DE69034054T2 - Neue Substanzen für die Krebstherapie - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft molekulare Chimären, infektiöse Virionen, Verfahren zu ihrer Konstruktion, sie enthaltende pharmazeutische Formulierungen, ihre Verwendung in der Therapie, insbesondere in der Virusspezifischen Enzym-Prodrug-Therapie, insbesondere in der Behandlung von Krebstypen, ganz besonders in der Behandlung von Leberzellkarzinom, und die Verwendung von Mitteln, die durch ein heterologes Enzym zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten katalysiert werden können, wie Purinarabinosiden und substituierten Pyrimidinen, in der Virus-spezifischen Enzym-Prodrug-Therapie.
  • Krebs aller Arten ist eine der Haupttodesursachen in der Welt. Forschung auf dem Gebiet der Krebschemotherapie hat eine Vielzahl von Antitumormitteln erzeugt, die unterschiedliche Wirksamkeitsgrade besitzen. Standardmäßig klinisch verwendete Mittel schließen Adriamycin, Actinomycin D, Methotrexat, 5-Fluorouracil, cis-Platin, Vincristin und Vinblastin ein. Jedoch sind diese derzeit verfügbaren Antitumormittel dafür bekannt, daß sie verschiedene Nachteile wie Toxizität gegenüber gesunden Zellen und Resistenz bestimmter Tumortypen aufweisen. Andere Therapieformen wie Chirurgie sind bekannt. Jedoch wird durch die Fachleute anerkannt, daß neue Ansätze und Möglichkeiten für Krebstherapien erforderlich sind.
  • Leberzellkarzinom ("hepatocellular carcinoma"; HCC) ist eine der hauptsächlichen bösartigen Erkrankungen in der Welt heutzutage, wobei das stärkste Auftreten in Japan, China, anderen Teilen von Asien und im Afrika der Subsahara ist. Kürzliche Hinweise lassen vermuten, daß das Auftreten von Leberzellkarzinom in Europa und Nordamerika zunimmt. Die Krankheit wird als verantwortlich für oder beteiligt an bis zu ca. 1 250 000 Toten im Jahr eingeschätzt und ist als solche zahlenmäßig eine der großen bösartigen Krankheiten der Welt.
  • Die HCC-Prognose ist immer schlecht, wobei die weltweite Häufigkeitsrate beinahe der Todesrate gleichkommt. Nach der Diagnose beträgt die mittlere Überlebensdauer weniger als 4 Monate. Langfristiges Überleben, definiert als ein Überleben von mehr als einem Jahr nach der Diagnose, wird gelegentlich beobachtet. Die meisten HCC-Patienten erliegen entweder den Komplikationen von Leberversagen mit oder ohne massive Blutung oder den allgemeinen Wirkungen einer hohen Tumorbelastung mit Kräfteverfall, Unterernährung, Infektion und Blutvergiftung. Obwohl entfernte Metastasen auftreten (bis zu 90% der Patienten weisen einen metastasierenden Tumor zum Todeszeitpunkt auf), beschränkt die örtlich begrenzte Erkrankung am häufigsten das Überleben. Entsprechend sind Therapien, die auf die Bekämpfung des Lebertumors gerichtet sind, angemessen, obwohl ersichtlich sein wird, daß die Behandlung der metastasierenden Erkrankung ebenfalls von großer Bedeutung ist (Kew M. C., Postgraduate Medical Journal 59 (Suppl.) 78–87 (1983) und Berk P. (Hrsg.) Seminars in Liver Disease 4, Nr. 2, Thieme-Stratton Inc. N.Y. N.Y (1984)).
  • Derzeit für den Krankenhausart verfügbare Therapien sind im ganzen unwirksam als Heilung für diese Krankheit (Nerenstone et al., Cancer Treatment Reviews 15, 1–31 (1988)). Bis heute ist die Operation weiterhin die einzige mögliche Heilung. Jedoch ist zum Zeitpunkt der Diagnose die überwiegende Mehrheit der Patienten nicht in der Lage, sich einer radikalen Operation zu unterziehen. In bestimmten Untersuchungen (Nerenstone et al. supra) wurde gefunden, daß weniger als 3% der Patienten als fähig für die Operation betrachtet wurden, und daß von dem geringen Prozentanteil, der infrage kam, ca. 50% der postoperativen Sterblichkeit erlag (Nerenstone et al. supra).
  • Systemische Einzel- und Kombinationschemotherapie und Bestrahlung sind relativ unwirksam, und dies betont die Notwendigkeit für neue Ansätze und Therapien für die Behandlung dieser Krankheit.
  • Die Gen-Therapie beinhaltet die stabile Integration neuer Gene in besondere Zielzellen und die Expression dieser Gene, sobald sie an der Stelle sind, um den Phänotyp der besonderen Zielzelle zu verändern (für eine Übersicht siehe Anderson, W. F. Science 226: 401–409, 1984; McCormick, D. Biotechnology 3: 690–693, 1985). Die Gen-Therapie kann vorteilhaft für die Behandlung einer genetischen Erkrankung sein, was den Austausch eines defekten oder fehlenden Enzyms beinhaltet, wie Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase bei der Lesch-Nyhan-Krankheit; Purinnukleosidphosphorylase bei schwerer Immunmangelerkrankung und Adenosindesaminase bei schwerer kombinierter Immunmangelerkrankung. Bis heute wurde die Gen-Therapie noch nicht in der Klinik verwendet, obwohl bei bestimmten Störungen bestimmte Typen der Gen-Therapie wahrscheinlich unmittelbar bevorstehen.
  • Es wurde durch die Autoren der vorliegenden Erfindung gefunden, daß es möglich ist, selektiv das Wachstum von Säugetier-Karzinomzellen mit chemischen Mitteln, die zur selektiven Umwandlung zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten fähig sind, anzuhalten oder sie abzutöten. Dies wird durch die Konstruktion einer molekularen Chimäre erreicht, die eine "Zielgewebe-spezifische" Transkriptionsregulationssequenz (TRS) umfaßt, die selektiv in krebsartigen Zellen aktiviert wird: dies steuert die Expression eines heterologen Enzyms. Diese molekulare Chimäre kann über geeignete Vektoren manipuliert und in ein infektiöses Virion eingeführt werden. Bei Verabreichung eines infektiösen Virions, das die molekulare Chimäre enthält, an einen Patienten, wird das Enzym selektiv in der Zielzelle exprimiert. Die Verabreichung von Verbindungen, die selektiv durch das Enzym zu Metaboliten metabolisiert werden, die entweder weiter zu cytotoxischen oder cytostatischen Mitteln metabolisiert werden oder tatsächlich solche sind, kann dann in situ erreicht werden.
  • Die Erfindung ist allgemein anwendbar und wird in bezug auf das Leberzellkarzinom dargestellt.
  • Wie oben erwähnt wurde, stirbt der überwiegende Prozentanteil der Patienten, die an Leberzellkarzinom leiden, am primären Tumor. Jedoch besitzen ca. 90% der HCC-Patienten eine offene metastasierende Erkrankung zum Todeszeitpunkt. Diese Metastasen weisen den typischen Phänotyp des primären Tumors auf, und als solche werden diese Metastasen ebenfalls selektiv das heterologe Enzym exprimieren und somit selektiv verabreichte Verbindungen, wie hier definiert, zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten aktivieren.
  • Eine Anzahl von Enzym-Prodrug-Kombinationen kann verwendet werden: die Bereitstellung des Enzyms kann selektiv die verabreichte Verbindung entweder direkt oder über eine Zwischenstufe zu einem cytostatischen oder cytotoxischen Metabolit aktivieren. Gleichsam wird die Wahl der Verbindung vom verwendeten Enzymsystem abhängen, aber muß selektiv durch das Enzym entweder direkt oder indirekt zu einem cytotoxischen oder cytostatischen Metabolit metabolisiert werden. Der Begriff heterologes Enzym wie hier verwendet bezeichnet ein Enzym, das die entsprechenden Eigenschaften der Selektivität aufzeigt.
  • Das Varicella-Zoster-Virus (VZV) codiert ein spezifisches Thymidinkinase-Protein. Das Gen wurde kloniert, sequenziert und charakterisiert (J. Gen. Virol. 67: 1759–1816 (1986)). Die VZV-Thymidinkinase wird im Gegensatz zum Säugetier-Enzym selektiv spezifische Purinarabinoside und substituierte Pyrimidin-Verbindungen monophosophorylieren. Außerdem haben die Autoren der vorliegenden Erfindung gefunden, daß bestimmte Purin- und Pyrimidin-Analoga, insbesondere jene der Formeln (I) und (II) wie nachfolgend definiert, zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten in spezifischen Säugetierzellen umgewandelt werden, die genetisch modifiziert sind, um selektiv VZV-Thymidinkinase zu exprimieren. Z. B. wird 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin zu 9-R-D-Arabinofuranosyladenintriphosphat [Ara-ATP] umgewandelt.
  • Andere Enzym-Prodrug-Kombinationen schließen das bakterielle (z. B. aus Pseudomonas) Enzym Carboxypeptidase G2 mit dem Prodrug para-N-Bis(2-chlorethyl)aminobenzoylglutaminsäure ein. Spaltung der Glutaminsäure-Einheit aus dieser Verbindung setzt ein toxisches Benzoesäuresenfgas frei: alkalische Phosphatase aus z. B. Kalbdarm wird inaktive phosphorylierte Verbindungen wie Etoposidphosphat, Doxorubicinphosphat, Mitomycinphosphat zu toxischen desphosphorylierten Metaboliten umwandeln. Penicillin-V-Amidase wird Phenoxyacetamid-Derivate von Doxorubicin und Melphalan zu toxischen Metaboliten umwandeln, und die Pilz-Cytsosindesaminase (z. B. aus Fusarium oxysporum) wird 5-Fluorocytosin zu toxischem 5-Fluorouracil umwandeln.
  • In Säugetierzellen werden bestimmten Gene allgegenwärtig exprimiert. Die meisten Gene werden jedoch in einer zeitlichen und/oder gewebespezifischen Weise exprimiert oder werden als Reaktion auf extrazelluläre Induktoren aktiviert, z. B. werden bestimmte Gene nur zu sehr präzisen Zeiten in der Ontogenese in spezifischen Zelltypen oder als Reaktion auf einen gewissen induzierenden Reiz aktiv transkribiert. Diese Regulation wird teilweise durch die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsregulationssequenzen (die z. B. Promotor- und Verstärkerregulations-DNA-Sequenzen sind) und sequenzspezifischen DNA-bindenden Transkriptions-Proteinfaktoren vermittelt.
  • Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß es möglich ist, bestimmte Säugetiergewebe, z. B. Lebergewebe oder transformiertes Lebergewebe, zu verändern, um selektiv ein heterologes Enzym wie hier zuvor definiert, z. B. VZV-Thymidinkinase, selektiv zu exprimieren. Dies wird durch die Konstruktion molekularer Chimären in einer Expressionskassette erreicht.
  • Expressionskassetten selbst sind auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohlbekannt. Eine solche Expressionskassette wird alle wesentlichen DNA-Sequenzen enthalten, die für die Expression des heterologen Enzyms in einer Säugetierzelle erforderlich sind. z. B. wird eine bevorzugte Expressionskassette eine molekulare Chimäre enthalten, die die codierende Sequenz für VN TK, ein geeignetes Polyadenylierungssignal für ein Säugetier-Gen (d. h. ein Polyadenylierungssignal, das in einer Säugetierzelle funktionieren wird), und geeignete Verstärker und Promotorsequenzen in der richtigen Orientierung enthalten.
  • In Säugetierzellen sind normalerweise zwei DNA-Sequenzen für die vollständige und effiziente Transkriptionsregulation von Genen erforderlich, die Boten-RNAs in Säugetierzellen codieren: Promotoren und Verstärker. Promotoren befinden sich direkt stromaufwärts (5') vom Transkriptionsstartort. Promotorsequenzen sind für einen genauen und effizienten Transkriptionsstart erforderlich. Unterschiedliche genspezifische Promotoren zeigen ein übliches Organisationsmuster. Ein typischer Promotor schließt eine AT-reiche Region, die als TATA-Box bezeichnet wird (die sich ca. 30 Basenpaare 5' zur Transkriptionsinitiationsstartstelle befindet), und ein oder mehrere stromaufwärts gelegene Promotorelemente ("upstream promotor element", UPE) ein. Die UPEs sind ein Hauptziel für die Wechselwirkung mit sequenzspezifischen Kern-Transkriptionsfaktoren. Die Aktivität von Promotorsequenzen wird durch andere, als Verstärker bezeichnete Sequenzen moduliert. Die Verstärkersequenz kann sich weit vom Promotor entfernt in einer Position entweder stromaufwärts (5') oder stromabwärts (3') befinden. Daher arbeiten Verstärker in einer orientierungs- und positionsunabhängigen Weise. Jedoch ist die absolute Unterscheidung zwischen Promotoren und Verstärkern aufgrund ähnlicher struktureller Organisation und Funktion, die wechseln kann, etwas willkürlich. Verstärker erhöhen die Transkriptionsgeschwindigkeit der Promotorsequenz. Es ist hauptsächlich die Wechselwirkung zwischen sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren mit dem UPE und Verstärkersequenzen, die es Säugetierzellen ermöglichen, gewebespezifische Gen-Expression zu erreichen. Die Gegenwart dieser Transkriptions-Proteinfaktoren (gewebespezifische, transaktivierende Faktoren), die an das UPE gebunden sind, und von Verstärkern (cis-agierende Regulationssequenzen), die es anderen Komponenten des Transkriptionsmechanismus, einschließlich RNA-Polymerase, ermöglichen, die Transkription mit gewebespezifischer Selektivität und Genauigkeit zu beginnen.
  • Die Selektion der Transkriptionsregulationssequenz, insbesondere der Promotor- und Verstärkersequenz, wird vom beabsichtigten Gewebe abhängen. Beispiele schließen die alpha-Fetoprotein-(AFP)-Transkriptionsregulationssequenz (z. B. den Promotor und Verstärker), die für transformierte Leberzellen spezifisch ist; und die Transkriptionsregulationssequenz für karzinoembryonisches Antigen (CEA) zur Verwendung in transformierten Zellen des Magen-Darm-Trakts, der Lunge, der Brust und anderer Gewebe ein. Zusätzlich können die Transkriptionsregulationssequenzen für bestimmte Onkogene verwendet werden, da diese hauptsächlich in bestimmtem Tumortypen exprimiert werden. Gute Beispiele dafür schließen die HER-2/neu-Onkogen-Regulationssequenz ein, die in Brusttumoren exprimiert wird.
  • Das ALB- und AFP-Gen weist eine umfassende Homologie bezüglich der Nukleinsäuresequenz, Genstruktur, Aminosäuresequenz und Protein-Sekundärfaltung auf (für eine Übersicht vgl. Ingram et al. PNAS 78 4694–4698 (1981)). Diese Gene werden unabhängig aber reziprok in der Ontogenese exprimiert. In der normalen Entwicklung wird die ALB-Transkription kurz vor der Geburt begonnen und setzt sich bis zum Erwachsenenstadium fort. Transkriptionsexpression von ALB im Erwachsenen ist auf die Leber beschränkt. AFP wird normalerweise in fötaler Leber, dem viszeralen Endoderm des Dottersacks und dem fötalem Magen-Darm-Trakt exprimiert, aber nimmt auf nicht nachweisbare Mengen kurz nach der Geburt ab und wird in der nichtpathogenen oder nicht-regenerierenden erwachsenen Leber oder in anderen normalen erwachsenen Geweben nicht signifikant exprimiert. Jedoch nimmt die AFP-Transkription in erwachsener Leber häufig dramatisch bei HCC zu. Zusätzlich kann die Transkription ebenfalls im nicht-seminomatösen und festen Karzinom der Hoden erhöht sein; in endodermalen Sinus-Tumoren, in bestimmten Teratokarzinomen und in bestimmten Magen-Darm-Tumoren. Leberspezifische Expression von AFP ist das Ergebnis von Wechselwirkungen der Regulationssequenzen ihrer Gene mit transaktivierenden Transkriptionsfaktoren, die in Kernextrakten aus der Leber gefunden werden. Die AFP-Transkriptionsregulationssequenz ist bevorzugt zur Erzeugung einer Hepatomspezifischen Expression von molekular kombinierten Genen, da das AFP-Gen auf dem Transkriptionsniveau reguliert wird und die mRNA unter den am häufigsten vorkommenden Polymerase II-Transkripten in der Leber ist.
  • Verschiedene Säugetier-AFP-Promotor- und -Verstärker-Sequenzen wurden identifiziert (für eine Übersicht vgl. Genes and Develop. 1: 268–276 (1987); Science 235: 53–58 (1987); The Journal of Biol. Chemistry 262: 4812–4818 (1987)). Diese Sequenzen ermöglichen die selektive und spezifische Expression von Genen in Hepatomen.
  • Die Regulationselemente der AFP-Gene fördern die gewebespezifische Expression von AFP bei bestimmten Leberpathologien wie HCC (Mol. Cel. Biol. 6: 477–487 (1986); Science 235; 53-58 (1987)). Die Regulationselemente eines Säugetier-AFP-Gens bestehen aus einer spezifischen 5'-Promotorproximalen Region (die sich bei einigen Säugetierarten zwischen 85 und 52 bp 5' zum Gen befindet). Diese Sequenz ist wesentlich für die Transkription in Hepatomen. Zusätzlich gibt es stromaufwärts gelegene (5') Regulationselemente, die für das AFP-Gen der Maus gut definiert sind, die sich als klassische Verstärker verhalten (Mol. Cel. Biol. 6: 477-487 (1986); Science 235: 53–58 (1987)). Diese Upstream-Regulationselemente werden als Elemente I, II und III bezeichnet und befinden sich zwischen 1 000 und 7 600 bp 5' zum Transkriptionsstartort für das AFP-Gen der Maus. Diese drei Verstärkerdomänen sind nicht funktionell äquivalent in der Erzeugung einer gewebespezifischen Expression von AFP. Elemente I und II haben die höchste Fähigkeit zur Ausrichtung der leberspezifischen Expression von AFP. Es ist wichtig festzustellen, daß die Regulationssequenzen des alpha-Fetoprotein-Gens vorteilhaft die Sequenzen nicht nur für die gewebespezifische Transkriptionsaktivierung, sondern ebenfalls zur Unterdrückung der Expression in Geweben enthalten, die nicht AFP exprimieren sollten. In einer ähnlichen Weise wurden die Regulationsregionen des menschlichen alpha-Fetoprotein-Gens charakterisiert (J. B. C. 262 4812 (1987)). Ein in der richtigen Orientierung 3' zu den AFP-Regulationssequenzen angeordnetes Strukturgen wird die selektive Expression dieses Strukturgens in fötaler Leber, Hepatomen, nicht-seminomatösen Karzinomen der Hoden, bestimmten Teratokarzinomen, bestimmten Magen-Darm-Tumoren und anderen normalen und pathologischen Geweben, die spezifisch AFP exprimieren, ermöglichen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine molekulare Chimäre bereit, die eine DNA-Sequenz umfaßt, die die codierende Sequenz des Gens enthält, das für ein heterologes Enzym unter der Kontrolle einer Transkriptionsregulationssequenz in einer Expressionskassette codiert; wobei der Promotor fähig zu selektiven Funktion in einer Ziel-Krebszelle ist; z. B. einer, der eine Krebszelle zur selektiven Expression von Thymidinkinase transformieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner in einer bevorzugten Ausführungsform eine molekulare Chimäre bereit, die eine Transkriptionsregulationssequenz umfaßt, insbesondere einen Promotor, der selektiv in Säugetier-Zielgeweben aktiviert wird und funktionsfähig mit der codierenden Sequenz für das Gen verbunden ist, das Varicella zoster-Virus-Thymidinkinase (VZV TK) codiert.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine molekulare Chimäre bereit, die eine DNA-Sequenz der codierenden Sequenz des Gens umfaßt, das für das Enzym codiert, das bevorzugt VZV TK ist, einschließlich einer geeigneten Polyandenylierungssequenz, verbunden in einer 3'-Position und in der richtigen Orientierung mit einer Säugetier-zielgewebespezifischen Transkriptionsregulationssequenz. Am meisten bevorzugt enthält die Expressionskassette ebenfalls eine Verstärkersequenz.
  • Die Promotor- und Verstärkersequenzen werden bevorzugt aus der Transkriptionsregulationssequenz für eines aus alfa-Fetoprotein (AFP), karzinoembryonischem Antigen (CEA) oder HERZ/neu oder anderen geeigneten Genen ausgewählt. Am meisten bevorzugt wird die Regulationssequenz für AFP zur Ausrichtung einer hepatomspezifischen Expression verwendet.
  • Die molekulare Chimäre der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung standardmäßiger rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. So wird die codierende Sequenz und das Polyadenylierungssignal von z. B. dem VZV-Thymidinkinase-(TK)-Gen (siehe 1A und 1B) in die passende 3'-Orientierung zu den wesentlichen AFP-Transkriptionsregulationselementen gesetzt. Diese molekularen Chimären ermöglichen die selektive Expression von VZV TK in Zellen, die normalerweise AFP exprimieren (2A). Die Expression des VZV TK-Gens in Hepatomen, bestimmten Tumoren des Magen-Darm-Traktes, nicht-seminomatösen Karzinomen der Hoden, bestimmten Teratokarzinomen und andere Tumoren wird es relativ nicht-toxischen Arabinosiden und Pyrimidinen wie hier definiert ermöglichen, selektiv zu cytotoxischen und/oder cytostatischen Metaboliten metabolisiert zu werden.
  • Entsprechend wird in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Konstruktion einer molekularen Chimäre bereitgestellt, welches das Binden einer DNA-Sequenz, die ein heterologes Enzym-Gen codiert, z. B. VZV TK, an einen gewebespezifischen Promotor umfaßt.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Konstruktion einer molekularen Chimäre wie hier definiert bereit, wobei das Verfahren das Ligieren einer DNA-Sequenz, die die codierende Sequenz und das Polyadenylierungssignal für das Gen für ein heterologes Enzym codiert, z. B. VZV-Thymidinkinase, an eine Säugetier-gewebespezifische Transkriptionsregulationssequenz (z. B. Promotorsequenz und Verstärkersequenz) umfaßt.
  • Die VZV-Thymidinkinase-codierende Sequenz und das 3'-Polyadenylierungssignal befinden sich in einem AccI/Nde I-Restriktionsendonuklease-Fragment mit ca. 1 381 bp (siehe 1).
  • Bevorzugt ist es das 1381 bp AccI/Nde I-Fragment, das die VZV TKcodierende Sequenz und das Polyadenylierungssignal enthält, das an die Säugetier-gewebespezifischen Promotor- und Verstärkersequenzen ligiert wird, obwohl es ersichtlich sein wird, daß andere DNA-Fragmente, die das VZV TK-Gen enthalten, verwendet werden könnten. Außerdem könnte das VZV TK-Polyadenylierungssignal gegen ein anderes geeignetes Polyadenylierungssignal, wie aus dem SV40-Virus oder anderen Säugetier-Genen, ausgetauscht werden.
  • Bevorzugt werden die Promotor- und Verstärkersequenzen aus den Transkriptionsregulationssequenzen für eines aus alpha-Fetoprotein (AFP), karzinoembryonischem Antigen (CEA) oder HER2/neu-Onkogen oder anderen geeigneten Genen ausgewählt.
  • Diese molekularen Chimären können in die Zielzelle durch ein Übertragungssystem übertragen werden. Zur Verabreichung an einen Patienten ist es notwendig, ein wirksames in vivo-Übertragungssystem bereitzustellen, das die molekulare Chimäre stabil in die Zellen integriert. Bekannte Verfahren verwenden Techniken der Calciumphosphat-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, des liposomalen Transfers, der ballistischen Bombardierung oder der Retrovirusinfektion. Für eine Übersicht zu diesem Gegenstand vergleiche Biotechnique Bd. 6, Nr. 7, 1988.
  • Die Technik der Retrovirusinfektion von Zellen zur Integration künstlicher Gene setzt retrovirale Shuttle-Vektoren ein, die auf diesem Gebiet bekannt sind (siehe z. B. Mol. and Cell Biol. Aug. 86, S. 2895). Im wesentlichen werden retrovirale Shuttle-Vektoren unter Verwendung der DNA-Form des in einem Plasmid enthaltenen Retrovirus erzeugt. Diese Plasmide enthalten ebenfalls Sequenzen, die zur Selektion und zum Wachstum in Bakterien erforderlich sind. Retrovirale Shuttle-Vektoren werden unter Verwendung standardmäßiger Techniken der Molekularbiologie, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, konstruiert. In retroviralen Shuttle-Vektoren sind die parentalen endogenen Retrovirus-Gene (z. B. gag, pol und env) entfernt, und die interessierende DNA-Sequenz ist insegtiert, wie die molekularen Chimären, die beschrieben wurden. Sie enthalten jedoch entsprechende retrovirale Regulationssequenzen zur viralen Enkapsidierung, proviralen Insertion in das Zielgenom, Botschaft-Splicing, Termination und Polyadenylierung. Retrovirale Shuttle-Vektoren wurden aus dem Moloney-Mäuseleukämie-Virus (Mo-MLV) abgeleitet, aber es wird ersichtlich sein, daß andere Retroviren verwendet werden können, wie jene, die eng mit dem Moloney-Mäusesarkom-Virus verwandt sind. Bestimmte DNA-Viren können sich ebenfalls als nützlich als Übertragungssystem erweisen. Das Rinder-Papillom-Virus [BPV] vermehrt sich extrachromosomal, so daß ein Übertragungssystem auf der Basis von BPV den Vorteil hat,. daß das übertragene Gen in einer nicht-integrierten Weise beibehalten wird.
  • Somit wird gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein retroviraler Shuttle-Vektor bereitgestellt, der die molekularen Chimären wie zuvor definiert enthält.
  • Die Vorteile eines retroviral-vermittelten Gen-Übertragungssystems sind die hohe Effizienz der Gen-Übertragung auf das Zielgewebe, eine sequenzspezifische Integration bezüglich des viralen Genoms (an den 5' und 3' langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR)) und geringe Umlagerungen der übertragenen DNA im Vergleich zu anderen DNA-Übertragungssystemen.
  • Entsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein retroviraler Shuttle-Vektor bereitgestellt, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die eine virale 5'-LTR-Sequenz, eine cis-agierende psi-Enkapsidierungssequenz, eine molekulare Chimäre wie hier zuvor definiert und eine virale 3'-LTR-Sequenz umfaßt (3A und 3B).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform und zur Unterstützung der Eliminierung nicht-gewebespezifischer Expression der molekularen Chimäre wird die molekulare Chimäre in entgegengesetzter Transkriptionsorientierung zum retroviralen 5'-LTR eingesetzt (3A und 3B). Zusätzlich kann ebenfalls ein dominantes selektierbares Marker-Gen eingeschlossen werden, das transkriptionsweise von der 5'-LTR-Sequenz gesteuert wird. Ein solches dominantes selektierbares Marker-Gen kann das bakterielle Neomycinresistenz-Gen NEO (Aminoglycosid-3'-phosphotransferase Typ II) sein, das eukaryotischen Zellen Resistenz gegen das Neomycin-Analogon G418-sulfat (Geneticin) (Handelsbezeichnung) verleiht (3A und 3B). Das NEO-Gen unterstützt die Selektion von Verpackungszellen, die diese Sequenzen enthalten (siehe unten).
  • Der in den Beispielen verwendete retrovirale Vektor beruht auf dem Moloney-Mäuseleukämie-Virus, aber es wird ersichtlich sein, daß andere Vektoren verwendet werden können. Solche Vektoren, die ein NEO-Gen als selektierbaren Marker enthalten, wurden beschrieben, z. B. der N2-Vektor (Science 230: 1395–1398 (1985)).
  • Ein mit den retroviralen Shuttle-Vektoren verbundenes theoretisches Problem ist die Möglichkeit, daß retrovirale lange terminale Wiederholungs(LTR)-Regulationssequenzen transkriptional ein zelluläres Onkogen am Integrationsort im Wirtsgenom aktivieren. Dieses Problem kann vermindert werden, indem SIN-Vektoren geschaffen werden (3A). SIN-Vektoren sind selbst-inaktivierende Vektoren, die eine Deletion enthalten, die die Promotor- und Verstärkerregionen in der retroviralen LTR umfassen. Die LTR-Sequenzen von SIN-Vektoren aktivieren genomische 5'- oder 3'-Sequenzen nicht transkriptional. Die transkriptionale Inaktivierung der viralen LTR-Sequenzen vermindert die insertionale Aktivierung von benachbarten Zielzell-DNA-Sequenzen und unterstützt ebenfalls die ausgewählte Expression der übertragenen molekularen Chimäre. SIN-Vektoren werden durch Entfernung von ca. 299 bp in der viralen 3'-LTR-Sequenz geschaffen (Biotechniques 4 504-512) (1986)).
  • Daher sind die retroviralen Shuttle-Vektoren der vorliegenden Erfindung bevorzugt SIN-Vektoren.
  • Da die parentalen retroviralen gag-, pol- und env-Gene aus diesen Shuttle-Vektoren entfernt wurden, kann ein Helfervirussystem verwendet werden, um die retroviralen gag-, pol- und env-Genprodukte trans bereitzustellen, um den retroviralen Vektor in einem infektiösen Virion zu verpacken oder zu enkapsidieren. Dies wird durch Verwendung spezialisierter "Verpackungs"-Zellinien erreicht, die zur Erzeugung von infektiösem synthetischem Virus fähig sind, denen aber dennoch die Fähigkeit zur Erzeugung von nachweisbarem Virus vom Wildtyp fehlt. Auf diese Weise enthält das künstliche synthetische Virus eine Chimäre der vorliegenden Erfindung, verpackt in synthetischen künstlichen infektiösen Virionen, die frei vom Helfervirus vom Wildtyp sind. Dies beruht auf der Tatsache, daß das Helfervirus, das stabil in der Verpackungszelle integriert ist, die viralen Strukturgene enthält, daß ihm aber die psi-Stelle fehlt, eine cisagierende Regulationssequenz, die im viralen genomischen RNA-Molekül enthalten sein muß, damit es in einem infektiösen viralen Teilchen enkapsidiert wird.
  • Entsprechend wird in einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein infektiöses Virion bereitgestellt, das einen retroviralen Shuttle-Vektor wie hier zuvor beschrieben umfaßt, wobei der Vektor innerhalb viraler Proteine enkapsidiert ist, um ein künstliches infektiöses vermehrungsunfähiges Retrovirus zu schaffen.
  • Bevorzugt umfaßt der retrovirale Shuttle-Vektor einen Shuttle-Vektor, der eine molekulare Chimäre mit der Transkriptionsregulationssequenz von AFP umfaßt. Insbesondere enthält der Shuttle-Vektor eine AFP/VZV TK-Chimäre.
  • Zusätzlich zur Entfernung der psi-Stelle können zusätzliche Veränderungen an den Helfervirus-LTR-Regulationssequenzen vorgenommen werden um sicherzustellen, daß das Helfervirus nicht in Virionen verpackt wird und auf dem Niveau der Umkehrtranskription und viralen Integration blockiert wird.
  • Alternativ können Helfervirus-Strukturgene (d. h. gag, pol und env) individuell und unabhängig in die Verpackungszellinie überführt werden. Da diese viralen Strukturgene innerhalb des Genoms der Verpackungszelle getrennt sind, besteht wenig Möglichkeit für verdeckte Rekombinationen, die Virus vom Wildtyp erzeugen.
  • In einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung infektiöser Virionen der vorliegenden Erfindung durch Übertragung des künstlichen retroviralen Shuttle-Vektors, der eine molekulare Chimäre der Erfindung wie hier zuvor beschrieben umfaßt, in eine Verpackungszellinie bereitgestellt.
  • Die Verpackungszellinie kann stabil darin integriert ein Helfervirus aufweisen, dem eine psi-Stelle und andere Regulationssequenzen wie hier zuvor beschrieben fehlen, oder alternativ kann die Verpackungszellinie so konstruiert werden, daß sie Helfervirus-Strukturgene innerhalb ihres Genoms enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein infektiöses Virion wie hier zuvor beschrieben zur Verwendung in der Therapie bereit, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung von Krebs und insbesondere zur Verwendung in der Behandlung von HCC, nichtseminomatösem Karzinom der Hoden, bestimmten Teratokarzinomen und bestimmten Magen-Darm-Tumoren.
  • Die selektive Expression des hetereologen Enzyms, insbesondere des Thymidinkinase-Gens, wird durch Verwendung gewebespezifischer Transkriptionsregulations-(z. B. Verstärker- und Promotor-)-Sequenzen erreicht. Die Selektivität kann zusätzlich durch selektive Infektion von Leberzellen verbessert werden. Das in der Verpackungszellinie vorhandene retrovirale env-Gen definiert die Spezifität für die Wirtsinfektion. Das in der Konstruktion der Verpackungszellinie verwendete env-Gen wird modifiziert, um künstliche infektiöse Virionen zu erzeugen, die selektiv Leberzellen infizieren. Als Beispiel kann ein retrovirales env-Gen, das in die Verpackungszelle eingeführt wurde, in einer solchen Weise modifiziert werden, daß das Hüll-Glycoprotein des künstlichen infektiösen Virions selektiv Leberzellen über die spezifische rezeptorvermittelte Bindung, die vom Hepatitis-B-Virus (HBV) verwendet wird, infiziert.
  • HBV infiziert primär Leberzellen über eine spezifische rezeptorvermittelte Bindung. Das durch die pre-Sl- und pre-S2-Sequenzen codierte HBV-Protein spielt eine Hauptrolle in der Anhaftung von HBV an Leberzellen (Hepadna Viruses, herausgegeben von Robinson et al., 189–203, 205–221, 1987). Das env-Gen der Verpackungszelle wird modifiziert, um die Leberzell-Bindungsstelle des großen S-HBV-Hüllproteins einzuschließen. Solche Modifikationen des env-Gens, eingeführt in die Verpackungszelle, können durch standardmäßige Techniken der Molekularbiologie durchgeführt werden, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, und werden die virale Aufnahme im Zielgewebe erleichtern.
  • Das erfindungsgemäße infektiöse Virion kann durch auf diesem Gebiet wohlbekannte Techniken formuliert werden und kann als Formulierung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür angeboten werden. Pharma zeutisch akzeptable Träger können in diesem Fall ein flüssiges Medium umfassen, das zur Verwendung als Träger zur Einführung des infektiösen Virions in den Patienten geeignet ist. Ein Beispiel für einen solchen Träger ist Kochsalzlösung. Das infektiöse Virion kann eine Lösung oder Suspension in einem solchen Träger sein. Stabilisatoren und Oxidationsinhibitoren und/oder andere Exzipienten können ebenfalls in solchen pharmazeutischen Formulierungen vorhanden sein, die an ein Säugetier durch jedes herkömmliche Verfahren, z. B. auf dem oralen oder parenteralen Weg, verabreicht werden können. Insbesondere kann das infektiöse Virion durch intravenöse oder intraarterielle Infusion verabreicht werden. Im Fall der Behandlung von HCC kann die intrahepatische arterielle Infusion vorteilhaft sein.
  • Entsprechend stellt die Erfindung eine pharmazeutische Formulierung bereit, die ein infektiöses Virion im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
  • Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Formulierungen wie hier beschrieben bereit, umfassend das Vermischen eines künstlichen infektiösen Virions, das eine molekulare Chimäre enthält, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  • Während jede geeignete Verbindung verwendet werden kann, die selektiv durch das Enzym umgewandelt werden kann, stellt die vorliegende Erfindung ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) oder (II) in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von Krebstypen bereit, die zur Expression von VZV-Thymidinkinase fähig sind. Insbesondere zur Verwendung in der Behandlung von Leberzellkarzinom (HCC).
  • 6-Substituierte Purinarabinoside der Formel (I), ihre Salze und physiologisch funktionalen Äquivalente davon wie nachfolgend gezeigt:
    Figure 00130001

    worin
    R1 Halogen; C1-5-Alkoxy; Halogen-substituiertes C1-5-Alkoxy; eine Amino-Gruppe, die mono- oder disubstituiert ist mit C1-5-Alkyl, C1-5-Alkyl, das mit einem oder mehreren Fluoratomen substituiert ist, oder C3-6-Cycloalkyl; oder ein stickstoffhaltiger Heterocyclus ist, der C4-7-Kohlenstoffatome und gegebenenfalls eine Doppelbindung enthält; und R2 Wasserstoff, Halogen oder Amino ist, sind als Anti-VZV- und -Cytomegalovirus-Mittel bekannt, und ihre Verwendung und Synthese werden in EP-A-0294114 beschrieben.
  • Verbindungen der Formel (II) sind wie nachfolgend gezeigt:
    Figure 00140001

    worin X eine Vinylen- oder Ethinylen-Gruppe darstellt; R1 eine Oxooder Imino-Gruppe darstellt; R2 ein Wasserstoffatom, Cl-2-Alkyl, eine verzweigte oder cyclische C3-4-Alkyl-Gruppe, z. B. Isopropyl oder Cyclopropyl, darstellt; R3 ein Wasserstoffatom oder eine Acyl-Gruppe dargestellt, z. B. C1-4-Alkanoyl oder Benzoyl, gegebenenfalls substituiert mit z. B. einem oder mehreren Halogen-, Alkyl-, Hydroxy- oder Alkoxy-Substituenten; und R4 ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxy-Gruppe darstellt; mit der Maßgabe, daß R1 keine Oxo-Gruppe darstellt, wenn R2, R3 und R4 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen.
  • Es wird ersichtlich sein, daß die Verbindung der Formel (I) oder (II) in ihren tautomeren Formen existieren kann, wenn R3 keine Acyl-Gruppe ist. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel (I) und (II) sind 9-β-Arabinofuranosyl-6-methoxy-9H-purin und 1-(β-D-Arabinofuranosyl)-5-propinyluracil.
  • Diese Verbindungen und Verfahren zu ihrer Synthese wurden in EP-A-0272065 offenbart, wonach sie Anti-VZV-Aktivität besitzen.
  • Die oben genannten Pyrimidin-Nukleoside und Purinarabinoside schließen ebenfalls die pharmazeutisch akzeptablen Derivate solcher Verbindungen ein, d. h. jedes pharmazeutisch akzeptable Salz, jeden solchen Ester oder ein jedes solches Salz eines solchen Esters, oder jede andere Verbindung, die bei Verabreichung an einen menschlichen Patienten zur Bereitstellung (direkt oder indirekt) des aktiven Metaboliten oder eines Restes davon fähig ist.
  • Bevorzugt ist die Verbindung oral aktiv.
  • Die Mengen und das präzise Schema bei der Behandlung eines Säugetiers wird natürlich von der Verantwortung des behandelnden Arztes abhängen und wird von einer Anzahl von Faktoren abhängen, die den Typ und die Schwere des zu behandelnden Zustandes einschließen. Jedoch wird für HCC wahrscheinlich eine intraarterielle Leberinfusion des künstlichen infektiösen Virions mit einem Titer zwischen 2 × 105 und 2 × 107 koloniebildenden Einheiten pro ml (KBE/ml) infektiöser Virionen für einen typischen Tumor geeignet sein. Die Gesamtmenge der infundierten Virionen wird von der Tumorgröße abhängen und würde wahrscheinlich in unterteilten Dosen verabreicht werden.
  • Arzneistoffbehandlung – Im Anschluß einer Infektion mit dem infektiösen Virion werden erfindungsgemäße Verbindungen verabreicht, die spezifisch eine VZV TK-Aktivität für den kritischen ersten Phosphorylierungsschritt in Anabolismus zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten erfordern.
  • Die Dosis des Arzneistoffs wird vorteilhaft im Bereich von 0,1 bis 250 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag liegen, bevorzugt 0,1 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht.
  • Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, aber sollten nicht als Beschränkung aufgefaßt werden.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion von Transkriptionsregulationssequenz von alpha-Fetoprotein/VZV-Thymidinkinase Die VZV-Thymidinkinase-codierende Sequenz und Polyadenylierungsstelle wurden als BamHI-XmnI-Restriktionsendonuklease-Fragment mit ca. 3 300 by aus pCR73 isoliert (4). Das 5'-überstehende Ende der BamHI-Restriktionsendonuklease-Stelle wurde durch Behandlung mit Klenow und dNTPs abgestumpft. Dieses DNA-Fragment enthält die vollständige codierende Sequenz und die Polyadenylierungsstelle des VZV TK-Gens, aber enthält keine Verstärker- oder Promotorsequenzen. Ein Plasmid mit ca. 9996 bp, pAF5.1-CAT, das eine menschliche 5'-flankierende DNA mit ca. 5100 by enthält, wurde von T. Tamaoki, Univ. of Calgary, Kanada, erhalten. Ein DNA- Fragment, das sich von ca. -5,1 kb bis +29 des menschlichen AFP-Gens erstreckt, wurde aus PAF5.1-CAT durch Digestion mit XmnI und partieller Digestion mit HindIII isoliert. Dieses XmnI/HindII-Fragment wurde an das BamHI/XmnI VZV TK-Fragment unter Verwendung von T4 DNA-Ligase unter Bildung von pCR 77 ligiert (4). Die AFP E/P VZV TK-Chimäre wurde durch Elektroelution aus PCR 77 als ein Aat II/PstI-Restriktionsendonuklease-Fragment mit ca. 6699 by gereinigt. Dieses Fragment wurde dann mit T4 DNA-Polymerase und dNTPS als Beispiel 1 zur Erzeugung eines stumpfendigen Restriktionsfragments behandelt.
  • pCR77 wurde bei der ATCC am 18. August 1989 unter der Eingangs-Nr. ATCC68079 hinterlegt.
  • Beispiel 2
  • Konstruktion eines retroviralen Shuttle-Vektor-Konstrukts, das die molekulare Chimäre aus Beispiel 1 enthält
  • Der retrovirale Shuttle-Vektor pCR78 (4) wurde durch Ligieren eines gereinigten AatII/PstI-Fragments aus pCR77, das die AFP E/P VZV TK-Chimäre enthält, in einen als N2(XM5) bezeichneten Moloney-Mäuseleukämie-Retrovirus-Vektor (Science 230: 1395-1398, 1985), erhalten von S. Karrlson, NIH, Bethesda, MD, USA, konstruiert. N2(XM5) wurde mit der Restriktionsendonuklease XhoI digeriert, und die 5'-überstehenden Enden wurden durch Behandlung mit sowohl Klenow als auch dNTPs vor dem Ligieren an das pCR73 SstI/KpnI-Fragment unter Verwendung von T4 DNA-Ligase abgestumpft. Der retrovirale Shuttle-Vektor pCR78, der die AFP E/P VZV TK-Chimäre enthält, wurde durch Restriktionsendonuklease-Kartierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert, wobei die Primärsequenz bestätigt wurde. Die die Verbindung von AFP E/P mit der VZV TK-Sequenz flankierende Sequenz ist in 5 gezeigt.
  • pCR78 wurde bei der ATCC am 18. August 1989 unter der Eingangs-Nr. ATCC68080 hinterlegt.
  • Beispiel 3
  • Viruserzeugung
  • Die als PA317 bezeichnete Verpackungs-Zellinie, erhalten von ATCC (ATCC CRL 9078), die zuvor beschrieben wurde, hat drei Veränderungen, die in der 5'-LTR, psi-Regulationssequenz und 3'-LTR enthalten sind (Mol. and Cell Biol. 6 Nr. 8 2895–2902 [1986]). Die in Beispiel 3 beschriebenen künstlichen retroviralen Konstrukte werden in die Verpackungszellinie durch Elektroporation oder Infektion gegeben. Zur Elektroporation werden 20 μg 1inearisierte Plasmid-DNA in 2 Millionen PA317-Zellen in Phosphat-gepufferter Saccharose unter Verwendung von 280 Volt, 25 Mikrofarad Kapazität in einem Gesamtvolumen von 0,8 ml elektroperforiert. Man kann wenigstens 150 G418 resistente Kolonien/20 μg Plasmid DNA/2 Millionen PA317 Zellen erhalten. Zur Infektion werden 20 μg linearisierte Plasmid-DNA in 2 Millionen ecotrope Verpackungszellen, wie Psi-2-Zellen, elektroperforiert. Zwei Tage später wird der Kulturüberstand verwendet, um die amphotrope Verpackungszellinie PA317 zu infizieren, und 418 resistente Kolonien werden isoliert. Für beide Elektroporations- und Infektionstechniken werden G418 resistente Kolonien einzelzellkloniert durch das Grenzwertverdünnungsverfahren und durch Southern-Blots analysiert und in NIH 3T3-Zellen (ATCC) getitert, um den stärksten Erzeuger für Virus voller Länge zu identifizieren. Für PA317-Zellen, die pCR78 enthalten, wurden 29 Einzelzellklone isoliert, und DNA wurde aus 25 Klone erhalten. Extensive Southern-Blot-Analyse unter Verwendung verschiedener Restriktionsendonuklease-Enzyme und AFP-, NEO- und VZV TK-Sequenzen als radioaktive Hybridisierungssonden wurden an diesen 25 Proben durchgeführt. Von den 25 analysierten Klonen zeigten 5 keinen Hinweis auf Verkürzung und werden als mit voller Länge betrachtet. Jede Verpackungszellinie, die eine virale Sequenz voller Länge enthält, wurde in NIH 3T3-Zellen titriert, die Thymidinkinase minus/minus waren, wobei Standardtechniken verwendet wurden.
  • Beispiel 4
  • Infektion einer menschlichen Hepatom-Zellinie (Positivkontrolle) mit infektiösen Virionen voller Länge aus Beispiel 5, die AFP/VZV TK enthalten, mit anschließenden Messungen von VZV Tx-Aktivität, ara-ATP-Produktion und Arzneistoffempfindlichkeit
  • Die replikationsunfähigen künstlichen Retroviren voller Länge, die die AFP/VZV TK-Chimäre enthielten, wurden verwendet, um eine menschliche, als Hep G2 bezeichnete menschliche Hepatomzellinie (ATCC KS 8065) zu infizieren. Im Anschluß an die Infektion und Selektion auf 1 mg Geneticin/ml (Handelsbezeichnung) wurden die Zellen auf VZV TK-Aktivität untersucht. Zusätzlich wurden die Zellen in Gegenwart von (3H)-markiertem 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin (bezeichnet als ara-M in den folgenden Tabellen und Figuren) mit anschließender Messung von ara-ATP inkubiert. Schließlich wurden Zellen in Gegenwart der oben genannten Verbindung kultiviert, und der IC50-Wert (Wachstumshemmung) wurde bestimmt. Mit keinem Virus oder N2-Virus infizierte Zellen fungieren als Kontrollproben für diese Experimente. N2-Virus enthält kein genetisches VZV TK-Material.
  • Tabelle 1 zeigt, daß die mit pCR78, das Viren enthält, infizierten menschlichen Hepatomzellen eine im Vergleich zu den Kontrollzellen um 52-fach höhere VZV TX-Aktivität aufweisen.
  • 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin (bezeichnet als ara-m) kann selektiv durch VZV TK mit anschließendem Anabolismus zu cytotoxischem ara-ATP monophosphoryliert werden. 6 zeigt, daß Hep G2-Zellen, die mit pCR78, das Viren enthält, infiziert und in Gegenwart von (3H)-markiertem 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin inkubiert wurden, signifikante Mengen von cytotoxischer (3H)-ara-ATP-Bildung aufwiesen.
  • Mit den replikationsunfähigen künstlichen Retroviren voller Länge, die die AFP/VZV TK (pCR78)-Chimäre enthielten, infizierte Hep G2-Zellen wurden in Gegenwart unterschiedlicher Mengen von 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin für 5 Tage inkubiert und die Wachstumshemmung durch Messung von Zellzahl und DNA-Gehalt bestimmt.
  • Tabelle 2 zeigt, daß der IC50-Wert (50%ige Wachstumshemmung) von 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin größer als 2000 μM in der Kontrolle und in N2-infizierten Hep G2-Zellen ist. Bei den mit replikationsunfähigen künstlichen Retroviren voller Länge, die die AFP/VZV TK (pCR78)-Chimären enthielten, infizierten Hep G2-Zellen betrug der IC50-Wert 175 μM. Einzelzellklonierung von Hep G2-Zellen, die die AFP/VZV TK (pCR 78)-Chimäre enthielten, zeigte, daß der IC50-Spiegel von 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin weiter auf ca. 40 μM verringert werden kann.
  • Figurenbeschreibung
  • 1A: Schaubild des Varicella-zoster-Thymidinkinase-Gens.
  • 1B: VZV TK-Gen – 1. Sequenz.
  • 2: alpha-Fetoprotein-Transkriptionsregulationssequenz/VZV TK molekulare Chimäre.
  • 3: Provirale Form des Retrovirus, das die alpha-Fetoprotein/VZV TK-molekulare Chimäre enthält.
  • 3B: pCR78.
  • 4: Flußdiagramm, das die Konstruktion von pCR78 zeigt.
  • 5: Sequenz, die AFP E/P an VZV TK in pCR78 flankiert.
  • 5: Herstellung von ara-ATP mit Zellen, die mit Kontrollen, pCR74, pCR78 infiziert sind.
  • VZV TK-Aktivität in Hep G2-Zellen, die mit replikationsunfähigen künstlichen Retroviren voller Länger infiziert sind, die die AFP/VZV TK-Chimäre (pCR78) enthalten. VZV TK-Aktivität wurde als Menge von ara-M-Phosphorylat pro mg zelluläres Protein pro 30 Minuten quantifiziert Tabelle 1
    Figure 00190001
  • Wachstumshemmung in Hep G2-Zellen, die mit replikationsunfähigen künstlichen Retroviren voller Länge infiziert sind, die ALB/VZV TK-Chimäre (pCR74) oder AFP/VZV TK-Chimäre (pCR78) enthalten. Tabelle 2
    Figure 00190002

Claims (28)

  1. Molekulare Chimäre zur Verwendung in der Therapie mit einem Prodrug, umfassend eine krebsspezifische Transkriptionsregulations-DNA-Sequenz, die selektiv in einer Säugetier-Krebszelle aktiviert werden kann, und eine DNA-Sequenz, die funktionsfähig mit der Transkriptionsregulations-DNA-Sequenz verbunden ist und ein heterologes Enzym codiert, das die Umwandlung des Prodrugs in ein für die Krebszelle toxisches Mittel katalysieren kann.
  2. Chimäre gemäß Anspruch 1, worin die Transkriptionsregulations-DNA-Sequenz einen Promotor umfaßt.
  3. Chimäre gemäß Anspruch 2, worin die Transkriptionsregulations-DNA-Sequenz ebenfalls einen Verstärker umfaßt.
  4. Chimäre gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Transkriptionsregulations-DNA-Sequenz aus dem Gen für karzinoembryonisches Antigen, HER2/neu oder alpha-Fetoprotein stammt.
  5. Chimäre gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die zusätzlich ein Polyadenylierungssignal stromabwärts der DNA-Sequenz umfaßt, die das heterologe Enzym codiert.
  6. Chimäre gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das heterologe Enzym aus Varicella zoster-Virus-Thymidinkinase, Carboxypeptidase G2, alkalischer Phosphatase, Penicillin-V-Amidase und nicht-Säugetier-Cytosindesaminase ausgewählt ist.
  7. Chimäre gemäß Anspruch 6, worin das heterologe Enzym Nicht-Säugetier-Cytosindesaminase ist.
  8. Chimäre gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Krebszelle eine alpha-Fetoprotein-exprimierende Teratokarzinom- oder Magen-Darm-Tumorzelle oder eine testikuläre nicht-seminomatöse Karzinomzelle oder Hepatomzelle ist.
  9. Viraler Vektor, der eine Chimäre gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.
  10. Vektor gemäß Anspruch 9, der ein retroviraler Vektor ist.
  11. Vektor gemäß Anspruch 10, der ein selbstinaktivierender (SIN) Vektor ist.
  12. Verpackungszellinie, die einen chiralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 enthält.
  13. Infektiöses Virion, das aus einer Verpackungszellinie gemäß Anspruch 12 erzeugt ist.
  14. Infektiöses Virion gemäß Anspruch 13, worin das Virion ein Retrovirus ist.
  15. Infektiöses Virion gemäß einem der Ansprüche 13 und 14, worin das Virion so konstruiert ist, um selektiv eine Krebszelle zu infizieren.
  16. Infektiöses Virion gemäß Anspruch 15, worin das konstruierte Virion ein modifiziertes Hüll-Gylcoprotein enthält.
  17. Infektiöses Virion gemäß Anspruch 16, worin das modifizierte Glycoprotein ein modifiziertes env-Genprodukt ist, das die Leberzell-Bindungsstelle des großen S-HBV-Hüllproteins enthält.
  18. Pharmazeutische Formulierung, die ein infektiöses Virion gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür umfaßt.
  19. Verwendung eines Prodrugs in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung mit einer Chimäre gemäß einem der Ansprüche 1 bis B.
  20. Verwendung eines Prodrugs in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11.
  21. Verwendung eines Prodrugs in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung mit einem infektiösen Virion gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17.
  22. Verwendung einer Chimäre gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Krebstherapie.
  23. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Krebstherapie.
  24. Verwendung eines infektiösen Virions gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Krebstherapie.
  25. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, worin der Prodrug ein Purin- oder Pyrimidinarabinosid ist.
  26. Verwendung gemäß Anspruch 25, worin der Prodrug 9-β-Arabinofuranosyl-6-methoxy-9H-purin oder 1-(β-D-Arabinofuranosyl)-5-propinyluracil oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz, ein pharmazeutisch akzeptabler Ester oder ein pharmazeutisch akzeptables Estersalz davon ist.
  27. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, worin der Prodrug para-N-Bis(2-chlorethyl)aminobenzoylglutaminsäure, Etoposidphosphat, Doxorubicinphosphat oder Mitomycinphosphat oder ein Phenoxyacetamid-Derivat von Doxorubicin oder Melphalan ist.
  28. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, worin der Prodrug 5-Fluorocytosin ist.
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