PT95134B

PT95134B - Proceso para a preparacao de novas entidades para a terapia do cancro

Info

Publication number: PT95134B
Application number: PT95134A
Authority: PT
Inventors: Brian Huber; Cynthia Ann Richards; Thomas Anthony Krenitsky
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1989-08-30
Filing date: 1990-08-29
Publication date: 2003-06-30
Also published as: AU6458794A; EP0415731A2; EP0415731B1; NZ235093A; FI904257A0; ZA906894B; DD297447A5; ES2194833T3; GB8919607D0; ATE236260T1; DK0415731T5; CN1058993C; DE69034054T2; EP0415731A3; AU3422897A; JPH03172189A; HUT58814A; AU647747B2; EP0657540A1; EP0690129A1

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a qui meras moleculares, a viriões infecciosos, a métodos para a sua construção,a composições farmacêuticas que os contêm, ao seu uso em terapia, particularmente terapia enzimática pro-droga dirigida a vírus, em especial no tratamento de cancros, mais em particular no tratamento do carcinoma hepatocelular, e ao uso de agentes que possam ser catalisados por um enzima heterólogo a metabolitos citotóxicos ou citostãticos, tais como arabinósidos de purina e pirimidina substituídas em terapia enzimática pro-droga dirigida a vírus.

cancro em todas as suas formas é uma das causas principais de mortalidade em todo o mundo. A investigação na área da quiometerapia do cancro deu origem a

uma grande variedade de agentes antitumor com diferentes graus de eficácia. Os agentes típicos usados em clínica incluem a adriamicina,a actinomicina D, o metotrexato, o 5fluo rouracilo, a cisplatina, a vincristina e a vimblastina. Con tudo, sabe-se que estes agentes antitumor de que se dispõe actualmente têm várias desvantagens tais como a toxicidade para as células saudáveis e a resistência de certos tipos de tumores. Conhecem-se também outros tipos de terapia, tais como a cirurgia. Contudo,os especialistas na matéria reconhe cem que são necessários novos métodos e entidades na terapia do cancro.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é actualmente uma das principais doenças malignas no mundo; sendo a maior incidência no Japão, na China, noutras partes da Ásia e na África sub-sabariana. Dados recentes revelam que a incidência do carcinoma hepatocelular na Europa e na América do Norte estã a crescer. Calcula-se que a doença é responsável por ou esta relacionada com cerca de 1 250 000 mortes por ano, sendo por isso numericamente uma das maiores doenças malignas do mundo.

prognóstico do HCC é sempre baixo, igualando a frequência mundial quase a taxa de mortalidade. Após o diagnóstico o tempo médio de sobrevivência é inferior a quatro meses. A sobrevivência a longo prazo, definida como a sobrevivência superior a um ano após o diagnós tico, é muito rara. A maior parte dos doentes de HCC morrem quer devido a complicações por inactivação do fígado, quer devido aos efeitos gerais de uma grande carga tumoral, com cachexia, malnutrição, infecção e gangrena. Embora ocorram metastases à distância (até 90% dos pacientes revelam tumores metastáticos na altura da morte), a doença local limita frequentemente a sobrevivência. Consequentemente, são neces sárias terapias dirigidas ao controlo do tumor hepático embo ra se reconheça também de grande interesse o tratamento das metastases (Kew, M.C. Postgraduate Medicai Journal 59 (Suppl), 78-87 (1983) e Berk. P. (Ed) Seminars in Liver Disease 4, Ns 2, Thieme - Stratton Inc. N. Y. N.Y. (1984)).

As terapias correntes disponíveis para o clínico são totalmente ineficazes para a cura desta doença (Nerenstone et. al, Câncer Treatment Reviews 15, 1-31 (1988)). Até à data, a cirurgia continua a ser única cura potencial. Contudo na altura do diagnóstico, a grande maioria dos doentes não estão em condições de serem submetidos a uma cirurgia radical. Em certos estados (Nerenstone et al; ver acima) Concluiu-se que menos de 3% dos doentes esta vam em condições de serem operados, e da pequena percentagem que o fazem cerca de 50% sofrem de morbidez pós-operatória (Nerenstone et al; ver acima).

Os sistemas de quiometerapia e de radiação isolados ou em combinação são relativamente inefica zes e isto mostra bem a necessidade de novos métodos e terapias para o tratamento desta doença.

A terapia genética compreende a integração estável de novos genes em certas células atingidas e a expressão desses genes, uma vez colocados, para alterar o fenotipo dessas células (para revisão veja-se: Anderson, W.F., Science 226, 401-409, 1984; Mc Cormick, D., Biotechno logy 3, 690-693, 1985). A terapia genética pode ser benéfica para o tratamento de doenças genéticas que envolvam a substituição de um enzima deficiente ou em falta, tal como a hipoxantina-guanina fosfo-ribosil transferase na doença de Lesch Nyhan, a purina nucleósido fosforilase em várias do enças imunodeficientes e a adenosina desaminase em várias doenças de imunodeficiência combinada. Até agora, a terapia genética não tem sido usada em clínica, embora em certas perturbações se esteja prestes a usar determinados tipos de terapia genética.

Descobriu-se na presente invenção que é possível parar selectivamente o crescimento de células de carcinoma em mamíferos, ou destruí-los, por meio de agentes químicos capazes de conversão selectiva a metabolitos ci totóxicos ou citostáticos. Tal consegue-se pela construção de uma quimera molecular que compreende uma sequência regulatória transcripcional (TRS) específica do tecido atingido que é selectivamente activada nesse tecido, tal como

as células cancerosas, controlando assim a expressão de um enzima heterólogo. Esta quimera molecular pode manipular-se através de vectores adequados e incorporar-se num virião infeccioso. Após administração de um virião infeccioso contendo a quimera molecular a um paciente, o enzima exprime-se selectivamente na célula atingida. A administração de compostos que sejam selectivamente metabolizados pelo enzima a metabolitos que sejam posteriormente metabolizados a agentes citotóxicos ou citostáticos ou que o sejam de facto, pode efectuar-se in situ.

A invenção aplica-se em geral ao carcinoma hepatocelular e para ele se demonstra.

Como referido acima, a grande maioria dos doentes que sofrem de carcinoma hepatocelular morrem devido ao tumor primário. Contudo, cerca de 90% dos doentes de HCC apresentam claramente doenças metastáticas na altura da morte. Estas metastases apresentam o fenótipo típico do tumor primário e como tal exprimem também selectivamente o enzima heterólogo activando assim selectivamente os compostos administrados a metabolitos citotóxicos ou citostáticos tal como definido acima.

Podem empregar-se várias combinações de enzima pro-droga; desde que o enzima seja capaz de activar selectivamente o composto administrado, quer directa mente quer através de um intermediário, a um metabolito cito tóxico ou citostático. Também a escolha do composto dependerá do sistema enzimático uzado, mas deve ser selectivamente metabolizado pelo enzima, quer directamente quer indirectamente, a um metabolito citotóxico ou citostático. 0 termo enzima heterólogo aqui utilizado,refere-se a um enzima que possua as caracteristicas apropriadas de selectividade.

O vírus de varicella Zoster (VZV) codifica uma proteína específica da timidina quinase. Clorou-se o gene, sequenciou-se e caracterizou-se (J. Gen. Virol. 67, 1759-1816 (1986)). A timidina quinase de VZV, em contraste com o enzima de mamíferos, monofosforila selectiva mente arabinósidos de purina específicos e compostos pirimidínicos substituídos. Além disso, na presente invenção descobriu-se que certos análogos de purina e pirimidina, particularmente os de fórmulas I e II aqui definidos, se convertem em metabolitos citotóxicos ou citostáticos em células específicas de mamíferos geneticamente modificadas para exprimir selectivamente a timidina quinase de VZV. Por exemplo, a 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina converte-se em trifosfato de 9-B-D-arabinofuranosil-adenina [Ara ATP].

Outras combinações enzima pró-droga incluem o enzima bacteriano carboxipeptidase G 2 (por exemplo de Pseudomonas) com a pró-droga ácido para-N-bis-(5-(2-cloroetil)aminobenzoilglutâmico. A cisão da metade ácido glutãmico deste composto liberta uma mustarda tóxica de ácido benzóico; a fosfatase alcalina, por exemplo do intestino de vitela, converte compostos fosforilados inactivos, tais como fosfato de etoposido, fosfato de dexorubicina, fosfato de mitomicina, em metabolitos desfosforilados tóxicos. A pe nicilina V amilase converte derivados fenoxiacetamido de do xorabicina e melfalano em metabolitos tóxicos e a citosina desaminase fúngica (por exemplo de fusarium oxysporum) converte 5-fluorocitosina em 5-fluorouracilo tóxico.

Em células de mamíferos, certos genes são ubiquoamente expressos. A maior parte dos genes, con tados, são expressos de um modo específico do tempo e/ou do tecido, ou são activados em resposta a indutores extracelula res, por exemplo certos genes são activamente transcriptos apenas em tempos muito precisos em ontogenia em tipos celulares específicos ou em resposta a alguns estímulos indutores. Esta regulação é mediada em parte pela interacção entre as sequências regulatórias transcripcionais (que são por exemplo sequências de DNA de promotor e de activador) e os factores de proteína transcripcionais que se ligam ao DNA, específicos da sequência.

Na presente invenção descobriu-se que é possível alterar certos tecidos de mamíferos, p.ex. te eidos de fígado ou tecidos de fígado transformados, para exprimir selectivamente um enzima heterólogo como definido aci ma, p. ex. timidina quinase do VZV. Tal consegue-se pela

construção de quimeras moleculares numa cassete de expressão.

As próprias cassetes de expressão são bem conhecidas na prática da biologia molecular. Uma tal cassete de expressão contém todas as sequências do DNA essen ciais necessárias para a expressão de um enzima heterõlogo numa célula de mamífero. Por exemplo, uma cassete de expressão preferencial deverá conter uma quimera molecular que con tém a sequência codificante para a TK (timidina quinase) de VZV, um sinal de poliadenilação apropriado para um gene de mamífero (i.e.um sinal de poliadenilação que funcione numa célula de mamífero), e sequências activantes e promotoras adequadas na orientação correcta.

Em células de mamíferos, são normal mente necessárias duas sequências de DNA para a regulação transcripcional completa e eficiente dos gases que codificam os RNAs mensageiros em células de mamíferos: os promotores e os activadores. Os promotores localizam-se imediatamente a seguir, no sentido ascendente da cadeira (5') ao local de início da transcripção. As sequências de promotor são necessárias para a iniciação exacta e eficiente da transcripção. Promotoras diferentes específicos do gene revelam características comuns de organização. Um promotor típico inclui uma região rica em AT, chamada caixa TATA (que está localizada aproximadamente a 30 pares de bases 5' do local de início de transcripção) e um ou mais elementos promotores as cendentes (upstream promoter elements (UPE)). Os UPEs são um alvo principal para a interacçao com factores transcripcionais nucleares específicos da sequência. A actividade das sequências de promotor são moduladas por outras sequências chamadas activadoras. A sequência de activador pode es tar a uma grande distância do promotor numa posição ascenden te (5') ou descendente (3'). Assim, os activadores actuam de um modo independente da orientação e da posição. Contudo, baseado ma organização estrutural semelhante e na função que pode ser intercambiável, a distinção absoluta entre promotores e activadores é algo arbitrária. Os activadores aumentam a velocidade de transcrição a partir da sequência

promotora. Ê essencialmente a interacção entre os factores transcripcionais específicos da sequência com as sequências de UPE e de activador que possibilita às células de mamífero levarem a cabo a expressão de genes específicos do tecido. A presença destes factores de proteína transcripcionais (factores, trans-activantes, específicos de tecido) ligados no UPE e aos activadores (sequências regulatórias de acção cis) permitem a outros componentes do mecanismo transcripcional, incluindo a RNA polimerase, iniciar a transcripção com selectividade e precisão específicas do tecido.

A seleçcão da sequência regulatória transcripcional, em particular da sequência de promotor e de activador,depende do tecido em causa. Como exemplos referem-se a sequência regulatória transcripcional da albumina (ALB) e da alfa-fetoproteína (AFP) por exemplo, o promutor e o activador) específicas para hepatócitos normais e para hepatócitos transformados, respectivamente; a sequência regulatória transcripcional para o antigene carcino-embriónico (CEA) para uso em células transformadas do tracto gastrointestinal, pulmão e peito e outros tecidos; a sequência regulatória transcripcional para a tirosina hidroxilase, colina acetil transferase ou enolase específica de neurõnio, para uso em neuroblastomas; a sequência regulatória transcripcional para a protena glicol fibro acídica, para uso em gliomas, a sequência regulatória transcrip cional para a insulina, para uso em tumores do pâncreas.

Outros exemplos incluem a sequência regulatória transcripcional específica para a gama-glutamil transpeptidase, para uso em certos tumores de fígado e para a dopa descarboxilase, para uso em certos tumores do pulmão. Além disso, as sequências regulatórias transcripcionais de certos oncogenes podem usar-se quando são expressas predominantemente em certos tipos de tumores. Bons exemplos deste tipo são a sequência regulatória do oncogene HER-2/neu que é expressa em tumores do peito e a sequência regulatória específica para o oncogene N-myc em neuroblastomas.

Os genes de ALBe da AFP têm uma homologia extensiva no que respeita à sequência de ácidos nu7

cleicos, à estrutura genética, a sequência de aminoácidos e à estrutura secundária das proteínas (para revisão veja-se Ingram et al. , PNAS 78 4694-4698 (1981)). Estes genes são expressos independente mas reciprocamente em ontogenia. No desenvolvimento normal a transcripção de ALB inicia-se pouco antes do nascimento e continua durante a vida adulta. A expressão transcripcional da ALB no adulto está confinada ao fígado. A AFP é expressa normalmente no fígado fetal, no endoderma visceral do ovário e no tracto gastrointestinal fetal, mas desce para níveis não detectãveis pouco depois do nascimento e não é significativamente expressa no fígado adulto não patogénico ou não regenerante ou em outros tecidos adultos normais. Contudo, a transcripção da AFP no fígado adulto aumenta muitas vezes dramaticamente no HCC. Além disso, a transcripção da AFP pode também ser elevada no carcinoma não seminomatoso e misto do testis, em tumores nasais endodérmicos, em certos tertocarcínomas e em certos tumores gastrointestinais. A expressão da AEP e da ALB específica do fígado é o resultado de interações das sequências regulatórias dos seus genes com factores transcripcionais trans-activantes encontrados em extractos nucleares do fígado. As sequências regulatórias transcripcionais da AFP e da ALB são preferidas para gerar a expressão específica de hepatoma ou específica do fígado em geral, respectivamente, de genes molecularmente combinados, uma vez que os genes da AFP e da ALB são regulados a nível transcripcional e os seus mRNAs estão entre os transcriptos de polimerase II mais abundantes no fígado.

Têm sido identificadas várias sequências de promotor e de activador de ALB e AFP em mamíferos (para revisão veja-se Genes and Develop. 1, 268 - 676 (1987) ; Science 235, 53 - 58 (1987) ; The Journal of Biol. Chemistry 262, 4812 - 4818 (1987)). Estas sequências possibilitam a expressão selectiva e específica de genes em hepatócitos (normais e transformados) e em hepatomas de fígado, respectivamente.

Por exemplo, como se mostra na figu ra 1, encontra-se um promotor de ALB de mamífero contido no

fragmento de 300 bp 5' em relação à posição de início de transcripção do gene da albumina. A sequência contida entre 300 bp 5' e 8500 bp 5' em relação à posição de início de transcripção do gene de albumina murina é dispensável para a expressão específica do fígado. Contudo, encontra-se uma se quência de activador específica do fígado contida num fragmento localizado de 8500 bp 5' a 10400 bp 5' em relação à po sição de início de transcripção (Fig. 1 A) . Se os elementos promotor e activador de ALB estiverem presentes pode conseguir-se a expressão específica do fígado de um gene estrutural heterólogo posicionado numa orientação 3' adequada (Fig. 1 B) . A expressão específica do fígado de um gene estrutural heterólogo 3' posicionado na orientação correcta em relação às sequências de promotor e activador de ALB mantém-se também quando se eliminam as sequências intervenientes não essenciais localizadas entre 300 bp 5' e 8500 bp 5' em relação à posição de início de transcripção (Fig. 1 C) . A truncagemm de sequências não essenciais consegue-se através de metodologia padrão de biologia molecular bem conhecida na especialidade e conduz a uma quimera molecular que se pode utilizar para a expressão directa específica do fígado de VZVTK.

De modo análogo ao da estrutura regulatória do gene de ALB,os elementos regulatórios dos genes de AFP promovem a expressão específica de tecidos da AFP em certas patologias do fígado, tais como o HCC (Mol. Cel.Biol. 6, 477-487 (1986); Science 235, 53-58 (1987)). Os elementos regulatórios do gene de AFP de mamíferos consiste numa região específica 5' próxima do promotor (localizada em algumas espécies de mamíferos entre 85 e 52 bp 5'em relação ao gene). Esta sequência é essencial para a transcripção em he patomas. Além disso, há elementos regulatórios ascendentes (5') bem defenidos para o gene de AFP murina que se comportam como activadores clássicos (Mol. Cel. Biol. 6, 477-487 (1986); Science 235, 53-58 (1987)). Estes elementos regula tórios ascendentes designam-se por elementos I, II e III e encontram localizados entre 1000 e 7600 bp 5' em relação à posição de início de transcripção para o gene de AFP murina.

Estas três regiões activadoras não são funcionalmente equiva valentes na geração da expressão específica de tecidos da AFP. Os elementos I e II têm maior capacidade para dirigir a expressão da AFP específica do fígado. É importante notar que as sequências regulatórias do gene da alfa-fetoproteína contêm vantajosamente as sequências não só para a activação transcripcional específica de tecidos mas também para a repressão da expressão em tecidos que não devem exprimir a AFP. Têm sido caracterizadas de um modo análogo as regiões regulatórias do gene da alfa-fetoproteína humana (J.B.C.262, 4812 (1987)). Um gene estrutural colocado na orientação 3' correcta em relação às sequências regulatórias da AFP permitirá a esse gene estrutural ser selectivamente expresso no fígado fetal, em hepatomas, carcinomas não seminamatosos do testis, certos teratocarcinomas, certos tumores gastrointestinais e outros tecidos normais e patológicos que exprimam selectivamente a AFP.

A presente invenção refere-se a uma quimera molecular que compreende uma sequência de DNA que contém a sequência codificante do gene que codifica um enzima heterólogo sob o controle de uma sequência regulatória transcripcional numa cassete de expressão; o promotor capaz de funcionar selectivamente numa determinada célula cancerosa, por exemplo um que seja capaz de transformar uma célula cancerosa para exprimir selectivamente a timidina quinase de VZV.

A presente invenção refere-se ainda, numa forma de concretização preferencial, a uma quimera molecular compreendendo uma sequência regulatória transcripcional, em particular um promotor que seja selectivamente activado em tecidos de mamíferos, ligado operativamente à se quência codificante para o gene que codifica a timidina quinase do vírus de varicella zoster (VZV TK).

Em particular, a presente invenção refere-se a uma quimera nolecular que compreende uma sequência do DNA da sequência codif icante do gene que codifica para o enzima, que é de preferência VZV TK, incluindo uma sequência de poliadenilação apropriada, ligada numa posição

3’ e na orientação correcta a uma sequência regulatória transcripcional específica do tecido de mamífero em causa. Muito em especial a cassete de expressão contém também uma sequência activadora.

As sequências de promotor e de acti vador, seleccionam-se de preferência a partir da sequência regulatória transcripcional para um oncogene de albumina (ALB), alfa-fetoproteína (AFP), antigene carcino-embriónico (CEA), tirosina hidroxilase, colina acetil transferase, enolase específica de neurónio, proteína gliol fibro ácida, insulina ou gama - glutaniltranspeptidase, dopadescarboxilase, HER 2/neu ou N-myc, onde outros genes adequados. Muito preferencialmente, as sequências regulatórias para ALB ou AFP usam-se para dirigir a expressão específica do fígado ou específica do hepatoma, respectivamente.

A quimera molecular da presente invenção pode construir-se utilizando técnicas do DNA recombinante padrão. Deste modo, a sequência codificante e o sinal de poliadenilação, por exemplo, do gene de timidina quinase (TK) de VZV (ver Figs. 2A. e 2B), colocam-se na orientação 3'correcta em relação aos elementos regulatórios transcripcionais de ALB ou AFP essenciais. Estas quimeras moleculares permitem a expressão selectiva de VZV TK em células que normalmente exprimem ALB ou AFB, respectivamente (Fig. 3A e 3B) . A expressão do gene de VZV TK em fígado de mamíferos,hepatomas, certos tumores do tracto gastro-intesti nal, carcinomas não seminamatosos do testis, certos teratocarcinomas e outros tumores, permitirá a arabinósidos e pirimidinas relativarnente não tóxicos, como os aqui definidos, serem selectivamente metabolizados a metabolitos citotóxicos ou citostáticos.

Deste modo, num segundo aspecto, a invenção, refere-se a um método para a construção de uma qui mera molecular que compreende a ligação de uma sequência de DNA que codifica um gene de um enzima heterólogo, p. ex. VZV TK, a um promotor específico do tecido.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para a construção de uma quimera mole11 cular como aqui definida, método esse que compreende a ligação de uma sequência de DNA que codifica a sequência codificante e o sinal de poliadenilação do gene para um enzima heterológo, p. ex. a timidina quinase de VZV, a uma sequência regulatória transcripcional específica do tecido de mamífero (p. ex. a sequência promotora e a sequência activadora).

A sequência codificante da timidina quinase de VZV e o sinal de poliadenilação 3' situam-se num fragmento de endonuclea se de restrição AccI/N de I de aproximadamente 1.381 bp (ver Fig. 2).

De preferência é o fragmento Accl/ /N de I de 1.381 bp contendo a sequência codificante de VZV TK e o sinal de poliadenilação que estã ligado às sequências de promotor e de activador específicos do tecido de mamífero, embora se possam usar outros fragmentos de DNA contendo o gene de VZV TK. Além disso, o sinal de poliadenilação de VZV TK pode ser substituído por outro sinal de poliadenilação adequado tal como o do vírus SV40 ou de outros genes de mamíferos.

De preferência,as sequências de pro motor e de activador seleccionam-se a partir das sequências regulatórias transcripcionais do oncogenes de albumina (ALB) , alfa-fetoproteína (AFP), antigene carcino-embriónico (CEA), tirosina hidroxilase, colina acetiltransferase, enola se específica de neurónio, proteína glial fibroacídica, insu lina, gama glutamiltranspeptidase, depois descarboxilase, HE R2/neu ou N-myc ou de outros genes adequados.

Estas quimeras moleculares podem ser fornecidas à célula em causa por um sistema distribuidor. Para administração a um paciente, é necessário dispôr de um sistema distribuidor eficiente in vivo que integre de uma forma estável a quimera molecular nas células. Os métodos conhecidos utilizam técnicas de transfecção de fosfato de cálcio, electroporação,microinjecção, transferência lopos somai, barragem balística ou infecção retroviral. Para uma revisão deste assunto veja-se Biotechnique,vol 6,N2 7, 1988.

A técnica da infecção retroviral de células para integrar genes artificiais emprega vectores de

transporte retrovirais conhecidos na especialidade (ver p. ex. Mol. and Cell Biol. Aug 86, p. 2895) . Essencialmente, preparam-se os vectores de transporte retroviral usando o DNA do retrovirus contido num plasmídeo. Estes plasmídeos contêm também as sequências necessárias para selecção e crescimento em bactérias. Os vectores de transporte retroviral constroem-se usando técnicas padrão de biologia molecular bem conhecidas da especialidade. Os vectores de transporte retroviral têm os genes retrovirais endógenos ori ginais removidas (p. ex. crag, pol e env) e têm inserida a se quência de DNA em causa, tal como as quimeras moleculares que têm sido descritas. Contêm contudo as sequências regulatórias retrovirais apropriadas para encapsidação virai, in serção proviral no genoma em causa, justaposição de mensagens, terminação e poliadenilação. Os vetores de transporte retrovirais foram derivados do vírus de leucemia rnurina Molo ney (Mo-MLV), mas também se podem usar outros retrovirus tal como o vírus do sarcoma murino Moloney com ele relaciona do. Certos vírus de DNA têm-se também mostrado úteis como sistemas de distribuição. 0 vírus de papilloma bovino [BPV] replica-se extracomossomalmente de modo que os sistemas de distribuição baseados em BPV têm a vantagem de o gene distri buído ser mantido de um modo não integrado.

Assim, de acordo com um terceiro as pecto,a presente invenção refere-se a vetores de transporte retrovirais contendo as quimeras moleculares acima definidas .

As vantagens de um sistema de trans ferência de genes mediado por retrovirus são a alta eficiên cia de distribuição do gene ao tecido em causa, integração específica da sequência em relação ao genoma virai (nas sequências de repetição terminal (LTR) 5' e 3') e pequena ocor rência de rearranjos do DNA distribuído comparada com outros sistemas de distribuição de DNA.De acordo com uma forma de concretização preferêncial, a presente invenção refere-se a um vector de transporte retroviral que compreende uma sequên cia de DNA contendo uma sequência LTR virai 5',uma sequência de encapsidação psi de acção cis,uma quimera molecular como “X definida acima e uma sequência LTR virai 2' (Figura 4A e figura 4B) .

Numa forma de concretização preferêncial, e para ajudar a eliminar a expressão não específica do tecido da quimera molecular, a quimera molecular colocase em orientação transcripcional oposta ao LTR retroviral 5' (figuura 4A e 4B) . Além disso, pode também incluir-se um gene marcador seleccionãvel dominante , transcripcionalmente derivado da sequência LTR 5'. Um tal gene marcador seleccionãvel dominante pode ser o gene NEO (aminoglicósido 3' fosfotransferase) de resistência à neomicina bacteriana, do tipo II, que confere em células encarióticas resistência ao análogo da neomicina G 418 sulfato (geneticina) (marca registada) , (figuras 4A e 4B) . 0 gene NEO ajuda a selecção de células de empacotamento que contêm essas sequências (ver abaixo).

vector retroviral usado nos exem pios é baseado no vírus de leucemia murina Moloney, mas podem usar-se também outros vectores. Têm sido descritos tais vectores contendo um gene NEO como marcador seleccionãvel, por exemplo, o vector N 2 (Science 230, 1395-1398 (1985)).

Um problema teórico associado com os vectores de transporte retrovirais é o potencial de sequências regulatórias (LTR) de repetição terminal retrovirais, que activam transcripcionalmente um oncogene celular no local de integração no genona hospedeiro. Este problema pode diminuir-se criando vectores SIN (figura 4A) . Os vectores SIN são vectores auto-inactivantes que contêm uma eliminação que compreende as regiões promotora e activadora no LTR retroviral. As sequências LTR dos vectores SIN não activam transcripcionalmente sequências genómicas 5 · ou 3’. A inactivação transcpcional das sequências (TR virais diminui a activaçâo insercíonal das sequências de DNA adjacentes da célula em causa e ajuda também à expessão seleccionada da quimera molecular distribuída. Os vectores SIN constroem-se por remoção de cerca de 299 bp na sequência • LTR virai 3' (Biotechniques, 4, 504-512 (1986)).

Deste modo os vectores de transporte retroviral preferenciais da presente invenção são vectores SIN.

Uma vez que se removeram destes veç tores de transporte os genes retroviriais originais gag, pol e env, pode utilizar-se um sistema de vírus auxiliar para introduzir os produtos genéticos retrovirais gag, pol e env in trans em relação ao empacotamento ou encapsidar o vector retroviral num virião infeccioso. Tal consegue-se utilizando linhas celulares packaging” especializadas, que são capazes de gerar vírus infecciosos sintéticos mas não são capazes de produzir qualquer vírus do tipo nativo detectável. Deste modo o vírus sintético artificial contém uma quimera da presente invenção empacotada em viriões infecciosos artificiais sintéticos livres do vírus auxiliar do tipo nativo. Isto baseia-se no facto de o vírus auxiliar, que está estavelmente integrado na célula de empacotamento, conter os genes estruturais virais mas não possuir a posição psi, uma sequência regulatória de acção cis que deve estar contida no RNA genõmico virai de modo a encapsidá-lo numa partícula virai infecciosa.

De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um virião infeccioso que compreende um vector de transporte retroviral como acima descri to sendo o referido vector encapsidado em proteínas virais de modo a criar um retrovirus infeccioso artificial, deficiente em replicação.

De preferência, o vector do transporte retroviral compreende um vector de transporte que contém uma quimera molecular com a sequência regulatória transcripcional de AFP ou ALB. Em particular, o vector de transporte contém uma quimera AFP/VZV TK ou uma quimera ALB/VZV TK. Para além da remoção da posição psi, podem fazer-se alterações adicionais às sequências regulatórias LTR do vírus auxiliar para assegurar que o vírus auxiliar não seja empaco tado em viriões e seja bloqueado a nível de transcripção re versa e da integração virai.

C .

“Stesroraoai

Em alternativa,os genes estruturais do vírus auxiliar (i.e. gag, pol e env) podem transferir-se individual e independentemente para a linha celular de empacotamento. Uma vez que estes genes estruturais virais estão separados no genoma celular de empacotamento há poucas hipóteses de as recombinações gerarem vírus do tipo nativo.

Num quinto aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação dos viriões infecciosos, de acordo com a presente invenção, por meio da distribuição do vector de transporte retroviral artificial compreendendo uma quimera molecular da invenção, como acima descrito, a uma linha celular de empacotamento.

A linha celular de empacotamento po de ter estavelmente integrada dentro dela um vírus auxiliar sem posição psi ou outra sequência regulatória como descrito acima ou, em alternativa, a linha celular de empacotamen to pode construir-se de modo a conter os genes estruturais do vírus auxiliar dentro do seu genoma.

A presente invenção refere-se a um virião infeccioso,como o descrito acima,para uso em terapia, particularmente para uso no tratamento do cancro e mais particularmente para uso no tratamento do HCC, carcinoma não seminomatoso do testis, certos teratocarcinomas e certos tumores gastrointestinais.

A expressão selectiva do enzima he terólogo, em particular do gene da timidina quinase de VZV efectua-se utilizando sequências regulatórias transcripcionais (p.ex. de activador e de promotor), específicas do teci do. A selectividade pode melhorar-se ainda mais por infecção selectiva de células do fígado. O gene retroviral eng presente na linha celular de empacotamento define a especifici dade para a infecção do hospedeiro. 0 gene env usado na cons trução da linha celular de empacotamento é modificado para gerar viriões infecciosos artificiais que infectam selectiva mente os hepatócitos. Como exemplo, pode modificar-se um ge ne env retroviral introduzido na célula de empacotamento de modo que a glicoproteína que envolve o virião infeccioso artificial infecte selectivamente os hepatócitos através da

ligação mediada pelo receptor específico utilizada pelo vírus da hepatite B (HBV) . 0 HBV infecta primariamente os hepatócitos através da ligação mediada pelo receptor específico. As proteínas HBV codificadas pelas sequências pre-S1 e pre-S2 desempenham um papel fundamental na ligação do HBV a hepatócitos (Hepadna Viruses editado por Robinson et al., 189-203, 205-221, 1987). O gene env da célula de empacotamento é modificado para incluir a posição de ligação ao hepatócito da grande proteína S envolvente do HBV. Tais modificações do gene env introduzido na célula de empacotamento podem efectuar-se por meio de técnicas padrão de biologia molecular bem conhecidas da especialidade,e facilitarão a incorporação virai no tecido em causa.

O virião infeccioso de acordo com a invenção pode formular-se por meio de técnicas bem conhecidas da especialidade e pode apresentar-se com uma formulação com um veículo adequado farmacêuticamente aceitável. Os veí culos farmacêuticamente aceitáveis,para este fim,compreendem um meio líquido adequado para utilização como veículo para introduzir o virião infeccioso no paciente. Um exemplo de um tal veículo é o soro fisiológico. O virião infeccioso pode encontrar-se em solução ou em suspensão nesse veículo. Podem também adicionar-se estabilizadores e anti-oxidantes e/ou outros excipientes às formulações farmacêuticas, que podem ser administradas a um mamífero por qualquer método convencional, por exemplo por via oral ou parenteral. Em particular, pode administrar-se o virião infeccioso por infusão intra-venosa ou intra-arterial. No caso do tratamento de HCC pode ser vantajosa a infusão arterial intra-hepãtica.

Deste modo, a presente invenção refere-se também a uma formulação farmacêutica que compreende um virião infeccioso misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Além disso, a presente invenção refere-se a processos de preparação de formulações farmacêuticas, como as acima descritas, caracterizados por se incorporar como ingrediente activo um virião infeccioso artificial,

contendo uma quimera molecular, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Embora se possa utilizar qualquer composto adequado, que possa ser selectivamente convertido pelo enzima, a presente invenção refere-se à utilização de compostos de fórmula I ou II para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancros, capaz de exprimir a timi dina quinase de VZV. Em particular, para uso no tratamento do carcinoma hepatocelular (HCC).

Conhecem-se como agentes anti VZV e citomegalovírus arabinósidos de purina 6-substituída, de fór mula I, os seus sais e equivalentes fisiológicamente funcionais, como indicado a seguir.

na qual

RI é haiogénio, alcooxilo ε_1-5, alcooxilo halo-substituído; um grupo amino mono- ou di-substituído por al quilo C_1-5, alquilo C_1-5 substituído por um ou mais átomos de fluor, cicloalquilo C₃_₆, ou um heterociclo de azoto contendo 4-7 ãtomos de carbono e uma ligação dupla opcionalmente, e

R² é hidrogénio, haiogénio ou amino, f'.

I 7

ίί&

e ο seu uso e sintese encontram-se descritos no registo de patente europeu publicado com o ns 0294114.

Os compostos de fórmula II, são do tipo a seguir indicado

em que

X representa um grupo vinileno ou etinileno;

I

R representa um grupo oxo ou ímino;

R representa um atomo de hidrogénio, alquilo ^um grupo alquilo C₃_^ ramificado ou cicloalquilo, p. ex. isopropilo ou ciclopropilo;

R³ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo acilo,

p.ex. alcanoilo ou benzoilo, opcionalmente substituído p.ex. por um ou mais substituintes halogénio, alquilo, hidroxilo ou alcooxilo; e

R⁴ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo,· desde que (a) quando R², R³ e R⁴ representem cada um um átomo de hidrogénio, R¹ não representa um grupo oxo.

E importante referir que quando R não é um grupo acilo, o composto de fórmula I ou II pode

existir na sua forma tautomérica. Em particular, os compostos preferi-dos de fórmula I e II são:

9-B-arabinofuranosil-6-metoxi-9H-purina e l-(B-D-arabinofuranosil)-5-propiniluracilo.

Estes compostos e os métodos para a sua síntese encontram-se descritos no registo de patente europeia publicado com o ns 0272065, e possuem actividade anti VZV.

Os nucleósidos de pirimidina e arabinósidos de purina acima mencionados incluem também os derivados farmacêuticamente aceitáveis desses compostos, ou seja qualquer sal, éster ou sal de éster farmacêuticamente aceitável, ou qualquer outro composto que, após administração a um ser humano, seja capaz de originar (directa ou indirectamente) o metabolito activo ou um seu resíduo. De preferência, o composto deve ser oralmente activo.

As quantidades e regime preciso de tratamento de um mamífero, serão evidentemente da responsabi lidade do médico assistente, e dependerão de vários factores incluindo o tipo e a gravidade da situação a tratar. Contu do, para o HCC é normalmente adequado para um tumor típico uma infusão arterial intra-hepãtica do virião infeccioso artificial a uma concentração entre 2 x 10⁵ e 2 x 10⁷ unidades de formação de colónias por ml (CFV/ml) de viriões infecciosos. A quantidade total de viriões na infusão dependerá do tamanho do tumor e será provávelmente distribuída em várias doses separadas.

Tratamento com drogas: A seguir à infecção com o virião infeccioso,administram-se os compostos de acordo com a invenção que requerem especificamente activi dade de VZV TK para o primeiro passo crítico de fosforilação em anabolismo com metabolitos citotóxicos ou citostáticos.

A dose da droga situar-se-á vantajo samente na gama de 0,1 a 250 mg por kg de peso corporal do paciente por dia, de preferência de 0,1 a 100 mg por kg de peso corporal.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção sem contudo a limitarem:

Exemplo 1

Construção da sequência requlatória transcripcional da quimera molecular da timidina quirase de albumina/VZV

Purificou-se um fragmento de DNA Acc I/Nde 1 com aproximadamente 1381 bp (pares de bases) (to dos os enzimas de restrição foram obtidos de Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg MD, USA; New England Biolabs Mass, USA; ou Promega, Madison, Wi, USA; todas as reacções enzimáticas se efectuaram como especificado pelo fornecedor) contendo a sequência codificante e o sinal de poliadenilação de gene de VZV TK, por meio de electroeluição usando uma câmara de electrofores elutrap (de Schleicher e Schuell, Keene, NH, USA) a partir de uma digestão com endonuclease de restrição de um plasmídeo com aproximadamente 4896 bp, designado por 22TK, contendo um fragmento EcoRI/Bam HI com aproxinadamente 2200 bp do genoma de VZV TK (Virology 149. 1-9, 1986; fornecido por J. Ostrove, NIH, Bethesda, Md.). 0 frag mento de DNA purificado contém a sequência completa que codi fica a VZV TK e o sinal de poliadenilação, mas não inclui quaisquer elementos promocionais de VZV TK (ver Fig. 2A e 2B) .

Os extremos 5' salientes do fragmen to purificado A cc I/Nde I VZV TK com 1381 bp foram aplanados por tratamento com o fragmento de Klenow da DNA polimera se I de E. coli (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) e trifosfato de desoxinucleótido (d NTPs).

Obteve-se um plasmídio com aproxima damente 5249 bp, designado por 2335 A-l, contendo aproximada mente 2300 bp de uma sequência ALB E/P,fornecido por Richard Palmiter (Universidade de Washington, Seatle, Washinton, USA) . Esta construção contém sequências necessárias para a expressão específica do fígado mas faltam-lhe sequências intervenientes não essenciais. Existe uma única posição de reconhecimento de endonuclease de restrição Bam HI, na posi ção + 23 em relação ao início da transcripção. O plasmídeo 2335 A-l digeriu-se com a endonuclease de restrição Bam HI e aplanaram-se os extremos 5' salientes por tratamento com Klenow dNTPs, como descrito acima.

Construiu-se a quimera ALB G/P VZV TK ligando o fragmento de extremos planos Acc I-Nde I, contendo as sequências codificante e poliodenilação de VZV TK, à posição BamHI de extremo plano do 2335A-1, usando T4 DNA ligase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg,MD), criando-se o PCR 73 (Fig. 5) . De modo análogo a todas as ligações descritas, a orientação dos fragmentos ligados foi determinada por digestões com endonuclease de restrição,por métodos bem conhecidos da especialidade. De modo análogo a todos os plasmídeos descritos em todos os exemplos, o pCR 73 contém as sequências essenciais necessárias para a replicação em bactérias e adequadas para amplificação por métodos bem conhecidos da especialidade. A quimera ALB E/P VZV TK purificou-se por electroeluição a partir do pCR 73, como um fragmento de endonuclease de restrição Sst I/kpnl com aproximadamente 3880 bp (Fig. 5). Os extremos salientes 3' aplanaram-se por tratamento com T4 DNA polimerase e dNTPs. Este fragmento de restrição de extremos planos Sstl/Kpn I foi posteriormente introduzido num sistema de vector de transporte retroviral do vírus da leucemia murina de Moloney (ver abaixo, exemplo 3).

Registou-se o pCR 73 no ATTC a 18 de Agosto de 1989 com o n2. ATTC 68077.

Exemplo 2

Construção da sequência regulatória transcripcional da alfa-fetoproteína/VZV timidina quinase

Isolou-se a sequência codificante e a posição de poliadenilação da timidina quinase de VZV como um fragmento de endonuclease de restrição BamHI - Xmn I com aproximadamente 3300 bp, pCR 73 (Figura 6). O extremo salien te 5' da posição de restrição de endonuclease BamHI tornou-se plano por tratamento com Klenow e dNTPs. Este fragmento de DNA contém a sequência codificante completa e a posição de poliadenilação do gene de VZV TK mas não contém quaisquer sequências activadoras ou promotoras. Obteve-se um plasmídeo com aproximadamente 9996 bp, o pAF 5.1 CAT, contendo um DNA 5' de AFP humana com aproximadamente 5100 bp, fornecido por T. Tamaoki, Univ. de Calgary, Canada. Isolou-se

um fragmento de DNA indo de aproximadmente - 5,1 kb a + 29 Kb do gene de AFP humano, a partir do pAF5. l-CAT, por digestão com Xmnl e digestão parcial com Hind III. Ligou-se este fragmento XmnI/Hind III ao fragmento BamHI/Xmnl VZV TK, usando T4 DNA ligase para formar o pCR 77 (Fig. 6) . Purificou-se a guimera AFP E/P VZV TK por electroeluição a par tir do pCR 77 como um fragmento de endonuclease de restrição Aat II/PstI com 6699 bp. Este fragmento tratou-se depois com T4 DNA polimerase e dNTPs, como no exemplo 1, para se obter um fragmento de restrição de extremos planos.

pCR 77 registou-se no ATCC a 18 de Agosto de 1989 com o nS. ATCC 68079.

Exemplo 3

Construção de um vector de transporte retroviral contendo a quimera molecular do exemplo 1

Construiu-se o vector de transporte retroviral, pCR 74, contendo a quimera ALB E/P VZV TK, li gando o fragmento de pCR 73 de extremos plamns purificado Sst I/kpnl num vector retroviral de leucemia murina de Moloney, designado por N2 (XM5)(Science 230, 1395-1398), 1985) fornecido por S. Karrlson, NIH, Bethesda, MD, USA. Digeriu-se ο N2 (XM5) com a endonuclease de restrição Xho I e aplanaram-se os extremos salientes 5' por tratamento com Klenow e dNTPs antes de se ligar ao fragmento pCR 73 Sst Ι/Κρη I usando T4 DNA ligase (Fig. 5).

Caracterizou-se o vector de transporte retroviral pCR 74 contendo a quimera ALB E/P VZV TK por mapping” com endonuclease de restrição e sequenciação de DNA para confirmar a sequência primária. A sequência que flanqueia a junção de ALB E/P VZP TK às sequências de VZV TK encontra-se apresentada na figura 7.

Registou-se o pCR 74 no ATCC a 18 de Agosto de 1989,com o na ATCC 68078.

Exemplo 4

Construção de um vector de transporte retroviral contendo a quimera molecular do exemplo 2

Construiu-se o vector de transporte retroviral pCR 78 (Fig. 6) ligando um fragmento de pCR 77, cexax™

^l%.

».··<♦*

Aat II/Pst I purificado, contendo a quimera AFP E/P VZV TK ao N2 (XM5) , que se digeriu com Xhol e se aplanou nos extremos com T4 DNA polimerase e dNTPs, como descrito no exemplo 3. Caracterizou-se o vector de transporte retroviral pCR 78 contendo a quimera AFP E/P VZV TK, por mapping com endonuclease de restrição e sequenciação do DNA para confirmar a sequência primária. A sequência que flanqueia a junção da AFP E/P às sequências de VZV TK encontra-se apresentada na figura 8.

Registou-se o pCR 78 no ATCC a 18 de Agosto de 1989,com o ns ATCC 68080.

Exemplo 5 Produção de vírus

A linha celular de empacotamento, chamada PA 317, obtida a partir do ATCC(ATCC CRL 9078), previamente descrita, tem três alterações contidas na sequência regulatória psi 5' LTR e 3' LTR (Mol. and Cell Biol 6, n28, 2895-2902 [1986]). A construção retroviral artificial descrita nos exemplos 3 e 4 introduz-se na linha celular de empacotamento por electroporação ou infecção. Para a electroporação, electroporam-se 20 pg de DNA plasmideo linearizado em 2 milhões de células PA 317 em sacarose temporizada com fosfato, usando 280 volts, 25 microforads de capacitância, num volume total de 0,8 ml. Podem obter-se pelo menos 150 colónias resistentes G418/20 pg de DNA plasmídeo/2 milhões de células PA 317. Para a infecção, electroporam-se 20 pg de DNA plasmideo linearizado com 2 milhões de células de empacotamento ecotrópicas, tais como células Psi 2. Dois dias mais tarde, utiliza-se a camada sobrenadante de cultura para infectar a linha celular de empacotamento anfotrófica PA 317 e isolam-se as colónias resistentes 418. Em ambas as técnicas, electroporação e infecção, as colónias resistentes G418 são células isoladas clonadas pelo método da diluição limitante e analisadas por Southern blot e tituladas em células NIH 3T3(ATCC), para identificar o maior produtor de virus de comprimento completo. Para as células PA 317 contendo pCR 74,isolaram-se 17 clonos de células simples e extraiu -se o DNA de 10 destes clonos. Efectuaram-se análises de %

*yr

Southern blot exaustivas, usando vários enzimas endonuclea se de restrição e sequências NEO e VZV TK como amostras de hibridação radioactivas, nestas 10 amostras de DNA. Destes 10 clonos analisados, dois não mostraram qualquer sinal de truncagem sendo por isso considerados de comprimento completo. Para as células PA 317 contendo pCR 78, isolaram-se 29 clonos de células simples e isolou-se o DNA de 25 clonos. Efectuaram-se análises de Southern exaustivas, usando várias enzimas endonuclease de restrição e sequências AFP, NEO e VZV TK como amostras de inibição radioactivas, nestas 25 amostras. Dos 25 clonos analisados, 5 não mostraram quais quer sinais de truncagem e consideraram-se por isso de comprimento completo. Todas as linhas celulares de empacotamento, contendo uma sequência virai de comprimento completo, se titularam em células NIH 3T3, que eram menos/menos em timidina quinase, usando técnicas padrão.

Exemplo 6

Infecção de uma linha celular de hepatoma humano (controle positivo) com viriões infecciosos de comprimento completo do exemplo 5 contendo ALB/VZV TK ou AFP/VZV TK, com medições subsequentes da actividade de VZV TK, produção de ATP ara e sensibilidade à droga

Usaram-se os retrovirus artificiais, deficientes em replicação e de comprimento completo,con tendo a quimera ALB/VZV TK ou a quimera AFP/VZV TK, para infectar uma linha célular de hepatoma humano chamada Hep G2 (ATCC HB 8065) . A seguir à infecção e à selecção em 1 mg de geneticina/ml (marca registada), testaram-se as células em relação à actividade de VZV TK. Além disso, incubaram-se as células na presença de 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi• ·

-9H-punna marcada com H (designada por ara-m nas tabelas e figuras seguintes) com medição subsequente do ATP ara. Final mente,cultivaram-se as células na presença do composto acima mencionado e determinou-se o valor IC₅₀ (inibição do crescimento) . As células infectadas sem vírus ou com vírus N2 ser vem como controle para estas experiências. O vírus N2 não contém material genético VZV TK.

t*-?sas&sa

Α tabela 1 mostra que as células de hepatoma humano infectadas com vírus contendo pCR 74 ou pCR 78 têm 904 vezes ou 52 vezes mais actividade de VZV, respectivamente, comparadas com as células de controle.

9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina (designada por ara-m) pode ser selectivamente fos forilada por VZV TK com subsequente anabolismo a ATP ara ci totóxico. A figura 9 mostra que as células Hep G2 infectadas com vírus contendo pCR 74 ou pCR 78 e incubadas na presença de 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H₃-purina marcada com

O O

H, têm quantidades significativas de ATP ara ( H) citotóxica formada.

Incubaram-se células Hep G2 infecta das com retrovirus deficientes em replicação, de comprimento completo, contendo a primeira ALB/VZV TK (pCR 74) ou a quime ra AFP/VZV TK (pCR 78) , na presença de quantidades variadas de 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina, durante 5 dias e determinou-se a inibição do crescimento pelo número de células e teor em DNA.

A tabela 2 mostra que o IC₅₀ (50% de inibição de crescimento) da 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina é maior do que 2000 μΜ nas células Hep G2 de controle e infectadas com N2. Em células Hep G2 infectadas com retrovirus artificiais deficientes em replicação de comprimento completo, contendo a quimera ALB/VZV TK (pCR 74) ou a quimera AFP/VZV TK (pCR 78) , os valores de IC_5Q foram de 5 μΜ e 175 μΜ, respectivamente. A clonagem de células simples de células Hep G2 contendo a quimera AFP/VZV TK (pCR 78) indicou que os níveis de IC₅₀ da 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina podem ainda ser diminuídos até aproximadamente 40 μΜ.

Exemplo 7

Selectividade de expressão de VZV/TK

Infectaram-se cinco linhas celulares de não hepatoma humano com retrovirus artificiais deficientes em replicação, de comprimento completo, contendo a quimera ALB/VZV TK (pCR 74) . Estas linhas celulares eram WiDR (ATCC CCL 218),IMR 90 (ATCC CCL 186), MCF7(ATCC HTB22),

-i-LianSjSs;

Detroit 555(ATCC CCL 110) e SW480 (ATCC CCL 228) .A seguir à infecção e à solução em geneticina (marca registada), testaram-se estas células em relação à actividade de VZV TK e à inibição de crescimento na presença de 9-(B-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina, como descrito acima. Não houve aumento da actividade de VZV TK ou de sensibilidade à droga 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-metoxi-9H-purina nestas cinco linhas celulares de não hepatoma infectadas com retrovirus artificiais deficientes em replicação, de comprimento completo, contendo a quimera ALB/VZV TK (pCR 74) , comparado com linhas celulares análogas não infectadas. Isto mostra a selectividade da expressão de VZV TK em células de hepatoma em relação a células de não hepatoma.

Tabela 1

Actividade de VZV TK em células Hep G2 infectadas com retrovirus artificiais deficientes em replicação,de comprimento completo, contendo a quimera ALB/VZV TK (pCR 74) ou a quimera AFP/VZV TK (pCR 78). Quantificou-se a actividade de VZV TK com a quantidade de M ara fosforilado por mg de proteína celular por 30 minutos.

Vírus	Actividade Enzimática VZV TK	Aumento
nMoles de MP ara/ucf de proteína
30 minutos
Nenhum	9	Ox
N2	4	Ox
pCR74	4521	904x
pCR78	258	52x

Tabela 2

Inibição de crescimento em células Hep G2 infectadas com retrovirus artificiais deficientes em replicação, de comprimento completo, contendo a quimera ALB/ /VZV TK (pCR 74) ou a quimera AFP/VZV TK (pCR 78).

Vírus	IC_5Q para a 9-(β-D-arabinofuranosil)-6-me- tóxi-9H-purina
Nenhum	>2000μΜ
N2	>2000μΜ
pCR74	5μΜ
pCR78	175μΜ

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã Processo para a preparação de uma quimera molecular caracterizado por se ligar uma sequência regulatória transcripcional capaz de ser selectivamente activada numa célula de mamífero, com uma sequência de DNA que codifica um enzima heterõlogo, enzima essa que é capaz de ca talizar a produção de um agente tóxico para a célula em causa.

- 2§ Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência regulatória transcripcional conter um promotor.

_ ₃a _

Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a sequência de DNA que codifica o enzima conter adicionalmente um sinal de poliadenilação no sentido descendente da cadeia do enzima.

- ₄â Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3 caracterizado por se ligar também uma sequência de activador â sequência de DNA que codifica o enzima heterõlogo.

_ ₅a _

Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com qualquer das reivindicações 2 ou 4 caracterizado por se seleccionar o promotor de entre os promotores da albumina, alfafeto-proteína, antigene carcino-embriónico, tirosina hidroxilase, colina acetil transferase, enolase específica de neurão, proteína glial fibro ácida, insulina, gamaglutaniltranspeptidase, dopa decarboxilase, oncogenes HER2/neu e N-myc.

- 6ã Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com a reivindicação 4, caracte30 ai«T£a«B rizado por se seleccionar o activador de entre os activadores de albumina, alfafeto-proteína, antigene carcino-embriónico, tirosina hidroxilase, colina acetiltransferase, protei na glial fibro ácida, insulina, gamaglutaniltranspeptidase, dopa descarboxilase e oncogenes HER2/neu e N-myc.

_ 7ã Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por se seleccionar o enzima de entre o seguinte grupo: timidina quinase do vírus de varicella zoster, carboxipeptidase G2, fosfatase alcalina, penicilina-V amidase, e desaminase de citosina de não-mamíferos.

- 8§ Processo para a preparação de uma quimera molecular, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 caracterizado por o enzima ser a timidina quinase do vírus de varicella zoster.

- ga _

Processo para a preparação de uma quimera molecular, contendo uma sequência de DNA que codifica o gene da timidina quinase do vírus de varicella zoster operativamente ligada à sequência regulatória transcripcional da albumina, caracterizado por se ligar a sequência de DNA à sequência regulatória transcripcional.

- 10- Processo para a preparação de uma quimera molecular, contendo uma sequência de DNA que codifica para a timidina quinase do vírus de varicella zoster operativamente ligada à sequência regulatória transcripcional da alfafeto-proteína, caracterizado por se ligar a sequência de DNA à sequência regulatória transcripcional.

- llã Processo para a preparação de um vector de transporte retroviral contendo uma quimera molecular quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10,caracterizado por se ligar sequências de DNA contendo uma sequência LTR 5' virai, uma sequência de encapsidação psi de acção cis, a quimera molecular de acordo com

J o processo de qualquer das reivindicações 1 a 10, e um LTR 3' virai.

- 12 a Processo para a preparação de um vector de transporte retroviral, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a quimera molecular estar colocada na orientação transcripcional oposta à sequência LTR 5' virai.

- 133 Processo para a preparação de um vector de transporte retroviral, de acordo com as reivindica ções 11 ou 12,caracterizado por se incorporar adicionalmente um gene marcador seleccionável ao vector de transporte retro virai.

- 143 Processo para a preparação de um vector de transporte retroviral, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o gene marcador seleccionável ser o gene aminoglicósido 3'-fosfotransferase do Tipo II (NEO).

- 153 Processo para a preparação de um vi rião infectante, caracterizado por se encapsidar um vector de transporte retroviral, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 14, no virião.

- 163 Processo para a preparação de um vi rião infectante, caracterizado por se introduzir um vector de transporte retroviral numa estirpe celular de empacotamento .

- 173 Processo para a preparação de um vi rião infectante capaz de provocar uma infecção selectiva na célula a que se destina, caracterizado por se modificar a proteína env do virião de modo a facilitar a ligação celular à célula em causa.

- 183 Processo para a preparação de uma formulação farmacêutica, caracterizado por se misturar um vi rião infectante, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 15, com um veículo farmaceuticamente ade quado.

A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 30 de Agosto de 1989, sob o n². 8919607.5.