ES2232505T3 - Solucion para la preservacion de corazones. - Google Patents
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Abstract
Solución para preservar y almacenar un corazón durante 24 horas mientras está a la espera de un trasplante, que comprende: (a) una solución isotónica equilibrada en una cantidad fisiológicamente aceptable; (b) una ciclosporina presente en una cantidad comprendida entre 2, 5 ìM y 10 ìM por litro de solución y (c) agua.
Description
Solución para la preservación de corazones.
La presente invención se refiere a soluciones
para preservación de corazones. Más particularmente, esta invención
se refiere a soluciones de preservación para la perfusión y
almacenamiento de un corazón a la espera de trasplante, así como a
procedimientos para utilizar la solución de preservación durante el
trasplante de un órgano.
La preservación de corazones a la espera de
trasplante se hizo una práctica común en muchos hospitales; sin
embargo, la capacidad para realizar trasplantes está limitada a la
viabilidad del corazón. Se hizo un gran progreso, en el transcurso
de los años, en el conocimiento de los mecanismos celulares así como
en el desarrollo de nuevas técnicas de trasplante para mantener los
órganos viables, no solamente mediante el almacenamiento, sino
también después de la reperfusión de estos órganos. Como resultado,
el trasplante de órganos incluyendo el trasplante de corazón, es una
operación electiva establecida. Un factor significativo que limita
la aplicación clínica del trasplante de órganos es la desviación de
la viabilidad para el órgano después de su retirada desde el
donante. La preservación a largo plazo del tejido cardíaco da lugar
a dos clases de destrucción de células: (1) necrosis y (2)
apoptosis. El daño de las células necróticas da lugar a un
hinchamiento celular con los organillos celulares hinchándose
incluso hasta las rupturas celulares, derramando su contenido
dentro del espacio celular extra. La apoptosis (muerte celular
programada) es una destrucción organizada de las células con los
componentes celulares en contracción hasta que nada permanece.
Durante el desarrollo embriónico, la apoptosis desempeña un papel
importante al personalizar varios órganos para uso de adultos. La
apoptosis está también presente en el tejido cardíaco isquémico
(privado de oxígeno) así como la necrosis cuando se preserva durante
90 minutos a temperaturas corporales normales. La apoptosis parece
ser un mecanismo más destructivo para las células miocardiales
durante la isquemia.
Se han estudiado a fondo las composiciones de
numerosas soluciones de preservación. Por ejemplo, las propiedades
protectoras de soluciones de preservación en frío fueron estudiadas
en G. Tian et al. (1991), Journal of Heart and Lung
Transplantation (10)975-985, donde las
soluciones de preservación en frío limitaron el tiempo de
almacenamiento del órgano. Una solución de preservación útil por
todos los órganos del donante, tanto para enfriamiento del órgano
in situ en el donante y para almacenamiento en frío después
de que la recogida del órgano esté disponible según E.I. du Pont de
Nemours and Co., bajo la marca comercial VIASPAN® y dada a conocer
en la patente US nº 4.879.283. La solución de la patente US nº
4.879.283 ha extendido el tiempo de preservación de órganos
destinados a trasplante, prolongando, por ejemplo, la viabilidad de
hígados desde 6 a 10 horas hasta más de 24 horas. Aunque la solución
de la patente US nº 4.879.283 ha sido efectiva al prolongar el
tiempo de preservación de órganos destinados a trasplante, todavía
se producen lesiones celulares. Por lo tanto, es deseable una
reducción adicional en las lesiones celulares y un aumento del
tiempo de supervivencia. Otra solución patentada para la
preservación de órganos es la patente US nº 4.873.230 titulada
"Composition For The Preservation Of Organs". No obstante, otra
solución patentada es la patente US nº 4.798.824 titulada
"Perfusate For The Preservation Of Organs" que se refiere a una
composición de almidón de hidroxietilo útil en una solución de
preservación.
La introducción de ciclosporina para
inmunosupresión, durante los años 1980, revivió el interés por los
tejidos y órganos trasplantados, concretamente, el hígado, los
riñones, el páncreas, el corazón y los pulmones. Sin embargo, los
procedimientos de preservación que fueron satisfactorios para los
riñones no han probado serlo para estos otros órganos, tales como
corazones, porque el corazón es más complejo de trasplantar que los
riñones. Tiempos de preservación cortos para el corazón exigen
también dos equipos quirúrgicos, uno para el donante y otro para el
receptor. Ampliar los tiempos de preservación para el corazón
tendría un impacto positivo sobre el trasplante, a saber, aumentando
la disponibilidad de órganos y disminuyendo el desperdicio de
órganos, incluyendo la utilización compartida de órganos y la
reducción de costes. La ciclosporina, un fármaco utilizado para
impedir el rechazo, fue informado también como que bloquea la
apoptosis en algunos sistemas celulares.
Los procedimientos de almacenamiento estático
frente a la perfusión continua mostraron grandes diferencias en la
duración de la preservación. Los cambios metabólicos durante el
almacenamiento hipotérmico están caracterizados por una pérdida de
trifosfato de adenosina (ATP) y fosfato de creatina (CP) que
conducen a la disrupción de bombas de intercambio iónico y
desequilibrios de electrólitos, que intensifican el daño celular e
impiden la recuperación del corazón. La preservación de los niveles
de ATP y CP beneficia el almacenamiento a largo plazo del corazón.
Sin embargo, por lo menos un 90% del ATP se pierde en la mayoría de
los órganos hipotérmicamente almacenados dentro de un plazo de 2 a 4
horas, pero se recuperan completamente después de períodos de
preservación mucho más largos.
El documento
US-A-5693462 se refiere a una
solución de preservación para la perfusión/almacenamiento de órganos
mientras están a la espera de trasplante. La solución de
preservación exige la inclusión de un compuesto de adenosina y
amilorida.
El documento
US-A-5665774 se refiere a una nueva
clase de compuestos inmunosupresivos que tienen una afinidad para la
proteína vinculante FK-506. Los compuestos aquí
revelados se utilizan como inmunosupresores para la profilaxis de
rechazo de órganos o tratamiento de rechazo de injerto crónico y
para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
El documento
US-A-5925510 se refiere a un
procedimiento para autotrasplante que, en particular, incluye la
preservación del tejido poniendo en contacto el tejido con un medio
de preservación. El medio de preservación es una solución isotónica
que incluye penicilina G y sulfato de estreptomicina. La penicilina
G y el sulfato de estreptomicina son antibióticos.
Massoudy et al., Journal of Molecular
Cell Cardiology, 29, 535-44 (1997) se refiere al
daño por reperfusión en corazones, pero no hace ninguna revelación
sobre la preservación y almacenamiento de un corazón mientras está a
la espera de trasplante.
Uno de los principales criterios para el
trasplante de corazón, después de que se cumplan procedimientos de
adaptación adecuados, es que el corazón debe recogerse desde el
donante, transportarse y reimplantarse en el receptor dentro de un
plazo de tiempo de cuatro a seis horas. Aunque no parece necesaria
la ampliación de los tiempos de preservación para corazones, un
procedimiento de preservación más fiable puede extender los márgenes
para que los corazones puedan transportarse y recibirse. Una barrera
de 18 horas ha existido en la mayoría de los laboratorios
experimentales para los corazones de grandes mamíferos con una
recuperación funcional del 50% transcurridas seis horas. Aunque no
vaya seguido por períodos de tiempo más largos, el intervalo de
tiempo de seis horas fue utilizado debido a su importancia clínica
para cumplir los requisitos funcionales iniciales del "nuevo
corazón" que no implicaba problemas de rechazo y esterilidad. Se
encontró que, a las 18 horas de la preservación y una temperatura de
4ºC con la solución de la Universidad de Wisconsin (UW), no era
evidente ninguna necrosis en un corazón, pero estaba presente la
apoptosis. Por consiguiente, si se puede bloquear la apoptosis, se
pueden prolongar los tiempos de
preservación.
preservación.
Por lo tanto, es objetivo general de esta
invención establecer la relación de muerte celular apoptótica y
necrótica a la preservación del corazón.
Otro objetivo de la presente invención es
determinar si la apoptosis bloqueante durante la preservación del
corazón extiende la viabilidad miocardial y extiende los límites
percibidos de almacenamiento en frío para corazones, permitiendo un
mayor intervalo de tiempo transcurrido entre la recogida desde el
donante hasta el trasplante al
receptor.
receptor.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar soluciones de preservación para el régimen pulsatorio y
almacenamiento de órganos mientras se encuentran a la espera de
implante, lo que inhibe el intercambio iónico, amplía la viabilidad
del órgano y reduce los daños a la célula.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para la preservación de corazones que
prolonga la vida máxima del corazón durante el trasplante.
Otras características y ventajas de la presente
invención serán evidentes a partir de los siguientes detalles de la
invención según se describe con más detalle.
Según estos objetivos y los principios de esta
invención, se da a conocer una solución de preservación para la
perfusión y almacenamiento de un corazón mientras se está a la
espera de su trasplante, así como un procedimiento para trasplantar
corazones utilizando las soluciones de preservación, cuyos
procedimientos aumentan los tiempos de almacenamiento y son menos
nocivos para el órgano.
Se ha descubierto que una solución de
preservación, que contiene ciclosporina, preserva la función
mitocondrial manteniendo los niveles de ATP y bloquea la apoptosis,
impidiendo así la muerte celular programada. En una realización
precedente de esta invención, la solución de preservación incluye
una solución isotónica equilibrada que comprende iones de sodio,
potasio, calcio, magnesio y bicarbonato en una cantidad
fisiológicamente aceptable.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se proporciona una solución para preservar y almacenar un corazón
durante hasta 24 horas mientras se está a la espera de trasplante,
que comprende:
- (a)
- una solución isotónica equilibrada en una cantidad fisiológicamente aceptable;
- (b)
- una ciclosporina presente en una cantidad de 2,5 \muM a 10 \muM por litro de solución y
- (c)
- agua.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para preservar y
almacenar un corazón a la espera de trasplante, que comprende:
la perfusión de dicho corazón durante 24 horas
con una solución que comprende:
- (a)
- una solución isotónica equilibrada en una cantidad fisiológicamente aceptable;
- (b)
- ciclosporina y
- (c)
- agua.
Preferentemente, se utiliza aproximadamente entre
5,0 \muM y 7,0 \muM de ciclosporina por litro de solución.
A medida que aumenta la duración isquémica, la
lesión tisular cambia desde un estado reversible a otro
irreversible. Se ha demostrado que cuando el tejido miocardial
isquémico presenta fragmentos de poli-(ADP-ribosa)
polimerasa (PARP) durante la preservación normotérmica, la
reperfusión resultaba en un daño irreversible, caracterizado por la
pérdida de capacidad funcional y la aparición de células apoptóticas
entre numerosas células necróticas. Cuando no se encontraban
fragmentos de PARP, la apoptosis no era considerada en la
reperfusión y no se encontraban daños irreversibles miocardiales y
se conseguía una recuperación funcional. En estudios clínicos
realizados utilizando la preservación hipotérmica de 18 horas con
solución de UW, se encontraron fragmentos de PARP al final del
período isquémico de 18 horas y con reperfusión, se encontró
apoptosis sin ninguna necrosis concomitante con una recuperación del
50-60% de la función LV (ventricular izquierda). La
vía común de la necrosis y apoptosis, a través del poro de
transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) sugiere la presencia
de un posible mecanismo que pueda limitar la preservación
miocardial.
la Figura 1 es una representación esquemática del
procedimiento de trasplante heterotópico para la reanimación del
corazón del donante y la determinación de la función ventricular
izquierda (LV);
la Figura 2 ilustra los cambios en la función del
ventrículo izquierdo LV (Ees) con y sin tratamiento de ciclosporina
A durante 18 y 24 horas de preservación hipotérmica;
la Figura 3 ilustra las alteraciones en las
concentraciones de ATP miocardiales durante 6 horas de reperfusión
transcurridas 18 y 24 horas de preservación con y sin ciclosporina
A;
la Figura 4 ilustra los efectos sobre la
concentración de CP miocardial durante 6 horas de reperfusión
después de 18 y 24 horas de preservación con y sin ciclosporina
A;
la Figura 5 ilustra los efectos de 18 y 24 horas
de preservación con y sin ciclosporina A a niveles de adenosina
miocardiales durante 6 horas de reperfusión;
la Figura 6A ilustra los resultados de TUNEL para
la presencia de miocitos apópticos durante 6 horas de reperfusión
después de 18 horas de preservación con UW sin ciclosporina A;
la Figura 6B ilustra el porcentaje de lamina
B_{1} reducido desde núcleos miocardiales bajo las mismas
condiciones experimentales;
la Figura 7A ilustra los resultados de TUNEL
durante 6 horas de reperfusión después de 18 horas de preservación
con solución UW y ciclosporina A; y
la Figura 7B ilustra que el porcentaje de lamina
B_{1} no cambia en los núcleos miocardiales durante la reperfusión
cuando se utilizó ciclosporina A durante la preservación.
A continuación se describirá la presente
invención con más detalle, haciendo referencia a los dibujos
adjuntos, en los que se ilustran realizaciones preferidas de la
invención. Esta invención puede, sin embargo, materializarse en
muchas formas diferentes y no debe interpretarse como estando
limitada a las realizaciones aquí descritas; no obstante, estas
realizaciones se proporcionan con el fin de que la presente memoria
sea más profunda y completa, y los expertos en la materia apreciarán
que se ajusta completamente al alcance de la invención.
La presente invención se refiere a soluciones de
preservación para el almacenamiento y perfusión de un corazón
destinado para trasplante a un paciente que requiera dicho implante.
Se descubrió que cuando se añade ciclosporina a la solución de
preservación para: (1) preservar la función mitocondrial que lo hace
manteniendo los niveles de adenosina trifosfato (ATP) y (2) para
bloquear la apoptosis e impedir la muerte celular programada. Por lo
tanto, la preservación de la función mitocondrial impide la necrosis
mientras el bloqueo impide la apoptosis.
Las soluciones de preservación de esta invención
incluyen una solución isotónica equilibrada en una cantidad
fisiológicamente aceptable, una ciclosporina y el resto de agua. Las
soluciones de preservación preferidas de la presente invención están
basadas en una solución isotónica equilibrada que incluye iones de
sodio, potasio, calcio y magnesio así como glucosa y bicarbonato
sódico en una cantidad fisiológicamente aceptable. Algunos de estos
tipos de soluciones son bien conocidos, tales como los descritos a
continuación, conocidos como solución de bicarbonato de
Krebs-Henseleit, que tiene la composición
siguiente.
| Márgenes de concentración en 1 litro | |
| NaCl | 85 mM a 145 mM |
| KCl | 3 mM a 50 mM |
| CaCl_{2} | 0,5 mM a 2,5 mM |
| KH_{2}PO_{4} | 0,7 mM a 1,3 mM |
| MgSO_{4} | 0,9 mM a 4,8 mM |
| NaHCO_{3} | 15 mM a 35 mM |
| Glucosa | 1,0 mM a 50 mM |
| mM = milimoles |
Otras soluciones pueden utilizarse como una base
para formar las soluciones de la invención. Un ejemplo de dicha
solución es la solución conocida como la solución de la Universidad
de Wisconsin (UW).
Las soluciones de preservación deben contener
entre 2,5 \muM y 10 \muM, aproximadamente, de ciclosporina por
litro de solución preferentemente entre 5,0 \muM y 8,0 \muM de
ciclosporina por litro de solución.
En un procedimiento preferida de la invención, el
donante es tratado con la solución de preservación mientras se
recoge el corazón. Una vez aislado y enfriado, el corazón se pone
una bolsa de plástico que se coloca en un baño de agua a una
temperatura comprendida entre 4ºC y 6ºC. Una solución de UW con una
concentración de 10^{-5} moles por litro de ciclosporina se
utiliza para la descarga inicial y se enfría el corazón. Durante las
18 o 24 horas de preservación, la misma solución es objeto de
perfusión a través del corazón circulando a 1 ml por minuto a través
de todo el periodo de preservación. Cuando se inició una
reperfusión, se utiliza una reperfusión por etapas de modo que un
25% de la presión
de perfusión se introduzca durante un periodo de 5 a 10 minutos, un 50% de presión de perfusión durante un periodo de 5 a 10 minutos y un 75% de presión de perfusión durante otro periodo de 5 a 10 minutos y, por último, un 100%.
de perfusión se introduzca durante un periodo de 5 a 10 minutos, un 50% de presión de perfusión durante un periodo de 5 a 10 minutos y un 75% de presión de perfusión durante otro periodo de 5 a 10 minutos y, por último, un 100%.
Para demostrar la eficacia de las soluciones de
preservación de esta invención, se realizaron experimentos con
perros mestizos (20-26 kg). Ochenta animales
sirvieron como donantes de corazones y 80 como receptores
heterotópicos para varios grupos experimentales. El donante y el
receptor fueron anestesiados con pentobarbital sódico (30 mg/kg),
incubados y mecánicamente ventilados
(Puritan-Bennett Companion 2800 Volume Ventilator,
Boulder, CO 80301). Los corazones de los animales donantes fueron
expuestos a través de una incisión de toracotomía de línea media.
Después de la heparinización (3 mg/kg), se introdujo una
cardioplegia cristaloide hipotérmica y la temperatura del corazón se
redujo y mantuvo a 10ºC. La temperatura miocardial fue controlada
por un termistor de aguja septal (Electromedic, Inc. TM 2100;
Englewood, CO 80112). El corazón del donante fue luego lavado con
una descarga de aproximadamente 1 litro de la solución de
conservación en la que se almacenaría durante el periodo de
conservación. Una solución de UW se utilizó para preservación y fue
modificada para los diversos grupos experimentales. A continuación,
el corazón fue escindido y colocado en una bolsa de plástico de
doble pared que contiene aproximadamente 100 ml de la solución de
UW. En dichos experimentos en los que se mantuvo una lenta perfusión
constante (1 ml/min) de la solución de preservación, la arteria
innominada fue canulada para la perfusión y el efluente fue extraído
a través de la arteria pulmonar canulada. Aproximadamente 1100 ml
fue objeto de perfusión durante las 18 horas de preservación.
Durante el periodo de preservación, la bolsa de plástico conteniendo
el corazón fue sumergida un baño de agua fría que mantuvo la
temperatura del corazón a 4,5ºC.
Según se ilustra en la Figura 1, después de la
preservación, la arteria aorta 18 y la arteria pulmonar 22 del
donante fue conectada, mediante el montaje de cánula, a la arteria
carótida izquierda 16 y a la vena yugular derecha 14 del animal
receptor, respectivamente. El corazón fue envuelto en una
almohadilla caliente 32 y la temperatura septal miocardial fue
lentamente aumentada mediante una reperfusión escalonada de la
sangre arterial hasta que fue posible la desfibrilación del corazón
receptor a una temperatura aproximada de 34 a 35ºC. El proceso de
calentamiento necesitó 20-30 minutos. La arteria
femoral 36 y la vena 34 del receptor fueron aisladas y conectadas
por medio de una bolsa elevada teniendo un orificio de ventilación
12 hacia la aurícula izquierda 28 del corazón del donante para
mantener la presión de la aurícula izquierda a aproximadamente 15
mmHg. Los cambios funcionales en el ventrículo izquierdo (LV) fueron
determinados a partir de la elastancia sistólica final (Ees)
derivada de los buques de presión / diámetro registrados a partir de
una presión del ventrículo izquierdo (catéter con punta de
transductor Millar colocado a través del ápice) y fue medido el
diámetro de LV-AP utilizando técnicas de
sonomicrometría 24 (Triton Technology Inc. San Diego, California).
El corazón del donante heterotópico funciona normalmente con la
presión de la aurícula izquierda mantenida a aproximadamente 15
mmHg. El flujo arterial coronario fue suministrado por la arteria
carótida izquierda del receptor y el flujo de salida venoso
coronario circulaba a través de la arteria pulmonar del corazón del
donante hacia la vena yugular del receptor. Cuando fueron medidos
los bucles de presión-diámetro, el flujo a través
del corazón del donante fue modificado temporalmente interrumpiendo
el flujo de entrada de la arteria carótida y ocluyendo el flujo de
entrada de la arteria femoral y el flujo de salida de la vena
femoral hacia la bolsa de presión de la aurícula izquierda (LA). La
salida ventricular LV fue temporalmente dirigida hacia la vena
yugular. Se proporciona un catéter de punta de transductor 26. La
disminución dinámica en la presión de la aurícula izquierda (LA)
creó reducciones en la presión de LV y en el diámetro de
LV-AP creando bucles de
presión-diámetro para derivación de Ees. Los modelos
de flujos normales fueron restablecidos después de las mediciones de
las funciones. El valor de Ees fue calculado utilizando el software
Acquire para la recogida de datos (Bowman Cray School of Medicine,
Winston-Salem, NC) y el software de Spectrum para
análisis de datos (Bowman Gray School of Medicine,
Winston-Salem, NC).
El grado de captación de sustrato miocardial del
corazón del donante fue determinado a partir de muestras sanguíneas
simultáneamente recogidas de sangre venosa coronaria y arterial. El
flujo de sangre coronaria fue determinado midiendo el flujo de
salida venoso coronario desde la cánula de la arteria pulmonar con
un tubo de ensayo graduado y un cronómetro. Se determinaron
enzimáticamente los niveles de glucosa, lactato y piruvato (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO). Se determinaron ácidos grasos libres
mediante el kit de prueba Wako NEFA (Wako Chemicals USA, Dallas,
Texas). Se midió la presencia de oxígeno mediante análisis de gases
sanguíneos (Analizador de gases sanguíneos/pH modelo 1306 de
Instrumentation Laboratory y CO-oxímetro 482 de
Instrumentation Laboratory, Lesington, MA). Las diferencias
arterio-venosas de glucosa, lactato, piruvato,
ácidos grasos libres y oxígeno multiplicadas por el flujo sanguíneo
coronario corregido para peso húmedo del corazón proporcionó una
captación miocardial de estos sustratos.
Las muestras de tejidos miocardiales fueron
tomadas utilizando la herramienta portátil de Dremel montada en una
pipeta capilar de vidrio de 250 \mul, de punta recientemente rota,
con un diámetro aproximado de 2,8 mm. La pipeta fue enfriada en
N_{2} líquido antes de tomar las muestras de tejidos para fosfatos
de alta energía. Las muestras fueron almacenadas a una temperatura
de -80ºC hasta su procesamiento. Las muestras fueron secadas por
congelación (Lyph-Lock 18, Labconco, Kansas City,
MO) y preparadas para cromatografía HPLC. La presencia de ATP, ADP,
AMP, adenosina y CP fue determinada por cromatografía de base
inversa utilizando un Supelco Supercosil
LC-18-T; 250 x 4,6 mm; columna 5
\mum. Véase F.S. Anderson, et al, "Isocratic separation
of some purine nucleotide, nucleoside, and base metabolites from
biological extracts by high performance liquid chromatography",
J. Chromotology, 121; 251-262, 1976.
Se tomaron muestras de biopsia mediante la
extracción de un núcleo de 100-150 mg de la pared
libre anterior. El núcleo del tejido se obtuvo insertando una punta
de micropipeta de vidrio de 100 \mul o 250 \mul recientemente
rayada y rota en una fresa portátil de Dremel Tool. Esto creó una
herramienta de extracción de núcleo muy afilada, circularmente
impulsada para muestrear el tejido muscular del ventrículo izquierdo
para técnicas de microscopia electrónica (100 \mul) o morfológicas
(250 \mul). Una sutura en forma de bolsa de tabaco cerró el
agujero. Las muestras para microscopia electrónica fueron fijadas en
glutaraldehido al 3% en solución tampón de cacocilato 0,1 M a una
temperatura de 4ºC (pH 7,4). Las muestras para apoptosis,
degradación de lamina y fragmentación de PARP fueron inmediatamente
congeladas en N_{2} líquido y almacenadas a una temperatura de
-80ºC hasta su uso posterior.
Pequeñas muestras de tejidos fueron incorporadas
en Epon (resinas epoxídicas sintéticas) después de los
procedimientos de imbibición rutinarios. Se prepararon secciones
ultradelgadas, coloreadas con acetato de uranilo y citrato de plomo
y se sometieron a examen y fotografiaron en un microscopio
electrónico Philips CM 10. Después de una técnica de evaluación
semi-cuantitativa, las biopsias fueron evaluadas
para determinar el grado de lesión isquémica.
Para detectar las células apoptópicas se utilizó
el kit de detección de apoptosis in situ (Amersham) de
ApoTag. La visualización de las células apoptópicas fue realizado
utilizando un anticuerpo de anti-digoidgenina
conjugado con isotiocianato de fluorosceína (FITC) y se examinaron
secciones en un microscopio láser confocal (Leica). Una sección de
control negativo, para cada muestra de tejido, fue preparada e
incubada en la ausencia de la enzima TdT. Para un control positivo,
las secciones fueron digeridas con 1 \mug de solución tampón
Dnase-I/ml Dnase buffer (Sigma) durante 10
minutos.
Muestras de tejido con congelación profunda
(-80ºC) fueron montadas con TissueTEK® (compuesto de OCT) sobre un
bloque metálico. Secciones de 5 \mum de espesor fueron montadas
con un criostato CM 3000 (Leica), colocadas sobre portamuestras de
vidrio recubiertas de gelatina y secadas al aire seguidos por su
fijación en acetona durante 15 minutos a menos 20ºC. Las secciones
fueron enjuagadas en PBS e incubadas con anticuerpo B de
antilamina-ratón (Calbiochern, dilución 1:10).
Después de un enjuague repetido, las secciones fueron incubadas en
biotina-SP-conjugado-Afinipure
donkey antimouse IgG Packson ImmunoResearch Inc., dilución de 1:50).
Cy 2- estreptavidina (Rockland, dilución 1:100) fue seguida por la
coloración nuclear con yoduro de propidio o DAPPI (sondas
moleculares). Se montaron secciones con Mowiol (Hoechst A.G.).
Fueron deslizadas bajo cubierta y examinadas en un microscopio láser
confocal (Leica) o en un microscopio DM equipado para fluorescencia
(Leica). Se proporcionó documentación sobre la película profesional
de Kodak Ektachrome 100 HC para diapositivas de color. Todas las
reproducciones se realizaron a partir de diapositivas. El número de
núcleos apoptópicos en neocitos fue contado en el microscopio y
expresado como porcentaje del número total de miocitos (un total de
100.000 miocitos y un correspondiente número de células
intersticiales fueron examinados por muestra). De manera similar, se
contaron y calcularon núcleos de cardiomiocitos positivos para
lamina.
Se utilizó una solución de preservación que
contiene ciclosporina A para bloquear la apoptosis. La apoptosis es
bloqueada evitando la activación de las caspasas. En los grupos en
los que se administró solución de ciclosporina A, los animales
donantes fueron tratados con 10 mg/Kg mediante infusión lenta
durante 45 a 60 minutos de modo que no descendiera severamente la
tensión sanguínea arterial que fue demostrado que estaba en relación
con el vehículo de ciclosporina A, cremoforo. Después de que los
corazones de donantes fueron aislados, se sometieron a exposición a
ciclosporina A (10^{-5} ml/min) mediante perfusión lenta (1,0
ml/min). Después de la preservación los corazones fueron
heterotópicamente conectados al receptor y se inició una infusión
lenta de ciclosporina A en el receptor (2,5 mg/kg) a una velocidad
suficientemente lenta para que no se produjera la depresión de la
tensión sanguínea arterial del receptor. La tensión sanguínea
arterial deprimida fue una observación constante cuando se
administró ciclosporina A de forma intensiva en el modelo de
transplante de perro y se puede relacionar con su vehículo, el
cremoforo.
Se utilizó un periodo de preservación de
dieciocho horas para delinear la apariencia del fragmento de PARP,
lamina B, apoptosis y necrosis, puesto que se consideró que 12 horas
es el límite para la recuperación funcional completa de los
corazones almacenados. Después de la preservación, los corazones
fueron controlados durante 6 horas. Parámetros hemodinámicos para
función fueron tomados cada hora durante el periodo de recuperación
de 6 horas. Se tomaron muestras metabólicas e histológicas de
corazones de donantes antes de la preservación, después de la
preservación y a las 2 y 6 horas durante la recuperación. Había
cinco grupos experimentales: 1) el Grupo I era un grupo de control
con corazones de donantes extraídos e inmediatamente reanimados (sin
preservación) n = 10 experimentos, 2) el Grupo II era un grupo de
periodo de preservación de 18 horas con perfusión lenta en la
solución de UW (n = 12 experimentos), 3) el Grupo III era de un
periodo de preservación de 18 horas con perfusión lenta de solución
de UW con ciclosporina A (n = 8 experimentos), 4) el Grupo IV era de
un periodo de preservación de 24 horas con perfusión lenta de la
solución de UW (n = 5 experimentos) y 5) el Grupo V era de un
periodo de preservación de 24 horas con perfusión lenta de la
solución de UW con ciclosporina A (n = 5 experimentos).
Los datos fueron expresados como medias \pm
SEM de por lo menos tres experimentos independientes. Los ensayos
utilizados fueron el ensayo de la t de Student, ANOVA,
Kruskal-Wallis-test,
Friedman-test, así como las subsiguientes
comparaciones múltiples por Dunn,
Student-Newman-Keuls y Bonferroni.
Los valores de p<0,5 fueron considerados como significativos. En
todos los casos, n valores corresponde al número de animales.
Los resultados se ilustran en las Figuras 2 a 7.
La recuperación funcional para el periodo de preservación de 18 y 24
horas se ilustra en la Figura 2. Transcurridas 18 horas de
preservación sin ninguna administración de ciclosporina A, la
recuperación funcional fue aproximadamente del
55-60% después de 6 horas de reperfusión. Después
del tratamiento con ciclosporina A durante las 18 horas de
preservación, la función se restableció al 100% transcurridos 60
minutos y permaneció a este nivel a través de todo el periodo de
recuperación. No se produjo ninguna recuperación funcional después
de 24 horas de preservación sin ciclosporina A. Sin embargo, el
tratamiento con ciclosporina A, durante el periodo de preservación
de 24 horas, resultó en una recuperación funcional que no era
significativamente diferente con control a las 4, 5 y 6 horas
durante la reperfusión.
Según se ilustra en la Figura 3, los niveles de
ATP fueron significativamente reducidos durante la preservación con
y sin ciclosporina A y aumentó el rendimiento de reperfusión aunque
no a niveles significativos. Hubo un 66,2% de reducción en CP
(Figura 4) durante la preservación sin ciclosporina A y una
reducción del 80,0% con tratamiento. Durante la reperfusión, CP
volvió a los niveles de control. En la Figura 5, se ilustra
concomitante con las reducciones en ATP y CP, se produjo una
elevación notable de adenosina durante la preservación y volvió a
los niveles preaislamiento durante la reperfusión.
En la Figura 6 se ilustran los cambios en las
células apoptópicas (TUNEL). Después de 2 y 6 horas de reperfusión
sin ninguna administración de ciclosporina A, se produjo un
incremento del 2 y 6% en células apoptópicas. En la Figura 6B, se
ilustran los cambios en lamina B_{1}. La presencia de lamina
B_{1} disminuyó en 3 y 8% durante los mismos periodos de tiempo.
La apariencia morfológica de las células apoptópicas en la
micrografía adjunta se muestra en color verde. La lamina B_{1} se
ilustra de color verde en la micrografía de la parte inferior con
los núcleos rojos indicando una pérdida de lamina B_{1}. Como se
ilustra en la Figura 7A, el tratamiento con ciclosporina A impidió
la formación de apoptosis (TUNEL) en miocitos transcurridas 18
horas de preservación. La Figura 7B ilustra que la lamina B_{1}
permaneció sin variar.
En un modelo de transplante de corazón
heterotópico canino, un 50-60% de recuperación
funcional se produjo transcurridas 18 horas de PRES con solución de
la Universidad de Wisconsin (UW). Al mismo tiempo que los cambios
funcionales, se produjeron incrementos significativos en células
apoptópicas y caspasa 3 a las 2 y 6 horas de reperfusión con una
disminución concomitante en lamina B_{1} sin ninguna célula
necrótica. Las concentraciones de ATP y CP se redujeron durante la
preservación hipotérmica (PRES). la concentración de ATP aumentó
pero se mantuvo bajo control durante 6 horas de reperfusión mientras
CP volvió a niveles por encima del control. Estos resultados
indicaron que el bloqueo de la apoptosis puede prolongar la
viabilidad miocardial durante PRES y reperfusión.
Los corazones de donantes se sometieron a 18 y 24
horas de PRES (2-4ºC) con y sin una solución de
preservación conteniendo el tratamiento con ciclosporina A
(ennegrecedor de apoptosis). La solución de preservación fue
administrada al animal donante (10 mg / kg) en la solución PRES
(10^{-5}mol/l) objeto de infusión lenta durante el periodo de PRES
(1 ml / min) y al animal receptor (2,5 mg / kg). Después de 18 horas
de PRES con una solución conteniendo ciclosporina A, la función se
restableció al 100% transcurrida 1 hora y permaneció a este nivel a
través de un periodo de recuperación de 6 horas. No aparecieron
miocitos apoptópicos ni actividad de caspasa 3 después de 18 horas
de PRES con la solución de preservación conteniendo ciclosporina A
(CyS) y la lamina B permanece al 100% en los núcleos. Veinticuatro
horas de PRES en UW no resultó en ninguna recuperación funcional.
Sin embargo, después del tratamiento con CyS, la recuperación
funcional volvió al 100% transcurridas 4 horas de reperfusión. Las
concentraciones de ATP y CP fueron sorprendentemente las mismas con
o sin tratamiento de CyS a las 18 horas y más bajas transcurridas
24 horas, pero se restableció durante la reperfusión a 18 niveles
PRES. El mecanismo de acción puede asociarse con la transición de
permeabilidad mitocondrial (MPT) mediante aglutinación de
ciclofilina D.
La recuperación funcional del ventrículo
izquierdo (LV) fue evaluada con una preparación de trabajo. Aunque
los modelos no de trabajo recuperaron la actividad contráctil, fue
solamente después de que se sometieran a cargas de trabajo
fisiológicas cuando fue reconocido un déficit funcional. La
presencia de apoptosis en varias enfermedades cardiacas así como en
los estudios actuales indican importantes diferencias en el
comportamiento contráctil durante el daño miocardial apóptico frente
al mismo daño necrótico. Aunque la recuperación funcional después de
18 horas de preservación sin ciclosporina A, alcanzó una
"meseta", siguió aumentando el daño apoptópico (2% a 2 horas y
6% a 6 horas). Sin embargo, la apariencia escaladora del daño
apoptópico dentro de las células, puede indicar que se iniciaron las
señales apoptópicas con reacciones intermedias continuando hacia la
fragmentación de ADN que requiere la presencia de ATP.
Tradicionalmente, las técnicas de almacenamiento
para corazones utilizan tres procedimientos diferentes: 1)
almacenamiento estático, 2) perfusión baja y 3) alta perfusión. El
almacenamiento estático se realiza lavando por descarga el
aloinjerto cardiaco con la solución de preservación y colocándola en
una bolsa de almacenamiento sumergida en hielo durante todo el
periodo de preservación. Con la perfusión baja, la única diferencia
respecto al almacenamiento estático es que la solución de
preservación es objeto de perfusión lenta a través del corazón del
donante a flujos en el margen de 1-1,5 ml / minuto o
presiones de perfusión que se aproximan a 5 mmHg. El efluente de
arteria pulmonar es desechado y en los presentes experimentos fue de
aproximadamente 1100 ml. Las técnicas de alta perfusión difieren
significativamente pero implican mayores tiempos de almacenamiento
del corazón acompañados por mayor coste y complejidad técnica. En
los presentes experimentos, se utilizó la técnica de baja perfusión
para entregar la solución de preservación al corazón mantenida a una
temperatura aproximada de 4ºC. Esto proporcionó una eliminación
constante de productos finales metabólicos y exposición del corazón
a nutrientes, puesto que los corazones almacenados son muy
dependientes de la energía.
Las concentraciones de ATP y CP fueron
notablemente reducidas durante la preservación con ciclosporina A y
sin ella. Los niveles fueron más bajos después de 24 horas que a las
18 horas y en la reperfusión, los niveles de ATP fueron solamente de
55-60% de control después de 6 horas mientras que
los niveles de CP volvieron a su valor normal. Aunque a las
temperaturas de 2-4ºC, con un metabolismo lento de
casi un 90%, prosigue la función mitocondrial. Una recuperación
funcional más lenta transcurridas 24 horas de preservación con
ciclosporina A puede indicar que las medidas para aumentar los
niveles de ATP al mismo tiempo que el bloqueo de la apoptosis puede
proporcionar mayores niveles de protección miocardial.
La apoptosis fue encontrada como un importante
mediador celular para atenuar la recuperación funcional. Dieciocho
horas de preservación con solución UW produjeron solamente una
recuperación funcional del 50-60% con cantidades
significativas de células apoptópicas en el miocardio, sin la
presencia de ninguna célula necrótica. El bloqueo de la apoptosis
con ciclosporina A tuvo como resultado la prolongación de la
viabilidad a 18 y 24 horas y puede proporcionar un método
satisfactorio para extender la preservación del calor.
El posible mecanismo para la acción de la
ciclosporina A al proporcionar una protección adicional puede ser
objeto de mediación por el poro MTP. Bajo condiciones de esfuerzo
oxidativo y sobrecarga de Ca^{++} dentro de la mitocondria, se
abre el poro MTP, dando lugar a un desequilibrio de volumen respecto
a la hiperosmolaridad de la matriz mitocondrial. Esto causará, a la
larga, la ruptura de la membrana y la liberación de proteína
activadora de caspasa y el desacoplamiento de la fosforilación
oxidativa y la disrupción de la síntesis de ATP precipitando
apoptosis y necrosis, respectivamente. Los resultados soportan la
conservación de ATP, pero también indican que la ciclosporina A
puede ser más importante al evitar la apoptosis mediante los poros
MPT conservando así los miocitos y la integridad funcional. El
mecanismo de acción para la ciclosporina A en la estabilización de
poros MTP es mediante la aglutinación de ciclofilina D. Por lo
tanto, una función esencial para la formación de poros MPT y su
estabilización por ciclosporina A actúa para atenuar los procesos
celulares apoptópicos y necróticos y merece importante consideración
en la preservación de órganos.
Los resultados indican que el tratamiento con una
solución de preservación, conteniendo ciclosporina A durante la
preservación, es beneficioso al evitar la pérdida de ATP, inhibiendo
la apoptosis y la necrosis y extendiendo esta barrera de
preservación. En resumen, el uso de ciclosporina en una solución de
preservación prolonga la viabilidad miocardial durante la
preservación del corazón del donante.
Numerosas modificaciones y otras realizaciones de
la invención serán alcanzables por un experto en esta técnica para
el que pertenezca a esta invención teniendo el beneficio de las
enseñazas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos
asociados. Por lo tanto, ha de entenderse que la invención no está
limitada a las realizaciones específicas aquí reveladas y que
modificaciones y otras realizaciones están previstas para
incorporarse dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Aunque en la presente memoria se emplean términos específicos, los
mismos se utilizan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y
en ningún caso con fines limitativos.
Claims (9)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Solución para preservar y almacenar un corazón durante 24 horas mientras está a la espera de un trasplante, que comprende:- (a)
- una solución isotónica equilibrada en una cantidad fisiológicamente aceptable;
- (b)
- una ciclosporina presente en una cantidad comprendida entre 2,5 \muM y 10 \muM por litro de solución y
- (c)
- agua.
- 2. Solución según la reivindicación 1, en la que dicha solución isotónica equilibrada incluye iones de sodio, potasio, calcio y magnesio así como bicarbonato.
- 3. Solución según la reivindicación 1, en la que la ciclosporina está presente en una cantidad comprendida entre 5,0 \muM y 8,0 \muM por litro de solución.
- 4. Solución según la reivindicación 1, en la que dicha solución isotónica equilibrada comprende:
Márgenes de concentración en 1 litro NaCl 85 mM a 145 mM KCl 3 mM a 50 mM CaCl_{2} 0,5 mM a 2,5 mM KH_{2}PO_{4} 0,7 mM a 1,3 mM MgSO_{4} 0,9 mM a 4,8 mM NaHCO_{3} 15 mM a 35 mM Glucosa 1,0 mM a 50 mM y dicha ciclosporina está presente en una cantidad comprendida entre 2,5 \muM y 10 \muM por litro de solución. - 5. Procedimiento para la preservación y almacenamiento de un corazón a la espera de trasplante, que comprende:perfusión de dicho corazón hasta 24 horas con una solución que comprende:
- (a)
- una solución isotónica equilibrada en una cantidad fisiológicamente aceptable;
- (b)
- ciclosporina y
- (c)
- agua.
- 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha solución isotónica equilibrada incluye iones de sodio, potasio, calcio y magnesio así como bicarbonato.
- 7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la ciclosporina está presente en una cantidad comprendida entre 2,5 \muM y 10 \muM por litro de solución.
- 8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha ciclosporina está presente en una cantidad comprendida entre 5,0 \muM y 8,0 \muM por litro de solución.
- 9. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha solución isotónica equilibrada comprende:
Márgenes de concentración en 1 litro NaCl 85 mM a 145 mM KCl 3 mM a 50 mM CaCl_{2} 0,5 mM a 2,5 mM KH_{2}PO_{4} 0,7 mM a 1,3 mM MgSO_{4} 0,9 mM a 4,8 mM NaHCO_{3} 15 mM a 35 mM Glucosa 1,0 mM a 50 mM y dicha ciclosporina está presente en una cantidad comprendida entre 2,5 \muM y 10 \muM por litro de solución.
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