HU211655A9 - Novel entities for cancer therapy - Google Patents

Novel entities for cancer therapy Download PDF

Info

Publication number
HU211655A9
HU211655A9 HU95P/P00180P HU9500180P HU211655A9 HU 211655 A9 HU211655 A9 HU 211655A9 HU 9500180 P HU9500180 P HU 9500180P HU 211655 A9 HU211655 A9 HU 211655A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
chimeric
molecular
vzv
gene
Prior art date
Application number
HU95P/P00180P
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Huber
Thomas Anthony Krenitsky
Cynthya Ann Richards
Original Assignee
Wellcome Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wellcome Found filed Critical Wellcome Found
Publication of HU211655A9 publication Critical patent/HU211655A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01021—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A jelen találmány foglalkozik molekuláris kimérákkal, fertőző virionokkal, ezek előállítási eljárásaival, az ezeket tartalmazó gyógyászati készítményekkel, ezen gyógyászati készítmények terápiás alkalmazásával, ezen belül elsősorban vírus-irányított enzim-előgyógyszer terápiával főleg rákok különösen májsejt-karcinóma kezelésében. Foglalkozik továbbá a találmány olyan szerek alkalmazásával, amelyeket heterológ enzimek képesek katalizálni citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká, pl. purin arabinozidokká és helyettesített pirimidinekké a vírus-irányított enzim-előgyógyszer terápiában.
A rák összes formája a morbiditás főbb okai között szerepel szerte a világon. A rák kemoterápiájának területén végzett kutatás sokféle tumorellenes szert alakított ki, amelyek különböznek a hatékonyság mértékében. A standard, klinikailag alkalmazom szerek között találjuk pl. az adriamicint, aktinomicin D-t, metotrexátot, 5-fluor-uracilt, cisz-platiniumot, vinkrisztint és vinblasztint. Ezekről a jelenleg rendelkezésre álló tumorellenes szerekről azonban ismert, hogy számos hátrányuk van, ilyenek pl. a toxicitás az egészséges sejtekre, továbbá bizonyos tumor-típusok ellenállóképessége. Ismeretesek a terápia más formái is, pl. a sebészi beavatkozás. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják hogy továbbra is szükségesek új megközelítések és gyógyszerkombinációk a rák-terápiában.
A májsejt-karcinóma (hepatocellular carcinoma; HCC) egyike a legfőbb rosszindulatú betegségeknek ma a világon; ennek előfordulása a lejelentősebb Japánban, Kínában, Ázsia más részeiben és a Szahara alatti Afrikában. A jelenlegi bizonyítékok azt sugallják, hogy a májsejt-karcinóma előfordulása emelkedőben van Európában és Észak-Amerikában is. Ez a betegség a becslések szerint mintegy 1 250 000 halálos áldozatot szed évente, és ezzel szám szerint a világ egyik legfőbb rosszindulatú betegsége.
A HCC prognózisa igen kevéssé bíztató: az elterjedtségi gyakoriság aránya csaknem azonos a halálozási aránnyal. A diagnózis után az átlagos túlélési idő kevesebb, mint négy hónap. A hosszú távú túlélés, amelyet úgy határozunk meg, hogy a diagnózistól számítva egy évnél több, csak alkalmanként fordul elő.
A legtöbb HCC beteg úgy pusztul el, hogy vagy a májelégtelenség komplikációi lépnek fel heveny vérzéssel vagy anélkül, vagy egy nagy tumor tömegének általános hatásai lépnek fel leromlással, alultápláltsággal, fertőzéssel és vérmérgezéssel. Mivel távoli áttételek is kialakulnak (haláluk időpontjában a betegek 90%-ának van áttételes tumora), gyakran a helyi betegségek korlátozzák a túlélést. Következésképpen ha a májtumor leküzdésére irányuló terápiák esetleg alkalmasak is lennének, számolni kell azzal, hogy nagy jelentősége van az áttételes betegség leküzdésének is [Kew M.C., Postgraduate Medical Journal 59(szupplementum) 78-87 (1983); Berk P.(szerkesztő): Seminars in Liver Disease 4 (2), kiadó: ThiemeStratton Inc., New York, New York (1984)].
A jelenleg az orvosok számára rendelkezésre álló terápiák összességében hatástalanok ennek a betegségnek a gyógyítására [Nerenstone és munkatársai: Cancer Treatment Reviews 15, 1-31 (1988)]. Mindezideig a sebészeti beavatkozás az egyetlen lehetséges gyógymód. A diagnózis időpontjában azonban a betegek túlnyomó többsége már nem képes arra, hogy radikális sebészi beavatkozásnak vesse alá magát. Bizonyos tanulmányokból (lásd pl. Nerenstone és munkatársai fentebb idézett munkáját) az derül ki, hogy a betegeknek kevesebb, mint 3%-át lehet tekinteni sebészi beavatkozás alá vethetőnek; ezek közül is mintegy 50% hal meg operáció utáni szövődményekben (Nerenstone és munkatársai, fentebb idézett munka).
A szisztematikus egyedi kemoterápia és a besugárzással kombinált kemoterápia viszonylag hatástalan; ez a tény különösen kiemeli, hogy ezen betegség kezeléséhez új megközelítések és terápiák szükségesek.
A génterápia új gének stabil integrálódását foglalja magában egy adott célsejtbe, valamint ezen gének kifejeződését; ezek a gének, ha megfelelően épültek be, megváltoztatják az adott célsejt fenotípusát [ezzel kapcsolatban lásd Anderson W.F. öszszefoglaló közleményét: Science 226, 401-409 (1984); valamint McCormick D. összefoglaló közleményét: Biotechnology 3, 690-693 (1985)]. A génterápia előnyös lehet olyan genetikai betegségek kezelésére amelyben egy hiányos vagy hiányzó enzimet kell helyettesíteni ilyen enzim pl. a hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz a Lesch-Nyhan betegségben; a purin nukleozid foszforiláz a súlyos immunhiányos betegségben (severe immunodeficiency disease), és az adenozin dezamináz a súlyos kombinált immunhiányos betegségben (severed combined immunodeficiency disease). Eddig azonban még a klinikai gyakorlatban a génterápiát nem alkalmazták, bár bizonyos rendellenességekben a génterápia bizonyos típusainak alkalmazása már küszöbön áll.
A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy szelektíven fel lehet tartóztatni az emló's karcinóma sejtek növekedését, vagy el lehet pusztítani ezeket olyan kémiai szerekkel, amelyek képesek szelektíven átalakulni citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká. Ezt egy olyan molekuláris kiméra megalkotásával érjük el amely egy „cél szövet-fajlagos” transzkripciós szabályozó szekvenciát (transcriptional regulatory sequence, TRS) tartalmaz; ez szelektíven aktiválódik a cél szövetekben, pl. rákos sejtekben és ez szabályozza egy heterológ enzim kifejeződését. Ezt a molekuláris kimérát megfelelő vektorokkal manipulálhatjuk és beépíthetjük valamely fertőző virionba. Amikor beadunk egy, a molekuláris kimérát tartalmazó fertőző viriont a betegbe, az enzim szelektíven kifejeződik a célsejtben. Ezután in situ elvégezhetjük olyan vegyületek beadását, amelyeket az enzim szelektíven metabolizál olyan metabolitokká, amelyek vagy tovább metabolizálódnak tényleges citotoxikus vagy citosztatikus szerekké, vagy már maguk is ilyen szerek.
A találmány általánosan alkalmazható; a bejelentésben a májsejt-karcinómára vonatkozóan mutatunk be példákat.
Amint fentebb említettük, a májsejt-karcinómában szenvedő betegek túlnyomó többsége a primer tumor2
HU 211 655 A9 bán hal meg. A HCC betegek mintegy 90%-ában azonban haláluk időpontjában egyértelmű áttételes betegségek is léteznek. Ezek az áttételek a primer tumor tipikus fenő típusát mutatják, ezek az áttételek is kifejezik tehát szelektíven a heterológ enzimet és így szelektíven aktiválják a beadott vegyületeket a fentebb leírt citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká.
Egy sor enzim-elógyógyszer kombinációt alkalmazhatunk; az a feltétel, hogy az enzim képes legyen szelektíven aktiválni a beadott vegyületet vagy közvetlenül, vagy egy intermedieren keresztül egy citosztatikus vagy citotoxikus metabolittá. A vegyület kiválasztása függ az alkalmazott enzimrendszertől; a vegyületnek azonban szelektíven metabolizálódnia kell az enzim segítségével - közvetve vagy közvetlenül - egy citotoxikus vagy citosztatikus metabolittá. A „heterológ enzim” kifejezés, ahogy itt használjuk, olyan enzimre utal, amely a szelektivitás megfelelő jellemzőit mutatja.
A Varicella zoster vírus (VZV) egy fajlagos timidin kináz fehérjét kódol. A gént már klónozták, szekvenciáját elemezték és jellemezték [J. Gén. Virol. 67, 17591816 (1986)]. A VZV timidin kináz, az emlős enzimekkel ellentétben, szelektíven mono-foszforilezi a speciális purin arabinozidokat és helyettesített pirimidin vegyületeket. A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá hogy bizonyos purin- és pirimidin analógok, elsősorban a (I) és (II) képlettel jellemzettek, citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká alakulnak át speciális emlős sejtekben, amelyek genetikailag úgy vannak módosítva, hogy szelektíven fejezzenek ki VZV timidin kinázt. így pl. a 9--D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H-purin átalakul 9—D-arabinofuranozil adenin trifoszfáttá (Ara ATP).
A további enzim- előgyógyszer kombinációk közt találjuk a bakteriális (pl. Pseudomonasból származó) G2 karboxi-peptidázt a para-N-bisz(2-klór-etil)-amino-benzoil-glutaminsav előgyógyszerrel. Amikor ebből a vegyületből a glutaminsavat lehasítjuk, toxikus benzoesav-mustár szabadul fel. Az inaktív, foszforilezett vegyületek pedig alkálikus foszfatáz (pl. borjúbélfoszfatáz) segítségével toxikus, defoszforilezett termékekké alakulnak át; az ilyen inaktív foszforvegyiiletekre példa lehet az etopozidfoszfát, doxorubicin-foszfát, vagy a mitomicin-foszfát. A penicillin V amidáz a doxorubicin és melfalan fenoxi-acetamid származékait toxikus metabolitokká alakítja át; és a gomba eredetű (pl. Fusarium oxysporumból kapott) citozin dezamináz az 5-fluor-citozint a toxikus 5-fluor-uracillá alakítja át.
Az emlős sejtekben bizonyos gének gyakorlatilag mindenütt kifejeződnek. A legtöbb gén azonban időlegesen és/vagy szövetfajlagos módon fejeződik ki, vagy sejten kívüli induktorokra adott válaszra aktiválódik; így pl. bizonyos gének csak az ontogenezis nagyon pontos időpontjaiban íródnak át aktívan, vagy csak bizonyos indukáló stimulálásra adott válaszra íródnak át. Ezt a szabályozást részben a transzkripciós szabályozó szekvenciák (amelyek pl. promotor és fokozó szabályozó DNS szekvenciák) és a szekvencia-specifikus, DNS-kötő transzkripciós fehérje faktorok közti kölcsönhatás közvetíti.
A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy bizonyos emlős szöveteket, pl. májszöveteket vagy transzformált máj szöveteket meg lehet változtatni olyan módon, hogy szelektíven fejezzen ki valamely fentebb meghatározott heterológ enzimet, pl. VZV timidin kinázt. Ezt molekuláris kimérák megalkotásával lehet elérni valamely kifejező kazettában.
Maguk a kifejező kazetták jól ismertek a molekuláris biológia szakterületén. Egy ilyen kifejező kazettának tartalmaznia kell az összes olyan esszenciális DNS szekvenciát, amely a heterológ enzim kifejezéséhez szükséges valamely emlős sejtben.
így pl. egy előnyös kifejező kazetta olyan molekuláriskimérát tartalmaz, amelyen belül megtalálható a VZV TK kódoló szekvenciája, valamely emlős génhez megfelelő poliadenilező szignál (pl. egy olyan poliadenilező szignál, amely működőképes emlős sejtekben), továbbá megtalálhatók megfelelő fokozók és promotor szekvenciák a korrekt orientációban.
Emlős sejtekben normálisan kétféle DNS szekvencia szükséges a hírvivő RNS-eket kódoló gének teljes és hatékony szabályozásához: promotorok és fokozók (enhancerek). A promotorok közvetlenül a transzkripció rajthelyétől fölfelé (5’ felé) helyezkednek el. A promotor szekvenciák a transzkripció pontos és hatékony beindításához szükségesek. Különböző gén-fajlagos promotorok feltárják a közös szervezettségi formákat.
Egy tipikus promotor magában foglal egy AT-ben gazdag területet, amelyet „TATA doboz”-nak hívnak (és amely mintegy 30 bázispárral a transzkripciós beindító rajthelytől 5’-felé helyezkedik el), továbbá egy vagy több fölfelé levő promotor elemet (upstream promoter element, UPE). Az UPE-k fő célpontok a lényegesebb szekvencia-fajlagos transzkripciós faktorokkal történő kölcsönhatáshoz. A promotor szekvenciák aktivitását más szekvenciák módosíthatják; ezeket fokozóknak nevezzük. A fokozó szekvenciák lehetnek nagy távolságban a promotortól, attól vagy fölfelé (5’) vagy lefelé (3’) helyezkedve el. A fokozók orientációtól és helytől független módon működnek. A hasonló szerkezeti szervezettségre és működésre alapozva amelyek cserélhetők, az abszolút távolság a promotorok és fokozók között bizonyos mértékig önkényes. A fokozók a promotor szekvenciákból kiinduló transzkripció arányát növelik.
Ez a fokozás elsősorban kölcsönhatás az UPE-val társult szekvencia-fajlagos transzkripciós faktorok és azok között a fokozók között, amelyek képessé teszik az emlős sejteket arra hogy szövet-fajlagos génkifejezést érjenek el. Ezeknek az UPEhoz kötött transzkripciós fehérje faktoroknak (szövet-fajlagos, transz-aktiváló faktorok) és a fokozóknak (cisz-működő, szabályozó szekvenciák) jelenléte képessé teszi a transzkripciós gépezet más komponenseit, beleértve az RNS polimerázt is, hogy beindítsák a transzkripciót szövet-fajlagos szelektivitással és pontossággal.
A transzkripciós szabályozó szekvencia, főleg a
HU 211 655 A9 promotor és fokozó szekvencia kiválasztása függ a célzott szövettóT. Erre példaként felhozhatjuk az albumin (ALB) és alfa-fetoprotein (AFP) transzkripciós szabályozó szekvenciát (pl. a promotort és fokozót), amelyek normál hepatocitákra, illetve transzformált hepatocitákra fajlagosak ; a karcino-embrionális antigén (CEA) transzkripciós szekvenciáját az emésztőtraktus, tüdő, emlő és más szövetek transzformált sejtjeiben való felhasználáshoz; a tirozin hidroxiláz, kolinacetil-transzferáz vagy neuron-fajlagos enoláz transzkripciós szabályozó szekvenciáját neuroblasztómákban való felhasználáshoz; a glia rost savas fehérje transzkripciós szabályozó szekvenciáját gliómákban való felhasználáshoz; az inzulin transzkripciós szabályozó szekvenciáját a hasnyálmirigy tumorjaiban való alkalmazáshoz.
A további példák között találjuk a gamma-glutamiltranszpeptidázra fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciát bizonyos májtumorokban való felhasználáshoz, továbbá a dopadekarboxilázt a tüdő bizonyos tumorjaiban való felhasználáshoz.
Ezen kívül bizonyos onkogénekbóT való transzkripciósszabályozó szekvenciákat is alkalmazhatunk, mivel ezek lényegében csak bizonyos tumor-típusokban fejeződnek ki. Ezekre jó példák lehetnek a HER-2/neu onkogén szabályozó szekvencia amely emlőtumorokban fejeződik ki, és az N-myc onkogénre fajlagos szabályozó szekvencia neuroblasztómákhoz.
Az ALB és AFP gének erőteljes homológiát mutatnak a nukleinsav-szekvencia, a génszerkezet, az aminosav-szekvencia és a másodlagos fehérje összehajtogatottság tekintetében [ezzel kapcsolatban lásd Ingram és munkatársai összefoglaló munkáját: PNAS 78, 4694-4698 (1981)]. Ezek a gének függetlenül, de ellentétesen fejeződnek ki az ontogenezis során. A normábs fejlődésben az ALB transzkripció röviddel a születés előtt beindul, és folytatódik végig az egész felnőtt koron. Az ALB transzkripciós kifejezése a felnőttekben a májra korlátozódik. Az AFP normálisan az embriómájban, a petehurok belső csíralemezében és az embrió gyomor-béltraktusban fejeződik ki de röviddel a születés után kimutathatatlanság szintjére csökken és jelentősen nem fejeződik ki nem-patogén és nem-regenerálódó felnőtt májban vagy más normál felnőtt szövetekben. HCC esetében azonban az AFP transzkripció a felnőtt májban gyakran drámaian megnövekszik. Az AFP transzkripció továbbá emelkedhet a here nem magra ható és kevert karcinómája, az endodermális testüreg tumorok, bizonyos teratokarcinómák és bizonyos gyomor-bélrendszeri tumorok esetében is. Az AFP és ALB máj-specifikus kifejeződése génjeik szabályozó szekvenciáinak kölcsönhatásaiból ered a máj belső extraktumaiban található transz-aktiváló transzkripciós faktorokkal. Az AFP és ALB transzkripciós szabályozó szekvenciák előnyösek molekulárisán kombinált gének hepatóma-faj tagos illetve általánosan máj-fajlagos kifejeződésének kialakítására, mivel az AFP és ALB gének transzkripciós szinten szabályozhatók és mRNS-ük a legdúsabb polimeráz II átiratok között van a májban.
Számos emlős ALB és AFP promotor és fokozó szekvenciát azonosítottak már [ezekkel kapcsolatban lásd az alábbi összefoglaló munkát : Genes and Develop. 1, 268-276 (1987); Science 235, 53-58 (1987); The Journal of Bioi. Chemistry 262, 4812-4818 (1987)]. Ezek a szekvenciák képesek gének szelektív és fajlagos kifejezésére máj hepatocitákban (normál és transzformált) illetve hepatómákban.
így pl. - amint az 1. ábrában bemutatjuk - egy emlős ALB promotor egy 300 bp-s fragmentumban található az albumin gén transzkripciós beindító rajthelyétől 5’-felé. A 300 bp (5’ irányban) és a 8500 bp (5’ irányban) közti szekvencia nélkülözhető a máj-specifikus kifejeződéshez; a megadott számok a rágcsáló albumin gén transzkripciós iniciációs rajthelyéről értendőit. Egy májfajlagos fokozó szekvencia található azonban egy olyan fragmentumban, amely a transzkripciós beindító rajthelytől 5’ felé 8500 bp és 10 400 bp között helyezkedik el (IA. ábra). Ha az ALB promotor és fokozó elemek jelen vannak, elérhető egy megfelelő 3’ orientációban elhelyezkedő heterológ strukturgén máj-fajlagos kifejezése (IB. ábra). Fenntartható egy, az ALB promotor és fokozó szekvenciához megfelelő orientációban elhelyezkedő heterológ strukturgén máj-fajlagos kifejezése akkor is, amikor a transzkripciós beindító helytől 5’ felé, a 300 bp és 8500 bp közt elhelyezkedő, nem-esszenciális közbenső szekvenciákat eltávolítjuk (IC. ábra). A nem-esszenciális szekvenciák megcsonkítását a szakterületen jól ismert, standard molekulárbiológiai eljárásokkal végezzük; a végeredmény olyan molekuláris kiméra, amelyet a VZV TK közvetlen máj-fajlagos kifejezéséhez alkalmazhatunk.
Az ALB gén szabályozó szerkezetéhez hasonlóan az AFP gének szabályozó elemei elősegítik az AFP szövet-fajlagos kifejeződését bizonyos máj-rendellenességek, pl. HCC esetében Mól. Cell. Bioi. 6, 477-487 (1986); Science 235, 53-58 (1987). Az emlős AFP gén szabályozó elemei egy speciális 5’ promotorproximális területet tartalmaznak (amely néhány emlős fajban a géntől 5’ felé, a 85 és 52 bp között helyezkedik el). Ezen kívül fölfelé (5’) a rágcsáló AFP génnél jól meghatározott szabályozó elemek is találhatók, amelyek klasszikus fokozóként viselkednek [Mól. Cell. Bioi. 6, 477-487 (1986); Science 235, 53-58 (1987)]. Ezeket a fölfelé lévő szabályozó elemeket I, II és III elemeknek nevezzük és az AFP rágcsáló génnél levő transzkripciós beindító helytől számítva 5’ irányban az 1000 és 7600 bp közt helyezkednek el. Ez a három fokozó tartomány működés szempontjából nem egyenértékű az AFP szövet-fajlagos kifejeződésének kialakításában. Az I. és II. elemeknek van a legnagyobb kapacitása az AFP máj-fajlagos kifejezésének irányításában. Fontosnak tartjuk megjegyezni, hogy az alfa-fetoprotein gén szabályozó szekvenciái előnyösen nem csupán a szövet-fajlagos transzkripciós aktiválásra alkalmas szekvenciákat tartalmazzák, hanem a kifejezés repressziójára alkalmas szekvenciákat is olyan szövetekben, amelyeknek nem szabad AFP-t kifej ezniök. Hasonló módon jellemezték már korábban is a humán alfa-fe4
HU 211 655 A9 toprotein gén szabályozó területeit J. B. C. 262, 4812 (1987).
Egy, az AFP szabályozó szekvenciáktól 3’ irányban, korrekt orientációban elhelyezkedő' strukturgén képes lesz tehát szelektíven kifejeződni embrió-májban, hepatómákban, a here nem magképzó'karcinómáiban, bizonyos teratokarcinómákban bizonyos gyomorbél rendszeri tumorokban és más olyan normális és patológiás szövetekben, amelyek fajlagosan fejeznek ki AFP-t.
A jelen találmány olyan molekuláris kimérát szolgáltat amely egy heterológ enzimet kódoló gén kódoló szekvenciáját tartalmazó DNS szekvenciát foglal magában, ahol ez a szekvencia egy transzkripciós szabályozó szekvencia szabályozása alatt áll egy kifejező' kazettában; magában foglal továbbá egy promotort amely egy célzott ráksejtben szelektíven működni képes; ez a kiméra pl. képes egy ráksejtet úgy transzformálni, hogy szelektíven fejezzen ki VZV timidin kinázt.
A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában olyan molekuláris kimérát szolgáltat, amely egy transzkripciós szabályozó szekvenciát, elsó'sorban egy olyan promotort tartalmaz, amely szelektíven aktiválódik az emlős célszövetekben és működőképesen össze van kapcsolva a Varicella zoster vírus timidin kinázt (VZV TK) kódoló gén kódoló szekvenciájával.
A jelen találmány elsó'sorban olyan molekuláris kimérát szolgáltat, amely az enzimet (amely előnyösen VZV TK) kódoló gén kódoló szekvenciájának DNS szekvenciáját tartalmazza beleértve egy poliadenilező szekvenciát, amely 3’ helyzetben és megfelelő orientációban kapcsolódik egy emlős célszövet-fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciához. Legeló'nyösebben a kifejező kazetta tartalmaz egy fokozó szekvenciát is.
A promotor és fokozó szekvenciákat eló'nyösen az alábbi transzkripciós szabályozó szekvenciák közül választjuk ki: albumin (ALB), alfa-fetoprotein (AFP), karcino-embrionális antigén (CEA), tirozin hidroxiláz, kolin acetil transzferáz, neuronfajlagos enoláz, gliarost savas fehérje, inzulin vagy gammaglutamil-transzpeptidáz, dopa-karboxiláz, HER2/neu vagy N-myc onkogén, vagy más alkalmas gének transzkripciós szabályozó szekvenciái. Legeló'nyösebben az ALB vagy AFP szabályozó szekvenciáját alkalmazzuk a máj-fajlagos, illetve hepatómafajlagos kifejezéshez.
A jelen találmány szerinti molekuláris kimérát standard rekombináns DNS technikákat alkalmazva állíthatjuk elő. így pl. a VZV timidin kináz (TK) gén kódoló szekvenciáját és poliadenilező szignálját (lásd a 2A. és 2B. ábrákat) a megfelelő 3’ orientációban helyezzük el az esszenciális, ALB vagy AFP transzkripciós szabályozó elemekhez viszonyítva. Ezek a molekuláris kimérák képesek a VZV TK szelektív kifejezésére olyan sejtekben, amelyek normálisan ALB-ot, illetve AFP-t fejeznek ki (3A. és 3B. ábra). A VZV TK gén kifejeződése emlős májban, hepatómákban, a gyomorbél rendszer bizonyos tumorjaiban, a here nem-magképző karcinómáiban, bizonyos teratokarcinómákban, és más tumorokban lehetővé teszi, hogy viszonylag nem toxikus arabinozidok és pirimidinek az itt leírtak szerint szelektíven metabolizálódjanak citotoxikus és/vagy citosztatikus metabolitokká.
Következésképpen a találmány - egy másik szempontjaszerint - eljárást nyújt olyan molekuláris kiméra megalkotására amely egy heterológ enzim gént, pl. VZV TK-t kódoló DNS szekvenciát tartalmaz valamely szövet-fajlagos promotorhoz kötve.
A jelen találmány elsó'sorban eljárást nyújt a fentebb meghatározott molekuláris kimérák megalkotására. Az eljárás abból áll, hogy egy, a heterológ enzim (pl. VZV timidin kináz) génjét kódoló szekvenciát és poliadenilező szignálját tartalmazó DNS szekvenciát ligálunk egy emló's szövet-fajlagos transzkripciós szabályozó szekvenciához (pl. promotor szekvenciához és fokozó szekvenciához).
A VZV timidin kináz kódoló szekvencia és 3’ poliadenilező szignál egy mintegy 1381 bp-s Acc I/Nde I restrikciós endonukleáz fragmentumot foglal el (lásd a
2. ábrát).
Ez eló'nyösen az az 1381 bp-s Acc IINde I fragmentum, amely tartalmazza a NZN TK kódoló szekvenciát, és emló's szövet-fajlagos promotor és fokozó szekvenciákhoz van ligáivá, bár azt is tudni kell, hogy más olyan DNS fragmentumok is alkalmazhatók, amelyek a N7N TK gént tartalmazzák. Ezen kívül a VZV TK poliadenilező szignált lehet helyettesíteni más megfelelő poliadenilező szignállal is, pl. olyannal, amely az SV4O vírusból vagy más emló's génekből ered.
A promotor és fokozó szekvenciákat eló'nyösen az alábbi transzkripciós szabályozó szekvenciák közül választjuk ki: albumin (ALB), alfa-fetoprotein (AFP), karcino-embrionális antigén (CEA), tirozin hidroxiláz, kolin-acetil-transzferáz, neuronfajlagos enoláz, gliarost savas fehérje, inzulin, gamma-glutamiltranszpeptidáz, dopa-dekarboxiláz, HER2/neu, és N-myc onkogének transzkripciós szabályozó szekvenciái, vagy más megfelelő gének szabályozó szekvenciái. Legeló'nyösebben az ALB vagy AFP szabályozó szekvenciáját alkalmazzuk a máj-fajlagos, illetve hepatoma-fajlagos kifejezéséhez.
Ezeket a molekuláris kimérákat egy szállítórendszerrel lehet a célsejthez eljuttatni. Abból a célból, hogy a betegnek beadhassuk szükséges, hogy rendelkezésre álljon egy hatásos in vivő szállító rendszer, amely stabilan integrálja a molekuláris kimérát a sejtekbe. Az ismert eljárások alkalmazzák a kalcium-foszfátos átfertó'zés, az elektroporáció, a mikroinjekció, Iiposzomális átvitel ballisztikus célzás vagy retrovírusos fertőzés technikáit. Ezekkel kapcsolatban áttekintő közlemény olvasható az alábbi irodalmi helyen: Biotechnique 6(7), (1988).
A sejtek retrovírusos fertőzésének technikája, amely mesterséges gének integrálására szolgál, retrovírus ingázó vektorokat alkalmaz; ez a technika a szakterületen ismert (lásd pl. Mól. and Cell Biok; 1986 aug., 2895. oldal). A retrovírus ingázó vektorokat lényegében úgy alakítjuk ki, hogy a retrovírus DNS formáját alkalmazzuk egy plazmidban befogva. Ezek a plazmi5
HU 211 655 A9 dók tartalmaznak olyan szekvenciákat is, amelyek a baktériumokban való szelekcióhoz és növekedéshez szükségesek. A retrovírus ingázó vektorok kialakításához a szakterületen jól ismert molekuláris biológiai technikákat alkalmazzuk. A retrovírus ingázó vektorokból el vannak távolítva a szülő endogén retrovírus gének (pl. gag, pol és env), és a szóban forgó DNS szekvencia, pl az a molekuláris kiméra, amelyet leírtunk, be van iktatva. Ezek azonban tartalmaznak megfelelő retrovírus szabályozó szekvenciákat a vírus burokképzéshez, az elővírus beiktatáshoz a cél-genomba, az üzenet összeillesztéshez (splicing), a terminációhoz és a poliadenilezéshez. A retrovírus ingázó vektorok a Moloney rágcsáló leukémia vírusból (Mo-MLV) származnak, de szakember számára világos, hogy más retrovírusok is használhatók, elsősorban a közeli rokon Maloney rágcsáló szarkóma vírus. Bizonyos DNS vírusok is bizonyulhatnak hasznosnak szolgáltató rendszerként. A szarvasmarha papillóma vírus (BPV) extrakromoszomálisan replikálódik úgy, hogy a BPVn alapuló szolgáltató rendszernek az az előnye, hogy a szolgáltatott gén nem-integrált módon marad fenn.
így a jelen találmány egy harmadik szempontja szerint olyan retrovírus ingázó vektort szolgáltat, amely a fentebb meghatározott molekuláris kimérákat tartalmazza.
A retrovírus által közvetített génátviteli rendszer előnyei: gén-eljuttatásának nagy hatékonysága a célzott szövethez, szekvencia-fajlagos integrálódás a vírus genomot illetően [az 5’ és 3’ hosszú terminális ismétlődés (LTR) szekvenciáknál], és az eljuttatott DNS csekély átrendeződése, összehasonlítva a más DNS eljuttató rendszerekkel.
Következésképpen a jelen találmány egy előnyös kiviteli módjában egy olyan retrovírus ingázó vektort szolgáltatunk, amely tartalmaz egy 5’ vírus LTR szekvenciát magában foglaló szekvenciát, egy cisz-muködő psi burokképző szekvenciát, egy korábban meghatározott molekuláris kimérát és egy 3’ vírus LTR szekvenciát (4A. és 4B. ábra).
Egy előnyös kiviteli módban - hogy segítsük eltüntetni a molekuláris kiméra nem szövet-fajlagos kifejeződését - a molekuláris kiméra az 5’ retrovírus LTR-rel ellenkező transzkripciós orientációban van elhelyezve (lásd a 4A. és 4B. ábrát). Ezen kívül egy domináns szelektálható marker gén is benne foglaltatik, amelyet átírás szempontjából az 5’ LTR szekvencia irányít. Ilyen domináns marker gén lehet a ΝΕΟ II típusú bakteriális neomicin rezisztencia gén (aminoglükozid 3’ foszfotranszferáz), amely eukarióta sejteknek rezisztenciát ad át a G418 szulfát neomicin analógra (védett gyártmányneve: geneticin) (lásd a 4A. és 4B. ábra).
A NEO gén segít olyan becsomagolt sejtek kiválasztásában amelyek ezeket a szekvenciákat tartalmazzák (lásd később).
A példákban alkalmazott retrovírus vektor a Moloney rágcsáló leukémia víruson alapszik, de a szakember számára világos, hogy más vektorokat is lehet alkalmazni. Ilyen szelektálható markerként NEO gént tartalmazó vektorokat írtak már le, ilyen pl. az N2 vektor [Science 230, 1395-1398 (1985)].
A retrovírus ingázó vektorokkal kapcsolatos elméleti gond az a lehetőség lehet, hogy a retrovírus hosszú terminális ismétlődés (LTR) szabályozó szekvenciák átírás szempontjából aktiválnak egy celluláris onkogént az integrálódás helyén a gazdasejt genomban. Ez a gond csökkenthető SIN vektorok megalkotásával (4A. ábra). A SIN vektorok ön-inaktiváló vektorok, amelyekben a promotor és fokozó területeket magában foglaló terület ki van iktatva a retrovírus LTR-ben. A SIN vektorok LTR szekvenciái átírás szempontjából nem aktiválnak 5’ vagy 3’ genomikus szekvenciákat. A vírus LTR szekvenciák átírási inaktiválása csökkenti a szomszédos célsejt DNS szekvenciák beiktatási aktivitását és segít az eljuttatott molekuláris kiméra szelektált kifejezésében is. SIN vektorokat úgy lehet megalkotni, hogy a 3’ vírus LTR szekvenciából mintegy 299 bp-t eltávolítunk [Biotechniques 4, 504-512 (1986)].
így a jelen találmány szerinti retrovírus ingázó vektorok előnyösen SIN vektorok.
Mivel a gag, pol és env szülő retrovírus géneket eltávolítottuk ezekből az ingázó vektorokból, egy segítő (helper) vírus rendszert hasznosíthatunk, hogy a gag, pol és env retrovírus géneket szolgáltassuk a retrovírus vektor becsomagolásához vagy beburkolásához egy fertőző virionba. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy speciális „csomagoló” sejtvonalakat alkalmazunk, amelyek képesek olyan fertőző szintetikus vírust kialakítani, amely nem képes semmiféle vad-típusú vírus termelésére. Ilyen módon a mesterséges szintetikus vírus tartalmaz egy jelen találmány szerinti kimérát vad típusú segítő vírustól mentes szintetikus, mesterséges fertőző virionba csomagolva. Ezt arra a tényre alapozzuk, hogy a segítő vírus, amely stabilan integrálódik a csomagoló sejtbe, tartalmazza a vírus strukturgéneket, de hiányzik belőle a psi hely és egy cisz-muködő szabályozó szekvencia, amelynek benne kell lenni a vírus genomikus RNS molekulában ahhoz, hogy be legyen burkolva egy fertőző vírus részecskébe.
Következésképpen a jelen találmány egy negyedik szempontja szerint olyan fertőző viriont szolgáltatunk, amely tartalmaz egy fentebb leírt retrovírus-ingázó vektort, ahol az említett vektor egy vírus fehérjébe van burkolva; ilyen módon alkotható meg egy mesterséges fertőző, replikáció-hiányos retrovírus.
A retrovírus ingázó vektor előnyösen olyan ingázó vektor amely egy, az AFP vagy ALB transzkripciós szabályozó szekvenciájával bíró molekuláris kimérát tartalmaz. Az ingázó vektor még előnyösebben egy AFP/VZV TK kimérát vagy egy ALB/VZV TK kimérát tartalmaz.
A psi hely eltávolításán kívül további változtatásokat is tehetünk a segítő vírus LTR szabályozó szekvenciáin annak biztosítására, hogy a segítő vírus ne csomagolódjék virionokba és blokkolódjék a fordított átírás és a vírus integráció szintjén.
Egy más eljárás szerint a segítő vírus strukturgéneket (tehát a gag, pol és env géneket) egyenként és függetlenül vihetjük át a csomagoló sejtvonalba, mivel
HU 211 655 A9 ezek a vírus strukturgének el vannak különülve a csomagoló sejt genomján belül, kevés arra az esély, hogy rejtett rekombináció történjék vad típusú vírust alakítva ki.
A jelen találmány ötödik szempontja szerint eljárást biztosítunk jelen találmány szerinti fertőző virionok előállítására olyan módon, hogy a mesterséges retrovírus ingázó vektort, amely egy fentebb leírt molekuláris kimérát tartalmaz, bejuttatjuk egy csomagoló sejtvonalba.
A csomagoló sejtvonal stabilan integrálhat magában egy olyan segítő vírust, amelyből hiányzik egy psi hely és más szabályozó szekvenciák, amint fentebb leírtuk, vagy egy másik esetben a csomagoló sejtvonal úgy lehet manipulálva, hogy tartalmazzon segítő vírus strukturgéneket genomján belül.
A jelen találmány továbbá szolgáltatja a fentebb leírt fertőző viriont gyógyászati célra, elsősorban rák kezelésére és különösen HCC, a here nem-magképző karcinómája, bizonyos teratokarcinómák és bizonyos gyomor-bélrendszeri tumorok kezelésére.
A heterológ enzim, elsősorban a VZV timidin kináz gén szelektív kifejezését úgy végezzük el, hogy szövetfajlagos transzkripciós szabályozó (pl. fokozó és promotor) szekvenciákat alkalmazunk. A szelektivitás tovább javítható a májsejtek szelektív fertőzésével. A csomagoló sejtvonalban jelen levő retrovírus env gén meghatározza a fajlagosságot a gazda fertőzésre. A csomagoló sejtvonal megalkotásában alkalmazott env gént módosítjuk, hogy olyan mesterséges, fertőző virionokat alakítsunk ki, amelyek szelektíven fertőznek hepatocitákat. Példaként: a csomagoló sejtvonalba bevezetett retrovírus env gént úgy módosíthatjuk, hogy a mesterséges, fertőző virion burkolati glikoproteinje szelektíven fertőzzön hepatocitákat a hepatitisz B vírus (HBV) által hasznosított fajlagos receptor-közvetített kötés révén. A HBV a hepatocitákat fajlagos receptorközvetített kötés révén fertőzi. A pre-Sl és pre-S2 szekvenciák által kódolt HBV fehérjék fontos szerepet játszanak a HBV kötésében a hepatocitákhoz [„Hepadna Viruses”; szerkesztették Robinson és munkatársai, 189-203; 205-221 oldalak (1987)]. A csomagoló sejt env génjét úgy módosítjuk, hogy magában foglalja a nagy S HBV burkolati fehérje hepatocita kötőhelyét. A csomagoló sejtbe bevezetett env gén ilyen módosításait a szakterületen jól ismert standard molekuláris biológiai technikák segítségével hajthatjuk végre, és ez elősegíti a cél-szövetben a virális felvételt.
A jelen találmány szerinti fertőző viriont a szakterületen jól ismert technikákkal szerelhetjük ki és úgy hozhatjuk forgalomba, mint gyógyszerkészítményt gyógyászatilag elfogadható hordozókkal együtt. A gyógyászatilag elfogadható hordozók ez esetben lehetnek folyékony közegek, amelyek lehetővé teszik hogy fertőző virionok bejussanak a betegbe. Az ilyen hordozóra jó példa a fiziológiás konyhasóoldat. A fertőző virion oldatban vagy szuszpenzióban lehet egy ilyen hordozóban. Egy ilyen gyógyászati kiszerelésben jelen lehetnek stabilizálószerek, antioxidánsok és/vagy egyéb segédanyagok. A gyógyászati készítményt emlősöknek beadhatjuk bármely hagyományos módon, pl. szájon át vagy parenterális úton. A fertőző viriont elsősorban intravénás vagy intraartériás infúzió útján adhatjuk be. A HCC kezelése esetén az intramájartériás infúzió lehet előnyös.
Következésképpen a találmány olyan gyógyászati kiszerelést nyújt, amely fertőző viriont tartalmaz valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve.
Ezen kívül a jelen találmány eljárást nyújt a fentebb leírt gyógyszerészeti kiszerelések előállítására, amely abból áll, hogy egy molekuláris kimérát tartalmazó mesterséges fertőző viriont összekeverünk valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval.
Bár bármilyen megfelelő vegyületet alkalmazhatunk, amelyet az enzim szelektíven átalakít, a jelen találmány bemutatja az (I) és (II) általános képletű vegyületek alkalmazását olyan rákok kezelésére alkalmas gyógyszerek előállításához, amelyek képesek kifejezni VZV timidin kinázt. Ezek a gyógyszerkészítmények elsősorban a máj sejt karcinóma (HCC) kezelésére alkalmasak.
Az (I) általános képletű 6-szubsztituált purin arabinozidokról sóikról és - fiziológiailag funkcionális ekvivalenseikről - ahol az (I) általános képletben ahol
R1 jelentése halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxi-, halogénnel helyettesített 1-5 szénatomos alkoxi-, 1-5 szénatomos alkilcsoporttal mono- vagy diszubsztituált amino-, egy vagy több fluoratommal szubsztituált 1-5 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkil-csoport, vagy egy olyan nitrogéntartalmú heterociklus csoport, amely 4-7 szénatomot és adott esetben egy kettős kötést tartalmaz; és
R2 jelentése hidrogén- vagy halogénatom, vagy aminocsoportismert, hogy anti-VZV és citomegalovírus hatású szerek; alkalmazásukat és szintézisüket leírja az EP 0294 114 számú közrebocsátási irat.
A (II) általános képletű vegyületeknél, a képletben
X jelentése vinilén vagy etiniléncsoport;
R1 jelentése oxo- vagy iminocsoport;
R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-2 szénatomos alkil
3-4 szénatomos elágazó szénláncú alkil- vagy cikloalkil-, pl. izopropil- vagy ciklopropilcsoport;
R3 jelentése hidrogénatom vagy acil, pl. 1-4 szénatomos alkanoil- vagy benzoilcsoport, amely kívánt esetben helyettesítve van pl. egy vagy több halogénatommal vagy alkil-, hidroxi- vagy alkoxicsoporttal; és
R4 jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport; azzal a feltétellel, hogy amikor R2, R3 és R4 mindegyike hidrogénatomot jelent, akkor R1 jelentése nem lehet oxocsoport.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy amikor R3 jelentése nem acilcsoport, az (I) vagy (II) általános
HU 211 655 A9 képletű vegyületek tautomer formában létezhetnek. Különösen előnyös (I) és (II) általános képletű, vegyületek a 9—arabinofuranozil-6-metoxi-9H-purin és az 1(-D-arabinofuranozil)-5-propinil-uracil.
Ezek a vegyületek és előállítási eljárásaik le vannak írva a 0 272 065 számú európai szabadalmi közzétételi iratban, és itt leírják ezek anti-VZV aktivitását is.
A fentebb említett pirimidin nukleozidok és purin arabinozidok közé értjük az ilyen vegyületek gyógyászatilag elfogadható származékait is, pl. gyógyászatilag elfogadható sóikat, észtereiket, észtereik sóit, vagy bármely olyan vegyületet amely egy emberi lénybe beadva képes (közvetve vagy közvetlenül) ezek aktív metabolitját vagy maradékát szolgáltatni. A vegyület előnyösen orálisan aktív.
Az emlősök kezelésénél a mennyiség és az adagolási rend a kezelőorvos felelőssége, és számos tényezőtől függ, beleértve a betegség típusát és a kezelendő beteg állapotának súlyosságát.
HCC-nél azonban a mesterséges fertőző virion intramájartériás infúziója esetén a 2.105 és 2.107 telepképző egység/ml (CFU/ml) közti fertőző virion valószínűleg elegendő egy tipikus tumorhoz.
Az infúzióban beadott virionok összes -mennyiségé fiigg a tumor méretétől, és valószínűleg a több részletben beadás az előnyös.
Gyógyszerkezelés. A fertó'ző virionnal végzett fertőzés után beadjuk azokat a találmány szerinti vegyületeket, amelyek fajlagosan igényelnek VZV TK aktivitást a kritikus első foszforilezési lépéshez a citotoxikus vagy citosztatikus metabolitokká történő anabolizmusban.
A gyógyszer mennyisége előnyösen a 0,1-250 mg/befogadó testtömeg kg tartományban van naponta, előnyösen a 0,1-100 mg/testtömeg kg tartományban.
Az alábbi kiviteli példák a jelen találmány szemléltetésére szolgálnak, és nem céljuk, hogy a találmány oltalmi körét korlátozzák.
1. példa
Az albumin transzkripciós szabályozó szekvencia/NZV timidin kináz molekuláris kiméra megalkotása
Egy mintegy 1381 bp-s Accl/Ndel DNS fragmentumot (az összes restrikciós enzimet az alábbi cégek valamelyikétől szerezzük be: Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok; New England Biolabs, Massachussets, Amerikai Egyesült Államok; és Promega Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok; az összes enzimes reakciót úgy végezzük, ahogyan ezt a szállító cégek ajánlják), amely tartalmazza a VZV TK gén kódoló szekvenciáját és poliadenilező szignálját, elektroelucióval tisztítunk Elutrap elektroforézis kamra (Schleicher and Schuell, Keene, New Hampshire, Amerikai Egyesült Államok) segítségével egy mintegy 4896 bp-s, 22TK-nak nevezett plazmid restrikciós enzimes emésztményébol, amely plazmid tartalmazza a VZV TK genom egy mintegy 2200 bp-s Eco RI/Bam Hl fragmentumát [Virology 149, 1-9 (1986); a plazmid beszerezhető Ostrove J.-től (National Institute of Health, Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok)]. A tisztított DNS fragmentum tartalmazza a teljes VZV TK kódoló szekvenciát és poliadenilező szignált, de nem foglal magában semmiféle VZV TK promotor elemet (lásd a 2A. és 2B. ábrákat).
A tisztított 1381 bp-s Accl/Ndel VZV TK fragmentum 5’ túlnyúló végeit E. coli DNS polimeráz I Klenow fragmentummal (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) és dezoxinukleotid txifoszfátokkal (d TNP) végzett kezeléssel tompa végűvé tesszük.
Egy mintegy 5249 bp-s plazmidot, amelyet 2335A1-nek nevezünk, és amely tartalmaz mintegy 2300 bp-t egy ALB E/P szekvenciából, Palmiter Richard-tól (University of Washington, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok) szerezetünk be. Ez a konstrukció tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek szükségesek a máj-fajlagos kifejezéshez, de hiányoznak belőle a nem-esszenciális köztes szekvenciák. Egy egyedi Bam Hl restrikciós enzim felismerő hely van a +23 helyen a transzkripció rajtjától számítva. A 2335A-l-et Bam Hl restrikciós enzimmel emésztjük és az 5’ túlnyúló végeket tompává tesszük Klenow-fragmentummal és d NTP-vel végzett kezeléssel, amint fentebb leírtuk.
Az ALB E/P N7N TK kimérát úgy alkotjuk meg, hogy a VZV TK kódoló és és poliadenilező' szekvenciákat tartalmazó tompa végű Accl-Ndel fragmentumot ligáljuk a 2335A-1 tompa végű Bam Hl helyéhez, így alkotva meg a p CR73-at T4 DNS ligázt alkalmazva (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) (5. ábra). Hasonlóan minden leírt ligáláshoz a ligáit fragmentumok orientációját restrikciós endonukleázos emésztéssel határozzuk meg a szakterületen jól ismert eljárásokkal. Apéldákban leírt minden további plazmidhoz hasonlóan a p CR73 tartalmaz a baktériumokban történő replikációhoz szükséges és sokszorozáshoz alkalmas esszenciális szekvenciákat, ahol replikáción és sokszorozáson a szakterületen jól ismert eljárásokat értjük. Az ALB E/P N7N TK kimérát elektroelucióval tisztítjuk pCR73ból, mint egy mintegy 3880 bp-s Sstl/KpnI restrikciós endonukleázos fragmentumot (5. ábra). A 3’ túlnyúló végeket tompává tesszük T4 DNS polimerázzal és d NTP-vel végzett kezeléssel. Ezt az Sstl/KpnI tompavégű restrikciós fragmentumot ezután bevezetjük egy Moloney rágcsáló leukémia vírus-retrovírus ingázó vektor rendszerbe (lásd később a 3. példát).
A pCR73-at az ATCC-nél 1989 augusztus 18-án deponáltuk ATCC 68077 deponálási számon.
2. példa
Az alfa-fetoproptein/VZV timidin kináz transzkripciós szabályozó szekvencia megalkotása
A VZV timidin kináz kódoló szekvenciát és poliadenilező helyet a p CR73 mintegy 3300 bp-s Bam Hl-Xmn I restrikciós endonukleázos fragmentumaként izoláljuk (6. ábra). A Bam Hl restrikciós endonukleáz hely 5’ túlnyúló végeit tompává tesszük Klenow-fragmentummal és d NTP-vel végzett kezeléssel. Ez a DNS fragmentum tartalmazza a VZV TK gén teljes kódoló szekvenciáját és poliadenilező helyét, de nem tartalmaz
HU 211 655 A9 semmiféle fokozó vagy promotor szekvenciát. Egy mintegy 9996 bp-s plazmidot, a pAF5.1-CAT-ot, amely tartalmaz mintegy 5100 bp-t a humán AFP 5’ szegélyező' DNS-ből, Tamaoki T.-tóT (University of Calgary, Kanada) szerezhetjük be. Egy olyan DNS fragmentumot izolálunk a pAF5.1-CAT-ból, amely a humán AFP gén mintegy - 5,1 kb és +29 kb közti tartományát öleli át; az izolálást Xmn I-gyel végzett teljes és Hind IIImal végzett részleges emésztéssel végezzük. Ezt az XmnI/HindlII fragmentumot a BamHI/XmnI VZV TK fragmentumhoz ligáljuk T4 DNS ligáz alkalmazásával, így kapjuk meg a p CR77-et (6. ábra). Az AFP E/P N7N TK kimérát elektroelucióval tisztítjuk a p CR77bóT, mintegy kb. 6699 bp-s AatH/Pstl restrikciós endonukleázos fragmentumot. Ezt a fragmentumot azután T4 DNS polimerázzal és dNTP-vel kezeljük az 1. példa útmutatásai szerint, így kapunk tompavégű restrikciós fragmentumot.
A pCR77.-et az ATCC-nél 1989. augusztus 18-án deponáltuk ATCC 68079 deponálási számon
3. példa
Az 1. példa molekuláris kiméráját tartalmazó retrovírus ingázó vektor konstrukció megalkotása
A pCR74 retrovírus ingázó vektort, amely tartalmazza az ALB E/P VZV TK kimérát, úgy alkotjuk meg, hogy a pCR73 tisztított Sstl/KpnI tompavégű fragmentumát ligáljuk egy N2(XM5)-nek nevezett Moloney rágcsáló leukémia retrovírus vektorba [Science 230, 1395-1398 (1985)], amely Karnison S.-tóT (National Institute of Health, Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) szerezhető be. Az N2(XM5)-öt Xhol restrikciós endonukleázzal emésztjük és az 5’ túlnyúló végeket tompává tesszük Klenow-fragmentummal és d NTP-vel végzett kezeléssel, majd a pCR73 Sstl/KpnI fragmentumhoz ligáljuk T4 DNS ligáz alkalmazásával (5. ábra). Az ALB E/P VZV TK kimérát tartalmazó pCR74 retrovírus ingázó vektort restrikciós endonukleázos térképezéssel és DNS szekvenciaelemzéssel jellemezzük, hogy igazoljuk a primer szekvenciát. Az ALB E/P és a VZV TK szekvenciák csatlakozását szegélyező szekvenciát a 7. ábrában mutatjuk be.
A pCR74-et az ATCC-nél 1989. augusztus 18-án deponáltuk ATCC 68078 deponálási számon.
4. példa
A 2. példa szerinti molekuláris kimérát tartalmazó retrovírus ingázó vektor konstrukció megalkotása
A pCR7B retrovírus ingázó vektort (6. ábra) úgy alkotjuk meg, hogy a pCR77, AFP E/P VZV TK kimérát tartalmazó tisztított AatH/Pstl fragmentumot N2(XM5)-be ligáljuk, amelyet előzőleg Xhol-gyel emésztettünk és T4 DNS polimerázzal valamint d NTP-vel tompa végűvé tettünk, amint ezt a 3. példában leírtuk. Az AFP E/P VZV TK kimérát tartalmazó pCR7B retrovírus ingázó vektort restrikciós endonukleázos térképezéssel és DNS szekvenciaelemzéssel jellemezzük, hogy igazoljuk a primer szekvenciát. Az AFP E/P és a VZV TK szekvenciák csatlakozását szegélyező szekvenciát a 8. ábrában mutatjuk be.
A pCR7B-at az ATCC-nél 1989. augusztus 18-án deponáltuk ATCC 68080 deponálási számon.
5. példa
Vírus kialakítás
A PA317-nek nevezett csomagoló sejtvonalat az ATCC-tóT szerezhetjük be (ATCC CRL 9078), amely, amint korábban leírták, három változással bír, mégpedig az 5’ LTR-en, a psi szabályozó szekvencián és a 3’ LTR-en belül [Mól. and Cell Bioi. 6 (8), 2895-2902 (1986)]. A 3. és 4. példában leírt mesterséges retrovírus konstrukciókat a csomagoló vonalba elektroporációval vagy fertőzései visszük be. Az elektroporációhoz 20 gg linearizált plazmid DNS-t elektroporálunk 2 millió PA317 sejtbe foszfáttal pufferolt szacharózban, 280 voltot és 25 mikrofarád elektrosztatikus kapacitást alkalmazva 0,8 ml össztérfogatban. Legalább 150 G418 telepet kaphatunk/ 20 gg plazmid DNS/2 millió PA317 sejt. A fertőzésnél 20 gg linearizált plazmid DNS-t elektroporálunk 2 millió ekotróp csomagoló sejtbe, pl. Psi 2 sejtekbe. Két nappal később a tenyészet felülúszóját a PA317 amfotróf csomagoló sejtvonal fertőzésére alkalmazzuk, és G418 rezisztens telepeket izolálunk. Mind az elektroporációs, mind a fertőzési technikáknál a G418 rezisztens telepeket egysejtklónozzuk korlátozott higitásos eljárással, Southern foltképzéssel elemezzük és NIH 3T3 sejteken (ATCC) titráljuk, hogy azonosítsuk a legmagasabb szinten termelőket a teljes hosszúságú vírusok közül. A p CR74-et tartalmazó PA317 sejteknél 17 egyedi sejtklónt izolálunk és ezen kiónok közül 10-bóT DNS-t extrahálunk. Ezen a 10 DNS mintán erőteljes Southern folt elemzést hajtunk végre különböző restrikciós endonukleáz enzimeket, és radioaktív hibridizációs vizsgáló mintaként különböző NEO és VZV TK szekvenciákat alkalmazva. A 10 elemzett klón közül 2 nem mutatja jelét csonkításnak, így teljes hosszúságúnak tekinthető. A p CR7B-at tartalmazó PA317 sejteknél 29 egyedi sejtklónt izolálunk, és ezek közül 25 kiónból DNS-t nyerünk ki. Ezen a 25 DNS mintán erőteljes Southern folt elemzést hajtunk végre különböző restrikciós endonukleáz enzimeket és radioaktív hibridizációs vizsgáló mintaként különböző NEO és VZV TK szekvenciákat alkalmazva. A 25 elemzett klón közül 5 nem mutatja jelét csonkításnak, így teljes hosszúságúnak tekinthető. Az összes, teljes hosszúságú vírus szekvenciát tartalmazó csomagotó sejtvonalat timidin kináz mínusz/mínusz NIH 3T3 sejteken titráljuk, standard technikákat alkalmazva.
6. példa
Humán hepatóma sejtvonal (pozitív kontroll) fertőzése az ALB/VZV TK-t vagy AFP/VZV TK-t tartalmazó, 5. igénypont szerinti, teljes hosszúságú fertőző virionokkal majd a VZV TK aktivitás, az ara ATP termelés és a gyógyszerérzékenység egymás utáni mérése
Az ALB/VZV TK kimérát vagy AFP1VZV TK kimérát tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírusokat alkalmazzuk egy Hep G2-nek nevezett humán hepatóma sejtvonal (ATCC HB 8065) fertőzésére. A fertőzés és 1 mg geneticin/mlen végzett szelekció után a sejteket VZV TK aktivitásra mérjük. Ezenkívül a sejteket (3H)-val jelzett 9-(-Darabinofuranozil)-6-metoxi-9H-purin (amelyet a további táblázatokban és ábrákban ara-m-nek nevezünk)
HU 211 655 A9 jelenlétében inkubáljuk, majd az ara ATP-t mérjük. Végül sejteket tenyésztünk a fentebb említett vegyület jelenlétében és az ICSO (növekedésgátlás) értéket meghatározzuk. A vírussal nem fertőzött vagy N2 vírussal fertőzött sejtek szolgálnak kontroll mintaként ezekhez a kísérletekhez. Az N2 vírus nem tartalmaz VZV TK genetikai anyagot.
Az 1. táblázat bemutatja, hogy a vagy pCR74, vagy pCR7B tartalmú vírusokkal fertó'zött humán hepatóma sejtek 904-szer, illetve 52-szer nagyobb N7N TK aktivitással rendelkeznek a kontrolisejtekkel összehasonlítva.
A 9-(-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H-purint (amelyet ara-m-nek nevezünk) a VZV TK szelektíven monofoszforilezi és ez az ezt követő' anabolizmussal citotoxikus ara ATP-vé válik. A 9. ábra bemutatja, hogy azok a Hep G2 sejtek, amelyek vagy pCR74 tartalmú, vagy pCR7B tartalmú vírusokkal vannak fertó'zve és (3H)-val jelzett 9-(-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H3 purin jelenlétében vannak inkubálva, jelentó's mennyiségű citotoxikus (3H) ara ATP képzésében vesznek részt.
Az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR7B) tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírusokkal fertó'zött Hep G2 sejteket változó mennyiségű
9-(-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin jelenlétében inkubáljuk 5 napon át, és meghatározzuk a növekedésgátlást, amelyet a sejtszám és a DNS tartalom alapján mérünk.
A 2. táblázat azt mutatja be, hogy a 9-(-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin IC50 értéke (50%-os növekedésgátlás) nagyobb, mint 2000 pmól/l a kontroliban és az N2-vel fertó'zött Hep G2 sejtekben. Az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR7B) tartalmazó, replikáció-hiányos, teljes hosszúságú mesterséges retrovírusokkal fertó'zött Hep G2 sejteknél az IC50 5 pmól/l, illetve 175 pmól/l. Az AFP/VZV TK-t tartalmazó (pCR7B) Hep G2 sejtek egysejtes klónozása azt jelzi, hogy a 9-(-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin IC50 értékét tovább lehet csökkenteni mintegy 40 pmól/literre.
7. példa
A VZV TK kifej ezó'désének szelektivitása Öt humán, nem hepatóma sejtvonalat fertőzünk az ALB/VZV TK kimérát (p CR74) tartalmazó replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírusokkal. Ezek a sejtvonalak a WiDR (ATCC CCL 218), IMR90 (ATCC CCL 186), MCF7 (ATCC HTB22), Detroit 555 (ATCC CCL 110) és SW480 (ATCC CCL 228). A fertó'zés és a geneticinen végzett szelekció után ezeket a sejteket megvizsgáljuk VZV TK aktivitásra, és növekedésgátlásra 9-((3-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purin jelenlétében, amint fentebb leírtuk. A VZV TK aktivitásban és a 9-(j3-D-arabinofuranozil)-6-metoxi-9H purinra való gyógyszerérzékenységben nincs növekedés ebben az öt nemhepatóma sejtvonalban, amikor az ALB/VZV TK kimérát (pCR74) tartalmazó replikáció-hiányos, teljes hosszúságú, mesterséges retrovírussal fertó'zzük ezeket. Az összehasonlítás alapjai azok a szüló'-sejtvonalak, amelyek nincsenek fertó'zve. Ez a kísérlet azt demonstrálja, hogy a VZV TK kifejezése szelektív hepatómára, és nem érvényes nem-hepatóma sejtekre.
Az alábbiakban az ábrákat röviden bemutatjuk.
Az 1. ábra az albumin fokozó és promotor szekvenciák vázlatos bemutatása az albumin-génre (IA), egy heterológ génre (IB) és nem-esszenciális szekvenciák nélküli heterológ génekre vonatkozóan.
A 2A. ábra a Varicella zoster timidin kináz gén diagramja.
A 2B. ábra a VZV TK gén szekvenciája.
A 3A. ábra az albumin transzkripciós szabályozó szekvencia/VZV TK molekuláris kimérát mutatja be.
A 3B. ábra az alfa-fetoprotein transzkripciós szabályozó szekvencia/VZV TK molekuláris kimérát mutatja be.
A 4A. ábra az alfa-fetoprotein/VZV TK molekuláris kimérát tartalmazó retrovírus provírus formája.
A 4B. ábra a pCR7B plazmidot mutatja be.
Az 5. ábra a pCR74 megalkotását bemutató folyamatábra.
A 6. ábra a pCR7B megalkotását bemutató folyamatábra. A 7. ábra az ALB E/P és VZV TK csatlakozását szegélyező' szekvencia pCR74-ben.
A 8. ábra az AFP E/P és VZV TK csatalkozását szegélyező' szekvencia pCR7B-ban.
A 9. ábra: ara ATP termelése kontrollal, pCR74gyel és pCR7B-cal fertó'zött sejtekből.
1. TÁBLÁZAT
VZV TK aktivitás ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR7B) tartalmazó, replikáció-hiányos teljes hosszúságú mesterséges retrovírusokkal fertó'zött Hep G2 sejtekben.
VírusVZV enzimes aktivitásNövekedés nmól ara MP/pg fehétje/30perc
Semmi90x
N240x pCR744521904x pCR7B25852x
2. TÁBLÁZAT
Növekedésgátlás ALB/VZV TK kimérát (pCR74) vagy AFP/VZV TK kimérát (pCR7B) tartalmazó, replikáció-hiányos teljes hosszúságú retrovírusokkal fertó'zött Hep G2 sejtekben.
VíiusIC5q a 9-(-D-arabinofüranozil)-6-metoxi-9Hpurinboz
Semmi2000 pmól N22000 pmól pCR745 pmól pCR7B175 pmól

Claims (27)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Molekuláris kiméra amely tartalmaz egy emlős cél sejtben szelektíven aktiválódni képes transzkripciós szabályozó szekvenciát és egy ehhez működőképesen kapcsolódó, egy heterológ enzimet kódoló DNS szekvenciát, amely heterológ enzim katalizálni képes egy a célsejtre toxikus anyag képződését.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti kiméra, amelyben a
    HU 211 655 A9 transzkripciós szabályozó szekvencia egy promotert tartalmaz.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti kiméra, amely a heterológ enzimet kodoló DNS szekvenciától lefelé még egy poliadenilező szignált is tartalmaz.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kiméra amelyben a transzkripciós szekvencia még egy fokozó szekvenciát is tartalmaz.
  5. 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti kiméra, amely a promoterként valamely követekző anyag promoterjét tartalmazza: albumin, alfa-fetoprotein, karcinoembrionikus antigén, tirozin hidroxiláz, kolin acetil transzferáz, neuronspecifikus enoláz, glial fibrosav protein, inzulin, gamma-glutamiltransz peptidáz, dopa dekarboxiláz, HER2/neu vagy N-myc onkogének.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti kiméra, amely a fokozóként valamely következő anyag fokozóját tartalmazza; albumin, alfafetoprotein, karcinoembrionikus antigén, tirozin hidroxiláz, kolin acetil transzferáz, neuronspecifikus enoláz, glial fibrosav protein inzulin, gamma-glutamiltransz-peptidáz, dopa dekarboxiláz, HER2/neu vagy N-myc onkogének.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti kiméra, amely enzimként valamely következő enzimet tartalmaz: varicella zoster vírus timidin kináz, karboxipeptidáz G2, alkalikus foszfatáz penicillin-V amidáz vagy nem-emlős citozin dezamináz.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti molekuláris kiméra, amelyben az enzim varicella zoster vírus timidin kináz.
  9. 9. Molekuláris kiméra, amely varicella zoster vírus timidin kináz génjét kodoló DNS szekvenciát tartalmaz az albumin transzkripciós szabályozó szekvenciájához működőképesen kapcsolva.
  10. 10. Molekuláris kiméra, amely varicella zoster vírus timidin kinázt kodoló DNS szekvenciát tartalmaz az alfafetoprotein transzkripciós szabályozó szekvenciájához működőképesen kapcsolva.
  11. 11. Retrovírus ingázó vektor, amely valamely, 1-10. igénypont bármelyike szerinti molekuláris kimérát tartalmaz.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti vektor, amely a következőket tartalmazza: egy 5’ virális hosszú terminális ismétlődés (LTR) szekvenciát, egy cisz-működő psi burokképző szekvenciát, egy az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti molekuláris kimérát és egy 3’ virális LTR szekvenciát.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti vektor, amelyben a molekuláris kiméra az 5’ retrovírus LTR -rel ellentétes irányban van orientálva.
  14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti vektor, amely még tartalmaz egy az 5’ LTR szekvenciához működőképesen kapcsolódó domináns szelektálható markert kodoló DNS szekvenciát.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti vektor, amelyben a szelektálható marker szekvencia egy NEO gén.
  16. 16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti vektor, amely egy ön-inaktiváló vektor (SIN).
  17. 17. Fertőző virion, amely egy, a 11-16. igénypontok bármelyike szerinti vektort burkol magába.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti fertőző virion, amely úgy van megszerkesztve, hogy szelektíven fertőzi a célsejtet.
  19. 19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti fertőző virion, amely replikáció-hiányos.
  20. 20. A 17-19. igénypontok bármelyike szerinti fertőző virion, amelyben a virion env génje úgy van módosítva, hogy megkönnyíti a sejt-kötést.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti fertőző virion, amelyben az env gén úgy van módosítva, hogy magában foglalja a nagy S HBV burkoló protein hepatocyta kötéshelyét.
  22. 22. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti molekuláris kiméra alkalmazása orvosi terápiás célra.
  23. 23. Gyógyszerkészítmény, amely valamely 17-21. igénypont szerinti fertőző viriont tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt.
  24. 24. A 17- 21. igénypontok bármelyike szerinti fertőző virion alkalmazása orvosi terápiás célra.
  25. 25. A 17-21. igénypontok bármelyike szerinti fertőző virion alkalmazása emlős rákbetegség kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállításához.
  26. 26. A 17-21. igénypontok bármelyike szerinti fertőző virion és egy vegyület - amely szelektíven katalizálható egy heterológ enzimmel citosztatikus vagy citotoxikus metabolittá - együttes alkalmazása terápiában.
  27. 27. pCR73, pCR74, pCR77 vagy pCR7B plazmidok bármelyike.
HU95P/P00180P 1989-08-30 1995-06-09 Novel entities for cancer therapy HU211655A9 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898919607A GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-08-30 Novel entities for cancer therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211655A9 true HU211655A9 (en) 1995-12-28

Family

ID=10662268

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU905679A HUT58814A (en) 1989-08-30 1990-08-29 Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer
HU95P/P00180P HU211655A9 (en) 1989-08-30 1995-06-09 Novel entities for cancer therapy

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU905679A HUT58814A (en) 1989-08-30 1990-08-29 Process for producing new pharmaceutical compositions for treating cancer

Country Status (19)

Country Link
EP (5) EP0657541A1 (hu)
JP (1) JPH03172189A (hu)
CN (1) CN1058993C (hu)
AT (1) ATE236260T1 (hu)
AU (3) AU647747B2 (hu)
CA (1) CA2024253C (hu)
DD (1) DD297447A5 (hu)
DE (1) DE69034054T2 (hu)
DK (1) DK0415731T5 (hu)
ES (1) ES2194833T3 (hu)
FI (1) FI904257A0 (hu)
GB (1) GB8919607D0 (hu)
HU (2) HUT58814A (hu)
IE (1) IE903125A1 (hu)
IL (1) IL95515A0 (hu)
MY (1) MY107402A (hu)
NZ (1) NZ235093A (hu)
PT (1) PT95134B (hu)
ZA (1) ZA906894B (hu)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5662896A (en) 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
US6133029A (en) 1988-03-21 2000-10-17 Chiron Corporation Replication defective viral vectors for infecting human cells
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US6569679B1 (en) 1988-03-21 2003-05-27 Chiron Corporation Producer cell that generates adenoviral vectors encoding a cytokine and a conditionally lethal gene
US5997859A (en) * 1988-03-21 1999-12-07 Chiron Corporation Method for treating a metastatic carcinoma using a conditionally lethal gene
WO1990007936A1 (en) * 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
EP0466815A4 (en) * 1989-04-05 1992-09-02 Novacell Corpporation Infectious targetted replication-defective virion
US6337209B1 (en) 1992-02-26 2002-01-08 Glaxo Wellcome Inc. Molecular constructs containing a carcinoembryonic antigen regulatory sequence
US6555370B1 (en) 1990-11-13 2003-04-29 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
EP0557459B1 (en) * 1990-11-13 1997-10-22 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
GB9100612D0 (en) * 1991-01-11 1991-02-27 Univ Edinburgh Method of altering the metabolic state of non-dividing cells,transgenic animals and therapeutic agents
GB9104165D0 (en) * 1991-02-27 1991-04-17 Wellcome Found Novel entities for hiv therapy
GB9107631D0 (en) * 1991-04-10 1991-05-29 British Bio Technology Proteinaceous particles
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5529774A (en) * 1991-08-13 1996-06-25 The Regents Of The University Of California In vivo transfer of the HSV-TK gene implanted retroviral producer cells
EP0564645B1 (fr) * 1991-10-30 1999-12-29 Universite Pierre Et Marie Curie Paris Vi Cellules transformees pour la prevention ou le traitement de maladies induites par des virus, notamment retrovirus pathogenes
WO1993010218A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
WO1994004196A1 (en) * 1992-08-14 1994-03-03 Imperial Cancer Research Technology Limited Tumour therapy
GB9305759D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 Medical Research Council And T Hiv therapy method and agents
US6017896A (en) * 1993-09-14 2000-01-25 University Of Alabama Research Foundation And Southern Research Institute Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US5552311A (en) * 1993-09-14 1996-09-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy
US6491905B1 (en) 1993-09-14 2002-12-10 The Uab Research Foundation Recombinant bacterial cells for delivery of PNP to tumor cells
US5804407A (en) * 1993-11-04 1998-09-08 University Technologies International, Inc. Method of expressing genes in mammalian cells
FR2712602B1 (fr) * 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
AU1257495A (en) 1993-11-18 1995-06-06 Chiron Corporation Compositions and methods for utilizing conditionally lethal genes
FR2712603B1 (fr) * 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
DE69524740T2 (de) * 1994-05-02 2002-08-14 University Of Washington, Seattle Thymidin-kinase-mutanten
US6451571B1 (en) 1994-05-02 2002-09-17 University Of Washington Thymidine kinase mutants
GB9415167D0 (en) * 1994-07-27 1994-09-14 Springer Caroline J Improvements relating to cancer therapy
EP0779929B1 (en) * 1994-09-02 2001-04-11 Gsf-Forschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit, Gmbh Non self-inactivating, expression targeted retroviral vectors
GB9422383D0 (en) * 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
GB9423367D0 (en) * 1994-11-18 1995-01-11 Wellcome Found Enzyme prodrug therapy
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
EP0817858B1 (en) 1995-03-09 2003-04-23 Austrian Nordic Biotherapeutics AG Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US7011976B1 (en) 1997-03-03 2006-03-14 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof
US6254862B1 (en) 1997-03-03 2001-07-03 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof
GB9516943D0 (en) * 1995-08-18 1995-10-18 Cancer Soc Auckland Div Nz Inc Novel cyclopropylindoles and their secoprecursors,and their use as prodrugs
GB9517001D0 (en) * 1995-08-18 1995-10-18 Denny William Enediyne compounds
US6248555B1 (en) 1995-08-31 2001-06-19 The General Hospital Corporation Genetic alterations related to familial alzheimer's disease
GB9523703D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Wellcome Found Enzyme prodrug thearapy
CN1062602C (zh) * 1996-01-25 2001-02-28 上海市肿瘤研究所 中国株单纯疱疹病毒胸苷激酶基因及其应用
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
US6130237A (en) * 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
CA2266656A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
GB9709421D0 (en) 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
GB9712370D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Aepact Ltd Therapeutic systems
GB9712512D0 (en) 1997-06-16 1997-08-20 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
DE69838584T2 (de) 1997-08-04 2008-06-26 Cell Genesys, Inc., Foster City Enhancer des menschlichen glandulären kallikreingens, vektoren die ihn enthalten und methoden für seine verwendung
JP2002516061A (ja) 1997-10-14 2002-06-04 ダーウィン モレキュラー コーポレイション チミジンキナーゼ変異体ならびにチミジンキナーゼ活性およびグアニル酸キナーゼ活性を有する融合タンパク質
BR9813930A (pt) 1997-11-06 2006-12-19 Chiron Spa antìgeno neisserial
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
WO1999036544A2 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Chiron S.P.A. Neisseria meningitidis antigens
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
WO2001031019A2 (en) 1999-10-29 2001-05-03 Chiron Spa Neisserial antigenic peptides
JP5102414B2 (ja) 1998-05-01 2012-12-19 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 髄膜炎菌抗原および組成物
EP1121437B1 (en) 1998-10-15 2008-02-20 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
NZ512122A (en) 1998-11-27 2003-12-19 Darwin Discovery Ltd Compositions and methods for increasing bone mineralization
EP1141331B1 (en) 1998-12-16 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. HUMAN CYCLIN-DEPENDENT KINASE (hPNQALRE)
US7063850B1 (en) 1998-12-22 2006-06-20 University Of Tennessee Research Foundation Protective antigen of group A Streptococci
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
CA2360347C (en) 1998-12-31 2013-05-07 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
GB9907414D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 Cancer Res Campaign Tech Improvements relating to prodrugs
US6911429B2 (en) 1999-04-01 2005-06-28 Transition Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans
US6864235B1 (en) 1999-04-01 2005-03-08 Eva A. Turley Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans
CN100392082C (zh) 1999-04-30 2008-06-04 启龙股份公司 保守的奈瑟球菌抗原
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
US20030108539A1 (en) 2000-02-14 2003-06-12 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
ES2335386T3 (es) 1999-11-18 2010-03-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Gen fgf-21 humano y productos de expresion genica.
CN1416352B (zh) 2000-01-17 2011-05-25 启龙股份公司 含有脑膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白质的外膜囊(omv)疫苗
EP1854476A3 (en) 2000-02-09 2008-05-07 Bas Medical, Inc. Use of relaxin to treat diseases related to vasoconstriction
MXPA02008314A (es) 2000-02-28 2002-12-09 Chiron Spa Expresion heterologa de proteinas de neisseria.
EP1263474A1 (en) * 2000-03-08 2002-12-11 Neurosearch A/S A method of sensitising endothelial cells to prodrugs
WO2001066595A2 (en) 2000-03-08 2001-09-13 Chiron Corporation Human fgf-23 gene and gene expression products
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
US6656718B2 (en) 2000-07-07 2003-12-02 Cancer Research Technology Limited Modified carboxypeptidase enzymes and their use
EP1328543B1 (en) 2000-10-27 2009-08-12 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
DE10055383A1 (de) 2000-11-08 2002-05-29 Max Delbrueck Centrum Verwendung des humanen LRP/MVP Promotors für einen Therapie-induzierbaren Vektor
US6958213B2 (en) 2000-12-12 2005-10-25 Alligator Bioscience Ab Method for in vitro molecular evolution of protein function
US20020086292A1 (en) 2000-12-22 2002-07-04 Shigeaki Harayama Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
WO2002081642A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002303261A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002305151A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7393657B2 (en) 2001-04-12 2008-07-01 Imperial College Innovations Limited Diagnosis and treatment of cancer: I
AU2002305331A1 (en) * 2001-05-02 2002-11-11 Southern Research Institute Gene delivery compounds
JP4353701B2 (ja) 2001-05-08 2009-10-28 ダーウィン モレキュラー コーポレイション Ｆｏｘｐ３蛋白質を用いた霊長類における免疫機能の調節方法
DE10292896D2 (de) * 2001-07-05 2004-07-01 Univ Goettingen Georg August Gentherapeutisches Verfahren zur Behandlung von GnRH-Rezeptor-positiven Karzinomen durch GnRH induzierte tumorzellspezifische Aktivierung eines therapeutischen Gens, zugehörige Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren
US7211659B2 (en) 2001-07-05 2007-05-01 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic HIV type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1273309A1 (de) * 2001-07-05 2003-01-08 Georg-August Universität Göttingen Gentherapeutisches Verfahren zur Behandlung von GnRH-Rezeptor-positiven Karzinomen durch GnRH induzierte tumorzellspezifische Aktivierung eines therapeutischen Gens, zugehörige Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren
EP2280074A3 (en) 2001-07-05 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
AU2002365223A1 (en) 2001-10-26 2003-09-02 Id Biomedical Corporation Of Washington Multivalent streptococcal vaccine compositions and methods for use
US7488598B2 (en) 2001-10-26 2009-02-10 Cornell Center For Technology Enterprise And Commercialization Mutant purine nucleoside phosphorylase proteins and cellular delivery thereof
US7037718B2 (en) 2001-10-26 2006-05-02 Cornell Research Foundation, Inc. Mutant purine nucleoside phosphorylase proteins and cellular delivery thereof
EP1453536A4 (en) 2001-12-12 2009-08-26 Mayne Pharma Int Pty Ltd COMPOSITION FOR PRESERVING VIRUSES
ES2386386T3 (es) 2001-12-12 2012-08-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunización contra Chlamydia trachomatis
MXPA04008890A (es) 2002-03-15 2005-10-18 Wyeth Corp Mutantes de la proteina p4 de haemophilus influenzae no tipicable con actividad enzimatica reducida.
US7138512B2 (en) 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7244565B2 (en) 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2003088995A2 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Recopharma Ab Mucin fusion polypeptide vaccines, compositions and methods of use thereof
EP1497437A4 (en) 2002-05-01 2005-11-16 Cell Genesys Inc LENTIVIRAL VECTOR PARTICLES RESISTANT TO THE INACTIVATION OF A COMPLEMENT
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
WO2005020928A2 (en) 2003-08-29 2005-03-10 The Regents Of The University Of California Agents and methods for enhancing bone formation by oxysterols in combination with bone morphogenic proteins
JP4792390B2 (ja) 2004-03-29 2011-10-12 株式会社ガルファーマ 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途
WO2007031098A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
WO2007098281A2 (en) 2006-02-27 2007-08-30 Regents Of The University Of California Oxysterol compounds and the hedgehog pathway
GB0607354D0 (en) 2006-04-12 2006-05-24 Bioinvent Int Ab Agent, Composition And Method
US20110206692A1 (en) 2006-06-09 2011-08-25 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
US9526737B2 (en) 2007-12-03 2016-12-27 The Regents Of The University Of California Oxysterols for activation of hedgehog signaling, osteoinduction, antiadipogenesis, and Wnt signaling
WO2009143865A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2009143864A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases
GB2460717A (en) 2008-06-11 2009-12-16 Sense Proteomic Ltd Autoantibodies for the detection of a predisposition to Lupus
CN102224254A (zh) 2008-09-23 2011-10-19 哈佛大学校长及研究员协会 Sirt4及其用途
US9181315B2 (en) 2009-01-08 2015-11-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for induced brown fat differentiation
WO2011038063A1 (en) 2009-09-28 2011-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of diagnosing and treating interstitial cystitis
WO2011091272A1 (en) 2010-01-21 2011-07-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Context specific genetic screen platform to aid in gene discovery and target validation
CA2790245C (en) 2010-02-19 2018-10-09 Universite De Liege A polynucleotide for use in treatment of influenza a virus induced diseases, encoding modified mx protein, said modified mx protein, and a transgenic animal expressing gene encoding modified mx protein
EP2627346B1 (en) 2010-10-14 2016-03-23 Xigen Inflammation Ltd. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for use in the treatment of uveitis
US9150618B2 (en) 2010-10-14 2015-10-06 Xigen Inflammation Ltd. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases
US9539427B2 (en) 2010-11-08 2017-01-10 The Johns Hopkins University Methods for improving heart function
WO2012075243A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for targeting sites of neovascular growth
GB201115280D0 (en) 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
US10093705B2 (en) 2011-09-13 2018-10-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for brown fat induction and activity using FNDC5
WO2013055911A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Znf365/zfp365 biomarker predictive of anti-cancer response
US20140309400A1 (en) 2011-11-30 2014-10-16 Xigen Inflammation Ltd. Use of Cell-Permeable Peptide Inhibitors of the JNK Signal Transduction Pathway for the Treatment of Dry Eye Syndrome
MX359257B (es) 2012-05-04 2018-09-19 Pfizer Antígenos asociados a próstata y regímenes de inmunoterapia basados en vacuna.
EP2847206A4 (en) 2012-05-07 2016-01-20 Univ California OXYSTEROL ANALOGUE OXY133 FOR INDUCTION OF OSTEOGENESIS AND HEDGEHOG SIGNALING AND ADIPOGENESIS INHIBITION
CA2911205A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 The Regents Of The University Of California Bone-selective osteogenic oxysterol-bone targeting agents
WO2015197098A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2014206427A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
AU2015249374A1 (en) 2014-04-24 2016-12-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor suppressor and oncogene biomarkers predictive of anti-immune checkpoint inhibitor response
AU2015328411C1 (en) 2014-10-06 2022-03-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Angiopoietin-2 biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response
EP3204031A2 (en) 2014-10-08 2017-08-16 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
AU2015328163B2 (en) 2014-10-09 2020-10-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Multiple-variable IL-2 dose regimen for treating immune disorders
WO2016144673A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pd-l2 biomarkers predictive of pd-1 pathway inhibitor responses in esophagogastric cancers
EP3362074B1 (en) 2015-10-16 2023-08-09 President and Fellows of Harvard College Regulatory t cell pd-1 modulation for regulating t cell effector immune responses
WO2017075329A2 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using pm20d1 and n-lipidated amino acids
US20210309965A1 (en) 2016-03-21 2021-10-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T-cell exhaustion state-specific gene expression regulators and uses thereof
JP7099967B2 (ja) 2016-07-01 2022-07-12 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 幹細胞由来移植片からの増殖性細胞の排除
CA3034643A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Ellen Weisberg Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of aml using usp10 biomarkers and modulators
US11820822B2 (en) 2017-06-06 2023-11-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for sensitizing cancer cells to T cell-mediated killing by modulating molecular pathways
EP3962529A4 (en) 2019-04-30 2023-11-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHOD FOR CANCER TREATMENT USING ANTI-CX3CR1 AND IMMUNE CHECKPOINT BLOCKING REAGENTS COMBINATIONS
EP4229222A2 (en) 2020-10-19 2023-08-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Germline biomarkers of clinical response and benefit to immune checkpoint inhibitor therapy
WO2022104104A2 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Personalized fusion cell vaccines
WO2022159793A2 (en) 2021-01-25 2022-07-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for identifying neuroendocrine prostate cancer
US20240280561A1 (en) 2021-06-08 2024-08-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating and/or identifying an agent for treating intestinal cancers
WO2023097119A2 (en) 2021-11-29 2023-06-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to modulate riok2
AU2023221961A1 (en) 2022-02-16 2024-09-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for decreasing pathologic alpha-synuclein using agents that modulate fndc5 or biologically active fragments thereof
LT7046B (lt) 2022-04-15 2024-02-12 Vilniaus Universitetas Hidrolazės ir jų panaudojimas

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1310924C (en) * 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
GB8629892D0 (en) * 1986-12-15 1987-01-28 Wellcome Found Antiviral compounds
GB8712528D0 (en) * 1987-05-28 1987-07-01 Clayton Found Res Gene transfer
GB8712745D0 (en) 1987-05-30 1987-07-01 Wellcome Found Antiviral compounds
NZ225599A (en) * 1987-08-04 1991-09-25 Bristol Myers Co Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells
DE68927996T2 (de) * 1988-02-05 1997-12-04 Hughes Howard Med Inst Modifizierte hepatozyten und deren anwendung
CN1038306A (zh) * 1988-03-21 1989-12-27 维吉恩公司 重组反转录病毒
EP0466815A4 (en) * 1989-04-05 1992-09-02 Novacell Corpporation Infectious targetted replication-defective virion
EP1645635A3 (en) * 1989-08-18 2010-07-07 Oxford Biomedica (UK) Limited Replication defective recombinant retroviruses expressing a palliative
WO1991012023A2 (en) * 1990-02-16 1991-08-22 Boston Biomedical Research Institute Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP0657540A1 (en) 1995-06-14
GB8919607D0 (en) 1989-10-11
EP0657541A1 (en) 1995-06-14
CA2024253A1 (en) 1991-03-01
DE69034054T2 (de) 2004-02-12
EP0415731A3 (en) 1992-01-08
IL95515A0 (en) 1991-06-30
DK0415731T3 (da) 1992-01-08
NZ235093A (en) 1992-11-25
JPH03172189A (ja) 1991-07-25
AU3422897A (en) 1997-11-20
EP0690129A1 (en) 1996-01-03
CN1050899A (zh) 1991-04-24
PT95134A (pt) 1991-05-22
MY107402A (en) 1995-11-30
EP0657539A1 (en) 1995-06-14
ATE236260T1 (de) 2003-04-15
PT95134B (pt) 2003-06-30
DE69034054D1 (de) 2003-05-08
ZA906894B (en) 1992-05-27
FI904257A0 (fi) 1990-08-29
AU647747B2 (en) 1994-03-31
AU698283B2 (en) 1998-10-29
EP0415731A2 (en) 1991-03-06
HU905679D0 (en) 1991-03-28
CA2024253C (en) 2001-12-04
AU6199190A (en) 1991-03-07
DK0415731T5 (da) 2003-07-28
IE903125A1 (en) 1991-03-13
HUT58814A (en) 1992-03-30
DD297447A5 (de) 1992-01-09
ES2194833T3 (es) 2003-12-01
CN1058993C (zh) 2000-11-29
EP0415731B1 (en) 2003-04-02
AU6458794A (en) 1994-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211655A9 (en) Novel entities for cancer therapy
EP0832980B1 (en) Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US5861290A (en) Methods and polynucleotide constructs for treating host cells for infection or hyperproliferative disorders
JP2021006031A (ja) ミニプロモーターカセットを含むレトロウイルスベクター
KR100361254B1 (ko) 발현표적화를위한태아성암항원의전사조절서열
WO1997019180A2 (en) Vector consisting of a transcriptional regulatory dna sequence linked to a dna sequence encoding beta-lactamase for enzyme prodrug therapy
EP0573479A1 (en) Chimeric tar enzyme construction for hiv therapy
EP0848757B1 (en) The use of the wap of mmtv regulatory sequences for targeted expression of linked heterologous genes in human mammary cells, including human mammary carcinoma cells
US11970708B2 (en) Gene therapy vector with minimizing recombination, recombinant retrovirus comprising the vector, and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant retrovirus
JP2002515231A (ja) シトシンデアミナーゼ遺伝子
WO2015020215A1 (ja) レンチウイルスベクターｔｈｔｄ、該ｔｈｔｄを含有する老化剤、がん抑制剤および医薬組成物、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、並びにウイルス様中空粒子の製造方法
EP1264892A2 (en) Lentiviral vectors comprising endothelial cell specific promoters
RU2476596C1 (ru) Многопрофильный промотор, экспрессирующий вектор и способ избирательного убийства раковых клеток с их использованием
WO2000050618A1 (fr) Vecteur viral
CA2047363C (en) Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
WO2001066148A1 (en) A method of sensitising endothelial cells to prodrugs
ES2235638A1 (es) Nuevo vector retroviral de alto titulo y metodos de transduccion.