DE69716581T2

DE69716581T2 - Retroviraler vektor und dessen verwendung in gentherapie

Info

Publication number: DE69716581T2
Application number: DE69716581T
Authority: DE
Inventors: Alan John Kingsman; Susan Mary Kingsman
Original assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Current assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: EP0880594A1; DE69716581D1; NZ326429A; WO1997027310A1; DK0880594T3; ATE226638T1; PT880594E; NO983375D0; JP3535521B2; ES2184059T3; NO983375L; CA2243529A1; KR19990087036A; AU729934B2; JP2000500986A; EP0880594B1; AU1452297A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Satzes von DNA-Sequenzen, die retrovirale Vektorpartikel codieren, in Formulierungen für die Gentherapie sowie Herstellerzellen, die solche Sätze von DNA-Sequenzen enthalten.

EINLEITUNG UND STAND DER TECHNIK

Eine Anzahl von Krankheiten ist einer Behandlung mittels der Auslieferung von therapeutischen Nukleinsäuren an Zellen eines Patienten zugänglich. Dies wird als Gentherapie bezeichnet (ausführlich beschrieben in Lever und Goodfellow 1995; Culver 1995; Ledley 1995). Um eine Gentherapie zu erreichen, braucht man ein Verfahren zur Auslieferung von Genen an die Zellen eines Patienten und zusätzliche Verfahren, um die effektive Produktion der therapeutischen Gene sicherzustellen. Es gibt zwei grundsätzliche Ansätze, um die Genauslieferung zu erreichen; diese sind nicht-virale Auslieferung und virusvermittelte Genauslieferung. Das am besten charakterisierte System zur virusvermittelten Genauslieferung verwendet bezüglich Replikation defekte Retroviren zur stabilen Einführung von Genen in Patientenzellen. Ein großer Nachteil der nicht-viralen Auslieferung besteht darin, daß die DNA auf die ursprünglichen Zielzellen beschränkt und von kurzer Lebensdauer ist, was bei chronischer Krankheit wiederholte Behandlungen mit der DNA erforderlich macht. Ein großer Nachteil retroviraler Vektoren besteht darin, daß ein effizienter Gentransfer nur durch Transduktion von Zellen ex vivo und Einführen entweder der transduzierten Zellpopulation zurück in den Patienten oder Verpflanzen in eine Zellinie, die zur Freisetzung retroviraler Vektorpartikel konstruiert ist, erreicht wird. Diese Verfahren erfordern ein erhebliches chirurgisches Verfahren und die Manipulation von Zellen. Zudem ist die Transduktion von Patientenzellen mit retroviralen Vektorpartikeln ineffizient.
Die verschiedenen bekannten Technologien, die in das Gebiet der Erfindung Eingang finden, werden nachfolgend ausführlicher beschrieben.

1. Herstellung von retroviralen Vektoren aus mehreren separaten DNA-Sequenzen

Es ist bekannt, daß die separate Expression der Bestandteile eines retroviralen Vektors auf separaten DNA-Sequenzen, die gemeinsam in die gleiche Zelle eingeführt werden, retrovirale Partikel liefert, die defekte retrovirale Genome aufweisen, welche therapeutische Gene tragen (z. B. berichtet von Miller 1992). Diese Zelle wird als die Herstellerzelle bezeichnet. Es gibt zwei übliche Verfahren zur Erzeugung von Herstellerzellen. Bei einem werden die Sequenzen, welche retrovirale Gag-, Pol- und Env-Proteine codieren, in die Zelle eingeführt und stabil in das Zellgenom integriert; es wird eine stabile Zellinie hergestellt, die als die verpackende Zellinie bezeichnet wird. Das retrovirale Vektorgenom wird dann in die verpackende Zellinie durch Transfektion oder Transduktion unter Erzeugung einer stabilen Zellinie, die alle für die Herstellung eines retroviralen Vektorpartikels erfor derlichen DNA-Sequenzen aufweist, eingeführt. Der zweite Ansatz besteht darin, die drei verschiedenen DNA-Sequenzen, die zur Herstellung eines retroviralen Vektorpartikels erforderlich sind, d. h. die env-codierenden Sequenzen, die gag-pol-codierende Sequenz und das defekte retrovirale Genom, gleichzeitig durch transiente Transfektion in die Zelle einzuführen, und das Verfahren wird als transiente Dreifachtransfektion bezeichnet (Landau & Littman 1992; Pear et al. 1993). Das Verfahren der Dreifachtransfektion wurde optimiert (Soneoka et al. 1995; Finer et al. 1994). Die WO 94/29438 beschreibt die Herstellung von Herstellerzellen in vitro unter Verwendung dieses transienten Mehrfach-DNA-Transfektionsverfahrens und beschreibt die Verwendung dieser Herstellerzellen in vitro für die Überführung von retroviralen Partikeln in menschliche Zellen jeder Abstammung, die aus einem Patienten entnommen worden sind. Die WO 94/19478 beschreibt die Verwendung neuer Zellinien zur Herstellung retroviraler Vorräte mit hohem Titer nach der transienten Transfektion eines oder mehrerer retroviraler Plasmide in eine verpackende Zellinie. Es wird auch nur die Überführung von Retroviren in Zielzellen in vitro beschrieben. Die Überführung von Retroviren aus einer Herstellerzelle in eine Zielzelle in vitro wird als Cokultivierung bezeichnet, und es handelt sich um ein gut etabliertes Verfahren zur Einführung von Retroviren in Zellen in vitro.

2. Durch DNA vermittelte Genauslieferung in vivo

Die Auslieferung von Genen an eine Vielzahl verschiedener Zellen im Menschen oder in Tieren unter Verwendung von nackter DNA oder von DNA, die mit einem nicht-viralen Auslieferungssystem verbunden ist, wurde ausführlich beschrieben (beschrieben von Ledley 1995). Das einfachste Verfahren beinhaltet die Injektion von nackter DNA in Gewebe, wo sie von einem Teil der Zellen aufgenommen wird, und die in der DNA enthaltenen Gene werden unter Herstellung von Proteinen in diesen Zellen exprimiert (Dubensky et al. 1984; Wolffe et al. 1990).
Die DNA kann mittels Biolistika ausgeliefert werden; bei diesem Verfahren werden Metallteilchen mit DNA beschichtet und mit hoher Geschwindigkeit mittels einer Hochdruckvorrichtung in die Zellen geschleudert (z. B. Yang et al. 1990). Die DNA kann mit chemischen Mitteln gekoppelt sein, welche die Aufnahme in die Zellen optimieren, z. B. Polylysin, oder mit Bestandteilen von viralen Partikeln, z. B. Adenoviruspartikeln oder Pentonprotein, oder mit Liganden für spezifische verwandte Rezeptoren. Die DNA kann in Liposomen eingeschlossen oder mit kationischen Lipiden komplexiert sein (z. B. Hyde et al. 1993). Unabhängig davon, wie die DNA durch diese nicht-viralen Verfahren ausgeliefert wird, besteht das wesentliche Merkmal darin, daß keine Übertragung von DNA aus den ursprünglich transfizierten Zellen in andere Zellen stattfindet, ausgenommen möglicherweise durch Übertragung auf Tochterzellen nach Zellteilung. Darüber hinaus bleibt das eingeführte Gen nicht mit Sicherheit dauerhaft in den Zielzellen erhalten.

3. Durch Retrovirus vermittelte Genauslieferung

Die Verwendung von defekten Retrovirusvektoren zur Auslieferung von Genen an Zielzellen ist gut dokumentiert (beschrieben von Morgan und Anderson 1993). Defekte Retroviren werden verwendet, um Zellen zu transduzieren, die aus dem Körper entnommen wurden (ex vivo- Genauslieferung), oder sie können in situ an Gewebe ausgeliefert werden (in vivo-Genauslieferung). Die Vektoren führen DNA in eine Zelle ein, und diese wird stabil in das Wirtszellgenom aufgenommen, wo sie zur Produktion irgendeines therapeutischen Gens, das darin enthalten ist, exprimiert wird. Es findet keine Verbreitung des therapeutischen Gens statt, weil die durch retroviralen Vektor vermittelte Genübertragung ein einstufiges Ereignis ist, das nur die ursprüngliche Zielzelle beeinflußt. In vivo-Genauslieferung wird nicht in breitem Maße eingesetzt, weil die Genauslieferung ineffizient ist, hauptsächlich weil die auf diese Weise ausgelieferten retroviralen Partikel schnell von dem Behandlungsort entfernt werden und keine verlängerte Exposition der Zellen an virale Partikel stattfindet. Wenn z. B. retrovirale Vektorpartikel in die Gehirne von Ratten injiziert wurden, die Glia- Tumore trugen, wurden nur sehr wenige Zellen von den Vektoren transduziert aufgrund der kurzen Halbwertszeit von 2-4 Stunden der retroviralen Partikel (Short et al. 1990).

4. Implantation von Herstellerzellen in Zielgewebe

Es wurde berichtet, daß eine Herstellerzelle, die in vitro erzeugt wurde, in situ in ein Gewebe implantiert werden kann (Short et al. 1990). Die Herstellerzelle setzt retrovirale Vektorpartikel frei, welche dann benachbarte Zellen transduzieren. Bei diesem Verfahren wird durch die stabile Transformation der Zelle mit den DNA-Sequenzen, welche retrovirale Bestandteile in vitro bestimmen, erzeugt. Die Zelle wird in vitro kultiviert und anschließend chirurgisch in den Patienten implantiert. Die Herstellerzelle ist fremd und kann aufgrund von Zerstörung durch das Immunsystem kurzlebig sein.
Es besteht ein klarer Bedarf nach verbesserten Wegen und Mitteln zum Einführen von therapeutischen Genen in Patienten. Gentherapie würde erheblich vereinfacht, wenn eine stabile Einführung von DNA in Patientenzellen nach nicht-viraler DNA-Auslieferung erreicht werden könnte und wenn die Effektivität von nicht-viraler DNA-Auslieferung verbessert werden könnte.
Die WO 96/17053 beschreibt einen adenoviralen Vektor, der aufgrund einer regulatorischen Sequenz, die funktionsfähig mit dem codierenden Bereich eines für die Vektorreplikation wesentlichen Gens verbunden ist, zur gewebespezifischen Replikation in der Lage ist. Der Vektor kann dazu verwendet werden, ein Polynukleotid in einem Gewebe in vivo zu verteilen.
Die WO 95/22617 beschreibt ein Retrovirus-Auslieferungssystem, bei dem das Vektorgenom ein therapeutisch aktives Gen anstelle des env-Gens enthält, aber ansonsten mit dem Wildtyp- Genom identisch ist. Es wird vorgeschlagen, daß durch Einführung eines env-Gens in die Zielzelle Retrovirusvektorpartikel dann in situ hergestellt werden können.

DIE ERFINDUNG

Der erste Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen eines therapeutisch aktiven Gens in eine Zielzelle. Gemäß einer ersten Ausführungsform liefert die Erfindung die Verwendung eines Satzes von DNA-Sequenzen mit
einer ersten DNA-Sequenz, welche einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor codiert, der
(a) ein defektes retrovirales Genom, dem funktionsfähige env- und funktionsfähige gag-pol-Gene fehlen, der jedoch die übrigen Komponenten hat, die für eine retrovirale Funktion wichtig sind, und
(b) ein therapeutisch aktives Gen
enthält, und
einer zweiten DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Verpackungskomponenten env und gag-pol zu codieren, wobei die DNA-Sequenz, die env codiert, auf einem von der DNA- Sequenz, die gag-pol codiert, getrennten Konstrukt vorhanden ist,
zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in einem Verfahren zum Einführen des therapeutisch aktiven Gens in eine Zielzelle in einem Patienten, welches die folgenden Stufen umfaßt:
(i) Einführen des Satzes von DNA-Sequenzen in eine aus dem Patienten isolierte Zelle, welche dabei in eine Herstellerzelle umgewandelt wird, die in der Lage ist, einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor herzustellen,
(ii) Reimplantieren der Herstellerzelle in den Patienten, wobei bezüglich Replikation defekte retrovirale Vektorpartikel in vivo hergestellt werden und das therapeutisch aktive Gen in vivo an die Zielzelle ausgeliefert wird.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform liefert die Erfindung die Verwendung eines Satzes von DNA-Sequenzen mit
einer ersten DNA-Sequenz, welche einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor codiert, der
(a) ein defektes retrovirales Genom, dem funktionsfähige env- und funktionsfähige gag-pol-Gene fehlen, der jedoch die übrigen Komponenten hat, die für eine retrovirale Funktion wichtig sind, und
(b) ein therapeutisch aktives Gen
enthält, und
einer zweiten DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Verpackungskomponenten env und gag-pol zu codieren, wobei die DNA-Sequenz, die env codiert, auf einem von der DNA- Sequenz, die gag-pol codiert, getrennten Konstrukt vorhanden ist,
zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in einem Verfahren zum Einführen des therapeutisch aktiven Gens in eine Zielzelle in einem Patienten, welches die folgende Stufe umfaßt:
Einführen des Satzes von DNA-Sequenzen in eine Patientenzelle durch in vivo-Auslieferung, wobei die Patientenzelle in vivo in eine Herstellerzelle umgewandelt wird, welche in der Lage ist, bezüglich Replikation defekte retrovirale Vektorpartikel herzustellen, wobei das therapeutisch aktive Gen in vivo an die Zielzelle ausgeliefert wird.
Vorzugsweise ist die Herstellerzelle vom gleichen Typ wie die Zielzelle.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung eine Herstellerzelle, die in der Lage ist, einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor in einem infektiösen retroviralen Partikel herzustellen, wobei die Herstellerzelle einen Satz von DNA-Sequenzen enthält mit
einer ersten DNA-Sequenz, die einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor codiert, welcher
(i) ein defektes retrovirales Genom, dem funktionsfähige env- und funktionsfähige gag-pol-Gene fehlen, der jedoch die übrigen Komponenten hat, die für eine retrovirale Funktion wichtig sind, und
(ii) wenigstens ein therapeutisch aktives Gen
enthält, und
einer zweiten DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Verpackungskomponenten env und gag-pol zu codieren, wobei die DNA-Sequenz, die env codiert, auf einem von der DNA-Sequenz, die gag-pol codiert, getrennten Konstrukt vorhanden ist,
wobei die Herstellerzelle eine aus einem Patienten isolierte frische Zelle ist, die, wenn sie in den Patienten reimplantiert wird, in der Lage ist, das therapeutisch aktive Gen an eine Zielzelle in dem Patienten durch in vivo-Herstellung von bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektorpartikeln auszuliefern.
Die Herstellerzelle kann eine Immunzelle sein.
Wie es nachfolgend ausführlicher erläutert wird, kann bei dem Verfahren gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung die Umwandlung der frischen Säugerzellen in Herstellerzellen entweder in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Im Fall von in vitro werden die Herstellerzellen für die Implantation in einen Patienten geeignet sein und sind vorzugsweise Zellen aus dem Patienten, in den sie reimplantiert werden sollen.
Es ist besonders bevorzugt, wenn die Herstellerzellen, die nach dem Verfahren gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung hergestellt sind, von einem Zielzelltyp sind, für den das therapeutisch aktive Gen vorgesehen ist. Dies vermeidet die Notwendigkeit, irgendwelche exogenen Zellen in den Zielbereich in einen Patienten einzuführen.
Alternativ können die Herstellerzellen jedoch Zellen sein, die in der Lage sind, das therapeutisch aktive Gen an die Zielzellen auszuliefern. Zellen des Immunsystems, wie Makrophagen oder tumorinfiltrierende Lymphozyten, könnten in Herstellerzellen umgewandelt werden; dies müßte in vitro durchgeführt werden. Wenn sie wieder in den Patienten eingeführt werden, werden diese mobilen Herstellerzellen Organe oder Gewebe infiltrieren, und retrovirale Vektorpartikel aus den Herstellerzellen werden diese Organe oder Gewebe infizieren.
Der Begriff "frische Säugerzellen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Säugerzellen, die sich in ihrem natürlichen Zustand oder so nah wie möglich an ihrem natürlichen Zustand befinden. Zellen, die extensiv in vitro kultiviert wurden, einschließlich Zellinien, werden nicht als frische Zellen angesehen. Frische Zellen, wie hierin darauf Bezug genommen wird, die aus einem Organismus entfernt wurden, sind normalerweise Primärzellen in dem Sinn, daß sie sich in einer primären Kultur von Zellen befinden, die direkt aus den Geweben eines Organismus hergestellt und nicht subkultiviert wurden.
Es ist ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung, daß der bezüglich Replikation defekte retrovirale Vektor nicht einen der strukturellen Bestandteile retroviraler Vektorpartikel codiert. Der Vektor erlaubt somit die Einführung des therapeutisch aktiven Gens oder der Gene in das Zielzellgenom ohne strukturelle Gene die Env und Gag-Pol codieren. Dies vermeidet Probleme, die mit der Expression von viralen Bestandteilen in den Zielzellen einhergehen, wie unerwünschten Immunreaktionen auf solche Bestandteile. Zum Beispiel werden Reaktionen von zytotoxischen T-Zellen, die gegen die Produkte anderer fremder Gene gerichtet sind, vermieden.
Es wird für den Fachmann auf dem Gebiet klar werden, daß Sicherheitserwägungen zur Vermeidung der Erzeugung von Replikationen von replikationskompetentem Virus durch Rekombination angewendet und bei der Konstruktion des Satzes von DNA-Sequenzen in Erwägung gezogen werden.
Die erste DNA-Sequenz, die gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung verwendet wird, kann auf separaten Expressionsvektoren vorhanden sein, oder sie kann auf einem einzelnen Expressionsvektor vorhanden sein, vorausgesetzt, daß das Vektorgenom in einer separaten Transkriptionseinheit codiert wird. Der Expressionsvektor oder die Vektoren sind normalerweise Plasmide. Vorzugsweise werden die DNA-Konstrukte, welche den retroviralen Vektor und die erforderlichen Verpackungsbestandteile codieren, dem Patienten gleichzeitig verabreicht oder gleichzeitig an die Zellen ausgeliefert, die in vitro in Herstellerzellen umgewandelt werden.
Die Erfindung umfaßt somit die Kombination aus zwei Technologien zur Bereitstellung eines Verfahrens zur Verabreichung von Genen direkt an Patienten-/Tiergewebe, so daß eine Langzeitexpression von therapeutischen Produkten erzielt wird. Das Wesentliche der Erfindung besteht darin, daß zuerst unter Einsatz nicht-viraler DNA-Verabreichung Kombinationen von DNA-Sequenzen in die Patientenzellen eingeführt werden. Die DNA-Sequenz, die den Vektor selbst codiert, d. h. das Genom des Retroviruspartikels, hat keine funktionalen env und gag-pol-Gene, so daß der Vektor sicher und praktisch ist. Das bevorzugte Verfahren erfordert keine Entnahme von Zellen aus dem Patienten. Die beschriebenen Verfahren können jedoch auch auf Zellen oder Gewebe oder Organe angewendet werden, die aus dem Körper entnommen und anschließend reimplantiert werden. Die Kombination aus DNA-Sequenzen ist so, daß sie, wenn sie exprimiert werden, die Produktion eines bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektorgenoms und die Produktion der Proteinbestandteile, die für die Verpackung des Genoms zur Herstellung retroviraler Vektorpartikel erforderlich sind, bestimmen. Die retroviralen Vektorpartikel werden freigesetzt, und durch das Verfahren der virusvermittelten Genauslieferung binden sie anschließend an zusätzliche Zellen und dringen in diese ein und liefern folglich das defekte retrovirale Genom in die Zelle, wo es von der partikelassoziierten reversen Transkriptase kopiert und in das Genom dieser Zellen integriert wird. Die Zelle, die ursprünglich die Kombination von DNA-Molekülen erhält, fährt damit fort, retrovirale Vektorpartikel so lange auszuscheiden, wie die Zelle überlebt oder die DNA fortbesteht. Dies erzeugt eine verlängerte Möglichkeit für die retroviralen Vektorpartikel, Zellen zu transduzieren. Die retroviralen Vektorpartikel enthalten ein therapeutisches Gen, das in den transduzierten Zellen exprimiert wird. Die Erfindung umfaßt daher die Etablierung einer Retrovirusvektor-Herstellerzelle in dem Zielgewebe durch die direkte Auslieferung geeigneter Kombinationen von DNA-Sequenzen.

Details

DNA wird an die Zellen mittels irgendeines geeigneten nicht-retroviralen Verfahrens ausgeliefert, einschließlich Injektion, biolistische Auslieferung und trägervermittelte Auslieferung. Einige der bekannten Verfahren wurden oben bereits beschrieben. Ein bevorzugtes Auslieferungsverfahren für die Auslieferung von DNA-Sequenzen an Zellen in vivo ist die liposomvermittelte Auslieferung. Unabhängig davon, welches Verfahren für die Auslieferung in vivo verwendet wird, müssen die DNA-Sequenzen in einer pharmazeutisch verträglichen Formulierung zur Verabreichung an den Patienten bereitgestellt werden. Mehrere verschiedene DNA-Sequenzen auf separaten Molekülen oder auf einem einzelnen Molekül, das mehrere verschiedene Sequenzen trägt, werden an menschliche/tierische Zellen ausgeliefert. Diese DNA-Sequenzen codieren die Bestandteile eines retroviralen Vektors, z. B. das HIT-System (Soneoka et al. 1995) und das kat-System (Finer et al. 1994). Die DNA-Sequenzen codieren ein retrovirales Env-Protein, ein retrovirales Gag-Pol-Protein und ein bezüglich Replikation defektes retrovirales Genom, das so konstruiert ist, daß es ein oder mehrere therapeutische Gene enthält. Zusätzliche Sequenzen können ebenfalls enthalten sein. Zum Beispiel kann auf einem oder allen Molekülen ein Selbstmordgen, wie HSV Tk, enthalten sein, um zu ermöglichen, daß transfizierte und transduzierte Zellen durch Behandlung mit Medikamenten, wie Acyclovir, zerstört werden (Plautz et al. 1991). Die Kombination von DNA-Sequenzen wird als das Vektorproduktionssystem (VPS) bezeichnet. Das VPS braucht nicht auf die drei Plasmidsysteme beschränkt zu sein, wie HIT und kat, sondern kann jedes retrovirale Vektorsystem umfassen. Bestandteile müssen nicht native retrovirale Bestandteile sein. Zum Beispiel kann das env-Gen so konstruiert sein, daß es ein Hüllprotein bestimmt, welches retrovirale Vektorpartikel auf einen spezifischen Zelltyp richtet, das Vektorgenom kann so konstruiert sein, daß es Genexpressionssignale enthält, die dem Vektor spezielle Eigenschaften verleihen, z. B. gewebespezifische Expression, regulierte Expression, und das gag-pol-Gen kann so konstruiert sein, daß es Infektion und Integration beeinflußt, z. B. zur Auslieferung von DNA in das Genom von sich nicht teilenden Zellen oder um DNA auf eine spezifische Stelle in dem Chromosom zu richten. Die Zelle, die das VPS erhält, wird als eine in situ retrovirale Fabrik (ISRF) bezeichnet, wobei es sich im wesentlichen um eine Retrovirusvektor- Herstellerzelle handelt, die aus einer der eigenen Zellen des Patienten erzeugt wurde. Wenn sie in vitro unter Verwendung von aus dem Patienten entnommenen Zellen erzeugt wird, muß die ISRF in einer pharmazeutisch verträglichen Formulierung zur Verabreichung an den Patienten bereitgestellt werden. Die ISRF produziert retrovirale Partikel, die von der Zelle so lange freigesetzt werden, wie das VPS fortbesteht, dies kann in der Größenordnung von Wochen bis Monaten oder ausnahmsweise Jahren liegen (Wolff et al. 1992). Die defekten retroviralen Partikel transduzieren Nachbarzellen, die als die Zielzellpopulation (TCP) bezeichnet werden und liefern das therapeutische Gen an solche Zellen als ein stabil integriertes Provirus aus. Die TCPs produzieren kein weiteres Virus. Die ISRF exprimiert auch das therapeutische Gen aus dem VPS. Diese Kombination aus nicht-viraler DNA-Auslieferung und virusvermittelter Genauslieferung, wie es beschrieben ist, erlaubt in sicherer Weise die Ausbreitung eines therapeutischen Gens innerhalb einer Population von Patientenzellen.
Die Erfindung hat eine Anzahl von Vorteilen, die sich auf die Erzeugung von ISRFs in Patientenzellen sowohl im Körper als auch in Geweben, die aus dem Körper entnommen wurden, beziehen.

Vorteile

i) Im Patienten

1. Erhöhte Effizienz der Auslieferung retroviraler Vektoren an Zielzellen im Patienten aufgrund der lokalen Konzentration von viralen Partikeln.
2. Erhöhte Effizienz der Auslieferung retroviraler Vektoren aufgrund des verlängerten Zeitraums der Exposition von Zellen an Viren. Dies bedeutet, daß Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus die Möglichkeit haben, in eine Phase des Zyklus einzutreten, die für eine retrovirale Infektion optimal ist. Diese Zellen wären als Ziele in einer Einzeldosisbehandlung mit retroviralen Partikeln nicht verfügbar.
3. Erzeugung einer ISRF erübrigt die Notwendigkeit, eine Herstellerzelle zu implantieren, die im Labor erzeugt wurde. Solche Herstellerzellen unterscheiden sich von Patientenzellen und können sogar von nicht menschlichem Ursprung sein. Diese Zellen werden von den meisten Implantationsorten im Körper schnell entfernt und besitzen daher begrenzte Brauchbarkeit.
4. Die Erzeugung von ISRFs erhöht dramatisch die Effizienz von nicht-viralen Gentherapieverfahren. Bei diesen Verfahren erfordert die transiente Natur der Expression häufige mehrfach wiederholte Behandlungen mit DNA. Die ISRF verbreitet therapeutische Gene an Zellen, die damit fortfahren werden, das Produkt über die Lebensdauer der Zelle zu produzieren. Die Behandlung muß daher, wenn überhaupt, für einige TCPs selten wiederholt werden.
5. Erzeugung einer ISRF erübrigt die Notwendigkeit, Patientengewebe chirurgisch zu entnehmen und sie vor der Reimplantation mit retroviralen Vektoren zu transduzieren. Dieses letztgenannte Verfahren erlaubt keine weitere Verbreitung des therapeutischen Gens auf andere Zellen. Es ist technisch komplex, und die Zellen müssen vor der Reimplantation einer erheblichen Manipulation in vitro ausgesetzt werden.
6. Wenn sie bei der Behandlung von Tumoren angewendet wird, erhöht die Erzeugung von ISRFs die Wahrscheinlichkeit, therapeutische Genexpression in dem Großteil der Tumorzellen zu erhalten, und erhöht daher die Wahrscheinlichkeit der Tumorentfernung.
7. Die ISRF-Technologie besitzt eine Vielzahl therapeutischer Anwendungen, z. B., jedoch nicht beschränkt auf:
i) Zystische Fibrose (CF): Das VPS wird in Lungengewebe eingeführt, z. B. durch liposomenvermittelte DNA-Auslieferung. Die infolgedessen etablierten ISRFs verbreiten das geeignete therapeutische Gen, z. B. CFTR (zystische Fibrose Transmembranleitfähigkeitsregu lator), innerhalb des pulmonaren Gewebes. Dies verleiht eine verlängerte Erleichterung von den Lungensymptomen der CF.
ii) Parkinson'sche Krankheit: Das VPS wird in Zellen im Gehirn durch biolistische Auslieferung über einen kleinen chirurgisch freigelegten Bereich eingeführt. Die infolgedessen etablierten ISRFs liefern einen retroviralen Vektor an spezifische Zellen, z. B. Gliazellen oder Astrozyten, zur Auslieferung der relevanten therapeutischen Gene, z. B. Tyrosinhydroxylase und Dopa-Decarboxylase.
iii) Alzheimer'sche Krankheit: Das VPS wird in Zellen im Gehirn eingeführt. Die infolgedessen etablierten ISRFs liefern das geeignete therapeutische Gen aus, z. B. Nervenwachstumsfaktor.
iv) Tumore: Das VPS wird an den Tumor ausgeliefert. Die infolgedessen etablierten ISRFs liefern einen retroviralen Vektor an umgebende Tumorzellen zur Auslieferung relevanter therapeutischer Gene, z. B. HSV-Thymidinkinase (Tk) oder fremde Histokompatibilitätsantigene.

ii) In Patientengeweben ex vivo

Die Vorteile i) 1-4 treffen auch auf ex vivo-Anwendungen von ISRFs zu.
1. Eine direkte Transduktion der Zellen eines Patienten ex vivo mit retroviralen Vektorpartikeln erfordert die Produktion von retroviralen Vektoren mit hohem Titer in großem Maßstab und ist häufig nicht sehr effizient, da längere Zellkultur und genetische Selektion von transduzierten Zellen erforderlich sind. Ein alternativer Ansatz ist die Cokultivierung von Patientenzellen mit einer Herstellerzellinie, die zuvor in vitro erzeugt wurde. Dies kann die Trennung der Zielzellen von der Herstellerzelle vor der Reimplantation von Patientenzellen erfordern. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Einführen eines therapeutisch aktiven Gens in eine Zielzelle, mit den Stufen, in denen man eine Zelle eines Patienten direkt in eine Herstellerzelle umwandelt. Die retroviralen Vektorpartikel werden dann aus der Herstellerzelle, die nun als eine ISRF bezeichnet wird, in andere Patientenzellen überführt, und das/die Organ/Gewebe/Zellen kann/können unter minimaler Manipulation reimplantiert werden. Die Herstellung von ISRFs erübrigt daher die Notwendigkeit für eine Cokultivierung mit Nicht-Patientenzellen oder die Behandlung von Zellen mit retroviralen Vektorpartikeln nach einem ex vivo-Verfahren der Gentherapie.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.

BEISPIELE (Nur zu Erläuterungszwecken)

Beispiel 1

Aufbau einer ISRF in einer Hela-Einzelzellage

Hela-Zellen werden in 60 cm Schalen ausgesät und bis 80% Konfluenz wachsen gelassen. Plasmid-DNA, die pHIT456, pHIT111 und pHIT60 umfaßt, wird für den Transfer in Hela-Zellen durch Standard-Calciumphosphatpräzipitation hergestellt und unter Verwendung des Verfahrens der verlängerten Überschichtung, wie es ausführlich in Soneoka et al. 1995 beschrieben ist, in Zellen eingeführt. pHIT456 enthält das amphotrope retrovirale Hüllgen, das eine Infektion von Hela-Zellen erlaubt, pHIT111 ist ein defektes retrovirales Genom, welches das lacZ-Gen enthält, und pHIT60 enthält das MLV gag-pol-Gen. Die Coexpression dieser Plasmide führt zur Herstellung von retroviralen Vektorpartikeln, die Zielzellen mit dem lacZ-Gen transduzieren können. Dies wird als Konfiguration A bezeichnet. Kurz gesagt werden 10 ug jedes Plasmids mit Calciumphosphat copräzipitiert, und das resultierende Präzipitat wird auf die Hela-Einzelzellage gegeben. Nach 24 Stunden wird das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Replikatschalen werden in Intervallen von 24 Stunden genommen und die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt, um die Expression von β-Galaktosidase festzustellen (Sanes et al. 1986). In einem Kontrollexperiment werden 10 ug des Plasmids pKV469 anstelle des retroviralen Vektorplasmids pHIT111 verwendet. pKV469 ist ein einfacher Expressionsvektor für eukaryontische Zellen, der das lacZ-Gen über den CMV-IE-Promotor exprimiert. In dieser Drei-Plasmid-Konfiguration werden keine retroviralen Vektorpartikel hergestellt. Dies wird als Konfiguration B bezeichnet.
Zellen, die β-Galaktosidase exprimieren, werden mit X-Gal blau gefärbt. Nach 24 Stunden wird β-Galaktosidase in beiden Konfigurationen von dem Vektorplasmid pHIT111 und von pKV469 exprimiert. Wenn die Zellen gezählt werden, beobachtet man in jeder Konfiguration eine ähnliche Anzahl. Nach 48 Stunden gibt es in beiden Fällen eine Zunahme der Anzahl blauer Zellen. Bei Konfiguration B ist dies auf Zellteilung zurückzuführen, und man beobachtet benachbarte Paare (Dubletten) blauer Zellen. Bei Konfiguration A findet ebenfalls ein Anstieg der Anzahl von Zellen statt, aber diese umfaßt sowohl eine Zunahme an Dublettenzellen als auch eine Zunahme an Einzelzellen und auch das Auftreten von Foci blauer Zellen. Die Foci umfassen mehr als zwei Zellen, was nicht aus einem Gentransfer durch Zellteilung herrühren kann. Die Foci erscheinen, weil Virus, das aus den ursprünglichen Zellen freigesetzt wurde, benachbarte Zellen infiziert hat. Die Zunahme von blauen Zellen in Konfiguration A ist nach 48 Stunden deutlicher, wobei multizelluläre Foci und erhöhte Anzahlen an Einzelzellen erscheinen. Dieses Muster der Färbung ist für eine oder mehrere Runden retroviraler Transduktion, die nach der anfänglichen Transfektion der DNA in die Hela-Zellen auftritt, bezeichnend. Bei Konfiguration A etablieren sich ISRFs in der Hela-Einzelzellage und das lacZ-Gen wird in der Zielzellpopulation verteilt. Bei Konfiguration B ist die β-Galaktosidase-Expression auf die anfänglich transfizierten Zellen und einige ihrer Nachkommen beschränkt. Dieses Experiment ver deutlicht, daß in einer einfachen homogenen Zellpopulation ohne die Zugabe frischer Zellen, wie es in einem Standard-Cokultivierungsexperiment der Fall wäre, wiederholte retrovirale Transduktion auftreten kann.

Beispiel 2

Verteilung des lacZ-Gens innerhalb der pulmonaren Gewebe von Mäusen

Die Plasmidsätze der Konfiguration A und Konfiguration B, wie sie oben beschrieben sind, werden mit kationischen Liposomen DOTAP oder DOTMA/DOPE komplexiert, wie es in Alton et al. 1993 beschrieben ist, wobei 10 bis 50 ug pro Plasmid verwendet werden. Liposome, die DNA enthalten, werden in die Lungen der Edinburgh CF-transgenen Maus (Dorin et al. 1992) unter Verwendung eines Düsenzerstäubers (Alton et al. 1993) eingeführt. Die Mäuse werden nach zwei Tagen getötet und Epithelzellen durch Lungenwaschung geerntet. Dies wird für Replikatmäuse nach 4 und 14 Tagen wiederholt. Von 14-Tages-Lungen werden Schnitte hergestellt, und die Schnitte werden auf das Vorhandensein von β-Galaktosidase im Lungengewebe gefärbt. Bei Konfiguration A nimmt die Anzahl blauer Zellen mit einem erheblich größeren Ausmaß zu als bei Konfiguration B, und in histologischen Schnitten sieht man Foci blauer Zellen bei Konfiguration A, aber nicht bei Konfiguration B. Eine ISRF wurde mit Konfiguration A etabliert, und das lacZ-Gen ist über das Lungengewebe verteilt.

Beispiel 3

Verteilung des lacZ-Gens innerhalb der Leber von Mäusen

Mäuse werden partieller Hepatektomie unterzogen. Plasmide in den Konfigurationen A und B werden mittels Calciumphosphat in Gegenwart von 1 um Goldpartikeln präzipitiert. Die Goldpartikel werden Zellen unter Verwendung einer biolistischen Auslieferungsvorrichtung verabreicht. Nach 2, 4 und 14 Tagen werden Tiere getötet und Leberschnitte mit X-Gal gefärbt. Foci und verstreute blaue Zellen sieht man in der Leber nur bei Konfiguration A.

Beispiel 4

Verteilung des lacZ-Gens innerhalb des Darms von Mäusen

Plasmide in den Konfigurationen A und B werden mit kationischen Liposomen komplexiert, und diese werden durch Einflößen an den Darm ausgeliefert. Nach 2, 4 und 6 Tagen werden Tiere getötet und histologische Schnitte des Darms mit X-Gal gefärbt. Foci und verstreute blaue Zellen sieht man im Darmepithel.

Beispiel 5

Verteilung des lacZ-Gens in den Gehirnen von Mäusen

Plasmide in den Konfigurationen A und B werden in die Gehirne von Mäusen durch ein chirurgisches Fenster im Schädel eingeführt. DNA wird mittels einer biolistischen Vorrichtung ausgeliefert. Die Mäuse werden nach 4 Tagen und 4 Wochen getötet. Foci und verstreute blaue Zellen sieht man nur bei Konfiguration A.

Beispiel 6

ISRF unter Verwendung humaner HT1080-Zellen in Kultur:

Drei-Plasmid-Cotransfektionen wurden durch Calciumphosphatpräzipitation durchgeführt, wie es in Soneoka et al. (1995) beschrieben ist. Plasmid pHIT60 (MuLV gag-pol- Expressionsplasmid), pHIT456 (amphotropes env-Expressionsplasmid) und pHIT111 (provirales DNA-Konstrukt, welches das lacZ-Gen enthält) wurden in doppelten Sätzen von fünf 10 cm Schalen in HT1080-Zellen cotransfiziert. Im ersten Abschnitt wurden diese Zellen für fünf Tage gehalten. Jeden Tag wurde eine Schale aus einem Satz fixiert und mit X-Gal gefärbt, und eine Schale aus dem anderen Satz wurde geerntet und lysiert, um β-Galaktosidase-Aktivität mittels eines kolorimetrischen Tests zu messen. Als eine Negativkontrolle wurden HT1080-Zellen mit pHIT60, pHIT123 (ecotropes env Expressionsplasmid) und pHIT111 transfiziert, und die gleichen Tests wurden durchgeführt, wie für die amphotropen Hersteller, wie es oben beschrieben ist. Ein weiterer Satz von fünf 10 cm Schalen wurde scheintransfiziert, und jeden Tag wurde eine Schale geerntet, um das Zellwachstum durch Zählen der Anzahl von Zellen unter Verwendung eines Hemacytometers aufzuzeichnen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 präsentiert. Die amphotropen, virusproduzierenden HT1080-Zellen zeigten eine Zunahme der lacZ exprimierenden Zellen und der β-Galaktosidase- Aktivität nach einem Tag, und die Niveaus wurden danach bis zum Tag 5 beibehalten. Die Zunahme sowohl lacZ exprimierender Zellen als auch von β-Galaktosidase-Aktivität konnte nicht alleine der Zunahme der Zellzahl zugeschrieben werden, da es nach Tag 2 kein signifikantes Zellwachstum gab und da die ecotropen virusproduzierenden HT1080-Zellen eine Abnahme der Anzahl lacZ exprimierender Zellen zeigten (Tabelle 1). In diesen Experimenten wurde kein Polybren dazu verwendet, die Virustransduktion zu erhöhen, und die ohne die Verwendung von Polybren zu dem Standardzeitpunkt von 48 Stunden nach der Transfektion (Tag 1) erhaltenen Titer waren relativ gering, etwa 103 LFU/ml bei NIH 3T3-Zellen sowohl für ecotrope als auch amphotrope Viren und auch bei HT1080- Zellen mit dem amphotropen Virus. Daher kann geschlußfolgert werden, daß in einer 10 cm Schale, die 5 ml Medium enthält, bis zu 5 · 10³ transduzierbare Partikel in Suspension waren, die sich auf umgebende HT1080-Zellen ausbreiten konnten.
Das Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurden die Zellen für 14 Tage gehalten. Die transfizierten Zellen wurden an den Tagen 5 und 10 mit einem Verhältnis von 1 : 5 passagiert. Man beobachtete wiederum ein ähnliches Phänomen mit amphotropen virusproduzierenden HT1080-Zellen dahingehend, daß β-Galaktosidase-Aktivität der Zellen nach Tag 1 zunahm und danach beibehalten wurde (Tabelle 2). Ein signifikanter Anstieg der Aktivität wurde am Tag 12 beobachtet (Tabelle 2). Diese Zunahme war höchstwahrscheinlich eher auf eine Proliferation von Zellen, die das lacZ-Gen enthielten, zurückzuführen als auf die Ausbreitung von retroviralen Vektoren, da in diesem Stadium kein infektiöses Virus produziert wurde (Tabelle 2). β-Galaktosidase-Aktivität von ecotropen virusproduzierenden HT1080-Zellen blieb fast auf dem Niveau der Grundlinie über die 14 Tage, was nahelegt, daß das durch das amphotrope Virus transduzierte lacZ-Gen erhalten blieb und stabil exprimiert wurde.
Es schien kein signifikantes Zellwachstum während des Verlaufs irgendeines Experiments stattzufinden, ausgenommen nur nach dem ersten Tag und wahrscheinlich nach der Passage der Zellen an den Tagen 5 und 10 in dem zweiten Experiment (Tabellen 1 und 2). Die Zellen wurden bei etwa 80% Konfluenz transfiziert, da aufgrund der Calciumphosphattransfektion eine gewisse Toxizität aufzutreten scheint. Gewinnung der Zellen aus der Transfektion kann das Wachstum der Zellen zwischen den Tagen 1 und 2 erklären. Am Tag 2 näherten sich die Zellen der Konfluenz und somit dem Fehlen eines nachweisbaren Zellwachstums. Obwohl es die Natur von MuLV erfordert, daß sich die Zellen in einem sich aktiv teilenden Zustand befinden, damit Infektion stattfindet, legen es die niedrigen Virustiter, die von Tag 3 an produziert wurden (Tabelle 2) nahe, daß das Wachstum der Zellen nach Tag 2 insignifikant war.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß es möglich ist, in situ retrovirale Fabriken als wirksames Mittel zur Verbreitung brauchbarer retroviraler Vektoren in einer Zellpopulation einzusetzen. Tabelle 1 Ausbreitung von retroviralem Vektor in HT1080 retroviralen Herstellerzellen, gehalten für fünf Tage Tabelle 2 Ausbreitung von retroviralem Vektor in HT1080 retroviralen Herstellerzellen, gehalten für 14 Tage

LITERATUR

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Yang, N. S. et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 9568

Claims

1. Verwendung eines Satzes von DNA-Sequenzen mit

einer ersten DNA-Sequenz, welche einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor codiert, der

(a) ein defektes retrovirales Genom, dem funktionsfähige env- und funktionsfähige gag-pol-Gene fehlen, der jedoch die übrigen Komponenten hat, die für eine retrovirale Funktion wichtig sind, und

(b) ein therapeutisch aktives Gen

enthält, und

einer zweiten DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Verpackungskomponenten env und gag-pol zu codieren, wobei die DNA-Sequenz, die env codiert, auf einem von der DNA- Sequenz, die gag-pol codiert, getrennten Konstrukt vorhanden ist,

zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in einem Verfahren zum Einführen des therapeutisch aktiven Gens in eine Zielzelle in einem Patienten, welches die folgenden Stufen umfaßt:

(i) Einführen des Satzes von DNA-Sequenzen in eine aus dem Patienten isolierte Zelle, welche dabei in eine Herstellerzelle umgewandelt wird, die in der Lage ist, einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor herzustellen,

(ii) Reimplantieren der Herstellerzelle in den Patienten, wobei bezüglich Replikation defekte retrovirale Vektorpartikel in vivo hergestellt werden und das therapeutisch aktive Gen in vivo an die Zielzelle ausgeliefert wird.

2. Verwendung eines Satzes von DNA-Sequenzen mit

(b) ein therapeutisch aktives Gen

enthält, und

zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in einem Verfahren zum Einführen des therapeutisch aktiven Gens in eine Zielzelle in einem Patienten, welches die folgende Stufe umfaßt:

Einführen des Satzes von DNA-Sequenzen in eine Patientenzelle durch in vivo- Auslieferung, wobei die Patientenzelle in vivo in eine Herstellerzelle umgewandelt wird, welche in der Lage ist, bezüglich Replikation defekte retrovirale Vektorpartikel herzustellen, wobei das therapeutisch aktive Gen in vivo an die Zielzelle ausgeliefert wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Herstellerzelle in dem Verfahren vom gleichen Typ ist wie die Zielzelle.

4. Herstellerzelle, die in der Lage ist, einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor in einem infektiösen retroviralen Partikel herzustellen, wobei die Herstellerzelle einen Satz von DNA-Sequenzen enthält mit

einer ersten DNA-Sequenz, die einen bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektor codiert, welcher

(i) ein defektes retrovirales Genom, dem funktionsfähige env- und funktionsfähige gag-pol-Gene fehlen, der jedoch die übrigen Komponenten hat, die für eine retrovirale Funktion wichtig sind, und

(ii) wenigstens ein therapeutisch aktives Gen

enthält, und

wobei die Herstellerzelle eine aus einem Patienten isolierte frische Zelle ist, die, wenn sie in den Patienten reimplantiert wird, in der Lage ist, das therapeutisch aktive Gen an eine Zielzelle in dem Patienten durch in vivo-Herstellung von bezüglich Replikation defekten retroviralen Vektorpartikeln auszuliefern.

5. Herstellerzelle nach Anspruch 4, welche eine Immunzelle ist.