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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Lösung für die Lagerung und Perfusion
von Organen, die auf eine Transplantation warten.
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In
den letzten 10 Jahren wurden orthotopische Organtransplantationen
eine unersetzliche therapeutische Methode für Patienten mit besonderen,
terminalen Organerkrankungen, wie z.B. Leber-, Herz-, Pankreas-,
Lungen- und Nierenerkrankungen.
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Die
Abstoßung
des transplantierten Organs ist jedoch weiterhin ein substanzielles
Problem.
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Die
Abstoßung
trägt z.B.
zu einer Mortalitätsrate
von 15 bis 25 % während
des ersten Jahres nach der Chirurgie im Fall einer Lebertransplantation
bei (Strasberg S.M. et al., Hepatology 1994, 20:829).
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Die
Phasen, in der die Leber für
die Transplantation zu Schaden kommt, wurden wie folgt bestimmt
- 1) Wärmeischämie während der
Entfernung aus dem Donor;
- 2) Kaltischämie
während
der hypothermen Lagerungsphase;
- 3) Reperfusion des Organs im Empfänger;
(Transplantation
53:957–978,
1992).
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Die
grundlegende Strategie für
die Lagerung von Organen für
die Transplantation ist diejenige einer Verlangsamung der zellulären katabolischen
Prozesse durch Erniedrigung der Temperatur des Organs von 37°C auf ungefähr 4 bis
6°C (Hypothermie).
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Die
Hypothermie erniedrigt die Stoffwechselrate und die Hydrolyserate,
katalysiert durch verschiedene intrazelluläre Enzyme, inhibiert den zellulären Stoffwechsel
jedoch nicht vollständig.
Dies kann zu Prozessen führen,
die zu zellulären
Veränderungen
sowohl in dem Endothelsinusoidkompartiment als auch im hepatozytischen
Kompartiment führen.
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Tatsächlich führt die
Abkühlung
einer isolierten Leber ohne Perfusion zu einer schnellen Reduktion
der ATP- und ADP-Niveaus (J. Surg. Res. 23:339–347, 1977; Cryobiology 31:441–452, 1994)
insoweit als die Restenergiebedürfnisse
die zelluläre
Kapazität
zur Erzeugung von ATP durch anaerobe Glykolyse aus den Glykogenreserven überschreiten,
mit einer darauffolgenden Anhäufung
von Milchsäure
und intrazellulärer
Azidose.
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Der
Abbau von ATP zu ADP und darauffolgend zu AMP und Adenin führt während der
Hypothermie zu einer Anhäufung
von Hypoxanthin mit gleichzeitiger Umwandlung von Xanthindehydrogenase
zu Xanthinoxidase und ist mit Anstiegen im intrazellulären Calcium
und einer Proteaseaktivierung assoziiert (McCord J. M., N. Engl.
J. Med. 1985, 312:158).
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Im
Reperfusionszustand führt
dies zu einem Abbau von Hypoxanthin zu Xanthin und dann zu Harnsäure mit
Erzeugung von reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROI) und Schaden
vom oxidativen Typ.
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Weiterhin
führt die
verminderte Aktivität
der Enzyme, wie z.B. der Na/K ATPasen zu Veränderungen in den Bedingungen
des Elektrolytgleichgewichts mit darauffolgendem Wassereinfluss
und zellulärem
Anschwellen.
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In
den letzten Jahren wurde eine direkte Korrelation zwischen ATP-Gehalt während der
hypothermen Lagerung des Organs für die Transplantation und dem
Erfolg der Transplantation beim Menschen demonstriert (Hepatology
1988, 8: 471).
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Um
solche Nachteile zu überwinden,
wurden Lagerlösungen
verwendet, deren Zusammensetzung untersucht wurde, um den gefährlichen
Wirkungen der Sauerstoffmangel-Hypothermie (während der Lagerphase) entgegenzuwirken
und denen der normothermischen Reperfusion (während der Implantationsphase).
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Die
Formulierung solcher Lösungen
ist eine kontinuierliche Entwicklung, um eine Verbesserung des vitalen
Zustands des Organs und einen Anstieg der Konservierungszeiten zu
ermöglichen.
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Lösungen,
die für
die Lagerung von Organen nützlich
sind, die auf eine Transplantation warten, sind bereits bekannt.
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In
Transplantation 2000 Apr. 15; 69(7):1261–5 wird berichtet, dass die
Lösung
der University of Wisconsin, die als UW-Lösung bekannt ist, dazu in der
Lage ist, die Stoffwechselprozesse zu verlangsamen und eine gute
Konservierung der Organe, die auf die Transplantation warten, sicherzustellen.
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Die
Zusammensetzung der UW-Lösung
basiert auf einer pharmakologischen Strategie, die folgendes beabsichtigt:
- 1) die Resynthese von ATP durch Zugabe von
Vorläufern
wie Adenin und Phosphat zu begünstigen;
- 2) eine Azidose durch Gegenwart von Phosphatpuffer zu verhindern;
- 3) die Xanthinoxidase-Aktivität durch Allopurinol zu inhibieren;
- 4) die ionische Umverteilung zu minimieren unter Verwendung
einer Zusammensetzung, ähnlich
derjenigen, die intrazellulär
angetroffen wird (hoch an K+) und vor allem
- 5) ein zelluläres
Anschwellen durch den osmotischen Druck zu verhindern, durch Zugabe
von Lactobionat, Raffinose und hochmolekularen Kolloiden wie Stärke.
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Die
grundlegende Strategie dieser Zusammensetzung ist jedoch empirisch
und es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Wirkung sich von
einem Phänomen
ableiten könnte,
das als "Summe von
Schutzwirkungen" bekannt
ist (Southard J. H. et al., Transplantation 1990, 49: 251).
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In
Transplant Proc. 1999; August; 31(5):2069–70 wird berichtet, dass die
Celsiorlösung
für die
Lagerung von Organen, die auf eine Transplantation warten, geeignet
ist.
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Die
Salzlösung
EuroCollins ist eine andere bekannte Lösung, die für die Lagerung von Organen
geeignet ist, mit der in der folgenden Tabelle 1 dargestellten Zusammensetzung.
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Diese
Lösung
wurde für
viele Jahre als Standardlösung
in Europa für
die Lagerung von Organen, insbesondere Nieren, angesehen. Ihre Formulierung
basiert auf dem Erhalt einer elektrolytischen Zusammensetzung, die
die intrazelluläre
Umgebung stimuliert. Weiterhin wird in dieser Lösung eine Hypertonizität (420 mOsmol)
durch Zugabe von hohen Glukosekonzentrationen (um 190 mM) erhalten.
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Die
oben zitierten Lösungen
sind jedoch nicht ohne Nachteile und wurden etlichen Modifikationen
unterzogen.
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Die
Hauptnachteile, die die UW-Lösung
zeigt, liegen in ihrer hohen Viskosität mit dementsprechenden möglichen
Schäden,
vor allem erhalten in den Endothelzellen während Perfusion des Organs
und in den hohen Kosten je des einzelnen Bestandteils, während unsicher
ist, ob diese tatsächlich
nützlich
sind [Transplant Proc. 1999; August; 31(5):2069–70].
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Die
Celsiorlösung
hat den Nachteil, dass sie keine geeignete Lösung für eine Leberlagerung ist, wenn sie
mit der UW-Lösung
verglichen wird [Transplant. 2000; Okt. 27;70(8):1140–2].
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Die
EuroCollins-Lösung
zeigt etliche Nachteile:
- 1: Sie hat eine hohe
Glukosekonzentration, was das Problem der Azidose, aufgrund der
enormen Produktion von Lactat während
der hypothermen Hypoxie verschlimmert;
- 2: Sie verhindert nicht das zelluläre Anschwellen während der
Lagerung des Organs;
- 3: Sie ist nicht besser als die UW-Lösung (Transplantation 2000
Apr. 15; 69(7):1261–5).
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Die
Verwendung von Carnitinen auf dem medizinischen Gebiet ist bereits
bekannt.
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In
Ann. Thorac. Surg. 2001; 71:254–9
wird die Verwendung von L-Carnitin für die Behandlung der kardioplegischen
Ischämie
am isolierten Kaninchenherzen beschrieben. Diese Arbeit berichtet,
dass L-Carnitin eine Schutzwirkung auf die Erholung der Herzfunktionen
beim isolierten Kaninchenherzen zeigt, wenn dieses mit Gesamtblut
perfundiert wurde, dem L-Carnitin zugefügt wurde.
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Andere
Referenzen betreffen das Problem der Konservierung von Organen.
Skrede, S., et al., Criobiology, 1983, Jun; 20(3):290–7, berichtet über die
Zugabe von Pantothetin und Adenosin als Vorläufer von CoA, um Cytosol- und
Mitochondrienpools von CoA in Nieren, die hypotherm perfundiert
werden, zu konservieren. Es wird vorgeschlagen, dass L-Carnitin
das Perfusionsmedium verbessert. Die Verwendung von L-Carnitin bei der
kalten Kardioplegie, gefolgt von Reperfusion, wird von Nakagawa
T., et al. in Thorac. Cardiovasc. Surg, 1994, Apr; 42(2):85–9 offenbart.
Die WO 00/30637 offenbart die Verwendung von Fumaratsalz von L-Carnitin oder
2 bis 8 Kohlenstoffatom-haltigen Alkanoyl L-Carnitinen für die Herstellung
eines Medikaments für
die Behandlung oder Verhinderung einer Organischämie. L-Carnitin-Hydrochlorid wird
bei der kalten Ischämie-Konservierung
von Fettlebertransplantaten verwendet (Puetz, U., et al., Transplant
Proc, 2001 Jun; 33(4):2523–4). L-Carnitin
wurde auch als Präventivmittel
für eine
experimentelle renale Ischämie-Reperfusionsverletzung
offenbart (Ergun, O., et al., Urol. Res., 2001 Jun; 29(3):186–9).
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Die
Verwendung von Carnitin bei der Herstellung einer Lösung für die Lagerung
von Organen, die auf eine Transplantation warten, wurde vorher noch
nie beschrieben.
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Es
wurde nun festgestellt, dass die Zugabe von Carnitin und/oder Alkanoyl-L-Carnitin
zu einer Lagerlösung
für isolierte
Organe eine überraschende
Fähigkeit
zur Lagerung und Perfusion von Organen zeigt, die derjenigen der
vorher erwähnten
bekannten Lösungen überlegen
ist.
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Die
Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung unterscheidet sich von den bekannten Lösungen durch die Gegenwart
von L-Carnitin und/oder einem Alkanoyl-L-Carnitin.
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Die
Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist für
die Verwendung bei der Lagerung und Perfusion von Organen, die auf
eine Transplantation warten, geeignet.
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Nicht
begrenzende Beispiele solcher Organe sind Herz, Leber, Pankreas,
Lunge und Niere.
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Vorzugsweise
umfasst die Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung L-Carnitin und ein Alkanoyl-L-Carnitin, wobei das Alkanoyl
L-Carnitin gewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl, Propionyl, Valeryl, Isovaleryl,
Butyryl und Isobutyryl-L-Carnitin.
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In
einer allgemeinen Ausführungsform
umfasst die Lagerlösung
für den
Erhalt und die Perfusion von Organen, die auf eine Transplantation
warten, gemäß der Erfindung
folgendes:
- (a) eine isotonische balancierte
Lösung,
umfassend eine physiologisch akzeptable Menge Kalium-, monosaures
Phosphat-, bisaures Phosphat-, Chlorid-, Natrium- und Bicarbonationen;
- (b) 50 bis 250 mM Glucose;
- (c) 0,2 bis 20 mM Alkanoyl-L-Carnitin oder eines seiner physiologisch
akzeptablen Salze und/oder
- (d) 1 bis 100 mM L-Carnitin oder eines seiner physiologisch
akzeptablen Salze;
- (e) Wasser.
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In
einer ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hat die Lösung für die Konservierung und Perfusion
von Organen, die auf eine Transplantation warten (die hiernach als "Carnival Solution" bezeichnet werden
wird) die in Tabelle 2 dargestellte Zusammensetzung.
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Isovaleryl-L-Carnitin
ist das bevorzugte Alkanoyl-L-Carnitin. Unter physiologisch akzeptablem
Salz von L-Carnitin oder Alkanoyl-L-Carnitin wird jedes Salz mit einer
Säure verstanden,
die nicht zu unerwünschten toxischen
Wirkungen führt.
Diese Säuren
sind dem Pharmakologen und Experten in der pharmazeutischen Technologie
wohlbekannt.
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Nicht
begrenzende Beispiele dieser Salze sind Chlorid, Bromid, Orotat,
saures Aspartat, Saures Citrat, Magnesiumcitrat, saures Phosphat,
Fumarat und saures Fumarat, Magnesiumfumarat, Lactat, Maleat und saures
Maleat, Mucat, saures Oxalat, Pamoat, saures Pamoat, saures Sulfat,
Glukosephosphat, Tartrat, saures Tartrat, Magnesiumtartrat, 2-Aminoethansulfonat,
Magnesium-2-aminoethansulfonat, Cholintartrat und Trichloracetat.
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Fumarat
wird bevorzugt.
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Ein
Beispiel einer bevorzugten Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung wird in Tabelle 3 dargestellt.
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Die
Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung kann zusätzlich
folgendes enthalten:
- 1) Ein oder mehr Antioxidanzien
in nützlichen
Mengen, um die Bildung von freien Radikalen, die von Sauerstoff
abstammen, zu verhindern. Nicht begrenzende Beispiele solcher Oxidanzien
sind: Allopurinol, Glutathion, (β-Carotin,
Katalase, Superoxiddismutase, Dimethylthioharnstoff (DMTU), Diphenylphenylendiamin (DPPD),
Mannitol und Cyanidanol und Vitamin E und/oder
- 2) Dichloressigsäure
zur Reduktion von Lactat, das während
der Konservierung gebildet wird.
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Die
Menge der Antioxidanzien und/oder Dichloressigsäure, die verwendet werden soll,
ist dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und in der Literatur
gut dargestellt.
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Die
Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist für
eine Verwendung zur Verhinderung der Mechanismen geeignet, die zu
Schäden
an Organen führen
und ist daher eine Lösung,
die (a) eine intrazelluläre
Azidose verhindert oder reduziert; (b) den Schaden verhindert, der
durch freie Sauerstoffradikale ausgelöst wird, insbesondere während der
Reperfusion; (c) die Regeneration von Hochenergiephosphaten während der
Reperfusion ermöglicht;
(d) vor der Ausdehnung der intrazellulären Räume schützt; (e) die zellulären Stoffwechselanforderungen
erhält.
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Die
Schutzaktivität
der Lösung
gemäß der Erfindung
wurde in geeigneten experimentellen Modellen bewertet, die als Referenzen
bekannte Lösungen
aufweisen, die für
denselben Zweck geeignet sind.
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Die
folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung weiter.
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Beispiel 1
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Viele
Studien haben eine Korrelation zwischen der Fähigkeit des Transplantatorgans
zur Regeneration von Hochenergie-phosphorylierten Verbindungen,
wie z.B. ATP und dem Erfolg der Transplantation demonstriert. Tatsächlich ist
einer der wichtigsten Aspekte z.B. bei der Lagerung von Leber die
Fähigkeit
zur Regeneration von Hochenergie-phosphorylierten Verbindungen wie
ATP nach der Transplantation.
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Die
Hochenergie-phosphorylierten Verbindungen müssen für eine große Zahl regulatorischer Mechanismen
zur Verfügung
stehen, die einen zellulären
Schaden verhindern. Die Niveaus an NTP (Nukleosodtriphosphaten)
in der Leber müssen
ausreichend hoch sein, um kritische zelluläre Prozesse wieder herzustellen, wie
den Erhalt von Gradienten, die den Ionenaustausch über das
Plasma und die Mitochondrienmembranen regulieren, die Proteinsynthese,
die Gallenerzeugung und den Harnstoffzyklus.
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In
den experimentellen Versuchen, die durchgeführt wurden, um die Wirksamkeit
der Lösung
gemäß der vorliegenden
Erfindung zu demonstrieren, wurden isolierte Rattenlebern verwendet,
worin Veränderungen in
ATP, ADP und Gesamt-Adeninnukleotid (NTP) -niveaus durch Spektroskopie 31P-NMR (J. Lab. Clin. Med. 1992, 120; 559;
Transplantation 1994, 57: 1576) während der Kaltischämie, während der
Periode der Konservierung und während
der Reperfusion analysiert wurden.
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Die
Realisierung dieser experimentellen Versuche machten die Lösung der
folgenden Hauptprobleme nötig:
- 1) Konstruktion einer Perfusionskammer, die
an eine Arbeit innerhalb eines NMR-Magneten angepasst ist und die
Erzeugung des pertinenten Perfusionskreislaufes;
- 2) Konstruktion einer Radiofrequenz (RF) -Spule, die mit der
Perfusionskammer verwendbar ist;
- 3) die Definition von Zeiten (Dauer der Perfusion, Konservierung
und Reperfusionsphasen; Intervalle für die Untersuchung durch Spektroskopie
während
jeder dieser Phasen; minimale Dauer eines einzelnen Spektrums; Optimierung
der Passagezeiten von einer Phase zur anderen).
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Perfusionskreislauf
und Kammer
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Das
Diagramm des Perfusionskreislaufs ist in 1 dargestellt.
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Die
Konstruktion dieses Kreislaufes wurde durchgeführt, wobei mit in die Betrachtung
einbezogen wurde, dass die geeigneten Temperatur- und Sauerstoffanreicherungsbedingungen
in dem Organ erhalten bleiben müssen,
das in einer Entfernung von etlichen Metern vom Perfusionssystem
lokalisiert ist, bestehend aus Pumpen und einem Thermostat. Tatsächlich müssen diese
Instrumente außerhalb
des Magnetfeldes der Messinstrumente positioniert sein, korrespondierend
zu einer minimalen Entfernung von 6 m in unserem Fall.
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Das
KH-Perfusionsmedium (Krebs-Henseleit + Glukose + BSA) (400 ml) (Krebs
H. A. 1930; Biochem. J. 98, 720; Henseleit K. 1932; Hoppe-Seylerr's Z. physiol. Chem.
210, 33.), platziert in einem thermostatischen Behälter, entfernt
von den Magneten, wurde kontinuierlich durch magnetisches Rühren vermischt.
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Die
Temperaturregelung wurde so durchgeführt, dass eine Temperatur von
37 ± 0,5°C in der
Perfusionskammer, enthaltend das Organ innerhalb der Magneten, erhalten
wurde.
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Die
Sauerstoffanreicherung des Mediums wurde durch Verwendung eines
Membranoxygenators sichergestellt.
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Das
Sauerstoff-Sättigungsniveau
wurde auf der Basis des Permeabilitätsfaktors des verwendeten Silikons
berechnet, des Kalibers und der Dicke des Rohrs, der Flussrate und
der Länge
des Rohrs, eingehüllt
in einer Spirale innerhalb des Sauerstoffanreicherungs- und Thermostatapparats.
Die berechneten Werte ergaben Ergebnisse zwischen 30 und 35 % O2.
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Das
Perfusat wurde mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe mit einer Flussrate
von 25 ml/min recyclet.
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Der
Perfusionskreislauf verwendete Polyethylenröhren mit einem Innendurchmesser
von 1 mm und einer Länge
von 6 m zu und von den Magneten.
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Um
den Erhalt einer kontrollierten Temperatur innerhalb der Perfusionskammer
im Magneten sicherzustellen, wurden sowohl der Thermostat als auch
der Perfusionskreislauf so angeordnet, dass sie gleichzeitig in
das thermoisolierte Neoprenrohr eingeführt wurden.
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Der
Kreislauf wurde aktiviert und mindestens eine Stunde vor der Organperfusion
stabilisiert, um sicherzustellen, dass er die gewünschte Temperatur
und Sauerstoffanreicherung erreichte.
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Die
Perfusionskammer, konstruiert in Perspex, wurde an einen PVC-Träger fixiert,
um eine Insertion in die Magneten zu ermöglichen. Diese hatten eine
zylindrische Geometrie, einen Durchmesser von 34 mm × 65 mm
in der Höhe.
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Die
Leber wurde aufgehängt
in der gewünschten
Höhe durch
Fixieren der Kanüle
mit geeigneten Entfernungsträgerscheiben
gehalten. Die Drainage wurde durch Sammeln der Perfusionsflüssigkeit
in dem trichterförmigen
Boden durchgeführt,
gefolgt von einer Aspiration zu dem Sammelreservoir.
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Ein
normothermer Schaden durch Ischämie
und Reperfusion ist ein bestimmender Faktor bei der Pathogenese
von Leberschäden,
die sich während
chirurgischer Verfahren ergeben, wie z.B. einer Leberresektion und
einer Lebertransplantation.
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Um
die Wärme-Ischämiezeit
so weit wie möglich
zu minimieren, wurden Variationen des chirurgischen Standardverfahrens
einer Leberentfernung eingeführt.
Insbesondere wurden Tiere, die nicht gefastet hatten, verwendet;
bei Tiermodellen zeigten tatsächlich
Studien in vivo als auch in vitro, dass ein Fasten den normothermen
Ischämieschaden
verschlimmert, der durch eine Reduktion im Glykogengehalt ausgelöst wird.
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Männliche
Wistar-Ratten wurden mit einem anfänglichen Körpergewicht von 150 g verwendet.
Die Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion (i.p.) von Natriumthiopental
anästhesiert,
dann einer medianen Inzision mit darauffolgender Öffnung des
Peritoneums unterzogen.
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Die
Portalvene und die Vena cava inferior wurden freigelegt, so viel
Adhärenzen
und Fett wie möglich wurden
entfernt, um eine Entfernung des Organs schneller zu machen und
die Zeit der Ischämie
zu minimieren.
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Für die Vena
cava inferior und die Portalvene wurden Ligaturen hergestellt.
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Die
Vena cava wurde geschlossen, gefolgt von, in schneller Folge, der
Portalvene.
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Eine
Kanüle
wurde in die Portalvene inseriert (Abbocath-T 20G; Abbott), die
mit einer vorher hergestellten Naht fixiert wurde und mit einer
Spritze, enthaltend kalte Ringer-Lactatlösung für eine erste Blutwaschperfusion
(Dawson R. M. C. (Herausgeber), Ellott D. C. Elliott W. H. und Jones
K. M. (1969) Data for biochemical research, 2. bis 4. Auflage, Clarendon
Press, Oxford) verbunden wurde. Die Vena cava wurde geschnitten,
um den Ausfluss der Perfusionsflüssigkeit
zu ermöglichen.
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Dann
wurde das Organ so schnell wie möglich
entfernt.
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Vom
Schließen
der Blutgefäße bis zum
Beginn der Perfusion innerhalb der Magneten lag ein Zeitintervall
von nicht mehr als 10 Minuten, mit 1 bis 2 Minuten einer Hitze-Ischämie.
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Man
ließ die
Kanüle
in situ und verwendete sie für
die Reperfusion. Das befolgte experimentelle Protokoll wird in dem
folgenden Diagramm 1 dargestellt.
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Die
Lebern wurden in situ mit Ringers Lactatlösung bei 4°C perfundiert, um das Blut zu
eliminieren und um die normothermen Ischämiezeiten des Organs so weit
wie möglich
zu begrenzen.
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Die
isolierten Organe wurden dann in Perfusion innerhalb der Magneten
platziert, in einem geeigneten Bioreaktor, versorgt mit Krebs-Henseleit-Lösung bei 37°C, 35 % O2 für den Erhalt
der basalen Referenzspektren 31P-NMR (Zeit
0).
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Der
Erhalt dieser NMR-Spektren wurde durchgeführt, um die biologische Variabilität zwischen
den Organen zu eliminieren; auf diese Weise können tatsächlich die nach Konservierung
beobachteten Variationen auf Werte bezogen werden, bestimmt im selben
Organ, direkt nach Entfernung aus dem Tier und stabilisiert in Perfusion
für 40
Minuten.
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Nach
Abschluss der 40 Minuten Stabilisierung wurden die Organe mit unterschiedlichen
Lagerlösungen
bei 4°C
perfundiert.
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Die
experimentellen Tests wurden unter Verwendung der Carnivallösung gemäß der vorliegenden
Erfindung und zwei bekannten Lagerlösungen als Referenz durchgeführt:
- 1) UW-Lösung
unter Zugabe von Insulin (40 I.U./l) und Dexamethason (8 mg/l) und
- 2) EuroCollins-Lösung.
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Tabelle
4 berichtet über
die Zusammensetzungen der Carnival-, Euro-Collins- und UW-Lösungen. Tabelle
4
- "-" bedeutet "abwesend
- "+" bedeutet "liegt vor".
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Bei
einigen Experimenten wurden die Spektren kalt, direkt nach Perfusion
des Organes mit der Lösung gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten, um die Kinetik des Verschwindens der phosphorylierten
Metaboliten in der ersten Stunde zu bewerten.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 8 bis 10 dargestellt.
Für jedes
Spektrum wurde folgendes festgehalten:
- 1) das
Gesamtniveau der phosphorylierten Metabolite;
- 2) das Niveau an anorganischem Phosphat und Phosphomonoestern
(Pi + PME);
- 3) das Niveau der Nukleosidtriphosphate (NTP);
- 4) das Niveau von NAD als Summe der Signale α-NTP + NAD.
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Die
Spektren wurden in 10minütigen
Intervallen über
eine Stunde erhalten.
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Die
Lebern wurden durch Eintauchen in etliche Lösungen bei 4°C für eine Gesamtzeit
von 26 Stunden gelagert.
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Die
Lagerzeit wurde gewählt,
um die Wiederbeginnfähigkeit
nach einer sehr viel längeren
Zeit als der normal in der klinischen Praxis oder in Experimenten
verwendeten zu bewerten.
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Nach
Abschluss der Lagerzeit (26 Stunden) wurden die Lebern wiederum
innerhalb der Magneten in Perfusion mit Lösung KH bei 37°C, 35 % O2 platziert, um die phosphorylierten Metaboliten
zu überwachen.
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Die 31-P-NMR-Spektren wurden alle 15 Minuten über eine
Zeitgrenze von 140 Minuten erhalten.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 5 bis 7 dargestellt.
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Experimeatelle NMR-Bedingungen.
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Die
spezifischen Eigenschaften des 31P-NMR-Experiments
hingen strikt von der für
die Leberperfusion gewählten
experimentellen Konfiguration ab mit dem Hauptziel, Spektren zu
erhalten, die optimale Signal/Hintergrundverhältnisse aufwiesen.
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Die
besonderen Schwierigkeiten, die in die Betrachtung mit einzubeziehen
waren, waren die folgenden:
- i) Die Notwendigkeit,
kurze Scanningzeiten zu verwenden;
- ii) Optimierung der Betriebsbedingungen des Nuclear Magnetic
Resonance Systems;
- iii) Heterogenität
der Geometrie und Zusammensetzung der Proben.
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Die
verwendeten experimentellen Bedingungen waren:
- – spektrale
Bandbreite 8,33 KHz,
- – Probennahme
2048 Punkte,
- – Akquisitionen
900,
- – Dummyscan
2,
- – zweistufiger
Phasenzyklus,
- – Impuls
bei 90° (150 μs),
- – 2
Sekunden Wiederholungsintervall.
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Die
Spektren wurden in Relation zu den unterschiedlichen experimentellen
Bedingungen von einer Akkumulierung von 450 Scans unter Bedingungen
von Perfusion oder Reperfusion und von 300 Scans unter Bedingungen
einer Hypothermie jeweils mit einer Wiederholungszeit von 2 Sekunden
erhalten.
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Die
erhaltenen 31-P-NMR-Spektren zeigen Signale
relativ zu α-, β- und γ- Phosphat
der Nukleotidtriphosphate jeweils bei –9,7, –18,35 und –4,2 ppm und werden vorrangig
durch Adenosintriphosphat (ATP) und zu geringeren Mengen durch Guanosintriphosphat
(GTP), Uridintriphosphat (UTP) und Cytidintriphosphat (CTP) dargestellt.
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Das α-NTP zugeschriebene
Signal wird durch die Resonanz von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphaten
(NAD) und Nikotinamidadenin-Dinukleotidphosphat
erhalten.
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Die α- und β-Phosphate
der Nukleotiddiphosphate betreffenden Signale, im wesentlichen repräsentiert durch
Adenosindiphosphat (ADP) liegen jeweils bei –8,9 und –4,4 ppm. Dieses letzte Signal
wird teilweise durch das Signal von γNTP maskiert.
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Die
Signale bei –11,5
ppm, zugeschrieben den Verbindungen mit zwei di-veresterten Phsophatgruppen
(DPDE) werden im wesentlichen durch Uridindiphosphoglukose und Uridindiphosphoglukuronat
repräsentiert.
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Signale
in Bezug auf Phospholipintermediate liegen in der spektralen Zone
zwischen 5,8 und 4 ppm, wo die Kerne der Phosphatgruppen von Monophosphatestern
(PME) schwingen.
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300
mM Methylendiphosphonat (MDP), enthalten in einer Kapillare (0,5
ml), fixiert an der Innenseite der Perfusionskammer, wurde als Referenz
verwendet.
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Der
Signalbereich wurde durch Anwendung eines der bekannten Programme
für die
Rekonstruktion von Resonanzspektren bewertet (Programm SPEC ANA;
SMIS).
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Erhaltene Ergebnisse
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Die
anfängliche
Perfusion mit KH-Lösung
(37°C, 35
% O2) nach Entfernen und Waschen der Leber
mit Ringers-Lactatlösung
(4°C) für 40 Minuten
wurde als ausreichend für
die Stabilisierung des phosphorylierten Metabolitniveaus betrachtet.
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Die
anfänglichen
Niveaus (vor der Lagerung) von β-ATP
lagen bei 8,3 ± 3,1
bzw. die für α-ATP bei
22,6 ± 5,4
(während
die in der Tabelle dargestellten Werte als Prozentzahl der Referenz
ausgedrückt
werden).
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Die β-ATP/Pi +
PME, α-ATP/Pi
+ PME und β-ATP/α-ATP-Verhältnisse
ergaben Werte von jeweils 8,4 ± 5,
23,4 ± 10,2
bzw. 35,7 ± 11.
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Die
so erhaltenen Werte wurden als Referenz für die Zeit 0 für die darauffolgenden
Bewertungen verwendet.
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In
Tabelle 5 werden die Ergebnisse in Bezug auf das vorher erhaltene
repräsentative
Spektrum, während
und nach Konservierung mit Carnival-Lösung dargestellt.
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Die
Werte in Bezug auf nach der Explantation sind als Verhältnisse
des Referenzsignals ausgedrückt. Alle
anderen Werten werden als Prozentzahlen im Hinblick auf das letztere
ausgedrückt.
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In
Tabelle 6 werden Daten, betreffend ein vorher erhaltenes repräsentatives
Spektrum vor und nach Lagerung mit UW-Lösung dargestellt.
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Die
Werte in Bezug auf nach der Explantation sind als Verhältnisse
des Referenzsignals ausgedrückt. Alle
anderen Werten werden als Prozentzahlen im Hinblick auf das letztere
ausgedrückt.
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In
Tabelle 7 werden Daten, betreffend ein vorher erhaltenes repräsentatives
Spektrum während
und nach Lagerung mit EuroCollins-Lösung dargestellt.
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Die
Werte in Bezug auf nach der Explantation sind als Verhältnisse
des Referenzsignals ausgedrückt. Alle
anderen Werten werden als Prozentzahlen im Hinblick auf das letztere
ausgedrückt.
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In
Tabelle 7 werden Daten von einem einzelnen Reperfusions (30 Minuten)
-spektrum berichtet, da zu dieser und darauffolgenden Zeiten keine
Resynthese von phosphorylierten Verbindungen beobachtet wurde.
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Die
Kinetik des Verschwindens phosphorylierter Metaboliten, beobachtet
in den ersten 60 Minuten einer kalten Konservierung hat gezeigt,
dass das Signal von α-ATP
+ α-ADP
+ NAD bis zum Ende der Messungen für alle Konservierungslösungen auf
eine Weise, die von Organ zu Organ variiert, vorliegt.
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Das β-ATP-Signal
war bis zu einer maximalen Zeit von 30 Minuten nur mit Konservierung
mit UW nachweisbar, während
es selbst im ersten Spektrum für
EuroCollins und Carnival-Lösungen
nicht vorlag.
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Die γ-ATP- + β-ADP-Signale
verblieben bis zu 50 Minuten eines Erwerbs, jedoch nur aufgrund
der Gegenwart von ADP.
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Die
Restmenge der phosphorylierten Metabolite bei 60 Minuten korrelierte
nicht mit der Kapazität
für eine
Resynthese von ATP bei der normothermen Reperfusion nach 26 Stunden
einer Konservierung in den unterschiedlichen Lösungen.
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In
den Tabellen 8, 9 und 10 wurden Werte mit Standardabweichungen für β-ATP und α-ATP, erhalten nach
80 und 140 Minuten einer normothermen Perfusion nach Perfusion und
zu Beginn der Konservierung bei 4°C
(kalte Spektren, NMR-Analysen wurden ungefähr 2 Stunden nach Organentfernung
durchgeführt)
in Carnival-, UW- bzw. EuroCollins-Lösungen dargestellt. Tabelle
8
- (n ist die Zahl der verwendeten Tiere)
Tabelle
9 - (n ist die Zahl der verwendeten Tiere)
Tabelle
10 - (n ist die Zahl der verwendeten Tiere)
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Die
Werte sind als Prozentzahlen unter Bezug auf dasselbe Signal, erhalten
bei 37°C
nach der Explantation, ausgedrückt.
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Wie
festgestellt werden kann, hat die Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung
eine Schutzrolle in der zellulären
Vitalität
während
der Phase der normothermen Reperfusion einer isolierten Leber, was
die Resynthese von ATP ermöglicht,
was vergleichbar ist mit der Phase der normothermen Perfusion, die
bei UW beobachtet wurde. Es ist wichtig festzuhalten, dass das Wiederauftreten
eines Signals und daher die Kapazität zur Resynthese schneller
für diejenigen
Organe ist, die in Carnival gelagert wurden als bei denjenigen,
die in UW gelagert wurden, mit einer zufriedenstellenden Resynthese,
die nicht früher
als nach 60 Minuten beobachtet wurde.
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Umgekehrt
zeigen Organe, die in EuroCollins-Lösung gelagert werden, keine
anerkennenswerten ATP-Niveaus in den betrachteten Zeiten.
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Weiterhin
sollte betont werden, dass die Konzentration der Metabolite auf
vergleichbaren Niveaus für UW-
und Carnival-Lösungen
bis zu 140 Minuten erhalten blieben.
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Die
erfindungsgemäße Lösung verhindert
weiterhin in der hypothermen Lagerphase ein zelluläres Anschwellen
aufgrund osmotischer Phänomene,
wie qualitativ beobachtet, analog zu der mit UW-Lösung mit
zugesetztem Lactobionat, Raffinose und Glycin, erhaltenen.
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Die
erfindungsgemäße Lösung begünstigt den
Erhalt der bioenergetischen Leberintegrität, selbst während einer 26stündigen hypothermen
Konservierung und stellt bei niedrigeren Kosten vergleichbare Ergebnisse
zu den mit der teureren UW-Lösung
erhaltenen bereit.
