DE69232387T2

DE69232387T2 - Kristallinische Oxathiolanderivate

Info

Publication number: DE69232387T2
Application number: DE69232387T
Authority: DE
Inventors: Paul Evans; Tony Gordon Roberts
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1991-06-03
Filing date: 1992-06-02
Publication date: 2002-09-26
Anticipated expiration: 2012-06-03
Also published as: ZA924007B; AU1881092A; HK1009599A1; BG60914B1; NO301713B1; IL102073A; IS1867B; CA2311988C; MX9202619A; JP2851480B2; IE20020782A1; IL102073A0; EP1099700A1; US5905082A; NO922182D0; TW254939B; CZ261293A3; EP0517145B1; AP9200395A0; ATE212630T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleosid-Analoga und ihre Verwendung in der Medizin. Insbesondere betrifft die Erfindung 1,3-Oxathiolan-Nukleosid-Analoga, besondere physikalische Formen davon, pharmazeutische Formulierungen daraus und Ihre Verwendung in der Behandlung von Virusinfektionen.
Von der Verbindung der Formel (I):
die ebenfalls als BCH-189 oder NGPB-21 bekannt ist, wurde baschrieben, daß sie eine antivirale Aktivität insbesondere gegen die humanen Immundefizienz-Viren (HIVs), die Verursacher von AIDS, hat (5. Anti-Aids Konferenz, Montreal, Kanada, 5. bis 9. Juni 1989: Zusammenfassungen T. C. O. 1 und M. C. P. 63; EP-A-0382562). Die Verbindung der Formel (I) ist eine racemische Mischung der zwei Enantiomere der Formeln (I-1) und (I-2):
und wurde in Form ihres Racemats beschrieben und untersucht. Die einzige derzeit für die Behandlung von Zuständen, die durch HIV verursacht werden, zugelassene Verbindung ist 3'-Azido-3-desoxythymidin (AZT, Zidovudin, BW 509U). Jedoch besitzt diese Verbindung eine Neigung zu signifikanten Nebenwirkungen und kann daher entweder nicht eingesetzt werden oder muß, sobald sie eingesetzt wird, bei einer signifikanten Anzahl von Patienten wieder abgesetzt werden. Es besteht daher ein fortgesetzter Bedarf an der Bereitstellung von Verbindungen, die wirksam gegen HIV sind, aber mit einer einhergehenden deutlich besseren therapeutischen Breite.
Obwohl die Enantiomere der Verbindung der Formel (I) gleich wirksam gegen HIV sind, hat das (-)-Enantiomer eine beträchtlich geringere Zelltoxizität als das andere Enantiomer und ist daher die bevorzugte Verbindung als Antivirusmittel.
Das (-)-Enantiomer hat den chemischen Namen (-)-cis-4-Amino-1-(2- hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on. Es hat die absolute Stereochemie der Verbindung der Formel (I-1), die den Namen (2R,cis)-4- Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on hat. Die Verbindung ist ebenfalls als 3TC bekannt.
Bevorzugt wird 3TC im wesentlichen frei vom entsprechenden (+)-Enantiomer sein, d. h. nicht mehr als ca. 5% G/G des (+)-Enantiomers, bevorzugt nicht mehr als ca. 2%, insbesondere weniger als ca. 1% G/G liegt vor.
Die internationale Anmeldung PCT/GB91/00706, Veröffentlichungs-Nr. WO91/17159, beschreibt die Herstellung von 3TC, seine Antivirus-Aktivität und seine Verwendung in der Medizin. 3TC wird in WO91/17159 als gefriergetrocknetes Pulver beschrieben und hergestellt.
Wir haben jetzt gefunden, daß 3TC in kristalliner Form erhalten werden kann und eine Polymorphie aufweist.
Wenn es aus wäßriger Lösung kristallisiert wird, wird 3TC in Form von nadelförmigen Kristallen erhalten (nachfolgend Form I). In dieser Form sind die Kristalle wegen ihrer physikalischen Eigenschaften, z. B. schlechter Fließeigenschaften, nicht zur pharmazeutischen Formulierung zu fasten Arzneiformen bevorzugt. Wir haben weiterhin gefunden, daß 3TC unter bestimmten Bedingungen in Form von im wesentlichen bipyramidalen Kristallen erhalten werden kann (nachfolgend Form II). Der Kristall-Habitus der Form II besitzt verbesserte Fließeigenschaften und ist daher in der Herstellung von festen Arzneiformen bevorzugt. Zusätzlich sind Form I-Kristalle eine weniger stabile polymorphe Form, und bestimmte pharmazeutische Grundverfahren, wie Mahlen, können eine Konvertierung von Form I zu Form II verursachen, eine ungewünschte Eigenschaft zur Herstellung von festen Arzneiformen.
3TC in der Form bipyramidaler Kristalle hat einen Schmelzpunkt von mehr als ca. 170ºC, insbesondere 177 bis 178ºC, wenn rein. 3TC in Form von nadelförmigen Kristallen hat einen Schmelzpunkt von weniger als ca. 130ºC, insbesondere ca. 124 bis 127ºC in reiner Form.
3TC in Form II weist charakteristische Absorptionsbanden in seinem Infrarot-(IR)-Spektrum auf, die im IR-Spektrum der Form I fehlen. Insbesondere weist Form II starke Absorptionsbanden bei den Wellenzahlen von ~920 und ~850 auf. Außerdem fehlt eine charakteristische Bande der Form I bei einer Wellenzahl von 1110 im Spektrum der Form II.
Die Form II von 3TC zeigt weiterhin ein charakteristisches endothermes Ereignis mit einer Starttemperatur bei 177 bis 178ºC in seinem Differentialscanning-Kalorimetrie-(DSC)-Profil. Im Gegensatz zeigt Form I ein charakteristisches endothermes Ereignis in seinem DSC-Profil bei einer Starttemperatur bei 124 bis 127ºC.
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird 3TC in Form von bipyramidalen Kristallen bereitgestellt.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird 3TC in bipyramidaler kristalliner Form und mit einem Schmelzpunkt von mehr als 170ºC, insbesondere 177 bis 178ºC bereitgestellt. In einem alternativen Aspekt wird 3TC in bipyramidaler kristalliner Form und mit einem endothermen Ereignis mit einer Starttemperatur von 177 bis 178ºC in seinem DSC-Profil bereitgestellt.
In noch einer weiteren Alternative wird 3TC in bipyramidaler kristalliner Form und mit Absorptionsbanden bei Wellenzahlen von ca. 920 und ca. 850 in seinem Infrarot-Spektrum bereitgestellt. Insbesondere wird 3TC bereitgestellt, in dem zusätzlich zu Absorptionsbanden bei diesen Wellenzahlen eine Bande bei einer Wellenzahl von 1110 im wesentlichen fehlt.
3TC kann aus seinem Racemat durch Auftrennung durch jedes auf diesem Gebiet zur Auftrennung von Racematen in ihre Enantiomer-Bestandteile bekannte Verfahren erhalten werden. Insbesondere kann 3TC aus dem bekannten Racemat durch chirale HPLC, durch Enzym-vermittelten entioselektiven Katabolismus mit einem geeigneten Enzym, wie Cytidin-Desaminase, oder durch selektiven enzymatischen Abbau eines geeigneten Derivats unter Verwendung eines 5'-Nukleotids erhalten werden. Geeignete Verfahren zur Herstellung von 3TC werden in WO 91/17159 beschrieben.
3TC in Form von nadelförmigen Kristallen kann durch Kristallisation der Verbindung aus wäßriger Lösung oder durch azeotrope Destillation mit Propan-1-ol erhalten werden.
3TC in Form der bevorzugten bipyramidal geformten Kristalle kann durch Umkristallisation aus nicht-wäßrigen Medien erhalten werden, insbesondere aus einem niederen (C&sub2;&submin;&sub6;-)Alkohol, z. B. Ethanol, IMS ("industrial methylated spirit", Brennspiritus) oder Propan-1-ol. In einem bevorzugten Verfahren kann 3TC in bipyramidaler Form aus 3TC in Nadelform durch Altern des letzteren in Brennspiritus (IMS) oder Ethanol bei erhöhter Temperatur (z. B. 30 bis 70, insbesondere ca. 50ºC) für eine angemessene Zeit (z. B. 0,5 bis 3 h, insbesondere ca. 1 h oder mehr) erhalten werden.
Alternativ kann 3TC in bipyramidaler Form durch Erwärmen der Verbindung in Nadelform oberhalb ihres Schmelzpunktes von 124 bis 127, insbesondere auf über ca. 170ºC, z. B. auf über ca. 177 bis 178ºC, und Abkühlenlassen der Schmelze erhalten werden.
In einer weiteren Alternative kann 3TC in bipyramidaler Form durch Reiben oder Mahlen der Verbindung in Form von nadelförmigen Kristallen erhalten werden.
Bevorzugt ist 3TC in Form bipyramidal geformter Kristalle, die im wesentlichen frei von Nadelkristallen sind. Wenn diese Kristalle durch Umkristallisation oder Altern in flüssigen Medien erhalten werden, wird die Verbindung normalerweise völlig frei von nadelförmigen Kristallen erhalten werden.
3TC in kristalliner Form kann als Antivirusmittel wie in WO 91/17159 beschrieben verwendet werden, das hier durch Verweis eingeführt wird.
3TC in kristalliner Form kann als pharmazeutische Formulierung zur Verwendung als Antivirusmittel wie in WO 91/17159 beschrieben formuliert werden.
Fig. 1 zeigt 3TC in Form nadelförmiger Kristalle (Form I).
Fig. 2 zeigt 3TC in Form bipyramidal geformter Kristalle (Form II).
Fig. 3 ist ein Infrarot-Spektrum von Form I-Kristallen.
Fig. 4 ist ein Infrarot-Spektrum von Form II-Kristallen.
Fig. 5 ist ein DSC-Thermogramm von Form I-Kristallen.
Fig. 6 ist ein DSC-Thermogramm von Form II-Kristallen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, aber sollen nicht als Beschränkung dafür dienen. Alle Temperaturen sind in ºC.

Zwischenstufe 1

5-Methoxy-1,3-oxothiolan-2-methanol-benzoat

Eine Lösung aus Zinkchlorid (1,6 g) in heißem Methanol (15 ml) wurde zu einer gerührten Lösung aus Mercaptoacetaldehyd-dimethylacetal (34,2 g) und Benzoyloxyacetaldehyd (48,3 g) in Toluol (1300 ml) gegeben, das dann unter Stickstoff für 50 min zum Rückfluß erwärmt wurde. Die abgekühlte Mischung wurde aufkonzentriert, mit etwas Toluol verdünnt und dann durch Kieselgur filtriert. Die vereinigten Filtrate und das Toluol wurden mit wäßriger gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (2x) und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und dann zu einem Öl eingedampft, das einer Säulenchromatographie an Silica (2 kg, Merck 9385) unterworfen und mit Chloroform eluiert wurde, um das Titelprodukt als Öl (45,1 g) aus einer Mischung von Anomeren (ca. 1 : 1) zu erhalten;
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 3,1-3,3 (4H), 3,42 (6H), 4,4-4,6 (4H), 5,41 (1H), 5,46 (1H), 5,54 (1H), 5,63 (1H), 7,46 (4H), 7,58 (2H), 8,07 (4H);
γmax (CHBr&sub3;) 1717,6 cm&supmin;¹.

Zwischenstufe 2

(±)-cis-1-(2-Benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin- 2,4-dion

Eine Mischung aus feingemahlenem Uracil (9,62 g), Hexamethyldisilazan (50 ml) und Ammoniumsulfat (30 mg) wurde unter Stickstoff zum Rückfluß erwärmt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Diese wurde abgekühlt und dann zu einem farblosen Öl eingedampft, das unter einer Stickstoffatmosphäre in Acetonitril (100 ml) aufgelöst wurde. Die Lösung wurde zu einer gerührten, eisgekühlten Lösung aus 5-Methoxy-1,3-oxathiolan-2-methanolbenzoat (Zwischenstufe 1) (19,43 g) in Acetonitril (600 ml) gegeben, und Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (14,7 ml) wurde hinzugegeben. Das Eisbad wurde entfernt, und die Lösung wurde unter Stickstoff für 45 min zum Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen und Eindampfen wurde der Rückstand durch Säulenchromatographie über 1 kg Silicagel (Merck 9385) unter Elution mit Chloroform/Methanol 9 : 1 gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden abgekühlt und unter Erhalt eines rohen Rückstands eingedampft. Dieser wurde aus der minimalen Menge heißem Methanol (ca. 1200 ml) unter Erhalt der Titelverbindung (6,32 g) als weiße Kristalle kristallisiert.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 11,36 (1H, bs), 7,50-8,00 (6H, m), 6,20 (1H, t), 5,46 (2H, m), 4,62 (2H, m), 3,48 (1H, m), 3,25 (1H, m).

Zwischenstufe 3

(±)-(cis)-4-Amino-1-(2-benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on

Verfahren (a)

Eine Suspension aus Cytosin (20,705 g) und Ammoniumsulfat (wenige Milligramm) in Hexamethyldisilazan (110 ml) wurde für 2 1/2 h unter Stickstoff gerührt und zum Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, und der verbleibende Feststoff wurde in trockenem Acetonitril (350 ml) gelöst. Diese Lösung wurde unter Verwendung einer Technik mit flexiblen Nadeln in eine gerührte, eisgekühlte Lösung aus 5-Methoxy-1,3-oxathiolan-2-methanol-benzoat (Zwischenstufe I) (43,57 g) in Acetonitril (650 ml) unter Stickstoff überführt. Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (33 ml) wurde hinzugegeben, die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen (1 1/2 h) und dann über Nacht zum Rückfluß erwärmt. Die Rückstandsmischung wurde aufkonzentriert, mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonat-Lösung (500 ml) verdünnt und dann mit Ethylacetat (3 · 500 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (2 · 250 ml) und Kochsalzlösung (250 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und dann zu einem Schaum eingedampft, der einer Säulenchromatographie an Silica (600 g, Merck 7734) unterworfen und mit Ethylaceatat- Methanol-Mischungen unter Erhalt einer Mischung der Anomere (ca. 1 : 1, 31,59 g) eluiert wurde. Die Mischung wurde aus Wasser (45 ml) und Ethanol (9,0 ml) kristallisiert, wodurch ein Feststoff (10,23 g) erhalten wurde, der aus Ethanol (120 ml) und Wasser (30 ml) umkristallisiert wurde, wodurch das Titelprodukt als weißer Feststoff (9,26 g) erhalten wurde;
λmax (MeOH): 229,4 mm (E1% 610); 272,4 mm (E1% 293);
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 3,14 (1H), 3,50 (1H), 4,07 (2H), 5,52 (1H), 5,66 (1H), 6,28 (1H), 7,22 (2H), 7,56 (2H), 7,72 (2H), 8,10 (2H).

Verfahren (b)

Phosphoroxychlorid (7,0 ml) wurde zu einer gerührten, eisgekühlten Suspension aus 1,2,4-Triazol (11,65 g) in Acetonitril (120 ml) getropft, und dann wurde unter Halten der inneren Temperatur auf unter 15ºC Triethylamin (22,7 ml) hinzugetropft. Nach 10 min wurde eine Lösung aus (±)-cis-1-(2-Benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2,4-dion (Zwischenstufe 2) (6,27 g) in Acetonitril (330 ml) langsam hinzugegeben. Das Rühren wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt. Die Mischung wurde mittels eines Eisbades gekühlt, und Triethylamin (30 ml) wurde langsam hinzugegeben, gefolgt von Wasser (21 ml). Die resultierende Lösung wurde eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (400 ml) und Chloroform (3 · 200 ml) aufgetrennt. Die vereinigten Chloroform-Extrakte wurden getrocknet (Magnesiumsulfat), filtriert und unter Erhalt eines rohen Rückstandes (9,7 g) eingedampft. Der Rückstand wurde in 1,4-Dioxan (240 ml) gelöst, und konzentrierte wäßrige Ammoniak-Lösung (Dichte 0,880, 50 ml) wurde hinzugegeben. Nach 1 1/2 h wurde die Lösung eingedampft und der Rückstand in Methanol gelöst. Dies verursachte eine Ausfällung eines Feststoffs, der abfiltriert wurde. Die Mutterlaugen wurden durch Säulenchromatographie über Silicagel (Merck 9385, 600 g) gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalt der Titelverbindung als rehbrauner Feststoff (2,18 g) eingedampft, der mit dem durch Verfahren (a) erhaltenen identisch war.

Zwischenstufe 4

(±)-(cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on

Eine Suspension aus (cis)-4-Amino-1-(2-benzoyloxymethyl-1,3- oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on (Zwischenstufe 3) (8,19 g) und Amberlite IRA-400 (OH)-Harz (8,24 g) in Methanol (250 ml) wurde für 1 1/4 h gerührt und zum Rückfluß erwärmt. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und dann mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (80 ml) verrieben. Der resultierende weiße Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen, um das Titelprodukt (5,09 g) zu ergeben;
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (18), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

Zwischenstufe 5

(-)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on

(i) Drei 50 ml-Kolben mit Kulturlösung (Oxoid Ltd.) wurden mit jeweils einer Schleife voll Escherichia coli (ATCC 23848), abgeschabt von einer Agar-Kulturplatte, geimpft. Die Kolben wurden über Nacht bei 37ºC unter Schütteln mit 250 U/min inkubiert, und dann wurde jeder Kolben verwendet, um 41 CDD-Medium (Glutaminsäure 3 g/l; MgSO&sub4; 0,2 g/l; K&sub2;SO&sub4; 2,5 g/l; NaCl 2,3 g/l; Na&sub2;HPO&sub4;·2H&sub2;O 1,1 g/l; NaH&sub2;PO&sub4;·2H&sub2;O 0,6 g/l; Cytidin 1,2 g/l) in einem 7 l-Fermenter zu impfen. Die Kulturen wurden bei 750 U/min und 37ºC unter Belüftung mit 4 l/min fermentiert. Nach Wachstum für 24 h wurden die Zellen durch Zentrifugieren (5000 g, 30 min) unter Erhalt von 72 g Naßgewicht aufgefangen. Das Zellpellet wurde in 300 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung (4 · 45 s) aufgerissen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren (30 000 g, 30 min) entfernt, und das Protein im Überstand wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat auf 75% Sättigung ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren (30 000 g, 30 min) aufgefangen, und das Pellet wurde in 25 ml HEPES-Puffer (100 mM, pH 7,0), der Ammoniumsulfat enthielt (75% Sättigung), resuspendiert. Eine Enzym-Lösung wurde hergestellt durch Zentrifugieren bei 12 000 U/min für 30 min. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Tris-HCl-Puffer (pH 7,0; 100 mM) zum ursprünglichen Volumen aufgelöst.
(ii) Zwischenstufe 4 (115 mg) wurde in Wasser (100 ml) gelöst und gerührt. Die Enzym-Lösung (0,5 ml) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde durch kontinuierliche Zugabe von HCl (25 mM) auf einem konstanten pH gehalten. Die Umwandlung wurde durch chirale HPLC überwacht, die zeigte, daß das (+)-Enantiomer des Substrat bevorzugt desaminiert wurde. Nach 22 h war das (+)-Enantiomer des Substrats (RT 12,5 min) vollständig entfernt worden, und die Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt.
Die oben erzeugte Lösung wurde durch eine auf pH 11 voräquilibrierte Säule aus QAE Sephadex (A25; Pharmacia; 30 · 1,6 cm) eluiert. Die Säule wurde mit Wasser (200 ml) und dann mit HCl (0,1 M) gewaschen. Fraktionen (40 ml) wurden entnommen und durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die Fraktionen 5 bis 13, die das unumgesetzte (-)-Enantiomer des Substrats enthielten, wurden vereinigt und mit HCl auf pH 7,5 eingestellt. Fraktion 47, die das desaminierte Produkt enthielt, würde mit verdünntem NaOH auf pH 7,5 eingestellt. Analyse durch chirale HPLC zeigte, daß dieses Material eine Mischung war, die aus einem Enantiomer (RT 10,2 min) als Hauptkomponente mit dem anderen Enantiomer (RT 8,5 min) als Nebenkomponente (e.e. c. 90%) bestand.
(iii) Der obige Schritt (ii) wurde in einem größeren Maßstab wiederholt. Die Verbindung des Beispiels 1 (363 mg) in 250 ml Wasser wurde mit Enzym-Lösung (0,5 ml), hergestellt wie in Schritt (i), inkubiert. Weitere Teilmengen (0,5 ml) Enzym wurden nach 18 und 47 h hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 70 h gerührt und dann für weitere 64 h stehengelassen. Analyse durch chirale HPLC zeigte, daß das (+)-Enantiomer des Substrats vollständig desaminiert worden war, und die resultierende Lösung wurde mit NaOH auf pH 10,5 eingestellt.
Die obige Lösung wurde auf die gleiche QAE-Säule aufgetragen und wie in Schritt (i) eluiert. Die Fraktionen 2 bis 6, die eine Mischung aus dem verbleiben Substrat und dem desaminierten Produkt enthielten, wurden vereinigt. Die Fraktionen 7 bis 13, die das verbleibende Substrat ((-)-Enantiomer) enthielten, wurden vereinigt und auf pH 7,5 eingestellt. Die Fraktionen 25 bis 26, die das desaminierte Produkt enthielten, wurden vereinigt und neutralisiert.
Die obigen Fraktionen 2 bis 6 wurden durch die gleiche QAE-Säule erneut eluiert. Die Fraktionen 3 bis 11 aus dieser zweiten Säule enthielten unumgesetztes Substrat ((-)-Enantiomer). Die Fraktion 70 enthielt das desaminierte Produkt.
(iv) Die aufgetrennten Substratfraktionen aus den Schritten (ii) und (iii) wurden vereinigt und auf pH 7,5 eingestellt. Diese Lösung wurde durch eine Säule aus XAD-16 (40 · 2,4 cm), gepackt in Wasser, eluiert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit Aceton: Wasser (1 : 4 V/V) eluiert. Die das gewünschte (-)-Enantiomer enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Erhalt eines weißen Pulvers (190 mg) gefriergetrocknet.
Die oben verwendeten HPLC-Methoden waren wie folgt:

1. Analytische Umkehrphasen-HPLC

Säule: Capital Cartridge, Spherisorb ODS-2 (5 uM) 150 · 4,6 mm
Elutionsmittel: Ammoniumdihydrogenphosphat (50 mM) + 5% MeCN
Fluß: 1,5 ml/min
Detektion: UV, 270 nm
Retentionszeiten: BCH-189 5,5 min
: desaminiertes BCH-189 8,1 min

2. Analytische chirale HPLC

Säule: Cyclobond I Acetyl 250 · 4,6 mm
Elutionsmittel: 0,2% Triethylammoniumacetat (pH 7,2)
Fluß: 1,0 ml/min
Detektion: UV, 270 nm
Retentionszeiten: BCH-189 11,0 und 12,5 min
: desaminiertes BCH-189 8,5 und 10,2 min
(Die Biokonvertierung wurde durch Überwachung des Verlusts des Peaks bei 12,5 min verfolgt und Produkt bei 10,2 min akkumuliert.)

Beispiel 1 (Referenzbeispiel)

Eine Suspension der Zwischenstufe 5 (64,8 g) in Wasser (200 ml) wurde auf 45º unter Erhalt einer Lösung erwärmt. Die Lösung wurde auf 30º gekühlt.
Das Produkt kristallisierte als nicht-rührbare Masse. Diese wurde aufgebrochen und die Suspension bei ca. 10º für 1 h gerührt.
Das Produkt wurde durch Filtration isoliert und mit Ethanol (Brennspiritus; 2 · 30 ml) gewaschen und dann im Vakuum bei 45º 24 h getrocknet, um 3TC als Form I (feine Nadelkristalle) zu ergeben.
Die Verbindung hatte ein IR-Spektrum und DSC-Thermogramm identisch mit den Fig. 3 bzw. 5.

Beispiel 2

Eine Suspension der Verbindung des Beispiels 1 (10,0 g) in Brennspiritus (IMS; 200 ml; 20 Volumina) wurde unter Erhalt einer klaren Lösung zum Rückfluß erwärmt. Die Lösung wurde heiß filtriert, und das Filtrat wurde bei Atmosphärendruck destilliert, bis 100 ml (10 Volumina) der Lösung verblieben. Die Lösung wurde mit authentischem Material geimpft und von 80 auf 25º für 1 h abkühlen gelassen. Die Kristallisation begann bei 79º. Die Suspension wurde für 1 h bei 15º gerührt. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert und mit IMS (10 ml; 1 Volumen) isoliert. Trocknen im Vakuum bei 50º ergab die Titelverbindung als Aggregate von Bipyramiden (8,42 g), Smp. 179-181º. (-)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethal-1,3- oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on. Analyse
Die Verbindung hatte ein IR-Spektrum und DSC-Thermogramm identisch mit den Fig. 4 bzw. 6.

Beispiel 3

Eine Suspension des Produktes aus Beispiel 1 (20,0 g) in Brennspiritus (IMS; 100 ml, 5 Volumina) wurden langsam bei 50º für 1 h gerührt.
Eine kleine Probe (ca. 100 mg) wurde entfernt, im Vakuum bei 50º getrocknet und durch Mikroskopie und Differentialscanning-Kalorimetrie (DSC) untersucht.
Die Probe war 100% Form II (bipyramidaler Habitus).
Die Suspension wurde bei 50º für weitere 2 h gerührt und eine Probe entfernt. Mikroskopie zeigte keine Veränderung.
Die Suspension wurde bei 50º für 22 h gerührt, dann auf 20º gekühlt und für 1 h gerührt.
Die Suspension wurde filtriert, das Produkt mit IMS (20 ml; 1 Vol) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um als weißen kristallinen Feststoff (17,13 g) (-)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on zu ergeben, Smp. 180-181º. Analyse
Das Produkt hatte ein IR-Spektrum und DSC-Thermogramm identisch mit jenen der Fig. 4 bzw. 6.

Beispiel 4

Röntgen-Kristallographie-Daten für Form II

Kristalldaten:
C&sub8;H¹¹N&sub3;O&sub3;S, M = 229,26
Tetragonal, a = b = 8,749(3), c = 26,523(9) Å, V = 2030(2) Å³ (durch Anpassung nach dem Verfahren der kleinsten Fehlerquaclrate an Diffraktometerwinkel für 14 automatisch zentrierte Reflexe, 1 = 154184 Å).
Raumgruppe P4&sub3;2&sub1;2 (Nr. 96), z = 8, Dc = 1,50 g cm&supmin;³
F(000) = 960, m(Cu-Kα) = 27,5 cm&supmin;¹.
Abmessungen des Datenkristalls 0,48 · 0,32 · 0,30 mm.
Einzelne Kristalle der Form II (farblose Bipyramiden) wurden durch Röntgenbeugung untersucht. Insgesamt 1651 Reflexe wurden auf einem Siemens R³ m/V-Diffraktometer mit monochromatisierter Cu-Kα-Strahlung und unter Verwendung von 2 J/w-Abtastungen gemessen (3 < 2J < 115º). Die Struktur wurde durch Direktverfahren gelöst und die Nicht-Wasserstoffatome anisotrop verfeinert. Die an Kohlenstoff gebundenen Wasserstoffatome wurden idealisiert (C-H = 0,96 Å) und auf ihren Stamm-Kohlenstoffatomen aufsitzen gelassen. Drei H-Atome an -NH&sub2;- und -OH-Gruppen wurden aus einer Differenz- Fourier-Karte lokalisiert. Alle H-Atome wurden isotrop verfeinert. Die Verfeinerung lief zusammen unter Erhalt von R = 0,068, Rw = 0,069, w&supmin;¹ = [s²(F) + 0,005[F]²]. Die maximale verbleibende Elektronendichte betrug 0,45 eÅ&supmin;³. Die absolute Chiralität wurde unter Verwendung des Rogers-Eta- Test bestätigt [h = 0,99 (9)].

Beispiel 5

Pharmazeutische Formulierungen

(a) 100 mg-Tabletten

Bestandteile pro Tablette

3TC (Form II) 100,0 mg
Mikrokristalline Cellulose NF 189,5 mg
Natriumstärkeglycolat NF 9,0 mg
Magnesiumstearat NF 1,5 mg
Gesamtgewicht 300,0 mg
Das 3TC (Form II), mikrokristalline Cellulose und Natriumstärkeglycolat wurden gesiebt und in einem V-Mischer für ca. 15 min vermischt. Gesiebtes Magnesiumstearat wurde dann hinzugegeben und das Mischen für weitere 2 min fortgesetzt.
Die Mischung wurde in Standard-Tablettierausrüstung verpreßt und dann mit einer wäßrigen Suspension aus grauem Opadry umhüllt, um ästhetisch akzeptable Tabletten herzustellen.

(b) 300 mg-Tabletten

Bestandteile pro Tablette

3TC (Form II) 300,0 mg
Mikrokristalline Cellulose NF 279,0 mg
Natriumstärkeglycolat NF 18,0 mg
Magnesiumstearat NF 1,5 mg
Gesamtgewicht 600,0 mg
Die Tabletten wurden wie oben in (a) beschrieben hergestellt.

Claims

1. (-)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on in Form bipyramidaler Kristalle.

2. Kristalline Form gemäß Anspruch 1 mit einem SchmelzptLnkt von mehr als 170ºC.

3. Kristalline Form gemäß Anspruch 1 oder 2 mit einem Schmelzpunkt von 177 bis 178ºC.

4. Kristalline Form gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit Absorptionsbanden in ihrem Infrarot-Spektrum bei Wellenzahlen von 920 und 850.

5. Kristalline Form gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 ohne Absorptionsbande in ihrem Infrarot-Spektrum bei einer Wellenzahl von 1110.

6. Kristalline Form gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem endothermen Ereignis bei einer Starttemperatur bei 177 bis 178ºC in ihrem Differentialscanning-Kalorimetrie-Profil.

7. (-)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on in der wie in Fig. 2 gezeigten kristallinen Form.

8. (-)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)- pyrimidin-2-on in der kristallinen Form und mit einem Infrarot-Spektrum wie in Fig. 4 gezeigt.

9. Verfahren zur Herstellung von (-)-cis-4-Amino-1-(2- hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on in bipyramidaler kristalliner Form, welches die Umkristallisation aus einem nicht-wäßrigen Medium umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin das nicht-wäßrige Medium ein C&sub2;&submin;&sub6;-Alkohol ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, worin das nicht-wäßrige Medium ausgewählt wird aus Ethanol und Brennspiritus.

12. Verfahren zur Herstellung von (-)-cis-4-Amino-1-(2- hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on in Form bipyramidaler Kristalle, welches das Altern der Verbindung in Form nadelförmiger Kristalle in Ethanol oder Brennspiritus bei erhöhter Temperatur umfaßt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die nadelförmigen Kristalle durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die Kristallisation der Verbindung aus wäßriger Lösung umfaßt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die nadelförmigen Kristalle durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die azeotrope Destillation einer wäßrigen Lösung der Verbindung mit Propan-1-ol umfaßt.

15. Pharmazeutische Formulierung, umfassend (-)-cis-4-Amino-1-(2- hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on in bipyramidaler kristalliner Form und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür.

16. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 15 in einer zur oralen Verabreichung geeigneten Form.

17. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 15 oder 15 in Form einer Tablette oder Kapsel.