KR100844191B1 - 이식 대기중인 기관의 저장 및 관류를 위한 용액 - Google Patents
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Abstract
(a) 생리학적으로 허용 가능한 양의 칼륨, 일-산성 포스페이트, 이-산성 포스페이트, 클로라이드, 나트륨 및 비카보네이트 이온을 포함하는 균형잡힌 등장성 용액; (b) 50 내지 250 mM의 글루코스; (c) 0.2 내지 20 mM의 알카노일 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염; (d) 1 내지 100 mM의 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염; (e) 물을 포함하는, 이식 대기 중인 기관의 유지 및 관류를 위한 저장 용액을 개시한다. 상기 저장 용액은 또한 산화 방지제 및/또는 킬레이트제와 같은 다른 성분들을 포함할 수 있다.
칼륨, 일-산성 포스페이트, 이-산성 포스페이트, 클로라이드, 나트륨 및 비카보네이트 이온, 알카노일 L-카르니틴, 이식, 관류, 저장용액
Description
본 발명은 이식 대기중인 기관의 저장 및 관류용 용액에 관한 것이다.
지난 10 년 간, 같은 자리(orthotopic) 기관 이식술은 특유의 말기 단계 기관 질병, 예를 들어 간, 심장, 췌장, 폐 및 신장 질병이 있는 환자에게 대체가 불가능한 치료 방법이 되어 왔다.
그러나, 이식된 기관의 거부반응은 계속해서 상당한 문제가 되고 있다.
예를 들어, 거부반응은 간이식의 경우 수술 후 처음 1 년 동안 15 내지 25%의 사망률에 기여한다(Strasberg S.M. et al., Hepatology 1994, 20:829).
이식을 위한 간이 손상을 입게되는 단계는 하기와 같이 결정되었다:
1) 공여자로부터 회수하는 도중의 열에 의한 허혈;
2) 저온 저장 단계 동안의 저온 허혈;
3) 수령자에서 기관의 재 관류
(Transplantation 53:957-978, 1992).
이식을 위한 기관의 저장에 대한 기본적인 전략은 상기 기관의 온도를 37 ℃에서 대략 4 내지 6 ℃ 부근으로 낮춤을 통해 세포의 이화 과정을 늦추는 것이다(저온법).
저온법(hypothermia)은 각종 세포 내 효소들에 의해 촉진되는 대사속도와 가수분해 속도를 늦추지만, 세포 대사를 완전히 억제하지는 못한다. 이로 인해 내피 동양혈관 구획과 간세포 구획 모두에서 세포 변경을 일으키는 과정이 발생할 수 있다.
실제로, 관류 없이 단리된 간을 냉각시키면 잉여 에너지가 여분의 글리코겐으로부터 혐기성 해당을 통해 ATP를 생성시키는 세포의 능력을 초과하는 만큼 ATP와 ADP 수준이 급속히 감소(J. Surg. Res. 23:339-347, 1977; Cryobiology 31:441-452, 1994)되며, 그 결과 젖산이 축적되어 세포 내 산독증이 발생한다.
ATP의 ADP로의 분해 및 연속적인 AMP 및 아데닌으로의 분해는 저온법 도중 크산틴 데하이드로게나제의 크산틴 옥시다제로의 부수적인 전환에 의해 하이포크산틴의 축적을 일으키고 이는 세포 내 칼슘의 증가 및 프로테아제 활성화와 관련이 있다(McCord J.M., N. Engl. J. Med. 1985, 312; 158).
재 관류 상태에서, 반응성 산소 중간체(ROI)의 생성 및 산화적 유형의 손상에 의해 하이포크산틴이 크산틴으로 분해되고 이어서 요산으로 분해된다.
더욱 또한, 효소, 예를 들어 Na/K ATP아제의 활성이 감소된 결과 전해질 균형 조건이 변하고, 결과적으로 수 유입 및 세포 팽윤이 일어난다.
최근 수년간, 이식을 위한 기관의 저온 저장 중의 ATP 함량과 인간에서의 이 식 성공률간의 직접적인 상관 관계가 입증되었다(Hepatology 1988, 8:471).
상기와 같은 단점들을 극복하기 위해서, 무산소성 저온법(저장 단계 도중)과 정상 온도(normothermic) 재 관류(재-이식 단계 도중)의 위험한 영향들을 중화시키는 것으로 연구된 조성을 갖는 저장 용액들을 사용한다.
상기와 같은 용액의 제형화는 계속적으로 발전하여 기관의 바이탈 상태와 보존 시간의 증가를 개선시키고 있다.
이식 대기 중인 기관의 저장에 유용한 용액들은 이미 공지되어 있다.
문헌[Transplantation 2000 Apr. 15; 69(7):1261-5]은 UW 용액으로서 공지된 위스콘신 대학의 용액이 이식 대기 중인 기관의 이화 과정을 지연시키고 양호한 보존을 보장할 수 있음을 보고하고 있다.
UW 용액의 조성은 하기를 목적으로 하는 약리학적 전략을 기준으로 한다:
1) 아데닌 및 포스페이트와 같은 전구체들의 첨가를 통해 ATP의 재 합성을 촉진시키고;
2) 포스페이트 완충제의 존재를 통해 산독증을 예방하고;
3) 알로퓨리놀을 통해 크산틴 옥시다제 활성을 억제하고;
4) 세포 내에서 발견되는 것과 유사한 조성(높은 K+)을 사용하여 이온 재 분포를 최소화시키고; 특히
5) 삼투압, 락토비오네이트, 라피노즈 및 고 분자량 콜로이드, 예를 들어 전분의 첨가를 통해 세포 팽윤을 방지한다.
상기 조성물의 기본적인 전력은 그러나 실험상의 것이며, 그 효과는 "보호들의 합"으로서 알려진 현상으로부터 유도할 수 있는 것으로 가정하였다(Southard J.H. et al., Transplantation 1990, 49:251).
문헌[Transplant Proc. 1999; August; 31(5):2069-70]에는 쎌슈어(Celsior) 용액이 이식 대기 중인 기관의 저장에 유용한 것으로 보고되어 있다.
염수 용액인 유로콜린스(EuroCollins)는 하기 표 1에 보고된 조성을 갖는, 기관의 저장에 유용한 또 다른 공지 용액이다.
| 농도 | |
| K2HPO4·3H2O | 32 mM |
| KH2PO4 | 15 mM |
| KCl | 15 mM |
| NaHCO3 | 10 mM |
| 글루코스 | 194 mM |
상기 용액은 수년간 유럽에서 기관, 특히 신장의 저장을 위한 표준 용액으로 간주되어 왔다. 그의 제형화는 세포 내 환경을 흉내내는 전해질 조성물을 수득함을 기본으로 한다. 더욱이, 상기 용액에서 고 농도의 글루코스(약 190 mM)의 첨가에 의해 고장성(420 mOsmol)을 얻는다.
상기 인용된 용액들은 불편함이 없지 않으며, 수많은 변경들이 가해져 왔다.
UW 용액에 의해 나타난 주요 단점들은 기관의 관류 도중 특히 내피 세포에 의해 지속되는 그의 높은 점도(이에 의해 손상이 가능함), 및 필수성과 관련된 여전한 불확실성과 함께 각각의 단일 성분들의 고 비용에 있다(Transplant Proc. 1999; August; 31(5):2069-70).
쎌슈어 용액은 UW 용액에 비해 간 저장에 적합한 용액이 아니라는 단점을 제공한다(Transplant. 2000; Oct. 27; 70(8):1140-2).
유로콜린스 용액은 다수의 단점들을 제공한다:
1-저온성 저산소증 중의 막대한 락테이트의 생성으로 인한, 산독증 문제를 더욱 악화시키는 높은 글루코스 농도를 갖고;
2-기관의 저장 도중 세포 팽윤을 방지하지 못하며;
3-UW 용액보다 양호하지 않다
(Transplantation 2000 Apr. 15; 69(7):1261-5).
의학 분야에서 카르니틴의 용도는 이미 공지되어 있다.
문헌[Ann. Thorac. Surg. 2001; 71:254-9]에 단리된 토끼 심장에서 심장마비성 허혈의 치료를 위한 L-카르니틴의 용도가 개시되어 있다. 상기 연구는 L-카르니틴이, 단리된 토끼 심장을 L-카르니틴이 첨가된 전혈로 관류시키는 경우 상기 심장에서 심장 기능이 회복되는데 보호 효과를 나타냄을 보고하고 있다.
이식 대기 중인 기관의 저장을 위한 용액의 제조에서 카르니틴의 용도는 결코 이전에 개시되지 않았다.
본 발명에 이르러, 카르니틴 및/또는 알카노일 L-카르니틴을 단리된 기관의 저장 용액에 첨가하면 기관의 저장과 관류에 놀라운 능력을 나타내며, 이는 앞서 언급된 공지된 용액들의 능력보다 우수한 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 용액은 L-카르니틴 및/또는 알카노일 L-카르니틴의 존재에 의해 공지 용액들과 상이하다.
본 발명에 따른 용액은 이식 대기 중인 기관의 저장 및 관류에 사용하기 적합하다.
상기와 같은 기관의 비 제한적인 예는 심장, 간, 췌장, 폐 및 신장이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 용액은 L-카르니틴 및 알카노일 L-카르니틴을 포함하며, 이때 상기 알카노일 L-카르니틴은 아세틸; 프로피오닐; 발레릴; 이소발레릴; 부티릴 및 이소부티릴 L-카르니틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
일반적인 실시태양에서, 본 발명에 따른, 이식 대기 중인 기관의 유지 및 관류를 위한 저장 용액은 하기를 포함한다:
(a) 생리학적으로 허용 가능한 양의 칼륨 이온, 일-산성 포스페이트, 이-산성 포스페이트, 염소, 나트륨, 비카보네이트를 포함하는 균형잡힌 등장성 용액;
(b) 50 내지 250 mM의 글루코스;
(c) 0.2 내지 20 mM의 알카노일 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염들 중 하나; 및/또는
(d) 1 내지 100 mM의 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염들 중 하나;
(e) 물.
본 발명의 첫 번째 바람직한 실시태양에서, 이식 대기 중인 기관의 보존 및 관류를 위한 용액(이후부터 "카니발 용액"이라 칭할 것이다)은 표 2에 나타낸 조성 을 갖는다:
| 농도 | |
| K2HPO4·3H2O | 10-60 mM |
| KH2PO4 | 3-50 mM |
| KCl | 3-50 mM |
| NaHCO3 | 2-50 mM |
| 글루코스 | 50-250 mM |
| 알카노일 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염들 중 하나 | 0.2-20 mM |
| L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염들 중 하나 | 1-100 mM |
이소발레릴 L-카르니틴이 바람직한 알카노일 L-카르니틴이다.
L-카르니틴 또는 알카노일 L-카르니틴의 생리학적으로 허용 가능한 염은 바람직하지 못한 독성 효과를 생성시키지 않는 산과의 임의의 염을 의도한다. 이러한 산은 약리학자 및 제약 기술 전문가들에게 널리 공지되어 있다.
이들 염의 비 제한적인 예로는 클로라이드, 브로마이드, 오로테이트, 산 아스파테이트, 산 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 산 포스페이트, 푸마레이트 및 산 푸마레이트, 마그네슘 푸마레이트, 락테이트, 말리에이트 및 산 말리에이트, 뮤케이트, 산 옥살레이트, 파모에이트, 산 파모에이트, 산 설페이트, 글루코스포스페이트, 타르트레이트, 산 타르트레이트, 마그네슘 타르트레이트, 2-아미노 에탄설포네이트, 마그네슘 2-아미노 에탄설포네이트, 콜린 타르트레이트 및 트리클로로아세테이트가 있다.
푸마레이트가 바람직하다.
본 발명에 따른 바람직한 용액의 예를 표 3에 나타낸다.
| 농도 | |
| K2HPO4·3H2O | 32 mM |
| KH2PO4 | 15 mM |
| KCl | 15 mM |
| NaHCO3 | 10 mM |
| 글루코스 | 187.5 mM |
| 이소발레릴 L-카르니틴 푸마레이트 | 2 mM |
| L-카르니틴(내염) | 10 mM |
본 발명에 따른 용액은 하기를 또한 함유할 수 있다:
1) 산소로부터 유도된 유리 라디칼의 형성을 방지하는데 유용한 양의 하나 이상의 산화방지제. 상기와 같은 산화 방지제의 비 제한적인 예로는 알로퓨리놀, 글루타치온, 베타-카로틴, 카탈라제, 초산화물 디스뮤타제, 디메틸 티오우레아(DMTU), 디페닐 페닐렌 디아민(DPPD), 만니톨, 시아니다놀; 및 비타민 E 및/또는
2) 보존 도중 형성되는 락테이트를 감소시키는 디클로로아세트산.
사용되는 산화 방지제 및/또는 디클로로아세트산의 양은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있으며, 문헌에 광범위하게 보고되어 있다.
본 발명에 따른 용액은 기관에 손상을 일으키는 기전을 방지하는데 사용하기에 적합하며, 따라서 (a) 세포 내 산독증을 예방 또는 감소시키고; (b) 특히 재 관류 도중 산소 유리 라디칼에 의해 야기된 손상을 방지하며; (c) 재 관류 도중 고 에너지 포스페이트의 재생을 허용하고; (d) 세포 내 공간의 팽창으로부터 보호하고; (e) 세포 대사 요청을 지속시키는 용액이다.
본 발명에 따른 용액의 보호 활성을 상기 목적에 유용한 적합한 실험 모델(대조군으로서 공지된 용액을 가짐)에서 평가하였다.
하기의 실시예들은 본 발명을 더욱 예시한다.
실시예 1
많은 연구들이 ATP와 같은 인산화된 고 에너지 화합물을 재생시키는 이식 기관의 능력과 이식 성공률간의 상관 관계를 입증하였다. 실제로, 가장 중요한 태양들 중 하나는 틀림없이, 예를 들어 간의 저장에서, 이식 후 ATP와 같은 인산화된 고 에너지 화합물을 재생시키는 능력이다.
상기 인산화된 고 에너지 화합물들은 세포 손상을 방지하는 다수의 조절 기전에 이용될 수 있어야 한다. 예를 들어, 간에서 NTP(뉴클레오티드 트리포스페이트)의 수준은 중대한 세포 과정들, 예를 들어 혈장과 미토콘드리아막을 통한 이온 교환, 단백질 합성, 담즙 생산 및 요소 주기를 조절하는 구배의 유지를 복원하기에 충분한 양이어야 한다.
본 발명에 따른 용액의 효능을 입증하기 위해 수행된 실험적 시도에서, 단리된 래트의 간을 사용하였고, 여기에서 ATP, ADP 및 전체 아데닌 뉴클레오티드(NTP) 수준의 변경을 저온 허혈, 보존 기간 및 재 관류 중에 분광학 31P-NMR(J. Lab. Clin. Med. 1992, 120: 559; Transplantation 1994, 57:1576)을 통해 분석하였다.
이러한 실험상 시도의 실현은 하기 주요 문제점들의 해결을 요하였다:
1) NMR 자석 내부의 작업하기에 적합한 관류 챔버의 제작, 및 적합한 관류 회로의 생성;
2) 상기 관류 챔버와 함께 이용할 수 있는 무선 주파수(RF) 코일의 제작;
3) 시간의 한정(관류, 보존 및 재 관류 단계의 지속 기간; 이들 각 단계 중에 분광학을 통해 연구하는 간격; 단일 스펙트럼의 최소 지속 시간; 하나의 단계에서 또 다른 단계로의 통과 시간의 최적화).
관류 회로 및 챔버
관류 회로의 도표를 도 1에 나타낸다.
상기 회로의 제작은 펌프 및 서머스탯으로 구성된 관류 시스템으로부터 수 미터의 거리에 위치된 기관에서 적합한 온도와 산소화 조건이 유지되어야 함을 고려하여 수행되었다. 실제로, 이러한 장치들은 측정 장치의 자기장 밖에, 본 발명의 경우 6 m의 최소 거리에 상응하게 위치시켜야 할 필요가 있다.
자석으로부터 떨어져, 자동 온도 조절 용기에 놓인 관류 매질 KH(크렙스-헨젤라이트(Krebs-Henseleit) + 글루코스 + BSA)(400 ㎖)(Krebs H.A. 1930; Biochem. J. 98, 720; Henseleit K. 1932; Hoppe-Seylerr's Z. Physiol. Chem. 210, 33.)를 자기 교반에 의해 계속 혼합하였다.
자석 내부의 기관 함유 관류 챔버에서 37 ± 0.5 ℃의 온도를 얻기 위해 자동 온도 조절을 수행하였다.
상기 매질의 산소화는 막 산소발생기의 사용을 통해 보장하였다.
산소 포화 수준을 사용된 실리콘의 투과성 인자, 튜브의 눈금 및 두께, 산소 화 및 자동 온도 조절 장치 내부의 나선으로 감긴 튜브의 길이 및 유속을 근거로 계산하였다. 계산된 값들은 30 내지 35% O2의 결과를 제공하였다.
관류물을 25 ㎖/분의 유속으로 연동식 펌프를 사용하여 재 순환시켰다.
상기 관류 회로는 자석 앞뒤로 움직이는 내경 1 ㎜ 및 길이 6 m의 폴리에틸렌 튜브를 사용하였다.
자석 중의 관류 챔버 내부에서 조절된 온도를 확실히 유지시키기 위해서, 자동 온도 조절과 관류 회로 모두를 열 단리된 네오프렌 튜브 내부를 연합하여 통과하도록 만들었다.
상기 회로를 최소한 기관 관류 1 시간 전에 활성화시키고 안정화시켜 목적하는 온도와 산소화에 도달할 수 있게 하였다.
페르스펙스(Perspex)에서 제조된 관류 챔버를 PVC 지지체에 고정시켜 자석 내부에 삽입하였다. 상기는 직경 34 ㎜ x 높이 65 ㎜의 원통형 기하를 가졌다.
간을 적합하게 이격된 지지체 원반들을 사용하여 캐뉼라를 고정시킴으로써 목적하는 높이에 매달아 유지시켰다. 관류액을 깔때기 형상의 기부에 수거한 다음 상기 수거 조를 흡입시켜 배액을 수행하였다.
허혈 및 재 관류에 의한 정상 온도 손상은 간 손상의 병인에서 결정적인 인자이며, 이는 수술 과정 도중에, 예를 들어 간 절제 및 간 이식 중에 발생한다.
열 허혈 시간을 가능한 한 많이 최소화시키기 위해서, 간 제거에 대한 표준 수술 절차에 변화를 주었다. 특히, 금식시키지 않은 동물을 사용하였으며; 실제 로 동물 모델에서 생체 내 및 생체 외 연구는 금식이 글리코겐 함량의 감소에 의해 발생하는 정상 온도 허혈 손상을 더욱 악화시킴을 입증하였다.
초기 체중 150 g의 수컷 위스타 래트를 사용하였다. 상기 동물을 나트륨 티오펜탈의 복강 내 주입(i.p.)에 의해 마취시키고, 이어서 연속적인 개복으로 복부 가운데를 절개하였다.
문맥과 하부 대정맥을 노출시키고, 가능한 한 많은 유착물과 지방을 제거하여 기관을 보다 신속히 회수하였고 허혈 시간을 최소화시켰다.
하부 대정맥과 문맥에 대해 봉합사를 준비하였다.
대정맥을 봉합한 다음 신속히 이어서 문맥을 봉합하였다.
제 1 혈액 세척 관류를 위해서 앞서 준비된 봉합사로 고정시키고 저온 락테이트 링거액을 함유하는 주시기에 연결시킨 문맥(Abbocath-T 20G; Abbott)에 캐뉼라를 삽입하였다(Dawson R.M.C.(ed.), Elliott D.C. Elliott W.H. and Jones K.M.(1969) Data for biochemical research, 2nd ed. Clarendon Press, Oxford.). 대정맥을 절단하여 관류액을 유출시켰다.
이어서 기관을 가능한 한 신속히 제거하였다.
혈관의 봉쇄에서부터 자석 내부에서의 관류 시작까지의 시간 간격은 10 분 이하였으며, 이때 열 허혈은 1 내지 2 분이었다.
캐뉼라를 원 위치에 두고 재 관류에 사용하였다.
이어진 실험 프로토콜을 하기 도표 1에 나타낸다.
도표 1
간을 원 위치에서 락테이트 링거액으로 4 ℃에서 관류시켜 혈액을 제거하고 상기 기관의 정상 온도 허혈 시간을 가능한 한 많이 제한하였다.
이어서 단리된 기관을 적합한 생물반응기의 자석 내부에서 기본 대조 스펙트 럼 31P NMR(시간 0)의 포착을 위해 37 ℃, 35% O2에서 크렙스-헨젤라이트 용액이 공급되는 관류 하에 두었다.
상기 NMR 스펙트럼의 포착은 기관간의 생물학적 변이성을 제거하기 위해 수행하였으며; 실제로, 이러한 방식으로 보존 후 관찰된 변이들은 동물로부터 제거 즉시 40'간 관류에 안정화시킨 동일 기관에서 측정된 값을 언급한 것일 수 있다.
40' 안정화의 끝에서, 기관들을 4 ℃에서 상이한 저장 용액들로 관류시켰다.
실험상 시험들을 본 발명에 따른 카니발 용액을 사용하여 수행하였으며, 2 개의 공지된 저장 용액을 대조군으로서 사용하였다:
1) 인슐린(40 I.U./L) 및 덱사메타손(8 ㎎/L)이 첨가된 UW 용액; 및
2) 유로콜린스 용액.
표 4는 카니발, 유로콜린스 및 UW 용액의 조성을 나타낸다.
| 카니발 용액 | 유로콜린스 용액 | UW 용액 | |
| K2HPO4·3H2O | 32 mM | 32 mM | 2.5 mM |
| KH2PO4 | 15 mM | 15 mM | - |
| KCl | 15 mM | 15 mM | - |
| NaHCO3 | 10 mM | 10 mM | - |
| 글루코스 | 187.5 mM | 194 mM | - |
| 이소발레릴 L-카르니틴 푸마레이트 | 2 mM | - | - |
| L-카르니틴(내염) | 10 mM | - | - |
| 글리신 | - | - | 15 mM |
| 알로퓨리놀 | - | - | 1 mM |
| 아데노신 | - | - | 2.5 mM |
| 락토비오네이트 | - | - | 100 mM |
| MgSO4·7H2O | - | - | 5 mM |
| 라피노즈 | - | - | 30 mM |
| PEG＼ | - | - | + |
| "-"는 "부재"를 의미하고, "+"는 "존재"를 의미한다. | |||
일부 실험에서 처음 1 시간째에 인산화된 대사산물의 소멸 동력학을 평가하기 위해서 저온 스펙트럼들을 본 발명에 따른 용액으로 기관을 관류시킨 직 후에 포착하였다.
수득된 결과를 표 8 내지 10에 나타낸다.
각각의 스펙트럼에 대해서 하기에 주목하였다:
1) 인산화된 대사산물의 전체 수준;
2) 무기 포스페이트 및 포스포 모노에스테르(Pi+PME)의 수준;
3) 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP)의 수준;
4) 신호 α-NTP+NAD의 합으로서 NAD의 수준.
스펙트럼을 1 시간에 걸쳐 10 분 간격으로 포착하였다.
간을 총 26 시간 동안 4 ℃에서 다수의 용액에 침지시킴으로써 저장하였다.
상기 저장 시간은 임상적 실시 또는 실험에 통상적으로 사용되는 것보다 훨씬 더 긴 시간 후의 재개 능력을 평가하기 위해서 선택하였다.
저장 시간(26 ore)의 끝에서, 간을 다시 37 ℃, 35% O2 하에 용액 KH로 관류시키면서 자석 내부에 두어 인산화된 대사산물을 감시하였다.
31P-NMR 스펙트럼을 140'의 시간 제한 동안 매 15' 마다 포착하였다.
수득된 결과를 표 5 내지 7에 나타낸다.
NMR 실험 조건
31P-NMR 실험의 특별한 특징은 간 관류에 대해 선택된 실험 구성에 엄격히 따르며, 이때 주 목적은 최적 신호/소음 비를 갖는 스펙트럼을 얻는 것이었다.
고려해야할 두드러진 어려움은 하기와 같다:
i) 짧은 주사 시간의 사용 필요성;
ii) 핵 자기 공명 시스템의 작동 조건의 최적화;
iii) 샘플의 조성과 기하 불균일성.
사용되는 실험 조건은 하기와 같다:
-스펙트럼 대역폭 8.33 KHz;
-샘플링 2048 포인트;
-포착 900;
-더미 스캔 2;
-2 단계 상 주기;
-90°에서 임펄스(150 μs);
-2s 반복 간격.
다양한 실험 조건들에 대한 스펙트럼들을 관류 또는 재 관류 조건 하에서 450 스캔, 및 저온 조건 하에서 300 스캔의 축적으로부터 수득하였으며, 이때 반복 시간은 항상 2 초였다.
수득된 31P-NMR 스펙트럼은 -9.7, -18.35 및 -4.2 ppm에서 각각 뉴클레오티드 트리포스페이트의 α, β 및 γ 포스페이트에 대한 신호를 나타내며, 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 우세하게 나타내고, 구아노신 트리포스페이트(GTP), 유리딘 트리포스페이트(UTP) 및 시티딘 트리포스페이트(CTP)는 소량으로 나타낸다.
αNTP에 할당된 신호는 니코틴아미드-아데닌-디뉴클레오티드 포스페이트(NAD)와 니코틴아미드-아데닌-디뉴클레오티드 포스페이트의 공명에 의한 것이다.
주로 아데노신 디포스페이트(ADP)에 의해 나타나는 뉴클레오티드 디포스페이트의 α 및 β 포스페이트와 관련된 신호들은 각각 -8.9와 -4.4 ppm에 있다. 상기 최종 신호는 γNTP로부터의 신호에 의해 부분적으로 가려진다.
2 개의 디-에스테르화된 포스페이트 그룹(DPDE)을 갖는 화합물에 기인하는 -11.5 ppm에서의 신호는 대개 유리딘 디포스포글루코스와 유리딘 디포스포 글루쿠로네이트에 의해 나타난다.
인지질 중간체들과 관련된 신호는 5.8과 4 ppm 사이의 스펙트럼 대역에 존재하며, 이때 모노포스페이트 에스테르(PME)로부터의 포스페이트 그룹의 핵은 공명한다.
관류 챔버의 내부에 고정된 모세관(0.5 ㎖)에 함유된 300 mM 메틸렌 디포스포네이트(MDP)를 대조군으로서 사용하였다.
신호 영역을 공지된 프로그램들 중 하나를 공명 스펙트럼의 재건에 적용시킴으로써 평가하였다(프로그램 SPEC ANA; SMIS).
수득된 결과
간의 제거 및 락테이트 링거액(4 ℃)으로 40'간 세척 후 KH 용액(37 ℃, 35% O2)을 사용한 초기 관류는 인산화된 대사산물 수준의 안정화에 충분한 것으로 간주되었다.
β-ATP의 초기 수준(예비-저장)은 8.3±3.1이고, α-ATP의 경우는 22.6±5.4였다(반면에 표에 나타낸 값들은 대조%로서 나타낸다).
β-ATP/Pi+PME, α-ATP/Pi+PME 및 β-ATP/α-ATP 비는 각각 8.4±5, 23.4±10.2 및 35.7±11의 결과를 제공하였다.
상기와 같이 수득된 값들을 후속적인 평가를 위해 시간 0에 대한 참조로서 사용하였다.
표 5에서, 카니발 용액을 사용하여 보존하기 전, 보존하는 동안 및 보존 후에 수득된 전형적인 스펙트럼에 대한 결과들을 나타낸다.
| 시간 | β | γ | α |
| 수준의 안정화; (37 ℃에서, 이식, 세척, KH 용액을 사용한 관류 후 NMR 분석) | |||
| 40' | 8.9 | 10.3 | 27.5 |
| 4 ℃에서 카니발 용액을 사용한 관류 및 저장; NMR 분석을 4 ℃에서 하기 지시된 시간으로 수행하였다 | |||
| 10' | n.d. | n.d. | 58% |
| 20' | n.d. | n.d. | 74% |
| 30' | n.d. | n.d. | 69% |
| 40' | n.d. | n.d. | 65% |
| 50' | n.d. | n.d. | 67% |
| 60' | n.d. | n.d. | 71% |
| 4 ℃에서, 추가로 25 시간 동안 기관들을 카니발 용액에 침지시켜 보존하였다 | |||
| 이어서 기관들을 37 ℃에서 KH 용액으로 관류시키고; NMR 분석을 37 ℃에서 하기 지시된 시간으로 수행하였다 | |||
| 30' | 84% | 68% | 90% |
| 45' | 81% | 81% | 87% |
| 60' | 109% | 75% | 99% |
| 75' | 112% | 97% | 83% |
| 90' | 71% | 83% | 70% |
| 105' | 99% | 85% | 87% |
| 120' | 101% | 68% | 68% |
| 135' | 72% | 69% | 75% |
이식 후와 관련된 값들을 대조 신호의 비로서 나타낸다. 모든 다른 값들은 대조 신호에 대한 퍼센트로서 나타낸다.
표 6에서, 앞서 수득한 전형적인 스펙트럼, UW 용액을 사용한 저장 도중 및 저장 후와 관련된 데이터를 나타낸다.
| 시간 | β | γ | α |
| 수준의 안정화; (37 ℃에서, 이식, 세척, KH 용액을 사용한 관류 후 NMR 분석) | |||
| 40' | 4.8 | 21.8 | |
| 4 ℃에서 UW 용액을 사용한 관류 및 저장; NMR 분석을 4 ℃에서 하기 지시된 시간으로 수행하였다 | |||
| 10' | 51% | 71% | 117% |
| 20' | 28% | 56% | 96% |
| 30' | n.d. | 64% | 95% |
| 40' | n.d. | 80% | 128% |
| 50' | n.d. | 44% | 75% |
| 60' | n.d. | n.d. | 81% |
| 4 ℃에서, 추가로 25 시간 동안 기관들을 UW 용액에 침지시켜 저장하였다 | |||
| 이어서 기관들을 37 ℃에서 KH 용액으로 관류시키고; NMR 분석을 37 ℃에서 하기 지시된 시간으로 수행하였다 | |||
| 30' | 51% | 49% | 79% |
| 45' | 45% | 56% | 70% |
| 60' | 91% | 74% | 90% |
| 75' | 79% | 62% | 81% |
| 90' | 65% | 94% | 75% |
| 105' | 58% | 58% | 86% |
| 120' | 56% | 91% | 83% |
| 135' | 44% | 73% | 64% |
이식 후와 관련된 값들을 대조 신호의 비로서 나타낸다. 모든 다른 값들은 대조 신호에 대한 퍼센트로서 나타낸다.
표 7에서, 앞서 수득한 전형적인 스펙트럼, 유로콜린스 용액을 사용한 저장 도중 및 저장 후와 관련된 데이터를 나타낸다.
| 시간 | β | γ | α |
| 수준의 안정화; (37 ℃에서, 이식, 세척, KH 용액을 사용한 관류 후 NMR 분석) | |||
| 40' | 7.9 | 6.1 | 25.6 |
| 4 ℃에서 유로콜린스 용액을 사용한 관류 및 저장; NMR 분석을 4 ℃에서 하기 지시된 시간으로 수행하였다 | |||
| 10' | n.d. | n.d. | 96% |
| 20' | n.d. | n.d. | 69% |
| 30' | n.d. | n.d. | 67% |
| 40' | n.d. | n.d. | 58% |
| 50' | n.d. | n.d. | 65% |
| 60' | n.d. | n.d. | 51% |
| 4 ℃에서, 추가로 25 시간 동안 기관들을 유로콜린스 용액에 침지시켜 저장하였다 | |||
| 이어서 기관들을 37 ℃에서 KH 용액으로 관류시키고; NMR 분석을 37 ℃에서 하기 지시된 시간으로 수행하였다 | |||
| 30' | 0% | 0% | 0% |
이식 후와 관련된 값들을 대조 신호의 비로서 나타낸다. 모든 다른 값들은 대조 신호에 대한 퍼센트로서 나타낸다.
표 7에서, 단일 재 관류(30') 스펙트럼의 데이터를 나타내는데, 그 이유는 상기 및 이후의 시간들에서 인산화된 화합물의 재 합성이 관찰되지 않았기 때문이다.
저온 보존의 처음 60'에서 관찰된 인산화된 대사산물의 소멸의 동력학은 α-ATP + α-ADP + NAD의 신호가 모든 보존 용액들에 대한 측정이 끝날 때까지 기관마다 다양한 방식으로 존재함을 입증하였다.
β-ATP 신호가 오직 UW에 의한 보존의 경우에만 30'의 최대 시간까지 검출될 수 있었던 반면, 상기 신호는 유로콜린스와 카니발 용액의 경우 첫 번째 스펙트럼에서 조차도 존재하지 않았다.
γ-ATP + β-ADP 신호는 그러나 오로지 ADP의 존재로 인해서 포착 50'까지 존재한 채로 있었다.
60'에서 인산화된 대사산물의 잔류 량은 상이한 용액들에서 26 시간 보존 후에 정상 온도 재 관류 하에 ATP의 재 합성 능력과는 상관이 없었다.
표 8, 9 및 10에서, 각각 카니발, UW 및 유로콜린스 용액들에 대한, 4 ℃에서 관류 후 및 보존 시작 시(저온 스펙트럼, NMR 분석을 기관 제거 후 약 2 시간 째에 수행하였다) 80' 및 140'의 정상온도 관류에서 포착된 β-ATP 및 α-ATP에 대한 표준 편차를 갖는 값들을 나타낸다.
| 용액 | 시간(분) | β-ATP(n=8) | α-ATP(n=8) |
| 카니발 | 80' | 62.4±24 | 62.4±14 |
| 카니발 | 140' | 55.2±25.2 | 53.5±15.6 |
| n은 사용된 동물들의 수이다 | |||
| 용액 | 시간(분) | β-ATP(n=8) | α-ATP(n=8) |
| UW | 80' | 64.2±13.1 | 55.2±17 |
| UW' | 140' | 57.2±13.5 | 63.4±19 |
| n은 사용된 동물들의 수이다 | |||
| 용액 | 시간(분) | β-ATP(n=8) | α-ATP(n=8) |
| 유로콜린스 | 80' | 15±13.7 | 52±14.4 |
| 유로콜린스 | 140' | N.D. | 25.4±21 |
| n은 사용된 동물들의 수이다 | |||
값들을 이식 후 37 ℃에서 포착된 동일 신호를 참조로 퍼센트로서 나타낸다.
주목할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 용액은 단리된 간의 정상 온도 재 관류 단계 동안 세포 생명력에 대해 보호 역할을 수행하여 정상 온도 재 관류 단계 동안 UW에 대해 관찰된 것에 필적할만한 ATP 재 합성을 허용한다. 신호의 재현, 및 따라서 재 합성의 능력이 UW(여기에서 만족할만한 재 합성은 60'까지 관찰되지 않는다)에서 저장된 기관들에 대해 카니발에서 저장된 기관의 경우 보다 빠름에 주목하는 것이 중요하다.
이와 역으로, 유로콜린스에서 저장된 기관들은 상당한 시간 내에 감지할만한 ATP 수준을 나타내지 않는다.
더욱 또한, 대사산물들의 농도가 140'까지 UW와 카니발 용액의 경우 필적할만한 수준으로 유지되었음은 분명히 강조되어야 한다.
저온적 저장 단계에서 본 발명에 따른 용액은 정성분석에 의해 관찰된 바와 같이, 락토비오네이트, 라피노즈 및 글리신이 첨가된 UW 용액에 의해 수득된 것과 유사한 삼투 현상으로 인해 세포 팽윤을 추가로 방지한다.
본 발명에 따른 용액은 26 시간의 저온적 보존 후에조차도 간의 생물에너지 보전성을 유지하는데 유리하여, 보다 저렴한 비용으로, 보다 값비싼 UW에 의해 수득되는 결과에 필적할만한 결과를 제공한다.
Claims (13)
- (a) 생리학적으로 허용 가능한 양의 칼륨, 일-산성 포스페이트, 이-산성 포스페이트, 클로라이드, 나트륨 및 비카보네이트 이온을 포함하는 균형잡힌 등장성 용액;(b) 50 내지 250 mM의 글루코스;(c) 0.2 내지 20 mM의 알카노일 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염들 중 하나;(d) 1 내지 100 mM의 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염들 중 하나; 및(e) 물;을 포함하는, 이식 대기 중인 기관의 유지 및 관류를 위한 저장 용액.
- 제 1 항에 있어서, 균형잡힌 등장성 이온 용액이 K2HPO4·3H2O; KH2 PO4; KCl; NaHCO3로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물들로 구성된 저장 용액.
- 제 1 항에 있어서,
K2HPO4·3H2O 10-60 mM KH2PO4 3-50 mM KCl 3-50 mM NaHCO3 2-50 mM 글루코스 50-250 mM 알카노일 L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염 0.2-20 mM L-카르니틴 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염 1-100 mM 을 포함하는 용액. - 제 1 항에 있어서, 알카노일 L-카르니틴이 아세틸; 프로피오닐; 발레릴; 이소발레릴; 부티릴; 및 이소부티릴 L-카르니틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 저장 용액.
- 제 4 항에 있어서, 알카노일 L-카르니틴이 이소발레릴 L-카르니틴인 저장 용액.
- 제 1 항에 있어서, L-카르니틴 또는 알카노일 L-카르니틴의 생리학적으로 허용 가능한 염이 클로라이드, 브로마이드, 오로테이트, 산 아스파테이트, 산 시트레이트, 마그네슘 시트레이트, 산 포스페이트, 푸마레이트 및 산 푸마레이트, 마그네슘 푸마레이트, 락테이트, 말리에이트 및 산 말리에이트, 뮤케이트, 산 옥살레이트, 파모에이트, 산 파모에이트, 산 설페이트, 글루코스포스페이트, 타르트레이트, 산 타르트레이트, 마그네슘 타르트레이트, 2-아미노 에탄설포네이트, 마그네슘 2-아미노 에탄설포네이트, 콜린 타르트레이트 및 트리클로로아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 저장 용액.
- 제 6 항에 있어서, L-카르니틴 또는 알카노일 L-카르니틴의 생리학적으로 허용 가능한 염이 푸마레이트인 저장 용액.
- 제 1 항에 있어서,
K2HPO4·3H2O 32 mM KH2PO4 15 mM KCl 15 mM NaHCO3 10 mM 글루코스 187.5 mM 이소발레릴 L-카르니틴 푸마레이트 2 mM L-카르니틴(내염) 10 mM 을 포함하는 용액. - 제 1 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 기관이 심장, 간, 췌장, 폐 및 신장으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 이식 대기 중인 기관을 유지 및 관류시키기 위한 저장 용액.
- 제 9 항에 있어서, 저장되는 기관이 간인 용액.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 산소 유도된 유리 라디칼들의 형성을 억제하기에 충분한 양의 하나 이상의 산화 방지제를 또한 함유하는 용액.
- 제 11 항에 있어서, 산화 방지제가 알로퓨리놀, 글루타치온, 베타-카로틴, 카탈라제, 초산화물 디스뮤타제, 디메틸 티오우레아(DMTU), 디페닐 페닐렌 디아민(DPPD), 만니톨 및 시아니다놀로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 저장 용액.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 디클로로아세트산을 또한 포함하는 용액.
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