CN1162643A - 用于癌症治疗的分子嵌合体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

描述了用DNA重组技术产生的新的分子嵌合体。它们包含一个连于其上的靶组织特异性转录调控顺序，该顺序控制一种杂合酶如水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因的表达。将分子嵌合体包装到能够感染哺乳动物组织的合成还原病毒颗粒中。该颗粒则可给患者施用，转录调控顺序将在靶组织(如癌组织)中被选择性地转录激活。施用能被酶选择性代谢的化合物，将就地产生细胞毒性或细胞抑制性代谢物，从而选择性地杀伤靶细胞或抑制其生长。

Description

用于癌症治疗的分子嵌合体的制备方法及应用

本申请是于1990年8月29日提交的、申请号为90107343.1、发明名称为“用于癌症治疗的分子嵌合体的制备方法及应用”的专利申请的分案申请。

本发明涉及分子嵌合体；感染性病毒粒子；其构建方法；含有它们的约物制剂；它们在治疗上的应用，特别是在病毒指导的酶前药治疗(具体说是癌症的治疗，更具体地说是肝细胞癌的治疗)上的应用；以及可被杂合酶催化成细胞毒性或细胞抑制性代谢物的药剂(如嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶)在病毒指导的酶前药治疗上的应用。

所有的癌症是全世界的主要病因之一。癌症化疗领域的研究已经得到了多种具有不同程度疗效的抗肿瘤药剂。临床上应用的标准药剂包括亚德里亚霉素、放线菌素D、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、顺氯氨铂、长春新碱和长春花碱。但是，已知这些现有的抗肿瘤药剂有各种缺点，例如对健康细胞有毒、某此类型的肿瘤产生抗性。其它形式的疗法如外科手术也是已知的。但本领域专业人员认识到需要治疗肿瘤的新方法和新实体。

肝细胞癌(HCC)是当今世界主要的恶性疾病之一，其中发病率最高的是日本、中国、亚洲的其它地区和非洲的亚撒哈拉地区。最近的证据表明，欧洲和北美的肝细胞瘤发病率在上升。估计这种疾病每年造成高达大约1,250,000人的死亡，或者这一死亡人数与该疾病有关，因而从数字上看这是世界上主要的恶性疾病之一。

肝细胞癌的预后总是很差，遍布世界的发病率几乎与死亡率相等。诊断后的平均生存时间低于四个月。只偶尔见到长期生存(定义为诊断后生存一年以上)。大多数肝细胞癌患者或者死于伴随或不伴随大量出血的肝衰竭并发症，或者死于巨大的肿瘤负荷的一般作用，这些作用伴有恶病质、营养不良、感染和脓毒症。虽然会发生远距离转移(高达90％的患者在死亡时有转移肿瘤)，但最经常限制生存的仍是区域性疾病。因此，虽然人们会认识到转移性疾病的治疗也具有重要意义，但旨在控制肝肿瘤的治疗才是适当的(Kew M.C.Postgraduate MedicalJoumal59(Suppl.)78-87，1983；Berk.P.(Ed)Seminars in Liver Disease4(2)，Thieme-Stratton Inc.N.Y.N.Y.，1984)。

临床医师现有的疗法从整体上说并不是这种疾病的有效疗法(Nerenstone等，Cancer Treatment Reviews 15：1-31，1988)。迄今为止，外科手术一直是唯一的有效疗法。但在作出诊断时，绝大多数患者不能子受彻底的外科手术。在某些研究(Nerenstone等，同上)中发现，能够承受外科手术的患者不足3％，并且在这个很小的百分比中，有大约50％出现术后病变(Nerenstone等，同上)。

体内单一或配伍药剂化疗法和放射疗法基本无效，这更增加了对治疗这种疾病的新途径和新疗法的需求。

基因疗法涉及把某些新基因稳定地整合到特定的靶细胞中，并在整合后表达这些基因，从而改变该特定靶细胞的表型(综述见Anderson，W.F.Science 226：401-409，1984；Mc Cormick，D.Biotechnology 3；690-693，1985)。基因疗法对涉及一个缺陷酶或缺失酶的置换的遗传病的治疗可能是有益的，所述的酶有Lesch Nyhan病中的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；严重免疫缺陷疾病中的嘌呤核苷磷酸化酶；严重综合免疫缺陷病中的腺苷脱氨酶。但基因疗法仍未应用于临床，虽然某些类型的基因疗法可能很快就要应用于某些疾病。

本发明人发现，有可能用能够选择性地转化为细胞毒性或细胞抑制性代谢物的化学药剂，选择性地抑制哺乳动物癌细胞的生长或将其杀死。达到这一目的方法是：构建一种分子嵌合体，它包含一个“靶组织特异性”转录调控顺序(TRS)，该顺序在靶组织如癌细胞中被选择性激活，这便控制了一种杂合酶的表达。此分子嵌合体可通过合适的载体进行操作并掺入感染性病毒粒子中。给患者施用含有分子嵌合体的感染性病毒粒子后，即在靶细胞内选择性地表达出酶。这样便可就地达到施用这样一些化合物的目的，这些化合物能被上述酶选择性代谢成某些代谢物，而这些代谢物要么被进一步代谢成细胞毒性或细胞抑制性药剂，要么实际上就是细胞毒性或细胞抑制性药剂。

本发明是普遍适用的，并将就肝细胞癌来说明。

如上所述，患有肝细胞癌的绝大部分串者死于原发肿瘤。但大约有90％的肝细胞癌患者在死亡时有明显的转移性病变。这些转移呈现出典型的原发肿瘤表型，因而这些转移也将选择性地表达杂合酶，从而将本文限定的所施用的化合物选择性地激活为细胞毒性或细胞抑制性代谢物。

可以采用多种酶前药配伍方式，其前提是该酶能够直接或通过一种中间体将所施用的化合物激活为细胞抑制性或细胞毒性代谢物。同样，化合物的选择将取决于所用的酶系统，但必须被该酶直接或间接地选择性代谢为细胞毒性或细胞抑制性代谢物。这里所用的术语杂合酶是指一种表现出适当的选择特性的酶。

水痘带状疱疹病毒(VZV)编码一种特异性的胸苷激酶蛋白。该基因已作了克隆及顺序测定和定性(J.Gen.Virol.67：1759-1816，1986)。与哺乳动物酶不同的是，VZV胸苷激酶能选择性地使特异的嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶化合物单磷酸化。此外，本发明人还发明，某些嘌呤和嘧啶类似物，特别是下文限定的式(I)和(II)的化合物，在经过遗传修饰而能选择性地表达VZV胸苷激酶的特定哺乳动物细胞中，转化成细胞毒性或细胞抑制性代谢物。例如，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤转化成9-β-D-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤三磷酸(AraATP)。

其它酶前药配伍包括：细菌(例如假单胞菌)酶羧肽酶G2与前药对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸的配伍(由此化合物上切下谷氨酸部分，释放出一种有毒的苯甲酸芥子)；碱性磷酸酶(例如小牛肠碱性磷酸酶)能将无活性的磷酸化化合物，例如磷酸鬼臼乙叉苷、磷酸阿霉素、磷酸丝裂霉素，转化成有毒的去磷酸化代谢物；青霉素V酰胺酶能将阿霉素和苯丙氨酸氮芥的苯氧乙酰胺衍生物转化成有毒代谢物；真菌(例如尖镰孢)胞嘧啶脱氨酶能将5-氟胞嘧啶转化成有毒的5-氟尿嘧啶。

在哺乳动物细胞中，某些基因是普遍表达的。但大多数基因只在一定时间内或在特定组织内表达，或者在对细胞外诱导剂作出响应时被激活，例如，某些基因只在特定细胞类型的个体发育中的非常准确的时间，或者在对某些诱导性刺激作出响应时才活泼转录。这种调控作用部分地是由转录调控顺序(例如启动子和增强子调控DNA顺序)与具有DNA结合作用的顺序特异性蛋白转录因子之间的相互作用介导的。

本发明人发现，有可能改变某些哺乳动物组织，例如肝组织或转化的肝组织，使其选择性地表达如上所限定的杂合酶，例如VZV胸苷激酶。这可通过在一个表达盒中构建分子嵌合体来实现。

表达盒本身在分子生物学领域是公知的。这样一种表达盒将含有为在哺乳动物细胞内表达杂合酶所需的所有必需DNA顺序。例如，优选的表达盒将含有一种分子嵌合体，此嵌合体含有VZV胸苷激酶编码顺序、一个适当的哺乳动物基因多聚腺苷酸化信号(即能在哺乳动物细胞内起作用的多聚腺苷酸化信号)、以及正确取向的合适增强子和启动子顺序。

在哺乳动的细胞内，编码信使RNA的基因的完整而有效的转录调控，通常需要两个DNA顺序：启动子和增强子。启动子位于紧接转录起始位点上游(5′)处。启动子顺序为准确而有效的转录起始所需。不同的基因特异性启动子具有共同的组织形式。典型的启动子包括一个称为TATA盒的富含AT区(位于距转录起始位点5′端大约30个碱基对处)和一个或多个上游启动子成份(UPE)。UPE是与顺序特异性细胞核转录因子相互作用的主要靶子。启动子顺序的活性由称为增强子的其它顺序来调节。增强子顺序可能与位于上游(5′)或下游(3′)的启动子相距很远。因而增强子以取向或位置依赖性方式起作用。但由于具有可互换的相似结构组织和功能，启动子和增强子之间的绝对区别在某种程度上有随意性。增强子由启动子顺序来提高转录速度。多半正是由于顺序特异性转录因子与UPE间的相互作用和增强子顺序，才使哺乳动物细胞实现了组织特异性基因表达。结合在UPE上的这些蛋白转录因子(组织特异性反式激活因子)和增强子(起顺式作用的调控顺序)的存在，使得转录机构的其它组分，包括RNA聚合酶，能够以组织特异性选择性和准确性启动转录。

转录调控顺序特别是启动子和增强子的选择将取决于靶组织。其实例包括：分别特异于正常肝细胞和转化肝细胞的清蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)转录调控顺序(例如启动子和增强子)；用于胃肠道、肺、乳房和其它组织的转化细胞的癌胚抗原(CEA)转录调控顺序；用于成神经细胞瘤的酷氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶或神经元特异性烯醇化酶转录调控顺序；用于神经胶质瘤的胶质纤维酸性蛋白转录调控顺序；用于胰腺肿瘤的胰岛素转录调控顺序。

其它实例包括用于某些肝肿瘤的特异于γ-谷氨酰基转肽酶的转录调控顺序，以及用于某些肺肿瘤的多巴脱羧酶。此外，也可使用来自某些致癌基因的转录调控顺序，因为这些顺序多半在某些类型的肿瘤中表达。其中较好的例子包括在乳房肿瘤中表达的HER-2/neu致癌基因调控顺序、和特异于成神经细胞瘤的N-myc致癌基因的调控顺序。

ALB和AFP基团就核酸顺序、基团结构、氨基酸顺序和蛋白二级折叠而言具有广泛的同源性(综述见Ingram等，PNAS 78：4694-4698，1981)。在个体发育中，这些基因彼此独立地但交互地表达。在正常发育中，ALB的转录在出生前不久便起始，并持续于整个成年期。成年的ALB转录表达仅限于肝脏。AFP通常在胎肝、卵黄囊的内脏内胚层和胎儿胃肠道中表达，但在出生后不久就下降至检测不出的水平，并且在非病原性或非再生性成肝脏或其它正常成年组织中表达不显著。但是，成人肝脏中的AFP转录在肝细胞癌中常常大大增强。此外，在睾丸的非精原细胞癌和混合癌、内胚层窦肿瘤、某些畸胎癌以及某些胃肠肿瘤中，AFP的转录也会提高。AFP和ALB的肝特异性表达是由其基因的调控顺序与存在于肝细胞核提取液中的反式激活转录因子之间的相互作用造成的。对产生在分子水平上结合的基因的肝细胞瘤特异性或一般肝特异性表达来说，分别优选AFP和ALB转录调控顺序，因为AFP和ALB基因在转录水平上受到调控，并且其mRNA属于肝脏中最丰富的聚合酶II转录本。

有几种哺乳动物ALB和AFP启动子和增强子顺序已得到了鉴定(综述见Genes and Develop.1：268-276，1987；Science235：53-58，1987；The Joumal of Biol.Chem.262：4812-4818，1987)。这些顺序分别使肝细胞(正常的和转化的)和肝细胞瘤中的基因得以选择性地和特异性地表达。

例如，如表1所示，有一个哺乳动物ALB启动子包含在位于清蛋白基因转录起始位点5′端的300bp片段中。包含在距鼠清蛋白基因转录起始位点5′端300bp与8,500bp之间的顺序，对肝特异性表达来说是非必需的。但有一个肝特异性增强子顺序包含在一个位于距转录起始位点5′端8,500bp至10,400bp的片段内(图1A)。如果有了ALB启动子和增强子成分，便可实现位于正确3′取向的杂合结构基因的肝特异性表达(图1B)。如果去掉位于距转录起始位点5′端300bp和8,500bp之间的非必需插入顺序，则相对于ALB启动子和增强子顺序位于正确取向的3′杂合结构基因仍维持肝特异性表达(图1C)。非必需顺序的去除用本领域公知的标准分子生物学方法来实现，从而得到可用来直接进行VZV胸苷激酶的肝特异性表达的分子嵌合体。

与ALB基团的调控结构相似，AFP基因的调控成分在某些肝脏病理现象(如肝细胞癌)中促进AFP的组织特异性表达(Mol.Cel.Biol.6：477-487，1986；Science235：53-58，1987)。哺乳动物AFP基因的调控成分由一个特异的5′启动子邻接区(在某些哺乳动物中位于距该基因5′端85和52bp之间)组成。此顺序对于在肝细胞瘤中转录是必需的。此外，还有一些对鼠AFP基因非常确定的上游(5′)调控成分，其行为与经典增强子相同(Mol.Cel.Biol.6：477-487，1986；Science 235：53-58，1987)。这些上游调控成分定名为成分I、II、III，它们位于距鼠AFP基因转录起始位点5′端1,000至7,600bp之间。这三个增强子结构域在产生AFP的组织特异性表达时，在功能上并不等价。成分I和II指导AFP肝特异性表达的能力最强。应该注意的是，甲胎蛋白基因的调控顺序不仅有利地含有可供组织特异性转录激活的顺序，而且有利地含有可供在不该表达AFP的组织内阻遏表达的顺序。人甲胎蛋白基因的调控区也已经以类似的方式被定性(J.B.C 262：4812-4818，1987)。在胎肝、肝细胞瘤、睾丸非精原细胞癌、某些畸胎癌、某些胃肠肿瘤、以及特异表达AFP的其它正常和病理组织中，对AFP调控顺序处于正确3′取向的结构基因将使该结构基因得以选择性地表达。

本发明提供一种用于前药治疗的分子嵌合体，该嵌合体包含一个能够在哺乳动物癌细胞中被选择性激活的转录调控DNA顺序，以及一个与该转录调控DNA顺序有效连接并编码一种杂合酶的DNA顺序，所述酶能够催化前药转化为对癌细胞有毒的药剂，例如能够转化癌细胞而使其选择性地表达VZV胸苷激酶的DNA顺序。

本发明还在一个优选具体方案中提供一种分子嵌合体，它包含与VZV胸苷激酶基因编码顺序有效连接的转录调控顺序，特别是一个能够选择性地在哺乳动物靶组织中被激活的启动子。

具体地说，本发明提供一种分子嵌合体，它包含杂合酶(最好是VZV胸苷激酶)基因DNA编码顺序(包括适当的多聚腺苷酸化顺序)，该顺序以3′位以正确的取向与一个哺乳动物靶组织特异性转录调控顺序相连。该表达盒最好还含有一个增强子顺序。

启动子和增强子顺序最好选自下列基因之一的转录调控顺序：清蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、胰岛素或γ-谷氨酰基转肽酶，多巴脱羧酶、HER2/neu或N-myc致癌基因，或其它合适的基因。最好分别用ALB或AFP的调控顺序来直接进行肝特异性或肝细胞瘤特异性表达。

本发明的分子嵌合体可以利用标准的DNA重组技术来制备。例如，将VZV胸苷激酶基因(见图2A和2B)的编码顺序和多聚腺苷酸化信号置于相对于必需的ALB和AFP转录调控成分正确的3′取向。这些分子嵌合体使VZV胸苷激酶得以分别在正常表达ALB或AFP的细胞中选择性表达(图3A和3B)。在哺乳动物肝脏、肝细胞瘤、某些胃肠道肿瘤、睾丸非精原细胞癌、某些畸胎癌和其它肿瘤中，VZV胸苷激酶基因的表达将使这里限定的相对无毒的阿拉伯糖苷和嘧啶类能够选择性地代谢成细胞毒性和/或细胞抑制性代谢物。

因此，本发明的第二方面提供一种构建分子嵌合体的方法，该方法包括：将编码杂合酶(如VZV胸苷激酶)基因的DNA顺序与一个组织特异性启动子相连接。

具体地说，本发明提供一种构建这里限定的分子嵌合体的方法，该方法包括，将一个编码杂合酶(例如VZV胸苷激酶)基因编码顺序和多聚腺苷酸化信号的DNA顺序，与一个哺乳动物组织特异性转录调控顺序(如启动子顺序和增强子顺序)相连接。

VZV胸苷激酶编码顺序和3′多聚腺苷酸化信号位于大约1,381bp的AccI/NdeI限制性核酸内切酶片段内(见图2)。

最好是用含有VZV胸苷激酶编码顺序和多聚腺苷酸化信号的1381bp AccI/NdeI片段与哺乳动物组织特异性启动子和增强子顺序连接，但应认识到，可以采用含有VZV胸苷激酶的其它DNA片段。此外，VZV胸苷激酶多聚腺苷酸化信号可以用其它合适的多聚腺苷酸化信号来代替，例如SV40病毒或其它哺乳动物基因的多聚腺苷酸化信号。

启动子和增强子顺序最好选自下列基因之一的转录调控顺序：清蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、胰岛素、γ-谷氨酰基转肽酶、多巴脱羧酶、HER2/neu或N-myc致癌基因，或其它合适的基因。

这些分子嵌合体可以用一个释放系统释放到靶细胞上。为给患者施用，必须提供一个能将分子嵌合体稳定整合到细胞中的有效体内释放系统。已知的方法所利用的技术有磷酸钙转染、电穿孔、微注射、脂质体转移、射弹法(Ballistic barrage)或还原病毒感染。这方面的综述见Biotechniques6(7)，1988。

整合合成基因的细胞还原病毒感染技术，采用了本领域已知的还原病毒穿梭载体(参见例如Mol.and Cell Biol.6：2985-2902，1986)。还原病毒穿梭载体基本上是用包含在质粒中的DNA形式的还原病毒产生的。这些质粒还含有选择和在细菌中生长所必需的顺序。还原病毒穿梭载体是用本领域公知的标准分子生物学技术构建的。还原病毒穿梭载体已去除了内源性亲本还原病毒基因(如gag、pol和env)，并插入所要的DNA顺序，如上述的分子嵌合体。但它们含有可供病毒包衣壳作用、原病毒对靶基因组的插入、信息拼接、终止和多聚腺苷酸化的适当的还原病毒调控顺序。还原病毒穿梭载体已从莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MLV)得到，但应认识到，也可使用其它还原病毒，例如密切相关的莫洛尼氏鼠肉瘤病毒。某些DNA病毒也可作为释放系统使用。牛乳头瘤病毒(BPV)在染色体外复制，因此以BPV为基础的释放系统有一个优点，即所释放的基因以非整合方式保持。

本发明的第三方面提供一种含有如前面所限定的分子嵌合体的还原病毒穿梭载体。

还原病毒介导的基因转移系统的优点在于：基因高效率地释放到靶组织中、病毒基因组进行顺序特异性整合(在5′和3′长末端重复(LTR)顺序处)、所释放的DNA与其它DNA释放系统相比很少有重排。

因此，本发明的一个优选方案提供一种还原病毒穿梭载体，该载体包含一个DNA顺序，其中含有一个5′病毒LTR顺序、一个顺式作用的泼西(psi)包衣壳顺序、一个如前面所限定的分子嵌合体、以及一个3′病毒LTR顺序(图4A和图4B)。

为有助于消除分子嵌合体的非组织特异性表达，一个优选的具体方案是将该分子嵌合体置于与5′还原病毒LTR相反的转录取向(图4A和图4B)。此外，还可以加入一个由5′LTR顺序转录驱动的显性可选择标记基因。这样一个显性可选择标记基因可以是细菌的II型新霉素抗性基因NEO(氨基糖苷3′磷酸转移酶)，该基因赋予真核细胞对新霉素类似物G418硫酸(商标为genetiein)的抗性(图4A和4B)。NEO基因有助于含有这些顺序的包装细胞的选择(见下文)。

实施例中所用的还原病毒载体是以莫洛尼氏鼠白血病毒为基础的，但应该认识到，也可使用其它载体。这些含有NEO基因作为可选择标记的载体已有记载，例如N2载体(Science 230：1395-1398，1985)。

与还原病毒穿梭载体有关的理论问题是，还原病毒LTR调控顺序有可能激活位于宿主基因组中整合位点处的细胞致癌基因的转录。这个问题可以通过产生一个SIN载体(图4A)来消除。SIN载体是一些自我失活载体，它们在还原病毒LTR中含有一个包括启动子和增强子区在内的缺失。SIN载体的LTR顺序不激活5′或3′基因组顺序的转录。病毒LTR顺序的转录失消除了相邻的靶细胞DNA顺序的插入激活，同时也有助于所释放的分子嵌合体的选择性表达。SIN载体是通过在3′病毒LTR顺序中去除大约299bp而产生的(Biotechniques 4：504-512，1986)。

因此，本发明的还原病毒穿梭载体最好是SIN载体。

由于已从这些穿梭载体中去除了亲本还原病毒的gag、pol和env基因，可以利用辅助病毒系统提供还原病毒的gag、pol和env中间基因产物，从而将还原病毒载体包装或包衣壳成感染性病毒粒子。这是利用特化的“包装”细胞系来实现的，这些细胞系能够产生感染性的合成病毒，但仍缺乏产生任何检测的野生型病毒的能力。这样，人工合成病毒便含有一个本发明的嵌合体，该嵌合体包装在不合野生型辅助病毒的人工合成感染性病毒粒子中。这根据的是如下的事实：稳定整合到包装细胞中的辅助病毒含有病毒结构基因，但缺乏泼西位点，后者是一个顺式作用的调控顺序，必须包含在要包衣壳成感染性病毒颗粒的病毒基因组RNA分子中。

因此，本发明的第四方面提供一种感染性病毒粒子，它包含一个如上所述的还原病毒穿梭载体，所述载体被包衣壳在病毒蛋白内，从而产生感染性的复制缺陷型人工还原病毒。

还原病毒穿梭载体所包含的穿梭载体中，最好包含一个具有AFP或ALB转录调控顺序的分子嵌合体。具体地说，穿梭载体含有AFP/VZV胸苷激酶嵌合体或ALB/VZV胸苷激酶嵌合体。

除了去除泼西位点外，还可对辅助病毒LTR调控顺序作其它改变，以确保辅助病毒不被包装在病毒粒子中，并在逆转录和病毒整合水平上被阻断。

此外，也可将辅助病毒结构基因(即gag、pol和env)分别地、彼此独立地转移到包装细胞系中。由于这些病毒结构基因在包装细胞的基因组内被分隔开，所以很少有发生暗重组而产生野生型病毒的机会。

本发明的第五方面提供一种制备本发明的感染性病毒粒子的方法，该方法是将含有如上所述的本发明分子嵌合体的人工还原病毒穿梭载体释放至包装细胞系中。

包装细胞系中可以稳定地整合有一个缺乏泼西位点的辅助病毒和如上所述的其他调控顺序，也可以对包装细胞系进行改造而使其在基因组中含有辅助病毒结构基因。

本发明还提供一种如上所述的感染性病毒粒子，用于治疗，特别是用于治疗癌症，特别是用于治疗肝细胞癌、睾丸非精原细胞癌、某些畸胎癌和某些胃肠肿瘤。

利用组织特异性转录调控(如增强子和启动子)顺序来实现杂合酶特别是VZV胸苷激酶基因的选择性表达。可以通过肝细胞的选择性感染进一步改进选择性。存在于包装细胞系中的还原病毒env基因确定了对宿主感染的特异性。对用于构建包装细胞系的env基因进行修饰，从而产生能选择性地感染肝细胞的人工感染性病毒粒子。例如，可以对导入包装细胞中的还原病毒env基因进行某种方式的修饰，使人工感染性病毒粒子的被膜糖蛋白能通过由乙型肝炎病毒(HBV)所利用的特异受体介导的结合作用而选择性地感染肝细胞。

HBV主要通过特异受体介导的结合作用来感染肝细胞。由前S1和前S2顺序编码的HBV蛋白在HBV与肝细胞的附着中起主要作用(Hepadna Viruses，Robinson等编，189-203，205-221，1987)。对包装细胞的env基因进行修饰，使其含有HBV大S被膜蛋白的肝细胞结合位点。导入包装细胞的env基因的这些修饰，可以用本领域公知的标准分子生物学技术进行，这些修饰将有利于靶组织对病毒的吸收。

本发明的感染性病毒粒子可以用本领域公知的技术进行配制，并可作为与药用载体配成的制剂存在。在这种情况下，药用载体可包含一种适于作为媒液使用的液体介质，以将感染性病毒粒子导入患者体内。这样一种载体的例子是盐水。感染性病毒粒子可以是在这样一种媒液中的溶液或悬浮液。在这些药物制剂中还可以有稳定剂和抗氧化剂和/或其它赋形剂，这些制剂可以用任何常规方法如口服或肠胃外途径给哺乳动物施用。具体地说，感染性病毒粒子可以通过静脉或动脉输入来施用。在治疗肝细胞癌时，用肝动脉输入法可能较为有利。

因此，本发明提供一种药物制剂，该制剂包含感染性病毒粒子与药用载体的混合物。

此外，本发明还提供制备这里所述的药物制剂的方法，包括使含有分子嵌合体的人工感染性病毒粒子与药用载体混合。

虽然可以利用可被酶选择性转化的任何适当的化合物，但本发明还提供式I或II的化合物用于一种药物的制备，这种药物可与本发明的分子嵌合体或人工感染性病毒粒子一起，用于治疗能够表达VZV胸苷激酶的癌症，特别是用于治疗肝细胞癌。

已在如下所示的式(I)的6-取代嘌呤阿拉伯糖苷、它的盐和有生理功能的等价物，可作为抗VZV和细胞肥大病毒药剂，它们的应用和合成描述于已公开的欧洲专利申请0294114中。其中

R₁为卤素、C_1-5烷氧基、卤素取代的C_1-5烷氧基、被C_1-5烷基单取代或二取代的氨基、被一个或多个氟原子取代的C_1-5烷基、C_3-6环烷基、或含有C_4-7碳原子和或有或无的双键的含氮杂环；R₂为氢、卤素或氨基。

式II化合物如下所示：其中X代表1，2-亚乙烯基或亚乙炔基；R¹代表氧或亚氨基；R²代表氢原子、C_1-2烷基、C_3-4支链烷基或环烷基，例如异丙基或环丙基；R³代表氢原子或酰基，例如C_1-4链烷酰基或可被例如一个或多个卤素、烷基、羟基或烷氧基取代基取代的苯甲酰基；R⁴代表氢原子或羟基；条件是：当R²、R³和R⁴各代表氢原子时，R¹不代表氧。

应该认识到，当R³不为酰基时，式(II)的化合物可以以其互变异构形式存在。特别优选的式I和II化合物是9-β-D-呋喃阿拉伯糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤和1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-丙炔基尿嘧啶。

这些化合物及其合成方法已在欧洲专利申请0272065中公开，这些化合物被认为具有抗VZV活性。

上述嘧啶核苷和嘌呤阿拉伯糖苷，还包括这些化合物的可药用衍生物，即任何可药用盐、酯或该酯的盐，或在施用于人体后能提供(直接地或间接地)活性代谢物或其残基的任何其它化合物。该化合物最好在口服时有效。

治疗哺乳动物时的剂量和准确方案，当然要由主治医师决定，这将取决于包括欲治疗症状的类型和严重程度在内的各种因素。但对肝细胞癌来说，以每毫升感染性病毒粒子2×10⁵至2×10⁷集落形成单位(CFU/ml)的效价肝动脉输入人工感染性病毒粒子可能会适于一般的肿瘤。所输入的病毒粒子的总量将取决于肿瘤的大小，并最好以分剂量给予。

前药治疗：在用感染性病毒粒子感染后，施用本发明的化合物，这些化合物在合成代谢中转化为细胞毒性或细胞抑制性代谢物时，关键性的第一个磷酸化步骤特异地需要VZV胸苷激酶活性。

前药的剂量最好在每天每千克患者体重0.1到250毫克范围内，最好是每千克体重0.1至100毫克。

下列实施例用来说明本发明，但不应误认为是限制本发明。

                     实施例1

           清蛋白转录调控顺序/VZV胸苷激酶分子

                     嵌合体的构建

用限制性核酸内切酶对含有VZV胸苷激酶基因组的约2200bpEcoRI/BamHI片段的约4896bp质粒(称为22TK)(Virology 149：1-9，1986；由J.Ostrove，NI H，Bethesda，Md供给)进行消化，用洗脱捕获(elutrap)电泳室(Schleicher and Schuell，Keene NH，USA)以电洗脱法纯化出含有VZV胸苷激酶基因编码顺序和多聚腺苷酸化信号的约1381bpAccI/Nde I DNA片段(所有限制酶得自Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg MD，USA；New England Biolabs，Mass，USA；或Promega，Madison，Wi，USA；所有酶反应都按供货商的说明进行)。纯化出的DNA片段含有完整的VZV胸苷激酶编码顺序和多聚腺苷酸化信号，但不包括任何VZV胸苷激酶启动成分(见图2A和2B)。

用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD，USA)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)进行处理，使纯化出的1381bp Acc I/Nde I VZV胸苷激酶片段的5′伸出端成为平末端。

由Richard Palmiter(华盛顿大学，美国华盛顿州西雅图市)得到含有约2300bp ALB E/P顺序的约5249bp质粒，称为2335A-1。此构建体含有肝特异性表达所必需的顺序，但缺乏非必需的插入顺序。在相对于转录起始位点+23位处，有一个唯一的BamHI限制性核酸内切酶识别位点。用限制性核酸内切酶BamHI消化2335A-1，并如上所述用Klenow酶和dNTP处理使5′伸出端成为平末端。

用T4 DNA连接酶(BRL，Gaithersburg，MD)将含有VZV胸苷激酶编码顺序和多聚腺苷酸化顺序的平末端AccI-Nde I片段连接到2335A-1的平末端BamHI位点中，产生pCR73，从而构建出ALB E/PVZV胸苷激酶嵌合体(图5)。与上述所有连接相似，用本领域公知的方法进行限制性核酸内切酶消化，从而确定连接后片段的取向。与所有实施例中所述的所有质粒相似，pCR73含有在细菌内复制所需的以及适于用本领域公知方法进行扩增的必需顺序。用电洗脱法从pCR73中纯化出ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合体，其形式为约3880bp的SstI/KpnI限制性核酸内切酶片段(图5)。用T4 DNA聚合酶和dNTP进行处理，使3′伸出端成为平末端。然后将这个SstI/KpnI平末端限制片段导入莫洛尼氏鼠白血病毒还原病毒穿梭载体系统(见下面的实施例3)。

pCR73已于1989年8月18日保藏于ATCC，登记号为ATCC68077。

                        实施例2

                 甲胎蛋白转录调控顺序/

                  VZV胸苷激酶的构建

分离出VZV胸苷激酶编码顺序和多聚腺苷酸化位点，其形式为pCR73的约3,300bp BamHI-XmnI限制性核酸内切酶片段(图6)。用Klenow酶和dNTP进行处理使BamHI限制性核酸内切酶位点的5′伸出端成为平末端。此DNA片段含有VZV胸苷激酶基因的完整编码顺序和多聚腺苷酸化位点，但不含有任何增强子或启动子顺序。从加拿大卡尔加里大学的T.Tamaoki处得到含有约5,100bp人AFP5′邻接DNA的约9996bp质粒pAF5.1-CAT。通过用XmnI消化和用HindIII部分消化，从pAF5.1-CAT中分离出一个从人AFP基因的约-5.1kb至+29kb的DNA片段。用T4 DNA连接酶使该XmnI/Hind III片段与BamHI/XmnI VZV胸苷激酶片段连接，形成pCR77(图6)。用电洗脱法从pCR77中纯化出AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合体，其形式为约6699bp Aat II/Pst I限制性核酸内切酶片段。然后如实施例1所述将此片段用T4 DNA聚合酶和dNTP处理，产生平末端限制片段。

pCR77已于1989年8月18日保藏于ATCC，登记号为ATCC68079。

                   实施例3

           含有实施例1的分子嵌合体

        的还原病毒穿梭载体构建体的构建

将pCR73的纯化的Sst I/kpn I平末端片段连接到称为N2(XM5)的莫洛尼氏鼠白血病还原病毒载体中(Science230：1395-1398，1985，得自S.Karrlson，NI H，Bethesda，MD，USA)，从而构建出含有ALB E/PVZV胸苷激酶嵌合体的还原病毒穿梭载体pCR74。在用T4 DNA连接酶连接到pCR73的Sst I/Kpn I片段中之前，用限制性核酸内切酶XhoI消化N2(XM5)，并用Klenow酶和dNTP进行处理，使5′伸出端成平末端(图5)。

含有ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合体的还原病毒穿梭载体pCR74已通过限制性核酸内切酶图谱分析和DNA顺序分析进行了定性，从而证实了它的一级顺序。邻接ALB E/P与VZV胸苷激酶顺序连接点处的顺序示于图7。

pCR74已于1989年8月18日保藏在ATCC，登记号为ATCC68078。

                  实施例4

          含有实施例2的分子嵌合体

       的还原病毒穿梭载体构建体的构建

将含有AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合体的pCR77的纯化的AatII/pst I片段连接到N2(XM5)中，从而构建出还原病毒穿梭载体pCR78(图6)，N2(XM5)已如实施例3所述用XhoI进行了消化并用T4 DNA聚合酶和dNTP处理成平末端。含有AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合体的还原病毒穿梭载体pCR78已通过限制性核酸内切酶图谱分析和DNA顺序分析进行了定性，从而证实了它的一级顺序。邻接AFP E/P与VZV胸苷激酶连接点的顺序示于图8。

pCR78已于1989年8月18日保藏在ATCC，登记号为ATCC68080。

                  实施例5

                病毒的生产

从ATCC(ATCC CRL9078)得到前述的称为PA317的包装细胞系，该细胞系有三个包含在5′LTR、泼西调控顺序和3′LTR内的变异(Mol.and Cell Biol.6(8)：2895-2902，1986)。通过电穿孔或感染将实施例3和4中所述的人工还原病毒构建体放入包装细胞系中。进行电穿孔时，将20微克线性化的质粒DNA电穿孔到磷酸缓冲蔗糖中的二百万个PA317细胞中，采用280伏、25微法拉的电容，总体积为0.8毫升。能够得到至少150个G418抗性集落/20微克质粒DNA/二百万个PA317细胞。进行感染时，将20微克线性化的质粒DNA电穿孔到二百万生态适应性(ecotropic)包装细胞(如Psi2细胞)中。两天后，用培养上清液感染兼性适应性(amphotropic)包装细胞系PA317，并分离出G418抗性集落。电穿孔和感染技术都是将G418抗性集落用有限稀释法进行单细胞克隆，并用Southem印迹法进行分析，在NIH 3T3细胞(ATCC)中进行滴定，从而鉴定出全长病毒产量最高的克隆。对含有pCR74的PA317细胞分离出17个单细胞克隆，从其中的10个克隆中提取DNA。利用不同的限制性核酸内切酶，并用NEO和VZV胸苷激酶顺序作为放射性杂交探针，对这10个DNA样品进行深入的Southern印迹分析。在所分析的10个克隆中，有两个没有显现出任何截短的迹象，因而被认为是全长的。对含有pCR78的PA317细胞分离出29个单细胞克隆，并从25个克隆中得到DNA。利用不同的限制性核酸内切酶，并用AFP、NEO和VZV胸苷激酶顺序作放射性杂交探针，对这25个样品进行深入的Southern印迹分析。在所分析的25个克隆中，有5个没有显现出任何截短的迹象，因而被认为是全长的。利用标准技术，在胸苷激酶-/-的NIH 3T3细胞中对含有全长病毒顺序的每个包装细胞系进行滴定。

                    实施例6

              用实施例5的含有ALB/VZV

            胸苷激酶或AFP/VZV胸苷激酶

            的全长感染性病毒粒子感染人

            肝细胞瘤细胞系(阳性对照)，

                然后测定VZV胸苷激酶活性、

                ara ATP的生成和药物敏感性

用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体或AFP/VZV胸苷激酶嵌合体的复制缺陷型全长人工还原病毒，感染称为Hep G2(ATCC HB8065)的人肝细胞瘤细胞系。感染并在1毫克Geneticin(商标)/毫升上进行选择后，测定细胞的VZV胸苷激酶活性。此外，在³H标记的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤(下表和附图中称为ara-m)存在下培养细胞，然后测定ara ATP。最后在上述化合物存在下培养细胞，并测定IC₅₀(生长抑制)。未用病毒感染的细胞或用N2病毒感染的细胞作为这些实验的对照样品。N2病毒不含VZV胸苷激酶遗传物质。

表1证实，用含有pCR74或pCR78的病毒感染的人肝细胞瘤细胞的VZV胸苷激酶活性，分别比对照细胞强904倍或52倍。

9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤(称为ara-m)可被VZV胸苷激酶选择性地单磷酸化，并在随后的合成代谢中转化为细胞毒性的ara ATP。图9证实，用含有pCR74或pCR78的病毒感染并在³H标记的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下培养的Hep G2细胞，形成大量的细胞毒性³H-ara ATP。

用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR74)或AFP/VZV胸苷激酶(pCR78)嵌合体的复制缺陷型全长人工还原病毒感染的Hep G2细胞，在不同量的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下培养5天，并测定生长抑制作用，以细胞数和DNA含量来量度。

表2证实，在对照细胞和用N2感染的Hep G2细胞中，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC₅₀(50％生长抑制)高于2000μM。用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR74)或AFP/VZV胸苷激酶(pCR78)嵌合体的复制缺陷型全长人工还原病毒感染的Hep G2细胞，其IC₅₀分别为5μM和175μM。含有AFP/VZV胸苷激酶(pCR78)嵌合体的Hep G2细胞的单细胞克隆表明，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC₅₀水平可进一步降至约40μM。

                     实施例7

              VZV胸苷激酶表达的选择性

取五个人非肝细胞瘤细胞系，用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR74)的复制缺陷型全长人工还原病毒进行感染。这些细胞系是：Wi DR(ATCC CCL218)、MR90(ATCC CCL186)、MCF7(ATCCHTB22)、Detroit555(ATCC CCL110)和SW480(ATCC CCL228)。在感染并在Geneticin(商标)上进行选择后，如上所述测定这些细胞的VZV胸苷激酶活性和在9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下的生长抑制作用。在这五个用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR74)的复制缺陷型全长人工还原病毒感染的非肝细胞瘤细胞系中，其VZV胸苷激酶活性或对9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的药物敏感性，比未感染的亲本细胞系没有提高。这证实了VZV胸苷激酶在肝细胞瘤中表达相对于在非肝细胞瘤细胞中表达的选择性。

附图说明

图1：清蛋白增强子和启动子顺序与清蛋白基因(IA)、杂合基因(IB)和不带非必需顺序的杂合基因(IC)之间关系的图示。

图1A：清蛋白的肝特异性表达；

图1B：以正确取向与完整的清蛋白增强子和启动子顺序的3′端相连的杂合基因(VZV胸苷激酶)的肝特异性表达；

图1C：以正确取向与截短的清蛋白调控顺序的3′端相连的杂合基因(VZV胸苷激酶)的肝特异性表达。

图2A：水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因的简图。

图2B：VZV胸苷激酶结构域的顺序。画出了VZV胸苷激酶基因及5′和3′邻接区的顺序(文献报道为碱基642276至66255(Gen.Virol.67：1759-1816，1986))。VZV TATA盒和多聚腺苷酸化信号画了下线。画出了用于亚克隆含有VZV胸苷激酶编码顺序和多聚腺苷酸化信号的1381bp AccI/NdeI片段的AccI和NdeI限制性核酸内切酶位点。这个1381bp片段以正确取向与肝特异性或肝细胞瘤特异性转录调控顺序的3′端相连，从而分别达到肝特异性或肝细胞瘤特异性表达。

图3A：清蛋白转录调控顺序/VZV胸苷激酶分子嵌合体。

图3B：甲胎蛋白转录调控顺序/VZV胸苷激酶分子嵌合体。

图4A：含有甲胎蛋白/VZV胸苷激酶分子嵌合体的原病毒形式的还原病毒。

图4B：pCR78。含有AFP转录调控顺序与VZV胸苷激酶基因编码顺序的人工分子嵌合体的原病毒形式的人工还原病毒穿梭载体。画出了包含在一个供在细菌中扩增的质粒中的这个人工穿梭载体。所画出的质粒是一个pBR322衍生物。穿梭载体是一个莫洛尼氏鼠白血病毒衍生物。这些以莫洛尼氏鼠白血病毒为基础的穿梭载体已以N2载体为例子作了描述(Science230：1395-1398，1985)。

图5：显示pCR74构建过程的流程图。

图6：显示pCR78构建过程的流程图。

图7：pCR74中邻接鼠ALB E/P与VZV胸苷激酶顺序的连接点的顺序。顺序1-140来自鼠ALB E/P。顺序141-276来自VZV。ALB相邻启动子成分画了双下线。RNA转录起始点用星号(^*)标示。BamHI位点画了下线。垂直线标示ALB与VZV顺序的连接点。翻译所画出的VZV编码顺序。

图8：pCR78中邻接人AFP E/P与VZV胸苷激酶顺序的连接点的顺序。顺序1-73来自人AFP E/P。顺序93-228来自VZV。两条垂直线之间的顺序为人工接头顺序。AFP相邻启动子成分画了双下线。RNA转录起始点用星号(^*)标号。翻译所画出的VZV编码顺序。

图9：用对照、pCR74和pCR78感染的细胞中ara ATP的生成。

                      表1

用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR74)或AFP/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR78)的复制缺陷型全长人工还原病毒感染的Hep G2细胞中VZV胸苷激酶的活性。VZV胸苷激酶的活性定量为每30分钟、每毫克细胞蛋白中被磷酸化的ara M的量。病毒           VZV胸苷激酶活性                 提高倍数

          (ara MP(毫微摩尔)/微克蛋白/30分)无            9                                   0N2            4                                   0pCR74         4521                                904pCR78         258                                 52

                       表2

用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR74)或AFP/VZV胸苷激酶嵌合体(pCR78)的复制缺陷型全长人工还原病毒感染的Hep G2细胞的生长抑制。病毒              9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基

              -9H-嘌呤的IC₅₀无                ＞2000μMN2                ＞2000μMpCR74             5μMpCR78             175μM

Claims (29)

1一种制备用于前药治疗的分子嵌合体的方法，该方法包括：使一个能够在哺乳动物癌细胞中被选择性激活的转录调控DNA顺序与一个编码一种杂合酶的DNA顺序连接，所述酶能够催化前药转化为对癌细胞有毒的药剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中转录调控DNA顺序是组织特异性或癌特异性转录调控DNA顺序。

3.如权利要求2所述的方法，其中转录调控DNA顺序是癌特异性转录调控DNA顺序。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中转录调控DNA顺序包含一个启动子。

5.如权利要求4所述的方法，其中转录调控DNA顺序还包含一个增强子。

6.如前述权利要求1所述的方法，其中转录调控DNA顺序得自一种或多种下列基因：清蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、胰岛素、γ-谷氨酰基转肽酶、多巴脱羧酶、HER2/neu和N-myc。

7.如权利要求6所述的方法，其中转录调控DNA顺序得自癌胚抗原、HER2/neu或甲胎蛋白的基因。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述嵌合体还含有位于编码杂合酶的DNA顺序下游的多聚腺苷酸化信号。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述杂合酶选自水痘带状疱疹病毒胸苷激酶、羧肽酶G2、碱性磷酸酶、青霉素V酰胺酶及胞嘧啶脱氨酶。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述杂合酶是胞嘧啶脱氨酶。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞是表达甲胎蛋白的畸胎癌或胃肠道肿瘤细胞，或睾丸非精原细胞癌细胞或肝癌细胞。

12.一种制备含有分子嵌合体的还原病毒载体的方法，该方法包括连接含有以下顺序的DNA顺序：一个5′病毒长末端重复顺序、一个顺式作用的泼西包衣壳顺序、用权利要求1-11中任一项的方法制备的分子嵌合体、一个3′病毒长末端重复顺序。

13.一种制备感染性病毒粒子的方法，该方法包括将用权利要求12的方法制备的还原病毒载体包入病毒粒子中。

14.如权利要求13所述的方法，其中感染性病毒粒子是由包装细胞系产生的。

15.一种制备按权利要求12或13制备且能够选择性感染靶组织的感染性病毒粒子的方法，该方法包括对病毒粒子的env蛋白进行修饰以促进细胞特异性病毒吸收。

16.一种制备药物制剂的方法，该方法包括使按权利要求13至15中任一项制备的感染性病毒粒子与可药用的载体混合。

17.一种病毒载体在制备用于癌症前药治疗的药物中的应用，所述载体含有一种嵌合体，所述嵌合体包含一个能够在哺乳动物癌细胞中被选择性激活的转录调控DNA顺序，以及一个与该转录调控DNA顺序有效连接并编码一种杂合酶的DNA顺序，所述酶能够催化前药转化为对癌细胞有毒的药剂。

18.如权利要求17所述的应用，其中所述载体是还原病毒载体。

19.如权利要求18所述的应用，其中所述载体是一种自我失活(SIN)载体。

20.一种感染性病毒粒子在制备用于癌症前药治疗的药物中的应用，所述感染性病毒粒子是由一种包装细胞系产生的，所述细胞系含有如权利要求17-19中任一项所限定的病毒载体。

21.如权利要求20所述的应用，其中所述病毒粒子是一种还原病毒。

22.如权利要求20或21所述的应用，其中所述病毒粒子已被改造而能选择性地感染癌细胞。

23.如权利要求22所述的应用，其中所述经过改造的病毒粒子含有经过修饰的被膜糖蛋白。

24.如权利要求23所述的应用，其中所述经过修饰的被膜糖蛋白是含有大SHBV被膜蛋白的肝细胞结合位点的修饰env基因产物。

25.一种前药在制备用于癌症治疗的药物中的应用，所述治疗是用如权利要求17-24中任一项所述的分子嵌合体、病毒载体或感染性病毒粒子进行的。

26.如权利要求25所述的应用，其中所述前药是嘌呤阿拉伯糖苷或嘧啶阿拉伯糖苷。

27.如权利要求26所述的应用，其中所述前药是9-β-D-呋喃阿拉伯糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤或1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-丙炔基尿嘧啶，或其可药用的盐、酯或酯盐。

28.如权利要求26所述的应用，其中所述前药是对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸、磷酸鬼臼乙叉苷、磷酸阿霉素或磷酸丝裂霉素、或阿霉素或苯丙氨酸氮芥的苯氧乙酰胺衍生物。

29.如权利要求26所述的应用，其中所述前药是5-氟胞嘧啶。

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