CN1492038B - 通过发酵产生靶物质的方法 - Google Patents

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Abstract

使用微生物生产靶物质的方法，其包括在培养基中培养γ-蛋白细菌以在培养基或细胞中生产及积累靶物质，然后收集该靶物质，其中该方法使用到一株菌，其中的ArcA蛋白因为例如细胞中染色体上的arcA基因的损坏而不能正常发挥功能。

Description

通过发酵产生靶物质的方法
技术领域
本发明涉及一种用于发酵工业的技术，更准确地讲是一种通过利用一种微生物发酵有效产生一种例如L-氨基酸的靶物质的方法。
背景技术
细菌细胞一直在修饰其代谢途径和呼吸途径等等来适应不同的环境。在能量代谢中，Arc(有氧呼吸控制)以及Fnr(延胡索酸盐硝酸还原作用)都是已知为起到很重要作用的控制系统。其包括普遍存在于大肠杆菌以及其他类似的种群中的球形调控蛋白。前者为位于大肠杆菌染色体上的0分位点的arcA基因所编码，后者为位于大肠杆菌染色体上的29分位点的fnr基因所编码，且二者同时在一个厌氧条件下通过控制许多因子来使细胞适应一个环境。更进一步讲，其被解释为Arc A蛋白和Fnr蛋白同时为转录因子，并且其通过直接连接至靶基因的控制区域来正向或反向地控制作在厌氧环境下一个靶基因在大肠杆菌染色体上的表达(S.Iuchi et al.，Cell，665-7(1991))。
最近，编码来源于大肠杆菌的球形调控蛋白例如arcA蛋白及Fnr蛋白的基因被破裂后通过使用DNA微阵列技术被收集至一个数据库且向公众公开(http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+B)。
迄今为止，已知ArcA蛋白反向调节三羧酸循环中基因的表达(S.Iuchi et al.，Cell，66，5-7(1991))，而且三羧酸循环中基因的表达在数据库中的arcA破裂株中是增加的。另一方面，已知Fnr蛋白正向调控在厌氧环境中起到作用的呼吸途径中的基因的表达。
至于球形因子破裂株中的表达情况，dam-破裂株被提到其中TCA循环中的基因表达如同arcA破裂株一样是增加的(H.Mori，Nara Institute of science andtechnology，oral announcement at the symposium”Gene biotechnology of GenomeAge”，2001，organized by Japan Bioindustry Associateon，Resource BiotransformationStudy Group)。
Dam蛋白是涉及到胞内限制修饰系统修饰因子的一个甲基化酶，且其由存在于大肠杆菌染色体上的76分位点处的dam基因所编码(Proc，Natl，Acad，Sci.USA.，87(23)，9454-9458(1990))。
至今尚未报道有关通过球形因子例如基因arcA，fnr以及dam的表达控制来提高物质的产率。
发明内容
本发明的一个目的就是通过使用一个γ-蛋白细菌(γ-proteobacterium)例如大肠杆菌的发酵来提高一个有用物质的产率。
本发明的发明者进行了不同的研究以实现上述目的，他们发现由γ-蛋白细菌生产的物质可以通过修饰一个编码普遍存在于一个γ-蛋白细菌中的调控蛋白的基因来提高产率。那就是，他们发现能够产生靶物质的能力可以由破裂一个存在于γ-蛋白细菌中的arcA基因来提高而由此来完成本发明。
那就是，本发明提供了下述技术方案：
(1)能够产生靶物质且被修饰以致于其中的ArcA蛋白不能正常发挥功能的一种γ-蛋白细菌。
(2)如(1)所述的γ-蛋白细菌，其中的能正常发挥功能的ArcA蛋白是一个如下述(A)或(B)进行限定的蛋白：
(A)一个具有如SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的蛋白；
(B)一个包括替代，缺失，插入或增加一个或多个氨基酸且其具有与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比在γ-蛋白细菌中蛋白不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高而且具有如SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的蛋白。
(3)如(1)所述的γ-蛋白细菌，其中的能正常发挥功能的ArcA蛋白是一个具有与SEQ ID NO：32所述氨基酸序列有70％或更多同源性的蛋白且其具有与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比在γ-蛋白细菌中蛋白不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高。
(4)如(1)所述的γ-蛋白细菌，其中的能正常发挥功能的ArcA蛋白是一个具有SEQ ID NO：32所述氨基酸序列包括替代，缺失，插入或增加2-20个氨基酸且其具有与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比在γ-蛋白细菌中蛋白不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高的蛋白。
(5)如(1)～(4)之一所述的γ-蛋白细菌，其中的不能正常发挥功能的ArcA蛋白是通过在一个染色体上破裂arcA基因的方法来实现的。
(6)如(5)所述的γ-蛋白细菌，其中的arcA基因是由下述(a)或(b)定义的DNA：
(a)含有SEQ ID NO：31中的101-817核苷的核苷酸序列的DNA；
(b)与SEQ ID NO：31中的101-817核苷的核苷酸序列杂交的DNA或在严格条件下能够从所述核苷酸序列中产生且编码一个与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高的蛋白的探针。
(7)如(1)～(6)之一所述的γ-蛋白细菌，其中的细菌属于埃希氏菌属。
(8)如(1)～(7)之一所述的γ-蛋白细菌，其中的靶物质是一种L-氨基酸。
(9)如(8)所述的γ-蛋白细菌，其中的L-氨基酸选自L-赖氨酸，L-谷氨酸以及L-精氨酸。
(10)一种产生靶物质的方法，其包括在培养基中培养如(1)～(9)之一所述的γ-蛋白细菌以在培养基或细胞中产生及积累靶物质且从所述的培养基和细胞中收集靶物质。
按照本发明，当一个有用物质例如L-氨基酸通过γ-蛋白细菌产生时，其生产效率可以被提高。
附图说明
图1显示的是在WC196，WC196ΔarcA，WC196Δdam以及WC196Δfnr中的积累模式。
具体实施方式
下面，本发明将详细描述。
(1)本发明所述的γ-蛋白细菌
用于本发明的γ-蛋白细菌并不特别限制，只要它属于γ-蛋白细菌例如埃希氏菌属，肠杆菌属，泛菌属，克雷伯氏菌属，沙雷氏菌属，欧文氏菌属，沙门氏菌属，摩根氏菌属或其类似属且具有产生靶物质的能力即可。详细说，按照NCBI(生物工程学国家信息中心)分类学其被归于γ-蛋白细菌。(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)。
属于埃希氏菌属的细菌例子包括大肠杆菌等，属于肠杆菌属的细菌的例子包括成团肠杆菌，产气肠杆菌等等。
成团肠杆菌的一些种最近重新划归为成团泛菌，菠萝泛菌，斯氏泛菌成团亚种或基于16S rRNA等的核苷序列的类似物。在本发明中，或者属于肠杆菌或者属于泛菌属的细菌因此划分为γ-蛋白细菌且含有arcA基因。
当通过基因工程技术培育大肠杆菌时，可以使用到大肠杆菌K12株及其衍生物。更进一步，当使用基因工程技术培育菠萝泛菌时，菠萝泛菌株AJ13355(FERM BP-6614)，AJ13356(FERM BP-6615)以及AJ13601(FERM BP-7207)以及其衍生物可以被用到。尽管上述菌株被分离时被鉴别为成团肠杆菌，这些菌株基于如上所述的16S rRNA等的核苷序列分析重新被划分为菠萝泛菌。
本发明所述的γ-蛋白细菌可以是上述任一细菌，且是一个具有可以产生靶物质能力的细菌。“产生靶物质能力”意指可以在细胞或培养基中产生或累积靶物质的能力，其在这样一个程度上即当本发明的细菌被培养在培养基中时，靶物质可以从细胞或培养基中收集。按照本发明所要产生的靶物质并不特别限制，只要其是一个可被γ-蛋白细菌产生且通过三羧酸循环产生或者通过底物合成的物质。具体的例子包括，传统上可被γ-蛋白细菌产生的物质，例如，不同的氨基酸例如L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-谷氨酸及L-谷氨酰胺及L-精氨酸，有机酸例如L-高丝氨酸及琥珀酸等等。更进一步，本发明还能应用于尚未应用γ-蛋白细菌工业上生产的物质，其可以通过TCA循环合成的物质作为底物来合成。
作为生产L-赖氨酸的γ-蛋白细菌其可以作为一个举例的突变株其具有对L-赖氨酸类似物的抗性。该L-赖氨酸类似物是一个底物其可以抑制L氨基酸生产菌株的生长，但是当L赖氨酸共存于一个培养基中时这种抑制可以被全部或部分取消。L-赖氨酸类似物的例子包括溶菌素，赖氨酸羟氨基盐，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯己内酰胺等等。具有对这些赖氨酸类似物抗性的突变株可以通过将γ-蛋白细菌经过一个传统的人工基因诱变处理而得到。用于产生L赖氨酸的细菌株的具体例子包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参照日本专利公开的56-18596以及美国专利号4346170以及大肠杆菌VL611。在这些微生物中，通过L赖氨酸的天冬氨酸激酶的反馈抑制已被减弱。
除了上面所述的以外，还有被提到的例如随后所述的L-苏氨酸产生菌，因为L赖氨酸对天冬氨酸激酶的抑制作用其一般在L苏氨酸产生菌中被删除。
在随后所述的实施例中，WC196菌株被用作大肠杆菌的L赖氨酸产生菌。该细菌菌株通过给予对来源于大肠杆菌K-12的W3110株的AEC抗性来孵育。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，且于1994年12月6日保存于国立生物科学及人类科技研究所，科技工业代理机构且收到一个保藏号FERM P-14690(现在，该独立的管理公司，国际专利生物储藏，国立高级工业科技研究所，邮编：305-8566，CHUO DAI-6，1-1HIGASHI1-CHOME，TSUKUBA-SHI，IBARAKI-KEN，日本)。然后按照布达佩斯条约于1995年9月29日转送至国际保藏且收到一个保藏号FERM BP-5252(参照国际专利公开号WO96/17930)。
γ-蛋白细菌的L苏氨酸产生菌的例子包括大肠杆菌VKPM B-3996(RIA1867，参照美国专利5175107)，菌株MG442(参照GUSYATINER等.，GENETIKA俄国，14，PP.947-956，1978)等等。
属于γ-蛋白细菌且具有L谷氨酸产生能力的微生物的例子包括α-酮戊二酸盐脱氢酶活性缺陷或具有α-酮戊二酸盐脱氢酶活性减弱的微生物。α-酮戊二酸盐脱氢酶活性缺陷或具有α-酮戊二酸盐脱氢酶活性减弱的属于埃希氏菌属的细菌及其获取方法已描述在日本专利公开号(KOKAI)5-244970以及7-203980中。尤其是下属菌株被提到
            E.coli W3110sucA：：Kmr
            E.coli AJ12624(FERM BP-3853)
            E.coli AJ12628(FERM BP-3854)
            E.coli AJ12949(FERM BP-4881)
            E.coli W3110sucA：：Kmr是一个通过破坏E.coli W3110的α-酮戊二酸盐脱氢酶基因(这里所指为SUCA基因)而获得的菌株，其是一个α-酮戊二酸盐脱氢酶完全缺陷的菌株。
α-酮戊二酸盐脱氢酶活性缺陷或具有α-酮戊二酸盐脱氢酶活性减弱的属于γ-蛋白细菌的细菌及其获取方法已描述在日本专利公开号(KOKAI)5-244970以及7-203980中。
L-精氨酸产生的γ-蛋白细菌的例子包括大肠杆菌其中已被引入了argA基因(日本专利公开号57-5693)以及大肠杆菌株237(俄国专利号200117677)或其类似物。
L-异亮氨酸产生的γ-蛋白细菌的例子包括大肠杆菌KX141(VKPM B-4781，参照欧洲专利公开号519113)。
L-高丝氨酸产生埃希氏杆菌属的例子包括NZ10菌株，其是一个C600菌株的Leu回复突变型菌株(参照AppleyardR.K.，Genetics，39，pp.440-452，1954)。
如同产生琥珀酸的γ-蛋白细菌，使用大肠杆菌的实施例均为所知(Wang，X.，et al.，Appl.Biochem.Biotech.，70-72，919-928(1998))。
更进一步，具有L氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌可以同样通过引入具有涉及到L氨基酸生物合成的遗传信息的DNA以及利用基因重组技术来提高该能力来哺育。例如，对于产生L赖氨酸的细菌来说，可被引入的基因的例子包括，编码L赖氨酸生物合成途径的酶例如磷酸烯醇丙酮酸盐(或酯)碳酸酵素，天冬氨酸激酶，二氢二甲基吡啶合成酶，二氢二甲基吡啶还原酶，琥珀酸二氨基庚二酸盐[酯]转氨酶以及琥珀酸二氨基庚二酸盐[酯]脱酰(基)酶的基因。以通过L天冬氨酸或L赖氨酸反馈抑制的酶例如磷酸烯醇丙酮酸盐(或酯)碳酸酵素或天冬氨酸激酶以及二氢二甲基吡啶合成酶的基因为例，非常需要使用一个编码一个所述抑制被删除的酶的突变基因。
更进一步，对于产生L-谷氨酸的细菌，可被引入的基因的例子包括谷氨酸脱氢酶的基因，谷氨酰胺合成酶，谷氨酸合酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头水合酶，柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸盐(或酯)碳酸酵素，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸激酶，磷酸烯醇丙酮酸盐(或酯)合成酶，烯醇酶，磷酸甘油变位酶，磷酸甘油酸盐(或酯)激酶，甘油醛-3磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果糖二磷酸醛缩酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶等等酶的基因。
更进一步，一个可以通过从L-氨基酸生物合成途径中分支出去而催化产生一个除靶L氨基酸以外的化合物的酶的活性可能被降低或缺失，例如，这样的可以通过从L赖氨酸生物合成途径中分支出去而催化一个生产除L赖氨酸以外的化合物的酶的实施例包括高丝氨酸脱氢酶(参照国际专利申请公开号WO95/23864)。更进一步，可以通过从L天冬氨酸生物合成途径中分支出去而催化一个生产除L天冬氨酸以外的化合物的酶的实施例包括α-酮戊二酸盐脱氢酶，异柠檬酸(裂合)酶，磷酸乙酰转移酶，醋酸激酶，乙酰羟基酸合成酶，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-焦磷酸盐脱氢酶等。
在如上所述培育具有这样一个靶物质产生能力的γ-蛋白细菌时，在γ-蛋白细菌中引入一个基因以提高其能力，其可以使用一个方法其中在γ-蛋白细菌细胞中可以自动复制的载体被连接至一个基因产生一个重组DNA，且该γ-蛋白细菌使用其进行转化。此外，通过使用转导，转位子(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.1，p.417，1983)，Mu噬菌体(日本专利公开号(KOKAI)2-109985)或者同源重组(分子遗传实验，Cold spring Harbor Lab.，1972)方法将一个靶基因引入一个寄主染色体上也是可能的。更进一步，靶基因还可经过PCR产生的线性DNA破坏一个基因的方法引入(Kirill A.，Datsenko et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97(12)，6640-6645(2000))。
如上所述通过重组DNA技术培育的γ-蛋白细菌的例子包括例如，属于埃希氏杆菌属二氢二甲基吡啶合成酶活性增加的细菌具有一个L赖氨酸，天冬氨酸激酶，二氢二甲基吡啶还原酶等反馈抑制减弱的突变，其中L赖氨酸的反馈抑制被减弱以及具有L赖氨酸的产生能力(US6040160)以及属于肠杆菌Enterobacter(泛菌属)且具有增强的柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或谷氨酸脱氢酶以及具有L谷氨酸产生能力的细菌(EP0952221A2，EP0999282A2，EP1078989A2)。
用于本发明的γ-蛋白细菌是一个具有能产生上述靶物质的细菌其被修饰后ArcA蛋白在细胞中并不正常发挥功能。该表达“修饰以致于ArcA蛋白在细胞中并不正常发挥功能”意指其被修饰的结果是ArcA蛋白的功能应该被完全清除或者该功能与未被修饰的埃希氏菌属这样一个野生菌相比较是减弱的。ArcA蛋白在细胞中并不正常发挥功能的状态，可能是例如ArcA基因转录或翻译被抑制的状态，以至于该基因产品即ArcA蛋白并不产生或其产量减少，或者这样一个状态其产生的ArcA蛋白发生突变，因此ArcA蛋白的正常功能被减弱或消除。ArcA蛋白在细胞中并不正常发挥功能的γ-蛋白细菌的例子通常包括在染色体上ArcA基因通过遗传重组技术被破坏的这样一个基因损坏株，或者这样一个突变株其中染色体上的ArcA基因的表达调控序列或编码区域被突变并因此功能性的ArcA蛋白不再产生。
用于培育本发明细菌的野生菌或未修饰株中含有的ArcA蛋白包括，例如，一个具有如SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的蛋白。更进一步，ArcA基因的例子包括具有如SEQ ID NO：31所述核苷酸序列的DNA，此外，该基因含有这样的序列其中密码子使用另一个相等的密码子替换。在本发明中，词组“编码一个蛋白的DNA”意指该DNA是一个双链任一条链均编码该蛋白。
更进一步，野生菌或未修饰株中含有的ArcA蛋白并不特便限制于野生型蛋白，其可以含有替代，缺失，插入或增加或一个或多个氨基酸残基的类似活动以至于蛋白具有ArcA蛋白的活性。尽管数字“几个”氨基酸残基这儿所指根据氨基酸残基在蛋白三维结构中所处的位置或残基的类型不同而不同，其一般指2-30，优选是2-20，更优选为2-10。
上述“ArcA蛋白的活性”是指当蛋白与正常情况下相比较不能发挥正常功能时可以提高产生靶物质的能力的活性，换句话讲，ArcA蛋白的活性意指修饰的γ-蛋白细菌并不能正常发挥功能的蛋白其与未修饰的γ-蛋白细菌(例如野生菌)相比较在培养基中产生及积累大量的靶物质。大肠杆菌的野生菌株的例子包括K12株及其衍生株例如大肠杆菌MG1655株(ATCC47076)以及W3110株(ATCC 27325)。更进一步，菠萝泛菌(成团肠杆菌)包括AJ13355(FERMBP-6614)，AJ13356(FERM BP-6615)以及AJ13601(FERM BP-7207)。
上述氨基酸残基的替代，缺失，插入，增加，倒置或其类似活动还包括由于含有ArcA蛋白的微生物的个体差异，种属差异等自然发生的突变或者变异。
如上所述的ArcA基因的突变或变异的例子包括杂交于一个含有SEQ IDNO：31的101-817核苷位点的序列的核苷序列的DNA或一个能在严谨条件下从所述核苷序列中产生的探针且编码一个具有与ArcA有类似活性的蛋白。这儿所使用的“严谨条件”是指在这样的一个环境下其所谓的特异杂交形成或非特性性杂交并不产生。很难使用数值来清楚表达该条件。然而严谨条件是可以例证的，例如具有50％或更高，优选是70％或更高，更优选是80％或更高同源性的DNA相互之间杂交，但是具有同源性低于上述数值的DNA分子之间并不杂交的条件。更具体地讲，严谨条件可以例为在一个相对于普通环境中southernhybridization的盐浓度DNA分子之间的杂交，也就是说，1×SSC，0.1％SDS，更优选是60℃下0.1×SSC，0.1％SDS。
作为一个探针，核苷序列SEQ ID NO：31部分序列同样可被用到，该探针可以通过使用基于SEQ ID NO：31的核苷序列的寡聚核苷酸作为引物及含有SEQ ID NO：31的核苷序列的DNA片段作为模板通过PCR来准备。当一个具有大约300bps的DNA片段被用作探针时，杂交的洗涤条件可能是50℃下2×SSC，0.1％SDS。
随后所使用到的arcA基因或ArcA蛋白并不限于那些具有如SEQ IDNO：31或32所示的核苷酸或氨基酸序列的基因或蛋白，但是包括其突变株或同源株，作为同源株的一个例子菠萝泛菌的arcA基因的核苷序列或ArcA蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：19及20。
本发明所述的细菌是经过修饰的细菌其中ArcA蛋白并不正常发挥功能，具体讲，一个γ-蛋白细菌其arcA基因被破坏，例如该细菌可通过使用遗传重组技术通过同源重组(Experiments in Moleculor Genetics，COLD SPRING HARBORLaboratory PRESS(1972)；MATSUYAMA，S AND MIZUSHIMA，S.，J.BACTERIOL。，162，1196(1985))在染色体上用一个并不正常发挥功能的arcA基因(这儿所指为“破坏的arcA基因”)取代arcA基因而获得。
同源重组的机理如下所述；当一个载有与染色体序列同源的序列的质粒或其类似物被引入一个相应的细菌细胞时，重组就在同源序列的某一位点以一定频率发生，从而引入的质粒整体加入至染色体上。然后，通过在染色体上同源序列位点再次发生重组质粒被从染色体上移除。然而根据重组位点的不同，在原始的正常的基因随着质粒被从染色体上移除的同时破坏的基因仍存在于染色体上。通过选择这样一个细菌株可以获得正常的arcA基被破坏的arcA基因所取代的菌株。
基于同源重组技术的基因破坏技术已经建立，以及一个使用线性DNA的方法，一个使用温度敏感质粒或其类似物的方法可被用到。arcA基因可通过使用一个含有插入了一个标记基因例如药物抗性基因的arcA基因的质粒而破坏，且不能在靶微生物细胞中复制。那就是，在一个已使用该质粒转化且由此获得药物抗性的转化子中，标记基因已整合进入染色体DNA中去。非常有可能该靶基因已通过存在于该染色体上的这些基因标记的两侧arcA基因的同源重组而整合，并由此可以有效选择一个基因破坏的菌株。
在埃希氏菌属中发挥功能的温度敏感性质粒的例子包括pMAN997(国际专利号WO99/03988)，pHSG415，pHSG422(Hashimoto-Gotoh，T.et al，Gene，16，227-235(1981))以及等等。
具体地讲，用于基因破坏的arcA基因可使用限制性酶切通过删除及再连接arcA基因上某一区域而获得，以及通过插入另一个DNA片段(标记基因，等)至arcA基因，或通过定点诱变引入在一个arcA基因编码区，启动区或其类似区域的核苷序列的一个或多个核苷的取代，缺失，插入，增加或倒置而获得(Kramer，W.and Frits，H.J.，酶学方法，154，350(1987))或使用化学试剂例如硫代硫酸钠及羟胺处理或其类似方法而得到(Shortle，D.及Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))，因此被编码的抑制子的活性应该减弱或消除。在这些方法中，考虑到可信赖性及稳定性，使用限制性酶切通过删除及再连接arcA基因上某一区域或通过插入另一个DNA片段至arcA基因是优选的。
arcA基因序列本身已知，因此arcA基因通过基于该序列的PCR方法或杂交方法可以轻易获得。用于基因破坏的arcA基因应有一定程度的同源性由此可致靶细菌中含有的arcA基因可与其发生同源重组。更确切地说，该同源性一般为70％或更多，优选为80％或更多，最优选为90％或更多。
使用Southem blotting方法或PCR方法分析染色体上的基因而证实靶基因的破坏。
用于本发明的获取不同基因的方法，杂交，PCR，质粒DNA的准备，DNA的消化及连接，转化等等描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，Cold Spring Harbor Lab Press，1.21(1989))。
另外，功能性ArcA蛋白不再产生的突变株可以通过将γ-蛋白细菌置于紫外照射或使用常规的突变试剂例如N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理而得到。
通过培养一个具有产生靶物质能力的γ-蛋白水解微生物并对此进行修饰以致于ArcA蛋白不再正常发挥功能。其可以通过上述方法而获得。在一个产生及积累培养基或细胞的靶物质的培养基中从其中收集靶物质并由此而获得。按照本发明，靶物质的生产效率可以通过使用具有上述特征的γ-蛋白细菌而提高。据估计，arcA基因在培养过程中具有arcA基因的野生株γ-蛋白细菌中进行表达而在涉及到TCA循环中抑制了该基因的表达，其中在一个菌株中ArcA蛋白不再正常发挥功能。该TCA循环中基因表达的抑制被取消并由此而获得上述效果。
用于本发明的培养基可以是含有碳、氮、无机离子源及其它有机成分的普通的培养基。至于碳源，可以是糖类例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯醣，麦芽糖，木糖，海藻糖，核糖以及淀粉水解产物，醇类例如甘油，甘露醇以及山梨(糖)醇以及有机酸例如葡萄糖酸，富马酸，柠檬酸以及琥珀酸。至于氮源，可用到无机铵盐例如硫酸铵，氯化铵，以及磷酸铵，有机氮例如大豆蛋白水解产物，氨气，氨水等等。至于痕量有机营养物，优选加入所需物质例如维他命例如VB1，核酸例如腺嘌呤及RNA或酵母抽提物或其类似物加入至培养基中合适的含量。除上之外，磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等等以小量加入至培养基中去。
培养可在传统已知的条件下进行，其主要依赖所使用到的微生物菌株。例如，培养最好是在有氧环境下16-72小时连续进行。培养温度最好控制在30-45℃，pH值优选在4.5-8，无机或有机酸或碱例如氨气等等可用于进行pH值的调整。
对于从培养基及细胞中收集靶物质，本发明并未限制特别的方法。那就是说可用传统已知技术例如使用离子交换树脂，沉降及依赖于靶物质特征的其它技术结合进行。更进一步，细胞中积累的靶物质可被收集，在细胞被物理性或酶学破坏之后，依赖于靶物质从细胞抽提物中或膜碎片中收集。更进一步，依赖于靶物质，含有靶物质的细胞被用作微生物的催化剂或其类似物。
实施例
下面，本发明将通过实施例进行详细解释。
实施例1：大肠杆菌的arcA，dam以及fnr基因的破坏
大肠杆菌K-12株基因组DNA的核苷全序列已知(Blattner F.R.，Plunkett G.，Bloch C.A.et al.，Scince，227，1453-1474(1997)；ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz).基于arcA，dam及fnr基因的已知核苷酸序列，可以生产每一株arcA，dam及fnr基因的基因破坏株。在下面的步骤中，QIAGEN-Genomic-Tip系统(由QIAGEN生产)用于进行基因组DNA的抽提。
(1)大肠杆菌(E.coli)的arcA基因的破坏
基于报道的arcA基因的核苷序列进行合成引物，使用的MG1655株的基因组DNA作为模板通过PCR技术扩增arcA基因的C-及N-末端片段。Pyrobest DNA多聚酶(由Takara Shuzo公司生产)被用于进行PCR并按照所附指导进行PCR的操作。引物1及引物2被用于进行扩增N-末端片段的PCR的引物，引物3及引物4被用于进行扩增C-末端片段的引物，引物1被设计含有一个HindIII酶切位点，引物4被设计含有一个XbaI酶切位点。
引物1：cccaagcttaaagccctttacttagctta(其与Genbank序列号AE000510的核苷序列的5482-5501核苷位点互补且在5’末端增加了一个CCC以及HindIII位点的序列，SEQ ID NO：1)
引物2：tccgcgccatctgtcgcttc(其与Genbank序列号AE000510的核苷序列的4851-4870核苷位点的序列，SEQ ID NO：2)
引物3：gaagcgacagatggcgcggaaaagctacaagttcaatggt(其与Genbank序列号AE000510的核苷序列的4541-4560核苷位点互补且在5’末端增加了一个与Genbank序列号AE000510的核苷序列的4851-4870核苷位点互补的序列，SEQID NO：3)
引物4：gggtctagaggttgaaaaataaaaacggc(其与Genbank序列号AE000510的核苷序列的4188-4207核苷位点且在5’末端增加了一个ggg以及XbaI位点的序列，SEQ ID NO：4)
PCR之后，扩增的DNA片段使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由QIAGEN生产)进行纯化。纯化的N-末端及C-末端DNA片段，引物1及引物4被用于进行交叉PCR反应(A.J.Link，D.Phillips，G.M.Church，Journal of Bacteriology，179，6228-6237(1997))以获取一个破坏的arcA基因。纯化的DNA片段使用HindIII以及XbaI(由Takara Shuzo公司生产)进行消化并进行苯酚/氯仿处理以及进行乙醇沉降。该片段使用温度敏感性质粒pMAN997(国际专利申请号WO99/03988)进行连接，同时使用DNA连接试剂盒Ver2(由Takara Shuzo公司生产)进行HingIII以及XbaI消化。JM109有能力细胞(由Takara Shuzo公司生产)使用该连接子溶液进行转化并使用一个含有25μg/ml氨苄的LB琼脂模板(由SIGAM公司生产)(LB+氨苄模板)。细胞在30℃下培养1天，生产的菌落在一个含有25μg/ml氨苄的LB培养基中在30℃下培养，使用一个自动质粒抽提仪PI-50(由KuraboIndustries生产)进行质粒抽提。所获质粒使用HindIII以及XbaI进行消化并进行琼脂糖凝胶电泳。插入靶片段的质粒被消化为质粒pMAN_ΔarcA进行arcA基因的破坏。上述pMAN997是一个通过交换pMAN031的VspI-HindIII而获得质粒(S.Matsuyama和S.Mizushima，J.Bacteriol.，162，1196(1985))以及pUC19(TakaraShuzo公司生产)。
大肠杆菌WC196株使用质粒pMAN_ΔarcA按照C.T.Chung等所述方法进行转化，在LB+氨苄平板上在30℃下挑选菌落，挑选的菌落在30℃下过夜培养作为液体培养物，然后培养肉汤被稀释至10-3浓度且在LB+氨苄平板上平铺并在42℃下挑选菌落。挑选的菌落在30℃下在LB+氨苄平板上培养，然后悬浮平板上1/8的细胞在2ML LB培养基中并在42℃下振荡培养4-5小时。培养肉汤被稀释至10-5浓度并转移至LB平板上，数百个所获菌落同时接种在LB以及LB+氨苄平板上进行培养，然后挑选氨苄敏感性菌株。对数个氨苄敏感性菌株进行PCR以证实arcA基因的缺失。以这种方式就可获得源自大肠杆菌WC196，WC196ΔarcA的arcA基因破坏株。
(2)大肠杆菌的dam基因的破坏
如(1)同样的方式从WC196株中获取dam基因破坏株。
基于报道的dam基因的核苷序列进行合成引物，dam基因的C-及N-末端片段通过使用大肠杆菌的MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增。引物5及引物6被用于进行扩增N-末端片段的PCR的引物，引物7及引物8被用于进行扩增C-末端片段的PCR的引物，引物5被设计含有一个HindIII酶切位点，引物8被设计含有一个XbaI酶切位点。
引物5：cccaagcttccgtggtatgtcctggtttc(其与Genbank序列号AE000414的核苷序列的5150-5169核苷位点互补且在5’末端增加了一个CCC以及HindIII位点的序列，SEQ ID NO：5)
引物6：agactgatcaggtcgctatt(其与Genebank序列号AE000414的核苷序列的4741-4760核苷位点的序列，SEQ ID NO：6)
引物7：aatagcgacctgatcagtctgccttatgcaccgctgtctg(其与Genbank序列号AE000414的核苷序列的4361-4380核苷位点互补且在5’末端增加了一个与Genebank序列号AE000414的核苷序列的4741-4760核苷位点序列互补的序列，SEQ ID NO：7)
引物8：gggtctagacgtcagattgggaacatagt(其与Genbank序列号AE000414的核苷序列的3931-3950核苷位点序列互补且在5’末端增加了一个ggg以及XbaI位点的序列，SEQ ID NO：8)
PCR之后，扩增的DNA片段各自使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由QIAGEN生产)进行纯化。纯化的N-末端及C-末端DNA片段，引物5及引物8被用于进行交叉PCR反应以获取一个缺陷型dam基因片段。以与(1)相同的方式进行下述操作以获取一个dam破坏株WC196Δdam。
(3)大肠杆菌的fnr基因的破坏
如(1)同样的方式从WC196株中获取fnr基因破坏株。
基于报道的fnr基因的核苷序列进行合成引物，fnr基因的C-及N-末端片段通过使用大肠杆菌的MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增。
引物9及引物10被用于进行扩增N-末端片段的PCR的引物，引物11及引物12被用于进行扩增C-末端片段的PCR的引物，引物9被设计含有一个HindIII酶切位点，引物12被设计含有一个XbaI酶切位点。以与(1)相同的方式从WC196株中获取一个fnr破坏株。
引物9：cccaagcttgcaattgggccgtcctggcg(其为Genbank序列号AE000231的核苷序列的7981-8000核苷位点互补且在5’末端增加了一个CCC以及HindIII位点的序列，SEQ ID NO：9)
引物10：tcaagctgatcaagctcatg(其与Genbank序列号AE000231的核苷序列的7501-7520核苷位点的序列，SEQ ID NO：10)
引物11：caggagttgatcagcttgagaaaaatgccgaggaacgtc(其与Genbank序列号AE000231的核苷序列的7121-7140核苷位点互补且在5’末端增加了一个与Genebank序列号AE000231的核苷序列的7501-7520核苷位点序列互补的序列，SEQ ID NO：11)
引物12：gggtctagattggtcgtcctggttaggat(其与Genbank序列号AE000231的核苷序列的6671-6690核苷位点序列互补且在5’末端增加了一个ggg以及XbaI位点的序列，SEQ ID NO：12)
PCR之后，扩增的DNA片段使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由QIAGEN生产)进行纯化。纯化的N-末端及C-末端DNA片段，引物9及引物12被用于进行交叉PCR反应以获取一个缺陷型dam基因片段。以与(1)相同的方式进行下述操作以获取一个Fnr破坏株WC196ΔFnr。
实施例2：arcA基因的破坏对于在大肠杆菌株中生产L赖氨酸的影响
arcA基因破坏株，WC196ΔarcA株，dam基因破坏株，WC196Δdam株，fnr基因破坏株，WC196ΔFnr株，以及母系株WC196被培养，测定其L赖氨酸的产量。下面描述了培养基，培养方法及测定的分析方法。
[碱性培养基：E-100培养基]
                     最终浓度
葡萄糖               10g/L(单独灭菌)
NH4Cl                20mM
NaHPO4               40mM
KH2PO4               30mM
CaCl2                0.01mM
FeSO4                0.01mM
MnSO4                0.01mM
柠檬酸               5mM
盐酸硫胺素           2mM(单独灭菌)
酪蛋白氨基酸，       2.5g/L(单独灭菌)
MES-NaOH(pH6.8)     50mM(单独灭菌)
[培养方法]
更新培养基：
接种常备细菌。
LB琼脂培养基(按需加入药剂)，37℃，24小时。
种子培养：更新培养基后细菌以体积为2ML接种至LB培养基中。
LB培养基(按需加入药剂)，37℃，过夜
主要培养：
接种平板种子培养液中1/16的细菌。
E-100培养基(按需加入药剂)，37℃，体积20ml在一个500ml体积的Sakaguchi烧瓶中。
[分析方法]
肉汤培养基在一个时间段中以500μl加样，测定肉汤中的葡萄糖浓度以及积累的L赖氨酸浓度，在15000rpm转下离心5分钟后所获肉汤培养基的上清使用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)用水稀释至一个合适的浓度测量葡萄糖浓度以及积累的L赖氨酸浓度，结果显示在图1中。
作为结果，可以看到，fnr基因破坏菌株与对照菌株相比L赖氨酸的累积量是一样的，而dam基因破坏菌株与对照菌株相比L赖氨酸的累积量减少，另一方面，发现arcA基因破坏菌株与对照菌株相比L赖氨酸的累积量是增加的。
实施例3：arcA基因的破坏对于在大肠杆菌株中生产L谷氨酸的影响
既然在实施例2中发现arcA基因的破坏L赖氨酸的累积量是增加的效果，使用该实施例可以证明arcA基因的破坏对于L谷氨酸的产量的影响。
为了证实arcA基因缺陷对于在大肠杆菌MG1655株中L谷氨酸产量的影响效果，进行构建大肠杆菌MG1655衍生的sucA以及arcA双重缺陷株(MG1655ΔsucAΔarcA)。
(1)大肠杆菌的sucA基因的破坏
以与实施例1相同的方式从MG1655株产生一个SucA基因缺陷株。
基于报道的sucA基因的核苷序列进行合成引物，sucA基因的C-及N-末端片段通过使用大肠杆菌的MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增。
引物13及引物14被用于进行扩增N-末端片段的PCR引物，引物15及引物16被用于进行扩增C-末端片段的PCR引物，引物13被设计含有一个HindIII酶切位点，引物16被设计含有一个XbaI酶切位点。以与(1)相同的方式从MG1655株中获取一个sucA破坏株。
引物13：cccaagcttctgcccctgacactaagaca(其与Genbank序列号AE000175的核苷序列的10721-10740核苷位点互补且在5’末端增加了一个CCC以及HindIII位点的序列，SEQ ID NO：13)
引物14：cgaggtaacgttcaagacct(其与Genbank序列号AE000175的核苷序列的11501-11520核苷位点互补的的序列，SEQ ID NO：14)
引物15：aggtcttgaacgttacctcgatccataacgggcagggcgc((其与Genbank序列号AE000175的核苷序列的12801-12820核苷位点互补且在5’末端增加了一个与Genbank序列号AE000175的核苷序列的10501-11520核苷位点的序列，SEQ IDNO：15)
引物16：gggtctagaccactttgtcagtttcgatt((其与Genbank序列号AE000175的核苷序列的13801-13820核苷位点序列互补且在5’末端增加了一个ggg以及XbaI位点的序列，SEQ ID NO：16)
PCR之后，扩增的DNA片段各自使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由QIAGEN生产)进行纯化。纯化的N-末端及C-末端DNA片段，引物13及引物16被用于进行交叉PCR反应以获取一个缺陷型sucA基因片段。以与(1)相同的方式进行下述操作以获取一个sucA破坏株MG1655ΔsucA。
(2)大肠杆菌的sucA及arcA基因双重缺陷株的制备
以实施例1相同的方式，MG1655ΔsucA的arcA基因被破坏以准备一个sucA及arcA基因双重缺陷株(MG1655ΔsucAΔarcA)。
类似地，也可产生sucA及dam基因双重缺陷株(MG1655ΔsucAΔdam)以及sucA及fnr基因双重缺陷株(MG1655ΔsucAΔFnr)。
为了测试arcA基因破坏对于L谷氨酸发酵的影响效果，这些基因的双重缺陷株，MG1655ΔsucAΔarcA，MG1655ΔsucAΔdam以及MG1655ΔsucAΔfnr株以及sucA基因缺陷株，MG1655ΔsucA，作为一个对照被培养，以及测量L谷氨酸产量。下面描述了培养基，培养方法及测定的分析方法。
[碱性培养基：MS培养基]
                       最终浓度
葡萄糖                 40g/L(单独灭菌)
MgSO4·7H2O          　1g/L(单独灭菌)
NH4)2SO4                  16g/L
KH2PO4                 1g/L
酵母抽提液             2g/L
FeSO4                  0.01g/L
MnSO4                  0.01g/L
CaCO3                  30g/L(单独灭菌)
[培养方法]
更新培养基：
接种常备细菌。
LB琼脂培养基(按需加入药剂)，37℃，24小时。
在试管中种子培养：更新培养基后接种细菌。
LB液体培养基(按需加入药剂)，37℃，16小时
主要培养：
接种种子培养液的10％液体培养基。
MS液体培养基(按需加入药剂)，37℃，体积20ml在一个500ml体积的Sakaguchi烧瓶中。
[分析方法]
肉汤培养基在一个时间段中以500μl加样，测定肉汤中的葡萄糖浓度以及积累的L谷氨酸浓度，在15000rpm转下离心5分钟后所获肉汤培养基的上清液用水稀释至一个合适的浓度使用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)测量葡萄糖浓度以及积累的L赖氨酸浓度，糖类被耗尽时L谷氨酸积累及产生的点的结果显示在表1中。
表1：SucA及arcA破坏株中L谷氨酸的累积及产生
 
菌株 L-谷氨酸的累积(g/L) L-谷氨酸的产量(％)
MG1655ΔsucA 15.4 36.9
MG1655ΔsucAΔarcA 17.0 41.7
MG1655ΔsucAΔdam 14.2 35.5
MG1655ΔsucAΔfnr 14.6 36.6
作为结果，可以看到，sucA及dam基因同时破坏菌株与对照菌株相比，L谷氨酸的累积量及产量是稍微降低的，且其与sucA及Fnr基因同时破坏菌株对照相比基本相当，另一方面，发现sucA及arcA基因破坏菌株与对照菌株相比L谷氨酸的累积量及产量是增加的。
实施例4：菠萝泛菌中arcA基因的破坏
<1>菠萝泛菌中arcA基因的获得
(1)在一低pH值条件下能产生L谷氨酸的菠萝泛菌的构建
ArcA是一个普遍存在于大肠杆菌及其他相关菌株中的球形调控子。使用一个属于泛菌属的微生物菠萝泛菌AJ13601，其与大肠杆菌相关。基于大肠杆菌arcA基因的已知核苷序列获得菠萝泛菌的arcA基因。菌株AJ13601如下获得(参照EP 1 078 989 A2).菌株AJ13355分离自日本Iwata-shi，Shizuoka的土壤，其为一个菌株其可以在含有L谷氨酸及碳源的低pH条件下生长。从菌株AJ13355中，选择菌株SC17作为一个低粘液生产的突变株，其展现出良好的生长。菌株SC17sucA，其中的α-酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)基因被破坏，其构建自SC17菌株。对于菌株SC17sucA，含有一个柠檬酸合成酶基因(gltA)的质粒pSTVCB源自乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(pSTVCB)，且该含有gltA的质粒RSFCPG，磷酸烯醇丙酮酸碳酸酵素基因(ppc)以及源自大肠杆菌的谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)被引入。从所获得的转化子中，菌株AJ13601被挑选为在一个低pH值条件下对高浓度L谷氨酸有增加抗性的菌株。菌株AJ13601被保藏在生物科学及人类工业国立研究所以及工业科技代理所(现在，一个独立的管理公司，国际专利生物保藏，国立高等工业科技研究所ChuoDai-6，1-1Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466)于1999年8月18日，其保藏序列号为FERM P-17516，然后按照布达佩斯条约于2000年7月6日该保藏被转送至国际保藏并取得一个序列号FERM BP-7207(参照EP1078989A2)。
(2)菠萝泛菌AJ13601株arcA基因的获得
菠萝泛菌AJ13601株的基因组DNA可使用QIAGEN-Genomic-tip系统(由QIAGEN生产)进行抽提。通过PCR使用基因组DNA作为模板及下述寡聚核苷作为引物，获得含有arcA基因ORF的759bp的DNA片段。Pyrobest DNA聚合酶(由Takara Shuzo生产)被用于PCR，且按照所附的指导进行PCR.引物17及18被用于进行PCR扩增的引物。引物17被设计成含有一个EcoRI酶切位点，引物18被设计成含有一个SphI酶切位点。
引物17：cccgaattccctgtttcgatttagttggc(其与Genbank序列号AE000510的核苷序列的4980-4999核苷位点互补且在5’末端增加了一个EcoRI位点的序列，SEQIDNO：17)
引物18：cccgcatgcgattaatcttccagatcacc(其与Genbank序列号AE000510的核苷序列的4245-4264核苷位点相同且在5’末端增加了一个SphI位点的序列，SEQID NO：18)
所获得的DNA片段按照转录方向的正向通过使用设计在引物中的lacZ基因的EcoRI及SphI酶切位点被插入至一个克隆载体pSTV29(由Takara Shuzo生产)以获得pSTV29_EaarcA.克隆的核苷序列显示如SEQ ID No：19.由ORF编码的推导的氨基酸序列显示于SEQ ID No：20中.所获得的ORF显示出与大肠杆菌的ArcA基因的大约有81.2％的核苷序列同一性以及大约92.1％的氨基酸序列的同一性。这样ORF被认为是编码菠萝泛菌ArcA的基因。
<2>菠萝泛菌arcA基因的破坏
菠萝泛菌株G106S被用于进行构建菠萝泛菌的arcA基因破坏株。AJ13601株中含有两个质粒RSFCPG以及pSTVCB，而在G106S株中仅含有RSFCPG而并没有pSTVCB.arcA基因破坏株从G106S株中进行构建，然后pSTVCB被引入至一个所获得的基因破坏株中以得到一个AJ13601的arcA基因破坏株。下面将详细描述其操作。
(1)用于arcA基因破坏的共轭转移的质粒的构建
使用传统繁殖方法用一个温度敏感性质粒在染色体上重组对于菠萝泛菌重组程序来说并不简单，因为其很难在42℃下生长的特点。因此，使用共轭转移的染色体重组技术被用于进行该实验。对于共轭转移方法，有必要构建一个质粒其并不含有菠萝泛菌的复制起始区(ori)，那就是说，一个并不复制菠萝泛菌的质粒这样，oriR6K以及mobRP4区域通过PCR进行扩增，其使用引物21及22，以及一个Tn5转移质粒，pUT/miniTn5-Cm(Lorenzo V.，et al.，Journal ofBacteriology，172，6568-(1990)；Herrero M.，et al.，Journal ofBacteriology，172，6557(1990))作为模板。此外，含有多克隆位点及氯霉素抗性基因的片段通过使用引物23及24及pHSG399作为模板用PCR法进行扩增。每一个所获得的扩增的片段使用BglII(由Takara Shuzo生产)进行消化，然后使用DNA连接试剂盒ver.2(由Takara Shuzo生产)连接该片段。
然后，E Coli株S17-1λpir(R.Simon.，et al.，BIO/TECHNOLOGYNOVEMBER1983，784-791(1983))使用结合混合物进行转化，并将其转移至含有30μg/ml的氯霉素的LB琼脂平板上。在37℃下培养1天，出现的菌落在含有30μg/ml的氯霉素的LB培养基中在37℃的在试管中培养。使用QIAprep Mini Spincolumn试剂盒(由QIAGEN生产)从每一个培养物中获得质粒。获得的质粒使用BglII进行消化，具有BglII唯一识别部位的质粒被称为共轭转移的质粒，pUT399Cm。
引物21：tcatagatcttttagattgatttatggtgc(SEQ ID NO：21)
引物22：ccacagatctaattcccatgtcagccgtta(SEQ IDNO：22)
引物23：ataaagatctgtgtccctgttgataccggg(SEQ IDNO：23)
引物24：ggggagatcttgcaaggcgattaagttggg(SEQIDNO：24)
然后，在pUT399Cm中引入一个卡那霉素抗性基因并按照下述程序从质粒中删除氯霉素抗性基因。使用引物25及26和pMW219(由Nippon Gene生产)作为模板通过PCR对卡那霉素抗性基因进行扩增。Pyrobest DNA聚合酶(由TakaraShuzo生产)被用于进行PCR，且按照所附的指导进行PCR.在5′末端的Bg1II位点增加引物25及26。所获得的DNA片段以及pUT399使用BglII(由Takara Shuzo生产)进行消化，并使用DNA连接试剂盒ver.2(由Takara Shuzo生产)进行连接。
然后，大肠杆菌株S17-1λpir(R.Simon.，et al.，BIO/TECHNOLOGYNOVEMBER1983，784-791(1983))使用连接混合物进行转化并转移至一个含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板(LB+卡那霉素平板)上。经过在37℃下培养1天，所出现的菌落在37℃的试管中在含有25μg/ml的卡那霉素的LB培养基中培养。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由QIAGEN生产)从每一培养物中获取质粒。所获得质粒使用BglII进行消化，并进行琼脂糖凝胶电泳，插入靶片段的质粒被命名为pUT399CmKm。
引物25：cccagatctagttttcgccccgaagaacg(SEQ ID NO：25)
引物26：cccagatctccagagtcccgctcagaaga(SEQ ID NO：26)
然后，氯霉素抗性基因从pUT399CmKm中如下所述进行删除。pUT399CmKm使用HindIII(由Takara Shuzo生产)进行消化并使用DNA连接试剂盒ver.2(由TakaraShuzo生产)进行连接。大肠杆菌株S17-1λpir(R.Simon.，et al.，BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER1983，784-791(1983))使用连接混合物进行转化并转移至一个含有25μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板(LB+卡那霉素平板)上。经过在37℃下培养1天，所出现的菌落在含有25μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板及含有30μg/ml氯霉素(由Sigma生产)的LB琼脂平板在37℃下培养，一株显示出对氯霉素的敏感性。该菌株在含有25μg/ml的卡那霉素的LB培养基中37℃下培养一天并使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由QIAGEN生产)从培养物中获取质粒。所获得的质粒命名为pUT399km。
基于如上<1>所获得的arcA基因的核苷序列进行引物准备，使用引物以及pSTV29_EaarcA作为模板对arcA基因的N-末端及C-末端片段进行扩增。PyrobestDNA聚合酶(由TakaraShuzo生产)被用于进行PCR，且按照所附的指导进行PCR。引物27及28被用于进行PCR引物扩增N-末端片段，引物29及30被用于进行PCR扩增的引物扩增C-末端片段。引物27被设计含有一个EcoRI酶切位点，引物30被设计含有一个SphI酶切位点。
引物27：cccgaattcgcgaccgatggtgcagagat(SEQ ID NO：27)
引物28：aaggcaaattcatggtgcgc(SEQ ID NO：28)
引物29：gcgcaccatgaatttgccttacccaatgaagagcgtcgcc(SEQ ID NO：29)
引物30：cccgcatgcaccttcgccgtgaatggtgg(SEQ ID NO：30)
PCR之后，扩增的DNA片段各自使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由QIAGEN生产)进行纯化。纯化的N-末端及C-末端DNA片段，引物27及引物30被用于进行交叉PCR反应(A.J.Link，D.Phillips，G.M.Church，Journal ofBacteriology，179，6228-6237(1997))以获取一个破坏的arcA片段。
纯化的DNA片段使用EcoRI及SphI(由Takara Shuzo公司生产)进行消化并进行苯酚/氯仿处理以及进行乙醇沉降。该片段使用一个同样使用EcoRI及SphI消化的质粒pUT399Km通过应用DNA连接试剂盒Ver2(由Takara Shuzo公司生产)进行连接。大肠杆菌株S17-1λpir(R.Simon.，et al.，BIO/TECHNOLOGYNOVEMBER1983，784-791(1983))使用连接混合物进行转化，然后转移至一个含有25μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上。经过在37℃下培养1天，所出现的菌落在含有25μg/ml的卡那霉素的LB培养基中在试管中37℃下培养。使用QIAprep Spin Miniprep柱试剂盒(由QIAGEN生产)从培养物中获取质粒。所获得质粒使用EcoRI以及SphI进行消化，并进行琼脂糖凝胶电泳，插入靶片段的质粒因为arcA的破坏被命名为pUT399KmΔarcA。
(2)通过共轭转移进行菠萝泛菌的arcA基因的破坏
使用上面提到的pUT399KmΔarcA通过同源重组方法进行基因破坏。菌株G106S被用作质粒输出株。使用含有5g/L葡萄糖(由Junsei Kagaku生产)，5g/L酵母抽提液(由Difco生产)，10g/L Trypotone-Peptone(Difco)，10g/L NaCl(JunseiKagaku)，6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，1g/LNH4Cl以及1.5g/LCaCl2-2H2O(下称″LBG-M9培养基″)并增加有25μg/mL四环素，25μg/mL卡那霉素及琼脂(下称″LBG-M9+Tet+Km″平板)的培养基进行筛选。在琼脂培养基中，含有pUT399KmΔarcA整合在其染色体上的菌株G106S被挑选为一个单重组菌株，也就是说，arcA基因破坏株，既然源自pUT399的质粒如上所述不能在菠萝泛菌中复制。使用pUT399KmΔarcA转化大肠杆菌株S17-1λpir(R.Simon.，etal.，BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER1983，784-791(1983))并将其转移至含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。培养后，所获得的转化子大肠杆菌S17-1λpir/pUT399Km_aarcA，在含有25μg/mL四环素的LBG-M9培养基中在37℃下培养1天。此外，菌株G106S被培养在含有25μg/mL四环素的LBG-M9培养基中在34℃下培养1天。每一培养基被离心，所获得的细胞悬浮在50μl LB培养液中。混合每一悬浮液25μl并在室温下在LBG-M9琼脂培养基中培养一小时。随后，在34℃下连续培养3小时以致共轭转移。然后培养的细胞稀释至10-1，10-2或10-3浓度，然后应用至LBG-M9+Tet+Km平板且挑选对四环素及卡那霉素抗性的菌株。在所挑选的菌株中进行一些菌株的PCR以证实arcA基因的删除。这样，源自G106S，G106SΔarcA的arcA破坏株就可获得。
(3)pSTVCB引入G106SΔarcA以及L谷氨酸的生产
菌株G106SΔarcA使用pSTVCB进行转化。所获得的转化株G106SΔarcA/pSTVCB与上述提到的AJ13601(AJ13601ΔarcA)的arcA基因破坏株是等价的。菌株G106SΔarcA/pSTVCB以及菌株AJ13601作为对照被培养，测量其L谷氨酸产量。培养基，培养方法及分析方法如下所述。
[L谷氨酸的评价培养基]
                  最终浓度
蔗糖              30g/L(单独灭菌)
MgSO4·7H2O        0.5g/L(单独灭菌)
NH4)2SO4           20g/L
KH2PO4             2g/L
酵母抽提液         2g/L
FeSO4              0.02g/L
MnSO4              0.02g/L
赖氨酸             0.2g/L
蛋氨酸             0.2g/L
二氨基庚二酸盐     0.2g/L
pH7.0(KOH)
CaCO3              20g/L(单独灭菌)
[培养方法]
在试管中进行种子培养：
接种常备细菌。
LBG-M9琼脂培养基(按需加入药剂)，34℃，24小时。
主要培养：
接种三铂圈种子培养液。
碱性培养基(按需加入药剂)，34℃，24小时。
每试管5ml。
[分析方法]
肉汤培养基在一个时间段中以400μl体积加样，测定肉汤培养基中的蔗糖浓度以及积累的L谷氨酸浓度，在15000rpm转下离心5分钟后所获肉汤培养基的上清液用水稀释至一个合适的浓度，然后使用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)测量蔗糖浓度以及L谷氨酸浓度，L谷氨酸积累及产生的点其中糖类被耗尽的结果显示在表2中。
表2：ArcA基因破坏株L谷氨酸的积累及产量
 
菌株 L谷氨酸的累积(g/L) L谷氨酸的产量(％)
G106(AJ13601) 16.3 50.8
G106△arcA(AJ13601△arcA) 17.4 54.3
作为结果，可以看到，arcA基因破坏菌株与对照菌株相比L谷氨酸的累积量及产量均是提高的。
实施例5大肠杆菌株中arcA基因的破坏对L精氨酸产量的影响
在上述实施例2中已经认识到：在sucA及arcA基因破坏株中其与对照株SucA基因破坏株相比较L谷氨酸的积累及产量均是提高的。
然后，使用谷氨酸作为底物测量L精氨酸产量的影响。大肠杆菌株237被用作L精氨酸产生株。菌株237已于2000年4月10日被保藏在俄罗斯工业微生物国家收集中心(VKPM)并有一个保藏号VKPM B-7925，然后，该保藏按照布达佩斯条约于2001年5月18日被转向国际储藏。
(1)大肠杆菌株237的arcA基因破坏株的构建
以与实施例1相同的方式，菌株237的一个arcA基因被破坏以准备一个arcA基因破坏株，237ΔarcA。
(2)L精氨酸的生产
为了测试arcA基因破坏对于L精氨酸发酵的影响效果，237，237ΔarcA的arcA基因破坏株，以及菌株237作为对照，测量L精氨酸产量。下面描述了培养基，培养方法及测定的分析方法。
[L精氨酸的评估培养基]
                  最终浓度
葡萄糖            60g/L(单独灭菌)
MgSO4.7H2O        1g/L(单独灭菌)
(NH4)2SO4         25g/L
KH2PO4            2g/L
酵母抽提液        5g/L
硫胺              0.1mg/L
pH7.2
CaCO3             25g/L(单独灭菌)
[培养方法]
在试管中进行种子培养：
接种储备细菌。
LB琼脂培养基(按需加入药品)，32℃，24小时。
主要培养：
接种一个铂圈的种子培养液。
精氨酸的评估培养基(按需加入药品)，32℃，3天。
每试管2ml.
[分析方法]
肉汤培养基在一个时间段中以500μl加样，测定肉汤培养基中的葡萄糖浓度以及积累的L精氨酸浓度，在15000rpm转下离心5分钟后所获肉汤培养基的上清液用水稀释至一个合适的浓度使用Biotech Analyzer(Sakura Seiki)以及氨基酸分析仪L-8500(HITACHI Keisokuki service)测量葡萄糖浓度以及积累的L精氨酸浓度，其中糖类被耗尽时L精氨酸积累及产生的结果显示在表3中。
表3：arcA破坏株中L精氨酸的积累及产量
 
菌株 L精氨酸的累积(g/L) L精氨酸产量(％)
237 4.04 6.73
2376ΔarcA 14.8 24.7
作为结果，可以看到，arcA基因破坏菌株与对照菌株相比L精氨酸的累积量及产量均是提高的。
                              序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>通过发酵产生靶物质的方法
<130>OP1582
<150>JP2002-203764
<151>2002-07-12
<160>32
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌arcA基因的引物
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌arcA基因的引物
<400>2
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌arcA基因的引物
<400>3
Figure S03127780220030821D000281
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌arcA基因的引物
<400>4
Figure S03127780220030821D000282
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌dam基因的引物
<400>5
Figure S03127780220030821D000283
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌dam基因的引物
<400>6
Figure S03127780220030821D000291
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌dam基因的引物
<400>7
Figure S03127780220030821D000292
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌fnr基因的引物
<400>8
Figure S03127780220030821D000293
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌fnr基因的引物
<400>9
Figure S03127780220030821D000301
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌fnr基因的引物
<400>10
Figure S03127780220030821D000302
<210>11
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：测定大肠杆菌fnr基因序列的引物
<400>11
Figure S03127780220030821D000303
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：测定大肠杆菌fnr基因序列的引物
<400>12
Figure S03127780220030821D000311
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌sucA基因序列的引物
<400>13
Figure S03127780220030821D000312
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌sucA基因序列的引物
<400>14
Figure S03127780220030821D000313
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌sucA基因序列的引物
<400>15
<210>16
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增大肠杆菌sucA基因的引物
<400>16
Figure S03127780220030821D000322
<210>17
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Pantoea ananatis arcA基因的引物
<400>17
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Pantoea ananatis arcA基因的引物
<400>18
Figure S03127780220030821D000331
<210>19
<211>759
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(41)..(757)
<400>19
Figure S03127780220030821D000332
<210>20
<211>238
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>20
Figure S03127780220030821D000342
Figure S03127780220030821D000351
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Ori6K及mobRP4基因的引物
<400>21
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Ori6K及mobRP4基因的引物
<400>22
Figure S03127780220030821D000361
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增氯霉素抗性基因引物
<400>23
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增氯霉素抗性基因引物
<400>24
Figure S03127780220030821D000363
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增卡那霉素抗性基因引物
<400>25
Figure S03127780220030821D000371
<210>26
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增卡那霉素抗性基因的引物
<400>26
Figure S03127780220030821D000372
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Pantoea ananatis arcA基因的引物
<400>27
Figure S03127780220030821D000373
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Pantoea ananatis arcA基因的引物
<400>28
Figure S03127780220030821D000381
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Pantoea ananatis arcA基因的引物
<400>29
<210>30
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：扩增Pantoeaananatis arcA基因的引物
<400>30
Figure S03127780220030821D000383
<210>31
<211>927
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(817)
<400>31
Figure S03127780220030821D000391
<210>32
<211>238
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>32
Figure S03127780220030821D000402
Figure S03127780220030821D000411

Claims (6)

1.产生通过三羧酸循环合成的靶物质的方法，其包括在培养基中在有氧条件下培养γ-蛋白细菌以在培养基或细胞中产生及积累所述靶物质，然后从所述的培养基或细胞中收集所述靶物质，其中所述γ-蛋白细菌能够产生通过三羧酸循环合成的所述靶物质并且所述γ-蛋白细菌修饰后的ArcA蛋白不能正常发挥作用，其中所述靶物质为L-氨基酸而且其选自L-赖氨酸、L-谷氨酸以及L-精氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于正常情况下发挥功能的ArcA蛋白是如下(A)或(B)定义的蛋白：
(A)SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成的蛋白；
(B)SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其中ArcA蛋白不能正常发挥功能是通过破裂染色体上的arcA基因的方法来实现的。
4.如权利要求3所述的方法，其中的arcA基因是由下述(a)或(b)定义的DNA：
(a)SEQ ID NO：31的101-817核苷的核苷酸序列组成的DNA；
(b)SEQ ID NO：19中的41-757核苷的核苷酸序列组成的DNA。
5.如权利要求1所述的方法，其中的细菌属于大肠杆菌或菠萝泛菌。
6.如权利要求1所述的方法，其中的L-氨基酸为L-赖氨酸或L-谷氨酸。
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