ES2291568T3 - Procedimiento para producir una sustancia diana por fermentacion utilizando una cepa bacteriana que carece del gen arca. - Google Patents
Procedimiento para producir una sustancia diana por fermentacion utilizando una cepa bacteriana que carece del gen arca. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para producir una sustancia diana seleccionada de entre el grupo constituido por L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, ácido L-glutámico, L-glutamina, L-arginina, L-homoserina y ácido succínico, que comprende el cultivo de una gamma-proteobacteria en un medio bajo condiciones aeróbicas para producir y acumular la sustancia diana en el medio o las células, y recuperar la sustancia diana a partir del medio o de las células, en el que la gamma-proteobacteria que presenta la capacidad de producir la sustancia diana es modificada, de manera que la producción de la proteína ArcA es reducida o eliminada, y en el que la proteína ArcA es la siguiente (A) o (AB): (A) una proteína que presenta la secuencia aminoácida de SEC ID nº 32; (B) una proteína que presenta la secuencia aminoácida de SEC ID nº 32, que comprende la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que mejora la capacidad de la gamma-protobacteria de producir la sustancia diana cuando la producción de la proteína es reducida o eliminada en la gamma-proteobacteria comparada con una cepa de tipo salvaje o una cepa no modificada.
Description
Procedimiento para producir una sustancia diana
por fermentación utilizando una cepa bacteriana que carece del gen
ArcA.
La presente invención se refiere a una técnica
utilizada en la industria de la fermentación, más exactamente, a un
procedimiento para producir eficientemente una sustancia diana tal
como los L-aminoácidos por fermentación utilizando
un microorganismo.
Las células bacterianas han modificado sus vías
metabólicas, sus vías respiratorias, etc, para adaptarse a diversos
entornos. En el metabolismo energético, el Arc (control de la
respiración aeróbica) y el Fnr (reducción del fumarato nitrato) se
conocen como sistemas de control que juegan importantes funciones.
Éstas consisten en proteínas reguladoras globales que se encuentran
universalmente en E. coli y en otras especies análogas. El
primero es codificado por el gen arcA que se encuentra en la
posición de 0 minutos del cromosoma de E. coli, el otro está
codificado por el gen fnr que se encuentra en la posición de
29 minutos del cromosoma de E. coli, y los dos adaptan la
célula a un entorno, controlando muchos factores en condiciones
anaeróbicas. Además, se ha dilucidado que la proteína ArcA y la
proteína Fnr son factores de transcripción, y controlan positiva o
negativamente la expresión de un gen diana en el cromosoma de E.
coli bajo condiciones anaeróbicas, uniéndose directamente a una
región promotora del gen diana (S. Iuchi et al., Cell, 66,
5-7 (1991)).
Recientemente, los perfiles de expresión de
cepas en las que los genes que codifican los reguladores globales
tales como la proteína ArcA y la proteína Fnr derivadas de E.
coli, se ven afectados y se recogen en una base de datos
utilizando técnicas de microselección del ADN y abiertas al público
(http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+B).
Además, se sabe que la proteína ArcA controla
negativamente la expresión de los genes del ciclo del ácido
tricarboxílico (S. Iuchi et al., Cell, 66,
5-7 (1991)), y la expresión de los genes del ciclo
del ácido cítrico aumenta en la cepa ArcA afectada en la
base de datos. Por otra parte, se sabe que la proteína Fnr controla
positivamente la expresión génica de la vía respiratoria que
funciona bajo condiciones anaeróbicas.
Como para los perfiles de la expresión en las
cepas afectadas por los factores globales, puede hacerse referencia
a la cepa afectada por dam como una cepa en la que la
expresión génica para TCA aumenta como la cepa afectada por
arcA (H. Mori, Nara Institute of Science and Technology,
anuncio oral en el simposio "Green Biotechnology of Genome
Age", 2001, organizado por la Japan Bioindustry Association,
Resource Biotransformation Study Group).
La proteína Dam es una metilasa para los
factores de modificación que están implicados en los sistemas de
modificación de la restricción intracelular, y es codificada por el
gen dam que se encuentra en la posición de 76 minutos del
cromosoma de E. coli (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87 (23),
9454-9458 (1990)).
No se ha informado además sobre la mejoría en la
producción de la sustancia mediante el control de la expresión de
los factores globales tales como los genes ArcA, fnr y
dam.
COTTER P A ET AL. (FEMS MICROBIOLOGY
LETTERS, vol 91, nº 1, 1992, páginas 31-36,
XP008024029 ISSN: 0378-1097) muestra cepas de E.
coli en las que el gen arcA ha sido afectado por un
cassette de resistencia a la kanamicina.
IUCHI ET AL. (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL
ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol 85, nº 6, 1988,
páginas 1888-1892, XP008024028 1988 ISSN:
0027-8424) proporciona cepas de E. coli que
albergan una deleción en una región cromosómica que comprende el
gen ArcA (conocido asimismo como gen teñido).
NYSTROM THOHAS ET AL (EMBO J. vol 15, nº
13, 1996, páginas 3219-3228, XP008024026 ISSN:
0261-4189) da a conocer una cepa de E. coli
en la que el locus ArcA se ha visto afectado por la secuencia de
Tn10 (véase la página 3226, columna a la izquierda, segundo párrafo
completo).
WO0102544 (Dervent WPI Resumen
2001-138133), da a conocer procedimientos para la
producción del ácido L-glutámico a partir de las
corinebacterias aumentando en dichas células la actividad de la
succinato deshidrogenasa.
WO0102546 (Dervent WPI Resumen
2001-138135), da a conocer procedimientos para la
producción de L-lisina a partir de las
corinebacterias aumentando en dichas células la actividad de la
malato deshidrogenasa.
Un objetivo de la presente invención consiste en
mejorar la eficiencia de la producción de una sustancia útil
mediante la fermentación, utilizando una
\gamma-proteobacteria tal como la
Escherichia.
Los inventores de la presente invención llevaron
a cabo varias investigaciones para alcanzar el objetivo mencionado
anteriormente, y descubrieron que la producción de sustancia por una
\gamma-proteobacteria podía mejorarse modificando
un gen que codifica una proteína reguladora que existe de modo
universal en las \gamma-proteobacterias. Es
decir, descubrieron que la capacidad de producir una sustancia diana
podía mejorarse alterando el gen arcA en una
\gamma-proteobacteria, lo cual cumplía con la
presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona lo
siguiente:
(1) Un procedimiento para producir una sustancia
diana seleccionada de entre el grupo constituido por
L-lisina, L-treonina,
L-isoleucina, ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-arginina,
L-homoserina y ácido succínico, que comprende el
cultivo de una \gamma-proteobacteria en un medio
bajo condiciones aeróbicas para producir y acumular la sustancia
diana en el medio o las células, y recuperar la sustancia diana a
partir del medio o de las células, en el que la
\gamma-proteobacteria posee la capacidad de
producir la sustancia diana y de modificarla, de forma que la
producción de la proteína ArcA se reduzca o se elimine, y en el que
la proteína ArcA es la siguiente (A) o (B):
- (A)
- una proteína que tenga la secuencia aminoácida de SEC ID nº 32;
- (B)
- una proteína que tenga la secuencia aminoácida de SEC ID nº 32, que incluya la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que mejore la capacidad de la \gamma-proteobacteria para producir la sustancia diana, cuando la producción de la proteína se reduce o se elimina en la \gamma-proteobacteria, comparada con una cepa de tipo salvaje o una cepa no modificada.
(2) El procedimiento según el punto (1)
anterior, en el que la proteína ArcA que se define en (B), es una
proteína que posee un 90% o más de homología con la secuencia
aminoácida de SEC ID nº 32 y que mejora la capacidad de la
\gamma-proteobacteria para producir la sustancia
diana cuando la producción de la proteína se reduce o se elimina en
la \gamma-proteobacteria, comparada con una cepa
de tipo salvaje o no modificada.
(3) El procedimiento según el punto (1) o (2)
anterior, en el que la producción de la proteína ArcA se reduce o
se elimina mediante la alteración de un gen arcA en un
cromosoma, y en el que el gen arcA es ADN que se define como
(a) o (b) a continuación:
- (a)
- ADN que contiene la secuencia nucleótida de los nucleótidos 101 a 817 de SEC ID nº: 31;
- (b)
- ADN capaz de hidridizarse con la secuencia nucleótida de los nucleótidos 101 a 817 de SEC ID nº: 31 o una sonda que puede obtenerse a partir de la secuencia nucleótida bajo condiciones de rigurosidad y que codifica una proteína que mejora una capacidad de la \gamma-proteobacteria para producir la sustancia diana, cuando la producción de la proteína se reduce o se elimina, comparada con una cepa de tipo salvaje o no modificada, en la que dichas condiciones de rigurosidad son 1 x SSC, SDS al 0,1%, a 60ºC.
(4) El procedimiento según cualquiera de los
puntos (1) a (3) anteriores, en el que dicha
\gamma-proteobacteria es una bacteria que
pertenece al género Escherichia o Pantoea.
Según el procedimiento de la presente invención,
cuando una sustancia útil tal como los L-aminoácidos
es producida utilizando una
\gamma-proteobacteria, la eficiencia de la
producción puede mejorarse.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra los patrones de acumulación en
WC196, WC196\DeltaarcA, WC196\Deltadam y
WC196\Deltafnr.
\vskip1.000000\baselineskip
En adelante, la presente invención será
explicada detalladamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La \gamma-proteobacteria
utilizada para la presente invención no está limitada
particularmente, siempre que sea un microorganismo que pertenezca a
\gamma-proteobacterias tales como los géneros
Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia,
Erwinia, Salmonella o Morganella, y posea la capacidad de
producir una sustancia diana. Específicamente, pueden utilizarse
los microorganismos clasificados en las
\gamma-proteobacterias según la taxononomía que se
utiliza en la base de datos de la NCBI (National Center for
Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=1&unlock).
Ejemplos de bacterias que pertenecen al género
Escherichia incluyen E. coli, etc, etc. Ejemplos de
bacterias que pertenecen al género Enterobacter incluyen
Enterobacter agglomerans y Enterobacter aerogenes.
Existen algunas especies de Enterobacter
agglomerans que se han vuelto a reclasificarlo recientemente en
Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis o Pantoea
stewartii agglomerans, basándose en el análisis de la secuencia
nucleótida de 16S rARN, etc, etc. En el procedimiento de la presente
invención, la bacteria puede pertenecer a cualquiera de los géneros
Enterobacter o Pantoea, siempre que esté clasificada
en las \gamma-proteobacterias y posea el gen
arcA.
Cuando E. coli se cultiva utilizando
técnicas de ingeniería genética, pueden utilizarse la cepa K12 de
E. coli y sus derivados. Además, cuando Pantoea
ananatis se cultiva utilizando técnicas de ingeniería genética,
Pantoea ananatis pueden utilizarse las cepas AJ13355 (FERM
BP-6614). AJ13356 (FERM BP-6615) y
AJ13601 (FERM BP-7207), y sus derivados. Aunque las
cepas mencionadas anteriormente se identificaron como
Enterobacter agglomerans cuando se aislaron, estas cepas se
han vuelto a clasificar en Pantoea ananatis basándose en el
análisis de la secuencia nucleótida del 16S rARN, etc, tal como se
ha descrito anteriormente.
La \gamma-proteobacteria que
se utiliza en el procedimiento de la presente invención es
cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente, y es una
bacteria que posee una capacidad para producir una sustancia diana.
La "capacidad de producir una sustancia diana" se refiere a una
capacidad de producir y acumular la sustancia diana en células o en
un medio en grado tal que, cuando la bacteria de la presente
invención se cultiva en el medio, la sustancia diana puede
recuperarse a partir de las células o del medio.
La sustancia diana que va a producirse según la
presente invención es L-lisina, L_treonina,
L-isoleucina, ácido L-glutámico,
L-glutamina y L-arginina.
Como \gamma-proteobacterias
productoras de L-lisina pueden ponerse como ejemplos
mutantes que muestran resistencia a un análogo de la
L-lisina. Este análogo de la
L-lisina es una sustancia que inhibe el crecimiento
de la cepa productora del L-aminoácido, pero esta
inhibición es abolida parcial o totalmente cuando la
L-lisina coexiste en un medio. Ejemplos de análogos
de la L-lisina incluyen oxalisina, hidroxamato
lisina,
S-(2-aminoetil)-L-cisteína
(AEC), \gamma-metillisina,
\alpha-clorocaprolactam, y así sucesivamente. Los
mutantes que presentan resistencia a estos análogos de la lisina
pueden obtener sometiendo a las
\gamma-proteobacterias a un tratamiento
convencional de mutagénesis artificial. Ejemplos específicos de
cepas bacterianas que se utilizan para producir
L-lisina, incluyen la E. coli AJ11442 (FERM
BP-1543, NRRL B-12185; haciendo
referencia a la publicación de patente japonesa abierta al público
(Kokai) nº 56-18596 y a la patente US nº 4.346.170),
y la E. coli VL611. En estos microorganismos, la
retroinhibición de la aspartoquinasa por la L-lisina
está desensibilizada.
Además de lo expuesto anteriormente, puede
hacerse referencia, por ejemplo, las bacterias que producen
L-treonina que se describen a continuación, porque
la inhibición de la aspartoquinasa por la L-lisina
está asimismo eliminada generalmente en las bacterias productoras de
L-treonina.
En los ejemplos que se describen a continuación,
la cepa WC196 se utilizó como una bacteria de E. coli
productora de L-lisina. Esta cepa bacteriana se
cultivó transmitiendo la resistencia a AEC a la cepa W3110 derivada
de E. coli K-12. Esta cepa se denominó E.
coli AJ13069, y se depositó en el National Institute of
Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology (actualmente, la compañía
administrativa independiente International Patent Organism
Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology, código postal: 305-8566, Chuo Dai,
1-1 Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el
día 6 de diciembre de 1994, que se registró con el número FERM
P-14690. Entonces, se transfirió a un depósito
internacional según las previsiones del tratado de Budapest el 29 de
septiembre de 1995, con el número de registro FERM
BP-5252 (referencia a la Publicación de Patente
internacional WO96/17930).
Ejemplos de las
\gamma-proteobacterias productoras de
L-treonina incluyen E. coli VKPM
B-3996 (RIA 1867, referencia a la patente US nº
5.175.107) y la cepa MG442 (referencia a Gusyatiner et al.,
Genetika (en ruso), 14, págs 947-956, 1978).
Ejemplos de los microorganismos pertenecientes a
las \gamma-proteobacterias y que presentan
capacidad para la producción de ácido L-glutámico,
incluyen, por ejemplo, microorganismos deficientes en la actividad
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa o que
presentan una actividad \alpha-cetoglutarato
deshidrogenasa reducida. Las bacterias que pertenecen al género
Escherichia, deficiente en la actividad
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa o que poseen
una actividad reducida de ésta, y los procedimientos para
obtenerlas, se describen en la publicación de las patentes
japonesas abiertas al público (Kokai) nº 5-244970 y
nº 7-203980. Específicamente, pueden mencionarse las
cepas siguientes:
E. coli W3110sucA::KM^{r}
E. coli AJ12624 (FERM
BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM
BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM
BP-4881)
E. coli W3110sucA:KM^{r} es una cepa
obtenida interrumpiendo el gen de la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (al que se
hará referencia en adelante como el gen sucA) de E.
coli W3110, y es una cepa completamente deficiente en la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa.
Los microorganismos que pertenecen a las
\gamma-proteobacterias y que son deficientes en la
actividad de la \alpha-cetoglutarato
deshidrogenasa o que muestran una actividad reducida de ésta, así
como los procedimientos para obtenerlas, se describen en la
publicación de las patentes japonesas abiertas al público (Kokai)
nºs 5-244970 y 7-203980.
Ejemplos de
\gamma-proteobacterias productoras de
L-arginina incluyen E. coli en la que se ha
introducido el gen argA (publicación de la patente japonesa
abierta al público 57-5693) y la cepa 237 de E.
coli (patente rusa nº 200117677) o similares.
Ejemplos de
\gamma-proteobacterias productoras de
L-isoleucina incluyen E. coli KX141 (VKPM
B-4781, referencia a la publicación de la patente
europea abierta al público nº 519.113).
Ejemplos de bacterias Escherichia
productoras de L-homoserina incluyen la cepa NZ10,
que es una cepa que experimenta reversión Leu^{+} de la cepa C600
(referencia a la Appleyard R.K., Genetics, 39, págs
440-452, 1954).
Como \gamma-proteobacterias
que producen ácido succínico se conocen ejemplos que utilizan E.
coli (Wang X., et al., Appl. Biochem. Biotech.,
70-72, 919-928 (1998)).
Además, las bacterias que pertenecen al género
Escherichia que tienen capacidad productora de
L-aminoácidos, pueden cultivarse asimismo
introduciendo ADN que tenga información genética que esté implicada
en la biosíntesis de los L-aminoácidos y que
potencie esta capacidad empleando una técnica de recombinación
genética. Por ejemplo, como para las bacterias que producen
L-lisina, ejemplos de genes que pueden introducirse
incluyen, por ejemplo, genes que codifican enzimas de la vía
biosintética de la L-lisina, tales como la
fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartoquinasa, dihidrodipicolinato
sintetasa, dihidrodipicolinato reductasa, succinildiaminopimelato
transaminasa y succinildiaminopimelato deaciclasa. En el caso de un
gen una enzima que experimente retroinhibición por el ácido
L-aspártico o por la L-lisina, tal
como la fosfoenolpiruvato carboxilasa o la aspartoquinasa y la
dihidropicolinato sintetasa, es deseable utilizar un gen mutante que
codifique una enzima en la que se elimine dicha inhibición.
Además, como para las bacterias que producen
ácido L-glutámico, ejemplos de genes que pueden
introducirse incluyen los de la glutamato deshidrogenasa, glutamina
sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato
hidratasa, citrato sintasa, fosfoenolpiruvatocarboxilasa, piruvato
deshidrogenasa, piruvato quinasa, fosfoenolpiruvato sintasa,
enolasa, fosfogliceromutasa, fosfogliceratoquinasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fructosa
bis-fosfato aldolasa, fosfofructoquinasa y glucosa
fosfato isomerasa.
Además, una actividad de una enzima que cataliza
una reacción para producir un compuesto distinto al
L-aminoácido diana, (dicho compuesto) se bifurca a
partir de la vía biosintética del L-aminoácido,
puede aminorarse o hacerse deficiente. Por ejemplo, ejemplos de
dicha enzima que cataliza una reacción para producir un compuesto
distinto a la L-lisina, el cual compuesto se
bifurca a partir de la vía biosintética de la
L-lisina, incluye la homoserina deshidrogenasa
(referencia a la publicación de patente internacional WO95/23864).
Además, ejemplos de una enzima que cataliza una reacción para
producir un compuesto distinto al ácido L-glutámico,
bifurcándose dicho compuesto a partir de la vía biosintética del
ácido L-glutámico, incluye la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa, la
isocitrato liasa, fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa,
acetohidroxi ácido sintasa, acetolactato sintasa, formato
acetiltransferasa, lactato deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa
y 1-pirofosfato deshidrogenasa.
En el cultivo de las
\gamma-proteobacterias que tienen tal capacidad de
producir dicha sustancia diana, tal como se ha mencionado
anteriormente, para introducir un gen en las
\gamma-proteobacterias para potenciar su
capacidad, puede utilizarse un procedimiento en el que un vector con
capacidad de replicación autónoma, en una célula de
\gamma-proteobacteria, se une al gen para producir
ADN recombinante, transformándose con él la
\gamma-proteobacteria. Además, es posible asimismo
incorporar un gen diana al cromosoma huésped mediante un
procedimiento que utiliza la transducción, el transposón (Berg, D.E.
y Berg, C.M., Bio/Technol. 1, pág 417, 1983), el fago Mu,
(publicación de patente japonesa abierta al público (Kokai) nº
2-109985), o la recombinación homóloga (Experiments
in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972). Además, el
gen diana puede introducirse asimismo mediante el procedimiento que
consiste en interrumpir un gen utilizando un ADN lineal producido
mediante PCR (Kirill A., Datsenko et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 97 (12), 6640-6645 (2000)).
Ejemplos de las
\gamma-proteobacterias cultivadas mediante
técnicas del ADN recombinante tal como se describen anteriormente,
incluyen, por ejemplo, las bacterias que pertenecen al género
Escherichia que muestran una potenciación de las actividades
de la dihidrodipicolinato sintasa, que poseen una mutación que
elimina la retroinhibición por la L-lisina, la
aspartoquinasa y la dihidropicolinato reductasa, de las cuales la
retroinhibición por la L-lisina es desensibilizada,
y que tienen la capacidad de producir L-lisina
(patente US: nº 6.040.160, y bacterias que pertenecen al género
Enterobacter (el género Pantoea), que muestran la
potenciación de la actividad de la citrato sintasa, de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa o de la glutamato deshidrogenasa, y
que poseen capacidad productora de ácido L-glutámico
(EP 0 952 221 A2, EP 0 999 282 A2, EP 1 078 989 A2).
La \gamma-protobacteria que se
utiliza para la presente invención es una bacteria que tiene la
capacidad de producir la sustancia diana mencionada anteriormente,
y que se modifica de tal forma que la proteína ArcA no funciona
normalmente en una célula. La expresión "que se modifica de tal
forma que la proteína ArcA no funciona normalmente en una
célula" significa que se modifica de manera que la función de la
proteína ArcA será eliminada completamente, o que la función se
reducirá cuando se compare con una cepa no modificada de la
bacteria Escherichia, tal como una cepa salvaje. El estado en
el que la proteína ArcA no funciona normalmente puede ser, por
ejemplo, una estado en el que transcripción o la traducción del gen
arcA está inhibida, y por tanto, el producto del gen, la
proteína ArcA, no se produce, o su producción está reducida, o un
estado en el que la proteína ArcA producida, muta, y por tanto, la
función apropiada de la proteína ArcA está reducida o es eliminada.
Ejemplos de la \gamma-proteobacteria en la que la
proteína ArcA no funciona normalmente, incluyen, típicamente, una
cepa que muestra una alteración génica, en la que el gen arcA
en el cromosoma está alterado mediante una técnica de recombinación
genética, y una cepa mutante, en la que una secuencia reguladora de
la expresión o una región codificante del gen arcA en el
cromosoma, muestra una mutación, y por tanto, la proteína funcional
ArcA ya no se produce.
Ejemplos de la proteína ArcA contenida en una
cepa salvaje o cepa no modificada utilizada para el cultivo de la
bacteria utilizada en el procedimiento de la presente invención,
incluyen, por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia
aminoácida de SEC ID nº:32. Además, ejemplos del gen arcA
incluyen, por ejemplo, ADN que posee la secuencia nucleótida de SEC
ID nº:31. Además, el gen puede poseer la secuencia en la que
cualquier codon es reemplazado con otro codon equivalente. En la
presente invención, el término "ADN que codifica una proteína"
se refiere a que cuando el ADN es bicatenario, cualquiera de las
cadenas codifica una proteína.
Además, la proteína ArcA contenida en la cepa
salvaje o cepa no modificada, no se limita a una proteína de tipo
salvaje, y puede contener sustituciones, deleciones, inserciones o
adiciones de uno a 20 residuos aminoácidos, de manera que la
proteína tenga la actividad de la proteína ArcA.
La "actividad de la proteína ArcA"
mencionada anteriormente, es una actividad que mejora la capacidad
de producir una sustancia diana cuando la proteína no funciona
normalmente, comparada con la situación en la que la proteína
funciona con normalidad. En otras palabras, la actividad de la
proteína ArcA significa que una
\gamma-proteobacteria modificada de forma que la
proteína no funcione normalmente, produzca y acumule una cantidad
más grande de la sustancia diana en un medio, cuando se compara con
una cepa no modificada de la \gamma-proteobacteria
tal como una cepa salvaje. Ejemplos de cepas salvajes de E.
coli incluyen, por ejemplo, la cepa K12 y su derivada tal como
la cepa E. coli MG1655 (ATCC nº 47076), y la cepa W3110 (ATCC
nº 27325). Además, ejemplos de cepa no modificada de Pantoea
ananatis (Enterobacter agglomerans) incluyen las cepas
AJ13355 (FERM BP-6614). AJ13356 (FERM
BP-6615) y AJ13601 (FERM
BP-7207).
Las sustitución, deleción, inserción, adición o
inversión mencionadas anteriormente de los residuos aminoácidos
incluyen mutaciones que tienen lugar de modo natural o variaciones
debidas a la diferencia en los individuos, especies o en la cepa
del microorganismo que contiene la proteína ArcA.
Ejemplos de dichos mutantes o variantes del gen
arcA tal como se ha mencionado anteriormente, incluyen ADN
que es capaz de hibridizarse con una secuencia nucleótida que
comprende la secuencia de los nucleótidos nº 101 a 817 en SEC ID
nº: 31, o una sonda que puede ser producida a partir de la secuencia
nucleótida bajo condiciones rigurosas y que codifica una proteína
que posee una actividad similar a la de ArcA. "La condiciones de
rigurosidad" que se utilizan en la presente memoria consisten en
condiciones bajo las cuales se forma un híbrido denominado
específico, y no se forma un híbrido no específico. Las condiciones
rigurosas son en las que los ADNs se hibridizan entre ellos a
concentraciones salinas que corresponden a una situación ordinaria
de lavado en la hibridización Southern, es decir, 1 x SSC, SDS al
0,1%, preferentemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1%, a 60ºC.
Como sonda, puede utilizarse asimismo una
secuencia parcial de la secuencia nucleótida de SEC ID nº: 31. Dicha
sonda puede prepararse mediante PCR utilizando oligonucleótidos
producidos basándose en la secuencia nucleótida de SEC ID nº 31
como cebadores y un ejemplo de ADN que contiene la secuencia
nucleótida de SEC ID nº:31, y en un fragmento de ADN como matriz,
que contiene la secuencia nucleótida de SEC ID nº:31 como matriz.
Cuando un fragmento de ADN que tiene una longitud de alrededor de
300 pares de bases se utiliza como sonda, las condiciones del
lavado para la hibridización, pueden consistir en 50ºC, 2 x SSC y
SDS al 0,1%.
Los términos gen arcA y proteína ArcA que
se utilizan en adelante, no se limitan a los que tiene la secuencia
nucleótida o aminoácida que se muestra en SEC ID nº:31 ó 32 sino que
incluyen sus mutantes o sus homólogos. Como un ejemplo de homólogo,
la secuencia nucleótida del gen arcA y la secuencia
aminoácida de ArcA de Pantoea ananatis se muestran en las SEC
ID nº 19 y 20.
La bacteria que se utiliza en el procedimiento
de la presente invención, es una bacteria modificada, de manera que
la proteína ArcA no funciona con normalidad, estando alterado
específicamente, por ejemplo, el gen arcA de la
\gamma-proteobacteria. Dicha bacteria puede
obtenerse mediante, por ejemplo, la sustitución de un gen
arcA que no funciona normalmente (al que se hace referencia
asimismo en adelante como "gen arcA alterado") por el
gen arcA en el cromosoma mediante recombinación homóloga,
utilizando una técnica de recombinación genética (Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972):
Matsuyuama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196
(1985)).
El mecanismo de la recombinación homóloga tiene
lugar de la manera siguiente. Cuando un plásmido o similar que
porta una secuencia que muestra una homología con una secuencia
cromosómica, se introduce en la célula bacteriana correspondiente,
tiene lugar con una cierta frecuencia la recombinación en el sitio
de la secuencia homóloga, y por tanto, el plásmido que se ha
introducido como un todo, se integra en el cromosoma. Entonces,
provocando otra vez la recombinación en el sitio de la secuencia
homóloga en el cromosoma, el plásmido puede eliminarse otra vez del
cromosoma. Sin embargo, dependiendo de la posición a la cual se
provoca la recombinación, el gen que se ha alterado puede
permanecer en el cromosoma, mientras que el gen normal original
puede ser eliminado del cromosoma conjuntamente con el plásmido.
Seleccionando dicha cepa bacteriana, se puede obtener una cepa
bacteriana en la que el gen normal arcA sea reemplazado con
el gen arcA alterado.
Dicha técnica de alteración génica que se basa
en la recombinación homóloga, ya ha sido establecida, y por tanto,
puede utilizarse un procedimiento que utilice un ADN lineal, o uno
que utilice un plásmido sensible a la temperatura o similares. El
gen arcA puede interrumpirse asimismo utilizando un plásmido
que contenga el gen arcA inserto con un gen marcador tal
como un gen de resistencia medicamentosa, y que no pueda replicarse
en una célula microbiana diana. Es decir, en un transformante que se
haya transformado con dicho plásmido, y, por tanto, haya adquirido
resistencia a un medicamento, el gen marcador se integra en el ADN
cromosómico. Es probable que este gen marcador se haya integrado
mediante recombinación homóloga del gen arcA que se
encuentra a ambos lados del marcador, con estos genes en el
cromosoma, y por tanto puede seleccionarse eficientemente una cepa
con el gen alterado.
Ejemplos de plásmidos térmicamente sensibles que
funcionan en la bacteria Escherichia incluyen pMAN997
(publicación de patente internacional WO99/03988), pHSG415 y pHSG422
(Hashimoto-Gotoh, T. et al, Gene, 16,
227-235 (1981).
Específicamente, puede obtenerse un gen
arcA alterado que se utilice para la alteración génica por
deleción de una cierta región del gen arcA mediante
digestión con el enzima o enzimas de restricción y la reunión,
mediante inserción de otro fragmento de ADN (gen marcador, etc) en
el gen arcA, o introduciendo sustituciones, deleciones,
inserciones, adiciones o inversiones de uno o más nucleótidos en una
secuencia nucleótida de la región codificante del gen arcA,
de su región promotora mediante mutagénesis puntual (Kramer, W. y
Frits, H,J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) o mediante
tratamiento con un reactivo químico, tal como hiposulfito sódico e
hidroxilamina (Shortle, D. y Nathans, D., Proc. Natl. Acad, Sci.,
USA. 75, 270 (1978), de forma que la actividad del represor
codificado se reduzca o elimine, o la transcipción del gen
arcA se reduzca o se elimine. Entre estos procedimientos, se
prefiere, en vista de su fiabilidad y estabilidad, un procedimiento
que utiliza la deleción de una cierta región del gen arcA
mediante digestión con una enzima de restricción y la reunión, o
mediante la inserción de otro fragmento de ADN en el gen
arcA.
La secuencia del gen arcA es conocida
per se, y por tanto, el gen arcA puede obtenerse
fácilmente mediante el procedimiento PCR o el de hibridización
basado en la secuencia. Es suficiente que el gen arcA que se
utiliza para la alteración génica muestre una homología de tal grado
que pueda llevarse a cabo la recombinación homóloga con el gen
arcA contenido en la bacteria diana. Específicamente, es
suficiente que la homología sea habitualmente del 70% o superior,
preferentemente del 80% o superior, más preferentemente del 90% o
superior.
La alteración del gen diana puede confirmarse
analizando el gen en el cromosoma utilizando la transferencia
Southern o el procedimiento PCR.
Los procedimientos para obtener varios genes,
hibridizaciones, PCR, preparación del ADN plasmídico, digestión y
unión del ADN, transformación, etc, que se utilizan en la presente
invención, se describen en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis,
T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21
(1989).
Además, puede obtenerse una cepa mutante en la
que la proteína funcional ArcA ya no se produzca, sometiendo una
\gamma-proteobacteria a irradiación ultravioleta o
tratándola con un agente mutante que se utilice para el tratamiento
mutante habitual, tal como la
N-metil-N'-nitrosoguanidina
(NTG) o el ácido nítrico.
Cultivando un microorganismo de una
\gamma-proteobacteria que muestre la capacidad
para producir una sustancia diana y modificándolo de forma que la
proteína ArcA no funcione normalmente lo cual puede obtenerse tal
como se ha descrito anteriormente, en un medio para producir y
acumular la sustancia diana en él o en las células, puede
producirse la sustancia diana recuperándola a partir de éstos. Según
la presente invención, la eficiencia de la producción de la
sustancia diana puede mejorarse utilizando una
\gamma-proteobacteria que posea las
características mencionadas anteriormente. Se estima que el gen
arcA se expresa en una cepa salvaje de una
\gamma-proteobacteria relacionada con el gen
arcA durante el cultivo, e inhibe la expresión de los genes
implicados en el ciclo TCA, mientras que en una cepa en la que la
proteína ArcA no funciona normalmente, dicha inhibición de la
expresión para los genes del ciclo TCA se elimina, y por tanto,
puede obtenerse el efecto anterior.
El medio que se utiliza en la presente invención
puede consistir en un medio ordinario que contenga una fuente de
carbono, fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y otros componentes
orgánicos que se necesiten. Como fuente de carbono,pueden
utilizarse sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa,
galactosa, fructosa, arabinosa, maltosa, xilosa, trehalosa, ribosa
e hidrolizado de almidón, alcoholes tales como glicerol, manitol y
sorbitol, y ácidos orgánicos tales como ácido glucónico, ácido
fumárico, ácido cítrico y ácido succínico. Como fuente de
nitrógeno, pueden utilizarse sales inorgánicas de amonio tales como
sulfato amónico, cloruro amónico y fosfato amónico, nitrógeno
orgánico tal como hidrolizado de proteína de soja, gas amoníaco y
amoníaco acuoso. Como nutrientes orgánicos en cantidades traza, es
deseable añadir al medio, en cantidades apropiadas, sustancias que
son necesarias, como vitamina B_{1}, ácidos nucleicos tales como
adenina o ARN o extracto de levadura o similares. Otras sustancias
distintas a las mencionadas anteriormente, fosfato potásico, sulfato
magnésico, iones de hierro, iones de manganeso y similares, se
añaden en pequeñas cantidades cuando se requiere.
El cultivo puede realizarse bajo condiciones
bien conocidas que se utilizan convencionalmente, dependiendo de la
cepa bacteria que se emplee. Por ejemplo, el cultivo se lleva a cabo
preferentemente bajo condiciones aeróbicas durante
16-72 horas. La temperatura del cultivo se controla
preferentemente entre 30 y 45ºC, y el pH está entre 4,5 y 8. Para
el ajuste del pH, pueden utilizarse sustancias inorgánicas u
orgánicas, ácidas o alcalinas, así como gas amoníaco.
Para la recuperación de la sustancia diana a
partir del medio o de las células, no es necesario ningún
procedimiento especial en la presente invención. Es decir, puede
realizarse combinando técnicas bien conocidas convencionalmente,
tales como los procedimientos que utilizan resinas de intercambio,
precipitación y otras técnicas, dependiendo del tipo de la
sustancia diana. Además, la sustancia diana acumulada en las células
puede recuperarse, después de la fragmentación de las células
física o enzimática, a partir del extracto celular o de la fracción
de las membranas, dependiendo de la sustancia diana. Además,
dependiendo también de la sustancia diana, las células que
contienen la sustancia diana, pueden asimismo utilizarse, pues
constituyen catalizadores microbianos.
En adelante, la presente invención se explicará
con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos siguientes
La secuencia nucleótida completa del ADN
genómico de E. coli, cepa K-12 se ha
dilucidado ya (Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A. et
al., Science, 227, 1453-1474 (1997):
ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.
seq.gz). Basándose en las secuencias nucleótidas conocidas de los genes arcA, dam y fnr, se obtuvieron cepas con genes alterados para cada uno de los arcA, dam y fnr.
seq.gz). Basándose en las secuencias nucleótidas conocidas de los genes arcA, dam y fnr, se obtuvieron cepas con genes alterados para cada uno de los arcA, dam y fnr.
En el procedimiento siguiente, se utilizó el
Sistema -Genomic-tip (producido por QIAGEN) para la
extracción del ADN genómico.
Los cebadores se sintetizaron basándose en la
secuencia nucleótida que se ha informado de arcA, y los
fragmentos N y C terminales del gen arcA se amplificaron
mediante el procedimiento PCR utilizando el ADN genómico de la cepa
MG1655 de E. coli como matriz. Para la PCR se utilizó la
Pyrobest ADN polimerasa (producida por Takara Shuzo), y la PCR se
llevó a cabo según las instrucciones acompañantes. Los cebadores 1 y
2 se utilizaron como los empleados por PCR para amplificar el
fragmento N-terminal, y los cebadores 3 y 4 se
utilizaron como los empleados por PCR para amplificar el fragmento
C-terminal. El cebador 1 se diseñó para contener un
sitio HindIII, y el cebador 4 se diseñó para contener un
sitio XbaI.
Cebador 1: cccaagcttaaagccctttacttagctta
(secuencia complementaria a los nucléotidos números 5842 a 5501 de
la secuencia nucleótida del Registro nº AE000510 de GenBank. a la
que se le añadieron ccc y el sitio HindIII en el extremo 5',
SEC ID nº:1)
Cebador 2: tccgcgccatctgtcgcttc (secuencia de
los nucléotidos números 4851 a 4870 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000510 de GenBank, SEC ID nº:2)
Cebador 3:
gaagcgacagatggcgcggaaaagctacaagttcaatggt (secuencia complementaria a
los nucléotidos números 4541 a 4560 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000510 de GenBank a la que se le añadió en el extremo
5' una secuencia complementaria a los nucleótidos números 4851 a
4870 de la secuencia nucleótida del Registro nº AE000510 de GenBank,
SEC ID nº:3)
Cebador 4: gggtctagaggttgaaaaataaaaacggc
(secuencia de los nucléotidos números 4188 a 4207 de la secuencia
nucleótida del Registro nº AE000510 de GenBank a la que se le añadió
con ggg y el sitio XbaI en el extremo 5', SEC ID nº:4)
Después de PCR, se purificó cada uno de los
fragmentos amplificados del ADN, utilizando el equipo de
purificación PCR QIA quick (fabricado por QIAGEN). El procedimiento
PCR de entrecruzamiento (A.J. Link, D. Phillips, G.M. Church,
Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997), se
utilizó con el fragmento purificado N-terminal y el
fragmento C-terminal del ADN y los cebadores 1 y 4
para obtener un fragmento del arcA alterado. El fragmento
purificado del ADN se sometió a digestión con HindIII y
XbaI (fabricados por Takara Shuzo), y se sometió a
tratamiento con fenol/cloroformo y precipitación etanólica. Este
fragmento se unió a un plásmido pMAN997 termosensible (publicación
de patente internacional WO99/03988) y se sometió asimismo a
digestión con HindIII y XbaI utilizando el equipo
Ver.2 de unión del ADN (fabricado por Takara Shuzo).
Las células competentes JM109 (producidas por
Takara Shuzo) se transformaron con esta solución de unión y se
aplicaron a una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de
ampicilina (fabricada por Sigma) (placa LB + ampicilina). Después
de que las células se cultivaron a 30ºC durante un día, las colonias
en crecimiento se cultivaron en tubos de ensayo a 30ºC en medio LB
que contenía 25 \mug/ml de ampicilina, extrayéndose los plásmidos
utilizando un extractor automático de plásmidos
PI-50 (fabricado por Kurabo Industries). Los
plásmidos obtenidos se sometieron a digestión con HindIII y
XbaI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa,
designándose el plásmido insertado con el fragmento diana como
plásmido pMAN_\DeltaarcA para la alteración arcA.
El pMAN997 mencionado anteriormente es un plásmido obtenido
intercambiando fragmentos VspI-HindIII de pMAN031
S.(Matsuyama y S.Mizushima, J. Bacteriol., 162,1196 (1985) y pUC19
(producido por Takara Shuzo).
La cepa WC196 de E. coli se transformó
con el plásmido pMAN_\DeltaarcA según el procedimiento de
C.T. Chung et al., y se seleccionaron las colonias sobre una
placa que contenía LB + ampicilina a 30ºC. Los clones seleccionados
se cultivaron por la noche a 30ºC como un cultivo líquido,
diluyéndose entonces el caldo de cultivo hasta una concentración de
10^{-3} y se sembró en una placa de LB + ampicilina,
seleccionándose las colonias a 42ºC. Los clones seleccionados se
aplicaron sobre una placa de LB + ampicilina y se cultivaron a
30ºC, suspendiéndose entonces 1/8 de las células de la placa en 2ml
de medio LB, y cultivándose a 42ºC durante 4-5
horas con agitación. El caldo de cultivo se diluyó hasta una
concentración de 10^{-5} y se aplicó sobre una placa LB, y varios
cientos de colonias de entre las obtenidas, se inocularon en una
placa LB y en una placa LB + ampicilina para confirmar el
crecimiento y de esta forma seleccionar las cepas sensibles a la
ampicilina. La PCR de las colonias se llevó a cabo para varias
cepas sensibles a la ampicilina, para confirmar la deleción del gen
arcA. De esta manera, se obtuvo una cepa
WC196\DeltaarcA, cepa con el arcA alterado, derivada
de E. coli WC196.
Se obtuvo una cepa con el gen dam
alterado a partir de WC196, de la misma manera que en (1).
Los cebadores se sintetizaron basándose en la
secuencia nucleótida de la que se ha informado del gen dam y
los fragmentos N y C terminales del gen dam se amplificaron
mediante el procedimiento PCR utilizando el ADN genómico de la cepa
MG1655 de E. coli como matriz. Los cebadores 5 y 6 se
utilizaron como los empleados por PCR para amplificar el fragmento
N-terminal, y los cebadores 7 y 8 se utilizaron como
los empleados por PCR para amplificar el fragmento
C-terminal. El cebador 5 se diseñó para contener un
sitio HindIII, y el cebador 8 se diseñó para contener un
sitio XbaI.
Cebador 5: cccaagcttccgtggtatgtcctggtttc
(secuencia complementaria a los nucléotidos números 5150 a 5169 de
la secuencia nucleótida del Registro nº AE000414 de GenBank. a la
que se añadieron ccc y el sitio HindIII en el extrmo 5', SEC
ID nº:5)
Cebador 6: agactgatcaggtcgctatt (secuencia de
los nucléotidos números 4741 a 4760 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000414 de GenBank, SEC ID nº:6)
Cebador 7:
aatagcgacctgatcagtctgccttatgcaccgctgtctg (secuencia complementaria a
los nucléotidos números 4361 a 4380 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000414 de GenBank. a la que se le añadió en el extremo
5' una secuencia complementaria a los nucleótidos números 4741 a
4760 de la secuencia nucleótida del Registro nº AE000414 de GenBank,
SEC ID nº:7)
Cebador 8: gggtctagacgtcagattgggaacatagt
(secuencia de los nucléotidos números 3931 a 3950 de la secuencia
nucleótida del Registro nº AE000414 de GenBank. a la que se le
añadió con ggg y el sitio XbaI en el extremo 5', SEC ID
nº:8)
Después de PCR, se purificó cada uno de los
fragmentos amplificados del ADN, utilizando el equipo de
purificación PCR QIA quick (fabricado por QIAGEN). El procedimiento
PCR de entrecruzamiento se utilizó con el fragmento purificado
N-terminal y el fragmento C-terminal
del ADN y los cebadores 5 y 8 para obtener un fragmento dam
del tipo deficiente. El procedimiento que se siguió a continuación
se llevó a cabo de la misma forma que en (1), para obtener una cepa
WC196\Deltadam con dam alterado.
Se obtuvo una cepa con el gen fnr
alterado a partir de WC196, de la misma forma que en (1).
Los cebadores se sintetizaron basándose en la
secuencia nucleótida de la que se ha informado del gen fnr y
los fragmentos N y C terminales del gen fnr se amplificaron
mediante el procedimiento PCR utilizando el ADN genómico de la cepa
MG1655 de E. coli como matriz.
Los cebadores 9 y 10 se utilizaron como los
empleados por PCR para amplificar el fragmento
N-terminal, y los cebadores 11 y 12 se utilizaron
como los empleados por PCR para amplificar el fragmento
C-terminal. El cebador 9 se diseñó para contener un
sitio HindIII, y el cebador 12 se diseñó para contener un
sitio XbaI. Se obtuvo una cepa con el gen fnr alterado
a partir de WC196, de la misma forma que en (1).
Cebador 9: cccaagcttgcaattgggccgtcctggcg
(secuencia complementaria a los nucléotidos números 7981 a 8000 de
la secuencia nucleótida del Registro nº AE000231 de GenBank. a la
que se le añadieron ccc y el sitio HindIII en el extremo 5',
SEC ID nº:9)
Cebador 10: tcaagctgatcaagctcagt (secuencia de
los nucléotidos números 7501 a 7520 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000231 de GenBank, SEC ID nº:10)
Cebador 11:
caggagttgatcagcttgagaaaaatgccgaggaagctc (secuencia complementaria a
los nucléotidos números 7121 a 7140 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000231 de GenBank. a la que se añadió en el extremo 5'
una secuencia complementaria a los nucleótidos números 7501 a 7520
de la secuencia nucleótida del Registro nº AE000231 de GenBank, SEC
ID nº:11)
Cebador 12: gggtctagattggtcgtcctggttaggat
(secuencia de los nucléotidos números 6671 a 6690 de la secuencia
nucleótida del Registro nº AE000231 de GenBank. a la que se añadió
con ggg y el sitio XbaI en el extremo 5', SEC ID nº:12)
Después de PCR, se purificó cada uno de los
fragmentos amplificados del ADN, utilizando el equipo de
purificación PCR QIAquick (fabricado por QIAGEN). El procedimiento
PCR de entrecruzamiento se utilizó con el fragmento purificado
N-terminal y el fragmento C-terminal
del ADN y los cebadores 9 y 12 para obtener un fragmento dam
del tipo deficiente. El procedimiento que se siguió a continuación
se llevó a cabo de la misma forma que en (1), para obtener una cepa
WC196\Deltafnr con fnr alterado.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa del gen alterado arcA la cepa
WC196\DeltaarcA, la cepa del gen alterado dam,
WC19\Deltadam, la cepa del gen alterado fnr,
WC196\Deltafnr, y su cepa parental, WC196, se cultivaron,
midiéndose su producción de L-lisina.
A continuación se muestran los medios,
procedimientos de cultivo y procedimiento analítico.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Concentración final
- Glucosa
- 10 g/l (esterilizado separadamente)
- NH_{4}Cl
- 20 mM
- NaHPO_{4}
- 40 mM
- KH_{2}PO_{4}
- 30 mM
- CaCl_{2}
- 0,01 mM
- FeSO_{4}
- 0,01 mM
- MnSO_{4}
- 0,01 mM
- ácido cítrico
- 5 mM
- clorhidrato de tiamina
- 2 mM (esterilizado separadamente)
- casaminoácidos
- 2,5 g/l (esterilizado separadamente)
- MES-NaOH (pH 6,8)
- 50 mM (esterilizado separadamente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon bacterias que estaban
almacenadas
Medio agar LB (se añadieron medicamentos si era
necesario), 37ºC, 24 horas
\newpage
Las bacterias que experimentaron el cultivo de
refresco se inocularon en el medio LB en un volumen de 2 ml.
Medio LB (se añadieron medicamentos si eran
necesarios), 37ºC, durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon 1/16 de las bacterias presentes en
las placas del cultivo de siembra.
Medio E-100 (los medicamentos se
añadieron si eran necesarios), 37ºC, 20 ml en un matraz Sagaguchi de
500 ml de volumen.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras del caldo de cultivo en un
volumen de 500 \mul a lo largo del tiempo, midiéndose la
concentración de glucosa y la acumulación de
L-lisina en el caldo de cultivo. La concentración de
glucosa y la acumulación de L-lisina se midieron en
el sobrenadante del caldo de cultivo obtenido después de
centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos, diluido hasta una
concentración apropiada con agua, utilizando el Analizador Biotech
(Sakura Seiki). Los resultados se muestran en la Fig 1.
Como resultado, se observó que la cepa del gen
alterado fnr mostraba una acumulación de
L-lisina equivalente a la de la cepa de control, y
que la cepa del gen alterado dam exhibía una acumulación
reducida, cuando se comparaba con la cepa de control. Por otra
parte, se reconoció que la acumulación de L-lisina
de la cepa con el gen alterado arcA, experimentó una mejoría
cuando se comparó con la cepa de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Ya que en el Ejemplo 2 se observó el efecto de
mejora en la acumulación de la L-lisina utilizando
la alteración del gen arcA, en este ejemplo se examinó el
efecto del gen arcA sobre la fermentación del ácido
L-glutámico.
Para confirmar el efecto de la deficiencia del
gen arcA sobre la producción del ácido
L-glutámico en E. coli MG1655, se
construyeron la cepa deficiente sucA (MG1655\DeltasucA) derivada
de E. coli MG1655 y la cepa doblemente deficiente
arcA y sucA derivada de E. coli MG1655
(MG1655\DeltasucA\DeltaarcA).
Se obtuvo una cepa con el gen sucA
alterado a partir de MG1655, de la misma forma que en el Ejemplo
1.
Los cebadores se sintetizaron basándose en la
secuencia nucleótida que se ha informado del gen sucA y los
fragmentos N y C terminales del gen sucA se amplificaron
mediante el procedimiento PCR utilizando el ADN genómico de la cepa
MG1655 de E. coli como matriz.
Los cebadores 13 y 14 se utilizaron como los
empleados por PCR para amplificar el fragmento
N-terminal, y los cebadores 15 y 16 se utilizaron
como los empleados por PCR para amplificar el fragmento
C-terminal. El cebador 13 se diseñó para contener
un sitio HindIII, y el cebador 16 se diseñó para contener un
sitio XbaI. Se obtuvo una cepa con el gen sucA
alterado a partir de MG1655, de la misma forma que en (1).
Cebador 13: cccaagcttctgcccctgacactaagaca
(secuencia de los nucléotidos números 10721 a 10740 de la secuencia
nucleótida del Registro nº AE000175 de GenBank. a la que se
añadieron ccc y el sitio HindIII en el extremo 5', SEC ID
nº:13)
Cebador 14: cgaggtaacgttcaagacct (secuencia
complementaria a los nucléotidos números 11501 a 11520 de la
secuencia nucleótida del Registro nº AE000175 de GenBank, SEC ID
nº:14)
Cebador 15:
aggtcttgaacgttacctcgatccataacgggcagggcgc (secuencia de los
nucléotidos números 12801 a 12820 de la secuencia nucleótida del
Registro nº AE000175 de GenBank. a la que se añadió en el extremo 5'
una secuencia de los nucleótidos números 10501 a 11520 de la
secuencia nucleótida del Registro nº AE000175 de GenBank, SEC ID
nº:15)
Cebador 16: gggtctagaccactttgtcagtttcgatt
(secuencia complementaria a los nucléotidos números 13801 a 13820 de
la secuencia nucleótida del Registro nº AE000175 de GenBank. a la
que se añadió con ggg y el sitio XbaI en el extremo 5', SEC
ID nº:16)
Después de PCR, se purificó cada uno de los
fragmentos amplificados del ADN, utilizando el equipo de
purificación PCR QIAquick (fabricado por QIAGEN). El procedimiento
PCR de entrecruzamiento se utilizó con el fragmento purificado
N-terminal y el fragmento C-terminal
del ADN y los cebadores 13 y 16 para obtener un fragmento
sucA del tipo deficiente. El procedimiento que se siguió a
continuación se llevó a cabo de la misma forma que en (1), para
obtener una cepa MG1655\DeltasucA con sucA alterada.
De la misma forma que en el Ejemplo 1, el gen
arcA de MG1655\DeltasucA fue sometido a una alteración para
preparar una cepa doblemente deficiente arcA y sucA
(MG1655\DeltasucA\DeltaarcA).
De manera similar, se produjeron la cepa
doblemente deficiente sucA y dam (MG1655\DeltasucA\Deltadam) y
la cepa doblemente deficiente suca y fnr
(MG1655\DeltasucA\Deltafnr).
Para examinar el efecto de la alteración del gen
arcA sobre la fermentación del ácido
L-glutámico, se cultivaron las cepas doblemente
deficientes para los genes, (MG1655\DeltasucA\DeltaarcA)
y (MG1655\DeltasucA\Deltadam) y
(MG1655\DeltasucA\Delta
fnr), así como la cepa deficiente en el gen sucA, (MG1655\DeltasucA), como control, midiéndose las cantidades de producción del ácido L-glutámico.
fnr), así como la cepa deficiente en el gen sucA, (MG1655\DeltasucA), como control, midiéndose las cantidades de producción del ácido L-glutámico.
A continuación se muestran los medios,
procedimientos de cultivo y el procedimiento analítico.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Concentración final
- Glucosa
- 40 g/l (esterilizado separadamente)
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 1 g/l (esterilizado separadamente)
- (NH)_{42}SO_{4}
- 16 g/l
- KH_{2}PO_{4}
- 1 g/l
- Extracto de levadura
- 2 g/l
- FeSO_{4}
- 0,01 g/l
- MnSO_{4}
- 0,01 g/l
- CaCO_{3}
- 30 g/l (esterilizado separadamente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon bacterias que estaban
almacenadas
Medio agar LB (se añadieron medicamentos si era
necesario), 37ºC, 24 horas
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias que experimentaron el cultivo de
refresco se inocularon.
Medio LB líquido (se añadieron medicamentos si
eran necesarios), 37ºC, 16 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó el 10% del medio líquido para el
cultivo de siembra.
Medio líquido MS (los medicamentos se añadieron
si eran necesarios), 37ºC, 20 ml en un matraz Sakaguchi de 500 ml de
volumen.
Se tomaron muestras del caldo de cultivo en un
volumen de 500 \mul a lo largo del tiempo, midiéndose la
concentración de glucosa y la acumulación de ácido
L-glutámico en el caldo de cultivo. La concentración
de glucosa y la acumulación del ácido L-glutámico
se midieron en el sobrenadante del caldo de cultivo obtenido
después de centrifugación a 15000 rpm durante 5 minutos, diluido
hasta una concentración apropiada con agua, utilizando el
Analizador Biotec (Sakura Seiki). La acumulación del ácido
L-glutámico y el rendimiento en el lugar donde el
sacárido se agotó se muestran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado, tanto la acumulación como el
rendimiento del ácido glutámico fueron ligeramente inferiores en la
cepa con los genes alterados sucA y dam comparada con
el control, y fueron comparables a los del control en la cepa con
los genes alterados fnr y sucA. Por otra parte, se
reconoció que tanto la acumulación como el rendimiento del ácido
L-glutámico mejoraron en la cepa con los genes
alterados fnr y sucA, cuando se compararon con la cepa
de control.
ArcA es un regulador global que se
presenta universalmente en E. coli y en otras especies
relacionadas. Utilizando una bacteria que pertenece al género
Pantoea, Pantoea ananatis AJ13601, que está relacionada con
E. coli, se obtuvo el gen arcA de Pantoea
ananatis basado en una secuencia nucleótida conocida de E.
coli arcA. La cepa AJ13601 se obtuvo de la manera siguiente
(referencia a la patente EP 1 078 989 A2). La cepa AJ13355 se aisló
a partir del suelo en Iwata-shi, Shizuoka, Japón,
como una cepa que podía crecer bajo un pH bajo, en un medio que
contenía ácido L-glutámico y una fuente de carbono.
A partir de la cepa AJ13355, se seleccionó la cepa SC17 como un
mutante que producía menos mucosidad y que mostraba un buen
crecimiento. La cepa SC17sucA, en la que la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (\alphaKGDH)
está alterada, se construyó a partir de la cepa SC17. En la cepa
SC17 se introdujeron el plásmido pSTVCB que contenía un gen de la
citrato sintasa (gltA) derivado de Brevibacterium
lactofermentum (pSTVCB), y el plásmido RSFCPG que contenía
gltA, el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc)
y el gen de la glutamato deshidrogenasa (gdhA). A partir de
los transformantes obtenidos, se seleccionó la cepa AJ13601 como una
cepa que presenta un aumento en la resistencia a las
concentraciones altas del ácido L-glutámico bajo
situaciones de pH bajo. La cepa AJ13601 se ha depositado en el
National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology (actualmente, la compañía administrativa independiente
International Patent Organism Depositary, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology, código postal:
305-5466, Chuo Dai-6,
1-1 Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el
día 18 de agosto de 1999, que se registró con el número FERM
P-17516 y entonces, se transfirió a un depósito
internacional según las previsiones del tratado de Budapest el 6 de
julio de 2000, con el número de registro FERM
BP-7207 (referencia a la publicación de patente EP 1
078 989 A2).
El ADN genómico de Pantoea ananatis
AJ13601 se extrajo utilizando el Sistema
QIAGEN-Genomic-tip (producido por
QIAGEN). Utilizando el ADN genómico como matriz y los siguientes
oligonucleótidos como cebadores, se obtuvo un fragmento de ADN de
759 pares de bases que contenía el ORF del gen arcA. Para
PCR, se utilizó Pyrobest ADN Polimerasa (producida por Takara
Shuzo), y el PCR se llevó a cabo según las instrucciones adjuntas.
Los cebadores 17 y 18 se utilizaron como cebadores PCR para
amplificación. El cebador 17 se diseñó para contener un sitio EcoRI,
y el cebador 18 se diseñó para contener un sitio SphI,
respectivamente.
Cebador 17: cccgaattccctgtttcgatttagttggc
(secuencia complementaria a los nucléotidos números
4980-4999 de la secuencia nucleótida del Registro nº
AE000510 de GenBank, a la que se añade el sitio EcoRI en el
extremo 5': SEC ID nº:17)
Cebador 18: cccgcatgcgattaatcttccagatcacc
(secuencia de los nucléotidos números 4245-4264 de
Registro nº
AE000510 de GenBank. a la que se añadió en el extremo 5' un sitio SphI: SEC ID nº:18)
AE000510 de GenBank. a la que se añadió en el extremo 5' un sitio SphI: SEC ID nº:18)
El fragmento obtenido de ADN se insertó en el
vector pSTV29 de clonación (producido por Takara Shuzo) en dirección
hacia adelante como dirección de transcripción por el gen
lacZ utilizando los sitios EcoRI y SphI
diseñados en los cebadores para obtener pSTV29_EaarcA. La
secuencia nucleótida de la secuencia clonada se muestra en SEC ID
nº:19. La secuencia aminoácida deducida codificada por el ORF se
muestra en SEC ID nº 20. El ORF obtenido muestra una identidad del
81,2% en la secuencia nucleótida y alrededor del 92,1% en la
secuencia minoácida con respecto al gen arcA de E.
coli. De este modo, el ORF se considera que codifica ArcA de
Pantoea ananatis.
La cepa G106S de Pantoea ananatis se
utilizó para construir la cepa de Pantoea ananatis con el gen
alterado arcA. Entre los dos plásmidos RSFCPG y pSTVCB,
albergados por la cepa AJ13601, la cepa G106S alberga sólo a
RSFCPG, suprimiéndose pSTVCB. La cepa con el gen alterado
arcA se construyó a partir de la cepa G106S. Entonces,
pSTVCB se introdujo en la cepa obtenida con el gen alterado para dar
lugar a la cepa de AJ13601 con el gen alterado arcA. El
procedimiento se explicará con mayor detalle a continuación.
La utilización del cultivo convencional mediante
recombinación cromosómica con un plásmido termosensible no es fácil
en un procedimiento de recombinación para Pantoea ananatis,
debido a las características de Pantoea ananatis que
difícilmente puede crecer a 42ºC. Por tanto, en este experimento se
utilizó una técnica de recombinación cromosómica utilizando una
transferencia por conjugación. Para el procedimiento de
transferencia por conjugación, es necesario construir un plásmido
que no contenga un origen de replicación (ori) de Pantoea
ananatis es decir, un plásmido que no pueda dar lugar a la
replicación de Pantoea ananatis. Así, la región oriR6K y
mobRP4 se amplificó mediante PCR, utilizando los cebadores 21 y 22,
y un plásmido para la transferencia Tn5, pUT
(miniTn5-Cm (Lorenzo V., et al., Journal of
Bacteriology, 172, 6568 (1990); Herrero M., et al., Journal
of Bacteriology, 172, 6557-(1990) como matriz. Además, un fragmento
que contenía un sitio de multiclonación y el gen de la resistencia
al cloramfenicol se amplificó mediante PCR utilizando los
inidicadores 23 y 24, y pHSG399 como matriz. Cada uno de los
fragmentos amilificados obtenidos se sometió a digestión con
BglII (fabricado por Takara Shuzo), y los fragmentos se
unieron con el Equipo de Unión del ADN ver.2 (fabricado por Takara
Shuzo).
Entonces, la cepa S17-1
\lambdapir de E. coli (R.Simon., et al.,
BIO/TECHNOLOGY NOVIEMBRE 1983, 784-791 (1983), se
transformó con la mezcla de unión, y se aplicó sobre una placa de
agar LB que contenía 30 \mug/ml de cloramfenicol. Después de
cultivo durante un día a 37ºC, aparecieron colonias que se
cultivaron en tubos de ensayo a 37ºC en medio LB, que contenía 30
\mug/ml de cloramfenicol. Los plásmidos se obtuvieron a partir de
cada uno de los cultivos, utilizando un Equipo QIAprep de columna
Mini Spin (fabricado por QiAGEN). Los plásmidos obtenidos se
sometieron a digestión con BglII, y un plásmido que poseía un
único sitio de reconocimiento BglII se designó como el
plásmido para la transferencia por conjugación, pUT399Cm.
| Cebador 21: | tcatagatcttttagattgatttatggtgc | (SEC ID nº: 21) |
| Cebador 22: | ccacagatctaattcccatgtcagccgtta | (SEC ID nº: 22) |
| Cebador 23: | ataaagatctgtgtccctgttgataccggg | (SEC ID nº: 23) |
| Cebador 24: | ggggagatcttgcaaggcgattaagttggg | (SEC ID nº: 24) |
\vskip1.000000\baselineskip
Entonces, se introdujo un gen de resistencia a
la kanamicina en pUT399Cm y se suprimió el gen de resistencia al
cloramfenicol del plásmido según el procedimiento que sigue. El gen
de resistencia a la kanamicina se amplificó mediante PCR utilizando
los cebadores 25 y 26, y pMW 219 (fabricado por Nippon Gene) como
matriz. Para PCR, se utilizó la Pyrobest ADN Polimerasa (fabricado
por Takara Shuzo), y dicha PCR se llevó a cabo según las
instrucciones adjuntas. Cada uno de los cebadores 25 y 26 se añadió
con el sitio BglII en el extremo 5'. El fragmento obtenido
de ADN, y pUT399, se sometieron a digestión con BglII
(fabricado por Takara Shuzo) y se unieron con el Equipo de unión
del ADN ver.2 (fabricado por Takara Shuzo). Entonces, la cepa
S17-1\lambdapir de E. coli (R.Simon.,
et al., BIO/TECHNOLOGY NOVIEMBRE 1983,
784-791 (1983), se transformó con la mezcla de
unión, y se aplicó sobre una placa de agar LB que contenía 25
\mug/ml de kanamicina (placa de LB + kanamicina). Después de
cultivo durante un día a 37ºC, aparecieron colonias que se
cultivaron en tubos de ensayo a 37ºC con medio LB, que contenía 25
\mug/ml de kanamicina. Los plásmidos se obtuvieron a partir de
cada uno de los cultivos, utilizando un Equipo QIAprep de columna
Mini Spin (fabricado por QiAGEN). Los plásmidos obtenidos se
sometieron a digestión con BglII, y a electroforesis en gel
de agarosa, y el plásmido insertado con el fragmento diana, se
designó como el plásmido pUT399CmKm.
| Cebador 25: | cccagatctagttttcgccccgaagaacg | (SEC ID nº:25) |
| Cebador 26: | cccagatctccagagtcccgctcagaaga | (SEC ID nº 26) |
\vskip1.000000\baselineskip
Entonces, el gen de resistencia al cloramfenicol
se suprimió del pUT399CmKm tal como se describe a continuación.
pUT399CmKm se sometió a digestión con HindIII (fabricado por
Takara Shuzo) y se unió con el Equipo de Unión de ADN ver.2
(fabricado por Takara Shuzo). La cepa
S17-1\lambdapir de E. coli (R.Simon., et
al., BIO/
TECHNOLOGY NOVIEMBRE 1983, 784-791 (1983), se transformó con la mezcla de unión, y se aplicó sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina (placa de LB + kanamicina). Después de cultivo durante un día a 37ºC, aparecieron colonias que se cultivaron en la placa de LB agar que contenía 25 \mug/ml de kanamicina y en la placa de agar que contenía 30 \mug/ml de cloramfenicol (fabricada por Sigma) a 37ºC y una cepa que era sensible al cloramfenicol. La cepa se cultivó en medio LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina durante un día a 37ºC y el plásmido se obtuvo a partir del cultivo utilizando el Equipo QIAprep de columna Mini Spin (fabricado por QiAGEN). Los plásmidos obtenidos se denominaron pUT399km.
TECHNOLOGY NOVIEMBRE 1983, 784-791 (1983), se transformó con la mezcla de unión, y se aplicó sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina (placa de LB + kanamicina). Después de cultivo durante un día a 37ºC, aparecieron colonias que se cultivaron en la placa de LB agar que contenía 25 \mug/ml de kanamicina y en la placa de agar que contenía 30 \mug/ml de cloramfenicol (fabricada por Sigma) a 37ºC y una cepa que era sensible al cloramfenicol. La cepa se cultivó en medio LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina durante un día a 37ºC y el plásmido se obtuvo a partir del cultivo utilizando el Equipo QIAprep de columna Mini Spin (fabricado por QiAGEN). Los plásmidos obtenidos se denominaron pUT399km.
Los cebadores se prepararon basándose en la
secuencia nucleótida del gen arcA obtenido en el <1>
anterior, y los fragmentos N y C terminales del gen arcA se
amplificaron utilizando los cebadores y pSTVV29_EaarcA como
matriz. Para la PCR se utilizó la Pyrobest ADN polimerasa (fabricada
por Takara Shuzo), y la PCR se llevó a cabo según las instrucciones
acompañantes. Los cebadores 27 y 28 se utilizaron como los empleados
por PCR para amplificar el fragmento N-terminal, y
los cebadores 29 y 30 se utilizaron como los empleados por PCR para
amplificar el fragmento C-terminal. El cebador 27 se
diseñó para contener un sitio EcoRI, y el cebador 30 se
diseñó para contener un sitio SphI, respectivamente.
| Cebador 27: | cccgaattcgcgaccgatggtgcagagat | (SEC ID nº 27) |
| Cebador 28: | aaggcaaattcatggtgcgc | (SEC ID nº: 28) |
| Cebador 29: | gcgcaccatgaatttgccttacccaatgaagagctgcgcc | (SEC ID nº: 29) |
| Cebador 30: | cccgcatgcaccttcgccgtgaatggtgg | (SEC ID nº: 30) |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de PCR, se purificó cada uno de los
fragmentos amplificados del ADN, utilizando el equipo de
purificación PCR QIAquick (fabricado por QIAGEN). El procedimiento
PCR de entrecruzamiento (A.J. Link, D. Philips, GM. Church, Journal
of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)) se utilizó
con el fragmento purificado N-terminal y el
fragmento C-terminal del ADN y los cebadores 27 y 30
para obtener un fragmento arcA alterado.
El fragmento purificado del ADN se sometió a
digestión con EcoRI y SphI fabricados por Takara
Shuzo), y se sometió a tratamiento con fenol/cloroformo y
precipitación etanólica. Este fragmento se unió a un plásmido
pUT399Km que se sometió asimismo a digestión con EcoRI y
SphI utilizando el equipo Ver.2 de unión del ADN (fabricado
por Takara Shuzo). La cepa S17-1\lambdapir de
E. coli (R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVIEMBRE
1983, 784-791 (1983), se transformó con la mezcla de
unión, y se aplicó sobre una placa de agar LB que contenía 25
\mug/ml de kanamicina. Después de cultivo durante un día a 37ºC,
aparecieron colonias que se cultivaron en medio LB que contenía 25
\mug/ml de kanamicina en tubos de ensayo a 37ºC. Los plásmidos se
obtuvieron a partir de cada uno de los cultivos, utilizando un
Equipo QIAprep de columna Mini Spin (fabricado por QiAGEN). Los
plásmidos obtenidos se sometieron a digestión con EcoI y
SphI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa El
plásmido inserto con el fragmento diana se denominó como plásmido
pUT399Km_\DeltaarcA para la alteración de arcA.
Se llevó a cabo la alteración génica utilizando
el procedimiento de recombinación homóloga con el
pUT399Km_
\DeltaarcA anteriormente mencionado. La cepa G106S se utilizó como una cepa donadora del plásmido El rastreo se llevó a cabo con un medio que comprendía 5g/l de glucosa (fabricado por Junsei Kagaku), 5 g/l de extracto de levadura (fabricado por Difco), 10 g/l de Triptófano-peptona (Difco), 10 g/l de NaCl (Junsei Kagaku), 6 g /l de Na_{2}HPO_{4}, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1g/l de NH_{4}Cl y 1,5 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O (al que se hará referencia en adelante como "medio LBG-M9), al que se le añadieron 25 \mug/ml de tetraciclina, 25 \mug/ml de kanamicina y agar (al que se hará referencia en adelante como placa "LBG-M9+Tet+Km) Sobre el medio de agar, la cepa G106S, a la cual se incorporó pUT399Km_\DeltaarcA en su cromosoma, puede seleccionarse como una cepa de recombinación única, es decir, la cepa con el gen arcA alterado, ya que el plásmido derivado de pUT399 no puede replicarse en Pantoea ananatis tal como se ha descrito anteriormente. La cepa S17-1\lambdapir de E. coli (R.Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVIEMBRE 1983, 784-791 (1983), se transformó con, pUT399Km_\DeltaarcA y se aplicó sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina. Después del cultivo, el transformante obtenido, E. coli S17-1\lambdapir/pUT399Km_\DeltaarcA, se cultivó en medio LBG-M9 que contenía 25 \mug/ml de tetraciclina durante un día a 34ºC Cada uno de los medios de cultivo se centrifugó y respectivamente se obtuvieron células que se suspendieron en 50 \mul de medio LB. 25 \mugl de cada suspensión se mezclaron y cultivaron en medio LBG-M9 agar durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, el cultivo se continuó durante 3 horas a 34ºC para provocar la transferencia por conjugación. Entonces, las células cultivadas diluidas hasta concentraciones de 10^{-1}, 10^{-2} ó 10^{-3} , se aplicaron a la placa LBG-M9+Tet+Km, seleccionándose las cepas resistentes a la tetraciclina y a la kanamicina. Se llevó a cabo la PCR colonial para algunas cepas entre las seleccionadas para confirmar la deleción del gen arcA. De este modo, se obtuvo la cepa con el gen arcA alterado derivada de G106S, G106S\DeltaarcA.
\DeltaarcA anteriormente mencionado. La cepa G106S se utilizó como una cepa donadora del plásmido El rastreo se llevó a cabo con un medio que comprendía 5g/l de glucosa (fabricado por Junsei Kagaku), 5 g/l de extracto de levadura (fabricado por Difco), 10 g/l de Triptófano-peptona (Difco), 10 g/l de NaCl (Junsei Kagaku), 6 g /l de Na_{2}HPO_{4}, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1g/l de NH_{4}Cl y 1,5 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O (al que se hará referencia en adelante como "medio LBG-M9), al que se le añadieron 25 \mug/ml de tetraciclina, 25 \mug/ml de kanamicina y agar (al que se hará referencia en adelante como placa "LBG-M9+Tet+Km) Sobre el medio de agar, la cepa G106S, a la cual se incorporó pUT399Km_\DeltaarcA en su cromosoma, puede seleccionarse como una cepa de recombinación única, es decir, la cepa con el gen arcA alterado, ya que el plásmido derivado de pUT399 no puede replicarse en Pantoea ananatis tal como se ha descrito anteriormente. La cepa S17-1\lambdapir de E. coli (R.Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVIEMBRE 1983, 784-791 (1983), se transformó con, pUT399Km_\DeltaarcA y se aplicó sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina. Después del cultivo, el transformante obtenido, E. coli S17-1\lambdapir/pUT399Km_\DeltaarcA, se cultivó en medio LBG-M9 que contenía 25 \mug/ml de tetraciclina durante un día a 34ºC Cada uno de los medios de cultivo se centrifugó y respectivamente se obtuvieron células que se suspendieron en 50 \mul de medio LB. 25 \mugl de cada suspensión se mezclaron y cultivaron en medio LBG-M9 agar durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, el cultivo se continuó durante 3 horas a 34ºC para provocar la transferencia por conjugación. Entonces, las células cultivadas diluidas hasta concentraciones de 10^{-1}, 10^{-2} ó 10^{-3} , se aplicaron a la placa LBG-M9+Tet+Km, seleccionándose las cepas resistentes a la tetraciclina y a la kanamicina. Se llevó a cabo la PCR colonial para algunas cepas entre las seleccionadas para confirmar la deleción del gen arcA. De este modo, se obtuvo la cepa con el gen arcA alterado derivada de G106S, G106S\DeltaarcA.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa G106S\DeltaarcA se transformó
con pSTVCB. El transformante obtenido
G106S\DeltaarcA/pSTVCB es equivalente a la cepa con el gen
alterado arcA del AJ13601 (AJ13601\DeltaarcA)
mencionado anteriormente. La cepa
G106S\DeltaarcA/
pSTVCB y la cepa AJ13601 como control, se cultivaron, y se midieron las cantidades que produjeron de ácido L-glutámico, respectivamente.
pSTVCB y la cepa AJ13601 como control, se cultivaron, y se midieron las cantidades que produjeron de ácido L-glutámico, respectivamente.
A continuación se muestran los medios,
procedimientos de cultivo y el procedimiento analítico.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Concentración final
- Sacarosa
- 30 g/l (esterilizado separadamente)
- MgSO_{4 \cdot}7H_{2}O
- 0,5 g/l (esterilizado separadamente)
- (NH_{4})_{2}SO_{4}
- 20 g/l
- KH_{2}PO_{4}
- 2 g/l
- Extracto de levadura
- 2 g/l
- FeSO_{4}
- 0,02 g/l
- MnSO_{4}
- 0,02 g/l
- Lisina
- 0,2 g/l
- Metionina
- 0,2 g/l
- Diaminopimelato
- 0,2 g/l
- pH
- 7,0 (KOH)
- CaCO_{3}
- 20 g/l (esterilizado separadamente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon bacterias que estaban
almacenadas
Medio agar LBG-M9 (se añadieron
medicamentos si era necesario), 34ºC, 24 horas
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias que experimentaron el cultivo de
refresco se inocularon.
Medio LB líquido (se añadieron medicamentos si
eran necesarios), 37ºC, 16 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon tres asas de platino del cultivo
de siembra.
Medio base (se añadieron medicamentos si eran
necesarios), 34ºC, 24 horas.
5 ml por tubo de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras del caldo de cultivo en un
volumen de 400 \mul a lo largo del tiempo, midiéndose la
concentración de sacarosa y la acumulación de ácido
L-glutámico en el caldo de cultivo. La concentración
de sacarosa y la acumulación del ácido L-glutámico
se midieron en el sobrenadante del caldo de cultivo obtenido
después de centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos, que se
diluyó hasta una concentración apropiada con agua, utilizando el
Analizador Biotech (Sakura Seiki). La acumulación del ácido
L-glutámico y el rendimiento en el lugar en el que
el sacárido se agotó se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado, se reconoció que tanto la
acumulación como el rendimiento del ácido glutámico mejoraron en la
cepa con el gen alterado arcA cuando se compararon con la
cepa de control.
\vskip1.000000\baselineskip
En el Ejemplo anterior 2, se reconoció que tanto
la acumulación como el rendimiento del ácido
L-glutámico mejoraron en la cepa con los genes
arcA y sucA alterados, cuando se comparó con la de control,
la cepa alterada sucA.
Entonces, se investigó el efecto sobre la
producción de L-arginina utilizando ácido glutámico
como substrato. Se utilizó la cepa 237 de E. coli como cepa
productora de L-arginina. La cepa 237 se depositó en
el Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)
el 10 de abril de 2000, con el número de registro de VKPM
B-7925, y entonces, el depósito se transfirió al
depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest
el 18 de mayo de 2001.
\vskip1.000000\baselineskip
Se alteró un gen arcA de la cepa 237 para
preparar una cepa con el gen arcA alterado,
237\DeltaarcA, de la misma manera que en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar el efecto de la alteración del gen
arcA sobre la fermentación de la L-arginina,
se cultivaron 237\DeltaarcA, cepa con el gen arcA
alterado de 237, y la cepa 237 como control, midiéndose las
cantidades de la producción de L-arginina.
A continuación se muestran los medios,
procedimientos de cultivo y el procedimiento analítico.
\newpage
- \quad
- Concentración final
- Glucosa
- 60 g/l (esterilizado separadamente)
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 1 g/l (esterilizado separadamente)
- (NH_{4})_{2}SO_{4}
- 25 g/l
- KH_{2}PO_{4}
- 2 g/l
- Extracto de levadura
- 5 g/l
- Tiamina
- 0,1 mg/l
- pH
- 7,2
- CaCO_{3}
- 25 g/l (esterilizado separadamente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon bacterias que estaban
almacenadas
Medio agar LB (se añadieron medicamentos si era
necesario), 32ºC, 24 horas
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó un asa de platino del cultivo de
siembra.
Medio de evaluación para la arginina (se
añadieron medicamentos si eran necesarios), 32ºC, 3 días
2 ml por tubo de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras del caldo de cultivo en un
volumen de 500 \mul a lo largo del tiempo, midiéndose la
concentración de glucosa y la acumulación de
L-arginina en el caldo de cultivo. La concentración
de glucosa y la acumulación de L-arginina se
midieron en el sobrenadante del caldo de cultivo obtenido después de
centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos, que se diluyó hasta
una concentración apropiada con agua, utilizando el Analizador
Biotech (Sakura Seiki) y el Analizador de Aminoácidos
L-8500 (HITACHI Keisokuki service). La acumulación
de L-arginina y el rendimiento en el lugar en el que
el sacárido se agotó se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se reconoció que tanto la acumulación como el
rendimiento de la L-arginina mejoraron en la cepa
con el gen alterado arcA cuando se compararon con la cepa de
control.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para producir una
sustancia diana por fermentación utilizando una cepa bacteriana que
carece del gen ArcA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
EP-A-63215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2002-203764
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-07-12
\vskip1.000000\baselineskip
<1600> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagctta aagcccttta cttagctta
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgcgccat ctgtcgcttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para secuenciar el gen arcA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagcgacag atggcgcgga aaagctacaa gttcaatggt
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para secuenciar el gen arcA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctagag gttgaaaaat aaaaacggc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen dam de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttc cgtggtatgt cctggtttc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen dam de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagactgatca ggtcgctatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para secuenciar el gen dam de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatagcgacc tgatcagtct gccttatgca ccgctgtctg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen dam de E. coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctagac gtcagattgg gaacatagt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen fnr de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttg caattgggcc gtcctggcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen fnr de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaagctgat caagctcatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen fnr de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggagttga tcagcttgag aaaaatgccg aggaacgtc
\hfill39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen fnr de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctagat tggtcgtcct ggttaggat
\hfill29
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen sucA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttc tgcccctgac actaagaca
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen sucA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaggtaacg ttcaagacct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen sucA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtcttgaa cgttacctcg atccataacg ggcagggcgc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen sucA de E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtctagac cactttgtca gtttcgatt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA Pantoea ananatis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgaattcc ctgtttcgat ttagttggc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA Pantoea ananatis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgcatgcg attaatcttc cagatcacc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 759
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pantoea ananatis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(757)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pantoea ananalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen ori6K y mobRP4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatagatct tttagattga tttatggtgc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen ori6K y mobRP4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacagatct aattcccatg tcagccgtta
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen de resistencia al cloramfenicol
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataaagatct gtgtccctgt tgataccggg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen de resistencia al cloramfenicol
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggagatct tgcaaggcga ttaagttggg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen de resistencia a la kanamicina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagatcta gttttcgccc cgaagaacg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen de resistencia a la kanamicina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagatctc cagagtcccg ctcagaaga
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA Pantoea ananatis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgaattcg cgaccgatgg tgcagagat
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA Pantoea ananatis
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<400> 28
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\hskip-.1em\dddseqskipaaggcaaatt catggtgcgc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA Pantoea ananatis
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<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaccatg aatttgcctt acccaatgaa gagcgtcgcc
\hfill40
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<210> 30
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen arcA Pantoea ananatis
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<400> 30
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgcatgca ccttcgccgt gaatggtgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (101)..(817)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Procedimiento para producir una sustancia
diana seleccionada de entre el grupo constituido por
L-lisina, L-treonina,
L-isoleucina, ácido L-glutámico,
L-glutamina, L-arginina,
L-homoserina y ácido succínico, que comprende el
cultivo de una \gamma-proteobacteria en un medio
bajo condiciones aeróbicas para producir y acumular la sustancia
diana en el medio o las células, y recuperar la sustancia diana a
partir del medio o de las células, en el que la
\gamma-proteobacteria que presenta la capacidad
de producir la sustancia diana es modificada, de manera que la
producción de la proteína ArcA es reducida o eliminada, y en el que
la proteína ArcA es la siguiente (A) o (AB):
(A) una proteína que presenta la secuencia
aminoácida de SEC ID nº 32;
(B) una proteína que presenta la secuencia
aminoácida de SEC ID nº 32, que comprende la sustitución, deleción,
inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que mejora la capacidad
de la \gamma-protobacteria de producir la
sustancia diana cuando la producción de la proteína es reducida o
eliminada en la \gamma-proteobacteria comparada
con una cepa de tipo salvaje o una cepa no modificada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la proteína ArcA que se define en (B), es una proteína que
presenta un 90% o más de homología con la secuencia aminoácida de
SEC ID nº 32 y que mejora la capacidad de la
\gamma-proteobacteria para producir la sustancia
diana cuando la producción de la proteína es reducida o eliminada en
la \gamma-proteobacteria comparada con una cepa de
tipo salvaje o no modificada.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la producción de la proteína ArcA es reducida o eliminada
mediante la alteración de un gen arcA en un cromosoma, y en
el que el gen arcA es de ADN definido en (a) o (b) a
continuación:
(a) ADN que contiene la secuencia nucleótida de
los nucleótidos números 101 a 817 de la SEC ID nº 31;
(b) ADN que puede hidridizarse con la secuencia
nucleótida de los nucleótidos números 101 a 817 de la SEC ID nº: 31
o una sonda que puede obtenerse a partir de la secuencia nucleótida
bajo condiciones de rigurosidad y que codifica una proteína que
mejora la capacidad de la \gamma-proteobacteria de
producir la sustancia diana cuando la producción de la proteína es
reducida o eliminada, comparada con una cepa de tipo salvaje o no
modificada, en la que dichas condiciones son 1 x SSC, SDS al 0,1%, a
60ºC.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 anteriores, en el que dicha
\gamma-proteobacteria es una bacteria que
pertenece al género Escherichia o Pantoea.
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| RU2338784C2 (ru) * | 2006-03-24 | 2008-11-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Новая альдолаза, днк, кодирующая альдолазу, клетки, трансформированные днк, способ получения альдолазы и способ получения 4-гидрокси-l-изолейцина (варианты) |
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