DE60315925T2

DE60315925T2 - Verfahren zur Herstellung einer Zielsubstanz durch Fermentation mittels eines bakteriellen Stamms, dem das ArcA-Gen fehlt

Info

Publication number: DE60315925T2
Application number: DE60315925T
Authority: DE
Inventors: Yukiko Kawasaki-shi Ishikawa; Akira Kawasaki-shi Imaizumi; Kazuhiko Kawasaki-shi Matsui; Hiroyuki Kawasaki-shi Kojima
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2023-07-12
Also published as: US20040180404A1; BRPI0302172B1; DE60315925D1; US7090998B2; TWI316957B; KR101178437B1; TW200500462A; ATE371743T1; CN1492038B; BR0302172A; PL361216A1; EP1382686B1; RU2003121547A; CN1492038A; ES2291568T3; AU2003205041A1; EP1382686A1; KR20040007337A; PE20040651A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in der Fermentationsindustrie eingesetztes Verfahren, genauer gesagt ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer Zielsubstanz, wie einer L-Aminosäure durch Fermentation unter Verwendung eines Mikroorganismus.
Beschreibung des Standes der Technik
Bakterielle Zellen modifizieren ihre metabolischen Wege, Atmungswege und dergleichen, um sich an verschiedene Umweltbedingungen anzupassen. Im Energiemetabolismus sind Arc (aerobic respiration control, Kontrolle der Sauerstoffatmung) und Fnr (fumarate nitrate reduction, Fumaratnitratreduktion) als Kontrollsysteme bekannt, die wichtige Rollen spielen. Sie bestehen aus globalen Regulatorproteinen und sind in E. coli und anderen analogen Arten universell vorhanden. Das erstgenannte Kontrollsystem wird von dem arcA-Gen codiert, das an der Position von 0 Minuten des E. coli-Chromosoms vorhanden ist, das zweitgenannte System wird von dem Fnr-Gen codiert, das an der Position von 29 Minuten des E. coli-Chromosoms vorhanden ist, und beide passen die Zelle an die Umgebung an, indem viele Faktoren unter anaeroben Bedingungen kontrolliert werden. Es wurde überdies herausgefunden, daß das ArcA-Protein und das Fnr-Protein Transcriptionsfaktoren sind, und sie kontrollieren die Expression eines Zielgens auf dem E. coli-Chromosom positiv und negativ unter anaeroben Bedingungen, indem sie direkt an eine Promotorregion des Zielgens binden (S. Iuchi et al., Cell, 66, 5-7 (1991)).
In letzter Zeit wurden Expressionsprofile von Stämmen, worin Gene, die für globale Regulatoren codieren, wie für das ArcA-Protein und das Fnr-Protein, und von E. coli abgeleitet sind, unterbrochen sind, in einer Datenbank gesammelt, indem DNA-Microarray-Techniken angewandt wurden, und wurden der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt
(http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get htext?Exp DB+-n+Bget-bin/get htext?Exp DB+-n+B).
Bislang ist bekannt, daß das ArcA-Protein die Expression der Gene für den Tricarbonsäurecyclus negativ kontrolliert (S. Iuchi et al., Cell, 66, 5-7 (1991)), und die Expression der Gene für den Tricarbonsäurecyclus ist in dem ArcA-gestörten Stamm in der Datenbank erhöht. Andererseits ist bekannt, daß das Fnr-Protein die Genexpression für den Atmungsweg, der unter anaeroben Bedingungen funktioniert, positiv kontrolliert.
Was die Expressionsprofile in den Stämmen, worin ein globaler Faktor unterbrochen ist, betrifft, kann der dam-gestörte Stamm als ein Stamm genannt werden, worin die Genexpression für TCA wie in dem arcA-gestörten Stamm erhöht ist (H. Mori, Nara Institute of Science and Technology, mündlicher Vortrag bei dem Symposium "Green Biotechnology of Genome Age", 2001, organisiert von der Japan Bioindustry Association, Resource Biotransformation Study Group).
Das Dam-Protein ist eine Methylase für die Modifikation von Faktoren, die an intrazellulären Restriktionsmodifikationssystemen beteiligt sind, und wird von dem dam-Gen codiert, das an der Position von 60 Minuten des E. coli-Chromosoms vorhanden sind (Proc. Natl. Arcad. Sci. U.S.A., 87 (23), 9454-9458 (1990)).
Es gibt bislang keine Berichte über die Verbesserung der Substanzproduktion durch Expressionskontrolle der globalen Faktoren, wie der Gene arcA, fnr und dam.
Cotter P. A. et al. (Fetus Microbiology Letters, Vol. 91, Nr. 1, 1992, S. 31-36, XP008024029 ISSN:0378-1097) zeigt E. coli-Stämme, worin das arcA-Gen durch eine Kanamycinresistenzkassette unterbrochen worden ist.
Iuchi S. et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, Vol. 85, Nr. 6, 1988, S. 1888-1892, XP008024028 1988, ISSN:0027-8424) stellt E. coli-Stämme bereit, die eine Deletion in einer chromosomalen Region tragen, welche das arcA-Gen enthält (auch als dye-Gen bekannt).
Nystrom Thomas et al. (Embo J. vol. 15, Nr. 13, 1996, S. 3219-3228, XP008024026 ISSN:0261-4189) offenbart einen E. coli-Stamm, worin der ArcA-Locus durch die Sequenz von Tn10 unterbrochen worden ist (vergl. S. 3226, linke Spalte, zweiter ganzer Absatz).
WO0102544 (Derwent WPI Abstract 2001-138133) offenbart Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure aus Corynebakterien durch Erhöhen der Aktivität von Succinatdehydrogenase in den genannten Zellen.
WO0102546 (Derwent WPO Abstract 2001-138135) offenbart Verfahren zur Produktion von L-Lysin aus Corynebakterien durch Erhöhen der Aktivität von Malatdehydrogenase in den genannten Zellen.
Beschreibung der Erfindung
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die Produktionseffizienz bei der Produktion einer nützlichen Substanz durch Fermentation unter Verwendung von γ-Proteobacterium, wie Escherichia-Bakterien, zu verbessern.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um das vorstehend genannte Ziel zu erreichen, und sie haben gefunden, daß die Produktion einer Substanz durch ein γ-Proteobacterium durch Modifizieren eines Gens, das für ein Regulatorprotein codiert, das universell in γ-Proteobakterien vorkommt, verbessert werden kann. Das heißt, sie haben gefunden, daß die Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz durch Unterbrechen des arcA-Gens in einem γ-Proteobacteriurn verbessert werden kann, und sie haben auf diese Weise die vorliegende Erfindung gemacht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit.

(1) Ein Verfahren zum Herstellen einer Zielsubstanz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, L-Arginin, L-Homoserin und Bernsteinsäure besteht, welches das Kultivieren eines γ-Proteobacteriums in einem Medium unter aeroben Bedingungen unter Produktion und Anhäufung der Zielsubstanz in dem Medium oder den Zellen und das Gewinnen der Zielsubstanz aus dem Medium oder den Zellen umfaßt, wobei das γ-Proteobacterium mit der Fähigkeit zur Produktion der Zielsubstanz so modifiziert ist, daß die Produktion des ArcA-Proteins verringert oder ausgeschaltet ist, und wobei das ArcA-Protein (A) oder (B) ist:
(A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 32;
(B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 32, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von 1 bis 20 Aminosäuren, wobei die Fähigkeit des Proteobacteriums zur Herstellung der Zielsubstanz verbessert ist, wenn die Herstellung des Proteins in dem γ-Proteobacterium im Vergleich zu einem Wildtypstamm oder einem nicht modifizierten Stamm verringert oder ausgeschaltet ist.
(2) Das Verfahren nach dem vorstehenden Punkt (1), wobei das in (B) definierte ArcA-Protein eine Homologie von 90% oder höherer zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 32 aufweist und die Fähigkeit des γ-Proteobacterium zur Herstellung der Zielsubstanz verbessert ist, wenn die Produktion des Proteins in dem γ-Proteobacterium im Vergleich zu einem Wildtypstamm oder einem unmodifizierten Stamm verringert oder ausgeschaltet ist.
(3) Das Verfahren nach den vorstehenden Punkten 1 oder 2, wobei die Produktion des ArcA-Proteins durch Störung eines arcA-Gens auf einem Chromosom verringert oder ausgeschaltet ist und das arcA-Gen eine in (a) oder (b) definierte DNA ist:
(a) DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 101 bis 817 der SEQ ID Nr. 31 enthält;
(b) DNA, die mit der Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 101 bis 817 der SEQ ID Nr. 31 oder mit einer Sonde, die aus der Nucleotidsequenz unter stringenter Bedingung hergestellt werden kann, hybridisierbar ist und für ein Protein kodiert, das die Fähigkeit von γ-Proteobacterium zur Herstellung der Zielsubstanz verbessert, wenn die Produktion des Proteins im Vergleich zu einem Wildtypstamm oder unmodifizierten Stamm verringert oder ausgeschaltet ist, wobei die stringente Bedingung 1 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C ist.
(4) Das Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte 1 bis 3, wobei das γ-Proteobacterium ein Bacterium der Gattung Escherichia oder Pantoea ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann, wenn eine nützliche Substanz, wie eine L-Aminosäure, unter Verwendung eines γ-Proteobacteriums produziert wird, die Produktionseffizienz verbessert werden.
Kurze Erklärung der Zeichnung
1 zeigt die Anhäufungsmuster in WC196, WC196ΔarcA, WC196Δdam und WC196Δfnr.
Eingehende Erklärung der Erfindung
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehend erklärt.
(1) Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte γ-Proteobacterium
Das für die vorliegende Erfindung eingesetzte γ-Proteobacterium ist nicht besonders eingeschränkt, solange es ein Mikroorganismus ist, der zu γ-Proteobacterien gehört, wie die Gattung Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella oder Morganella, und die Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz hat. Genauer gesagt können solche eingesetzt werden, die gemäß der Taxonomie, die in der NCBI (National Center for Biotechnology Information)-Datenbank angewandt wird (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode =1&unlock), in die Kategorie γ-Proteobakterien klassifiziert werden.
Beispiele des Bacteriums der Gattung Escherichia umfassen E. coli und dergleichen. Beispiele der Gattung Entero bacter umfassen Enterobacter agglomerans und Enterobacter aerogenes.
Es gibt einige Arten von Enterobacter agglomerans, die kürzlich in Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis oder Pantoea stewartii agglomerans auf der Grundlage der Nucleotidsequenzanalyse der 16S rRNA usw. umklassifiziert worden sind. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Bakterien entweder zu der Gattung Enterobacter oder Pantoea gehören, solange sie in die Kategorie γ-Proteobakterien klassifiziert werden und das arcA-Gen aufweisen.
Wenn E. coli unter Verwendung von Genkonstruktionsverfahren gezüchtet wird, können der Stamm E. coli K12 und Derivate davon eingesetzt werden. Wenn Pantoea ananatis unter Einsatz von Genkonstruktionsverfahren gezüchtet wird, können die Pantoea ananatis-Stämme AJ13355 (FERN BP-6614), AJ13356 (FERN BP-6615) und AJ13601 (FERN BP-7207) und Derivate davon eingesetzt werden. Obwohl die vorstehend beschriebenen Stämme als Enterobacter agglomerans identifiziert wurden, wenn sie isoliert wurden, wurden diese Stämme in Pantoea ananatis auf der Grundlage der Nucleotidsequenzanalyse der 16S rRNA usw., wie vorstehend beschrieben, umklassifiziert.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte γ-Proteobacterium ist ein beliebiges der vorstehend beschriebenen Bakterien und ist ein Bacterium mit der Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz. Die "Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz" bedeutet die Fähigkeit, die Zielsubstanz in Zellen oder einem Medium in einem solchen Maß herzustellen und anzuhäufen, daß, wenn das Bacterium der vorliegenden Erfindung in dem Medium kultiviert wird, die Zielsubstanz aus den Zellen oder dem Medium gewonnen werden kann.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielsubstanz ist L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, L-Arginin, L-Homoserin oder Bernsteinsäure.
Als L-Lysin produzierende γ-Proteobakterien können Mutanten mit einer Resistenz gegenüber einem L-Lysin-Analogon, beispielhaft genannt werden. Dieses L-Lysin-Analogon ist eine Substanz, die das Wachstum eines L-Aminsäure produzierenden Stammes hemmt, diese Inhibition wird jedoch vollständig oder teilweise aufgehoben, wenn L-Lysin in einem Medium gleichzeitig vorhanden ist. Beispiele des L-Lysin-Analogons umfassen Oxalysin, Lysinhydroxamat, S-(2-Aminoethyhl)-L-cystein (AEC), γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam und dergleichen. Mutanten mit einer Resistenz gegenüber diesen Lysinanaloga können erhalten werden, indem γ-Proteobakterien einer herkömmlichen künstlichen Mutagenesebehandlung unterworfen werden. Spezifische Beispiele des Bakterienstammes, der für die Produktion von L-Lysin eingesetzt wird, umfassen E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; vergl. die offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 56-18596 und das U.S. Patent Nr. 4,346,170 ) und E. coli VL611. In diesen Mikroorganismen ist die Rückkopplungshemmung der Aspartokinase durch L-Lysin ausgehoben.
Zudem können beispielsweise die nachstehend beschriebenen L-Threonin-produzierenden Bakterien genannt werden, weil die Inhibition der Aspartokinase durch L-Lysin im allgemeinen in L-Threonin-produzierenden Bakterien eliminiert ist.
In den später beschriebenen Beispielen wurde der Stamm WC196 als L-Lysin-produzierendes Bacterium von E. coli eingesetzt. Dieser bakterielle Stamm wurde durch Übertragen einer AEC-Resistenz auf den Stamm W3110, abgeleitet von E. coli K-12, gezüchtet. Dieser Stamm wurde E. coli AJ13069 genannt und wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit die unabhängige Verwaltungseinheit International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, PLZ: 305-8566, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 6. Dezember 1994 unter der Hinterlegungsnummer FERN P-14690 hinterlegt. Dann wurde die Hinterlegung am 29. September 1995 gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERN BP-5252 (vergl. die internationale Veröffentlichung WO96/17930).
Beispiele von L-Threonin-produzierenden γ-Proteobakterien umfassen E. coli VKPM B-3996 (RIA 1867, vergl. U.S. Patent Nr. 5,175,107 ) und den Stamm MG442 (vrgl. Gusyatiner et al., Genetika (auf Russisch), 14, S. 947-956, 1978).
Beispiele des Mikroorganismus, der zu γ-Proteobakterien gehört und die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure hat, umfassen Mikroorganismen, denen die α-Ketoglutaratdehydrogenaseaktivität fehlt oder die eine reduzierte α-Ketoglutaratdehydrogenaseaktivität haben. Bakterien der Gattung Escherichia, denen die α-Ketoglutaratdehydrogenaseaktivität fehlt oder die eine verminderte α-Ketoglutaratdehydrogenaseaktivität aufweisen, und Verfahren zur Herstellung dieser Bakterien in den offengelegten japanischen Patentanmeldungen (Kokai) Nr. 5-244970 und 7-203980 beschrieben. Genauer gesagt können die folgenden Stämme genannt werden.
E. coli W3110sucA::Km^r
E. coli AJ12624 (FERN BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERN BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERN BP-4881)
E. coli W3110sucA::Km^r ist ein Stamm, der durch Unterbrechen des α-Ketoglutaratdehydrogenasegens (im folgenden als "sucA-Gen" bezeichnet) von E. coli W3110 erhalten wird und dem die α-Ketoglutaratdehydrogenase vollständig fehlt.
Mikroorganismen, die zu γ-Proteobakterien gehören, und denen die α-Ketoglutaratdehydrogenaseaktivität fehlt oder die eine verminderte α-Ketoglutaratdehydrogenaseaktivität aufweisen und Verfahren zur Herstellung dieser Mikroorganismen, sind in den offengelegten japanischen Patentanmeldungen (Kokai) Nr. 5-244970 und 7-203980 beschrieben.
Beispiele von L-Arginin-produzierenden γ-Proteobakterien umfassen E. coli, worin das argA-Gen eingeführt worden ist (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 57-5693 ) und E. coli-Stamm 237 (Russisches Patent Nr. 200117677 ) oder dergleichen.
Beispiele von L-Isoleucin-produzierenden γ-Proteobakterien umfassen E. coli KX141 (VKPM B-4781, vergl. die europäische Patentveröffentlichung Nr. 519, 113).
Beispiele von L-Homoserin-produzierenden Bakterien umfassen den Stamm NZ10, welcher eine Leu⁺-Revertante des Stammes C600 ist (vergl. Appleyard R.K., Genetics, 29, S. 440-442, 1954).
Als Bernsteinsäure-produzierende γ-Bakterien sind Beispiele unter Einsatz von E. coli bekannt (Wang, X., et al., Appl. Biochem. Biotech., 70-72, 919-928 (1998)).
Bakterien der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure können auch durch Einführen einer DNA mit einer genetischen Information, die an der Biosynthese von L-Aminosäuren beteiligt ist, und durch Verstärken der Fähigkeit unter Einsatz einer Genrekombinationstechnik gezüchtet werden. Was L-Lysin-produzierende Bakterien betrifft, umfassen Beispiele von Genen, die eingeführt werden können, Gene, die für Enzyme des Biosyntheseweges von L-Lysin codieren, wie Phosphenolpyruvatcarboxylase, Aspartokinase, Dihydrodipicolinatsynthetase, Dihydrodipicolinatreduktase, Succinyldiaminopimelattransaminase und Succinyldiaminopimelatdeacylase. Im Fall eines Gens eines Enzyms, das einer Rückkopplungshemmung durch L-Asparaginsäure oder L-Lysin unterliegt, beispielsweise Phosphoenolpyruvatcarboxylase oder Aspartokinase und Dihydrodipicolinatsynthetase, ist es wünschenswert, ein mutiertes Gen einzusetzen, das für ein Enzym codiert, worin eine solche Inhibition eliminiert ist.
Was L-Glutaminsäure-produzierende Bakterien betrifft, umfassen Beispiele von Genen, die eingeführt werden können, Gene von Glutamatdehydrogenase, Glutaminsynthetase, Glutamatsynthase, Isocitratdehydogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatkinase, Phosphoenolpyruvatsynthase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehdrogenase, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase, Phosphofructokinase und Glucosephosphatisomerase.
Außerdem kann die Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion zur Herstellung einer anderen Verbindung als der Zielaminosäure katalysiert, indem von dem Biosyntheseweg der L-Aminosäure abgezweigt wird, verringert oder ausgeschaltet werden. Beispiele eines solchen Enzyms, das eine Reaktion zur Herstellung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg von L-Lysin katalysiert, umfassen Homoserindehyrogenase (vergl. die internationale Patentveröffentlichung WO95/23864 ). Außerdem umfassen Beispiele eines Enzyms, das eine Reaktion für die Herstellung einer anderen Verbindung als L-Glutaminsäure durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure katalysiert, α-Ketoglutatratdehydrogenase, Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroxysäuresynthase, Acetolactatsynthase, Formatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, Glutamatdecarboxylase und L-Pyrophosphatdehydrogenase.
Beim Züchten von γ-Proteobakterien mit der vorstehend beschriebenen Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz kann zur Einführung eines Gens in γ-Proteobakterien zur Verstärkung dieser Fähigkeit ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem ein Vektor, der in einer Zelle von γ-Proteobacterium autonom replizierbar ist, an das Gen ligiert werden, wobei eine rekombinante DNA erhalten wird, und ein γ-Proteobacterium kann damit transformiert werden. Zudem ist es auch möglich, ein Zielgen in ein Wirtschromosom durch ein Verfahren einzuverleiben, welches Transduktion, Transposon (Berg, D.E., and Berg C.M., Bio/Technol. 1, S. 417, 1983), den Phagen Mu (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 2-109985 ) oder homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972) verwendet. Außerdem kann das Zielgen auch durch ein Verfahren eingeführt werden, bei dem ein Gen unter Verwendung einer durch PCR hergestellten linearen DNA unterbrochen wird (Kirill A., Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (12), 6640-6645 (2000)).
Beispiele der γ-Proteobakterien, die durch die vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA-Techniken gezüchtet werden, umfassen beispielsweise Bakterien der Gattung Escherichia mit verstärkten Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase mit einer Mutation, welche die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, Aspartokinase und Dihydrodipicolinatreduktase, deren Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausgeschaltet ist, und welche die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin haben ( U.S. Patent Nr. 6,040,160 ), und ein Bacterium der Gattung Enterobacter (der Gattung Pantoea) mit verstärkter Aktivität von Citratsynthase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase oder Glutamatdehydrogenase und mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsärue ( EP 0 952 221 A2 , EP 0 999 282 A2 , EP 1 078 989 A2 ).
Das für die vorliegende Erfindung eingesetzte γ-Proteobacterium ist ein Bacterium mit der Fähigkeit zur Produktion der vorstehend beschriebenen Zielsubstanz, das so modifiziert ist, daß das ArcA-Protein in einer Zelle nicht normal funktioniert. Der Ausdruck "modifiziert, so daß das ArcA-Protein in einer Zelle nicht normal funktioniert," bedeutet, daß das Protein so modifiziert worden ist, daß die Funktion des ArcA-Proteins vollständig ausgeschaltet ist, oder daß die Funktion im Vergleich zu einem nicht-modifizierten Stamm eines Escherichia-Bacteriums, beispielsweise ein Wildtypstamm, vermindert sein sollte. Der Zustand, bei dem das ArcA-Protein nicht normal funktioniert, kann beispielsweise ein Zustand sein, bei dem die Transkription oder die Translation des arcA-Gens inhibiert ist, so daß das Genprodukt, nämlich das ArcA-Protein, nicht produziert oder in vermindertem Maß produziert wird, oder ein Zustand, bei dem das produzierte ArcA-Protein mutiert ist, so daß die normale Funktion des ArcA-Proteins verringert oder ausgeschaltet ist. Beispiele der γ-Proteobakterien, in denen das ArcA-Protein nicht normal funktioniert, umfassen typischerweise einen Gen-unterbrochenen Stamm, worin das arcA-Gen auf dem Chromosom durch ein genetisches Rekombinationsverfahren unterbrochen ist, und einen mutierten Stamm, worin eine Expressionsregulationssequenz oder eine codierende Region des arcA-Gens auf dem Chromosom mutiert ist und deshalb ein funktionelles ArcA-Protein nicht länger produziert wird.
Beispiele des ArcA-Proteins, das in einem Wildtypstamm oder einem nicht-modifizierten Stamm, der zum Züchten des in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Bacteriums verwendet wird, enthalten ist, umfassen ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 32. Außerdem umfassen Beispiele des arcA-Gens eine DNA mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 31. Überdies kann das Gen die Sequenz aufweisen, worin ein beliebiges Codon durch ein anderes, äquivalentes Codon ausgetauscht worden ist. In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "DNA, die für ein Protein codiert", das wenn DNA doppelsträngig ist, einer der beiden Stränge für ein Protein codiert.
Außerdem ist das ArcA-Protein, das in dem Wildtypstamm oder dem nicht-modifizierten Stamm enthalten ist, nicht auf ein Wildtypprotein beschränkt und kann eine Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von einem bis 20 Aminosäurerestern aufweisen, solange das Protein die Aktivität des ArcA-Proteins aufweist.
Die vorstehend genannte "Aktivität des ArcA-Proteins" ist eine Aktivität, die die Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz verbessert, wenn das Protein im Vergleich zu dem Fall, wenn das Protein normal funktioniert, nicht normal funktioniert. Anders ausgedrückt bedeutet die Aktivität des ArcA-Proteins, daß ein γ-Proteobacterium, das so modifiziert worden ist, daß das Protein nicht normal funktioniert, eine größere Menge der Zielsubstanz in einem Medium im Vergleich zu einem nicht-modifizierten Stamm des γ-Proteobacteriums, beispielsweise einem Wildtypstamm, produziert und anhäuft. Beispiele des Wildtypstamms von E. coli umfassen den Stamm K12 und Derivat davon, wie E. coli MG1655 (ATCC Nr. 47076) und W3110 (ATCC Nr. 27325). Außerdem umfassen Beispiele des nicht-modifizierten Stammes von Pantoea ananatis (Enterobacter agglomerans) die Stämme AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615) und AJ13601 (FERM BP-7207).
Die vorstehend beschriebene Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von Aminosäurerestern umfaßt auch natürlich vorkommende Mutationen oder Variationen aufgrund der Unterschiede in dem einzelnen Mikroorganismen, den Arten oder den Stämmen der Mikroorganismen, die das ArcA-Protein enthalten.
Beispiele solcher Mutanten oder Varianten des vorstehend erwähnten arcA-Gens umfassen DNA, die mit einer Nucleotidsequenz, welche die Sequenz der Nucleotidnummern 101 bis 817 in SEQ ID NR: 31 enthält, oder mit einer Sonde hybridisierbar ist, die von der Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hergestellt werden kann und für ein Protein mit einer ähnlichen Aktivität wie ArcA codiert. Die hier eingesetzten "stringenten Bedingungen" sind Bedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird, ein nicht-spezifisches Hybrid jedoch nicht gebildet wird.
Die stringenten Bedingungen sind Bedingungen, unter denen DNA miteinander bei einer Salzkonzentration hybridisieren, welcher einer üblichen Waschbedingung bei der Southern-Hybridisierung entspricht, d.h. 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C.
Als Sonde kann auch eine Teilsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 31 eingesetzt werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 31 hergestellt werden als Primer und eines DNA-Fragments, welches die Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 31 enthält, als Matrize hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 300 pbs als Sonde eingesetzt wird, können die für die Hybridisierung eingesetzten Waschbedingungen aus 50°C, 2 × SSC und 0,1% SDS bestehen.
Die Ausdrücke "arcA-Gen" und "ArcA-Protein", die im folgenden verwendet werden, sind nicht auf solche beschränkt, die die Nucleotidsequenz oder die Aminsoäuresequenz in SEQ ID NR: 31 oder 32 aufweisen, sie umfassen vielmehr auch Mutanten oder Homologe davon. Als Beispiel eines Homologen sind die Nucleotidsequenz des arcA-Gens und die Aminosäuresequenz von ArcA von Pantoea ananatis in SEQ ID NR: 19 und 20 gezeigt.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Bacterium ist ein Bacterium, das so modifiziert ist, daß das ArcA-Protein nicht normal funktioniert, genauer gesagt beispielsweise ein γ-Proteobacterium, dessen arcA-Gen unterbrochen ist. Ein solches Bacterium kann beispielsweise durch Substituieren eines arcA-Gens, das nicht normal funktioniert (im folgenden auch als "unterbrochenes arcA-Gen" bezeichnet), gegen ein arcA-Gen auf dem Chromosom durch homologe Rekombination unter Verwendung eines Genrekombinationsverfahrens erhalten werden (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985).
Der Mechanismus der homologen Rekombination ist wie folgt. Wenn ein Plasmid oder dergleichen, welches eine Sequenz trägt, die eine Homologie mit einer chromosomalen Sequenz aufweist, in eine korrespondierende Bakterienzelle eingeführt wird, kommt es an der Stelle der homologen Sequenz in einer bestimmten Häufigkeit zu einer Rekombination, so daß das eingeführte Plasmid als Ganzes in das Chromosom integriert wird. Dann kann, indem eine erneute Rekombination an der Stelle der homologen Sequenz auf dem Chromosom bewirkt wird, das Plasmid aus dem Chromosom wieder entfernt werden. In Abhängigkeit von der Position, an der die Rekombination bewirkt wird, kann jedoch das unterbrochene Gen auf dem Chromosom verbleiben, während das ursprüngliche normale Gen zusammen mit dem Plasmid von dem Chromosom entfernt wird. Durch Selektieren solcher Bakterienstämme kann ein Bakterienstamm erhalten werden, worin das normale arcA-Gen durch das unterbrochene arcA-Gen ersetzt ist.
Eine solche Genunterbrechungstechnik auf der Grundlage der homologen Rekombination ist gut etabliert, und ein Verfahren unter Einsatz einer linearen DNA, ein Verfahren unter Einsatz eines temperaturempfindlichen Plasmids oder dergleichen können dafür eingesetzt werden. Das arcA-Gen kann auch unter Einsatz eines Plasmids unterbrochen werden, das das arcA-Gen mit einem eingeführten Markergen, beispielsweise einem Arzneimittelresistenzgen, enthält und in einer mikrobiellen Zielzelle replizieren kann. Das heißt, in einer Transformante, die mit solch einem Plasmid transformiert worden ist und auf diese Weise Arzneimittelresistenz erworben hat, ist das Markergen in der chromosomalen DNA integriert. Es ist wahrscheinlich, daß dieses Markergen durch homologe Rekombination des an beiden Seiten des Markers vorhandenen arcA-Gens mit diesen Genen auf dem Chromosom integriert worden ist, und deshalb kann ein Gen-unterbrochener Stamm effizient selektiert werden.
Beispiele von temperaturempfindlichen Plasmiden, die in Escherichia-Bakterien funktionieren, umfassen pMAN997 (Internationale Patentveröffentlichung WO99/03988 ), pHSG415 und pHSG422 (Hashimoto-Gotoh, T. et al., Gene, 16, 227-235 (1981)).
Genauer gesagt kann ein unterbrochenes arcA-Gen, das für die Genunterbrechung eingesetzt wird, durch Deletion einer bestimmten Region des arcA-Gens mittels Verdauung mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen und Religieren, durch Einführen eines anderen DNA-Fragments (Markergens etc.) in das arcA-Gen oder durch Einführen einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nucleotide in einer Nucleotidsequenz der codierenden Region des arcA-Gens oder ihrer Promotorregion mittels ortsgerichteter Mutagenese (Kramer, W. und Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) oder durch Behandlung mit einem chemischen Mittels, wie Natriumhyposulfit und Hydroxylamin (Shortle, D. und Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270 (1978)) erhalten werden, so daß die Aktivität des codierten Repressors verringert oder ausgeschaltet sein sollte, oder die Transkription des arcA-Gens sollte verringert oder ausgeschaltet sein. Unter diesen Verfahren ist ein Verfahren unter Einsatz einer Deletion einer bestimmten Region des arcA-Gens durch Verdauen mit einem Restriktionsenzym und Religierung oder Insertion eines anderen DNA-Fragments in das arcA-Gen im Hinblick auf die Zuverlässigkeit und Stabilität bevorzugt.
Die Sequenz des arcA-Gens als solche ist bekannt, und deshalb kann das arcA-Gen durch das PCR-Verfahren oder das Hybridisierungsverfahren auf der Grundlage der Sequenz leicht erhalten werden. Es ist ausreichend, daß das arcA-Gen, das für die Unterbrechung des Gens eingesetzt wird, eine Homologie in einem solchen Maß haben soll, daß die homologe Rekombination mit dem arcA-Gen, das in dem Zielbacterium enthalten ist, bewirkt werden sollte. Genauer gesagt ist es ausreichend, daß die Homologie üblicherweise 70% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr, stärker bevorzugt 90% oder mehr ist.
Das Unterbrechen des Zielgens kann durch Analysieren des Gens auf dem Chromosom unter Einsatz von Southern blotting oder einem PCR-Verfahren bestätigt werden.
Verfahren zum Herstellen verschiedener Gene, die Hybridisierung, PCR, Präparation von Plasmid-DNA, Verdauung und Ligierung von DNA, Transformation und dergleichen, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, sind in Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989) beschrieben.
Außerdem kann ein mutierter Stamm, worin ein funktionelles ArcA-Protein nicht mehr produziert wird, dadurch erhalten werden, daß ein γ-Proteobacterium einer UV-Bestrahlung oder einer Behandlung mit einem Mutagenisierungsmittel, das für eine übliche Mutagenisierungsbehandlung eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure, ausgesetzt wird.
Durch Kultivieren eines Mikroorganismus von γ-Proteobacterium mit der Fähigkeit zur Produktion einer Zielsubstanz, der so modifiziert ist, daß das ArcA-Protein nicht normal funktioniert, was wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden kann, in einem Medium zur Produktion und Anhäufung der Zielsubstanz in dem Medium oder den Zellen und durch Gewinnen der Zielsubstanz aus dem Medium oder den Zellen kann die Zielsubstanz hergestellt werden. Erfindungsgemäß kann die Produktionseffizienz der Zielsubstanz durch Verwenden eines γ-Proteobacteriums mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften verbessert werden. Es wird angenommen, daß das arcA-Gen in einem Wildtypstamm von γ-Proteobacterium während der Kultivierung exprimiert wird und die Expression der Gene, die an dem TCA-Zyklus beteiligt sind, inhibiert, während in einem Stamm, worin das ArcA-Protein nicht normal funktioniert, eine solche Expressionsinhibition für die Gene des TCA-Zyklus ausgeschaltet ist, so daß die vorstehend beschriebene Wirkung erzielt werden sollte.
Das für die vorliegende Erfindung eingesetzte Medium kann ein übliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Komponenten nach Bedarf enthält. Als Kohlenstoffquelle können Saccharide, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose, Fructose, Arabinose, Maltose, Xylose, Trehalose, Ribose und Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin, Mannitol und Sorbitol, und organische Säuren, wie Gluconsäure, Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischer Stickstoff, wie Sojabohnenproteinhydrolysat, Ammoniakgas und wäßriges Ammoniak, eingesetzt werden. Als organische Spurennährstoffe werden erforderliche Substanzen, beispielsweise Vitamine, wie Vitamin B₁, Nucleinsäuren, wie Adenin und RNA, oder Hefeextrakt oder dergleichen zu dem Medium in geeigneten Mengen gegeben. Daneben werden bei Bedarf Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen in kleinen Mengen zugegeben.
Die Kultivierung kann unter herkömmlich verwendeten, bekannten Bedingungen in Abhängigkeit von den eingesetzten Bakterienstamm durchgeführt werden. Die Kultivierung wird beispielsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 72 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird vorzugsweise auf 30 bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung vorzugsweise auf 4,5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen, sowie Ammoniakgas können für die pH-Einstellung eingesetzt werden.
Für die Gewinnung der Zielsubstanz aus dem Medium oder den Zellen ist ein spezielles Verfahren für die vorliegende Erfindung nicht erforderlich. Das heißt, die Gewinnung kann durch eine Kombination von herkömmlich bekannten Techniken, wie Verfahren unter Einsatz von Ionenaustauscherharzen, Ausfällung und anderen Techniken in Abhängigkeit von der Art der Zielsubstanz durchgeführt werden. Die in den Zellen angehäufte Zielsubstanz kann außerdem, nachdem die Zellen physikalisch oder enzymatisch aufgebrochen worden sind, aus dem Zellextrakt oder der Membranfraktion in Abhängigkeit von der Zielsubstanz gewonnen werden. Außerdem können in Abhängigkeit von der Zielsubstanz Zellen, welche die Zielsubstanz enthalten, auch als solche als mikrobieller Katalysator eingesetzt werden.
Beispiele
Im folgenden wird die Erfindung anhand der folgenden Beispiele eingehender erklärt.
Beispiel 1: Unterbrechung der Gene arcA, dam und fnr von E. coli
Die gesamte Nucleotidsequenz der genomischen DNA des Stammes E. coli K-12 ist bereits aufgeklärt worden (Blattner F.R., Plunkert G., Bloch C.A. et al., Science, 227, 1453-1474 (1997);
ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz). Basierend auf den bekannten Nucleotidsequenzen der Gene arcA, dam und fnr wurden Gen-unterbrochene Stämme für jedes der Gene arcA, dam und fnr hergestellt. In dem folgenden Verfahren wurde das QIAGEN-Genomic-tip-System (hergestellt von QIAGEN) für die Extraktion der genomischen DNA eingesetzt.
(1) Unterbrechung des arcA-Gens von E. coli
Primer wurden auf der Grundlage der bekannten Nucleotidsequenz von arcA synthetisiert, und die N- und C-terminalen Fragmente des arcA-Gens wurden durch das PCR-Verfahren unter Verwendung der genomischen DNA des Stammes E. coli MG1655 als Matrize amplifiziert. Pyrobest DNA Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet, und die PCR wurde gemäß den beigefügten Anweisungen durchgeführt. Primer 1 und 2 wurden als die Primer für die PCR für die Amplifizierung des N-terminalen Fragments eingesetzt, und Primer 3 und 4 wurden als die Primer für die PCR für die Amplifizierung des C-terminalen Fragments eingesetzt. Primer 1 wurde so konstruierte, daß er eine HindIII-Stelle enthielt, und Primer 4 wurde so konstruiert, daß er eine XbaI-Stelle enthielt.

Primer 1: cccaagcttaaagccctttacttagctta (die Sequenz ist komplementär zu den Nucleotidnummern 5482 bis 5501 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000510, wobei ccc und eine HindIII-Stelle am 5'-Ende eingeführt werden, SEQ ID NR: 1)
Primer 2: tccgcgccatctgtcgcttc (Sequenz der Nucleotidnummern 4851 bis 4870 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000510, SEQ ID NR: 2)
Primer 3: gaagcgacagatggcgcggaaaagctacaagttcaatggt (die Sequenz ist komplementär zu den Nucleotidnummern 4541 bis 4560 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000510, wobei am 5'-Ende eine Sequenz eingefügt wurde, die zu den Nucleotidnummern 4851 bis 4870 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000510 komplementär ist, SEQ ID NR: 3)
Primer 4: gggtctagaggttgaaaaataaaaacggc (Sequenz der Nucleotidnummern 4188 bis 4207 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000510, wobei ggg und eine XbaI-Stelle am 5'-Ende eingefügt wurde, SEQ ID NR: 4.)

Nach der PCR wurden die amplifizierten DNA-Fragmente unter Verwendung von QIAquick PCR Purification Kit (ein Produkt von QIAGEN) jeweils gereinigt. Das gereinigte N-terminale DNA-Fragment und das gereinigte C-terminale DNA-Fragment, die Primer 1 und 4 wurden für das Überkreuz-PCR-Verfahren eingesetzt (A.J. Link, D. Phillips, G.M. Church, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)), wobei ein unterbrochenes arcA-Fragment erhalten wurde. Das gereinigte DNA-Fragment wurde mit HindIII und XbaI (produziert von Takara Shuzo) verdaut und einer Phenol/Chloroformbehandlung und Ethanolausfällung unterworfen. Das Fragment wurde mit einem temperaturempfindlichen Plasmid pMAN997 (Internationale Patentveröffentlichung WO99/03988 ), das ebenfalls mit HindIII und XbaI verdaut worden war, unter Verwendung des DNA ligation Kit Ver. 2 (produziert von Takara Shuzo) ligiert. Kompetente Zellen von JM109 (hergestellt von Takara Shuzo) wurden mit dieser Ligierungslösung transformiert und auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin (hergestellt von Sigma) (LB+Ampicillinplatte) aufgetragen. Nachdem die Zellen einen Tag bei 30°C kultivierte worden waren, wurden die gewachsenen Zellen in Teströhrchen bei 30°C in LB-Medium, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, kultiviert, und Plasmide wurden unter Einsatz eines automatischen Plasmidextraktors PI-50 (hergestellt von Kurabo Industries) extrahiert. Die erhaltenen Plasmide wurden mit HindIII und XbaI verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, und das Plasmid, welches das Zielfragment enthielt, wurde als Plasmid pMAN ΔarcA für die arcA-Unterbrechung bezeichnet. Das vorstehend erwähnte Plasmid pMAN997 ist ein Plasmid, das durch Austauschen der VspI-HindIII-Fragmente von pMAN031 (S. Matsuyama und S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) und pUC19 (hergestellt von Takara Shuzu) erhalten wurde.
Der Stamm E. coli WC196 wurde nach dem Verfahren von C.T. Chung et al. mit dem Plasmid pMAN_ΔarcA transformiert, und Kolonien wurden auf einer LB+Ampicillin-Platte bei 30°C selektiert. Die selektierten Klone wurden bei 30°C über Nacht als Flüssigkultur kultiviert. Dann wurde die Kulturbrühe auf eine Konzentration von 10^-3 verdünnt und auf eine LB+Ampicillin-Platte ausgestrichen, und Kolonien wurden bei 42°C selektiert. Die selektierten Klone wurden auf eine LB+Ampicillin-Platte aufgetragen und bei 30°C kultiviert, und dann wurde ein Achtel der Zellen auf der Platte in 2 ml LB-Medium suspendiert und bei 42°C während 4 bis 5 Stunden unter Schütteln kultiviert. Die Kulturbrühe wurde auf das 10^-5-fache verdünnt und auf eine LB-Platte aufgetragen, und mehrere hundert Kolonien unter den erhaltenen Kolonien wurden auf eine LB-Platte und eine LB+Ampicillin-Platte geimpft, um das Wachstum zu bestätigen und somit Ampicillin-empfindliche Stämme zu selektieren. Es wurde eine Kolonie-PCR für mehrere Ampicillin-empfindliche Stämme durchgeführt, um die Deletion des arcA-Gens zu bestätigen. Auf diese Weise wurde der arcA-unterbrochene Stamm WC196ΔarcA, der von E. coli WC196 abgeleitet war, erhalten.
(2) Unterbrechung des dam-Gens von E. coli
Ein Stamm mit unterbrochenem dam-Gen wurde aus WC196 auf dieselbe Weise wie in (1) hergestellt.
Primer wurden auf der Grundlage der bekannten Nucleotidsequenz des dam-Gens synthetisiert, und N- und C-terminale Fragmente des dam-Gens wurden durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung der genomischen DNA des Stammes E. coli MG1655 als Matrize amplifiziert. Primer 5 und 6 wurden als die Primer für die PCR zum Amplifizieren des N-terminalen Fragments eingesetzt, und Primer 7 und 8 wurden als die Primer für die PCR zum Amplifizieren des C-terminalen Fragments eingesetzt.

Primer 5 wurde so entworfen, daß er eine HindIII-Stelle enthielt, und Primer 8 wurde entworfen, so daß er eine XbaI-Stelle enthielt.
Primer 5: cccaagcttccgtggtatgtcctggtttc (die Sequenz ist komplementär zu den Nucleotidnummern 5150 bis 5169 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000414, wobei ccc und eine HindIII-Stelle am 5'-Ende angefügt waren, SEQ ID NR: 5)
Primer 6: agactgatcaggtcgctatt (Sequenz der Nucleotidnummern 4741 bis 4760 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000414, SEQ ID NR: 6)
Primer 7: aatagcgacctgatcagtctgccttatgcaccgctgtctg (eine Sequenz, die zu den Nucleotidnummern 4361 bis 4380 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangnsnummer AE000414 komplementär ist, an die am 5'-Ende eine Sequenz angefügt ist, die zu Nucleotidnummern 4741 bis 4760 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000414 komplementär ist, SEQ ID NR: 7)
Primer 8: gggtctagacgtcagattgggaacatagt (Sequenz der Nucleotidnummern 3931 bis 3950 der Sequenz der Genbankzugangsnummer AE000414, an die ggg und eine XbaI-Stelle am 5'-Ende angefügt waren, SEQ ID NR: 8)

Nach der PCR wurden die amplifizierten DNA-Fragmente jeweils unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kit (hergestellt von QIAGEN) gereinigt. Das gereinigte N-terminale DNA-Fragment und das gereinigte C-terminale DNA-Fragment, die Primer 5 und 8 wurden für das Überkreuz-PCR-Verfahren eingesetzt, wobei ein defizientes dam-Fragment erhalten wurde. Das folgende Verfahren wurde auf dieselbe Weise wie in (1) durchgeführt, wobei der Stamm WC196Δdam mit unterbrochenem dam-Gen erhalten wurde.
(3) Unterbrechung des fnr-Gens von E. coli
Ein Stamm mit unterbrochenem fnr-Gen wurde von WC196 auf dieselbe Weise wie in (1) hergestellt.
Primer wurden auf der Grundlage der bekannten Nucleotidsequenz des fnr-Gens synthetisiert, und N- und C-terminale Fragmente des fnr-Gens wurden durch PCR-Verfahren unter Verwendung der genomischen DNA des Stammes E. coli MG1655 als Matrize amplifiziert.
Primer 9 und 10 wurden als Primer für die PCR zum Amplifizieren eines N-terminalen Fragments eingesetzt, und Primer 11 und 12 wurden als Primer für die PCR zum Amplifizieren des C-terminalen Fragments eingesetzt. Primer 9 wurde so entworfen, daß er eine HindIII-Stelle enthielt, und Primer 12 wurde so entworfen, daß er eine XbaI-Stelle enthielt. Ein Stamm mit unterbrochenem fnr-Gen wurde von WC196 auf dieselbe Weise wie in (1) hergestellt.

Primer 9: cccaagcttgcaattgggccgtcctggcg (eine Sequenz, die komplementär ist zu den Nucleotidnummern 7981 bis 8000 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000231, an die ccc und eine HindIII-Stelle am 5'-Ende angefügt waren, SEQ ID NR: 9)
Primer 10: tcaagctgatcaagctcatg (Sequenz der Nucleotidnummern 7501 bis 7520 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000231, SEQ ID NR: 10)
Primer 11: caggagttgatcagcttgagaaaaatgccgaggaacgtc (Sequenz, die komplementär ist zu den Nucleotidnummern 7121 bis 7140 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000231, an die am 5'-Ende eine Sequenz angefügt war, die komplementär ist zu den Nucleotidnummern 7501 bis 7520 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000231, SEQ ID NR: 11)
Primer 12: gggtctagattggtcgtcctggttaggat (Sequenz der Nucleotidnummern 6671 bis 6690 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000231, an die ggg und eine XbaI-Stelle am 5'-Ende angefügt waren, SEQ ID NR: 12).

Nach der PCR wurden die amplifizierten DNA-Fragmente jeweils unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (hergestellt von QIAGEN) gereinigt. Das gereinigte N-terminale DNA-Fragment und das gereinigte C-terminale DNA-Fragment, Primer 9 und 12 wurden für das Überkreuz-PCR-Verfahren eingesetzt, wobei ein defizientes dam-Fragment erhalten wurde. Das folgende Verfahren wurde auf dieselbe Weise wie in (1) durchgeführt, wobei der Stamm WC196Δfnr mit unterbrochenem fnr-Gen erhalten wurde.
Beispiel 2: Wirkung der Unterbrechung des arcA-Gens auf die L-Lysinproduktion in einem Stamm von E. coli

Der Stamm WC196ΔarcA mit unterbrochenem arcA-Gen, der Stamm WC196Δdam mit unterbrochenem dam-Gen, der Stamm WC196Δ fnr mit unterbrochenem fnr-Gen und deren Elternstamm WC196 wurden kultiviert, und ihre Lysinproduktionsmengen wurden gemessen. Die Medien, Kulturverfahren und Analyseverfahren für die Messung sind nachstehend beschrieben. (Basismedium: E-100 Medium)

	Endkonzentration
Glucose	10 g/l (getrennt sterilisiert)
NH₄Cl	20 mM
NaHPO₄	40 mM
KH₂PO₄	30 mM
CaCl₂	0,01 mM
FeSO₄	0,01 mM
MnSO₄	0,01 mM
Zitronensäure	5 mM
Thiaminhydrochlorid	2 mM (getrennt sterilisiert)
Casaminosäure	2,5 g/l (getrennt sterilisiert)
MES-NaOH (pH 6,8)	50 mM (getrennt sterilisiert)

(Kulturverfahren)
Erneuerungskultur:
Es wurde ein Bakteriengrundstock eingeimpft.
LB-Agarmedium (ein Arzneimittel wurde bei Bedarf zugegeben), 37°C, 24 Stunden.
Impfkultur:
Die Bakterien aus der Erneuerungskultur wurden in ein Volumen von 2 ml in LB-Medium geimpft.
LB-Medium (ein Arzneimittel wurde bei Bedarf zugegeben), 37°C, über Nacht.
Hauptkultur:
1/16 der Bakterienimpfkulturzellplatte wurde eingeimpft.
E-100-Medium (ein Arzneimittel wurde bei Bedarf zugegeben), 37°C, 20 ml in einem 500 ml-Sakaguchi-Kolben.
(Analyseverfahren)
Proben in einem Volumen von 500 μl wurden in Zeitabständen aus der Kulturbrühe entnommen, und die Glucosekonzentration und die L-Lysinanhäufung in der Kulturbrühe wurden gemessen. Die Glucosekonzentration und die L-Lysinanhäufung wurden für den Überstand der Kulturbrühe gemessen, der nach der Zentrifugation bei 15 000 UpM während 5 Minuten erhalten wurde und auf eine zweckmäßige Konzentration mit Wasser verdünnt wurde, wobei für die Messung ein Biotech Analyzer (Sakura Seiki) eingesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Als Ergebnis wurde beobachtet, daß der Stamm mit dem unterbrochenen fnr-Gen eine L-Lysinanhäufung zeigte, die zu derjenigen des Kontrollstammes äquivalent war, und daß der Stamm mit dem unterbrochenen dam-Gen eine verminderte Anhäufung im Vergleich zu dem Kontrollstamm zeigte. Andererseits wurde erkannt, daß die L-Lysinanhäufung des Stammes mit unterbrochenem arcA-Gen im Vergleich zu dem Kontrollstamm verbessert war.
Beispiel 3: Wirkung der arcA-Unterbrechung auf die Produktion von L-Glutaminsäure in einem Stamm von E. coli
Da die verbesserte Wirkung auf die Anhäufung von L-Lysin in Beispiel 2 durch den Einsatz einer Unterbrechung des arcA-Gens beobachtet wurde, wurde die Wirkung des arcA-Gens auf die L-Glutaminsäurefermentation in diesem Beispiel untersucht.
Um die Wirkung eines Fehlens des arcA-Gens auf die L-Glutaminsäureproduktion in E. coli MG1655 zu bestätigen, wurde ein von E. coli MG1655 abgeleiteter sucA-defizienter Stamm (MG1655ΔsucA) und ein von E. coli MG1655 abgeleiteter Stamm mit einer Doppeldefizient in sucA und arcA (MG1655ΔsucA ΔarcA) konstruiert.
(1) Unterbrechung des sucA-Gens von E. coli
Ein Stamm mit unterbrochenem sucA-Gen wurde von MG1655 auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Primer wurden auf der Grundlage der bekannten Nucleotidsequenz des sucA-Gens synthetisiert, und die N- und C-terminalen Fragmente des sucA-Gens wurden durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung der genomischen DNA des Stammes E. coli MG1655 als Matrize amplifiziert.
Primer 13 und 14 wurden als die Primer für die PCR zum Amplifizieren eines N-terminalen Fragments eingesetzt, und Primer 15 und 16 wurden als die Primer für die PCR zum Amplifizieren eines C-terminalen Fragments eingesetzt. Primer 13 wurde so entworfen, daß er eine HindIII-Stelle enthielt, und Primer 16 wurde so entworfen, daß er eine XbaI-Stelle enthielt. Ein Stamm mit unterbrochenem sucA wurde von MG1655 auf dieselbe Weise wie in (1) hergestellt.

Primer 13: cccaagcttctgcccctgacactaagaca (Sequenz der Nucleotidnummern 1072 bis 10740 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000175, an die ccc und eine HindIII-Stelle am 5'-Ende angefügt waren, SEQ ID NR: 13)
Primer 14: cgaggtaacgttcaagacct (Sequenz, die komplementär ist zu den Nucleotidnummern 11501 bis 11520 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000175, SEQ ID NR: 14)
Primer 15: aggtcttgaacgttacctcgatccataacgggcagggcgc (Sequenz der Nucleotidnummern 12801 bis 12820 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000175, an die am 5'-Ende eine Sequenz der Nucleotidnummern 10501 bis 11520 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000175 eingefügt war, SEQ ID NR: 15)
Primer 16: gggtctagaccactttgtcagtttcgatt (Sequenz, die komplementär ist zu den Nucleotidnummern 13801 bis 13820 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000175, an die ggg und ein XbaI-Stelle am 5'-Ende angefügt waren, SEQ ID NR: 16)

Nach der PCR wurden die amplifizierten DNA-Fragmente jeweils unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kit (hergestellt von QIAGEN) gereinigt. Das gereinigte N-terminale DNA-Fragment und das gereinigte C-terminale DNA-Fragment, die Primer 13 und 16 wurden für das Überkreuz-PCR-Verfahren eingesetzt, wobei ein defizientes sucA-Fragment erhalten wurde. Das folgende Verfahren wurde auf dieselbe Weise wie in (1) durchgeführt, wobei der Stamm MG1655ΔsucA mit unterbrochenem sucA-Gen erhalten wurde.
(2) Präparation eines Stammes von E. coli mit einer Doppeldefizienz im sucA-Gen und arcA-Gen
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde das arcA-Gen von MG1655ΔsucA unterbrochen, wobei ein Stamm mit einer Doppeldefizienz im sucA-Gen und arcA-Gen erhalten wurde (MG1655Δ sucAΔarcA).
Auf ähnliche Weise wurden ein Stamm mit Doppeldefizienz in sucA und dam (MG1655ΔsucAΔdam) und ein Stamm mit Doppeldefizienz in sucA und fnr (MG1655ΔsucAΔfnr) hergestellt.

Um die Wirkung der arcA-Genunterbrechung auf die L-Glutaminsäure-Fermentation zu untersuchen, wurden die doppeldefizienten Stämme für die Gene, nämlich MG1655ΔsucAΔarcA, MG1655ΔsucAΔdam und MG1655ΔsucAΔfnr sowie der sucA-Gen-defiziente Stamm MG1655ΔsucA als Kontrolle kultiviert, und die Mengen an produzierter L-Glutaminsäure wurden gemessen. Die Medien, Kulturverfahren und Analyseverfahren für die Messung sind nachstehend gezeigt. (Basismedium: MS-Medium)

	Endkonzentration
Glucose	40 g/l (getrennt sterilisiert)
MgSo₄·7H₂O	1 g/l (getrennt sterilisiert)
(NH₄)₂SO₄	16 g/l
KH₂PO₄	1 g/l
Hefeextrakt	2 g/l
FeSO₄	0,01 g/l
MnSO₄	0,01 g/l
CaCO₃	30 g/l (getrennt sterilisiert)

(Kulturverfahren)
Erneuerungskultur:
Es wurden ein Bakteriengrundstock eingeimpft.
LB-Agarmedium (ein Arzneimittel wurde nach Bedarf zugegeben), 37°C, 24 Stunden.
Impfkultur im Teströhrchen:
Es wurden die Bakterien aus der Erneuerungskultur eingeimpft.
LB-Flüssigmedium (es wurde bei Bedarf ein Arzneimittel zugegeben), 37°C, 16 Stunden.
Hauptkultur:
10% des flüssigen Mediums für die Impfkultur wurden eingeimpft.
MS-Flüssigmedium (ein Arzneimittel wurde bei Bedarf zugegeben), 37°C, 20 ml in einem 500 ml-Sakaguchi-Kolben.
(Analyseverfahren)
Es wurde Proben in einem Volumen von 500 μl in Zeitabständen aus der Kulturbrühe genommen, und die Glucosekonzentration und die L-Glutaminsäureanhäufung in der Kulturbrühe wurden gemessen. Die Glucoskonzentration und die L-Glutaminsäurekonzentration wurden für den Überstand der Kulturbrühe, der nach Zentrifugation bei 15 000 UpM während 5 Minuten erhalten wurde und dann auf eine geeignete Konzentration mit Wasser verdünnt wurde, unter Verwendung eines Biotech Analy zer (Sakura Seiki) gemessen. Die Anhäufung der L-Glutaminsäure und die Ausbeute zu dem Zeitpunkt, an dem das Saccharid verbraucht war, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Anhäufung von L-Glutaminsäure und Ausbeute des Stammes mit unterbrochenem sucA und arcA

Stamm L-Glutaminsäureanhäufung (g/l) L-Glutaminsäureausbeute (%)

MG1655ΔsucA 15,4 36,9

MG1655ΔsucAΔarcA 17,0 41,7

MG1655ΔsucAΔdam 14,2 35,5

MG1655ΔsucAΔfnr 14,6 36,6
Als Ergebnis wurde gefunden, daß sowohl die Anhäufung als auch die Ausbeute von Glutaminsäure in dem Stamm mit unterbrochenem sucA und dam im Vergleich zu der Kontrolle etwa geringer war, und die Anhäufung und die Ausbeute waren vergleichbar mit den Werten der Kontrolle in dem Stamm mit unterbrochenem sucA und fnr. Andererseits wurde erkannt, daß sowohl die Anhäufung als auch die Ausbeute von L-Glutaminsäure in dem Stamm mit unterbrochenem sucA und arcA im Vergleich zu dem Kontrollstamm verbessert waren.
Beispiel 4: Unterbrechung des arcA-Gens von Pantoea ananatis
(1) Gewinnung des arcA-Gens von Pantoea ananatis
(1) Konstruktion von Pantoea ananatis, der L-Glutaminsäure bei einem niedrigen pH-Wert produziert.
ArcA ist ein globaler Regulator, der in E. coli und anderen Arten universell vorhanden ist. Unter Verwendung eines Bacteriums der Gattung Pantoea, nämlich Pantoea ananatis AJ13601, der mit E. coli verwandt ist, wurde das argA-Gen von Pantoea ananatis auf der Grundlage der bekannten Nucleotidsequenz von arcA aus E. coli erhalten. Der Stamm AJ13601 wurde wie folgt erhalten (vergl. EP 1 078 989 A2 ). Der Stamm AJ13355 wurde aus der Erde in Iwata-shi, Shizuoka, Japan, als ein Stamm isoliert, der bei einem niedrigen pH-Wert in einem Medium wachsen kann, das L-Glutaminsäure und eine Kohlenstoffquelle enthält. Von dem Stamm AJ13355 wurde der Stamm SC17 als eine Mutante selektiert, die weniger Schleimbildung aufweist und gutes Wachstum zeigt. Der Stamm SC17sucA, worin die α-Ketoglutaratdehdrogenase (αKGDH) unterbrochen ist, wurde von dem Stamm SC17 konstruiert. In den Stamm SC17sucA wurde das Plasmid pSTVCB, enthaltend ein Citratsynthasegen (gltA), das von Brevibacterium lactofermentum (pSTVCB) abgeleitet ist, und das Plasmid RSFCPG, enthaltend gltA, das Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen (ppc) und das Glutamatdehydrogenasegen (gdhA), die von E. coli abgeleitet sind, eingeführt. Unter den erhaltenen Transformanten wurde der Stamm AJ13601 als ein Stamm selektiert, der eine erhöhte Resistenz gegenüber hohen Konzentrationen von L-Glutaminsäure bei niedrigem pH-Wert aufweist. Der Stamm AJ13601 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit die unabhängige Verwaltungseinheit International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan, PLZ:305-5466) am 18. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERN P-17516 hinterlegt und dann am 6. Juli 200 gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung mit der Nummer FERM BP-7207 (vergl. EP 1 078 989 A2 ).
(2) Gewinnung des arcA-Gens von Pantoea ananatis AJ13601
Genomische DNA von Pantoea ananatis AJ13601 wurde unter Verwendung des QIAGEN-Genomic-tip-System (hergestellt von QIAGEN) extrahiert. Durch die PCR wurde unter Verwendung der genomischen DNA als Matrize und den folgenden Oligonucleotiden als Primern ein 759bp-DNA-Fragment, enthaltend den ORF des arcA-Gens, erhalten. Pyrobest-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) wurde für die PCR eingesetzt, und die PCR wurde nach den beiliegenden Anweisungen durchgeführt. Primer 17 und 18 wurden als Primer für die Amplifikation eingesetzt. Primer 17 war so entworfen worden, daß er eine EcoRI-Stelle enthielt, und Primer 18 wurde so entworfen, daß er eine SphI-Stelle enthielt.

Primer 17: cccgaattccctgtttcgatttagttggc (Sequenz, die komplementär ist zu den Nucleotidnummern 4980-4999 der Nucleotidsequenz der Genbankzugangsnummer AE000510, an die eine EcoRI-Stelle am 5'-Terminus angehängt ist: SEQ ID NR: 17)
Primer 18: cccgcatgcgattaatcttccagatcacc (Sequenz der Nucleotidnummern 4245-4264 der Genbankzugangsnummer AE000510, an die eine SphI-Stelle am 5'-Terminus angehängt ist, SEQ ID NR: 18).

Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den Clonierungsvektor pSTV29 (hergestellt von Takara Shuzo) in Vorwärtsrichtung bezüglich der Transcriptionsrichtung durch das lacZ-Gen unter Verwendung der EcoRI- und SphI-Stellen, die in die Primer eingebaut waren, cloniert, wobei pSTV29_EaarcA erhalten wurde. Die Nucleotidsequenz der clonierten Sequenz ist in SEQ ID NR: 19 gezeigt. Die von dem ORF codierte abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 20 gezeigt. Der erhaltene ORF zeigt etwa 81,2% Identität in der Nucleotidsequenz und etwa 92,1% in der Aminosäuresequenz zu dem ArcA-Gen von E. coli. Somit wird angenommen, daß der ORF arcA von Pantoea ananatis codiert.
(2) Unterbrechung des arcA-Gens von Pantoea ananatis
Der Stamm Pantoea ananatis G106S wurde für die Konstruktion eines Stammes von Pantoea ananatis mit unterbrochenem ArcA-Gen eingesetzt. Unter den zwei Plasmiden RSFCPG und pSTVCB, die in dem Stamm AJ13601 enthalten sind, trägt der Stamm G106S nur RSFCPG, wohingegen pSTVCB entfernt worden ist. Der Stamm mit dem unterbrochenen arcA-Gen wurde von dem Stamm G106S konstruiert. Dann wurde pSTVCB in den erhaltenen Stamm mit unterbrochenem Gen eingeführt, wobei der Stamm AJ13601 mit unterbrochenem ArcA-Gen erhalten wurde. Das Verfahren wird im folgenden eingehend beschrieben.
(1) Konstruktion eines Plasmids für den konjugativen Transfer für die Unterbrechung des arcA-Gens.
Der Einsatz einer konventionellen Züchtung durch Rekombination auf dem Chromosom mit einem temperaturempfindlichen Plasmid ist in einem Rekombinationsverfahren für Pantoea ananatis nicht einfach, weil Pantoea ananatis die Eigenschaft aufweist, das es bei 42°C kaum wachsen kann. Deshalb wurde in diesem Experiment eine Technik der Rekombination auf einem Chromosom unter Verwendung des konjugativen Transfers eingesetzt. Für das konjugative Transferverfahren ist es erforderlich, ein Plasmid zu konstruieren, das keinen Replikationsursprung (ori) von Pantoea ananatis enthält, d.h. ein Plasmid, das in Pantoea ananatis nicht replizieren kann. Die Region oriR6K und mobRP4 wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 21 und 22 und eines Plasmids für den Tn5-Transfer, nämlich pUT/miniTn5-Cm (Lorenzo V., et al., Journal of Bacteriology, 172, 6568-(1990); Herrero M., et al., Journal of Bacteriology, 172, 6557 (1990) als Matrize amplifiziert. Daneben wurde ein Fragment, das mehrere Clonierungsstellen und ein Chloramphenicolresistenzgen enthielt, durch PCR unter Verwendung der Primer 23 und 24 und von pHSG399 als Matrize amplifiziert. Jedes der erhaltenen amplifizierten Fragmente wurde mit BglII (produziert von Takara Shuzo) verdaut, und die Fragmente wurden mit dem DNA-Ligation Kit ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert.
Dann wurde der Stamm E. coli S17-1 λpir (R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983) mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 30 μg/ml Chloramphenicol, aufgetragen. Nach eintägiger Kultivierung bei 37°C wurden die erschienenen im LG-Medium, enthaltend 30 μg/ml Chloramphenicol, in Teströhrchen bei 37°C kultiviert. Plasmide wurden von jeder der Kulturen unter Verwendung des QIAprep Mini Spin column Kit (hergestellt von QIAGEN) erhalten. Die erhaltenen Plasmide wurden mit BglII verdaut, und ein Plasmid, das eine einzige BglII-Erkennungsstelle hat, wurde als das Plasmid für den konjugativen Transfer, pUT399Cm, benannt.

Primer 21: tcatagatcttttagattgatttatggtgc (SEQ ID NR: 21)
Primer 22: ccacagatctaattcccatgtcagccgtta (SEQ ID NR: 22)
Primer 23: ataaagatctgtgtccctgttgataccggg (SEQ ID NR: 23)
Primer 24: ggggagatcttgcaaggcgattaagttggg (SEQ ID NR: 24)

Dann wurde ein Kanamycinresistenzgen in pUT399Cm eingeführt und das Chloramphenicolresistenzgen aus dem Plasmid gemäß dem folgenden Verfahren entfernt. Das Kanamycinresistenzgen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 25 und 26 und von pMW 219 (hergestellt von Nippon Gene) als Matrize amplifiziert. Pyrobest DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) wurde für die PCR eingesetzt, und eine PCR wurde gemäß der beigefügten Anweisung durchgeführt. Jeder der Primer 25 und 26 wurde mit einer BglII-Stelle am 5'-Terminus versehen. Erhaltene DNA-Fragmente und pUT399 wurden mit BglII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und mit DNA-Ligation Kit ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert. Dann wurde der E. coli-Stamm S17-1 λpir (R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983) mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin (LB+Kanamycinplatte), aufgetragen. Nach eintägiger Kultivierung bei 37° wurden erscheinende Kolonien im LB-Medium, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin in Teströhrchen bei 37°C kultiviert. Plasmide wurden von jeder Kultur unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kit (hergestellt von QIAGEN) erhalten. Erhaltene Plasmide wurden mit BglII verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, und das mit dem Zielfragment versehene Plasmid wurde Plasmid pUT399CmKm genannt.

Primer 25: cccagatctagttttcgccccgaagaacg (SEQ ID NR: 25)
Primer 26: cccagatctccagagtcccgctcagaaga (SEQ ID NR: 26)

Dann wurde das Chloramphenicolresistenzgen wie nachstehend beschrieben aus pUT399CmKm entfernt. Das Plasmid pUT399CmKm wurde mit HindIII (produziert von Takara Shuzo) verdaut und mit dem DNA Ligation Kit ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert. Der Stamm E. coli S17-1 λpir (R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin (LB+Kanamycinplatte), aufgetragen. Nach eintägiger Kultivierung bei 37°C wurden erscheinende Kolonie auf einer LB-Agarplatte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, und auf einer LB-Agarplatte, enthaltend 30 μg/ml Chloramphenicol (hergestellt von Sigma), bei 37°C kultiviert. Der Chloramphenicolempfindlichkeit-aufweisende Stamm wurde im LB-Medium, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, einen Tag bei 37°C kultiviert, und das Plasmid wurde aus der Kultur unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep column Kit (hergestellt von QIAGEN) erhalten. Das erhaltene Plasmid wurde pUT399km genannt.
Primer wurden auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des vorstehend in (1) erhaltenen arcA-Gens hergestellt, und das N-terminale Fragment und das C-terminale Fragment des arcA-Gens wurden unter Verwendung der Primer und von pSTV29_EaarcA als Matrize amplifiziert. Pyrobest DNA Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) wurde für die PCR eingesetzt, und die PCR wurde gemäß der beiliegenden Anweisung durchgeführt. Primer 27 und 28 wurden als die Primer für die PCR zum Amplifizieren des N-terminalen Fragments eingesetzt, und Primer 29 und 30 wurden als Primer für die PCR zum Amplifizieren des C-terminalen Fragments eingesetzt.

Primer 27 wurde so entworfen, daß er eine EcoRI-Stelle enthielt, und Primer 30 wurde so entworfen, daß er eine SphI-Stelle enthielt.
Primer 27: cccgaattcgcgaccgatggtgcagagat (SEQ ID NR: 27)
Primer 28: aaggcaaattcatggtgcgc (SEQ ID NR: 28)
Primer 29: gcgcaccatgaatttgccttacccaatgaagagcgtcgcc (SEQ ID NR.: 29)
Primer 30: cccgcatgcaccttcgccgtgaatggtgg (SEQ ID NR: 30)

Nach der PCR wurden die amplifizierten DNA-Fragmente jeweils unter Verwendung des QUAquick PCR Purification Kit (hergestellt von QIAGEN) gereinigt. Das gereinigte N-terminale DNA-Fragment und das gereinigte C-terminale DNA-Fragment, die Primer 27 und 30 wurden für das Überkreuz-PCR-Verfahren (A. J. Link, D. Phillips, G.M. Church, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)) eingesetzt, wobei ein unterbrochenes arcA-Fragment erhalten wurde.
Das gereinigte DNA-Fragment wurde mit EcoRI und SphI (produziert von Takara Shuzo) verdaut und einer Phenol/Chloroformbehandlung und einer Ethanolausfällung unterworfen. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pUT399 Km, das auch mit EcoRI und SphI verdaut worden war, unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert. Der Stamm E. coli S17-1 λpir (R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) wurde mit dem Ligationsgemisch ligiert. Nach eintägiger Kultivierung bei 37°C wurden die erschienenen Kolonien in LB-Medium, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, in Teströhrchen bei 37°C kultiviert. Ein Plasmid wurde aus der Kultur unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Column Kit (hergestellt von QIAGEN) erhalten. Erhaltene Plasmide wurden mit EcoRI und SphI verdaut und einer Agarasogelelektrophorese unterworfen. Das Plasmid mit dem eingeführten Zielfragment wurde Plasmid pUT399Km_ΔarcA für die arcA-Unterbrechung genannt.
(2) Unterbrechung eines arcA-Gens von Pantoea ananatis durch konjugativen Transfer
Es wurde eine Genunterbrechung unter Einsatz des homologen Rekombinationsverfahrens mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pUT399Km_ΔarcA durchgeführt. Der Stamm G106S wurde als Plasmiddonorstamm eingesetzt. Das Screenen wurde mit einem Medium, enthaltend 5 g/l Glucose (hergestellt von Junsei Kagaku), 5 g/l Hefeextrakt (hergestellt von Difco), 10 g/l Trypton-Pepton (Difco), 10 g/l NaCl (Junsei Kagaku), 6 g/l Na₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, und 1,5 g/l CaCl₂·2H₂O (im folgenden als "LBG-M9-Medium" bezeichnet), das mit einer Lö sung, enthaltend 25 μg/ml Tetracyclin, 25 μg/ml Kanamycin und Agar (im folgenden als "LBG-M9+Tet+Km"-Platte bezeichnet), versetzt worden war, durchgeführt. Auf dem Agarmedium kann der Stamm G106S, in dem das Plasmid pUT399Km_ΔarcA auf seinem Chromosom einverleibt worden war, als ein Ein-Rekombinationsstamm selektiert werden, d.h. als Stamm mit unterbrochenem arcA-Gen, da das Plasmid, das von pUT399 abgeleitet ist, wie vorstehend beschrieben in Pantoea ananatis nicht replizieren kann. Der Stamm E. coli S17-1 λpir (R. Simon., et al. BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) wurde mit pUT399Km_ΔarcA transformiert und auf eine LB-Agarplatte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, aufgetragen. Nach der Kultivierung wurde die erhaltene Transformante E. coli S17-1 λ pir/pUT399Km_ΔarcA in LBG-M9-Medium, enthaltend 25 μg/ml Tetracyclin, einen Tag bei 37°C kultiviert. Daneben wurde der Stamm G106S in LBG-M9-Medium, enthaltend 25 μg/ml Tetracyclin, einen Tag bei 34°C kultiviert. Jedes Kulturmedium wurde zentrifugiert, und die erhaltenen Zellen wurden jeweils in 50 μl LB-Medium suspendiert. 25 μl jeder Suspension wurden in LBG-M9-Agarmedium gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur kultiviert. Danach wurde die Kultivierung 3 Stunden bei 34°C fortgesetzt, um den konjugativen Transfer zu bewirken. Dann wurden die um den Faktor 10^-1, 10^-2, oder 10^-3 verdünnten kultivierten Zellen auf eine LBG-M9+Tet+Km-Platte aufgetragen, und Stämme, die gegen Tetracyclin und Kanamycin resistent waren, wurden selektiert. Es wurde eine Kolonie-PCR für einige der selektierten Stämme durchgeführt, um die Deletion des arcA-Gens zu bestätigen. Auf diese Weise wurde der vom G106S abgeleitete Stamm G106SΔarcA mit unterbrochenem arcA-Gen erhalten.
(3) Einführen von pSTVCB in G106SΔarcA und Produktion von L-Glutaminsäure

Der Stamm G106SΔarcA wurde mit pSTVCB transformiert. Die erhaltene Transformante G106SΔarcA/pSTVCB ist äquivalent zu dem vorstehend beschriebenen Stamm AJ13601 mit unterbrochenem arcA-Gen (AJ13601ΔarcA). Der Stamm G106SΔarcA/pSTVCB und der Stamm AJ13601 als Kontrolle wurden kultiviert, und die Mengen der produzierten L-Glutaminsäure wurden jeweils gemessen. Die Medien, Kulturverfahren und Analyseverfahren für die Messung sind nachstehend gezeigt. [Beurteilungsmedium für L-Glutaminsäure]

	Endkonzentration
Saccharose	30 g/l (getrennt sterilisiert)
MgSO₄·7H₂O	0,5 g/l (getrennt sterilisiert)
(NH₄)₂SO₄	20 g/l
KH₂PO₄	2 g/l
Hefeextrakt	2 g/l
FeSO₄	0,02 g/l
MnSO₄	0,02 g/l
Lysin	0,2 g/l
Methionin	0,2 g/l
Diaminopimelat	0,2 g/l
pH 7,0 (KOH)
CaCO₃	20 g/l (getrennt sterilisiert)

[Kulturverfahren]
Impfkultur im Teströhrchen:
Es wurde ein Bakteriengrundstock eingeimpft.
LBG-M9-Agarmedium (Arzneimittel wurde bei Bedarf zugegeben), 34°C, 24 Stunden.
Hauptkultur:
Es wurden drei Platinösen der Impfkultur eingeimpft.
Grundmedium (Arzneimittel wurde bei Bedarf zugegeben), 34°C, 24 Stunden.
5 ml pro Teströhrchen
[Analyseverfahren]
Es wurden Proben in einem Volumen von 400 μl in Zeitabständen aus der Kulturbrühe entnommen, und die Saccharosekon zentration und die L-Glutaminsäureanhäufung in der Kulturbrühe wurden gemessen. Die Saccharosekonzentration und die Konzentration der L-Glutaminsäure wurden für den Überstand der Kulturbrühe, erhalten nach Zentrifugation bei 15 000 Umdrehungen pro Minute während 5 Minuten, nach Verdünnung mit Wasser auf eine geeignete Konzentration unter Verwendung eines Biotech Analyzer (Sakura Seiki) gemessen. Die Anhäufung von L-Glutaminsäure und die Ausbeute zu dem Zeitpunkt, an dem das Saccharid vollständig verbraucht worden war, sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Anhäufung von L-Glutaminsäure und Ausbeute des Stammes mit unterbrochenem arcA-Gen

Stamm Anhäufung von L-Glutaminsäure (g/l) Ausbeute an L-Glutaminsäure (%)

G106(AJ13601) 16,3 50,8

G106ΔarcA(AJ13601ΔarcA) 17,4 54,3
Als Ergebnis wurde erkannt, daß sowohl die Anhäufung als auch die Ausbeute an L-Glutaminsäure in dem Stamm mit unterbrochenem arcA-Gen im Vergleich zum Kontrollstamm verbessert waren.
Beispiel 5: Wirkung der arcA-Unterbrechung auf die L-Argininproduktion ein einem Stamm von E. coli
In dem vorstehenden Beispiel 2 wurde erkannt, daß sowohl die Anhäufung als auch die Ausbeute an L-Glutaminsäure in dem Stamm mit unterbrochenem sucA-Gen und arcA-Gen im Vergleich zu dem Kontrollstamm mit unterbrochenem sucA-Gen verbessert waren.
Dann wurde die Wirkung auf die Produktion von L-Arginin untersucht, welches unter Verwendung von Glutaminsäure als Substrat produziert wird. Der Stamm E. coli 237 wurde als L-Arginin produzierender Stamm verwendet. Der Stamm 237 wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) am 10. April 2000 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7925 hinterlegt und am 18. Mai 2001 nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung umgewandelt.
(1) Konstruktion des Stammes E. coli 237 mit unterbrochenem arcA-Gen
Ein arcA-Gen des Stammes 237 wurde unterbrochen, um auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 einen Stamm mit unterbrochenem arcA-Gen, nämlich 237ΔarcA, herzustellen.
(2) Produktion von L-Arginin

Um die Wirkung der Unterbrechung des arcA-Gens auf die L-Argininfermentation zu untersuchen, wurden der Stamm 237Δ arcA mit unterbrochenem arcA-Gen und der Stamm 237 als Kontrolle kultiviert, und ihre produzierten Mengen an L-Arginin wurden gemessen. Die Medien, Kulturverfahren und Analyseverfahren für die Messung sind nachstehend gezeigt. [Beurteilungsmedium für L-Arginin]

	Endkonzentration
Glucose	60 g/l (getrennt sterilisiert)
MgSO₄·7H₂O	1 g/l (getrennt sterilisiert)
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	2 g/l
Hefeextrakt	5 g/l
Thiamin	0,1 mg/l
pH 7,2
CaCO₃	25 g/l (getrennt sterilisiert)

[Kulturverfahren]
Impfkultur im Teströhrchen:
Es wurde ein Bakteriengrundstock eingeimpft.
LB-Agarmedium (ein Arzneimittel wurde nach Bedarf zugegeben), 32°C, 24 Stunden.
Hauptkultur:
Es wurde eine Platinöse Impfkultur eingeimpft.
Untersuchungsmedium für Arginin (Arzneimittel wurde nach Bedarf zugegeben), 32°C, 3 Tage.
2 ml pro Teströhrchen.
[Analyseverfahren]
Proben in einem Volumen von 500 μl wurden in Zeitabständen aus der Kulturbrühe entnommen, und die Glucosekonzentration und die L-Argininanhäufung in der Kulturbrühe wurden gemessen. Die Glucosekonzentration und die L-Argininkonzentration wurden für den Überstand der Kulturbrühe, der nach der Zentrifugation bei 15 000 UpM während 5 Minuten erhalten wurde, nach einer geeigneten Verdünnung mit Wasser unter Verwendung eines Biotech Analyzer (Sakura Seiki) und eines Amino Acids Analyser L-8500 (Hitachi Keisokuki Service) gemessen.
Die L-Argininanhäufung und die Ausbeute zu dem Zeitpunkt, an dem das Saccharid vollständig verbraucht war, sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Anhäufung und Ausbeute an L-Arginin des Stammes mit unterbrochenem arcA-Gen

Stamm Anhäufung von L-Arginin (g/l) Ausbeute an L-Arginin (%)

237 4,04 6,73

2376ΔarcA 14,8 24,7
Es wurde erkannt, daß sowohl die Anhäufung als auch die Ausbeute an L-Arginin in dem Stamm mit unterbrochenem arcA-Gen im Vergleich zum Kontrollstamm verbessert waren. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Zielsubstanz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, L-Arginin, L-Homoserin und Bernsteinsäure besteht, welches das Kultivieren eines γ-Proteobacteriums in einem Medium unter aroben Bedingungen unter Produktion und Anhäufung der Zielsubstanz in dem Medium oder den Zellen und das Gewinnen der Zielsubstanz aus dem Medium oder den Zellen umfasst, wobei das γ-Proteobacterium mit der Fähigkeit zur Produktion der Zielsubstanz so modifiziert ist, dass die Produktion des ArcA-Proteins verringert oder ausgeschaltet ist, und wobei das ArcA-Protein (A) oder (B) ist: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 32; (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 32, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von 1 bis 20 Aminosäuren, wobei die Fähigkeit des Proteobacteriums zur Herstellung der Zielsubstanz verbessert ist, wenn die Herstellung des Proteins in dem γ-Proteobacterium im Vergleich zu einem Wildtypstamm oder einem nicht modifizierten Stamm verringert oder ausgeschaltet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in (B) definierte ArcA-Protein eine Homologie von 90% oder höherer zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 32 aufweist und die Fähigkeit des γ-Proteobacterium zur Herstellung der Zielsubstanz verbessert ist, wenn die Produktion des Proteins in dem γ-Proteobacterium im Vergleich zu einem Wildtypstamm oder einem unmodifizierten Stamm verringert oder ausgeschaltet ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Produktion des ArcA-Proteins durch Störung eines ArcA-Gens auf einem Chro mosom verringert oder ausgeschaltet ist und das ArcA-Gen eine in (a) oder (b) definierte DNA ist: (a) DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 101 bis 817 der SEQ ID Nr. 31 enthält; (b) DNA, die mit der Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 101 bis 817 der SEQ ID Nr. 31 oder mit einer Sonde, die aus der Nucleotidsequenz unter stringenter Bedingung hergestellt werden kann, hybridisierbar ist und für ein Protein kodiert, das die Fähigkeit von γ-Proteobacterium zur Herstellung der Zielsubstanz verbessert, wenn die Produktion des Proteins im Vergleich zu einem Wildtypstamm oder unmodifizierten Stamm verringert oder ausgeschaltet ist, wobei die stringente Bedingung 1 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das γ-Proteobacterium ein Bakterium der Gattung Escherichia oder Pantoea ist.