ES2271290T3 - Solucion para el almacenamiento y perfusion de organos en espera de ser transplantados. - Google Patents

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Abstract

Una solución de almacenamiento para mantener y perfundir órganos en espera de trasplante que comprende: (a) una solución isotónica equilibrada que comprende una cantidad fisiológicamente aceptable de iones potasio, fosfato monoácido, fosfato biácido, cloruro, sodio, bicarbonato; (b) 50-250 mM de glucosa; (c) 0, 2-20 mM de alcanoil L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables; y/o (d) 1-100 mM de L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables; (e) agua.

Description

Solución para el almacenamiento y perfusión de órganos en espera de ser trasplantados.
La presente invención se refiere a una solución para el almacenamiento y perfusión de órganos esperando trasplante.
En los últimos 10 años, el trasplante ortotópico de órganos se ha convertido en un procedimiento terapéutico irremplazable para pacientes con enfermedades orgánicas particulares, en estado terminal, tales como por ejemplo enfermedades hepáticas, cardiacas, pancreáticas, pulmonares y renales.
Sin embargo, el rechazo del órgano trasplantado continúa siendo un problema sustancial.
Por ejemplo, el rechazo contribuye a una tasa de mortalidad de 15-25% durante el primer año tras la cirugía en el caso del trasplante hepático (Strasberg S. M. y col., Hepatology 1994, 20: 829).
Las fases en las que el hígado para trasplante sufre daños se determinaron como:
1)
Isquemia por calor durante la extracción del órgano del donante;
2)
Isquemia por frío durante la fase de almacenamiento hipotérmico;
3)
Reperfusión del órgano en el receptor;
(Transplantation 53:957-978, 1992).
La estrategia básica para el almacenamiento de órganos para trasplante es la de bajar los procesos catabólicos celulares bajando la temperatura del órgano desde 37ºC hasta aproximadamente 4-6ºC (hipotermia).
La hipotermia disminuye la tasa metabólica y la tasa de hidrólisis catalizada por diversas enzimas intracelulares, pero no inhibe completamente el metabolismo celular. Esto puede dar lugar a procesos que llevan a alteraciones celulares tanto en el compartimiento endotelial sinusoidal como en el compartimiento hepatocítico. De hecho, el enfriamiento del hígado aislado sin perfusión da como resultado una rápida disminución de los niveles de ATP y ADP (J. Surg. Res. 23:339-347, 1977; Cryobiology 31:441-452, 1994) en una cantidad tal que las demandas de energía residual exceden la capacidad celular para generar ATP por medio de glucólisis anaerobia a partir de las reservas de glucógeno, con la consiguiente acumulación de ácido láctico y acidosis intracelular.
La degradación de ATP en ADP y sucesivamente en ANP y adenina causa, durante la hipotermia, una acumulación de hipoxantina con la concomitante conversión de xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa y se asocia con aumentos de calcio intracelular y activación de proteasas (McCord J. M., N. Engl. J. Med. 1995, 312:158).
En el estado de reperfusión, esto da como resultado la degradación de hipoxantina en xantina y posteriormente en ácido úrico con la producción de intermediarios reactivos de oxígeno (ROI) y daño de tipo oxidativo.
Además, la actividad disminuida de las enzimas tales como por ejemplo, las Na/K ATPasas da como resultado cambios en las condiciones de equilibrio electrolítico con el consiguiente influjo de agua y dilatación celular.
En los últimos años, se ha demostrado una correlación directa entre el contenido de ATP durante el almacenamiento hipotérmico del órgano para trasplante y el éxito del trasplante en seres humanos (Hepatolgy 1988, 8:471).
Para solucionar tales desventajas, se usan soluciones de almacenamiento cuya composición ha sido estudiada para contrarrestar los efectos peligrosos de la hipotermia anóxica (durante la fase de almacenamiento) y de la reperfusión normotérmica (durante la fase de reimplantación).
La formulación de tales soluciones está en constante evolución para permitir mejorar el estado vital del órgano y el aumento de los tiempos de conservación.
Ya se conocen soluciones útiles para el almacenamiento de órganos esperando trasplantes.
En Transplantation 2000 15 de Abril; 69(7): 1261-5 se informa que la solución de la Universidad de Wisconsin, conocida como solución UW, es capaz de retardar los procesos catabólicos y garantizar una buena conservación de los órganos esperando trasplante.
La composición de la solución UW está basada en una estrategia farmacológica, que intenta:
1)
favorecer la resíntesis de ATP por medio del agregado de precursores tales como adenina y fosfato;
2)
prevenir la acidosis por medio de la presencia de tampón fosfato;
3)
inhibir la actividad de xantina oxidasa por medio de alopurinol;
4)
minimizar la redistribución iónica usando una composición similar a la que se encuentra intracelularmente (K^{+} elevado); y sobre todo
5)
prevenir la dilatación celular por medio de presión osmótica, por medio del agregado de lactobionato, rafinosa y coloides de alto peso molecular, tal como el almidón.
La estrategia básica de esta composición es sin embargo empírica y se sostuvo la hipótesis de que el efecto podría derivar de un fenómeno conocido como "suma de protecciones" (Southard J. H. y col., Transplantation 1990, 49:251).
En Transplant Proc. 1999; Agosto; 31(5):2069-70 se informa que la solución Celsior es útil para el almacenamiento de órganos esperando trasplante.
La solución salina EuroCollins es otra solución conocida, útil para el almacenamiento de órganos, que tiene la composición que se presenta en la siguiente Tabla 1.
TABLA 1
Concentración
K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 32 mM
KH_{2}PO_{4} 15 mM
KCl 15 mM
NaHCO_{3} 10 mM
Glucosa 194 mM
Esta solución ha sido considerada durante muchos años la solución estándar en Europa para el almacenamiento de órganos, en particular riñones. Su formulación se basa en la obtención de una composición electrolítica que simula el medio intracelular. Además, en esta solución, se obtiene hipertonicidad (420 mOsmol) mediante el agregado de altas concentraciones de glucosa (alrededor de 190 mM).
Las soluciones anteriormente citadas no están libres de inconvenientes y fueron objeto de numerosas modificaciones.
Las principales desventajas mostradas por la solución UW radican en su alta viscosidad, con el consiguiente posible daño, sobre todo soportado por las células endoteliales, durante la perfusión del órgano y el elevado coste de cada componente mientras permanece la duda acerca de que sea indispensable [Transplant. 2000; Oct. 27;70(8):1140-2].
La solución EuroCollins presenta numerosas desventajas:
1-
tiene una alta concentración de glucosa, que agrava el problema de la acidosis, debido a la enorme producción de lactato durante la hipoxia hipotérmica;
2-
no previene la dilatación celular durante el almacenamiento del órgano;
3-
no es mejor que la solución UW (Transplantation 2000 Abr. 15;69(7):1261-5).
Ya es conocido el uso de carnitinas en el campo médico.
En Ann. Thorac. Surg. 2001; 71:254-9 se describe el uso de L-carnitina para el tratamiento de la isquemia cardiopléjica, en corazón aislado de conejo. Este trabajo informa que la L-carnitina muestra un efecto protector de las funciones cardiacas en corazón aislado de conejo, cuando se lo perfundió con sangre entera en la que se había agregado L-carnitina.
Otras referencias encaran el problema de la conservación de órganos. Skrede, S., y col., Criobiology, 1983, Jun.; 20(3):290-7, enseña el agregado de pantotetina y adenosina como precursores de CoA con el fin de conservar la reserva de CoA citosólica y mitocondrial en riñones perfundidos de manera hipotérmica. Se sugiere que L-carnitina mejora el medio de perfusión. Nakagawa, T. y col. describen el uso de L-carnitina en cardioplejia por frío seguida por reperfusión en Thorac. Cardiovasc. Surg., 1994, Abr; 42(2):85-9. El documento WO 00/30637 describe el uso de la sal fumarato de L-carnitina o alcanoil L-carnitinas de 2-8 átomos de carbono para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la isquemia del órgano. El clorhidrato de L-carnitina se usa en la conservación isquémica en frío de injertos de hígado graso (Puetz, U., y col. Transplant Proc., 2001 Jun; 33(4):2523-4). También se describe la L-carnitina como agente preventivo en la lesión renal experimental por isquemia y reperfusión (Ergun, O., y col., Urol. Res., 2001 Jun; 29(3):186-9.
No se ha descrito aún el uso de carnitina en la preparación de una solución para almacenamiento de órganos en espera de trasplante.
Recientemente se ha encontrado que el agregado de carnitina y/o una alcanoil L-carnitina a una solución de almacenamiento para órganos aislados exhibe una capacidad sorprendente para almacenar y perfundir órganos, que es superior a la de las soluciones conocidas mencionadas anteriormente.
La solución de acuerdo con la presente invención difiere de las soluciones conocidas por la presencia de L-carnitina y/o una alcanoil L-carnitina.
La solución de acuerdo con la presente invención es adecuada para usar en el almacenamiento y perfusión de órganos en espera de trasplante.
Son ejemplos no limitantes de tales órganos, el corazón, hígado, páncreas, pulmón y riñón.
De preferencia, la solución de acuerdo con la presente invención comprende L-carnitina y una alcanoil L-carnitina, en la que la alcanoil L-carnitina se selecciona del grupo constituido por acetil; propionil; valeril; isovaleril; butiril e isobutiril L-carnitina.
En una forma de realización general, la solución de almacenamiento para mantener y perfundir órganos en espera de trasplante, de acuerdo con la presente invención comprende:
(a)
una solución isotónica equilibrada que comprende una cantidad fisiológicamente aceptable de iones potasio, fosfato monoácido, fosfato biácido, cloruro, sodio, bicarbonato;
(b)
50-250 mM de glucosa;
(c)
0,2-20 mM de alcanoil L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables; y/o
(d)
1-100 mM de L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables;
(e)
agua.
En una primera forma de realización de preferencia de la presente invención la solución para la conservación y perfusión de órganos en espera de trasplante (la que se denominará de aquí en adelante como "Solución Carnival") tiene la composición presentada en la Tabla 2,
TABLA 2
Concentración
K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 10-60 mM
KH_{2}PO_{4} 3-50 mM
KCl 3-50 mM
NaHCO_{3} 2-50 mM
Glucosa 50-250 mM
Alcanoil L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables 0,2-20 mM
L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables 1-100 mM
Isovaleril L-carnitina es la alcanoil L-carnitina de preferencia.
Se entiende por sal fisiológicamente aceptable de L-carnitina o de alcanoil L-carnitina a cualquier sal de las mismas con un ácido que no da lugar a efectos tóxicos indeseados. Estos ácidos son bien conocidos por farmacólogos y expertos en tecnología farmacéutica.
Son ejemplos no limitantes de estas sales, cloruro, bromuro, orotato, aspartato ácido, citrato ácido, citrato de magnesio, fosfato ácido, fumarato y fumarato ácido, magnesiofumarato, lactato, maleato y maleato ácido, mucato, oxalato ácido, pamoato, pamoato ácido, sulfato ácido, glucosafosfato, tartrato, tartrato ácido, magnesiotartrato, 2-aminoetansulfonato, magnesio 2-aminoetansulfonato, colinatartrato y tricloroacetato.
Resulta de preferencia el fumarato.
En la tabla 3 se presenta un ejemplo de una solución de preferencia, de acuerdo con la presente invención.
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TABLA 3
Concentración
K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 32 mM
KH_{2}PO_{4} 15 mM
KCl 15 mM
NaHCO_{3} 10 mM
Glucosa 187,5 mM
Fumarato de Isovaleril L-carnitina 2 mM
L-carnitina (sal interna) 10 mM 
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de acuerdo con la presente invención puede contener además:
1)
Uno o más antioxidantes, en cantidad útil para prevenir la formación de radicales libres derivados del oxígeno. Son ejemplos no limitantes de tales antioxidantes: alopurinol, glutation, betacaroteno, catalasa, superóxido dismutasa, dimetil tiourea (DMTU), difenilfenilendiamina (DPPD), manitol, cianidanol; y vitamina E y/o
2)
Ácido dicloroacético para reducir el lactato que se forma durante la conservación.
La cantidad de antioxidantes y/o ácido dicloroacético a usar es bien conocida por los expertos en la técnica y está ampliamente presente en la bibliografía.
La solución de acuerdo con la presente invención es adecuada para usarse en la prevención de mecanismos que causan daño a los órganos y por lo tanto es una solución que (a) previene o reduce la acidocis intracelular; (b) previene el daño causado por los radicales libres de oxígeno, en particular durante la reperfusión; (c) permite la regeneración de fosfatos de alta energía durante la reperfusión; (d) protege de la expansión de los espacios intracelulares; (e) mantiene los requerimientos metabólicos celulares.
Se ha evaluado la actividad protectora de la solución de acuerdo con la invención en modelos experimentales adecuados, con soluciones conocidas como referencia, útiles para el mismo objetivo.
Los siguientes ejemplos además ilustran la invención.
Ejemplo 1
Muchos estudios demostraron una correlación entre la capacidad del órgano de trasplante para regenerar compuestos fosforilados de alta energía, tal como ATP y el éxito del trasplante. De hecho, uno de los aspectos más importantes, por ejemplo en el almacenamiento del hígado, es ciertamente la capacidad de regeneración de compuestos fosforilados de alta energía, tal como ATP, tras el trasplante.
Los compuestos fosforilados de alta energía deben estar disponibles para una gran cantidad de mecanismos regulatorios que previenen el daño celular. Por ejemplo, los niveles de NTP (nucleósido trifosfatos) en el hígado deben estar en cantidad suficiente para restaurar los procesos celulares críticos, tales como el mantenimiento de gradientes que regulan el intercambio iónico a través del plasma y las membranas mitocondriales, la síntesis de proteínas, la producción de bilis y el ciclo de la urea.
En los ensayos experimentales llevados a cabo para demostrar la eficacia de la solución de acuerdo con la presente invención, se usaron hígados aislados de rata, en los que se analizaron las alteraciones en los niveles de ATP, ADP y nucleótidos adenínicos totales (NTP), por medio de espectroscopía ^{31}P-NMR (J. Lab. Clin. Med. 1992, 120:559; Transplatation 1944, 57:1576), durante la isquemia por frío, durante el período de conservación y durante la reperfusión.
La realización de estos ensayos experimentales requirió la resolución de los siguientes problemas principales:
1)
la construcción de una cámara de perfusión adaptada para trabajar dentro del imán de NMR y la creación del circuito de perfusión pertinente;
2)
la construcción de una bobina de radiofrecuencia (RF) utilizable con la cámara de perfusión;
3)
la definición de tiempos (duración de las fases de perfusión, conservación y reperfusión; intervalos para estudiar por medio de espectroscopía durante cada una de las fases; duración mínima de un único espectro; optimización de los tiempos de pasaje de una fase a otra).
Circuito y cámara de perfusión
En la Figura 1 se presenta el diagrama del circuito de perfusión.
La construcción de este circuito se realizó teniendo en cuenta que deben mantenerse las condiciones adecuadas de temperatura y oxigenación en el órgano, que está ubicado a una distancia de varios metros del sistema de perfusión, constituido por bombas y un termostato. De hecho, estos instrumentos necesitan estar colocados fuera del campo magnético de los instrumentos de medición, lo que corresponde a una distancia mínima de 6 metros, en nuestro
caso.
El medio de perfusión KH (Krebs-Henseleit + glucosa + BSA) (400 ml) (Krebs H. A. 1930; Biochem. J. 98, 720; Henseleit K. 1932; Hoppe-Seylerr's Z. physiol. Chem. 210, 33), colocado en el recipiente termostático, fuera de los imanes, se mezcló continuamente mediante agitación magnética.
La termostatización se realizó de manera de obtener una temperatura de 37 \pm 0,5ºC en la cámara de perfusión conteniendo el órgano dentro de los imanes.
La oxigenación del medio se aseguró por medio del uso de un oxigenador de membrana.
Se calculó el nivel de saturación de oxígeno en base al factor de permeabilidad de la silicona usada, el calibre y el espesor del tubo, la velocidad de flujo y la longitud del tubo envuelto en un espiral dentro del aparato de oxigenación y termostatización. Los valores calculados dieron resultados entre 30 y 35% de O_{2}.
Se recicló el líquido de perfusión con la ayuda de una bomba peristáltica con una velocidad de flujo de 25 ml/min.
El circuito de perfusión usó tubos de polietileno con un diámetro interno de 1 mm y una longitud de 6 m desde y hacia los imanes.
Para asegurar el mantenimiento de una temperatura controlada dentro de la cámara de perfusión en el imán, se fabricaron los circuitos de termostatización y perfusión de modo de pasar conjuntamente por dentro de un tubo de neopreno termoaislado.
Se activó y estabilizó el circuito al menos una hora antes de la perfusión del órgano para asegurar obtener la temperatura y oxigenación deseadas.
La cámara de perfusión, construida en Perspex, se fijó a un soporte de PVC para permitir la inserción dentro de los imanes. Esta tuvo una geometría simétrica, un diámetro de 34 mm por una altura de 65 mm.
Se mantuvo el hígado suspendido a la altura deseada fijando la cánula con discos de soporte a distancias adecuadas. Se realizó el drenaje recogiendo el líquido de perfusión en el fondo con forma de embudo, seguido por la aspiración hacia el reservorio de recogida.
El daño normotérmico debido a isquemia y reperfusión es un factor determinante en la patogénesis del daño hepático, que se produce durante los procedimientos quirúrgicos, tales como resección hepática y trasplante
hepático.
Con el fin de minimizar lo más posible el tiempo de isquemia por calor, se introdujeron variaciones en el procedimiento quirúrgico estándar de extracción del hígado. En particular, se usaron animales que no estaban en ayunas; en modelos animales, de hecho, estudios in vivo e in vitro demostraron que el ayuno agrava el daño isquémico normotérmico causado por una disminución en el contenido de glucógeno.
Se usaron ratas Wistar macho con un peso inicial de 150 g. Se anestesió a los animales con una inyección intraperitoneal (i. p.) de tiopental sódico, posteriormente se los sometió a una incisión media con la apertura sucesiva del peritoneo.
Se expusieron la vena porta y la vena cava, se eliminaron tantas adherencias y grasa como fue posible para extraer rápidamente el órgano y minimizar el tiempo de isquemia.
Se prepararon ligaduras para la vena cava inferior y para la vena porta.
Se cerró la vena cava y a continuación en una sucesión rápida, la vena.
Se insertó una cánula en la vena porta (Abbocath T 20G Abbott) que fue fijada con una sutura previamente preparada y conectada a una jeringa conteniendo solución de Ringers lactato fría (Dawson R. M. C. (ed.), Elliott D. C. Elliott W. H. y Jones K. M. (1969) Data for biochemical research, 2º ed. Clarendon Press, Oxford.) para una primera perfusión de lavado de la sangre. Se cortó la vena cava para permitir la salida del líquido de perfusión.
Posteriormente se extrajo el órgano lo más rápidamente posible.
Desde el cierre de los vasos sanguíneos hasta el inicio de la perfusión dentro de los imanes hubo un intervalo de tiempo no mayor de 10 minutos, con 1-2 minutos de isquemia por calor.
Se dejó la cánula in situ y se usó para la reperfusión.
En el siguiente diagrama 1 se presenta el protocolo experimental que se llevó a cabo.
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(Diagrama pasa a página siguiente)
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Diagrama 1
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1 
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Se perfundieron los hígados in situ con solución de Ringers lactato a 4ºC para eliminar la sangre y limitar lo más posible el tiempo de isquemia normotérmica del órgano.
Posteriormente se colocaron los órganos aislados en perfusión dentro de los imanes, en un biorreactor adecuado, se los nutrió con solución de Krebs-Henseleit a 37ºC, 35% de O_{2}, para la obtención de los espectros ^{31}P-NMR basales de referencia (tiempo 0).
La obtención de estos espectros NMR se llevó a cabo para eliminar la variabilidad biológica entre órganos; de esta manera, de hecho, las variaciones observadas tras la conservación pueden referirse a valores determinados en el mismo órgano inmediatamente tras la extracción desde el animal y estabilización en perfusión durante 40'.
Al final de los 40' de estabilización, se perfundieron los órganos con diferentes soluciones de almacenamiento a 4ºC.
Las pruebas experimentales se realizaron efectuando solución Carnival de acuerdo con la presente invención y se usaron dos soluciones de almacenamiento conocidas como referencia:
1)
Solución UW con el agregado de insulina (40 U.I./l) y dexametasona (8 mg/l); y
2)
Solución EuroCollins
La Tabla 4 presenta las composiciones de las soluciones Carnival, EuroCollins y UW.
TABLA 4
Solución Carnival Solución EuroCollins Solución UW
K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 32 mM 32 mM 2,5 mM
KH_{2}PO_{4} 15 mM 15 mM -
KCl 15 mM 15 mM -
NaHCO_{3} 10 mM 10 mM -
Glucosa 187,5 mM 194 mM -
Fumarato de Isovaleril L-carnitina 2 mM - -
L-carnitina (sal interna) 10 mM - -
Glicina - - 15 mM
Alopurinol - - 1 mM
Adenosina - - 2,5 mM
Lactobionato - - 100 mM
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O - - 5 mM
Rafionosa - - 30 mM
PEG\ - - +
"-" significa "ausente";
"+" significa "presente".
En algunos experimentos se obtuvieron los espectros en frío, inmediatamente tras la perfusión del órgano con la solución de acuerdo con la presente invención, para evaluar la cinética de desaparición de metabolitos fosforilados en la 1º hora.
Los resultados obtenidos se presentan en las Tablas 8-10.
Para cada espectro se prestó atención a:
1)
los niveles totales de metabolitos fosforilados;
2)
los niveles de fosfato inorgánico y fosfomonoésteres (P_{i}+PME);
3)
los niveles de nucleósido trifosfatos (NTP);
4)
los niveles de NAD como la suma de las señales de \alpha-NTP+NAD.
Se obtuvieron los espectros con intervalos de 10 minutos durante una hora.
Se almacenaron los hígados por inmersión en varias soluciones a 4ºC durante un tiempo total de 26 horas.
Se eligió el tiempo de almacenamiento con el fin de evaluar la capacidad de reinicio tras un tiempo mucho mayor que el usado normalmente en la práctica clínica o en los experimentos.
Al final del tiempo de almacenamiento (hora 26), se colocaron los hígados nuevamente dentro de los imanes en perfusión con solución KH, a 37ºC, 35% de O_{2}, para controlar los metabolitos fosforilados.
Se obtuvieron los espectros ^{31}P-NMR cada 15' durante un tiempo límite de 140'.
Los resultados obtenidos se presentan en las Tablas 5-7.
Condiciones experimentales de NMR
Las características específicas del experimento ^{31}P-NMR dependen estrictamente de la configuración experimental elegida para la perfusión del hígado, con el principal objetivo de obtener espectros con proporciones óptimas de señal/ruido.
Las dificultades destacadas a considerar fueron:
i)
la necesidad de usar tiempos de exploración breves;
ii)
optimización de las condiciones operativas del sistema de Resonancia Magnética Nuclear;
iii)
heterogeneidad en la geometría y composición de las muestras.
Las condiciones experimentales usadas fueron:
-
ancho de banda espectral 8,33 KHz;
-
2048 puntos probados;
-
900 obtenciones;
-
2 ensayos de prueba;
-
ciclo de fase en 2 etapas;
-
impulso a 90º (150 \mus);
-
intervalo de repetición 2 s.
Se obtuvieron los espectros, en relación con las diversas condiciones experimentales a partir de la acumulación de 450 exploraciones en condiciones de perfusión o reperfusión y de 300 exploraciones en condiciones de hipotermia, siempre con un tiempo de repetición de 2 segundos.
El espectro ^{31}P-NMR obtenido muestra señales de referidas a \alpha, \beta y \gamma fosfato de los nucleósido trifosfatos respectivamente en -9,7, -18,35 y -4,2 ppm y están representados prevalentemente por adenosina trifosfato (ATP) y en cantidades menores por guanosina trifosfato (GTP), uridina trifosfato (UTP) y citidina trifosfato (CTP).
La resonancia de nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfatos (NAD) y nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato contribuyen a la señal asignada a \alphaNTP.
Las señales relacionadas con \alpha y \beta fosfatos de los nucleótido difosfatos, representados principalmente por adenosina difosfato (ADP), están respectivamente en -8,9 y -4,4 ppm. La última señal está parcialmente enmascarada por la señal de \gammaNTP.
Las señales en -11,5 ppm atribuidas a compuestos con 2 grupos fosfato diesterificados (DPDE) están representadas en su mayoría por uridina disfosfoglucosa y uridina disfosfoglucuronato.
Las señales relacionadas con intermediarios de fosfolípidos están presentes en la zona espectral entre 5,8 y 4 ppm, donde resuenan los núcleos de los grupos fosfato de ésteres de monofosfato (PME).
Se usó como referencia metilen difosfato (MDP) 300 mM, contenido en un capilar (0,5 ml) fijado al interior de la cámara de perfusión.
Se evaluó el área de señal aplicando uno de los programas conocido para la reconstrucción de espectros de resonancia (programa SPEC ANA; SMIS).
Resultados obtenidos
La perfusión inicial con solución KH (37ºC, 35% O_{2}) tras la extracción y lavado del hígado con solución de Ringers lactato (4ºC) durante 40', se consideró suficiente para la estabilización de niveles de metabolitos fosforilados.
Los niveles iniciales (prealmacenamiento) de \beta-ATP resultaron ser 8,3 \pm 3,1, los niveles iniciales de \alpha-ATP resultaron de 22,6 \pm 5,4 (mientras que los valores presentados en la tabla están expresados como un porcentaje de la referencia).
Las proporciones \beta-ATP/Pi + PME, \alpha-ATP/Pi + PME y \beta-ATP/\alpha-ATP dieron resultados de 8,4 \pm 5, 23,4 \pm 10,2 y 35,7 \pm 11, respectivamente.
Los valores obtenidos de esta manera se usaron como referencia para tiempo 0 para las evaluaciones subsiguientes.
En la Tabla 5 se presentan los resultados relacionados con un espectro representativo obtenido previamente, durante y tras la conservación con solución Carnival.
TABLA 5 
\vskip1.000000\baselineskip
3
Los valores posteriores al explante están expresados como proporciones de la señal de referencia. Todos los demás valores están expresados como porcentajes con respecto al último.
En la Tabla 6, se presentan los datos con relación al espectro representativo obtenido previamente, durante y tras el almacenamiento con solución UW.
TABLA 6 
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores posteriores al explante están expresados como proporciones de la señal de referencia. Todos los demás valores están expresados como un porcentaje del último.
En la Tabla 7, se presentan los datos con relación al espectro representativo obtenido previamente, durante y tras el almacenamiento con solución EuroCollins.
TABLA 7
7
Los valores posteriores al explante están expresados como proporciones de la señal de referencia. Todos los demás valores están expresados como porcentajes del último.
En la Tabla 7, se presentan datos de un espectro de una reperfusión única (30') ya que en este y en los tiempos subsiguientes, no se observó resíntesis de compuestos fosforilados.
La cinética de desaparición de metabolitos fosforilados observada en los primeros 60' de conservación en frío demostró que la señal de \alpha-ATP + \alpha-ADP + NAD está presente hasta el final de las mediciones para todas las soluciones de conservación de una manera que varía de órgano a órgano.
La señal de \beta-ATP fue detectable hasta un tiempo máximo de 30' sólo con la conservación con UW, mientras que estuvo ausente incluso en el primer espectro de las soluciones EuroCollins y Carnival.
Las señales de \gamma-ATP + \beta-ADP permanecieron presentes hasta los 50' de la adquisición, debido sin embargo sólo a la presencia de ADP.
La cantidad residual de metabolitos fosforilados a los 60' no se correlacionó con la capacidad para resintetizar ATP en la reperfusión normotérmica tras 26 horas de conservación en las diferentes soluciones.
En las Tablas 8,9 y 10 se presentan valores con desviaciones estándar para \beta-ATP y \alpha-ATP obtenidos a los 80' y 140' de perfusión normotérmica, tras perfusión y al inicio de la conservación a 4ºC (espectros en frío, los análisis NMR se realizaron aproximadamente 2 horas tras la extracción del órgano) en soluciones Carnival, UW y EuroCollins respectivamente.
TABLA 8
Solución Tiempo (min) \beta-ATP (n = 8) \alpha-ATP (n = 8)
Carnival 80' 62,4 \pm 24 62,4 \pm 14
Carnival 140' 55,2 \pm 25,2 53,5 \pm 15,6
(n es el número de animales usados)
TABLA 9
Solución Tiempo (min) \beta-ATP (n = 8) \alpha-ATP (n = 8)
UW 80' 64,2 \pm 13,1 55,2 \pm 17
UW' 140' 57,2 \pm 13,5 63,4 \pm 19
(n es el número de animales usados)
TABLA 10
Solución Tiempo (min) \beta-ATP (n = 8) \alpha-ATP (n = 8)
EuroCollins 80' 15 \pm 13,7 52 \pm 14,4
EuroCollins 140' n.d. 25,4 \pm 21
(n es el número de animales usados)
Los valores están expresados con referencia a la misma señal obtenida a 37ºC tras el explante.
Como puede notarse, la solución de acuerdo con la presente invención juega un papel protector en la vitalidad celular durante la fase de reperfusión normotérmica del hígado aislado permitiendo la resíntesis de ATP que es comparable durante la fase de reperfusión normotérmica con la observada con UW. Es importante resaltar que la reaparición de señal y por lo tanto la capacidad de resíntesis es más rápida para los órganos almacenados en Carnival con respecto a los almacenados en UW, donde no se observa resíntesis satisfactoria hasta los 60'.
Viceversa, los órganos almacenados en solución EuroCollins no demostraron niveles apreciables de ATP en los tiempos considerados.
Además, debería subrayarse que las concentraciones de los metabolitos se mantuvieron en niveles comparables para las soluciones UW y Carnival hasta los 140'.
La solución de acuerdo con la presente invención, en la fase de almacenamiento hipotérmico, además previene la dilatación celular debida al fenómeno osmótico, como se observa cualitativamente, de manera análoga al efecto obtenido con solución UW con agregado de lactobionato, rafinosa y glicina.
La solución de acuerdo con la presente invención favorece el mantenimiento de la integridad bioenergética hepática incluso tras 26 horas de conservación hipotérmica proveyendo, a menor coste, resultados comparables con los obtenidos con la solución UW, más costosa.

Claims (13)

  1. \global\parskip0.960000\baselineskip
    1. Una solución de almacenamiento para mantener y perfundir órganos en espera de trasplante que comprende:
    (a)
    una solución isotónica equilibrada que comprende una cantidad fisiológicamente aceptable de iones potasio, fosfato monoácido, fosfato biácido, cloruro, sodio, bicarbonato;
    (b)
    50-250 mM de glucosa;
    (c)
    0,2-20 mM de alcanoil L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables; y/o
    (d)
    1-100 mM de L-carnitina o una de sus sales fisiológicamente aceptables;
    (e)
    agua.
  2. 2. La solución de almacenamiento de la reivindicación 1, en la que la solución iónica isotónica equilibrada está compuesta por compuestos seleccionados del grupo constituido por: K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O; KH_{2}PO_{4}; KCl; NaHCO_{3}.
  3. 3. Las soluciones de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprenden:
    K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 10-60 mM KH_{2}PO_{4} 3-50 mM KCl 3-50 mM NaHCO_{3} 2-50 mM Glucosa 50-250 mM Alcanoil L-carnitina o una sal fisiológicamente aceptable de la misma 0,2-20 mM L-carnitina o una sal fisiológicamente aceptable de la misma 1-100 mM
  4. 4. La solución de almacenamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la alcanoil L-carnitina se selecciona del grupo constituido por: acetil; propionil; valeril; isovaleril; butiril o isobutiril L-carnitina.
  5. 5. Las soluciones de almacenamiento de la reivindicación 4, en las que la alcanoil L-carnitina es isovaleril L-carnitina.
  6. 6. Las soluciones de almacenamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la sal de L-carnitina o de alcanoil L-carnitina fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo constituido por: cloruro, bromuro, orotato, aspartato ácido, citrato ácido, citrato de magnesio, fosfato ácido, fumarato y fumarato ácido, magnesiofumarato, lactato, maleato y maleato ácido, mucato, oxalato ácido, pamoato, pamoato ácido, sulfato ácido, glucosafosfato, tartrato, tartrato ácido, magnesiotartrato, 2-aminoetansulfonato, magnesio 2-aminoetansulfonato, colinatartrato y tricloroacetato.
  7. 7. La solución de almacenamiento de la reivindicación 6, en la que la sal de L-carnitina o de alcanoil L-carnitina fisiológicamente aceptable es fumarato.
  8. 8. Las soluciones de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
    K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 32 mM KH_{2}PO_{4} 15 mM KCl 15 mM NaHCO_{3} 10 mM Glucosa 187,5 mM Fumarato de Isovaleril L-carnitina 2 mM L-carnitina (sal interna) 10 mM
  9. 9. Las soluciones de almacenamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para mantener y perfundir un órgano en espera de trasplante en las que el órgano se selecciona del grupo constituido por: corazón, hígado, páncreas, pulmón o riñón.
  10. 10. La solución de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el órgano a almacenar es el hígado.
  11. 11. La solución de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además contiene al menos un antioxidante en una cantidad suficiente para inhibir la formación de radicales libres derivados del oxígeno.
  12. 12. La solución de almacenamiento de la reivindicación 11, en la que el antioxidante se selecciona del grupo constituido por: alopurinol, glutation, betacaroteno, catalasa, superóxido dismutasa, dimetil tiourea (DMTU), difenilfenilendiamina (DPPD), manitol y cianidanol.
  13. 13. La solución de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además contiene ácido dicloroacético.
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