino)-naphthalin versetzt. Bei 0°C werden 0,72 ml (6,00 mmol) Chlorameisensäuretrichlormethylester in 10 ml Di- methylmethan zugetropft und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird mit 50 ml Dichlormethan verdünnt und mit Eiswasser, 1 N Salzsäure sowie gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Filtrat mit 1,12 g (10,00 mmol) des Amins aus Stufe A versetzt und 4 h bis zum Sieden erhitzt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Dichlor- methan gewaschen und aus Ethanol umkristallisiert. Die Zielverbindung wird in einer Ausbeute von 27 % (0,71 g) erhalten. MS (DCI/NH3) : 264 [M+H]⁺

1H-NMR (200 MHz, D₆-DMSO): δ = 2,10 (s, 3H) ppm; 2,20 (d, 3H) ppm; 2,26 (s, 3H) ppm; 7,00 (t, IH) ppm; 7,28 - 7,30 (m, IH) ppm; 7,34 (dd, IH) ppm; 7,68 (breites s, IH) ppm; 8,72 (breites s, IH) ppm.

Beispiel 35

N-(3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl)-N'-(4-fluor-3-methylphenyl)-thioharnstoff

In 50 ml Toluol werden 1,25 g (10,00 mmol) 3-Methyl-4-fluoranilin gelöst und mit 2,18 g (11,00 mmol) N,N'-Thiocarbonyldiimidazol versetzt. Anschließend wird 45 Minuten bis zum Sieden erhitzt. Nach Abkühlen auf 50°C werden 1,12 g (10,00 mmol) der Verbindung aus Beispiel 34 (Stufe A) zugegeben und die Reak- tionslösung 4 h bei 70°C gerührt. Der Rückstand wird nach Abdestillieren des Lösemittels mit Essigsäureethylester verrührt, die Kristalle abgesaugt und aus Ethanol umkristallisiert. Die Zielverbindung wird in einer Ausbeute von 54 % (1,50 g) erhalten. MS (DCI/NH3): 280 [M+H]⁺ 1H-NMR (200 MHz, D₆-DMSO): δ = 2,10 (s, 3H) ppm; 2,20 (d, 3H) ppm; 2,25 (s,

3H) ppm; 7,05 - 7,18 (m, IH) ppm; 7,18 - 7,38 (m, 2H) ppm; 8,95 (breites s, IH) ppm; 9,80 (breites s, IH) ppm.

Beispiel 36

3-(3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl)-N-(4-fluoro-3-methylphenyl)propanamid

In 20 ml Dichlormethan werden 1,00 g (7,99 mmol) 4-Fluor-3-methylanilin gelöst und mit 1,21 g (11,99 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 0°C wird eine Lösung aus 1,50 g (7,99 mmol) 3-(3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl)propanoylchlorid in 10 ml Dichlormethan zugegeben. Es wird 1 Stunde bei 0°C gerührt und anschließend mit Wasser, IN Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonat- sowie gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat wird über Kiesel- gel filtriert, das Filtrat eingeengt, der Rückstand abgetrennt und aus Essigsäureethylester/n-Pentan umkristallisiert. Die Zielverbindung wird in einer Ausbeute von 54 % (1,19 g) erhalten. Fp.: 136-137 °C.

Beispiel 37

N-[3-(3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl)propyl]-N-(4-fluoro-3-methylphenyl)-amin

In 30 ml Tetrahydrofuran werden 0,50 g (1,81 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3 gelöst und bei 0°C mit 0,58 g (7,69 mmol) Borandimethylsulfid-Komplex versetzt.

Nach 2 Stunden Rühren unter Rückfluß wird erneut auf 0°C gekühlt, mit 3,71 ml 1 N Salzsäure versetzt und 1 Stunde bis zum Sieden erhitzt. Bei Raumtemperatur werden 11 ml 1 N Natronlauge zugegeben, mit Essigsäureethylester extrahiert und anschließend mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels wird durch Flashchromatographie an Kieselgel (1. Cyclohexan, 2. Cyclohexan/Essigsäureethylester 5:1, 2:1) und Umkristallisation aus Essigsäureethylester/n-Pentan die Zielverbindung gereinigt in einer Ausbeute von 58 % (0,273 g) erhalten. Fp.: 74-76 °C 2. Anwendungsbeispiele

Die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in Anlehnung an die von M.A. Seils et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 1005-1009 (1987) und B.E. Korba et al, Antiviral Research 19, 55-70 (1992) beschriebenen Methoden untersucht.

Die antiviralen Tests wurden in 96-well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Die erste vertikale Reihe der Platte erhielt nur Wachstumsmedium und HepG2.2.15-Zellen. Sie diente als Viruskontrolle.

Stammlösungen der Testverbindungen (50 mM) wurden zunächst in DMSO gelöst, weitere Verdünnungen wurden in Wachstumsmedium der HepG2.2.15 hergestellt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in der Regel in einer Testkonzentra- tion von 100 μM (1. Testkonzentration) jeweils in die zweite vertikale Testreihe der

Mikrotiterplatte pipettiert und anschließend in Zweierschritten 2¹⁰-fach in Wachstumsmedium plus 2 % fötales Kälberserum, verdünnt (Volumen 25 μl).

Jeder Napf der Mikrotiterplatte erhielt dann 225 μl einer HepG2.2.15-Zellsuspension (5 x 10⁴ Zellen/ml) in Wachstumsmedium plus 2 % fötales Kälberserum.

Der Testansatz wurde 4 Tage bei 37°C und 5 % CO₂(v/v) inkubiert.

Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und verworfen, und die Näpfe erhiel- ten 225 μl frisch zubereitetes Wachstumsmedium. Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden jeweils erneut als 10-fach konzentrierte Lösung in einem Volumen von 25 μl zugefügt. Die Ansätze wurden weitere 4 Tage inkubiert.

Vor der Ernte der Überstände oder Zellen zur Bestimmung des antiviralen Effektes wurden die HepG2.2.15-Zellen lichtmikroskopisch oder mittels biochemischer Nach- weisverfahren (z.B. Alamar-Blue-Färbung oder Trypanblau-Färbung) auf zytotoxi- sche Veränderungen untersucht.

Anschließend wurden die Überstände oder Zellen geerntet und mittels Vakuum auf mit Nylonmembran bespannten 96-Napf-Dot-Blot-Kammern (entsprechend den Herstellerangaben) gesogen.

Zytotoxizitätsbestimmung

Substanzinduzierte zytotoxische oder zytostatische Veränderungen der HepG2.2.15-

Zellen wurden z.B. lichtmikroskopisch als Änderungen der Zellmorphologie ermittelt. Derartige Substanz-induzierte Veränderungen der HepG2.2.15-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen wurden z.B. als Zellyse, Vakuolisierung oder veränderter Zellmorphologie sichtbar. 50 %> Zytotoxizität ("Tox.-50") bedeuten, dass 50 % der Zellen eine der entsprechenden Zellkontrolle vergleichbare Morphologie aufweisen.

Die Verträglichkeit einiger der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde zusätzlich auf anderen Wirtszellen, wie z.B. HeLa-Zellen, primäre periphere Blutzellen des Menschen oder transformierte Zellinien wie H-9-Zellen, getestet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen waren in der Regel bis zu Konzentrationen von lOμM zellverträglich (Tox-50).

Bestimmung der antiviralen Wirkung

Nach Transfer der Überstände oder Zellen auf die Nylon-Membran der Blot- Apparatur (s.o.) wurden die Überstände der HepG2.2.15-Zellen denaturiert (1,5 M NaCl/0,5 N NaOH), neutralisiert (3 M NaCl 0,5 M Tris HC1, pH 7,5) und ge- waschen (2 x SSC). Anschließend wurde die DNA durch Inkubation der Filter bei

120°C innerhalb von 2 - 4 Stunden an die Membran gebacken. Hybridisierung der DNA

Der Nachweis der viralen DNA von den behandelten HepG2.2.15-Zellen auf den Nylonfiltern wurde in der Regel mit nichtradioaktiven, Digoxigenin-markierten Hepatitis B-spezifischen DNA-Sonden durchgeführt, die jeweils nach Herstellerangabe mit Digoxigenin markiert, gereinigt und zur Hybridisierung eingesetzt wurden.

Die Prähybridisierung und Hybridisierung erfolgte in 5 x SSC, 1 x Blockierungsrea- genz, 0,1 % N-Lauroylsarcosin, 0,02 % SDS und 100 μg Sperma-DNA des Herings.

Die Prähybridisierung erfolgte 30 Minuten bei 60°C, die spezifische Hybridisierung mit 20 bis 40 ng/ml der digoxigenierten, denaturierten HBV-spezifischen DNA (14 Stunden, 60°C). Anschließend wurden die Filter gewaschen.

Nachweis der HBV-DNA durch Digoxigenin- Antikörper

Der immunologische Nachweis der Digoxigenin-markierten DNA erfolgte nach Angaben des Herstellers:

Die Filter wurden gewaschen und in einem Blockierungsreagenz (nach Herstellerangabe) prähybridisiert. Anschließend wurde mit einem Anti-DIG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war, 30 Minuten hybridisiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat der alkalischen Phosphatase, CSPD, zugefügt, 5 Minuten mit den Filtern inkubiert, anschließend in Plastikfolie eingepackt und wei- tere 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Chemilumineszenz der Hepatitis B-spezifi- schen DNA-Signale wurde über eine Exposition der Filter auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht (Inkubation je nach Signalstärke: 10 Minuten bis 2 Stunden).

Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC-50, inhibitorische Konzentration 50 %>) wurde als die Konzentration bestimmt, bei der gegenüber einer unbehandelten Probe die Hepatitis B-spezifische Bande durch die erfindungsgemäße Verbindung um 50 % reduziert wurde.

Die Behandlung der Hepatits B-Virus produzierenden HepG2.2.15-Zellen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen führte überraschenderweise zu einer Reduktion viraler DNA im Zellkulturüberstand, die von den Zellen in Form von Virionen in den Zellkulturüberstand ausgeschleust wird, oder zu einer Reduktion von intrazellulärer viraler DNA.

Wirkdaten:

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen eine nicht vorhersehbare und wertvolle Wirkung gegen Viren. Sie sind überraschenderweise antiviral gegen Hepatitis B (HBV) wirksam und sind somit zur Behandlung von virusinduzierten Erkrankungen, insbesondere von akut und chronisch persistenten Virusinfektionen des HBV geeignet. Eine chronische Viruserkrankung, hervorgerufen durch das HBV, kann zu unterschiedlich schweren Krankheitsbildern führen; bekanntermaßen führt die chronische Hepatitis B -Virusinfektion in vielen Fällen zur Leberzirrhose und/oder zum hepato- zellulären Karzinom.

Claims

Patentansprtiche

1. Verbindungen der Formel

woπn

R¹ und R² unabhängig voneinander Alkyl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist,

X einen zweibindigen Rest aus der Reihe bestehend aus

C=Y, -N(R⁴)-C(=Y)-, -CH₂- oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_nC(=Y)-

n eine ganze Zahl von 1 bis 4,

R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder gegebenenfalls Halo- gen-substituiertes Alkyl,

Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A Aryl oder 6-gliedriges Hetaryl, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Reste substituiert sind, die unabhängig voneinander aus der Reihe Halogen,

Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkoxycarbonyl, Aminocarbonylamino, Mono- und Dialkylamino, Cyano, Amino, Mono- und Dialkylamino- carbonyl - im Falle der Substitution in o-Stellung aus der Reihe Halogen, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio - ausgewählt sind, bedeuten.

2. Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1 , worin

R¹ und R² unabhängig voneinander gegebenenfalls Halogen-substituiertes d-Cs-Alkyl,

X einen zweibindigen Rest aus der Reihe C=Y und CH ,

R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder gegebenenfalls Halogen-substituiertes d-C₆- Alkyl,

Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A Phenyl, Pyridyl oder Pyrimidyl, die gegebenenfalls durch 1 bis 3

Reste aus der Reihe Halogen, d-C₆- Alkyl, d-C₆-Alkoxy, d-C₆- Alkylthio, Cι-C₆-Alkoxycarbonyl, Carbamoyl, Mono-Cι-C₆-alkyl- aminocarbonyl, Di-Cι-C₆-alkylaminocarbonyl, Cyano - im Falle der Substitution in o-Stellung aus der Reihe Halogen, C]-C₆-Alkyl, d-C₆- Alkoxy, Cι-C₆- Alkylthio - substituiert sind,

bedeuten.

3. Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1, worin

R¹ und R² unabhängig voneinander d-C₆- Alkyl oder Trifluormethyl,

X C=Y,

R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Cι-C₆-Alkyl, Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A ein- bis dreifach substituiertes Phenyl oder Pyridyl, deren Substituenten unabhängig voneinander aus der Reihe Alkyl, Halogen, CF₃ ausgewählt sind,

bedeuten.

4. Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1 , worin

R¹ und R² unabhängig voneinander Cι-C₆- Alkyl oder Trifluormethyl,

X C=Y,

R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C _\ -C₆- Alkyl,

Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A disubstituiertes Phenyl oder Pyridyl, deren Substituenten unabhängig voneinander aus der Reihe Alkyl, Halogen, CF₃ und Phenyl ausgewählt sind,

bedeuten.

5. Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1, worin

R¹ und R² unabhängig voneinander d-C₆- Alkyl oder Trifluormethyl,

X C=Y,

R > 3 . u„nd R unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl, Y ein Sauerstoffatom und

A 3-Methyl-4-fluor-phenyl oder 3-Chlor-4-fluor-phenyl bedeuten.

6. Verbindung, ausgewählt aus den Verbindungen der Beispiele 1, 2 und 4 bis 9.

7. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) nach Ansprüchen 1 bis 6, worin

R¹ bis R³ und A die in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebenen Bedeutungen besitzen,

X C=Y oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_nC(=Y)- ,

Y ein Sauerstoffatom und

n eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeuten,

durch Umsetzung von Säurechloriden der Formel

woπn

1 9

R und R die in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebenen Bedeutungen und

X und Y die obigen Bedeutungen besitzen, mit Aminen der Formel NHAR³,

worin A und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), worin

R¹ bis R³ und A die in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X C=Y und

Y ein Schwefelatom bedeuten,

durch Behandlung von Verbindungen der Formel (I), worin

R¹ bis R³ und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

X C=Y und

Y ein Sauerstoffatom bedeuten,

mit Lawessons Reagenz.

9. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), worin

R¹ bis R³ und A die in den Ansprüchen 1 und 2 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X für CH₂ steht, durch Reduktion von Verbindungen der Formel (I), worin

1 ^

R bis R und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

X C=Y und

Y ein Sauerstoffatom bedeuten.

10. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), worin

R¹ bis R⁴ und A die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X -N(R⁴)-C(=Y)- und

Y ein Sauerstoffatom bedeuten,

durch Umsetzung von Verbindungen der Formel

worin

R , 1 und , r R>2 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

mit Carbonylgruppendonatoren und Aminen der Formel NHAR ,

worin A und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

11. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), worin R¹ bis R⁴ und A die in den Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X -N(R⁴)-C(=Y)- und

Y ein Schwefelatom bedeuten,

durch Umsetzung von Verbindungen der Formel

woπn

R und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

mit Thiocarbonylgruppendonatoren und Aminen der Formel NHAR ,

wobei A und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

12. Kombinationen

A) mindestens eines Isoxazols,

B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Wirkstoffs und gegebenenfalls C) mindestens eines Immunmodulators.

13. Kombinationen nach Anspruch 12, deren Isoxazol A der Formel

entspricht, worin

X einen zweibindigen Rest aus der Reihe C=Y, -N(R⁴)-C(=Y)- , CH₂,

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl,

Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und

A Aryl oder Hetaryl, die gegebenenfalls durch 1 bis 3 Reste substituiert sind, die unabhängig voneinander aus der Reihe Halogen, Alkyl,

Alkoxy, Alkylthio, Alkoxycarbonyl, Aminocarbonylamino, Mono- und Dialkylamino, Cyano, Amino, Mono- und Dialkylaminocarbonyl ausgewählt sind,

bedeuten.

14. Kombinationen nach Ansprüchen 12 und 13, deren Komponente B mindestens ein Dihydropyrimidin der Formel

bzw. deren isomerer Form

und/oder deren Salze enthält,

woπn

R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Reste der Formeln

oder

bedeutet,

wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, Cι-C₆-Alkoxy, Cι-C₆- Alkoxycarbonyl und C_.-C_Ö- Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch -S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, -SO₂-CF₃ und -A-CH₂-Rⁿ substituiert sind,

wonn

R⁶ gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,

R bis R unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, Hydroxy, C]-C₆-Acyl oder Cι-C₆- Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, Cι-C₆- Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,

A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO₂ -,

R¹ ' Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, Cι-C₆- Alkyl und Cι-C₆- Alkoxy, substituiert ist,

bedeuten,

R² einen Rest der Formeln -XR¹² oder -NR¹³R¹⁴,

worin

X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,

R¹² Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C_.-C_ö-Alkoxycarbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C.-C₈-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(Cι-C₄-Alkyl)-, -S- oder -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,

worin

R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, d-C₆- Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,

R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

H₃CO

OCH, oder

Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes Cι-C₆- Alkylthio, Trifluormethyl oder Pyridyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoff- atomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, d-C₆-

Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, d- C₆- Alkylthio oder Cι-C₆- Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino, Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist, woπn

a Null oder 1 bedeutet,

R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl mit 6 bis

10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Cι-C₆- Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C₆- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy,

Carboxyl, Cj-Cό- Alkyl oder Cι-C₆- Alkoxy substituiert sind und/oder C_rC₆-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist,

oder

R und R gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,

oder

R ,3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl

oder

R und R gemeinsam einen Rest der Formel — C / R⁴ Wasserstoff, d-C₄-Alkyl, C₂-C₄-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Benzoyl oder C₂-C₆-Acyl, und

R⁵ Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3 -fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, Ci-C_ö-Alkoxy, d-C₆-Alkyl, d-C₆- Alkylthio, Carbalkoxy, C C₆- Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-Cι-C₆-alkylamino substituiert sein können,

bedeuten.

15. Kombinationen nach Anspruch 14, deren Komponente B mindestens eine Verbindung der Formeln

ihrer isomeren Formen und/oder ihrer Salze enthält.

16. Kombinationen nach Anspruch 14, deren Komponente B mindestens eine Verbindung der Formel

bzw. deren isomerer Form

und oder deren Salze enthält,

woπn

bedeutet,

wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, Cι-C₆-Alkoxy, d-C₆-Alkoxycarbonyl und -C_ö- Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, -SO₂-CF₃ und -A-CH₂-Rⁿ substituiert sind,

woπn

R gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,

R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, Hydroxy, d-C₆-Acyl oder C_.-C₆-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, d-C_ö- Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,

A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO₂- R¹¹ Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, d-C₆-Alkyl und d-C₆-Alkoxy, substituiert ist,

bedeuten,

R² einen Rest der Formeln -OR¹² oder -NR¹³R¹⁴,

worin

R¹² Wasserstoff, Cι-C₆- Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C.-C₈- Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-,

-N-(C]-C₄- Alkyl)-, -S- und -SO - enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,

woπn

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C₆- Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,

R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel H₃CO

OCH,

oder Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes C.-C₄- Alkylthio, Trifluormethyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge- sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, d-C₆-Alkoxy- carbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, Cι-C₆- Alkylthio oder d-C₆- Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die

Gruppe -(CO)_a-NR^I7R¹⁸ substituiert ist,

wonn

a Null oder 1 bedeutet,

17 1 R

R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis

10 Kohlenstoffatomen oder d-C₆- Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C₆-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, d-C₆- Alkyl oder d-C₆-Alkoxy substituiert sind und/oder d-C₆-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist,

oder

D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und R⁵ Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen

bedeuten.

17. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 16, deren Komponente B mindestens einen HB V-Polymerase-Inhibitor enthält.

18. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 16, deren Komponente B Lamivudin enthält.

19. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 16, deren Komponente B mindestens eine Verbindung der Formel

und/oder deren Salze enthält, worin

R und R unabhängig voneinander d-C - Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden, R -R unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, d-C₄- Alkyl, gegebenenfalls substituiertes d-C₄- Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,

R¹³ Wasserstoff, C C₄-Alkyl, C C₇-Acyl oder Aralkyl und

X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes d-C₄- Alkyl

bedeuten.

20. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 19, deren Komponente B (i) ein Di- hydropyrimidin und/oder (ii) einen HBV-Polymerase-Inhibitor enthält.

21. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 19, deren Komponente B mindestens eine Verbindungen der Formel

und/oder deren Salz(e) enthält, worin

R¹ und R² unabhängig voneinander Cι-C₄- Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden, R³-R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, d-C₄-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes d-C₄- Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,

R¹³ Wasserstoff, d-C₄-Alkyl, Cι-C₇-Acyl oder Aralkyl und

X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes Cι-C₄- Alkyl

bedeuten.

22. Kombinationen nach Anspruch 21 ,

worin

X Chlor, A 1 -Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten.

23. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 22, deren Immunmodulator C Interferone enthält.

24. Kombinationen von A) mindestens eines Isoxazols, B) (i) mindestens eines

Dihydropyrimidins, (ii) Lamivudin und gegebenenfalls C) mindestens ein Interferon.

25. Verfahren zur Herstellung der Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponenten A, B und gegebenenfalls C in geeigneter Weise kombiniert oder herrichtet.

26. Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 6 und Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 24 zur Bekämpfung von Erkrankungen.

27. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 6 oder mindestens eine Kombination nach Ansprüchen 12 bis 24 und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.

28. Verwendung von Verbindungen der Ansprüche 1 bis 6 oder von Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 24 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen.

29. Verwendung nach Anspruch 28 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis B .