DE69217227T2

DE69217227T2 - Verwendung von dioxapyrrolomycin als antiparasitisches mittel und dafür verwendbare zusammensetzung

Info

Publication number: DE69217227T2
Application number: DE69217227T
Authority: DE
Inventors: George A. Richland Mi 49083 Conder; Ming-Shang T. Portage Mi 49002 Kuo; Vincent P. Kalamazoo Mi 49008 Marshall; Raymond J. Plainwell Mi 49080 Zielinski
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co; Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1991-08-01
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1997-06-05
Anticipated expiration: 2012-08-04
Also published as: ES2097921T3; NZ243766A; AU657357B2; DE69217227D1; GR3022727T3; ATE148342T1; DK0597004T3; ZA925696B; WO1993002676A1; AU2425392A; CA2112704A1; EP0597004A1; EP0597004B1; JPH06509579A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Abtötung und Bekämpfung von Würmern (Eingeweidewürmern) bei Tieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die allgemein als Helminthiasis bezeichneten Erkrankungen oder Gruppen von Erkrankungen beruhen auf einer Infektion des Tiers mit als Eingeweidewürmer bekannten parasitischen Würmern. Helminthiasis und Helminthose sind weitverbreitet und können bei Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen, Pferden, Geflügel und Menschen zu schwerwiegenden wirtschaftlichen und/oder Gesundheits-Problemen führen. Unter den Eingeweidewürmern verursachen die als Nematoden, Trematoden und Cestoden bekannten Gruppen von Würmern weitverbreitete und oftmals ernsthafte Infektionen bei den verschiedensten Tierarten einschließlich von Menschen. Die üblichsten Gattungen der die zuvor genannten Tiere infizierenden Nematoden, Trematoden und Cestoden sind Dictyocaulus, Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Strongybides, Trichuris, Fasciola, Dicrocoehum, Enterobius, Ascaris, Toxascaris, Toxocara, Ascaridia, Capillaria, Heterakis, Ancylostoma, Uncinaria, Onchocerca, Taenia, Moniezia, Dipylidium, Metastrongylus, Hyostrongylus und Strongylus. Einige dieser Gattungen attackieren primär den Darmtrakt, während andere sich im Magen, in der Lunge, in der Leber und im subkutanen Gewebe einnisten. Die Helminthiasis und Helminthose verursachenden parasitischen Infektionen führen zu Anamle, Unterernährung, Schwäche, Gewichtsverlust, schlechtem Gedeihen und einer massiven Schädigung der Wand des Magen-Darm-Trakts und können - wenn ihnen keine Beachtung geschenkt wird - zum Tod der befallenen Tiere führen.
Pyrrolomycine, einschließlich von Dioxapyrrolomycin, Pyrrolomycin C und Pyrrolomycin D, stellen bekannte Stoffwechselprodukte von Streptomyces sp. dar.
Über die Entdeckung von Dioxapyrrolomycin (Formel I) wurde erstmalig aus dem Lederle Labor von G.T. Carter und Mitarbeitern in "J. Antibio.", 40:233 (1987) berichtet. Es wurde ihm ohne jeglichen chemischen Namen die Bezeichnung LL-F42248alpha zugeordnet. Kurz danach wurde die Bezeichnung "Dioxapyrrolomycin" in einem Bericht des Institute of Microbial Chemistry von H. Nakamara und Mitarbeitern in "J. Antibio.", 40:899 (1987) benutzt.
Von Dioxapyrrolomycin wurde berichtet, daß es hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien bei einer gewissen Aktivität gegen Pilze aktiv ist. Die LD&sub5;&sub0; soll 13 mg/kg (peroral) und 125-250 mg/kg (intraperitoneal) bei Mäusen betragen (vgl. G.T. Carter und Mitarbeiter in "J. Antibio.", 40:233 (1987)). Über die insektizide Aktivität von Dioxapyrrolomycin wurde ebenfalls berichtet (ACS Meeting Abstracts 97, 98, 99 (Spring 1991)).
G.T. Carter und Mitarbeiter beschreiben in "J. Chem. Soc.", Chem. Commun., 1989, Seiten 1271-1273 die Biosynthese von Dioxapyrrolomycin.
N. Ezaki und Mitarbeiter, "J. Antibio.", 34:1363-1365 (1981); M. Kaneda und Mitarbeiter, "J. Antibio.", 34:1366-1368 (1981) und M. Koyama und Mitarbeiter, "J. Antibio.", 34:1569- 1576 (1981) beschreiben die Struktur und Synthese der Pyrrobmycine A und B.
M. Ishizuka, T. Sawa und T. Takeuchi beschreiben in "J. Antibio.", 37:1253-1256 (1984) die immunverstärkende Aktivität von Pyrrolomycin B.
K. Umezawa und Mitarbeiter berichten in "Biochem. and Biophysic. Research Communic.", 105:82-88 über eine Verstärkung der Hämolyse und eine zelluläre Arachidonsäurefreisetzung durch Pyrrolomycine, z.B. die Pyrrolomycine A, B, C und D.
N. Ezaki und Mitarbeiter beschreiben in "J. Antibio.", 36:1263-1267 (1983) die Pyrrolomycine C, D und E. M. Koyama und Mitarbeiter beschreiben in "J. Antibio.", 36:1483-1489 (1983), deren Strukturen.
Aus der US-PS 4 495 358 ist das durch Züchten einer Streptomyces sp. hergestellte antibiotisch wirksame Pyrrolomycm E bekannt. Es werden auch die Pyrrolomycine A, B, C und D hergestellt.
Derwent Abstract, Zugriffsnummer 83-755496 beschreibt das durch Züchten von Streptomyces sp. hergestellte Antibiotikum Pyrrolomycin F.
N. Ezaki und Mitarbeiter beschreiben in "J. Antibio.", 36:1431-1438 (1983) die Pyrrolomycine F1, F2a, F2b und F&sub3;. Hierbei handelt es sich um durch Zusatz von Bromids zum Fer mentationsmedium hergestellte Pyrrolomycinmetaboliten.
Die EP-A-0 080 051 beschreibt 1-Trijodalkyl-allyl-pyrrole und Analoge derselben mit einer Aktivität gegen Pilze und Mikroben, die sich besonders gut als antibakterielle Mittel eignen. Diese Verbindungen wurden als Ergebnis von Strukturmodi fikationen von Pyrrolomycin A hergestellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sorgt insbesondere für den Einsatz von Dioxapyrrolomycin zur Herstellung eines Medikaments zum Abtöten oder zur Verhinderung des Auftretens parasitischer Würmer bei diese Würmer beherbergenden oder für diese Würmer anfälligen Tieren.
Dioxapyrrolomycin ist gegen die folgenden parasitischen Würmer besonders wirksam: Dictyocaulus, Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Strongybides, Trichuris, Fasciola, Dicrocoelium, Enterobius, Ascaris, Toxascaris, Toxocara, Ascaridia, Capillaria, Heterakis, Ancylostoma, Uncinaria, Onchocerca, Taenia, Moniezia, Dipylidium, Metastrongylus, Hyostrongylus und Strongylus. Diese Würmer kommen oftmals bei Tieren, wie Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen, Pferden, Geflügel, und dem Menschen vor.
Dioxapyrrolomycin ist eine bekannte Verbindung und kann nach den von G.T. Carter und Mitarbeitern, "J. Antibio.", 40:233 (1987) und H. Nakamara und Mitarbeitern, "J. Antibio.", 40:899 (1987) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt jedoch eine Verbesserung im Herstellungsverfahren für Dioxapyrrolomycin.
Gemäß G.T. Carter und Mitarbeiter, "J. Antibio.", 40:233 (1987) bestand das bei der Tankfermentation verwendete Medium aus Melasse (20 g/l), Dextrin (10 g), Sojapepton (10 g), CaCO&sub3; (1 g). Der pH-Wert war mit KOH auf 7,2 eingestellt. Das erfin dungsgemäße Medium benutzt CBS-10, welches vorzugsweise Difcolösliche Stärke (20 g/l), Solulys (20 g), Rindfleischextrakt (4 g), NaCl (5 g) und eine zum Auffüllen auf 1 l ausreichende Menge Leitungswasser umfaßt. Sein pH-Wert ist mit KOH auf 7,2 eingestellt. Die genannten Bestandteile sind im Handel erhältlich. Bei den Mengen der Bestandteile handelt es sich um ungefähre Mengen. Sie können vom Fachmann in geeigneter Weise varuert werden. Anstelle von Solulys kann auch Maiseinweichflüssigkeit oder sprühgetrocknetes Schmaizwasser verwendet werden. Bei Verwendung dieses Mediums ließ sich die Ausbeute an Dioxapyrrolomycin mehr als verdoppeln. Durch die Verwendung dieses Mediums plus das handelsübliche Harz XAD-2 konnte nicht nur die Ausbeute an Dioxapyrrolomycin verdoppelt, sondern auch im Vergleich zu dem Medium allein eine doppelt so reine Verbindung erhalten werden. Es können auch andere derartige neutrale Harze verwendet werden, XAD-2 wird jedoch bevorzugt. Somit wurde bei der erfindungsgemäßen Herstellung von Dioxapyrrolomycin in erfolgreicher Weise vom Einsatz eines Neutralharzes (XAD-2) als Titerverstärker Gebrauch gemacht. Es hat sich gezeigt, daß bei Zusatz von 50 g/l XAD-2 bei Tankfer mentationen mehr als die doppelte Menge an extrahierbaren Rohfermentationsprodukten als bei alleiniger Durchführung der Literaturmaßnahmen erhalten wird. Diese erhöhte Produktausbeute erhöht auch die Menge an gewinnbarem Dioxapyrrolomycin, selbst wenn die Dioxapyrrolomycinproduktion relativ zu den sonstigen Fermentationsprodukten nicht erhöht ist.
Die zur Untersuchung dieser Verbindung benutzten biologischen Tests beinhalteten in vitro-Wirkungen auf den freilebenden Fadenwurm Caenorhabditis elegans, die Fähigkeit zur Beseitigung von Ziel-Fadenwürmern (Haemonchus contortus und Trichostrongylus colubriformis) aus experimentell infizierten mongolischen Wüstenmäusen sowie die Beseitigung von Haemonchus contortus aus monospezifisch infizierten Lämmern (vgl. die später folgende detaillierte Beschreibung).
Dioxapyrrolomycin ist bei dem C. elegans in-vitro-Test in einer Konzentration von 0,825 ppm wirksam. Die Tabelle I zeigt die mit Dioxapyrrolomycin gegen H. contortus und einen zweiten Ziel-Parasiten, nämlich T. colubriformis, bei dem mongolischen Wüstenmaus-Modell erhaltenen Ergebnisse. Dioxapyrrolomycin zeigte eine starke Aktivität 0 90,9%ige Beseitigung bei 0,33 mg/mongolische Wüstenmaus 8,25 mg/kg; 96,4%ige Beseitigung bei 0,037 mg/mongolische Wüstenmaus = 0,925 mg/kg) gegen diesen Parasiten. Es ist darauf hinzuweisen, daß es trotz fehlender starker Aktivität gegen T. colubriformis einen Aktivitätshinweis (41,5%ige Beseitigung bei 0,33 mg/mongolische Wüstenmaus = 8,25 mg/kg) von Dioxapyrrolomycin gegen diesen Parasiten gibt.
Die Tabelle II zeigt die für Dioxapyrrolomycin bei Scha fen gegen H. contortus (monospezifische Versuchsinfektionen) erhaltenen Ergebnisse. Dioxapyrrolomycin zeigte eine starke Aktivität (92,2%ige Beseitigung der Würmer bei 1,56 mg/kg).
Nachdem für Dioxapyrrolomycin eine starke Aktivität gegen H. contortus bei Schafen gezeigt wurde, wurde die betreffende Verbindung auf die Kreuzresistenz gegen die drei Hauptklassen von Breitbandanthelmintica (Ivermectin, Levamisol und Benzimidazole) unter Benutzung von mit resistenten Stämmen von H. contortus infizierten mongolischen Wüstenmäusen hin untersucht. Die in Tabelle III enthaltenen Daten zeigen, daß Dioxapyrrolomycin in gleicher Weise gegen die untersuchten resistenten und nicht-resistenten Stämme wirksam ist und folglich keine Kreuzresistenz gegen die Haupt-Breitbandanthelmintica besitzt. Dioxapyrrolomycin besitzt jedoch eine Kreuzresistenz gegen das zur Bekämpfung von H. contortus eingesetzte Schmalbandanthelminiticum dosantel. In vitro betrug die zur Beeinträchtigung eines dosantel-resistenten Stamms von H. contortus erforderliche Dioxapyrrolomycin-Dosis das etwa 17fache der für den anfälligen Stamm erforderlichen Dosis.
Zusammenfassend besitzt Dioxapyrrolomycin die Aktivität einer möglichen Einsetzbarkeit gegen den wichtigen Wiederkäuer-Parasiten H. contortus. Dioxapyrrolomycin scheint eine gewisse, wenn auch sehr schwache Aktivität gegen einen zweiten Wiederkäuer-Parasiten, nämlich T. colubriformis, aufzuweisen.
Es wurde für Dioxapyrrolomycin belegt, daß es keine Kreuzresistenz gegen die drei (3) Hauptklassen von Breitbandanthelmintica, jedoch eine Kreuzresistenz gegen das Schmalbandarzneimittel Closantel besitzt.
Folglich ist Dioxapyrrolomycin gegen Würmer, insbesondere parasitische Würmer von Warmblütern und vornehmlich parasitäre Eingeweidewürmer bei Schafartigen (Schafen) und Rinderartigen (Rindern) wirksam.
Dioxapyrrolomycin der Formel I kann als reine Verbindung oder als Mischung der reinen Verbindung eingesetzt werden. Aus praktischen Gründen wird die Verbindung jedoch vorzugsweise als Wurmmittel formuliert und als Einzel- oder Mehrfachdosis alleine oder in Kombination mit anderen Anthelmintica (beispielsweise Avermectine, Benzimidazole, Levamisol, Praziquantel u.dgl.) verabreicht. So knnen beispielsweise wäßrige oder ölige Suspensionen oral verabreicht oder die Verbindung zum Verfüttern zusammen mit einem festen Träger hergestellt werden. Weiterhin kann eine Ölsuspension durch Vermischen mit Wasser in eine wäßrige Emulsion überführt und die Emulsion dann intramuskulär, subkutan oder in die Bauchhöhle injiziert werden. Darüber hinaus kann Dioxapyrrolomycin (das im folgenden zuweilen als die "aktive Verbindung" bezeichnet wird) an das Tier in Form einer üblichen Aufgießrezeptur topisch verabreicht werden.
Die reine aktive Verbindung, Mischungen der aktiven Verbindung oder Kombinationen derselben mit einem festen Träger ktnnen im Tierfutter oder in Form von Tabletten, Pillen, als Boh, Oblaten, in pastöser Form und in sonstigen üblichen Dosiereinheitsformen sowie in Dosierformen zur verzögerten/gesteuerten Freigabe, welche die aktive Verbindung über mehrere Tage, Wochen oder Monate hinweg abgeben, verabreicht werden. Sämtliche dieser verschiedenen Formen der erfindungsgemäßen aktiven Verbindung können unter Verwendung physiologisch akzeptabler Träger und nach bekannten Rezepturen und Herstellungsmaßnahmen erhalten werden.
Bequem erhältliche und für physiologisch akzeptable Einheitsdosis-Rezepturen geeignete, repräsentative feste Träger sind Maisstärke, pulverisierte Lactose, pulverisierte Saccharose, Talkum, Stearinsäure, Magnesiumstearat, feinteiliger Bentonit u.dgl.. Die aktive Verbindung kann mit einem Träger in wechselnden Mengen, beispielsweise in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-% in Tierfutter bis etwa 90 - 95% oder mehr in einer Pille oder Kapsel, gemischt werden. In letzterer Form braucht man nicht mehr Träger zu verwenden, als zum Binden der Teilchen der aktiven Verbindung ausreicht.
Im allgemeinen kann die aktive Verbindung als stabiles Pulver oder Granulat zum Einmischen in eine (bestimmte) Fut termenge zum einmaligen Füttern oder in genug Futter für einen Tag formuliert werden, wobei man dann die (gewünschte) therapeutische Wirkung ohne Komplikation erreicht. Es sind (nur) das vorbereitete und gelagerte Futter oder die Futtervormischungen, die Sorgfalt erfordern. Eine empfohlene Praxis ist es, eine körnige Rezeptur zum Schutz und zur Konservierung der aktiven Verbindung zu überziehen. Ein vorbereitetes Schweinefutter mit etwa 0,02% der aktiven Verbindung sorgt für eine Dosis von etwa 10 mg/kg Körpergewicht für jedes 100 lb (schwere) Schwein in seiner täglichen Futterration.
Ein fester verdünnender Träger braucht keine homogene Einheit zu sein, Mischungen unterschiedlicher verdünnender Träger können jedoch geringe Anteile an Hilfsstoffen, wie Wasser, Alkohole, Proteinlösungen und Suspensionen, wie Magermilch, Speiseöle, Lösungen, beispielsweise Sirupe, und organische Hilfsstoffe, wie Propylenglykole, Sorbit, Glycerin, Diethylcarbonat u.dgl., enthalten.
Die festen Trägerrezepturen der aktiven Verbindung werden zweckmäßigerweise in Einheitsdosisform hergestellt, um eine Verabreichung an Tiere zu erleichtern. Folglich sind mehrere große Boli (eines Gewichts von etwa 2 g) mit bis zu etwa 4,1 g aktiver Verbindung als Einzeldosis für ein 900 lb schweres Pferd bei einer Dosiermenge von 10 mg/kg Körpergewicht erforderlich. In ähnlicher Weise wurde ein 60 lb schweres Lamm bei einer Dosiermenge von 10 mg/kg Körpergewicht eine Pille, Kapsei oder einen Bolus mit etwa 0,3 g aktivem Verbindung benötigen. Ein etwa 20 lb wiegender kleiner Hund wurde andererseits eine Gesamtdosis von etwa 90 mg bei einer Dosiermenge von 10 mg/kg Körpergewicht benötigen. Die festen Einheitsdosisformen lassen sich bequem in verschiedenen Größen und in verschiedenen Konzentrationen der aktiven Verbindung zubereiten, um die Behandlung an verschieden große, von Würmern befallene Tiere anzupassen.
Es können auch flüssige Zubereitungen verwendet werden. Beispiele für flüssige Zubereitungen sind wäßrige (einschließlich isotonische Kochsalz-)Suspensionen, Öllösungen und -suspensionen und Öl-in-Wasser-Emulsionen. Wäßrige Suspensionen erhält man durch Dispergieren der aktiven Verbindung in Wasser, vorzugsweise in Gegenwart eines geeigneten oberflächenaktiven Dispergiermittels, z.B. von kationischen, anionischen oder nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln. Geeignete Beispiele hierfür sind Polyoxyalkylenderivate von Fettalkoholen und von Sorbitanestern sowie Glycerin- und Sorbitanester von Fettsäuren. Es können verschiedene Dispergier- oder Suspendiermittel mitverwendet werden. Beispiele hierfür sind synthetischer und natürlicher Gummi, Tragant, Akaziengummi, Alginat, Dextran, Gelatine, Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Natriumpolyvinylpyrrolidon u.dgl.. Der Anteil der aktiven Verbindung an den erfindungsgemäßen wäßrigen Suspensionen kann von etwa 1% bis etwa 20% oder mehr reichen.
Öllösungen erhält man durch Vermischen der aktiven Verbindung mit einem Öl, beispielsweise einem Speiseöl, wie Baumwollsaatöl, Erdnußöl, Kokosnußöl, modifiziertem Sojabohnenöl und Sesamöl. Üblicherweise ist die Löslichkeit in Öl begrenzt. ölsuspensionen lassen sich durch Einmischen zusätzlicher feinteiliger aktiver Verbindung in das Öl zubereiten.
Öl-in-Wasser-Emulsionen erhält man durch Vermischen und Dispergieren einer Öllösung oder -suspension der aktiven Ver bindung mit (in) Wasser, vorzugsweise mit Unterstützung oberflächenaktiver Mittel und Dispergier- oder Suspendiermittel (vgl. oben).
Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Zubereitungen derart an Tiere verabreicht, daß man therapeutische oder pro phylaktische Spiegel der aktiven Verbindung erreicht. Derzeit ist es bekannt, daß Dosen von 1,56-12,5 mg Dioxapyrrolomycin pro kg Körpergewicht bei Schafen eine wirksame Bekämpfung von H. contortus ermöglichen. Wirksame therapeutische und prophylaktische Dosen dürften im Bereich von etwa 2 bis etwa mg/kg Körpergewicht liegen.
Bei sonstigen Tieren und für andere Arten parasitischer Würmer lassen sich endgültige Dosierungen (lediglich) vorschlagen. In Betracht gezogen werden Dosiermengen von etwa 1 mg bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht. Ein bevorzugt in Betracht gezogener Dosierbereich reicht von etwa 5 mg bis etwa mg/kg Körpergewicht. In dieser Hinsicht sei darauf hingewiesen, daß die Konzentration der aktiven Verbindung in der zur Verabreichung gewählten Rezeptur in vielen Situationen nicht ausschlaggebend ist. Man kann eine größere Menge der Zubereitung mit relativ niedriger Konzentration verabreichen und dieselbe therapeutische oder prophylaktische Dosierung erreichen wie mit einer relativ geringen Menge einer relativ stärker konzentrierten Zubereitung. Häufigere geringe Dosen liefern in gleicher Weise mit einer großen Dosis vergleichbare Ergebnisse. Man kann auch ein Depot-Dosiersystem (Zubereitung zur protrahierenden Abgabe) verabreichen, um über längere Zeit hinweg für therapeutische und/oder prophylaktische Dosismengen zu sorgen. Einheitsdosisformen gemäß der Erfindung können irgendeine Menge von weniger als 1 mg bis 50 g an aktiver Verbindung pro Einheit enthalten.
Obwohl Dioxapyrrolomycin hauptsächlich zur Behandlung und/oder Verhinderung eines Befalis mit parasitären Eingewei dewürmern bei Haustieren, wie Schafen, Rindern, Pferden, Hunden, Schweinen, Ziegen und Geflügel, eingesetzt wird, ist es auch bei der Behandlung von anderen Warmblütern einschließlich des Menschen wirksam. Seine optimale Menge im Hinblick auf optimale Ergebnisse hängt selbstverständlich von der zu behan delnden Tierart, der Behandlungsvorschrift und der Art und Schwere des Eingeweidewurmbefalls ab. Im allgemeinen erreicht man gute Ergebnisse bei oralem oder parenteralem Verabreichungsweg von Dioxapyrrolomycin in einer Menge von etwa 1 - 10 mg/kg Tierkörpergewicht (eine solche Dosis kann auf einmal, in protrahierender Weise oder in Teildosen über eine kurze Zeit hinweg, z.B. innerhalb von 1 - 4 Tagen, verabreicht werden). Die Verabreichungstechnik für diese Substanzen an Tiere sind dem Tierarzt und Arzt bekannt.
Vermutlich dürfte sich Dioxapyrrolomycin zur Behandlung der verschiedensten Eingeweidewurm-Erkrankungen beim Menschen, einschließlich solcher, die durch Ascaris, Enterobius, Ancylostoma, Trichuris, Strongybides, Fasciola, Taenia und/oder Onchocerca und sonstige Fadenwürmer hervorgerufen werden, in einer Dosis von 1 - 20 mg/kg Körpergewicht bei oraler und/oder parenteraler Verabreichung eignen.
Die folgenden detaillierten Beispiele/Maßnahmen beschreiben die biologischen Tests und die Herstellung von Dioxapyrrolomycin und dienen lediglich einer Veranschaulichung, ohne irgendwie beschränkend zu sein. Für den Fachmann dürften sich ohne weiteres geeignete Abweichungen von den Maßnahmen eröffnen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Beispiel 1

Caenorhabditis elegans-Test

Der mit dem freilebenden Fadenwurm C. elegans durchgeführte in vitro-Test wurde ausführlich in der Literatur, beispielsweise von K.G. Simpkin und G.C. Coles in "J. Chem. Tech. Biotechnol.", 31:66-69 (1981) beschrieben.
Dioxapyrrolomycin ist bei dem C. elegans-Test in einer Konzentration von 0,825 ppm aktiv.

Beispiel 2

Haemonchus contortus/Trichostrongylus colubriformis-Test bei der mongolischen Wüstenmaus

Bei diesem in vivo-Test werden mit zwei wichtigen Zielpa rasiten von Wiederkäuern, nämlich H. contortus und T. colubriformis (es können gegen Wurmmittel empfindliche oder resistente Würmer verwendet werden) infizierte mongolische Wüstenmäuse verwendet. Zunächst wird lediglich die Aktivität gegen H. contortus entsprechend den Angaben von G.A. Conder und Mitarbeitern in "J. Parasitol.", 76:168-170 (1990) bewertet. Nachfolgende Studien prüfen die Aktivität gegen beide Parasitenarten nach den von G.A. Conder und Mitarbeitern in "J. Parasitol.", 77:168-170 (1991) beschriebenen Techniken.
Tabelle I zeigt die mit Dioxapyrrolomycin bei dem mongolischen Wüstenmaus-Modell erhaltenen Ergebnisse.

Beispiel 3

Haemonchus contortus-Test beim Schaf

Es werden für Testzwecke gezüchtete, von Fadenwürmern freie Lämmer besorgt. Bei ihrer Ankunft werden die Lämmer mit Ivermectin (0,2 mg/kg, subkutan) behandelt, gegen wunde Lippen geimpft und in einen einzigen Gemeinschaftspferch verbracht. Drei Wochen später wird jedes Lamm mit Levamisolhydrochlond (8,0 mg/kg per os) behandelt. Zwei Wochen nach der Levamisol- Behandlung werden sämtliche Lämmer per os mit ungefähr 7 500 infektiösen Larven von H. contortus beimpft. Von jedem Lamm werden 1 bis 3 Tage vor der Infektion rektale Fäkalproben ge nommen und mit Hilfe der Doppelzentrifugentechnik untersucht, um sicherzustellen, daß die Tiere vor der Infektion von Trichostongylen frei sind. Am Tag 32-34 nach der Beimpfung (Pl) wird eine rektale Fäkalprobe von jedem Lamm unter Benutzung der Mcmaster-Zählkammer-Technik erneut untersucht, um eine Infektion zu verifizieren Diejenigen Tiere, die keine geeignete Infektion zeigen, werden aus der Studie herausgenommen. Die restlichen Lämmer werden am Tag 35 PI per os behandelt. 4 - 5 Tiere erhalten lediglich ein Vehikel. Vor der Verabreichung werden die Testmaterialien in einer für die untersuchte Sub stanz geeigneten Weise hergestellt. Sämtliche Lämmer werden nach der Behandlung auf toxische Anzeichen hin überwacht. 7 Tage nach der Behandlung (am Tag 42 PI) werden die Lämmer getötet. Nach dem Abbinden des Labmagens wird dieser aus jedem Tier entnommen. Jeder Labmagen wird in Längsrichtung eröffnet, worauf dessen Inhalt auf ein 80 mesh-Sieb gespült wird. Der Siebinhalt wird in einen geeigneten Behälter gesammelt und in Formol-Alkohol fixiert. Später wird jede Probe in einen 1000 ml fassenden geeichten Zylinder überführt und mit Leitungswasser auf ein Volumen von 400 - 1000 ml aufgefüllt. Danach wird die Gesamtzahl an Würmern in einem aliquoten Teil von 10% bestimmt. Wenn in dem 10%igen aliquoten Teil keine Würmer gefunden werden, wird die gesamte Probe untersucht. Für jede Behandlung werden die Gesamtwurmzahl pro Lamm und die prozentuale Beseitigung berechnet. Die prozentuale Beseitigung wird nach folgender Gleichung ermittelt: Prozentuale Beseitigung [(Mittlere Anzahl der aus den Vehikel-Kontrollämmern gesammelten Würmer - Anzahl der aus dem behandelten Lamm gesammelten Würmer)/mittlere Anzahl der aus den Vehikel-Kontrollämmern gesammelten Würmer] x 100. Einr Substanz wird dann als hochaktiv angesehen, wenn die Beseitigung ≥90% ist. Sie ist mäßig aktiv, wenn die Beseitigung ≥70, jedoch < 90% ist.
Tabelle II zeigt die mit Dioxapyrrolomycin bei Schafen gegen H. contortus (monospezifische Versuchsinfektionen) erreichten Ergebnisse.

Beispiel 4

Herstellung und Isolierung von Dioxapyrrolomycin

Bakterienkultur

Streptomyces sp. 90413 (Stammnummer der Upjohn Culture Collection, 90413, UC 11065, The Upjohn Co., Kalamazoo, MI) wird aus dem Boden in Michigan isoliert und als gefrorener Agarpfropfen vegetativen Wachstums in einer Flüssigstickstoffdampfphase aufbewahrt. Vermutlich stellen auch andere bekannte Dioxapyrrolomycin produzierende Steptomyces-Arten, z.B. die von G.T. Carter und Mitarbeitern in "J. Antibio.", 40:233 (1987) und H. Nakamara und Mitarbeitern in "J. Antiobio.", 40:899 (1987) identifizierten Arten, geeignete Substituenten für diese Art im Rahmen des Verfahrens des vorliegenden Beispiels dar.

Fermentierbedingungen

Anfangsfermentationen im Medium CBS 10 werden in 100 ml- Volumina in Schüttelflaschen durchgeführt. Die Schüttelflaschen-Fermentationen in 100 ml-Volumina in 500 ml fassenden Weithalskolben bei 28ºC (250 U/min, 1,5 Inch Rüttelbreite) dauern 72 h. Die Schüttelflaschen-Pools (2 und 3 1) werden aus 100 ml Saat-Schüttelflaschen-Kulturen (Medium GS-7: 25 g/l Cerelose, 25 g/l Pharmamedia, pH-Wert: 7,2 mit NH&sub4;OH, 30 min im Autoklaven behandelt) in einer Menge von 5% (v/v) beimpft.
Der Organismus wird in das Medium GS-7 geimpft. Die beimpften 100 ml-Volumina GS-7 werden - wie beschrieben - 72 h fermentiert. Die reifen Saatkulturen dienen als Impfquelle (Saatmenge von 5%) für das Fermentationsmedium (CBS 10 mit XAD-2). CBS-10 besteht aus löslicher Difco-Stärke (20 g), Solulys (20 g), Rinderextrakt (4 g), NaCl (5 g) und Leitungswasser in einer zum Auffüllen auf 1 l ausreichenden Menge. Vor der Autoklavenbehandlung wird dem CBS 10 in den Flaschen ein neutrales Harz (XAD-2) in einer Endkonzentration von 60 g/l einverleibt. Bei Tankfermentationen wird steriles XAD-2 2 bis 3 h nach dem Beimpfen in einer Endkonzentration von 50 g/l zugesetzt. Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird vor der Autoklavenbehandlung (30 min/Flasche, 90 min/Tank) mit KOH auf 7,2 eingestellt. Die beimpften Flaschenfermentationen werden in der oben für GS-7 beschriebenen Weise für eine 4-tägige Fermentation benutzt. Die beimpften 10 l-Tankfermentationen (Labraferm) werden bei 28ºC mit 250 U/min bei einer Luftstromgeschwindigkeit von 6 - 7 l/min während einer 4- bis 5-tägigen Fermentation gerührt.

Probenherstellung, Test und Ernten

Testproben aus den Schüttelflaschenfermentationen (1,5 ml) werden zentrifugiert, worauf die klaren Überstände in 1,2 ml fassende Mikroröhrchen überführt werden. Die Proben werden in der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Weise aufihre Aktivität hin getestet.

Extraktionsmaßnahmen

Die vollbierähnliche Probe wird beim Ernte-pH-Wert filtriert (gewünschtenfalls kann ein Celaton-FW-40-Filterhilfs-30 mittel mitverwendet werden). Das klare Filtrat kann verworfen werden. Der Mycelkuchen wird in der im folgenden beschriebenen Weise aufgearbeitet. Das XAD-2-Harz bleibt während der Filtration im Mycelkuchen zurück und sollte als Teil des Kuchens behandelt werden.

Reiben des Mycelkuchens mit Aceton

1. Dreimaliges Verrühren des Mycelkuchens mit jeweils 1/6 des ursprünglichen "Bier"-Volumens Aceton (ACETON-1, -2, -3).
Die Acetonextrakte 1, 2 und 3 werden vereinigt und in der im folgenden beschriebenen Weise behandelt.

Extraktion des Acetonpools

1. Dem Acetonpool wird 1/2 Poolvolumen Methylenchlorid zugesetzt. Danach wird die (untere) organische Phase von der (oberen) wäßrigen Acetonphase abgetrennt. Die wäßrige Phase kann verworfen werden. Die organische Phase aus MeCl&sub2;/Aceton wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum zu einem Öl eingeengt (Präparat A). Das Präparat A sollte danach in der imfolgenden beschriebenen Weise durch Silikagelsäulenchromatographie fraktioniert werden.

Silikagelsäulenchromatographie

1. Eine offene Silikagel (70 - 230 mesh)-Säule (25 g Silikagel pro Gramm rohes Präparat A) wird in 2 Bettvolumina n-Hexan gegossen und (darin) ins Gleichgewicht gesetzt. Danach wird das zuvor hergestellte Präparat A auf der zweifachen Gewichtsmenge Silikagel absorbiert und auf das obere Ende der Säule gegeben.
2. Die Silikagelsäule wird danach wie folgt eluiert: (Vorsicht: Beim Eingießen der Mischung 85 Hexan:15 EtOAc in die Säule erwärmt sich die Säule)
Beginn: 2 Bettvolumina n-Hexan
4 Bettvolumina 85 Hexan:15 EtOAc
Ende: 2 Bettvolumina EtOAc.
3. Die Silikagelpools werden - wie im folgenden beschrieben - als aliquote Bettvolumina gesammelt:
Pool A: Bettvolumina 1 und 2 (Verwerfen)
Pool B: Bettvolumen 3
Pool C: Bettvolumen 4
Pool D: Bettvolumen 5
Pool E: Bettvolumen 6
Pool F: Bettvolumina 7 und 8.
4. Anschließend werden die erhaltenen Silikasäulenpools B bis F im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Pool D enthält den Großteil des Dioxapyrrolomycins und wird als Präparat B bezeichnet. Die Pools C und E können geringe Mengen an Dioxapyrrolomycin enthalten. Eine Bestimmung der Silikapoolzusammensetzungen kann nach dem im folgenden beschriebenen analytischen HPLC-Verfahren erfolgen.

Analytische HPLC des Präparats B

1. Eine analytische HPLC zur Probenanalyse und Peak-Identifizierung wurde an einem Hewlett Packard (HP) 1090A-Gerät mit einem Diodenanordnungsdetektor (DAD) und einem HP-PC-Arbeitsplatz durchgeführt. Die Trennung erfolgte auf einer HP- 2,1 mm x 200 mm-ODS (Hypersil)-RP-(5 µm)-Säule, der eine HP- ODS-Schutzsäule vorgeschaltet war. Eluiert wurde mit isokratischem 65% ACN:35% NH&sub4;OAc (pH-Wert: 4,0) während 5,0 min und anschließend 20 min mittels eines linearen Gradienten auf 100% ACN. Die Säulentemperatur wurde bei 65ºC gehalten. Das Eluat aus der Säule wurde durch UV-Nachweis bei 240 nm überwacht. Die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase wurde während der gesamten Trennung bei 0,5 ml/min gehalten. Probeninjektionen von 1,0 - 25,0 ml erfolgten automatisch durch das HP-Gerät 1090A HPLC.
Die relative Retentionszeit von Dioxapyrrolomycin bei diesen analytischen HPLC-Parametern beträgt 1,4 min. Die Peak- Identifizierung wird durch das mit dem den DAD aufgezeichnete, für Dioxapyrrolomycin charakteristische UV-Spektrum verifiziert. Nachdemdiezusammensetzungdespräparatsbdurchdie analytische HPLC verifiziert worden war, erfolgte die endgültige Gewinnung von reinem Dioxapyrrolomycin aus dem Präparat B durch präparative HPLC wie folgt:

Präparative HPLC-Reinigung von Dioxapyrrolomycin aus dem Präparat B

Die präparative HPLC zur Reinigung von Dioxapyrrolomycin aus dem Präparat B erfolgte auf einem Waters prep LC 3000- Gerät mit einem variablen Wellenlängen-UV/VIS-Detektor und einem Waters 7458-Integrator. Die Trennung erfolgte auf drei mit einer Waters 25 x 10 mm Radial Pak C-18-Schutzsäule in Reihe geschalteten Waters Radial Pak C-18 (25 x 100 mm)- Säulen. Eluiert wurde mit isokratischem 60% ACN:40% NH&sub4;OAc (pH-Wert: 4,0) während 25 min. Die Säule wurde bei Raumtemperatur gehalten. Die Überwachung des Eluats aus der Säule erfolgt durch UV-Nachweis bei 254 nm. Während der gesamten Trennung wurde die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase bei 34,2 ml/min gehalten. Probeninjektionen wurden direkt auf den Säulenkopf gepumpt. Die maximalen Injektionsvolumina betrugen 50,0 ml.
Die Retentionszeit von Dioxapyrollomycin bei diesen präparativen HPLC-Parametern reicht je nach Probenaufgabe von 9,00 bis 12,00 min. Mit diesen Parametern ist eine Basislinienauflösung von Dioxapyrollomycin zwar erreichbar, die Reinheit der präparativen HPLC-Frakionen sollte jedoch vor dem Sammeln der präparativen Fraktionen durch analytische HPLC- Analyse überprüft werden. Überschüssiger NH&sub4;OAc-Puffer aus dem präparativen HPLC-Verfahren wurde aus der Probe durch Absor bieren des Dioxapyrollomycins auf HP-20-Harz und Auswaschen des Harzes mit Wasser entfernt. Danach wurde das Dioxapyrollomycin aus dem Harz durch Extrahieren mit MeOH gewonnen. Das erhaltene Produkt aus dieser Endreinigungsstufe ist kristallines Dioxapyrollomycin (Präparat C).
Die Verifizierung der Struktur des Präparats C erfolgte dann durch spektroskopische und analytische Analyse entsprehend den im folgenden beschriebenen Maßnahmen:

Identifizierung von Dioxapyrollomycin

Das Präparat C (1) wurde in Form feiner gelber Nadeln erhalten. Das UV-Spektrum von 1 läßt vermuten, daß 1 mit Pyrrolomycinen strukturverwandt ist. Eine Computer-Recherche des IR-Spektrums von 1 in der Spektrumbibliothek identifizierte Dioxapyrollomycin als die wahrscheinlichste Struktur. Ein Vergleich dieser Spektren mit dem veröffentlichten UV- und IR-Spektrum von Dioxapyrollomycin zeigte, daß sie praktisch zur Deckung gebracht werden können.
Die Elementaranalyse für 1 ergab 37,4% C, 1,5% H, 7,0% N und 36,5% Cl. Diese Ergebnisse stimmen mit der Molekülformel von Dioxapyrollomycin (C&sub1;&sub2;H&sub6;N&sub2;O&sub4;Cl&sub4;) überein. Aus letzterer ergibt sich für C 37,5%, für H 1,6%, für N 7,35% und für Cl 37,0%.
Das FAB-MS-Spektrum von 1 zeigte ein schwaches Ionenkluster (m/e = 382, 384, 386), wie es für die (M+H)&spplus;-Ionen von Dioxapyrollomycin zu erwarten ist. Die intensivsten Peaks bei 306, 308 und 310 entsprechen dem Verlust einer Nitrogruppe und eines Formaldehyds (M-NO&sub2;-CH&sub2;O) aus Molekülionen.
Das (in CDCl&sub3; erhaltene) HMR-Spektrum von 1 zeigte lediglich ein austauschbares Proton bei 9.14 ppm aufgrund des Pyrrolprotons. Die höhere Feldstellung dieses Protons im Vergleich zu dem ähnlich liegenden Proton in Pyrrolomycin C ist auf die Abwesenheit einer benachbarten Carbonylgruppe zurückzuführen. Im Bereich zwischen 5 und 8 ppm wurden insgesamt fünf nicht austauschbare Protonen nachgewiesen. Das AB-Quartett (5.58, 5.37 ppm, J = 6.2 Hz) stimmt mit der Anwesenheit einer Methylendioxygruppe überein. Das scharfe Singulett (6.85 ppm) stimmt mit der Anwesenheit eines zwischen zwei aromati schen Systemen befindlichen Carbinolprotons überein. Die beiden eine Long-Range-Kopplung aufweisenden Protonen bei 7.31 und 6.88 ppm (J 2.1 Hz) stimmen mit der Anwesenheit einer 1,2,3, 5-tetrasubstituierten Phenylgruppe überein. Wiederum ist der relative Abschirmungsverlust dieser beiden Protonen im Vergleich zu Pyrrolomycin C auf die Reduktion der Carbonylgruppe zu Methylenoxyfunktionalität zurückzuführen.
Die CMR-Signale von 1 (75 MHz, deuteriertes MeOH) sind folgende: δ 146.2(s), 131.5(s), 130.5(d), 130.4(s), 127.3(s), 126.1(d), 125.5(s), 124.0(s), 117.5(s), 106.0(s), 92.3(t) und 70.4(d). Obwohl sämtliche der genannten Signale (chemische Verschiebung und Multiplizitäten) gut mit der Struktur von Dioxapyrollomycin übereinstimmen, wurden geringe Unterschiede zwischen diesen und den veröffentlichten Werten (8) (in CDCl&sub3; erhalten) als Ergebnis von Lösungsmittelauswirkungen beobach tet.
Da die Struktur von Dioxapyrollomycin ein optisches Zentrum enthält, wurde zur Bestimmung der Chiralität von 1 die ORD von 1 erhalten (c = 2.23, MeOH). Das Ergebnis (-77º) stimmt recht gut mit dem veröffentlichten Wert (-88º) von Dioxapyrollomycin überein. Folglich besitzt 1 dieselben absoluten Konfigurationen wie Dioxapyrollomycin.

TABELLE I

Prozentuale Beseitigung von Haemonchus contortus und Trichostrongylus colubriformis aus von per os mit ungefähr 1000 enthäuteten infektiösen Larven eines jeden Parasiten beimpften mongolischen Wüstenmäusen, die am Tag 10 nach dem Beimpfen (PI) per os mit Dioxapyrollomycin behandelt und am Tag 13 nach dem Beimpfen einer Autopsie unterworfen wurden.

TABELLE II

Prozentuale Beseitigung von Haemonchus contortus aus monospezifisch per os mit ungefähr 7500 infektiösen Larven des Pa rasiten beimpften Lämmern, die am Tag 35 nach dem Beimpfen (PI) per os mit Dioxapyrollomycin behandelt und am Tag 42 PI einer Autopsie unterworfen wurden.

TABELLE III

Prozentuale Beseitigung von empfindlichem, Levamisol/Benzmidazol-resistentem oder Ivermectin-resistentem Haemonchus contortus aus per os mit ungefähr 1000 enthäuteten infektiösen Larven eines speziellen Stamms des Parasiten beimpften mongoischen Wüstenmäusen, die am Tag 10 nach dem Beimpfen (PI) per os mit Dioxapyrollomycin, Levamisolhydrochlond, Albendazol oder Ivermectin behandelt und am Tag 13 PI einer Autopsie unterworfen wurden.
*Pyrrolomycin C bildet den Großteil des Rests. N.D. = nicht erfolgt. Formelblatt

Claims

1. Verwendung von Dioxapyrrolomycin zur Herstellung eines Medikaments zur Abtötung oder Verhinderung des Vorkommens von parsitischen Würmern in einem diese Würmer beherbergenden oder für diese Würmer anfälligen Tier.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Dioxapyrrolomycin die Formel I aufweist:

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei den parasitischen Würmern um Dictyocaulus, Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Strongybides, Trichuris, Fasciola, Dicrocoelium, Enterobius, Ascaris, Toxascaris, Toxocara, Ascaridia, Capillaria, Heterakis, Ancylostoma, Uncinaria, Onchocera, Taenia, Moniezia, Dipylidium, Metastrongylus, Hyostrongylus und Strongylus handelt.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei den Tieren um Schafe, Schweine, Rinder, Ziegen, Hunde, Katzen, Pferde, Geflügel und Menschen handelt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Medikament eine therapeutische Dioxapyrrolomycindosis von etwa zwei (2) bis etwa zwanzig (20) mg/kg aufweist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Medikament eine prophylaktische Dioxapyrrolomycindosis von etwa zwei (2) bis etwa zwanzig (20) mg/kg aufweist.