SE464168B - Antiviral komposition bestaaende av en 3'-fluoro-2',3'-dideoxynukleosidfoerening och en 2',3'-dideoxynukleosidfoerening (exempelvis azt) - Google Patents

Description

464 168 2 Känd teknik I dag har endast ett läkemedel, AZT (US patentet nr 4,7 24,232), registrerats för användning mot AIDS. AZT fördröjer sjukdomens utveckling och orsakar en ökad överlevnad i patienter med AIDS och AIDS relaterade symptom. Biverkningarna är emellertid allvarliga och kräver ofta att behandlingen avbryts. Användning av AZTi asymptomatíska patienter undersöks och man hoppas att därigenom fördröja utvecklingen av HIV- infektionen till AIDS.

En annan substans som visar effekt mot HIV i cellkulturer är 3'- fluoro-Sïdeoxitymidin, FLT (WO 88/00050), som är en nära strukturell analog till AZT.

Verkningsmekanismen för AZT och FLT tycks vara en fosforylering med hjälp av cellulära enzym till 5'-trífosfat vilka fungerar som inhibitorer av HIV omvänt transkriptas.

Det finns ett klart behov av nya läkemedel mot HIV med mindre toxicitet än AZT och flera nya substanser utvärderas nu. Det har också visats att kombinationer av substanser med olika verkningsmekanismer i cellkultur kan ge synergistisk effekt mot HIV (Öberg, B. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 1257-266, 1988). Substanser som visat synergi mot HIV i cellkultur har varit de som verkat på olika sätt som AZT plus foscarnet och AZT plus interferon. Kombinationer av substanser med strukturella och troligen mekanistiska likheter med AZT som ddI, d4T och ddC har visat additiva effekter med AZT mot HIV i cellkulturer.

Beskrivning av uppfinningen Det har överraskande visat sig att en kombination av FLT och en annan inhíbitior av omvänt transkriptas visar synergistisk effekt mot HIV i cellkultur och också överraskande att substanserna FLT och AZT visar antagonistisk effekt med avseende på cellulär toxicitet.

En synergistisk antiviral effekt av FLT och AZT har också påvisats mot apimmunbristvirus (simian immunodeñciency virus, SIV) i apor och detta är den första observerade synergieffekten in vivo mot ett immunbrist- virus. Denna modell är mycket lik HIV-infektion i människa (Lundgren et al., inskickad för publicering till Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1989) och har en hög sannolikhet att förutsäga klinisk effekt.

Den stora likheten mellan omvänt transkriptas från HIV och andra retrovirus från människa och djur liksom likheten med hepatit B virus gör det troligt att kombinationer mellan FLT och andra liknande inhibitorer av 3 464 168 omvänt transkriptas också har synergistisk effekt mot infektioner orsakade av dessa virus.

Föreliggande uppfinning avser en terapeutisk komposition om- fattande en kombination av en 3'-fluoro-2',3'-dideoxinukleosid förening I med formeln.

HO F i vilken B är adenin, tymín, guanin, cytosin, inosin, uracil, 5-etyl- uracil, Zß-diaminopurin; och en 2',3'-dideoxinukleosid förening Il med formeln Dä HO II X Y i vilken X är N3 eller H eller tillsammans med X en extra kol-kol bindning, Y och Z oberoende av varandra är H, OH eller F, och B är adenin, tymin, guanin, cytosin, inosin, uracil, 5-etyluracil, 2,6-diaminopurin, i ett förhållande som ger en synergistisk antiviral effekt.

Förening I kan väljas från följande föreningar 3'-fluoro-2',3'-dideoxiadenosin 3'-fluoro-3'-deoxitymidin (FLT) 3'-fluoro-2',3'-dideoxiguanosin 3'-fluoro-2',3'-dideoxicytidin 3'-fluoro-2',3'-dideoxiinosin 464 168 3'-fluoro-2',3'-dideoxiuracil 3'-fluoro-2'ßïdideoxi-ö-etyluracil 3'-fluoro-2',3'-dideoxi-2,6-diaminopurin Dessa föreningar visar alla i någon utsträckning antíviral effekt.

En fóredragen förening ll som visar antiviral efïekt har formeln Ila HO B IIa xa Y i vilken Xa är H eller tillsammans med Y en extra kol-kol bindning och B, Y och Z är som definierats ovan.

Som exempel kan nämnas 2',3'-dídeoxiadenosin (ddA) 2',3'-dideoxitymidin (ddT) 2',3'-dideoxiguanosin (ddG) 2',3'-dideoxicytidin (ddC) ' 2',3'-dideoxíinosin (ddl) 2',3'-dide0Xi-2 ' , 3 ' -didehydrotymidjn (d4T) En annan fóredragen förening II är en förening med formeln lIb HO B Ilb Na i vilken Bb är tymin, uracil eller 5-etyluracil, d.v.s.

Sïazido-ßïdeoxítymidin (AZT) 3'-azido-3'-dideoxiuridin (AZU) 8'-azido-3ïdideoxi-ö-etyluridin (CS 85) 5 464 168 En föredragen komposition enligt denna uppfinning utgörs av en kombination av 3'-fluoro-3'-deoxitymidin (FLT) och 3'-azido-3'-deoxitymidin (AZT).

För att uppnå synergistisk effekt skall det molära förhållandet mellan förening I och förening 11 i allmänhet väljas mellan 50:1 och 1:50.

Iden föredragna kompositionen bestående av en kombination av FLT och AZT är området av FLT:AZT som ger en synergistisk effekt 10:1 till 1:20, med ett optimalt molförhållande av omkring 1:1 till 1:10.

I kliniskt bruk kommer normalt komposítionen i denna uppfinning att ges oralt, med injektion eller med infusion i form av ett farmaceutiskt preparat omfattande de aktiva beståndsdelarna i form av den ursprungliga föreningen eller möjligen i form av ett farmaceutiskt godtagbart salt därav, tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel bärare som kan vara fast, halvfast eller flytande eller en kapsel som kan intas oralt. De två föreningarna kan också användas utan bärarmaterial. Som exempel på farmaceutiska preparat kan nämnas tabletter, dragéer, kapslar, granulat, suspensioner, elixir, sirap, lösningar, etc. Vanligtvis kommer de aktiva beståndsdelarna att utgöra mellan 0,05 och 20 % för preparat avsedda för injektion och mellan 10 och 90 % för preparat avsedda för oral tillförsel.

Vid behandling av patienter som lider av retrovirus injektioner, speciellt HIV eller hepatit B infektioner, kommer kompositionen företrädes- vis att ges på något lämpligt sätt som oralt, parenteralt eller rektalt. Den parenterala administreríngen inkluderar subkutan, intramuskulär, intra- venös och sublingual tillförsel. Den topiska tillförseln inkluderar buckal och sublingual administrering. Den dosering vari de aktiva komponenterna administreras kan variera inom ett brett intervall och beror på olika faktorer som sjukdomens svårighetsgrad, patientens ålder, etc. samt kan behöva in- sättas individuellt. Ett möjligt intervall för mängden av substanser, eller fysiologiskt acceptabla salt av dessa, i kompositionen enligt uppfinningen som skall ges dagligen kan anges till från omkring 0,1 till omkring 100 mg/kg kroppsvikt av varje substans. En föredragen komposition är till exempel 0,1 - 1 mg FLT /kg-d i kombination med 1 - 10 mg AZT/kg-d. 464 168 Kort beskrivning av ritningen Figur 1 visar kombinationsindex för anti-HIV effekten i cellkulturer som behandlats med fixerade blandningar av AZT och FLT vid olika in- hibitionsgrader; Figur 2 visar kombinationsindex för inhibition av celltillväxt med fixerade blandningar av AZT och FLT vid olika inhibitionsgrader; och Figur 3 visar den synergistiska effekten av FLT och AZT på SIV- infektion i cynomolgus apor.

Experimentella försök Den synergistiska antivirala effekten liksom den cytotoxiska effekten av kombinationen enligt uppfinningen visas i följande försök.

Effekt av AZT, FLT och en kombination av AZT och FLT i cellkultur Material och Metoder Bestämning au HIV -inhibition H9 celler (en human CD4+ lymfoid cell linje) fick växa som suspension i RPMI-1640 medium med 10 % värme - inaktiverat fetalt kalvserum och antibiotika. HIV -1 erhölls från kultur supernatant-vätskan från persistent HIV-infekterade HQ-celler (HQ/HTLV-lll B) och fórvarades i 20 % fetalt kalvserum vid -70°C fram till användningen. Inhibitionseffekten av substanser på HIV-replikationen bestämdes på följande sätt. Oinfekterade H9 celleri 0,5 ml (2x105 celler/ml) såddes uti 24-brunnars mikroplattor (Costar, Cambridge, MA) tillsammans med 0,5 ml medium som innehöll olika koncentrationer av AZT och/eller FLT. Infekterade celler utan antivirala substanser odlades som kontroll. Omedelbart efter det att celler och läke- medel blandats tillsattes till varje brunn 1 ml HIV av två olika koncentra- tioner (som gav 50 - 60 % respektive 30 - 40 % infekterade celler efter 6 dagars odling), till en total volym av 2 ml. Kulturerna inkuberades vid 37 °C i 5 % C02 i luft under 6 dagar utan byte av medium. Efter inkubering mättes halten av HIV -antigen i cellerna genom immunfluorescens analys (IFA) och i supernatanterna genom en enzymkopplad immunosorbent assay (ELISA). 464 168 I mmunfluorescens (IF).

För IF tvättades celler från varje brunn noggrant, applicerades på 8 brunnars objektglas och fick lufttorka varpå de fixerades i kall (-20°C) metanol. Humant anti-HIV antiserum (innehållande IgG till alla viktiga HIV komponenter) tillsattes och inkuberades under 30 min i en fuktig kammare vid 37 °C. Objektglasen tvättadesi fosfatbuffrad salin (PBS; med Ca2 + och Mg2+) och en fluorescein-isotíocyanat (FITC)-märkt får anti- human IgG (alla reagens från SBL, Stockholm) tillsattes och inkuberades 30 min vid 37 °C. Efter tvättning och kontrastfärgning med Evan's blått, under- söktes objektglasen i fluorescensmikroskop och andelen immunfluorescens- positiva celler mättes. Den koncentration som inhiberade produktionen av virusantigen med 50 % (1050) beräknades.

ELISA För att mäta mängden HIV antigen i supernatanten från kulturerna användes en känslig Sandwich ELISA (som kunde detektera 20 pg p24 ml). 100 pl av seriespädningen av supernatanten från varje brunn inkuberades över natt vid rumstemperatur i 96-brunns mikroplattor (Nunc, Aarhus, Danmark) täckta med humant anti-I-IIV IgG. Efter tvättning tillsattes 100 pl av två pepparrotsperoxidas (HRPO) konjugerade mus monoklonala anti- kroppar (Mab) mot HIV p24 antigen och inkuberades 2 timmar vid 37°C.

Plattorna tvättades och 100 pl av substratet orto-fenylendiamin-dihydro- klorid (ODP, Dakopatts, Glostrup, Danmark) tillsattes. Efter 30 min in- kubation vid rumstemperatur stoppades reaktionen med 100 pl 2.5 M H2SO4.

Absorbansen vid 490 nm mättes i en Dynatech MR 600 (Arlington, VA). Alla tester ordes i duplikat. En HIV antigen standard inkluderades på varje platta i varje försök. Den koncentration som inhiberade produktionen av virusantigen med 50 % (IC5g) beräknades.

Cytotoxicítetsbestämning Oinfekterade CEM celler (en CD4+ human T cell linje) inkuberades i närvaro av olika koncentrationer av AZT eller FLT eller kombinationer av AZT/FLT. Efter tre dagars inkubering räknadesviabla celler i en volym- distríbutionsanalysator (VDA 140, Analysinstrument AB, Stockholm, Sverige). Resultaten jälnfördes med kontrollceller inkuberade utan antiviralt läkemedel. Den koncentration som krävdes fór att inhibera cellförökningen med 50 % (CIC50) beräknades med hjälp av dataprogram. 464 168 8 Databeräkníngar Alla resultat från cellkulturforsöken analyserades med ett data- program (utvecklat av Dr. Johan Harmenberg) fór Apple, Macintosh.

Programmet följer medianeffektprincipen som publicerats av Chou och Talalay, Adv. Enzy. Reg. 22:27-55, 1984. Programmet ger 50 % inhibitions- koncentrationer, IC50, CIC50 och kombinationsindex (C.I.). C.I. av 1 visar att två läkemedel uppvisar additiv effekt. C.I. < 1 visar synergi, och C.I. > 1 visar antagonism. Den påverkade fraktionen (Fa) definieras som den fraktion av infekterade celler (0-1) som inhiberats av läkemedlet. Ett Fa = 1 betyder 100 % inhibition och Fa = 0 betyder 0 % inhibition. Enligt medianeffekt- principen användes ett fixerat fórhållande mellan koncentrationerna av två läkemedel. Den antivirala eller cytotoxiska effekten av olika kombinationer vid samma fixerade förhållande analyserades sedan med dataprogrammet (Harmenberg, J., Åkesson-Johansson, A., Vrang, L. and Cox, S., Inhibition of human immunodeficiency-virus in vitro by combinations of 3'-azido-3'- deoxythymidine and 3'-fluoro-3'-deoxythymidine., Department of Virology, National Bacteriological Laboratory, S-105 21 Stockholm, Sweden).

Effekt av AZT, FLT och kombinationer av AZT och FLT mot HIV i H9-celler Effekten av antivirala läkemedel studerades med användning av anti-p24 ELISA i cellsupernatanter eller immunofluorescens på hela celler (IF) med användning av humant anti-HIV antiserum. FLT och AZT testades på cellkulturer vid koncentrationer från 0,000065 pM som ökades i två-steg till 0,256 pM. Det molära förhållandet mellan FLT och AZT valdes från IC50 i cellkulturforsök. Förhållandena 1:8 och 1:1 användes i kombinations- försöken. Metoderna har beskrivits av Koshida et al. Antimicrob. Agents and Chemother. 33:778-780, 1989.

Trots att de två metoderna mäter olika aspekter av HIV infektion blev resultaten lika. Enbart FLT visade i alla försök en minst tiofaldi gt högre antiviral effekt än enbart AZT. Resultaten visas i Tabell 1.

Kombinationsfórsöken visade alla antiviral synergi vilket också indikeras av C.I. i Figur 1. C.I. fór de två kombinationerna bestämda med immunfluorescens (IF) eller ELISA varierade från 0,34 till 0,67. De två metoderna (ELISA och F) att mäta antiviral effekt skilde sig inte påtagligt i detta avseende. Ett C.I. mindre än 1 indikerar synergistisk effekt. 464 168 Inhibitíon av celltillvåxt med FLT och AZT Celltillväxt undersöktes med hjälp av en cellräknare med volym- distributionsanalys. FLT visade mer än ett tiofaldigt lägre CIC50 Värde än AZT. Se Tabell 1.

Kombinationsindex för inhibition av celltillväxt av de två bland- ningarna av AZT och FLT, dvs 1:1 och 8:1, visade ett antagonistiskt samband som visas i Figur 2.

Tabell 1 Anti-HIV och cvtotoxisk effekt av AZT, FLT och kombinationer av AZT och FLT i cellkultur.

HIV-Inhibition Cytotoxicitet Terapeutiskt Index ICm, pM CICm ,pM CICw/ICW Substans ELISA IF ELISA IF AZT 0,038 0,057 88,5 2323 1549 FLT 0,003 0,002 5,70 1816 2863 AZT:FLT(1:1) 0,003 0,002 27,7 8666 14742 AZT:FLT (8:1) 0,007 0,007 63 .5 9625 9169 Resultaten visar en synergistisk effekt av FLT och AZT mot HIV replikation i cellkultur och även att kombinationen har en antagonistisk effekt på celltillväxt. Detta betyder att terapeutiskt index, dvs förhållandet mellan cellulär toxicitet och antíviral effekt, CIC50:IC50, för kombinationen är högre än för vardera komponenten.

Effekt av AZT, FLT och en kombination av AZT och FLT mot SlV i makaker Den allmänna utformningen av utvärderingen av kombinationer av FLT och AZT i apor infekterade med immunobristvirus från apa (SIVSMM) följde metoden som beskrvitis av Lundgren et al., loc.cit. 1989. Fyra apor användes i varje behandlingsgrupp och 4 apori kontrollgruppen. Behand- lingen startades 8 timmar före virusinokulering och gavs tre gånger dagligen som subkutana injektioner med doserna 3x0,250 mg/kg/dag av FLT, 3x2,5O mg/kg/dag av AZT och 3x(0,125 mg/kg/dag av FLT plus 1,25 mg/kg/dag av AZT). Substanserna gavs under 10 dagar och uppkomsten av SIV p24 antigen i apserum följdes under 40 dagar med en modifierad Abbott HIV p24 test.

Figur 3 visar effekterna av FLT, AZT och en kombination av FLT och AZT på en SIVSMM infektion i Macaca fascicularisis. Vid en dosnivå av 464 168 10 3x0,25 mg/kg av FLT och 3x2,5 mg/kg av AZT observerades samma for- dröjning i uppkomst av p24 antigen. När halva koncentratíonerna av FLT (3xO,l25 mg/kg) respektive AZT (3x1,25 mg/kg) användes i en kombinations- behandling observerades en synergistisk effekt på SIV replíkationen och en fördröjning í p24 antigen uppkomst i stället för den förväntade additiva effekten. _)

Claims (8)

464 168 11 Patentkrav

1. En terapeutisk komposition omfattande en kombination av 3'-fluoro- 2',3ïdideoxinukleosidforening I med formeln Ho B F i vilken B är adenin, tymin, guanin, cytosín, inosin, uracil, 5-ety1- uracil, Zß-diaminopurin; och en 2',3'-dideoxinukleosidfórening 11 med formeln HO II X Y i vilken X är N 3 eller H eller tillsammans med Y en ytterligare kol- kol-bindning, Y och Z oberoende av varandra är H, OH eller F och B är adenin, tymín, guanin, cytosín, inosin, uracil, 5-etyluracil, 2,6-diaminopurin, i ett förhållande som ger en synergistisk antíviral effekt.

2. En komposition enligt krav 1, vari det molära förhållandet mellan förening I och förening lI år i området 50:1 till 1:50. 464 168 12

3. En komposition enligt krav 1, vari föreningen I är 3'-fluoro-3'- deoxitymidin och föreningen lI är en förening med formeln ah HO B Ila Xa Y i vilken Xa är H eller tillsammans med Y en ytterligare kol-kol bindning och B, Y och Z är definierade som i krav 1.

4. En komposition enligt krav 1 eller 2, vari förening I är 3'-fluoro-3'- deoxitymidin och föreningen lI är en förening med formeln Ho O Bb IIb Na i vilken Bb är tymin, uracil eller 5-etyluracil.

5. En komposition enligt krav 1 eller 4, omfattande en kombination av ßïfluoro-ßïdeoxitymidin och 3'-azido-3'-deoxitymidin.

6. En komposition enligt krav 5, vari det molära förhållandet mellan 3'- fluoro-Sïdeoxityrnidin och 3'-azido-3'-deoxitymidin är 1021 till 1:20.

7. En komposition enligt något av kraven 1 - 6 för användning vid behandling eller profylax av infektioner orsakade av virus som använder omvänt transkriptas vid sin replikation. 464 168 13

8. En komposition enligt någon av kraven 1 - 6 fór användning vid behandling eller profylax av psoriasis, multipel skleros eller infektioner orsakade av HIV, HTLV-1, HTLV-Z eller hepatit B virus.