HUT58814A - Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer - Google Patents

Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer Download PDF

Info

Publication number
HUT58814A
HUT58814A HU905679A HU567990A HUT58814A HU T58814 A HUT58814 A HU T58814A HU 905679 A HU905679 A HU 905679A HU 567990 A HU567990 A HU 567990A HU T58814 A HUT58814 A HU T58814A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
vzv
gene
promoter
enzyme
Prior art date
Application number
HU905679A
Other languages
English (en)
Other versions
HU905679D0 (en
Inventor
Brian Huber
Cynthia Ann Richards
Thomas Anthony Krenitsky
Original Assignee
Wellcome Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wellcome Found filed Critical Wellcome Found
Publication of HU905679D0 publication Critical patent/HU905679D0/hu
Publication of HUT58814A publication Critical patent/HUT58814A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01021—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

A jelen találmányfmolekuláris kimérákkal, fertőző virionokkai, ezek előállítási eljárásaival, az ezeket tartalmazó gyógyászati készítményekkel, ezen gyógyászati készítmények terápiás alkalmazásával, ezen belül elsősorban vírus-irányított enzim — előgyógyszer terápiával főleg rákok, különösen májsejtkarcinóma kezelésében. Foglalkozik továbbá a találmány olyan szerek alkalmazásával, amelyeket heterológ enzimek képesek katalizálni citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká, pl. purin arabinozidokká és helyettesített pirimidinekké a vírus-irányjtott enzim előgyógyszer terápiában.
A rák összes formája a nQűxhixiiiás főbb okai között szerepel szerte a világon. A rák kemoterápiájának területén végzett kutatás sokféle tumorellenes szert alakított ki^amelyek különböznek a hatékonyság mértékében. A mázott^szerek között találjuk pl.
standard, klinikailag alkalaz adriamicint, aktinomicin D-t, metotrexátot, 5-fluor-uracilt, cisz-platiniumot, vinkrisztint és vinblasztint. Ezekről a jelenleg rendelkezésre álló tumorellenes í ' ' t szerekről azonban ismert, hogy számos hátrányuk van, ilyenek pl.
a toxicitás egészséges sejtekre, ^e-llenállóképessége·. Ismeretesek továbbá bizonyos tumor-típusok a terápia más formái is, pl. a sebészi beavatkozás. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy továbbra is szükségesek új megközelítések és gyógyszerkombinációk a rák-terápiában.
A májsejt-karcinóma (hepatocellular carcinoma;
HCC) egyike a legfőbb rosszindulatú betegségeknek ma a világon;
ennek előfordulása a legjelentősebb Japánban, Kínában, Ázsia más részeiben és a Szahara alatti Afrikában. A jelenlegi bizonyítékok azt sugallják, hogy a májsejt-karcinóma előfordulása emelkedőben van
Európában és Észak-Amerikában is. Ez a betegség a becslések szerint mintegy 1,250 000 halálos áldozatot szed évente, és ezzel szám szerint a világ egyik legfőbb rosszindulatú betegsége.
A HOC prognózisa igen kevéssé bíztató: az elterjedtségi gyakoriság aránya csaknem azonos a halálozási arányával. A diagnózis után az átlagos túlélési idő kevesebb, mint négy hónap. A * hosszú távú túlélés, amelyet úgy határozunk meg, hogy a diagnózistól számítva egy évnél több, csak alkalmanként fordul elő.
( . A legtöbb HCC beteg úgy pusztul el, hogy vagy a májelégtelenség kJ.
komplikációi lépnek fel ,heveny vérzéssel vagy a nélkül, vagy egy nagy tumor tömegének általános hatásai lépnek fel leromlással, alultápláltsággal, fertőzéssel és vérmérgezéssel. Mivel távoli j áttételek is kialakulnak (haláluk időpontjában a betegek 90 %* ának van áttételes tumora), gyakran a helyi betegségek korlátozzák a túlélést. Következésképpen ha a máj-tumor leküzdésére irá/ nyúló terápiák esetleg alkalmasak is lennének, számolni kell az_ zal, hogy nagy jelentősége van az áttételes betegség leküzdésének is j_Kew M.C.: Postgraduate Medical Journal 59 (szupp*Sementum) 78-87 (1983); Berk P. (szerkesztő): Seminars in Liver Disease £ (2), kiadó: Thieme-Strattofi Inc., New York, New York (1984)j.
A jelenleg az orvosok számára rendelkezésre álló terápiák összességében hatástalanok ennek a betegségnek a gyógyítására [^Nerenstone és munkatársai: Cancer Treatment Reviews 15, 1-31 (1988)j . Mindezideig a sebészeti beavatkozás az egyetlen lehetséges gyógymód. A diagnózis időpontjában azonban a betegek túlnyomó többsége már nem képes arra, hogy radikális sebészi beavatkozásnak vesse alá magát. Bizonyos tanulmányokból (lásd pl. Nerenstone és munkatársai fentebb idézett munkáját) az derül ki, hogy a betegeknek kevesebb, mint 3 %-át lehet tekinteni sebészi beavatkozás alá vethetőnek; ezek közül is mintegy 50 % hal meg operáció utáni szövődményekben (Nerenstone és munkatársai, fentebb idézett mur>ka).
A szisztematikus egyedi kemoterápia és a besugárzással kombinált kemoterápia viszonylag hatástalan; ez a tény különösen kiemeli, hogy ezen betegség kezeléséhez új megközelítések és terápiák szükségesek.
\ A génterápia új gének stabil integrálódását foglalja magában egy adott célsejtbe, valamint ezen gének kifejeződését;
ezek a gének, ha megfelelően épültek be, megváltoztatják az adott célsejt fenotípusát íezzel kapcsolatban lásd Anderson W.F. öszszefoglaló közleményét: Science 224, 401-409 (1984); valamint McCormick D. összefoglaló közleményét: Biotechnology 690-693 (1985)] . A- génterápia előnyös lehet olyan genetikai betegségek kezelésére, amelyben egy hiányos vagy hiányzó enzimet kell helyettesíteni, ilyen enzim pl. a hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz a Lesch-Nyhan betegségben; a purin nukleozid foszforiláz a súlyos immunhiányos betegségben (severe immunodeficiency disease), és az adenozin dezamináz az elkülönült kombinált immunhiányos betegségben (severed combined immunodeficiency disease). Eddig azonban még a klinikai gyakorlatban a génterápiát nem alkalmazták, bár bizonyos rendellenességekben a génterápia bizonyos típusainak alkalmazása már küszöbön áll.
A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy szelektíven fel lehet tartóztatni az emlős karcinóma sejtek növekedését, vagy el lehet pusztítani ezeket olyan kémiai szerekkel, amelyek képesek szelektíven átalakulni citotoxikus vagy citosztatikus ·· metabolitokká. Ezt egy olyan molekuláris kiméra megalkotásával érhetjük el, amely egy cél szövet-fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciát (transcriptional regulatory sequervce, TRS) tartalmaz; ez szelektíven aktiválódik a cél szövetekben, pl. rákos sejtekben/’, és ez szabályozza egy heterológ enzim kifejeződését. Ezt a molekuláris kimérát megfelelő vektorokkal manipulálhatjuk és beépíthetjük valamely fertőző virionba. Amikor beadunk egy, a molekuláris kimérát tartalmazó fertőző viriont a betegbe, az enzim szelektíven kifejeződik a célsejtben. Ezután in situ elvégezhetjük olyan vegyületek beadását, amelyeket az enzim szelektíven metabolizál olyan metabolitokká, amelyek vagy tovább metabolizálódnak tényleges citotoxikus vagy citosztatikus szerekké, vagy már maguk is ilyen szerek.
A találmány általánosan alkalmazható; a bejelentésben a májsejt-karcinómára vonatkozóan mutatunk be példákat.
Amint fentebb említettük, a májsejt-karcinómában szenvedő betegek túlnyomó többsége a primer tumorban hal meg. A HCC betegek mintegy 90 %-ában a/onban haláluk időpontjában egyértelmű áttételes betegségek is léteznek. Ezek az áttételek a primer tumor tipikus fenű,£ípusát mutatják, ezek az áttételek is kifejezik tehát szelektíven a heterológ enzimet és így szelektíven aktiválják a beadott vegyületeket a fentebb leírt citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká.
Egy sor enzim- előgyógyszer kombinációt alkalmazhatunk; az a feltétel, hogy az enzim képes legyqn szelektíven aktiválni a beadott vegyületet vagy közvetlenül, vagy egy intermedieren keresztül egy citosztatikus vagy citotoxikus metabolittá. A vegyület kiválasztása függ az alkalmazott enzimrendszertől; a vegyü letnek azonban szelektíven metabolizálódnia kell az enzim segítségével - közvetve vagy közvetlenül - egy citotoxikus vagy citosztatikus metabolittá. A heterolog enzim kifejezés, ahogy itt használjuk, olyan enzimre utal, amely a szelektivitás megfelelő jellemzőit mutatja.
A Varicella zoster vírus (VZV) egy fajlagos timidin kinéz fehérjét kódol. A gént már klónozták , szekvenciáját elemezték és jellemezték [j. Gén. Virol. 67, 1759-1816 (1986)J. A VZV timidin kináz, az emlős enzimekkel ellentétben, szelektíven mono-foszforilezi a speciális purin arabinozidokat és helyettesített pirimidin vegyületeket. A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy bizonyos purin- és pirimidin analógok, elsősorban a (I) és (II) képlettel jellemzettek, citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká alakulnak át speciális emlős sejtekben, amelyek genetikailag úgy vannak módosítva, hogy szelektíven fejezzenek ki VZV timidin kiná zt . így pl. a 9(p-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9]ípurin átalakul 9-p-D-arabinofuranozil adenin trifoszfáttá (Ara ATP).
A további enzim- elő gyógyszer kombinációk közt találjuk a bakteriális (pl. Pseudomonasból származó) G2 karboxi-peptidázt a para-N-bisz(2-klőr-etil)-amino-benzoil-glutaminsav előgyógyszerrel. Amikor ebből a vegyületből a glutaminsavat lehasítjuk, toxikus benzoesav-mustár szabadul fel. Az inaktív, foszforilezett vegyületek pedig alkálikus foszfatáz (pl. borjűbél-foszfatáz) segítségével toxikus, defoszforilezett termékekké alakulnak át; az ilyen inaktív foszforvegyületekre példa lehet az etopozidfoszfát, doxorubicin-foszfát, vagy a mitomicin-foszfát. A penicillin V amidáz a doxorubicin és melfalan fenoxi-acetamid szár• · • · · ··· ·
9 · · · ·«·· ···· ·♦· ·· ··*
- 7 mazékait toxikus metabolitokká alakítja át; és a gomba eredetű (pl. Fusarium oxisporumból kapott) citozin dezamináz az 5-fluorcitozint a toxikus 5-fluor-uracillá alakítja át.
Az emlős sejtekben bizonyos gének gyakorlatilag mindenütt kifejeződnek. A legtöbb gén azonban időlegesen és/vagy szövet-fajlagos módon fejeződik ki, vagy sejten kívüli induktorokra adott válaszra aktiválódik; így pl. bizonyos gének csak az ontogenezis nagyon pontos időpontjaiban íródnak át aktívan, vagy csak bizonyos indukáló stimulálásra adott válaszra íródnak át. Ezt a szabályozást részben a transzkripciós szabályozó szekvenciák (amelyek pl. promotor és fokozó szabályozó DNS szekvenciák) és a szekvenciaspecifikus, DNS-kötő transzkripciós fehérje faktorok közti kölcsönhatás közvetíti.
A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy bizonyos emlős szöveteket, pl. májszöveteket vagy transzformált májszöveteket meg lehet változtatni olyan módon, hogy szelektíven fejezzen ki valamely fentebb meghatározott heterológ enzimet, pl. VZV timidin kinázt. Ezt molekuláris kimérák megalkotásával lehet elérni valamely kifejező kazettában.
Maguk a kifejező kazetták jól ismertek a molekuláris biológia szakterületén. Egy ilyen kifejező kazettának tartalmaznia kell az összes olyan esszenciális DNS szekvenciát, amely a heterológ enzim kifejezéséhez szükséges valamely emlős sejtben, íc^y pl. egy előnyös kifejező kazetta olyan molekuláris kimérát tartalmaz, amelyen belül megtalálható a VZV TK kódoló szekvenciája, valamely emlős génhez megfelelő poliadenilező szignál (pl. egy olyan poliadenilező szignál, am^ly működőképes emlős sejtekben), továbbá megtalálhatók megfelelő fokozok és promotor szekvenciák a korrekt orientációban.
• · · ♦ ·· ·· ·· • · · · • · • · ···· ····
Emlős sejtekben normálisan kétféle DNS szekvencia szükséges y a hírvivő RNS-eket kódoló gének teljes és hatékony szabályozásához: promotorok és fokozok (enhancerek). A promotorok közvetlenül a transzkripció rajthelyétől fölfelé (5’ felé) helyezkednek el. A promotor szekvenciák a transzkripció pontos és hatékony beindításához szükségesek. Különböző génfajlagos promotorok feltárják a közös szervezettségi formákat. Egy tipikus promotor magában foglal egy AT-ben gazdag területet, amelyet TATA doboz-nak hívnak (és amely mintegy 30 bázispárral a transzkripciós beindító rajthelytől 5’-felé helyezkedik el), .y továbbá egy vagy több fölfelé levő promotor elemet (upstream promoter element, UPE). Az UPE-k fő célpontok a lényegesebb szekvencia-fajlagos transzkripciós faktorokkal történő kölcsönhatáshoz. A promotor szekvenciák aktivitását más szekvenciák módosíthatják; ezeket fokozóknak nevezzük. A fokozó szekvenciák lehetnek nagy távolságban a promotortól, attól vagy fölfelé (5’) vagy lefelé (3’) helyezkedve el. A fokozok orientációtól és helytől független módon működnek. A hasonló szerkezeti szervezettségre és működésre alapozva, amelyek cserélhetők, az abszolút távolság a promotorok és fokozok között bizonyos mértékig önkényes. A f-okozók a promotor szekvenciákból kiinduló transzkripcTB arányát növelik. Ez a fokozás elsősorban kölcsönhatás az UPE-val társult szekvencia-fajlagos transzkripciós faktorok és azok között a fokozók között, amelyek képessé teszik az emlős sejteket arra, hogy szövet-fajlagos génkifejezést érjenek el. Ezeknek az UPE-hoz kötött transzkripciós fehérje faktoroknak (szövet-fajlagos, transzaktiváló faktorok) és a fokozóknak (cisz-működő, szabályozó szekvenciák) jelenléte képessé teszi a transzkripciós gépezet más komponenseit, beleértve az RNS polimerázt is, hogy beindítsák a transzkripciót szövet-fajlagos szelektivitással és pontossággal.
A transzkripciós szabályozó szekvencia, főleg a promotor és fokozó szekvencia kiválasztása függ a célzott szövettől. Erre példaként felhozhatjuk az albumin (ALB) és alfa-fetoprotein (AFP) transzkripciós szabályozó szekvenciát (pl. a promotort és fokozót), amelyek normál hepatocitákra, illetve transzformált hepatocitákra fajlagosak ; a karcino-embrionális antigén (CEA) transzkripciós szekvenciáját az emésztőtraktus, tüdő, emlő és más szöp vetek transzformált sejtjeiben való felhasználáshoz; a tirozin hidroxiláz, kolin-acetil-transzferáz vagy neuron-fajlagos enoláz transzkripciós szabályozó szekvenciáját neuroblasztómákban való felhasználáshoz; a glia rost savas fehérje transzkripciós szabályozó szekvenciáját gliómákban való felhasználáshoz; az inzulin transzkripciós szabályozó szekvenciáját a hasnyálmirigy tumorjaiban való alkalmazáshoz.
A további példák között találjuk a gamma-glutamil-transzpeptidázra fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciát bizonyos májtumorokban való felhasználáshoz, továDbá a dopa-dékarboxilázt a tüdő bizonyos tumorjaiban való felhasználáshoz.
Ezen kívül bizonyos onkogénekből való transzkripciós szabályozó szekvenciákat is alkalmazhatunk, mivel ezek lényegében csak bizonyos tumor-típusokban fejeződnek ki. Ezekre jó példák lehetnek a HER-2/neu onkogén szabályozó szekvencia, amely emlőtumorokban fejeződik ki, és az N-myc on nre fajlagos szabá-
lyozó szekvencia neuroblasztómákhoz.
Az ALB és AFP gének erőteljes homológiát mutatnak a nukleinsav-szekvencia, a génszerkezet, az aminosav-szekvencia és a másodlagos fehérje összehajtogatottság tekintetében kapcsolatban lásd Ingram és munkatársai összefoglaló munkáját: PNAS • β
78, 4694-4698(1981)1. Ezek a gének függetlenül, de ellentétesen fejeződne!? ki az ontogenezis során. A normális fejlődésben az ALB transzkripció röviddel a születés előtt beindul, és folytatódik * végig az egész felnőtt koron. Az ALB transzkripciós kifejezése a felnőttekben a májra korlátozódik. Az AFP normálisan az embriómájban, a petehurok belső csíralemezében és az embrió gyomor-bél traktusban fejeződik ki, de röviddel a születés után kimutathatatlanság szintjére csökken és jelentősen nem fejeződik ki nem-patogén és nem-regenerálódó felnőtt májban vagy más normál felnőtt szövetekben. HCC esetében azonban az AFP transzkripcióba felnőtt májban gyakran drámaian megnövekszik.
AFP transzkripció továbbá emelkedhet a here nem magra ható és kevert karcinómája, a^_endodermális testüreg tumorok, bizonyos teratokarcinómák és bizonyos gyomor-bélrendszeri tumorok esetében is. Az AFP és ALB máj-speci fikus kifejeződése génjeik szabályozó szekvenciáinak kölcsönhatásaiból ered a máj belső extraktumaiban található transzéktiváló transzkripciós faktorokkal. Az AFP és ALB transzkripciós szabályozó szekvenciák előnyösek molekulárisán kombinált gének hepatóma-fajlagos illetve általánosan máj-fajlagos kifejeződésének kialakítására, mivel az AFP és ALB gének transzkripciós szinten szabályozhatók és mRNS-ük a legdúsabb polimerázll átiratok között van a májban.
Számos emlős ALB és AFP promotor és fokozó szekvenciát azonosítottak már ^ezekkel kapcsolatban lásd az alábbi összefoglaló munkát : Genes and Develop. 1_, 268-276 (1987); Science 235, 53-58 (1987); The Journal of Bioi. Chemistry 262, 4812-4818 (1987)J. Ezek a szekvenciák képesek gének szelektív és fajlagos kifejezésére máj hepatocitákban (normál és transzformált) illetve hepatómákban.
·♦· · ·· · · ♦ így pl. - amint az 1. ábrában bemutatjuk - egy emlős ALB promotor egy 300 bp-s fragmentumban található az albumin gén transzkripciós beindító rajthelyétől 5’-felé. A 311 bp (5’ irányban) és a 8500 bp (5’ irányban) közti szekvencia nélkülözhető a máj-specifikus kifejeződéshez; a megadott számok a rágcsáló albumin gén transzkripciós iniciációs rajthelyéről értendők. Egy máj-fajlagos fokozó szekvencia található azonban egy olyan fragmentumban, amely a transzkripciós beindító rajthelytől 5’ felé 8500 bp és 10 400 bp között helyezkedik el (IA. ábra). Ha az ALB promotor és fokozó elemek jelen vannak, elérhető egy megfelelő 3’ orientációban elhelyezkedő heterológ strukturgén májfajlagos kifejezése (IB. ábra). Fenntartható egy, az ALB promotor és fokozó szekvenciához’megfelelő orientációban elhelyezkedő heterológ strukturgén máj-fajlagos kifejezése akkor is, amikor a transzkripciós beindító helytől 5’ felé, a 300 bp és 8500 bp közt elhelyezkedő, nem-esszenciális közbenső szekvenciákat eltávolítjuk (IC. ábra). A nem-esszenciális szekvenciák megcsonkítását a szakterületen jól ismert, standard molekulárbiológiai eljárásokΛ kai végezzük; a végeredmény olyan molekuláris kiméra, amelyet a VZV TK közvetlen máj-fajlagos kifejezéséhez alkalmazhatunk.
Az ALB gén szabályozó szerkezetéhez hasonlóan az AFP gének szabályozó elemei elősegítik az AFP szövet-fajlagos kifejeződését bizonyos máj-rendellenességek, pl. HCC esetében j_Mol. Cell. Bioi. £, 477-487 (1986); Science 235 , 53-58(1987) j. Az emlős AFP gén szabályozó elemei egy speciális 5’ promotor-proximális területet tartalmaznak (amely néhány emlős fajban a géntől 5’ felé, a 85 és 52 bp között helyezkedik el). Ezen kívül felfelé (5’) a rágcsáló AFP génnél jól meghatározott szabályozó elemek is találhatók, amelyek klasszikus fokozóként viselkednek ! ΜΌ1. Cell. Bioi. 6, ·♦ ·· ♦ » « · · · • · < » · ·· «4 • 4 * »9 fölfelé ·· « · • · •··· ·»·♦
- 12 477-487 (1986); Science 235, 53-58 (1987)1. Ezeket a szabályozó elemeket I, II és III elemeknek nevezzük és az AFP rágcsáló génnél levő transzkripciós beindító helytől számítva 5’ irányban az 1000 és 7600 bp közt helyezkednek el. Ez a három fokozó tartomány működés szempontjából nem egyenértékű az AFP szövet-fajlagos kifejeződésének kialakításában. Az I. és II. elemeknek van a legnagyobb kapacitása az AFP máj-fajlagos kifejezésének irányításában. Fontosnak tartjuk megjegyezni, hogy az alfa-fetoprotein gén szabályozó szekvenciái előnyösen nem csupán a szövetfajlagos transzkripciós aktiválásra alkalmas szekvenciákat tartalmazzák, hanem a kifejezés repressziójára alkalmas szekvenciákat is olyan szövetekben, amelyeknek nem szabad AFP-t kifejezniük. Hasonló módon jellemezték már korábban is a humán alfafetoprotein gén szabályozó területeit l'J.B.C. 262, 4812 (1987)7. Egy, az AFP szabályozó szekvenciáktól 3’ irányban, korrekt orientációban elhelyezkedő strukturgén képes lesz tehát szelektíven kifejeződni embrió-májban, hepatómákban, a here nem magképző karcinómáiban, bizonyos teratokarcinómákban, bizonyos gyomor-bél rendszeri tumorokban és más olyan normális és patológiás szövetekben, amelyek fajlagosan fejeznek ki AFP-t.
A jelen találmány olyan molekuláris kimérát szolgáltat, amely egy heterológ enzimet kódoló gén kódoló szekvenciáját tartalmazó DNS szekvenciát foglal magában, ahol ez a szekvencia egy transzkripciós szabályozó szekvencia szabályozása alatt áll egy kifejező kazettában; magában foglal továbbá egy promotort, amely egy célzott ráksejtben szelektíven működni képes; ez a kiméra pl. képes egy ráksejtet úgy transzformálni, hogy szelektíven fejezzen ki VZV timidin kinázt.
• 4 4· ♦ ·♦· • 44 4 ·4 · ···
4 · ·*··
4 · ·♦ »·«· ···· ·*4 ··*♦’
- 13A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában olyan molekuláris kimérát szolgáltat, amely egy transzkripciós szabályozó szekvenciát, elsősorban egy olyan promotort tartalmaz, amely szelektíven aktiválódik az emlős célszövetekben, és működőképesen össze van kapcsolva a Varicella zoster vírus timidin kinázt (VZV TK) kódoló gén kódoló szekvenciájával.
A jelen találmány elsősorban olyan molekuláris kimérát szolgáltai, amely az enzimet (amely előnyösen VZV TK) kódoló gén kódoló szekvenciájának DNS szekvenciáját tartalmazza, beleértve egy poliadenilező szekvenciát, amely 3’ helyzetben és megfelelő orientációban kapcsolódik egy emlős célszövet-fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciához. Legelőnyösebben a kifejező kazetta tartalmaz egy fokozó szekvenciát is.
A promotor és fokozó szekvenciákat előnyösen az alábbi transzkripciós szabályozó szekvenciák közül választjuk ki: albumin (ALB), alfa-fetoprotein (AFP), karcino-embrionális antigén (CEA), tirozin hidroxiláz, kolin acetil transzferáz, neuron-fajlagos enoláz, glia-rost savas fehérje, inzulin vagy gamma-glutamil-transzpeptidáz, dopa-karboxiláz, HER2/neu vagy N-myc onkogén, vagy más alkalmas gének transzkripciós szabályozó szekvenciái. Legelőnyösebben az ALB vagy AFP szabályozó szekvenciáját alkalmazzuk a máj-fajlagos, illetve hepatóma-fajlagos kifejezéshez.
A jelen találmány szerinti molekuláris kimérát standard rekombináns DNS technikákat alkalmazva állíthatjuk elő. így pl. a VZV timidin kináz (TK) gén kódoló szekvenciáját és poliadenilező szignálját (lásd a 2A. és 2B. ábrákat) a megfelelő 3’ orientációban helyezzük el az esszenciális, ALB vagy AFP transzkripciós szabályozó elemekhez viszonyítva. Ezek a molekuláris kimérák képesek a VZV TK szelektív kifejezésére olyan sejtekben, amelyek normá4 ·· 44 • * 4 · • · • · ···· «··« «4
4 «·· • ·· lisan ALB-ot, illetve AFP-t fejeznek ki (3A. és 3B. ábra). A VZV TK gén kifejeződése emlős májban, hepítómákban, a gyomor-bél rendszer bizonyos tumorjaiban, a here nem-magképző karcinómáiban, bizonyos teratokarcinómákban, és más tumorokban lehetővé teszi, hogy viszonylag nem toxikus arabinozidok és pirimidinek az itt leírtak szerint szelektíven metabolizálódjanak citotoxikus és/vagy citosztatikus metabolitokká.
Következésképpen a találmány - egy másik szempontja szerint
- eljárást nyújt olyan molekuláris kiméra megalkotására, amely egy heterolog enzim gént, pl. VZV TK-t kódoló DNS szekvenciát tartalmaz valamely szövet-fajlagos promotorhoz kötve.
A jelen találmány elsősorban eljárást nyújt a fentebb meghatározott molekuláris kimérák megalkotására. Az eljárás abból áll, hogy egy, a heterolog enzim (pl. VZV timidin kináz) génjét kódoló szekvenciát és poliadenilező szignálját tartalmazó DNS szekvenciát ligálunk egy emlős szövet-fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciához (pl. promotor szekvenciához és fokozó szekvenciához).
A VZV timidin kináz kódoló szekvencia és 3’ poliadenilező szignál egy mintegy 1381 bp-s Accl/Ndel restrikciós endonukleáz fragmentumot foglal el (lásd a 2. ábrát).
Ez előnyösen az az 1381 bp-s Accl/Ndel fragmentum, amely tartalmazza a VZV TK kódoló szekvenciát, és emlős szövet-fajlagos promotor és fokozó szekvwnciákhoz van ligáivá, bár azt is tudni kell, hogy más olyan DNS fragmentumok is alkalmazhatók, amelyek a VZV TK gént tartalmazzák. Ezen kívül a VZV TK poliadenilező szignált lehet helyettesíteni más megfelelő poliadenilező szignállal is, pl. olyannal, amely az SV40 vírusból vagy más em4« ♦ · « ··· • · ··· ·· • 4 4« • · · · • · • · ···* ···· lős génekből ered.
A promotor és fokozó szekvenciákat előnyösen az alábbi transzkripciós szabályozó szekvenciák közül választjuk ki: albumin (ALB), alfa-fetoprotein (AFP), karcino-embrionális antigén (CEA), tirozin hidroxiláz, kolin-acetil-transzferáz, neuron-fajlagos enoláz, glia-rost savas fehérje, inzulin, gamma-glutamil-transzpeptidáz, dopa-dekarboxiláz, HER2/neu, és N-myc onkogének transzkripciós szabályozó szekvenciái, vagy más megfelelő gének szabályozó szekvenciái. , A egy.
Ezeket a molekuláris kimerákat Y szállítórendszerrel lehet a célsejthez eljuttatni. Abból a célból, hogy a betegnek beadhassuk, szükséges, hogy rendelkezésre álljon egy in vivő szolgáltató rendszer, amely stabilan integrálja a molekuláris kimérát ja sejtekbe. Az isfivert eljárások alkalmazzák a kalcium-foszfátos átfertAzes, az elektroporáció, a mikróinjekció, liposzomális átvitel, technikáit ballisztikus célzás vagy retrovírusos fertőzés^ Ezekkel kapcsolatban áttekintő közlemény olvasható az alábbi irodalmi helyen: Biotechnique £(7),(1988).
A sejtek retrovírusos fertőzésének technikája, amely mesterséges gének integrálására szolgál, retrovírus ingázó vektorokat alkalmaz; ez a technika a szakterületen ismert (lásd pl. Mól. and Cell Bioi.; 1986 aug., 2895. oldal). A retrovírus ingázó vektorokat lényegében úgy alakítjuk ki, hogy a retrovírus DNS formáját alkalmazzuk egy plazmidbay/befogva. Ezek a plazmidok tartalmaznak olyan szekvenciákat is, amelyek a baktériumokban való szelekcióhoz és növekedéshez szükségesek. A retrovírus ingázó vektorok kialakításához a szakterületen jól ismert molekuláris biológiai technikákat alkalmazzuk. A retrovírus ingázó vektorokból el vannak távolítva a szülő endogén retrovírus gének (pl. gag, « ·· · «· · · ·· • ··· 9 «« <· · · · ·’ ·* · · · ···· ···· ··· ·· ♦··
- 16 pol és env), és a szóban forgó DNS szekvencia, pl. az a molekuláris kiméra, amelyet leírtunk, be van iktatva. Ezek azonban tartalmaznak megfelelő retrovírus szabályozó szekvenciákat a vírus burokképzéshez, az elővírus beiktatáshoz a cél-genomba, az üzenet összeillesztéshez (splicing), a terminációhoz és a poliadenilezéshez. A retrovírus ingázó vektorok a Moloney rágcsáló leukémia vírusból (Mo-MLV) származnak, de szakember számára világos, hogy más retrovírusok is használhatók^ elsősorban a közeli rokon Maloney rágcsáló szarkóma vírus. Bizonyos DNS vírusok is bizonyulhatnak hasznosnak szolgáltató rendszerként. A szarvasmarha papillóma vírus (BPV) extrakromoszomálisan replikálódik úgy, hogy a BPV-n alapuló szolgáltató rendszernek az az előnye, hogy a szolgáltatott gén nem-integrált módon marad fenn.
így a jelen találmány egy harmadik szempontja szerint olyan retrovírus ingázó vektort szolgáltat, amely a fentebb meghatározott molekuláris kimérákat tartalmazza.
A retrovírus által közvetített génátviteli rendszer előnyei 1 gén-eljuttatásának nagy hatékonysága a célzott szövethez, szekvencia-fajlagos integrálódás a vírus genomot illetően [az 5’ és 3’ hosszú terminális ismétlődés (LTR) szekvenciáknál^, és az eljuttatott DNS csekély átrendeződése, összehasonlítva a más DNS eljuttató rendszerekkel.
Következésképpen a jelen találmány egy előnyös kiviteli módjában egy olyan retrovírus ingázó vektort szolgáltatunk, amely tartalmaz egy 5’ vírus LTR szekvenciát magában foglaló szekvenciát, egy cisz-működő psi burokképző szekvenciát, egy korábban meghatározott molekuláris kimérát és egy 3’ vírus LTR szekvenciát (4A. és 4B. ábra).
• · · ·
Egy előnyös kiviteli módban - hogy segítsük eltüntetni a molekuláris kiméra nem szövet-fajlagos kifejeződését - a molekuláris kiméra az 5’ retrovírus LTR-rel ellenkező transzkripciós orientációban van elhelyezve (lásd a 4A. és 4B. ábrát). Ezen kívül egy domináns szelektálható marker gén is benne foglaltatik, amelyet átírás szempontjából az 5’ LTR szekvencia irányít. Ilyen domináns marker gén lehet a NEOII típusú bakteriális neomicin rezisztencia gén (aminoglükozid 3’ foszfotranszferáz), amely eukarióta sejteknek rezisztenciát ad át a G418 szulfát neomicin analógra (védett gyártmányneve: geneticin) (lásd a 4A. és 4B. ábra). A NEO gén segít olyan becsomagolt sejtek kiválasztásában, amelyek ezeket a szekvenciákat tartalmazzák (lásd később).
A példákban alkalmazott retrovírus vektor a Moloney rágcsáló leukémia víruson alapszik, de a szakember számára világos, hogy más vektorokat is lehet alkalmazni. Ilyen, szelektálható markerként NEO gént tartalmazó vektorokat írtak már le, ilyen pl. az N2 vektor [science 230, 1395-1398(1985)J.
A retrovírus ingázó vektorokkal kapcsolatos elméleti gond az a lehetőség lehet, hogy a retrovírus hosszú terminális ismétlődés (LTR) szabályozó szekvenciák átírás szempontjából aktiválnak egy celluláris onkogént az integrálódás helyén a gazdasejt genomban. Ez a gond csökkenthető SIN vektorok megalkotásával (4A. ábra). A SIN vektorok ön-inaktiváló vektorok, amelyekben a promotor és fokozó területeket magában foglaló terület ki van iktatva a retrovírus LTR-ben. A SIN vektorok LTR szekvenciái átírás szempontjából nem aktiválnak 5’ vagy 3’ genomikus szekvenciákat. A vírus LTR szekvenciák átírási inaktiválása csökkenti a szomszédos célsejt DNS szekvenciák beiktatási aktivitását és segít az eljuttatott molekuláris kiméra szelektált kifejezésében is. SIN
vektorokat úgy lehet megalkotni, hogy a 3’ vírus LTR szekven-
ciából mintegy 299 bp-t eltávolítunk ^Biotechniques £, 504-512
(1986)].
így a jelen találmány szerinti retrovírus ingázó vektorok előnyösen SIN vektorok.
Mivel a gag, pol és env szülő retrovírus géneket eltávolítottuk ezekből az ingázó vektorokból, egy segítő (helper) vírus rendszert hasznosíthatunk, hogy a gag, pol és env retrovírus géneket szolgáltassuk a retrovírus vektor becsomagolásához vagy beburkolásához egy fertőző virionba. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy speciális csomagoló sejtvonalakat alkalmazunk, amelyek képesek olyan fertőző szintetikus vírust kialakítani, amely nem képes semmiféle vad-típusú vírus termelésére. Ilyen módon a mesterséges szintetikus vírus tartalmaz egy jelen találmány szerinti kimérát vad típusú segítő vírustól mentes szintetikus, mesterséges fertőző virionba csomagolva. Ezt arra a tényre alapozzuk, hogy a segítő vírus, amely stabilan integrálódik a csomagoló sejtbe, tartalmazza a vírus strukturgéneket, de hiányzik belőle a psi hely és egy cisz-működő szabályozó szekvencia, amelynek benne kell lenni a vírus genomikus RNS molekulában ahhoz, hogy be legyen burkolva egy fertőző vírus részecskébe.
Következésképpen a jelen találmány egy negyedik szempontja szerint olyan fertőző viriont szolgáltatunk, amely tartalmaz egy fentebb leírt retrovírus ingázó vektort, ahol az említett vektor egy vírus fehérjébe van burkolva; ilyen módon alkotható meg egy mesterséges fertőző, replikáció-hiányos retrovírus.
A retrovírus ingázó vektor előnyösen olyan ingázó vektor, amely egy, az AFP vagy ALB transzkripciós szabályozó szekvenciájával bíró molekuláris kimérát tartalmaz. Az ingázó vektor
még előnyösebben egy AFP/VZV TK kimérát vagy egy ALB/VZV TK kimérát tartalmaz.
A psi hely eltávolításán kívül további változtatásokat is tehetünk a segítő vírus LTR szabályozó szekvenciáin annak biztosítására, hogy a segítő vírus ne csomagolodjék virionokba és blokkolódjék a fordított átírás és a vírus integráció szintjén.
Egy más eljárás szerint a segítő vírus strukturgéneket (tehát a gag, pol és env géneket) egyenként és függetlenül vihetjük át a csomagoló sejtvonalba, mivel ezek a vírus strukturgének el vannak különülve a csomagoló sejt genomján belül, kevés arra az esély, hogy rejtett rekombináció történjék vad típusú vírust alakítva ki.
A jelen találmány ötödik szempontja szerint eljárást nyújtunk jelen találmány szerinti fertőző virionok előállítására olyan módon, hogy a mesterséges retrovírus ingázó vektort, amely egy fentebb leírt molekuláris kimérát tartalmaz, bejuttatjuk egy csomagoló sejtvonalba.
A csomagoló sejtvonal stabilan integrálhat magában egy olyan segítő vírust, amelyből hiányzik egy psi hely és más szabályozó szekvenciák, amint fentebb leírtuk, vagy egy másik esetben a csomagoló sejtvonal úgy lehet manipulálva, hogy tartalmazzon segítő vírus strukturgéneket genomján belül.
A jelen találmány továbbá szolgáltatja a fentebb leírt fertőző viriont gyógyászati célra, elsősorban rák kezelésére és különösen HCC, a here nem-magképző karcinómája, bizonyos teratokarcinómák és bizonyos gyomor-bélrendszeri tumorok kezelésére.
A heterológ enzim, elsősorban a VZV timidin kináz gén szelektív kifejezését úgy végezzük el, hogy szövet-fajlagos transzkripciós szabályozó (pl. fokozó és promotor) szekvenciákat alkal20
mázunk. A szelektivitás tovább javítható a májsejtek szelektív fertőzésével. A csomagoló sejtvonalban jelen levő retrovírus env gén meghatározza a fajlagosságot a gazda fertőzésre. A csomagoló sejtvonal megalkotásában alkalmazott env gént módosítjuk, hogy olyan mesterséges, fertőző virionokat alakítsunk ki, amelyek szelektíven fertőznek hepatocitákat. Példaként: a csomagoló sejtvonalba bevezetett retrovírus env gént úgy módosíthatjuk, hogy a mesterséges, fertőző virion burkolati glikoproteinje szelektíven fertőzzön hepatocitákat a hepatitisz B vírus (HBV) által hasznosított fajlagos receptor-közvetített kötés révén. A HBV a hepatocitákat fajlagos receptor-közvetített kötés révén fertőzi. A preS1 és pre-S2 szekvenciák által kódolt HBV fehérjék fontos szerepet játszanak a HBV kötésében a hepatocitákhoz jj'Hepadna Viruses; szerkesztették Robinson és munkatársai, 189-203; 205-221 oldalak ¢1987)(. A csomagoló sejt env génjét úgy módosítjuk, hogy magában foglalja a nagy S HBV burkolati fehérje hepatocita kötőhelyét. A csomagoló sejtbe bevezetett env gén ilyen módosításait a szakterületen jól ismert standard molekuláris biológiai technikák segítségével hajthatjuk végre.
A jelen találmány szerinti fertőző viriont a szakterületen jól ismert technikákkal szerelhetjük ki és úgy hozhatjuk forgalomba, mint gyógyszerkészítményt gyógyászatilag elfogadható hordozókkal együtt. A gyógyászatilag elfogadható hordozók ez esetben lehetnek folyékony közegek, amelyek lehetővé teszik, hogy fertőző virionok bejussanak a betegbe. Az ilyen hordozóra jó példa a fiziológiás konyhasóoldat. A fertőző virion oldatban vagy szuszpenzióban lehet egy ilyen hordozóban. Egy ilyen gyógyászati kiszerelésben jelen lehetnek stabilizálószerek, antioxidánsok és/vagy egyéb segédanyagok. A gyógyászati készítményt emlősöknek beadhat21 juk bármely hagyományos módon, pl. szájon át vagy parenterális úton. A fertőző viriont elsősorban intravénás vagy intraartériás infúzió útján adhatjuk be. A HCC kezelése esetén az intramájartériás infúzió lehet előnyös.
Következésképpen a találmány olyan gyógyászati kiszerelést nyújt, amely fertőző viriont tartalmaz valamely gyógyászatilag
X. elfogadható hordozóval összekeverve.
Ezen kívül a jelen találmány eljárást nyújt a fentebb leírt gyógyszerészeti kiszerelések előállítására, amely abból áll, hogy egy molekuláris kimérát tartalmazó mesterséges fertőző viriont összekeverünk valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval.
/ Bár bármilyen megfelelő vegyületet alkalmazhatunk, amelyet az enzim szelektíven átalakít, a jelen találmány bemutatja az (I) és (II) általános képletű vegyületek alkalmazását olyan rákok kezelésére alkalmas gyógyszerek előállításához, amelyek képesek kifejezni VZV timidin kinázt. Ezek a gyógyszerkészítmények elsősorban a májsejt karcinóma (HCC) kezelésére alkalmasak.
Az (I) általános képletű 6-szubsztituált purin arabinozidokról, sóikról és fiziológiailag funkcionális ekvivalenseikről - ahol az (I) általános képletben r!jelentése halogén atom, 1-5 szénatomos alkoxi, halogénnel helyettesített 1-5 szénatomos alkoxi, 1-5 szénatomos alkilcsoporttal mono- vagy diszubsztituált amino-, egy vagy több fluoratommal szubsztituált alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkil-csoport, vagy egy olyan nitrogéntartalmú heterociklus, amely 4-7 szénatomot és adott esetben egy kettős kötést tartalmaz; és
R jelentése hidrogén- vagy halogénatom, vagy aminocsoport ismert, hogy anti-VZV és citomegalovírus hatású szerek;
• · ·
- 22 alkalmazásukat és szintézisüket leírja a 0294114 számú európai közrebocsátási irat. x
A (II) általános képletben
X jelentése vinilén vagy etinilén csoport;
R1 jelentése oxo- vagy iminocsoport;
R jelentése hidrogénatom vagy 1-2 szánatomos alkil, 3-4 szénatomos elágazó szénláncú alkil vagy cikloalkil, pl. izopropilvagy ciklopropilcsoport;
R2 3 jelentése hidrogénatom vagy acil, pl. 1-4 szénatomos alkanoil- vagy benzilcsoport, amely kívánt esetben helyettesítve van pl. egy vagy több halogénatommal vagy alkil-, hidroxi- vagy alkoxicsoporttal; és
Λ
R jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport;
3 4 azzal a feltétellel, hogy amikor R , R és R mindegyike hidrogénatomot jelent, akkor R^ jelentése nem lehet oxocsoport.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy amikor R^ jelentése nem acilcsoport, az (I) vagy (II) általános képletű vegyületek tautomer formában léteznek. Különösen előnyös (I) és (II) általános képletű vegyületek a 9-p-arabinofuranozil-6-metoxi-9]H-purin és az l-(^-D-arabinofuranozil)-5-propinil-uracil.
Ezek a vegyületek és előállítási eljárásaik le vannak írva a 027065 számú európai szabadalmi közzétételi iratban, és itt leírják ezek anti-VZV aktivitását is.
A fentebb említett pirimidin nukleozidok és purin arabinozidok közé értjük az ilyen vegyületek gyógyászatilag elfogadható származékait is, pl. gyógyászatilag elfogadható sóikat, észtereiket, észtereik sóit, vagy bármely olyan vegyületet, amely egy emberi lénybe beadva képes (közvetve vagy közvetlenül) ezek aktív
metabolitját vagy maradékát szolgáltatni. A vegyület előnyösen orálisan legyen aktív.
Az emlősök kezelésénél a mennyiség és az adagolási rend a kezelőorvos felelőssége, és számos tényezőtől függ, beleértve a betegség típusát és a kezelendő beteg állapotának súlyosságát. HCC-nél azonban a mesterséges fertőző virion intra-májartériás infúziója esetén a 2.10^ és 2.10? telepképző egység/ml (CFU/ml) közti fertőző virion valószínűleg elegendő egy tipikus tumorhoz. Az infúzióban beadott virionok összes mennyiségé függ a tumor méretétől, és valószínűleg a több részletben beadás az előnyös.
Gyógyszerkezelés. A fertőző virionnal végzett fertőzés után beadjuk azokat a találmány szerinti vegyületeket, amelyek fajlagosan igényelnek VZV TK aktivitást a kritikus első foszforilezési lépéshez a citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká történő anabolizmusban.
A gyógyszer mennyisége előnyösen a 0,1-250 mg/befogadó testtömeg kg tartományban van naponta, előnyösen a 0,1-100 mg/testtömeg kg tartományban.
Az alábbi kiviteli példák a jelen találmány__szemléltetésére szolgálnak, és nem céljuk , hogy a találmány oltalmi körét korlátozzák .
1. példa
Az albumin transzkripciós szabályozó szekvencia/VZV timidin kináz molekuláris kiméra megalkotása
Egy mintegy 1J81 bp-s Accl/Ndel DNS fragmentumot (az öszszes restrikciós enzimet az alábbi cégek valamelyikétől szerezzük be: Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok; New England Biolabs, Massachussets,
Amerikai Egyesült Államok; és Promega, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok; az összes enzimes reakciót úgy végezzük, ahogyan ezt a szállító cégek ajánlják), amely tartalmazza a VZV TK gén kódoló szekvenciáját és poliadenilező szignálját, elektroelucióval tisztítunk Elutrap elektroforézis kamra (Schleicher and Schuell, Keene, New Hampshire, Amerikai Egyesült Államok) segítségével egy mintegy 4896 bp-s, 22TK-nak nevezett plazmid restrikciós enzimes emésztményéből, amely plazmid tartalmazza a VZV TK genom egy mintegy 2200 bp-s EcoRI/BamHI fragmentumot IVirology 149, 1-9 (1986); a plazmid beszerezhető Ostrove 0.-től (National Institute of Health, Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok)^. A tisztított DNS fragmentum tartalmazza a teljes VZV TK kódoló szekvenciát és poliadenilező szignált, de nem foglal magában semmiféle VZV TK promotor elemet (lásd a 2A. és 2B. ábrákat).
A tisztított 1381 bp-s Accl/Ndel VZV TK fragmentum túlnyúló végeit E. coli DNS polimerázjl Klenow fragmentummal (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) és dezoxinukleotid trifoszfátokkal (dTNP) végzett kezeléssel tompa végűvé tesszük.
Egy mintegy 5249 bp-s plazmidot, amelyet 2335A-l-nek nevezünk, és amely tartalmaz mintegy 2300 bp-t egy ALB E/P szekvenciából, Palmiter Richard-tól (University of Washington, Seattle, szerezhetünk be
Washington, Amerikai Egyesült Államok)YrEz a konstrukció tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek szükségesek a máj-fajlagos kifejezéshez, de hiányoznak belőle a nem-esszenciális köztes szekvenciák. Egy egyedi BamHI restrikciós enzim felismerő hely van a +23 helyen a transzkripció rajtjától számítva. A 2335A-l-et BamHI restrikciós enzimmel emésztjük és az 5> túlnyúló végeket tompává tesszük Klenow-fragmentummal és dNTP-vel végzett kezeléssel, amint fentebb leírtuk.
Az ALB E/P VZV TK kimérát úgy alkotjuk meg, hogy a VZV TK kódoló és és poliadenilező szekvenciákat tartalmazó, tompa végű Accl-Ndel fragmentumot ligáljuk a 2335A-1 tompa végű BamHI helyéhez, így alkotva meg a pC73-at T4 DNS ligázt alkalmazva (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok)(5. ábra). Hasonlóan minden leírt ligáláshoz a ligáit fragmentumok orientációját restrikciós endonukleázos emésztéssel határozzuk meg a szakterületen jól ismert eljárásokkal. A példákban leírt minden további plazmidhoz hasonlóan a pC73 tartalmaz a baktériumokban történő replikációhoz szükséges és sokszorozáshoz alkalmas esszenciális szekvenciákat, ahol replikáción és sokszorozáson a szakterületen jól ismert eljárásokat értjük. Az ALB E/P VZV TK kimérát elektroelucióval tisztítjuk pCR73-ból, mint egy mintegy 3880 bp-s Sstl/KpnI restrikciós endonukleázos fragmentumot (5. ábra). A 3’ túlnyúló végeket tompává tesszük T4 DNS polimerázzal és dNTP-vel végzett kezeléssel. Ezt az Sstl/KpnI tompavégű restrikciós fragmentumot ezután bevezetjük egy Moloney rágcsáló leukémia vírus-retrovírus ingázó vektor rendszerbe (lásd később a 3. példát).
A pCR73-at az ATCC-nél 1989 augusztus 18-án deponáltuk ATCC 68077 deponálási számon.
2. példa
Az alfa-fetoprotein/VZV timidin kináz transzkripciós szabályozó szekvencia megalkotása
A VZV timidin kináz kódoló szekvenciát és poliadenilező helyet a pCR73 mintegy 3300 bp-s BamHI-XmnI restrikciós endonukleázos fragmentumaként izoláljuk (6. ábra). A BamHI restrikciós en« · donukleáz hely 5’ túlnyúló végeit tompává tesszük Klenow-fragmentummal és dNTP-vel végzett kezeléssel. Ez a DNS fragmentum tartalmazza a VZV TK gén teljes kódoló szekvenciáját és poliadenilező helyét, de nem tartalmaz semmiféle fokozó vagy promotor szekvenciát. Egy mintegy 9996 bp-s plazmidot, a pAF5.1-CAT-ot, amely tartalmaz mintegy 5100 bp-t a humán AFP 5’ szegélyező DNS-ből, Tamaoki T.-től (University of Calgary, Kanada) szerezhetjük be. Egy olyan DNS fragmentumot izolálunk a pAF5.1-CAT-ból, amely a humán AFP gén mintegy -5,1 kb és +29 kb közti tartományát öleli át; az izolálást XmnI-gyel végzett teljes és HindlII-mal végzett részleges emésztéssel végezzük. Ezt az Xmnl/HindlII fragmentumot a BamHI/XmnI VZV TK fragmentumhoz ligáljuk T4 DNS ligáz alkalmazásával, így kapjuk meg a pCR77-et (6. ábra). Az AFP E/P VZV TK kimérát elektroelucióval tisztítjuk a pCR77-ből(mint egy kb 6699 bp-s AatlI/PstI restrikciós endonukleázos fragmentumot. Ezt a fragmentumot azután T4 DNS polimerázzal és dNTP-vel kezeljük az 1. példa útmutatásai szerint, így kapunk tompavégű restrikciós fragmentumot.
A pCR77-et az ATCC-nél 1989. augusztus 18-án deponáltuk
ATCC 68079 deponálási számon.
3. példa
Az 1. példa molekuláris kiméráját tartalmazó retrovírus ingázó vektor konstrukció megalkotása
A pCR74 retrovírus ingázó vektort, aemly tartalmazza az ALB E/P VZV TK kimérát, úgy alkotjuk meg, hogy a pCR73 tisztított SstI/ΚρπΙ tompavégű fragmentumát ligáljuk egy N2(XM5)-nek nevezett Moloney rágcsáló leukémia retrovírus vektorba rScience 230, 13951398 (1985) , amely Karrlson S.-től (National Institute of Health, ♦ ♦ ·· · ··· • · · · ·· 9 ··· • · · ···« • * · · · ···· «··· ··· ·· ··· szerezJ/s-tő be
Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok)); Az N2(XM5)-öt Xhol restrikciós endonukleázzal emésztjük és az 5’ túlnyúló végeket tompává tesszük Klenow fragmentummal és dNTP-vel végzett kezeléssel, majd a pCR73 Sstl/KpnI fragmentumhoz ligáljuk T4 DNS ligáz alkalmazásával (5. ábra).
Az ALB E/P VZV TK kimérát tartalmazó pCR74 retrovírus ingázó vektort restrikciós endonukleázos térképezéssel és DNS szekvenciaelemzéssel jellemezzük, hogy igazoljuk a primer szekvenciát. Az ALB E/P és a VZV TK szekvenciák csatlakozását szegélyező szekvenciát a 7. ábrában mutatjuk be.
A pCR74-et az ATCC-nél 1989. augusztus 18-án deponáltuk
ATCC 68078 deponálási számon.
4. példa
A 2. példa molekuláris kiméráját tartalmazó retrovírus ingázó vektor konstrukció megalkotása
A pCR78 retrovírus ingázó vektort (6. ábra) úgy alkotjuk meg, hogy a pCR77 AFP E/P VZV TK kimérát tartalmazó tisztított AatlI/ PstI fragmentumot N2(XM5)-be ligáljuk, amelyet előzőleg Xhol-gyel emésztettünk és T4 DNS polimerázzal, valamint dNTP-vel tompa végűvé tettünk, amint ezt a 3. példában leírtuk. Az AFP E/P VZV TK kimérát tartalmazó pCR78 retrovírus ingázó vektort restrikciós endonukleázos térképezéssel és DNS szekvenciaelemzéssel jellemezzük, hogy igazoljuk a primer szekvenciát. Az AFP E/P és a VZV TK szekvenciák csatlakozását szegélyező szekvenciát a 8. ábrában mutatjuk be.
A pCR78-at az ATCC-nél 1989. augusztus 18-án deponáltuk
ATCC 68080 deponálási számon.
·« · * · · · · • · · · ·* · » ·· ♦ · · ♦·· · • · · · · ···· ··«· ··· ·· «··
5. példa
Vírus kialakítás
A PA317-nek nevezett csomagoló sejtvonalat az ATCC-től szerezhetjük be (ATCC CRL 9078), amely, amint korábban leírták, három változással bír, mégpedig az 5’ LTR-en, a psi szabályozó szekvencián és a 3’ LTR-en belül i_Mol. and Cell Bioi. _6(8), 28952902(1986) . A 3. és 4. példában leírt mesterséges retrovírus konstrukciókat a csomagoló vonalba elektroporációval vagy fertőzései visszük be. Az elektroporációhoz 20 χg linearizált plazmid DNS-t'elektroporálunk 2 millió PA317 sejtbe foszfáttal pufferolt szacharózban, 280 voltot és 25 mikrofarád elektrosztatikus kapacitást alkalmazva 0,8 ml össztérfogatban. Legalább 150 G418 telepet kaphatunk/ 20«g plazmid DNS/2 millió PA317 sejt. A fertőzésnél 20vKg linearizált plazmid DNS-t elektroporálunk 2 millió ekotróp csomagoló sejtbe, pl. Psi 2 sejtekbe. Két nappal később a tenyészet felülúszóját a PA317 amfotróf csomagoló sejtvonal fertőzésére alkalmazzuk, és G418 rezisztens telepeket izolálunk. Mind az elektroporációs, mind a fertőzési technikáknál a G418 rezisztens telepeket egysejt-klónozzuk korlátozott higitásos eljárással, Southern foltképzéssel elemezzük és NIH 3T3 sejteken (ATCC) titráljuk, hogy azonosítsuk a legmagasabb szinten termelőket a teljes hosszúságú vírusok közül. A pCR74-et tartalmazó PA317 sejteknél 17 egyedi sejtklónt izolálunk és ezen kiónok közül 10-ből DNS-t extrahálunk. Ezen a 10 DNS mintán erőteljes Southern folt elemzést hajtunk végre különböző restrikciós endonukleáz enzimeket, és radioaktív hibridizációs vizsgáló mintaként különböző NEO és VZV TK szekvenciákat alkalmazva. A 10 elemzett klón közül 2 nem mutatja jelét csonkításnak, így teljes hosszú29 «· ·· · ·« · « · · « ·· · « ·· * · · ··· · • * · ♦ · ···· ···· ··« ·· ··♦ ságűnak tekinthető. A pCR78-at tartalmazó PA317 sejteknél 29 egyedi sejtklónt izolálunk, és ezek közül 25 kiónból DNS-t nyerünk ki. Ezen a 25 DNS mintán erőteljes Southern folt elemzést hajtunk végre különböző restrikciós endonukleáz enzimeket és radioaktív hibridizációs vizsgáló mintaként különböző NEO és VZV TK szekvenciákat alkalmazva. A 25 elemzett klón közül 5 nem mutatja jelét csonkításnak, így teljes hosszúságúnak tekinthető. Az összes, teljes hosszúságú vírus szekvenciát tartalmazó csomagoló sejtvonalat timidin kináz minusz/minusz NIH 3T3 sejteken titráljuk, standard technikákat alkalmazva.
6. példa
Humán hepatóma sejtvonal· (pozitív kontroll) fertőzése az ALB/VZV TK-t vagy AFP/VZV TK-t tartalmazó, 5. igénypont szerinti, teljes hosszúságú fertőző virionokkal, majd a VZV TK aktivitás, az ara ATP termelés és a gyógyszerérzékenység egymás utáni mérése
Az ALB/VZV TK kimérát vagy AFP/VZV TK kimérát tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírusokat alkalmazzuk egy Hep G2-nek nevezett humán hepatóma sejtvonal (ATCC HB 8065) fertőzésére. A fertőzés és 1 mg geneticin/ml-en végzett szelekció után a sejteket VZV TK aktivitásra mérjük. Ezen kívül a sejteket (^Hí-val jelzett 9-(p-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin (amelyet a további táblázatokban és ábrákban ara-m-nek nevezünk) jelenlétében inkubáljuk, majd az ara ATP-t mérjük. Végül sejteket tenyésztünk a fentebb említett vegyület jelenlétében és az IC^gínövekedésgátlás) értéket meghatározzuk. A vírussal nem fertőzött vagy N2 vírussal fertőzött sejtek szolgálnak kontroll mintaként ezekhez a kísérletekhez. Az N2 vírus nem tartalmaz VZV TK genetikai anyagot.
Az 1. táblázat bemutatja, hogy a vagy pCR74, vagy pCR78 tartalmú vírusokkal fertőzött humán hepatóma sejtek 904-szer, illetve 52-szer nagyobb VZV TK aktivitással rendelkeznek a kontroll sejtekkel összehasonlítva.
A 9-(^-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H-purint (amelyet aram-nek nevezünk) a VZV TK szelektíven monofoszforilezi és ez az ezt követő anabolizmussal citotoxikus ara ATP-vé válik. A 9.
ábra bemutatja, hogy azok a Hep G2 sejtek, amelyek vagy pCR74 tartalmú, vagy pCR78 tartalmú vírusokkal vannak fertőzve és (3H)val jelzett 9-(p-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H^ purin jelenlétében vannak inkubálva, jelentős mennyiségű citotoxikus (^H) ara ΑΪΡ képzésében vesznek részt.
Az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR78) tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovíTusokkal fertőzött Hep G2 sejteket változó mennyiségű
9-(í3-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin jelenlétében inkubáljuk 5 napon át, és meghatározzuk a növekedésgátlást, amelyet a sejtszám és a DNS tartalom alapján mérünk.
A 2. táblázat azt mutatja be, hogy a 9-(/?-D-arabinofuranozil) -6-metoxi-9H purin IC5Q értéke (50 %-os növekedésgátlás) nagyobb, mint 2000 í<mól/l a kontroliban és az N2-vel fertőzött Hep G2 sejtekben. Az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR78) tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú mesterséges retrovíTusokkal fertőzött Hep G2 sejteknél az IC^g 5j.\mól/l, illetve 175<<mól/l. Az AFP/VZV TK-t tartalmazó (pCR78) Hep G2
V sejtek egysejtes klónozása azt jelzi, hogy a 9-(ρ-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin IC^q értékét tovább lehet csökkenteni mintegy 40 ^mól/litérré.
*· 4 ·£· • · · 4 ·· *«44 • * · ·»♦ * • · · ·4 ·4·4 ·*4· ··« 44···
7, példa
A VZV TK kifejeződésének szelektivitása
Öt humán, nem hepatóma sejtvonalat fertőzünk az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) tartalmazó replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírusokkal. Ezek a sejtvonalak a WiDR (ATCC CCL 218), IMR90 (ATCC CCL 186), MCF7 (ATCC HTB22) , Detroit 555 (ATCC CCL 110) és SW480 (ATCC CCL 228). A fertőzés és a geneticinen végzett szelekció után ezeket a sejteket megvizsgáljuk VZV TK aktivitásra, és növekedésgátlásra 9-(^-D-arabinofuranozil)-6metoxi-9H purin jelenlétében, amint fentebb leírtuk. A VZV TK aktivitásban és a 9-(p -D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purinra való gyógyszerérzékenységben nincs növekedés ebben az öt nem-hepatóma sejtvonalban, amikor az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) tartalmazó replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírussal fertőzzük ezeket. Az összehasonlítás alapjai azok a szülő-sejtvonalak, amelyek nincsenek fertőzve. Ez a kísérlet azt demonstrálja, hogy a VZV TK kifejezése szelektív hepatómára, és nem érvényes nem-hepatóma sejtekre.
Az alábbiakban az ábrákat röviden bemutatjuk.
Az 1. ábra az albumin fokozó és promotor szekvenciák vázlatos bemutatása az albumin-génre (IA), egy heterológ génre (IB) és nem-esszenciális szekvenciák nélküli heterológ génekre vonatkozóan .
A 2A. ábra a Varicella zoster timidin kináz gén diagramja.
A 2B. ábra a VZV TK gén szekvenciája.
A 3A. ábra az albumin transzkripciós szabályozó szekvencia/ VZV TK molekuláris kimérát mutatja be.
A 3B. ábra az alfa-fetoprotein transzkripciós szabályozó szekvencia/VZV TK molekuláris kimérát mutatja be.
- 32 ·♦ • · · · • · • · ·*·· ·<·· ·* ·
A 4A. ábra az alfa-fetoprotein/VZV TK molekuláris kimérát tartalmazó retrovírus provírus formája.
A 4B. ábra a pCR78 plazmidot mutatja be.
Az 5. ábra a pCR74 megalkotását bemutató folyamatábra.
A A 6. 7. ábra ábra a az pCR78 megalkotását bemutató folyamatábra.
ALB E/P és VZV TK csatlakozását szegélyező szek-
vencia pCR74-ben
A 8. ábra az AFP E/P és VZV TK csatalkozását szegélyező
szekvencia pCR78-ban
A 9. ábra: ara ATP termelése kontrollal, pCR74-gyel és pCR78cal fertőzött sejtekből.
- 33 t< «4 * ·<« • · * · η* * ♦·« • · * ···« • · · · « ·'··· · ♦ 9 · · * · · *» « *
1. TÁBLÁZAT
VZV TK aktivitás ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR78) tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú mesterséges retrovíTusokkal fertőzött Hep G2 sejtekben.
Vírus VZV enzimes aktivitás nmól/1 ara MP^g fehérje/30 perc Növekedés
Semmi 9 Ox
N2 4 Ox
pCR74 4521 904x
pCR78 258 52x
- 34 ·♦ · • · · » ·>
* · ♦ • · « •··· · *·« 4·4 ··· ·*
2, TÁBLÁZAT
Növekedésgátlás ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR78) tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú retrovírusokkal fertőzött Hep G2 sejtekben
Vírus IC50 a 9-(^-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H-purinhoz
Semmi 2000 -:mól/l V
N2 2000 mól/1
pCR74 5,λmól/1
pCR78 175;<mól/l

Claims (18)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. ) Eljárás molekuláris kiméra előállítására azzal jellemezve, hogy egy emlős célsejtben szelektív aktiválásra képes transzkripciós szabályozó szekvenciát összekapcsolunk egy heterológ enzimet kódoló DNS szekvenciával, ahol a nevezett enzim a célsejtre toxikus szer kialakításának katalizálására képes.
  2. 2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy transzkripciós szabályozó szekvenciaként valamely promotort tartalmazó szekvenciát kapcsolunk.
  3. 3. ) Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az enzimet kódoló DNS szekvenciaként olyan szekvenciát kapcsolunk, amely egy poliadenilező szignált is tartalmaz az enzimtől lefelé.
  4. 4. ) Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a heterológ enzimet kódoló DNS szekvenciaként olyan szekvenciát kapcsolunk, amelyhez még egy fokozó szekvencia is kapcsolódik .
  5. 5. ) A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy promotorként az albumin, alfa-fetoprotein, karcinoembrionális antigén, tirozin-hidroxiláz, kolin acetil transzferáz, neuron-fajlagos enoláz, glia-rost savas fehérje, inzulin, gammaglutamil transzpeptidáz, dopa-dekarboxiláz, HER2/neu vagy N-myc onkogének promotorját alkalmazzuk.
  6. 6. ) A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fokozóként az albumin, alfa-fetoprotein, karcino-embrionális antigén, tirozin-hidroxiláz, kolin acetil transzferáz, glia-rost savas féhérhe, inzulin', gamma-glutamil transzpeptidáz, dopa-dekarboxiláz, HER2/neu vagy N-myc onkogének fokozóját alkalmazzuk.
  7. 7. ) Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jelle36 « · · ··« · • · · · · ···· ···· ··· 99 999 mezve, hogy heterológ kódolt enzimként
    Varicella zoster vírus timidin kinázt,
    G2 karboxi-peptidázt, alkálikus foszfatázt, penicillin-V amidázt vagy nem-emlős citozin dezaminázt alkalmazunk.
  8. 8. ) Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy heterológ enzimként Varicella zoster timidin kinázt alkalmazunk.
  9. 9. ) Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan molekuláris kiméra előállítására, amely Varicella zoster vírus timidin kináz gént kódoló DNS szekvenciát tartalmaz működőképesen öszszekapcsolva az albumin transzkripciós szabályozó szekvenciájával, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben említett DNS szekvenciát összekapcsoljuk a tárgyi körben említett transzkripciós szabályozó szekvenciával.
  10. 10. ) Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan molekuláris kiméra előállítására, amely Varicella zoster vírus timidin kináz gént kódoló DNS szekvenciát tartalmaz működőképesen összekapcsolva az alfa-fetoprotein transzkripciós szabályozó szekvenciájával, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben említett DNS szekvenciát összekapcsoljuk a tárgyi körben említett transzkripciós szabályozó szekvenciával.
  11. 11. ) Eljárás retrovírus ingázó vektor előállítására, amely az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti molekuláris kimérát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy egy 5’ vírus LTR szekvenciát, egy cisz-működő psi burkoló szekvenciát, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti molekuláris
    ·· * ·· • • · • · «· · · ·· • • • ··· • • • • · • ···· ···· ··· ·· ···
    kimérát, egy 3’ vírus LTR szekvenciát, és kívánt esetben valamely szelektálható marker gént össze kapcsolunk.
  12. 12. ) A 11. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a molekuláris kimérát az 5’ vírus LTR szekvenciával ellentétes transzkripciós orientációban elrendezve kapcsoljuk össze.
  13. 13. ) A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a retrovírus ingázó vektorba valamely szelektálható marker gén is van beépítve.
  14. 14. ) A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy szelektálható marker génként a NEOII típusú aminoglikozid 3’-foszfotranszferáz gént építjük be.
  15. 15. ) Eljárás fertőző virion előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, 11-14. igénypontok bármelyike szerinti retrovírus ingázó vektort burkolatba zárunk.
  16. 16. ) A 15. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a retrovírus ingázó vektort valamely csomagoló sejtvonalba juttat juk be.
  17. 17. ) Eljárás valamely célsejt szelektív fertőzésére képes módosított fertőző virion előállítására azzal jellemezve, hogy a 15. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti virion env fehérjéjét úgy módosítjuk, hogy a sejt kötődése a célszövethez könnyebb legyen.
  18. 18. ) Eljárás gyógyszrkészítmény előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, a 15-17. igénypontok bármelyike szerinti fertőző viriont valamely gyógyászatilqg elfogadható hordozóval gyógyszerkészítménnnyé keverünk.
    ~r-
    KÖZZÉTÉT· *· »» • · · ··· · . ···· ···« ··· · * · · · / PÉLDÁNY 15/1 J > J 1 k 1A. ábra
    Albunin fokozó és promotor szekvencia
    5' albunin promotor
    -x_______ albunin fokozo nem-esszenciális szekvenciák
    -10,400
    -8,500
    Az albumin máj-fajlagos kifejezése - 3 θθ albunin strukturgén
    1B. ábra albunin promotgr
    Éfe®on nem-esszenciális szekvenciák T heterológ gén 10,400 -8,500 -3( 0 (VZV TK) )0
    A 3' felé és megfelelő orientációban a komplett albunin fokozó és promotor szekverciá<hoz ligáit heterológ gén (VZV IK) máj-falagos kifejeződése
    IC. ábra albunin promotor
    albunin I promotor T heterológ gén I 0 ( VZV TK)
    3'
    -10,400 -300
    -8,500
    A 3' és megfelelő orientációban a megcsonkított albunin szabályozó szekvenciákhoz ligáit heterológ gén (VZV TK) kifejezne c' /- transzkripciós iniciációs rajthely
    15/2
    .. . .
    KOZZETETE’:
    PÉLDÁNY
    2A. Ábra
    A Varicella zoster timidin kinéz gén diagramja
    - fehérje kódoló terület
    Γ - traszkripciós iniciációs rajthely * 1* - poliadenilező szignál
    2B. ábra
    A varicella zoster timidin kinéz tartomány szekvenciája. Bemutatja a ZVZ TK gén szekvenciáját és az 5' és 3' szegélyező területkeket a 64276-66255 bázisokat, amint erről az alábbi irodalmi helyen beszámolnak: Gén. Virol. 67, 1759-1816 (1986). A VZV TATA doboz és a poliadenilező hely alá van húzva. Bemutatjuk az AccI és Ndel restrikciós endonukleáz helyeket, amelyeket a VZV TK kódoló szekvenciát és poliadenilező szignált tartalmazó 1381 bp-s Accl/Ndel fragmentum alklónozásához használunk. Ezt az 1381 bp-s fragmentumot 3' felé és megfelelő orientációban máj-fajlagos vagy hepatóma-fajlagos szabályozó szekvenciákhoz ligáljuk, hogy máj-fajlagos, illetve hepatóma-fajlagos kifejeződést érjünk el.
HU905679A 1989-08-30 1990-08-29 Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer HUT58814A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898919607A GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-08-30 Novel entities for cancer therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU905679D0 HU905679D0 (en) 1991-03-28
HUT58814A true HUT58814A (en) 1992-03-30

Family

ID=10662268

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU905679A HUT58814A (en) 1989-08-30 1990-08-29 Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer
HU95P/P00180P HU211655A9 (en) 1989-08-30 1995-06-09 Novel entities for cancer therapy

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00180P HU211655A9 (en) 1989-08-30 1995-06-09 Novel entities for cancer therapy

Country Status (19)

Country Link
EP (5) EP0415731B1 (hu)
JP (1) JPH03172189A (hu)
CN (1) CN1058993C (hu)
AT (1) ATE236260T1 (hu)
AU (3) AU647747B2 (hu)
CA (1) CA2024253C (hu)
DD (1) DD297447A5 (hu)
DE (1) DE69034054T2 (hu)
DK (1) DK0415731T5 (hu)
ES (1) ES2194833T3 (hu)
FI (1) FI904257A0 (hu)
GB (1) GB8919607D0 (hu)
HU (2) HUT58814A (hu)
IE (1) IE903125A1 (hu)
IL (1) IL95515A0 (hu)
MY (1) MY107402A (hu)
NZ (1) NZ235093A (hu)
PT (1) PT95134B (hu)
ZA (1) ZA906894B (hu)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5662896A (en) 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
US5997859A (en) * 1988-03-21 1999-12-07 Chiron Corporation Method for treating a metastatic carcinoma using a conditionally lethal gene
US6133029A (en) * 1988-03-21 2000-10-17 Chiron Corporation Replication defective viral vectors for infecting human cells
US6569679B1 (en) 1988-03-21 2003-05-27 Chiron Corporation Producer cell that generates adenoviral vectors encoding a cytokine and a conditionally lethal gene
US5716826A (en) * 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
JP2752788B2 (ja) * 1989-01-23 1998-05-18 カイロン コーポレイション 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法
JPH04504361A (ja) * 1989-04-05 1992-08-06 ノバセル　コーポレイション 感染性標的化複製―欠陥ビリオン
US6337209B1 (en) 1992-02-26 2002-01-08 Glaxo Wellcome Inc. Molecular constructs containing a carcinoembryonic antigen regulatory sequence
US6555370B1 (en) 1990-11-13 2003-04-29 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
JP3150340B2 (ja) * 1990-11-13 2001-03-26 イムネクス コーポレイション 二機能選択可能融合遺伝子
GB9100612D0 (en) * 1991-01-11 1991-02-27 Univ Edinburgh Method of altering the metabolic state of non-dividing cells,transgenic animals and therapeutic agents
GB9104165D0 (en) * 1991-02-27 1991-04-17 Wellcome Found Novel entities for hiv therapy
GB9107631D0 (en) * 1991-04-10 1991-05-29 British Bio Technology Proteinaceous particles
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5529774A (en) * 1991-08-13 1996-06-25 The Regents Of The University Of California In vivo transfer of the HSV-TK gene implanted retroviral producer cells
ES2142834T3 (es) * 1991-10-30 2000-05-01 Univ Paris Curie Celulas transformadas para la prevencion o el tratamiento de enfermedades inducidas por virus, en particular retrovirus patogenos.
WO1993010218A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
WO1994004196A1 (en) * 1992-08-14 1994-03-03 Imperial Cancer Research Technology Limited Tumour therapy
GB9305759D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 Medical Research Council And T Hiv therapy method and agents
US6017896A (en) * 1993-09-14 2000-01-25 University Of Alabama Research Foundation And Southern Research Institute Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US5552311A (en) * 1993-09-14 1996-09-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US6491905B1 (en) 1993-09-14 2002-12-10 The Uab Research Foundation Recombinant bacterial cells for delivery of PNP to tumor cells
US5804407A (en) * 1993-11-04 1998-09-08 University Technologies International, Inc. Method of expressing genes in mammalian cells
JPH09503920A (ja) * 1993-11-18 1997-04-22 チロン ビアジーン，インコーポレイティド 条件致死遺伝子を利用する組成物及び方法
FR2712602B1 (fr) * 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2712603B1 (fr) * 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
ATE211174T1 (de) * 1994-05-02 2002-01-15 Univ Washington Thymidin-kinase-mutanten
US6451571B1 (en) 1994-05-02 2002-09-17 University Of Washington Thymidine kinase mutants
GB9415167D0 (en) * 1994-07-27 1994-09-14 Springer Caroline J Improvements relating to cancer therapy
PL184375B1 (pl) * 1994-09-02 2002-10-31 Gsfforschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit Gmbh Wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, układ wektora retrowirusowego, sposób wytwarzania prowirusa retrowirusowego, sposób wytwarzania cząstki retrowirusa rekombinowanego, kompozycja farmaceutyczna, mRNA retrowirusowego prowirusa wytworzonego na drodze transkrypcji wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promatora, RNA wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora oraz sposóby wytwarzania kompozycji farmaceutycznej
GB9422383D0 (en) * 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
GB9423367D0 (en) * 1994-11-18 1995-01-11 Wellcome Found Enzyme prodrug therapy
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
DE69627644T2 (de) 1995-03-09 2004-02-19 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vektoren, die therapeutische gene fuer antimikrobielle peptide enthalten, zur verwendung in der gentherapie
US6254862B1 (en) 1997-03-03 2001-07-03 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof
US7011976B1 (en) 1997-03-03 2006-03-14 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
GB9516943D0 (en) * 1995-08-18 1995-10-18 Cancer Soc Auckland Div Nz Inc Novel cyclopropylindoles and their secoprecursors,and their use as prodrugs
GB9517001D0 (en) * 1995-08-18 1995-10-18 Denny William Enediyne compounds
US6248555B1 (en) 1995-08-31 2001-06-19 The General Hospital Corporation Genetic alterations related to familial alzheimer's disease
GB9523703D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Wellcome Found Enzyme prodrug thearapy
CN1062602C (zh) * 1996-01-25 2001-02-28 上海市肿瘤研究所 中国株单纯疱疹病毒胸苷激酶基因及其应用
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
US6130237A (en) * 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
CA2266656A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
GB9709421D0 (en) 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
GB9712370D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Aepact Ltd Therapeutic systems
GB9712512D0 (en) 1997-06-16 1997-08-20 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
DE69838584T2 (de) 1997-08-04 2008-06-26 Cell Genesys, Inc., Foster City Enhancer des menschlichen glandulären kallikreingens, vektoren die ihn enthalten und methoden für seine verwendung
DE69838483T2 (de) 1997-10-14 2008-07-03 Darwin Molecular Corp. Thymidinkinase mutanten und fusionproteine mit thymidinkinase und guanylatekinase aktivitäten
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
EP2278011A3 (en) 1998-01-14 2012-03-07 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisseria meningitidis antigens
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
AU761780B2 (en) 1998-05-01 2003-06-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Neisseria meningitidis antigens and compositions
JP2002527066A (ja) 1998-10-15 2002-08-27 カイロン コーポレイション 転移性乳癌および結腸癌調節遺伝子
CA2352532C (en) 1998-11-27 2014-10-14 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
PT1141331E (pt) 1998-12-16 2008-12-22 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinase dependente de ciclina humana (hpnqalre)
US7063850B1 (en) 1998-12-22 2006-06-20 University Of Tennessee Research Foundation Protective antigen of group A Streptococci
JP2002533124A (ja) 1998-12-31 2002-10-08 カイロン コーポレイション Ｈｉｖポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB9907414D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 Cancer Res Campaign Tech Improvements relating to prodrugs
US6864235B1 (en) 1999-04-01 2005-03-08 Eva A. Turley Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans
US6911429B2 (en) 1999-04-01 2005-06-28 Transition Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans
EP1228217B1 (en) 1999-04-30 2012-11-21 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Conserved neisserial antigens
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
US20030108539A1 (en) 2000-02-14 2003-06-12 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
AU784203B2 (en) 1999-10-29 2006-02-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisserial antigenic peptides
PT1232264E (pt) 1999-11-18 2009-11-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Gene fgf-21 humano e produtos da expressão do gene
EP2275129A3 (en) 2000-01-17 2013-11-06 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Outer membrane vesicle (OMV) vaccine comprising N. meningitidis serogroup B outer membrane proteins
EP1854476A3 (en) 2000-02-09 2008-05-07 Bas Medical, Inc. Use of relaxin to treat diseases related to vasoconstriction
JP4763210B2 (ja) 2000-02-28 2011-08-31 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル ナイセリアのタンパク質の異種発現
US20030036524A1 (en) * 2000-03-08 2003-02-20 Jens Licthenberg Method of sensitising endothelial cells to prodrugs
JP2003531583A (ja) 2000-03-08 2003-10-28 カイロン コーポレイション ヒトｆｇｆ−２３遺伝子および遺伝子発現産物
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
US6656718B2 (en) 2000-07-07 2003-12-02 Cancer Research Technology Limited Modified carboxypeptidase enzymes and their use
MX357775B (es) 2000-10-27 2018-07-20 J Craig Venter Inst Inc Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
DE10055383A1 (de) * 2000-11-08 2002-05-29 Max Delbrueck Centrum Verwendung des humanen LRP/MVP Promotors für einen Therapie-induzierbaren Vektor
US6958213B2 (en) 2000-12-12 2005-10-25 Alligator Bioscience Ab Method for in vitro molecular evolution of protein function
US20020086292A1 (en) 2000-12-22 2002-07-04 Shigeaki Harayama Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
WO2002081641A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081639A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081642A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
JP4541645B2 (ja) 2001-04-12 2010-09-08 インペリアル・イノベイションズ・リミテッド Ｉ型癌の診断および治療
AU2002305331A1 (en) * 2001-05-02 2002-11-11 Southern Research Institute Gene delivery compounds
WO2002090600A2 (en) 2001-05-08 2002-11-14 Darwin Molecular Corporation A method for regulating immune function in primates using the foxp3 protein
CA2452119C (en) 2001-07-05 2013-10-15 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1411770A4 (en) 2001-07-05 2006-05-10 Chiron Corp POLYNUCLEOTIDES CODING FOR ANTIGENIC C-TYPE HIV POLYPEPTIDES, POLYPEPTIDES AND THEIR USE
EP1273309A1 (de) * 2001-07-05 2003-01-08 Georg-August Universität Göttingen Gentherapeutisches Verfahren zur Behandlung von GnRH-Rezeptor-positiven Karzinomen durch GnRH induzierte tumorzellspezifische Aktivierung eines therapeutischen Gens, zugehörige Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren
WO2003004063A1 (de) * 2001-07-05 2003-01-16 Georg-August Universität Göttingen Gentherapeutisches verfahren zur behandlung von gnrh-rezeptor-positiven karzinomen durch gnrh induzierte tumorzellspezifische aktivierung eines therapeutischen gens, zugehörige nukleinsäurekonstrukte und vektoren
US7037718B2 (en) 2001-10-26 2006-05-02 Cornell Research Foundation, Inc. Mutant purine nucleoside phosphorylase proteins and cellular delivery thereof
US7488598B2 (en) 2001-10-26 2009-02-10 Cornell Center For Technology Enterprise And Commercialization Mutant purine nucleoside phosphorylase proteins and cellular delivery thereof
MXPA04003852A (es) 2001-10-26 2005-02-17 Univ Tennessee Res Foundation Composiciones de vacuna estreptococica multivalente, y metodos para sus uso.
CA2469491A1 (en) 2001-12-12 2003-06-19 Kerrie Setiawan Composition for viral preservation
ATE406912T1 (de) 2001-12-12 2008-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia tracheomatis
CA2479118A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Wyeth Holdings Corporation Mutants of the p4 protein of nontypable haemophilus influenzae with reduced enzymatic activity
US7244565B2 (en) 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7138512B2 (en) 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
ES2385032T3 (es) 2002-04-22 2012-07-17 Recopharma Ab Vacunas de polipéptido de fusión de mucina, composiciones y métodos de uso de las mismas
AU2003228751A1 (en) 2002-05-01 2003-11-17 Cell Genesys, Inc. Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US9532994B2 (en) 2003-08-29 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Agents and methods for enhancing bone formation by oxysterols in combination with bone morphogenic proteins
US8268324B2 (en) 2004-03-29 2012-09-18 Galpharma Co., Ltd. Modified galectin 9 proteins and use thereof
WO2007031098A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
EP1993558B1 (en) 2006-02-27 2014-07-30 The Regents of The University of California Oxysterol compounds and the hedgehog pathway
GB0607354D0 (en) 2006-04-12 2006-05-24 Bioinvent Int Ab Agent, Composition And Method
DK2054431T3 (da) 2006-06-09 2012-01-02 Novartis Ag Konformere af bakterielle adhæsiner
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2707663C (en) 2007-12-03 2017-05-30 The Regents Of The University Of California Oxysterols for activation of hedgehog signaling, osteoinduction, antiadipogenesis, and wnt signaling
WO2009143865A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2009143864A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases
GB2460717A (en) 2008-06-11 2009-12-16 Sense Proteomic Ltd Autoantibodies for the detection of a predisposition to Lupus
CN102224254A (zh) 2008-09-23 2011-10-19 哈佛大学校长及研究员协会 Sirt4及其用途
US9181315B2 (en) 2009-01-08 2015-11-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for induced brown fat differentiation
WO2011038063A1 (en) 2009-09-28 2011-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of diagnosing and treating interstitial cystitis
US20130040853A1 (en) 2010-01-21 2013-02-14 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Context Specific Genetic Screen Platform to Aid in Gene Discovery and Target Validation
US9149025B2 (en) 2010-02-19 2015-10-06 Universite De Liege Polynucleotide for use in treatment of influenza A virus induced diseases, encoding modified Mx protein, said modified Mx protein, and a transgenic animal expressing gene encoding modified Mx protein
PL2902035T3 (pl) 2010-10-14 2019-04-30 Xigen Inflammation Ltd Przechodzące przez komórkę peptydowe inhibitory szlaku przekazywania sygnałów przez JNK do zastosowania w leczeniu chorób zapalnych oka
WO2012048721A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases
US9539427B2 (en) 2010-11-08 2017-01-10 The Johns Hopkins University Methods for improving heart function
US9198975B2 (en) 2010-12-01 2015-12-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for targeting sites of neovascular growth
GB201115280D0 (en) 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
US8969519B2 (en) 2011-09-13 2015-03-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for brown fat induction and activity using FNDC5
US10378060B2 (en) 2011-10-14 2019-08-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ZNF365/ZFP365 biomarker predictive of anti-cancer response
AU2012344299A1 (en) 2011-11-30 2014-05-29 Xigen Inflammation Ltd. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of dry eye syndrome
KR20200075023A (ko) 2012-05-04 2020-06-25 화이자 인코포레이티드 전립선 관련된 항원 및 백신 기재 면역치료 요법
JP6262723B2 (ja) 2012-05-07 2018-01-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ オキシステロールアナログｏｘｙ１３３は、骨発生及びヘッジホッグシグナル伝達を誘導し、脂肪生成を阻害する
CA2911205A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 The Regents Of The University Of California Bone-selective osteogenic oxysterol-bone targeting agents
WO2015197098A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2014206427A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
US11624093B2 (en) 2014-04-24 2023-04-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor suppressor and oncogene biomarkers predictive of anti-immune checkpoint inhibitor response
CA2963091A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Angiopoietin-2 biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response
EP3204031A2 (en) 2014-10-08 2017-08-16 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
CA2963602A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Multiple-variable il-2 dose regimen for treating immune disorders
AU2016229238B2 (en) 2015-03-06 2022-06-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. PD-L2 biomarkers predictive of PD-1 pathway inhibitor responses in esophagogastric cancers
WO2017066561A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 President And Fellows Of Harvard College Regulatory t cell pd-1 modulation for regulating t cell effector immune responses
WO2017075329A2 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using pm20d1 and n-lipidated amino acids
KR20190080825A (ko) 2016-03-21 2019-07-08 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. T-세포 기능소실 상태-특이적 유전자 발현 조절인자 및 그 용도
US20180030478A1 (en) 2016-07-01 2018-02-01 Research Development Foundation Elimination of proliferating cells from stem cell-derived grafts
WO2018057618A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of aml using usp10 biomarkers and modulators
EP3634496A4 (en) 2017-06-06 2021-09-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHOD FOR RISING AWARENESS IN CANCER CELLS AGAINST T-CELL-MEDIATED KILLING BY MODULATING MOLECULAR SIGNAL PATHS
US20220289854A1 (en) 2019-04-30 2022-09-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer using combinations of anti-cx3cr1 and immune checkpoint blockade agents
EP4343004A2 (en) 2020-10-19 2024-03-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Germline biomarkers of clinical response and benefit to immune checkpoint inhibitor therapy
US20240024474A1 (en) 2020-11-13 2024-01-25 David Avigan Personalized fusion cell vaccines
WO2022159793A2 (en) 2021-01-25 2022-07-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for identifying neuroendocrine prostate cancer
WO2022261183A2 (en) 2021-06-08 2022-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating and/or identifying an agent for treating intestinal cancers
WO2023097119A2 (en) 2021-11-29 2023-06-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to modulate riok2
WO2023158732A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for decreasing pathologic alpha-synuclein using agents that modulate fndc5 or biologically active fragments thereof
LT7046B (lt) 2022-04-15 2024-02-12 Vilniaus Universitetas Hidrolazės ir jų panaudojimas

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1310924C (en) * 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
GB8629892D0 (en) * 1986-12-15 1987-01-28 Wellcome Found Antiviral compounds
GB8712528D0 (en) * 1987-05-28 1987-07-01 Clayton Found Res Gene transfer
GB8712745D0 (en) * 1987-05-30 1987-07-01 Wellcome Found Antiviral compounds
NZ225599A (en) * 1987-08-04 1991-09-25 Bristol Myers Co Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells
JP2917998B2 (ja) * 1988-02-05 1999-07-12 ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 修飾された肝細胞およびその用途
JPH03504079A (ja) * 1988-03-21 1991-09-12 カイロン　コーポレイション 組換えレトロウィルス
JPH04504361A (ja) * 1989-04-05 1992-08-06 ノバセル　コーポレイション 感染性標的化複製―欠陥ビリオン
WO1991002805A2 (en) * 1989-08-18 1991-03-07 Viagene, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
CA2075927A1 (en) * 1990-02-16 1991-08-17 Victor A. Raso Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP0657541A1 (en) 1995-06-14
EP0657540A1 (en) 1995-06-14
FI904257A0 (fi) 1990-08-29
AU698283B2 (en) 1998-10-29
GB8919607D0 (en) 1989-10-11
AU6458794A (en) 1994-09-08
PT95134B (pt) 2003-06-30
EP0657539A1 (en) 1995-06-14
EP0690129A1 (en) 1996-01-03
NZ235093A (en) 1992-11-25
EP0415731A2 (en) 1991-03-06
HU905679D0 (en) 1991-03-28
CN1058993C (zh) 2000-11-29
AU6199190A (en) 1991-03-07
ZA906894B (en) 1992-05-27
EP0415731B1 (en) 2003-04-02
PT95134A (pt) 1991-05-22
JPH03172189A (ja) 1991-07-25
DK0415731T3 (da) 1992-01-08
ES2194833T3 (es) 2003-12-01
IE903125A1 (en) 1991-03-13
AU647747B2 (en) 1994-03-31
DE69034054T2 (de) 2004-02-12
EP0415731A3 (en) 1992-01-08
DE69034054D1 (de) 2003-05-08
HU211655A9 (en) 1995-12-28
ATE236260T1 (de) 2003-04-15
DD297447A5 (de) 1992-01-09
MY107402A (en) 1995-11-30
CA2024253A1 (en) 1991-03-01
DK0415731T5 (da) 2003-07-28
CA2024253C (en) 2001-12-04
IL95515A0 (en) 1991-06-30
AU3422897A (en) 1997-11-20
CN1050899A (zh) 1991-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT58814A (en) Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer
EP0832980B1 (en) Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US5861290A (en) Methods and polynucleotide constructs for treating host cells for infection or hyperproliferative disorders
JP2021006031A (ja) ミニプロモーターカセットを含むレトロウイルスベクター
KR100361254B1 (ko) 발현표적화를위한태아성암항원의전사조절서열
WO1997019180A2 (en) Vector consisting of a transcriptional regulatory dna sequence linked to a dna sequence encoding beta-lactamase for enzyme prodrug therapy
EP0573479A1 (en) Chimeric tar enzyme construction for hiv therapy
JPH11511979A (ja) ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのｗａｐまたはｍｍｔｖ制御配列の使用
US6743631B1 (en) Use of human serum resistant vector particles and cell lines for human gene therapy
US6555370B1 (en) Bifunctional selectable fusion genes
US11970708B2 (en) Gene therapy vector with minimizing recombination, recombinant retrovirus comprising the vector, and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant retrovirus
US20040115800A1 (en) Selectable marker for genetically engineered cells and tissues
CA2328596A1 (en) Cytosine deaminase gene
JP2003530855A (ja) 遺伝子治療のためのベクター
US20030103940A1 (en) Vector
CA2047363C (en) Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
RU2476596C1 (ru) Многопрофильный промотор, экспрессирующий вектор и способ избирательного убийства раковых клеток с их использованием
Sugimoto et al. [39] Construction of MDR1 vectors for gene therapy
CN1162643A (zh) 用于癌症治疗的分子嵌合体的制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee