DE60208554T2

DE60208554T2 - Neue aliphatische verbindung, syntheseverfahren und anwendungsverfahren

Info

Publication number: DE60208554T2
Application number: DE60208554T
Authority: DE
Inventors: Centr Research Inst. T. Maruha Corporation Tsukuba-shi TAMAI; Central Research Inst. K. Maruha Corp. Tsukuba-shi YOSHIKAI; Central Reseach Inst. M. Maruha Corp. Tsukuba-shi NISHIKAWA; Kunio Sendai-shi OGASAWARA; Central Research Intitute I. Maruha Corp. Tsukuba-shi MUROTA
Original assignee: Maruha Corp
Current assignee: Maruha Corp
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2002-06-18
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: WO2002102770A1; DE60208554D1; EP1408030A1; ATE315024T1; CA2450856A1; US6949553B2; EP1408030B1; JP4303103B2; EP1408030A4; US20040162435A1; JPWO2002102770A1

Description

TECHNISCHES GEBIET:
Diese Erfindung betrifft neue aliphatische Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, und ihre Verwendung bei der Unterdrückung der Plättchenaggregation, der Unterdrückung von Entzündungen und der Vorbeugung und Behandlung von Kreislauferkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Wenn Plättchen im Blut in Kontakt mit subendothelialem Gewebe kommen, nachdem vaskuläre Endothelialzellen verletzt und abgelöst wurden, haften sie hieran an und verursachen eine Aggregationsreaktion. Diese Reaktion führt zur Thrombusbildung, was vaskuläre Störungen, einschliesslich Thrombose verursacht.
Bei der Vorbeugung und Behandlung solcher Krankheiten ist es daher wichtig, die Plättchenfunktionen zu verstehen und zu überlegen, wie die Plättchenaggregation unterdrückt werden könnte.
Im Zusammenhang mit den Anhaftungs- und Aggregationsfunktionen unter den Plättchenfunktionen wird derzeit die folgende Theorie aufgestellt: Wenn ein Stimulans, wie Kollagen, Arachidonsäure, ADP, Thrombin, Serotonin oder Epinephrin, die entsprechenden Rezeptoren auf der Plättchenmembran stimuliert, wird das Glycoproteinkonjugat GPIIb/IIIa dazu befähigt, an das Fibrinogen im Blut über das stimulusleitende System zu binden. Als Ergebnis werden die Plättchen zufällig vernetzt und aggregiert.
Über die Wirkungen der obigen Substanzen, die als Stimulanzien wirken, bleibt immer noch viel unbekannt. Jedoch wird spekuliert, dass Stimulanzien von verschiedenen Stimulanzien, die Kollagen beinhalten, Phospholipase A2 aktivieren, um Arachidonsäure aus Phospholipid herzustellen, und die verbleibende Arachidonsäure durch Cyclooxygenase (COX) zu Prostaglandinen (PG)G₂ und PGH₂ und weiter zu Thromboxan (TX)A₂ metabolisiert wird.
Auch sind die Wirkungen der obigen Stimulanzien unterschiedlich. Stimulanzien von den Stimulanzien neben Epinephrin und Kollagen an Plättchen verursachen den Einfluss von Ca-Ionen von ausserhalb der Zellen und mobilisieren Ca-Ionen aus Ca-Speicherkörnern, wodurch sie die intrazelluläre Ca-Ionenkonzentration erhöhen. Dies verursacht eine strukturelle Veränderung von GPIIb/IIIa und die Kontraktion von kontraktivem Protein, das die Plättchenaggregation und -freisetzungsreaktionen anregt. Mit Kollagen sind solche Reaktionen nicht beobachtet worden.
Angesichts der Wirkungsmechanismen solcher Plättchenfunktionen werden die derzeit entwickelten Wirkstoffe in solche, die auf die Stimulansrezeptoren wirken, solche, die auf das stimulansleitende System wirken (PG-Metabolismus-Systeminhibitoren, solche, die am cAMP-Metabolismus beteiligt sind) wirken, und solche, die auf GPIIb/IIIa wirken, klassifiziert.
GPIIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten inhibieren den Endpunkt der zuvor erwähnten Plättchenreaktion und inhibieren somit jegliche Plättchenreaktion, ungeachtet der Ursache der Plättchenreaktion. Andererseits ist die Wirkungskraft herkömmlicher GPIIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten so, dass ihre effektive Dosis bei der Einzeldosisbehandlung etwa 0,1 bis 1 mg/kg auf dem intravenösen Weg beträgt. Somit kann nicht gesagt werden, dass diese Wirkungskraft ausreichend hoch ist. Daher sind Anti-Plättchenwirkstoffe, die die Plättchenaggregation stark unterdrücken, erwünscht.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG:
Wir, die Erfinder, haben eine Tiefenstudie angesichts der obigen Tatsachen durchgeführt. Als Ergebnis haben wir neue Verbindungen entdeckt, die durch die nachstehend gezeigte Formel (I) dargestellt werden, oder deren Stereoisomere, und haben gefunden, dass diese Verbindungen (nachstehend als "Verbindungen der vorliegenden Erfindung" oder "erfindungsgemässe Verbindung", was ihre Stereoisomere beinhaltet, bezeichnet) eine viel stärkere Wirkung der Unterdrückung der Plättchenaggregation zeigen als herkömmliche GPIIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten, und dass sie weiterhin eine entzündungshemmende Wirkung aufweisen. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesem Befund, und ihre Aufgabe ist es, neue aliphatische Verbindungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Pharmazeutika, die diese umfassen, zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf aliphatische Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder Stereoisomere davon oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze:
worin:
A gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nH_(2n-2m)- darstellt, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 22 bezeichnet und m eine Unsättigungszahl darstellt, welche eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist,
l eine Zahl von 0 bis 10 darstellt,
s 0 oder 1 darstellt, vorausgesetzt dass, wenn s 0 ist, p + q = 4 oder 5 ist, aber wenn s 1 ist, p + q = 3 oder 4 ist, und in jedem Fall entweder p oder q eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist,
R eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann, und
R^A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann.
(In Bezug auf die Positionen der ungesättigten Bindungen von CH₃C_nH_(2n-2m)- in der Definition von A in Formel (I) wird die Position von "C" der Amidbindung NHCO als 1 festgesetzt, und die benachbarten Kohlenstoffe werden nacheinander mit 2, 3, 4 ... numeriert, um die Positionen zur Verwendung in den nachstehend angebotenen Erklärungen anzuzeigen.)
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1 ist ein Graph, der die Wirkung durch die erfindungsgemässe Verbindungen (Verbindungen (1) bis (9)) bei der dosisabhängigen in vitro-Unterdrückung der Plättchenaggregation als auch von Indomethacin zeigt.
2 ist ein Graph, der die zeitliche Veränderung der Wirkung durch die erfindungsgemässe Verbindung (Verbindung (2)) bei der Unterdrückung der Plättchenaggregation ex vivo zeigt.
3 ist ein Graph, der die Wirkung durch die erfindungsgemässe Verbindung (Verbindung (2)) bei der Unterdrückung der Plättchenaggregation ex vivo in Abhängigkeit von der Dosis zeigt.
4 ist ein Graph, der die Wirkung durch die erfindungsgemässe Verbindung (Verbindung (5)) bei der Unterdrückung der Plättchenaggregation ex vivo zeigt.
5 ist ein Graph, der die Wirkung durch die erfindungsgemässe Verbindung (Verbindung (2)), oral absorbiert, bei der Unterdrückung der Plättchenaggregation zeigt.
6 ist ein Graph, der zeigt, dass im Fall der Verabreichung der erfindungsgemässen Verbindung nach der Induktion der Beinnekrose die Nekrosezahl in Abhängigkeit von der Dosis in einem peripheren Kreislauf-Störungsmodell verbessert wird.
7 ist ein Graph, der zeigt, dass im Fall der Verabreichung der erfindungsgemässen Verbindung vor der Induktion der Beinnekrose die Nekrosezahl in Abhängigkeit von der Dosis in einem peripheren Kreislauf-Störungsmodell verbessert wird.
8 ist ein Graph, der zeigt, dass bei Verabreichung einer O/W-Emulsion der erfindungsgemässen Verbindung vor der Beinnekroseinduktion die Nekrosezahl in Abhängigkeit von der Dosis in einem peripheren Kreislauf-Störungsmodell verbessert wird.
9 ist ein Graph, der zeigt, dass die erfindungsgemässen Verbindungen (Verbindungen (1) und (2)) auf die Unterdrückung der Migration von Neutrophilen in vaskuläre Endothelialzellen wirken.
10 ist ein Graph, der zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung (Verbindung (2) Gehirninfarkt in einem Behinderungsmodell der mittleren cerebralen Arterie verbessert.
11 ist ein Graph, der zeigt, dass eine O/W-Emulsion der erfindungsgemässen Verbindung die vaskuläre Tunica intima-Verdickung in Abhängigkeit von der Dosis in einem post-PTCA-Restenosemodell unterdrückt.
12 ist ein Graph, der die Wirkung der erfindungsgemässen Verbindung (Verbindung (2)) bei der Unterdrückung der vaskulären glatten Muskelzellenproliferation in Abhängigkeit von der Dosis zeigt.
BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG:
Es werden die Definitionen in Formel (I) für die erfindungsgemässen Verbindungen beschrieben.
Konkrete Beispiele der "Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können", sind Alkylgruppen, wie eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine n-Butylgruppe, eine Isobutylgruppe, eine tert-Butylgruppe, eine sek-Butylgruppe, eine n-Pentylgruppe, eine tert-Amylgruppe, eine 3-Methylbutylgruppe, eine Neopentylgruppe, eine n-Hexylgruppe, eine n-Heptylgruppe, eine n-Outylgruppe, eine n-Nonylgruppe und eine n-Decylgruppe.
Der Ausdruck "gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nH_(2n-2m)-" bezieht sich auf CH₃C_nH_(2n-2m)-, das irgendeinen Substituenten aufweisen kann.
Beispiele des Substituenten beinhalten eine Hydroxylgruppe, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein kann, eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen und eine Arylgruppe.
Konkrete Beispiele der "Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen" beinhalten eine Cyclopropylgruppe, eine Cyclobutylgruppe, eine Cyclopentylgruppe, eine Cyclohexylgruppe und eine Cycloheptylgruppe.
Konkrete Beispiele der "Arylgruppe" beinhalten eine Phenylgruppe usw.
Konkrete Beispiele der "Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein kann", sind wie oben beschrieben.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden wie folgt angegeben:
Vorzugsweise sind p und q so, dass p = q = 2.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Verfügung, die Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel (II) sind (diese Verbindungen entsprechen den Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin s = 0 und p = q = 2 ist).
Allgemeine Formel (II):
worin R, R^A, A und l die gleichen Bedeutungen wie die Bedeutungen der Symbole in Formel (I) haben.
In der obigen allgemeinen Formel (II) ist die bevorzugteste Substitutionsposition von A-CONH-(CH₂)_l- an dem Kohlenstoff, der an N-R angrenzt.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Verfügung, die Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel (III) sind (diese Verbindungen entsprechen den Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin s = 1 und p = q = 2 ist):
Allgemeine Formel (III):
worin R, R^A, A und l die gleichen Bedeutungen wie die Bedeutungen der Symbole in Formel (I) haben.
In der obigen allgemeinen Formel (III) ist die bevorzugteste Substitutionsposition von A-CONH-(CH₂)_l- an dem Stickstoffatom des Piperazinrings.
In den erfindungsgemässen Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (III) sind die bevorzugten Ausführungsformen wie folgt:
R ist vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl oder Butyl, stärker bevorzugt Methyl oder Ethyl, und am stärksten bevorzugt eine Methylgruppe.
R^A ist vorzugsweise Wasserstoff, jedoch, wenn R^A eine Alkylgruppe ist, besitzt sie vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome, und stärker bevorzugt besitzt sie 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Die Substitutionsposition von R^A im Ring ist vorzugsweise eine Position, die nicht an N-R angrenzt.
l ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 0 bis 3.
n ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 6 bis 22, und stärker bevorzugt eine ganze Zahl von 14 bis 22.
m ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 7, und stärker bevorzugt eine ganze Zahl von 2 bis 6.
Bevorzugte Beispiele von A leiten sich aus Docosahexaensäure (n = 20, m = 6) oder Eicosapentaensäure (n = 18, m = 5) ab.
Im Zusammenhang mit den Positionen der ungesättigten Bindungen von CH₃C_nH_(2n-2m)- in der Definition von A sind sie vorzugsweise die Positionen 9, 12 und 15, falls n = 16 ist, die Positionen 5, 8, 11, 14 und 17, falls n = 18 ist, und die Positionen 4, 7, 10, 13, 16 und 19, falls n = 20 ist.
Der gegebenenfalls vorhandene Substituent von A ist vorzugsweise einer, der die Löslichkeit der Verbindungen der Formel (I) nicht beeinträchtigt. Falls der Substituent Alkyl ist, ist er bevorzugt eine Alkylgruppe mit niedrigem Molekulargewicht, z.B. eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder stärker bevorzugt eine Methylgruppe. Die bevorzugte Substitutionsposition ist an einer Position, die nicht nahe zu der Amidbindung ist. Zum Beispiel ist die Position die Position 3 bis 22, stärker bevorzugt die Position 3 bis 20.
Bevorzugte Beispiele von A, die den Substituenten aufweisen, falls sie Derivate mit dem Substituenten OH sind, beinhalten hydroxylierte Derivate von Docosahexaensäure (DHA) oder hydroxylierte Derivate von Eicosapentaensäure (EPA), und stärker bevorzugt hydroxylierte Derivate von Docosahexaensäure (DHA). Die sterische Konfiguration der hydroxylierten Derivate kann eine (R)-Konfiguration oder (S)-Konfiguration sein.
Beispiele der hydroxylierten Derivate von Docosahexaensäure (DHA) beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, 4-OH-DHA, 10-OH-DHA, 11-OH-DHA, 14-OH-DHA, 8-OH-DHA und 17-OH-DHA.
Beispiele der hydroxylierten Derivate von Eicosapentaensäure (EPA) beinhalten 12-OH-EPA, was jedoch nicht beschränkend ist. (Für die obigen hydroxylierten Derivate, siehe J. W. Karanian et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (1994) 270, 1105–1109.)
Als bevorzugte erfindungsgemässe Verbindungen werden die folgenden Verbindungen, ihre optischen Isomere oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze angeführt:
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]docosahexaenamid;
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(4-Methylpiperazin-1-yl)docosahexaenamid;
N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]caprylamid;
N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]myristamid;
9Z-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]oleamid;
(9Z,12Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]linolamid;
(9Z,12Z,15Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]linolenamid;
(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]eicosapentaenamid;
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)methyl]docosahexaenamid; und
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[3-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)propyl]docosahexaenamid.
Weitere bevorzugte Verbindungen der erfindungsgemässen Verbindungen sind wie folgt:
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(4-Methylpiperazin-1-yl)docosahexaenamid der Formel (IV), deren optische Isomere oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze:
und (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]docosahexaenamid der Formel (V), deren optische Isomere oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze:
Die erfindungsgemässen Stereoisomere betreffen solche, die irgendeine optische Isomerie unter (R)-Formen, (S)-Formen und racemischen Modifikationen, und geometrische Isomerie unter cis-Form, trans-Form und einer Mischung hiervon aufweisen. Als geometrische Isomerie ist die cis-Form bevorzugt.
Die pharmazeutisch akzeptablen Salze in der vorliegenden Erfindung beinhalten Salze mit Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure und Phosphorsäure, und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Milchsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Von diesen Salzen sind die Salze, wie Hydrochlorid, Citrat und Maleat, bevorzugt.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können die Plättchenaggregation selektiv unterdrücken, insbesondere die Plättchenaggregation, die durch Kollagen verursacht wird. Wie durch die später beschriebenen Ergebnisse der Experimente gezeigt wird, weisen die erfindungsgemässen Verbindungen eine unterdrückende Wirkung auf die ex vivo- Plättchenaggregation auf, die stärker ist als die herkömmlicher GPIIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können auch die Entzündung unterdrücken, die durch entzündende Cytokine, wie TNFα und PDGF verursacht wird.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können bei der Vorbeugung oder Behandlung von Kreislauferkrankungen verwendet werden.
Die Kreislauferkrankungen beziehen sich hier auf Krankheiten, in denen der zirkuläre Status des Bluts und der Lymphe verschlechtert wird, was Schäden an Gewebe oder Zellen verursacht. Diese Krankheiten beinhalten all diejenigen, die aus verschiedenen Ursachen, wie Plättchenaggregation und entzündender Cytokine, wie TNFα und PDGF, auftreten. Ihre Beispiele beinhalten thrombotische Erkrankungen, Arterioskleroseerkrankungen und hyperlipämische Erkrankungen.
Die thrombotischen Erkrankungen beziehen sich hier auf Zustände, bei denen ein Blutgefäss durch einen Thrombus verstopft wird, und sie werden in arterielle Thrombose und venöse Thrombose klassifiziert. Arterielle Thrombose tritt hauptsächlich als Komplikation der Arteriosklerose auf. Ein Thrombus der koronaren Arterie wird zur Ursache für Herzinfarkt, und ein Thrombus der cerebralen Arterie wird zur Ursache von Gehirninfarkt. Venöse Thrombose beinhaltet eine Thrombose der oberflächlichen Vene oder der tiefen Vene, und als Beispiel wird tiefvenöse Thrombose aufgeführt.
Die thrombotischen Erkrankungen beinhalten z.B. instabile Angina, Herzinfarkt, Infarkt, der mit einer prothetischen Klappe assoziiert ist, Verstopfung eines transplantierten Blutgefässes nach einer By-pass-Operation der Koronararterie, transiente, cerebrale, ischämische Attacke, Gehirninfarkt, arteriosklerotische Verstopfung der peripheralen Arterie, Erythromelalgia (Thrombocytemia), Thrombus eines Hämodialyseshunts, Angina der Anstrengung, Restenose nach PTCA und Verstopfung nach einer Blutgefäss-wiederherstellenden Operation ("Treatment of Thrombosis", veröffentlicht von Medical Review, 1. Auflage, 20. Juni 1996, Autor: Yasuo Ikeda).
Die arteriosklerotischen Erkrankungen beziehen sich hier auf Zustände, in denen sich die arterielle Wand verdickt und ihre Elastizität verliert. Arteriosklerose tritt in drei Typen auf: Arteriosklerose, Mönckeberg's Arteriosklerose und Arteriolosklerose. Beispiele der arteriosklerotischen Erkrankungen beinhalten Gehirninfarkt und cerebrale Hämorrhagie der cerebralen Arterie, ischämische Herzerkrankungen, wie Herzinfarkt und Angina pectoris der Koronararterie, aortisches Aneurysma und aortische Zergliederung der Aorta, Nephrosklerose und assoziiertes Nierenversagen für die renale Arterie, und verstopfende Arterosklerose der peripheralen Arterie.
Die hyperlipämischen Erkrankungen beziehen sich hier auf pathologische Zustände, in denen Serumcholesterin und/oder die Triglyceridlevel erhöht sind. Beispiele sind Hypercholesterinämie und Hyperlipidämie.
Jede der erfindungsgemässen Verbindungen kann oral oder parenteral verabreicht werden (als Injektion, äussere Zubereitung, Suppositorium usw.). Ihre Dosis beträgt vorzugsweise 0,000001 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag, welche als Einzeldosis oder in verschiedenen geteilten Dosen verabreicht wird. Stärker bevorzugt werden 0,0001 bis 10 mg/kg Körpergewicht/Tag als Einzeldosis oder in verschiedenen Dosen pro Tag verabreicht. Diese Dosis kann in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung oder dem Alter, dem Körpergewicht und den Symptomen des Patienten erhöht oder verringert werden.
Um die erfindungsgemässen Verbindungen als Pharmazeutika zu verwenden, kann irgendeine Form, einschliesslich einer festen Zusammensetzung, einer flüssigen Zusammensetzung und einer anderen Zusammensetzung, gewählt werden, und die optimale Form wird entsprechend den Erfordernissen ausgewählt. Pharmazeutische Zusammensetzungen können durch Zugabe herkömmlicher Vehikel, Füllmittel, Bindemittel, Zerfallsförderer, pH-Wert-Einstellmittel und Löslichkeitsmacher zu den erfindungsgemässen Verbindungen und Formen der Mischungen zu Tabletten, Pillen, Kapseln, Körnern, Pulvern, Flüssigkeiten, Emulsionen, Suspensionen und Injektionen durch herkömmliche pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Beispiele der Vehikel und Füllmittel sind Lactose, Magnesiumstearat, Stärke, Talk, Gelatine, Agar, Pectin, Gummi arabicum, Olivenöl, Sesamöl, Kakaobutter, Ethylenglykol und andere, die gewöhnlich verwendet werden.
Um die Oxidation der Zubereitungen zu vermeiden, ist es erlaubt, ein Antioxidans (Tocopherol oder dergleichen) zuzugeben, einen Einschluss mit einem Einschluss-Komplexbildner, wie Cyclodextrin, oder eine Einkapselung mit einem Film aus Gelatine durchzuführen.
Darüber hinaus können die obigen Verbindungen in Form von Emulsionen vom O/W-Typ unter Verwendung von Phospholipiden oder nicht-ionischen Tensiden als Emulgatoren hergestellt werden, wie es in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 1994-298642 beschrieben ist.
Die Emulgatoren können allein oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden, und ihre Zugabemenge kann, wie gewünscht, 0,001 bis 10% (G/V), vorzugsweise 0,01 bis 5% (G/V) betragen.
Als Phospholipide können aus Sojabohnen gewonnene Phospholipide, aus Eigelb gewonnene Phospholipide, Lysolecithin, Phosphatidylcholin (Lecithin) und Phosphatidylserin allein oder in Kombination verwendet werden. Als nicht-ionische Tenside können vorzugsweise die folgenden allein oder in Kombination, jedoch ohne Beschränkung, verwendet werden: Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere mit einem Molekulargewicht von 500 bis 15.000 (z.B. Pluronic F-68), Polyalkylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1.000 bis 10.000, Polyoxyalkylen-Copolymere mit einem Molekulargewicht von 1.000 bis 20.000, hydrierte Castoröl-Polyoxyalkylen-Derivate, Castoröl-Polyoxyalkylen-Derivate, Glycerinester von Fettsäuren, Polyglycerinester von Fettsäuren, Sorbitanester von Fettsäuren, Polyoxyethylen-Castoröl, hydriertes Castoröl, Polyoxyethylenalkylether und Saccharose-Fettsäureester.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können auf die folgende Weise hergestellt werden:
Diese Verbindungen können durch ein Amidierungsverfahren unter Verwendung von Aminen der Formel (VI) als Ausgangsmaterial hergestellt werden:
worin:
l eine ganze Zahl von 0 bis 10 darstellt,
s 0 oder 1 darstellt, vorausgesetzt dass, wenn s gleich 0 ist, p + q = 4 oder 5, jedoch wenn s 1 ist, p + q = 3 oder 4, und in jedem Fall ist entweder p oder q eine ganze zahl von 1 oder mehr,
R eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann, und
R^A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann,
und
Verbindungen der Formel (VIII): A-CO₂-R', worin R' Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, und A stellt gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nCH_(2n-2m)- dar, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 22 bezeichnet, und m stellt eine Unsättigungszahl dar, die eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist.
Die Amine der Formel (VI) können als Ausgangsmaterial auf herkömmliche Weise synthetisiert werden.
Die Carbonsäuren oder Carbonsäureester der Formel (VIII) können als Ausgangsmaterial auf herkömmliche Weise synthetisiert werden. Die Ester können durch eine herkömmliche esterbildende Reaktion aus den entsprechenden Carbonsäuren oder deren Salzen hergestellt werden. Die entsprechenden Carbonsäuren oder deren Salze können synthetische Substanzen oder natürlich auftretende Substanzen sein. Die synthetischen Substanzen sind bezüglich der Wirtschaftlichkeit vorteilhaft, jedoch sind die natürlich auftretenden Substanzen wegen geringerer Giftigkeit bevorzugt. Als natürlich auftretende Substanzen können solche, die z.B. aus Fisch usw. abgetrennt und gereinigt werden, eingeschlossen sein.
Die Carbonsäuren und Carbonsäureester der Formel (VIII), die Substituenten besitzen, können natürlich auftretende Produkte oder synthetische Produkte sein.
Das Verfahren zum Einführen des Substituenten während der Synthese kann ein Verfahren sein, das gewöhnlich von einem Durchschnittsfachmann eingesetzt wird, z.B. das Verfahren zum Einführen des Substituenten in die Carbonsäure oder den Ester der Formel (VIII) durch eine Substitutions- oder Additionsreaktion.
Falls der Substituent eine Alkylgruppe ist, kann die Alkylgruppe durch Verwendung eines Alkylierungsmittels in CH₃C_nCH_(2n-2m)- eingeführt werden.
Falls der Substituent eine OH-Gruppe ist, können die interessierenden Verbindungen durch Hydroxylieren von natürlich auftretendem DHA und Fraktionieren des hydroxylierten DHA durch HPLC synthetisiert werden. Zum Beispiel können die Verbindungen durch Zugabe von 10 bis 200 mM DHA als Substrat zu einer Suspension von Branchialzellen oder Epithelialzellen der Regenbogenforelle, Säugetierplättchen oder aus menschlichen Zellen gewonnenen, etablierten Zellinien, wie RBL-1, und Reagieren der Mischung bei 10 bis 37°C für 1 bis 50 Minuten erhalten werden. Die Reaktionslösung wird angesäuert (mit Ameisensäure, Essigsäure oder Trichloressigsäure), um die Reaktion zu beenden. Dann wird das entsprechende OH-Derivat mit einem organischen Lösungsmittel (Chloroform, Methanol, Ethylacetat, Acetonitril usw.) extrahiert und durch ein Verfahren, wie HPLC oder Dünnschichtchromatografie, unter Verwendung eines Entwicklungslösungsmittels (Chloroform, Methanol, Ethylacetat, Acetonitril, Wasser oder Trifluoressigsäure) fraktioniert. Jedoch sind diese Verfahren nicht beschränkend. Die entsprechenden OH-Derivate können auch durch selektive Syntheseverfahren unter Verwendung ortsspezifischer Enzyme hergestellt werden. Die Derivate, wie 4-OH-DHA, 10-OH-DHA, 11-OH-DHA, 14-OH-DHA, 8-OH-DHA und 17-OH-DHA (S-Formen hiervon) sind von Wako Pure Chemical Industries kommerziell erhältlich.
Beim Erhalt der Ausgangsmaterialien durch Synthese können die Amine der Formel (VI) oder die Carbonsäuren oder Ester der Formel (VIII) isoliert sein oder sie können aufgelöst in Lösungsmittel verwendet werden.
Das Amidierungsverfahren ist nicht beschränkt, jedoch kann die Zielverbindung im allgemeinen durch das gemischte Säureanhydridverfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können hier die folgenden Verfahren genannt werden.
(1) Weinreb-Verfahren:
Die erfindungsgemässe Verbindung kann durch Reaktion des Esters der Formel (VIII) mit dem Reaktionsprodukt, das aus dem Amin der Formel (VI) und einem Trialkylaluminium, insbesondere (CH₃)₃Al, gebildet wird, hergestellt werden. Diese Reaktion wird unter Verwendung des folgenden Schemas detailliert erklärt (bequemlichkeitshalber zeigt das Schema die Ester der Formel (VIII) als nicht durch einen Substituenten substituiert):
Die Reaktion zur Bildung der Verbindung (VII) im obigen ersten Schritt wird durch Umsetzen des Amins der Formel (VI) (vorzugsweise ein Säureadditionssalz, wie ein Hydrochlorid) mit (CH₃)₃Al durchgeführt. Diese Reaktion wird vorzugsweise unter Kühlen in einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel (z.B. Toluol, Xylol oder Benzol) durchgeführt.
Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Menge an (CH₃)₃Al vorzugsweise 0,5 bis 5,0 Äquivalente pro Äquivalent der Verbindung (VI).
Der obige zweite Schritt wird durch Reaktion der Verbindung (VII), die im ersten Schritt erhalten wird, mit dem Ester der Formel (VIII) durchgeführt. Diese Reaktion wird vorzugsweise unter Erwärmen in einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel (z.B. Toluol, Xylol oder Benzol) durchgeführt. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise 40 bis 70°C. Vorzugsweise übersteigt die Reaktionstemperatur etwa 70°C nicht, weil ein überschreiten dieser Temperatur das Produkt zersetzbar machen würde. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise 1 bis 5 Stunden.
Zu diesem Zeitpunkt ist die Menge des Esters der Formel (VIII) vorzugsweise 0,5 bis 5,0 Äquivalente pro Äquivalent der Verbindung (VII).
(2) Verfahren unter Verwendung von (COCl)₂:
Die erfindungsgemässe Verbindung kann auch durch Reaktion des Amins der Formel (VI):
worin p, q, s, l, R und R^A wie oben definiert sind, mit einem Säurechlorid, das durch die Reaktion zwischen der Carbonsäure der Formel (VIII): A-CO-OH [worin A gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nCH_(2n-2m)- darstellt (worin n eine ganze Zahl von 4 bis 22 bezeichnet, und m stellt eine Unsättigungszahl dar, die eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist)] und (COCl)₂ gebildet wird, erhalten werden.
Der obige erste Schritt – die Reaktion zur Bildung des Säurechlorids durch die Reaktion zwischen der Carbonsäure der Formel (VIII) und (COCl)₂ – wird vorzugsweise unter Kühlen in einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel (z.B. Toluol, Xylol oder Benzol) durchgeführt.
Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Menge an (COCl)₂ vorzugsweise 1 bis 5 Äquivalente pro Äquivalent der Carbonsäure der Formel (VIII): A-CO-OH.
Der obige zweite Schritt – die Reaktion zwischen dem Säurechlorid, das im ersten Schritt erhalten wird, und dem Amin der Formel (VI) – wird vorzugsweise in einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel (z.B. Dichlormethan oder Chloroform) oder einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel (z.B. Toluol, Xylol oder Benzol) durchgeführt. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise –5 bis +5°C. Vorzugsweise überschreitet die Reaktionstemperatur etwa +5°C nicht, weil ein Überschreiten dieser Temperatur das Produkt zersetzbar machen würde. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise 0,5 bis 5 Stunden.
Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Menge des Amins der Formel (VI) vorzugsweise 1 bis 5 Äquivalente pro Äquivalent des Säurechlorids.
Unabhängig davon, welches Herstellungsverfahren eingesetzt wird, kann die erfindungsgemässe Verbindung, falls gewünscht, nach Vollendung der Reaktion auf herkömmliche Weise isoliert und gereinigt werden (z.B. Filtration, Lösungsmittelextraktion, Umkristallisation, Wiederausfällen oder Chromatografie). Das Stereoisomer kann durch Auswahl geeigneter Ausgangsmaterialien erhalten werden. Im Fall einer Stereoisomerenmischung können stereochemisch reine Isomere durch Chromatografie oder Racemattrennung erhalten werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen und Testbeispielen detailliert beschrieben.
BEISPIEL 1
Synthese von (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(4-Methylpiperazin-1-yl)docosahexaenamid (Verbindung (1)):
Toluol (15 ml), das unter Verwendung des Molekularsiebs MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 10,3 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 1,69 ml (14,1 mmol) 1-Amino-4-methylpiperazin tropfenweise über etwa 2 Minuten zugegeben (innere Temperatur < 7°C). Das 1-Amino-4-methylpiperazin wurde letztendlich unter Verwendung von 2 ml Toluol gewaschen. Nach 35-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht und 6 ml einer Toluollösung von 5,0 g (14,0 mmol) Docosahexaensäureethyleter (nachfolgend als DHA-Ethylester bezeichnet) wurden tropfenweise über 6 Minuten zugegeben (innere Temperatur 25~26°C). Nach 2-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 24 ml 0,67 N-Salzsäure wurden tropfenweise zugegeben (die innere Temperatur stieg bis auf 39°C). Die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, und Wasser und Ethylacetat wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung durch Celite filtriert, das Filtrat wurde in die entsprechenden Phasen getrennt und die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 32°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten. Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃ → AcOEt → CHCl₃:MeOH (4:1)), und dann zur Reinigung einer weiteren Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (19:1)) unterworfen. Die NMR bestätigte, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt (Ausbeute: 5,4 g, Reinheit: 95%):
BEISPIEL 2
Synthese von (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)docosahexaenamid (Verbindung (2)):
Toluol (15 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 10,3 ml einer n-Hexanlösung mit 15 Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 2,03 ml (14,1 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 2 Minuten zugegeben (innere Temperatur –7→+8°C). Das 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin wurde letztendlich unter Verwendung von 2 ml Toluol gewaschen. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 6 ml einer Toluollösung von 5,0 g (14,0 mmol) DHA-Ethylester wurden tropfenweise über 2 Minuten zugegeben (innere Temperatur 28~29°C). Nach 2-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 24 ml 0,67 N-Salzsäure wurden tropfenweise zugegeben (innere Temperatur 12~27°C). Die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, und Wasser und Ethylacetat wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung durch Celite filtriert, das Filtrat wurde in die entsprechenden Phasen unter Zugabe einer geringen Menge NaOH getrennt, und die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 32°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten (Ausbeute: 4,7 g). Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (19:1 → 9:1)) zur Reinigung unterworfen. Die NMR bestätigte, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
BEISPIEL 3
Synthese von N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]caprylamid (Verbindung (3)):
Toluol (1,0 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 1,48 ml einer n-Hexanlösung mit 15 Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 0,25 ml (1,16 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 2 Minuten zugegeben. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 0,5 ml einer Toluollösung von 0,2 g (1,16 mmol) Caprylsäureethylester wurden tropfenweise über 1 Minute zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 10 ml 1 N-NaOH wurden tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, und Wasser und Ethylacetat wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung in die entsprechenden Phasen getrennt, und die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 30°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten (Ausbeute: 0,22 g). Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (19:1 → 9:1)) zur Reinigung unterworfen. Die NMR und das Massenspektrum bestätigten, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
Molekulargewicht: 254,41
BEISPIEL 4
Synthese von N-(2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]myristamid (Verbindung (4)):
Toluol (1,00 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 1,00 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 0,17 ml (0,78 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 2 Minuten zugegeben. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 0,5 ml einer Toluollösung von 0,2 g (0,78 mmol) Myristinsäureethylester wurden tropfenweise über 1 Minute zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und eine 1 N-NaOH-Lösung wurde tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, und Wasser und Ethylacetat wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung in die entsprechenden Phasen getrennt, und die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 30°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten (Ausbeute: 0,25 g). Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (19:1 → 9:1)) zur Reinigung unterworfen. Die NMR und das Massenspektrum bestätigten, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
Molekulargewicht: 338,566
BEISPIEL 5
Synthese von 9Z-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]oleamid (Verbindung (5)):
Toluol (18 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 12,3 ml einer n-Hexanlösung mit 15 Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 2,42 ml (16,7 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 5 Minuten zugegeben. Das 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin wurde letztendlich unter Verwendung von 2 ml Toluol gewaschen. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 7 ml einer Toluollösung von 5,0 g (16,9 mmol) Ölsäuremethylester wurden tropfenweise über 2 Minuten zugegeben. Nach 2,5-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 30 ml 0,67 N-Salzsäure wurden tropfenweise zugegeben. Eine wässrige 1 N-NaOH-Lösung (etwa 100 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde mit etwa 100 ml Ethylacetat extrahiert. Zu diesem Zeitpunkt betrug der pH-Wert der wässrigen Phase 9 bis 10. Die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 32°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten. Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (BW·80S 150 g, Fujisilysia, Laufmittel: CHCl₃:MeOH (9:1 → 4:1 → 3:1 (V/V)) zur Reinigung unterworfen. Die gereinigte Verbindung wurde unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 35°C konzentriert, um 4,09 g einer blassgelben Flüssigkeit zu erhalten (10,4 mmol, Ausbeute: 62%). Die NMR bestätigte, dass das Produkt die folgende Struktur besitzt:
BEISPIEL 6
Synthese von (9Z,12Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]linolamid (Verbindung (6)):
Toluol (0,7 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 0,83 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 0,14 ml (0,98 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 2 Minuten zugegeben. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 0,4 ml einer Toluollösung von 0,2 g (0,65 mmol) Linolsäureethylester wurden tropfenweise über 1 Minute zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 10 ml einer 1 N-NaOH-Lösung wurden tropfenweise zugegeben (innere Temperatur 12~27°C). Die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, und Wasser und Ethylacetat wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung in die entsprechenden Phasen getrennt, und die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 30°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten (Ausbeute: 0,114 g). Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (19:1 → 9:1)) zur Reinigung unterworfen. Die NMR und das Massenspektrum bestätigten, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
Molekulargewicht: 390,638
BEISPIEL 7
Synthese von (9Z,12Z,15Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]linolenamid (Verbindung (7))
Toluol (0,6 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 1,99 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 0,23 ml (1,56 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 1 Minute zugegeben. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 0,2 ml einer Toluollösung von 0,2 g (0,65 mmol) Linolsäureethylester wurden tropfenweise über 1 Minute zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 10 ml einer 1 N-NaOH-Lösung wurden tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, und Wasser und Ethylacetat wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung in die entsprechenden Phasen getrennt, und die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfrei Magnesiumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 30°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten (Ausbeute: 0,13 g). Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (19:1 → 9:1)) zur Reinigung unterworfen. Die NMR und das Massenspektrum bestätigten, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
Molekulargewicht: 338,622
BEISPIEL 8
Synthese von (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]eicosapentaenamids
Toluol (18 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 12,3 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 2,42 ml (16,7 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 5 Minuten zugegeben. Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht, und 7 ml einer Toluollösung von 4,5 g (13,6 mmol) Eicosapentaensäureethylester wurden tropfenweise über 2 Minuten zugegeben. Nach 2,5-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 30 ml 0,67 N-Salzsäure wurden tropfenweise zugegeben. Eine wässrige 1 N-NaOH-Lösung (etwa 100 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde mit etwa 100 ml Ethylacetat extrahiert. Zu diesem Zeitpunkt betrug der pH-Wert der wässrigen Phase 9 bis 10. Die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem diese Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde sie unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 32°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten. Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (BW·80S 150 g, Fujisilysia, Laufmittel: CHCl₃:MeOH (9:1 → 4:1 → 3:1 (V/V)) zur Reinigung unterworfen. Die gereinigte Verbindung wurde unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 35°C konzentriert, um 3,2 g einer blassgelben Flüssigkeit (Ausbeute: 57%) zu erhalten Die NMR bestätigte, dass dieses Produkt die folgende Struktur besitzt:
BEISPIEL 9
Synthese von (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[(1-Methylpyrrolidin-2-yl)methyl]docosahexaenamid:
Toluol (5 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 3,2 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me3Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurde eine Toluollösung (2 ml) mit 0,6 g 2-Aminomethyl-1-methylpyrrolidin tropfenweise über etwa 2 Minuten zugegeben (innere Temperatur –10→+0°C). Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf 12°C erhöht, und 2 ml einer Toluollösung von 1,56 g (4,38 mmol) DHA-Ethylester wurden tropfenweise über 2 Minuten zugegeben (innere Temperatur 10~13°C). Nach 2,5-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 7,5 ml 0,67 N-Salzsäure wurden tropfenweise zugegeben. Nachdem 35 ml 1 N NaOH zugegeben worden waren, wurde die Mischung zweimal mit Ethylacetat extrahiert, gefolgt von zweimaligem Waschen des Extrakts mit 20 ml Wasser und 20 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung. Das gewaschene Produkt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 40°C konzentriert, um die Titelverbindung zu erhalten. Diese Verbindung wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (50:1 → 9:1)) zur Reinigung unterworfen (1,4 g, 3,3 mmol, Ausbeute: 75%). Die NMR bestätigte, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
BEISPIEL 10
Synthese von (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[2-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]docosahexaenamid (Verbindung (10)):
Rohe Docosahexaensäure (DHA) (2,1 g) und 10 ml Toluol wurden gemischt. Während die Mischung mit Eis gekühlt wurde, wurden 0,93 ml (10,6 mmol) (COCl)2 zugegeben, und die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck auf einem Wasserbad von 40°C konzentriert und wurde nach Zugabe von Toluol wiederum unter reduziertem Druck konzentriert, um ein rohes DHA-Säurechlorid als gelbe Flüssigkeit zu erhalten. Nachdem 3 ml (21 mmol) 2-(2-Aminoethyl)-1-methylpyrrolidin mit 20 ml CH₂Cl₂ kombiniert worden waren, wurde die Gesamtmenge des rohen DHA-Säurechlorids unter Eiskühlung zugegeben. Die Mischung wurde für 1 Stunde gerührt, wobei sie mit Eis gekühlt wurde, und 30 ml CH₂Cl₂ und 50 ml Eiswasser wurden zugegeben. Die organische Phase wurde unter Verwendung eines Schütteltrichters abgetrennt, mit 130 ml 1 M HCl gewaschen und zweimal mit Wasser gewaschen. Die gewaschene Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und einer Silicagel-Säulenchromatografie (50 g Silica, Laufmittel: n-Hexan:Ethylacetat (9:1 → 3:1)) zur Reinigung unterworfen, um hierdurch 1,9 g (Ausbeute: 73%) einer hellgelben Flüssigkeit zu erhalten. Die NMR bestätigte, dass das gereinigte Produkt das gleiche wie in Beispiel 2 ist.
BEISPIEL 11
Synthese von (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[3-(1-Methylpyrrolidin-2-yl)propyl]docosahexaenamid (Verbindung (11)):
Toluol (1,34 ml), das unter Verwendung von MS 4A getrocknet worden war, wurde mit 0,86 ml einer n-Hexanlösung mit 15% Me₃Al gemischt. Während die Mischung in einem Eis-Methanol-Bad gekühlt wurde, wurden 0,167 g 2-(3-Aminopropyl)-1-methylpyrrolidin in 0,6 ml Toluol tropfenweise über etwa 1 Minute zugegeben (innere Temperatur –15°C). Nach 20-minütigem Rühren wurde die Temperatur auf 20°C erhöht, und 0,6 ml einer Toluollösung von 0,42 g (1,2 mmol) DHA-Ethylester wurden tropfenweise zugegeben (innere Temperatur 20°C). Nach 3-stündigem Rühren bei 70°C wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 2,1 ml 0,67 N-Salzsäure wurden tropfenweise zugegeben. Nachdem 10 ml einer wässrigen 1 N-NaOH-Lösung zugegeben worden waren, wurde die Mischung mit Ethylacetat extrahiert, gefolgt von Waschen des Extrakts mit Wasser und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung. Das gewaschene Produkt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatografie (Laufmittel: CHCl₃:MeOH (50:1 → 9:1 → 4:1)) gereinigt, um hierdurch 0,21 g der Titelverbindung zu erhalten (Ausbeutemenge: 0,46 mmol, Ausbeute: 39%, Reinheit: 97,9%). Die NMR bestätigte, dass die gereinigte Verbindung die folgende Struktur besitzt:
BEISPIEL 12
Synthese von N-[2-((2S)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl] (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenamid (2S-Form der Verbindung (2))
(1) (5S)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]pyrrolidin-2-on:
Imidazol (4,09 g, 60 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (100 mg, 0,82 mmol) wurden zu einer CH₂Cl₂ (85 ml)-Lösung von (5S)-5-(hydroxymethyl)-2-pyrrolidinon (3,14 g, 27,3 mmol) zugegeben. Dann wurde, während die Mischung mit Eis gekühlt wurde, eine CH₂Cl₂ (15 ml)-Lösung von tert-Butyldimethylsilylchlorid (4,53 g, 30 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 300 g, MeOH-CHCl₃ 5:95 V/V) unterworfen, um (5S)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]pyrrolidin-2-on (6,22 g, 99,5%) zu erhalten.
[α]_D ²⁷ +42,32 (c 1,136, CHCl₃)
IR ν_max (Film) cm^–1: 3342, 1697
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 5,89 (1H, br), 3,80–3,71 (1H, m), 3,63 (1H, dd, J = 9,9, 3,8 Hz), 3,44 (1H, dd, J = 9,9, 7,7 Hz), 2,44–2,26 (2H, m), 2,24–2,11 (1H, m), 1,80–1,67 (1H, m), 0,89 (9H, s), 0,06 (6H, s)
MS m/z: 230 (M⁺ + 1), 214 (M⁺ – 15), 172 (100%)
HRMS berechnet für C₁₀H₂₀NO₂Si: 214,1263 (M⁺ – 15)
gefunden: 214,1240 (M⁺ – 15)
(2) (5S)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]-1-methylpyrrolidin-2-on:
Eine THF (10 ml)-Lösung von (5S)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]pyrrolidin-2-on (3,71 g, 16,2 mmol) wurde tropfenweise zu einer THF (70) ml)-Suspension von NaH (60%-ige Öldispersion, 778 mg, 19,4 mmol) zugegeben, wobei das System mit Eis gekühlt wurde, wonach die Mischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde. Zu der Mischung wurde MeI (5,0 ml, 81 mmol) zugegeben, während mit Eis gekühlt wurde, und die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während mit Eis gekühlt wurde, wurde eine gesättigte wässrige NH₄Cl-Lösung (50 ml) zugegeben, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt, wonach die Verdünnung mit AcOEt (3 × 50 ml) extrahiert wurde, und die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 150 g, MeOH-CHCl₃ 3:97 V/V) unterworfen, um (5S)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]-1-methylpyrrolidin-2-on (3,86 g, 97,9%) zu erhalten.
[α]_D ²⁹ +3,46 (c 1,13, CHCl₃)
IR ν_max (Film) cm^–1: 1682
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 3,73 (1H, dd, J = 10,2, 3,3 Hz), 3,60 (1H, dd, J = 10,2, 4,1 Hz), 3,55 (1H, Quintett, J = 4,1 Hz), 2,85 (3H, s), 2,50–2,37 (1H, m), 2,35–2,23 (1H, m), 2,15–2,01 (1H, m), 1,89–1,77 (1H, m), 0,89 (9H, s), 0,06 (3H, s), 0,05 (3H, s)
MS m/z: 228 (M⁺ – 15), 186, 98 (100%)
HRMS berechnet für C₁₁H₂₂NO₂Si: 228,1420 (M⁺ – 15)
gefunden: 228,1441 (M⁺ – 15)
(3) (5S)-5-(Brommethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on:
Bu₄NF (1 molare THF-Lösung, 17,5 ml, 17,5 mmol) wurde zu einer THF (100 ml)-Lösung von (5S)-5-[(tert-Butyldimethyl silyloxy)methyl]-1-methylpyrrolidin-2-on (3,84 g, 15,8 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 150 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um (5S)-5-(Hydroxymethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on als Mischung (2,46 g) mit nicht-abtrennbaren Verunreinigungen zu erhalten.
Ph₃P (4,13 g, 15,75 mmol) wurde zu einer CH₃CN (35 ml)-Lösung der obigen Mischung (2,46 g) zugegeben, und dann wurde eine CH₃CN (10 ml)-Lösung von CBr₄ (5,22 g, 15,75 mmol) tropfenweise unter Kühlen mit Eis zugegeben, gefolgt von Rühren der Mischung für 15 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 150 g, AcOEt) unterworfen, um (5S)-5-(Brommethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on (2,57 g, 84,7%) zu erhalten.
IR ν_max (Film) cm^–1: 1688
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 3,81 (1H, Sextett, J = 4,1 Hz), 3,53 (1H, d, J = 4,1 Hz), 2,84 (3H, s), 2,62–2,46 (1H, m), 2,42–2,27 (1H, m), 2,26–2,14 (1H, m), 2,01–1,88 (1H, m)
MS m/z: 193 (M⁺ + 2), 191 (M⁺), 98 (100%)
HRMS berechnet für C₆H₁₀NOBr: 190,9945 (M⁺)
gefunden: 190,9935 (M⁺)
(4) 2-((2S)-1-Methyl-5-oxopyrrolidin-2-yl)ethannitril:
KCN (886 mg, 13,6 mmol), NaCN (666 mg, 13,6 mmol) und 18-Krone-6 (207 mg, 1,02 mmol) wurden zu einer CH₃CN-Lösung (25 ml) von (5S)-5-(Brommethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on (1,31 g, 6,8 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 43 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das anorganische Material wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit AcOEt (50 ml) verdünnt. Die Verdünnung wurde mit einer gesättigten NaCl-Lösung (30 ml) gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 50 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um 2-((2S)-1-Methyl-5-oxopyrrolidin-2-yl)ethannitril als Mischung (1,05 g) mit schwer abtrennbaren Verunreinigungen zu erhalten.
IR ν_max (Film) cm^–1: 2246, 1685
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 3,85–3,76 (1H, m), 2,88 (3H, s), 2,68 (1H, dd, J = 17,0, 4,4 Hz), 2,61 (1H, dd, J = 17,0, 6,0 Hz), 2,62–2,48 (1H, m), 2,46–2,30 (2H, m), 2,00–1,86 (1H, m)
MS m/z: 138 (M⁺), 98 (100%)
HRMS berechnet für C₇H₁₀N₂O: 138,0793 (M⁺)
gefunden: 138,0794 (M⁺)
(5) 2-((2)-1-Methyl-5-thioxopyrrolidin-2-yl)ethannitril:
Lawesson-Reagens (Tokyo Kasei Kogyo) (1,54 g, 3,8 mmol) wurde zu einer Benzol (25 ml)-Lösung von 2-((2)-1-Methyl-5-oxopyrrolidin-2-yl)ethannitril (1,05 g, 7,6 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 60 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um 2-((2S)-1-Methyl-5-thioxopyrrolidin-2-yl)ethannitril (941 mg, 80,6%) zu erhalten.
IR ν_max (Film) cm^–1: 2246
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 4,20–4,10 (1H, m), 3,30 (3H, s), 3,25–2,98 (2H, m), 2,77 (1H, dd, J = 17,0, 4,9 Hz), 2,68 (1H, dd, J = 17,0, 6,6 Hz), 2,50–2,36 (1H, m), 2,06–1,94 (1H, m)
MS m/z: 154 (M⁺), 114 (100%)
HRMS berechnet für C₇H₁₀N₂S: 154,0565 (M⁺)
gefunden: 154,0561 (M⁺)
(6) N-[2-((2S)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenamid:
Raney-Ni (1,5 ml) wurde zu einer EtOH (30 ml)-Lösung von 2-((2S)-1-Methyl-5-thioxopyrrolidin-2-yl)ethannitril (940 mg, 6,1 mmol) zugegeben und die Mischung wurde für 24 Stunden unter Rückfluss erwärmt (bei TCL waren die Ausgangsmaterialien nicht komplett verschwunden). Das anorganische Material wurde abfiltriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 40 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um 2-((2S)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethannitril als Mischung (195 mg) mit Verunreinigungen, die schwer abzutrennen waren, zu erhalten.
Zu einer THF (10 ml)-Suspension von LiAlH₄ (88 mg, 2,3 mmol) wurde eine THF (5 ml)-Lösung der 2-((2S)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethannitril-Mischung (195 mg) tropfenweise unter Rühren und während mit Eis gekühlt wurde zugegeben. Dann wurde die Mischung für 15 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde c. NH₄OH zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wonach CH₂Cl₂ zum Rückstand zugegeben wurde, und die Mischung wurde über K₂CO₃ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert. CH₂Cl₂ (8 ml) wurde zu dem resultierenden Rohprodukt 2-((2S)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethylamin zugegeben, dann wurde eine CH₂Cl₂ (2 ml)-Lösung von DHA-Cl (150 mg, 0,43 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 30 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V, gesättigt mit einer konzentrierten wässrigen Lösung von NH₄OH) unterworfen, um die Titelverbindung (157 mg, 22,4%) zu erhalten.
[α]_D ²⁴ –6,85 (c 0,928, CHCl₃)
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 6,71 (1H, br), 5,45–5,26 (12H, m), 3,52–3,40 (1H, m, 3,28–3,16 (1H, m), 3,09–3,01 (1H, m), 2,90–2,77 (10H, m), 2,44–2,35 (2H, m), 2,31 (3H, s), 2,29–2,02 (6H, m), 1,97–1,82 (1H, m), 1,80–1,51 (5H, m), 0,97 (3H, t, J = 7,7 Hz)
BEISPIEL 13
Synthese von N-(2-((2R)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl](4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenamid(2R-Form der Verbindung (2)):
(1) (5R)-5-((tert-Butyldimethylsilyloxy)methyh]pyrrolidin-2-on:
Imidazol (5,24 g, 77 mmol) wurde zu einer CH₂Cl₂ (85 ml)-Lösung von (5R)-5-(Hydroxymethyl)-2-pyrrolidinon (4,03 g, 35 mmol) zugegeben. Dann wurde unter Eiskühlung eine CH₂Cl₂ (15 ml)-Lösung von tert-Butyldimethylsilylchlorid (4,53 g, 30 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 300 g, MeOH-CHCl₃ 5:95 V/V) unterworfen, um (5R)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]pyrrolidin-2-on (7,92 g, 98,7%) zu erhalten.
[α]_D ²⁵ –47,44 (c 1,80, CHCl₃)
(2) (5R)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]-1-methylpyrrolidin-2-on:
Eine THF (20 ml)-Lösung von (5R)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]pyrrolidin-2-on (5,73 g, 25 mmol) wurde tropfenweise unter Kühlen mit Eis zu einer THF (100 ml)-Suspension von NaH (60%-ige Öldispersion, 1,20 g, 30 mmol) zugegeben, wonach die Mischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde. Zu der Mischung wurde MeI (7,8 ml, 125 mmol) unter Kühlen mit Eis zugegeben, und die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Unter Kühlen mit Eis wurde eine gesättigte wässrige Lösung (50 ml) von NH₄Cl zugegeben, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt, wonach die Verdünnung mit AcOEt (3 × 50 ml) extrahiert wurde, und die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 250 g, MeOH-CHCl₃ 3:97 V/V) unterworfen, um (5R)-5-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]-1-methylpyrrolidin-2-on (6,00 g, 98,8%) zu erhalten.
(3) (5R)-5-(Brommethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on:
Bu₄NF (1 mol THF-Lösung, 14,1 ml, 14,1 mmol) wurde zu einer THF (100 ml)-Lösung von (5R)-5-[(tert- Butyldimethylsilyloxy)methyl]-1-methylpyrrolidin-2-on (3,43 g, 14,1 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 150 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um (5R)-5-(Hydroxymethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on als eine Mischung (2,48 g) mit nicht-abtrennbaren Verunreinigungen zu erhalten.
Ph₃P (5,04 g, 19,2 mmol) wurde zu einer CH₃CN (60 ml)-Lösung der obigen Mischung (2,48 g) zugegeben, und dann wurde eine CH₃CN (15 ml)-Lösung von CBr₄ (6,37 g, 19,2 mmol) tropfenweise unter Kühlen mit Eis zugegeben, gefolgt von 15-stündigem Rühren der Mischung bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 150 g, AcOEt) unterworfen, um (5R)-5-(Brommethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on (2,68 g, 98,5%) zu erhalten.
(4) 2-((2R)-1-Methyl-5-oxopyrrolidin-2-yl)ethannitril:
KCN (1,26 g, 25,7 mmol), NaCN (2,78 mg, 42,7 mmol) und 18-Krone-6 (793 mg, 3 mmol) wurden zu einer CH₃CN (60 ml)-Lösung von (5R)-5-(Brommethyl)-1-methylpyrrolidin-2-on (2,67 g, 13,9 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 44 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das anorganische Material wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde mit AcOEt (50 ml) verdünnt. Die Verdünnung wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (30 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 100 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um 2-((2R)-1-Methyl-5-oxopyrrolidin-2-yl)ethannitril als eine Mischung (1,49 g) mit Verunreinigungen zu erhalten, die schwierig abzutrennen waren.
(5) 2-((2R)-1-Methyl-5-thioxopyrrolidin-2-yl)ethannitril:
Lawesson-Reagens (Tokyo Kasei Kogyo) (2,26 g, 5,6 mmol) wurde zu einer Benzol (40 ml)-Lösung von 2-((2R)-1-Methyl-5-oxopyrrolidin-2-yl)ethannitril (1,48 g, 10,7 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert, und dann wurde der Rückstand einer Säulenchromatografie (SiO₂ 80 g, MeOH-CHCl₃ 5:95 V/V) unterworfen, um 2-((2R)-1-Methyl-5- thioxopyrrolidin-2-yl)ethannitril (1,36 g, 82,8%) zu erhalten.
(6) N-[2-((2R)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethyl](4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenamid:
Raney-Ni (1,5 ml) wurde zu einer EtOH (30 ml)-Lösung von 2-((2R)-1-Methyl-5-thioxopyrrolidin-2-yl)ethannitril (1,36 g, 8,8 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 24 Stunden unter Rückfluss erwärmt (nach TCL waren die Ausgangsmaterialien nicht vollständig verschwunden). Das anorganische Material wurde abfiltriert, und dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatografie (SiO₂ 40 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V) unterworfen, um 2-((2R)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethannitril als eine Mischung (498 mg) mit Verunreinigungen zu erhalten, die schwierig abzutrennen waren.
Zu einer THF (15 ml)-Dispersion von LiAlH₄ (130 mg, 3,4 mmol) wurde eine THF (5 ml)-Lösung der 2-((2R)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethannitril-Mischung (249 mg) tropfenweise unter Rühren allmählich zugegeben, während mit Eis gekühlt wurde. Dann wurde die Mischung für 45 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde c. NH₄OH zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wonach CH₂Cl₂ zum Rückstand zugegeben wurde, und die Mischung wurde über K₂CO₃ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert. CH₂Cl₂ (12 ml) wurde zu dem resultierenden Rohprodukt 2-((2R)-1-Methylpyrrolidin-2-yl)ethylamin (257 mg) zugegeben, dann wurde eine CH₂Cl₂ (3 ml)-Lösung von DHA-Cl (350 mg, 1,01 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und dann wurde der Rückstand einer Silicagel-Säulenchromatografie (SiO₂ 30 g, MeOH-CHCl₃ 1:9 V/V, gesättigt mit einer konzentrierten wässrigen Lösung von NH₄OH) unterworfen, um die Titelverbindung (314 mg, 35,8%) zu erhalten.
[α]_D ²⁴ +2,74 (c 0,786, CHCl₃)
BEISPIEL 14
Herstellung einer Emulsionszubereitung vom O/W-Typ der Verbindung (2) (nachstehend als Verbindung (2-MS) bezeichnet):
Eine Emulsionszubereitung vom O/W-Typ der Verbindung (2) (Verbindung (2-MS)) wurde auf die folgende Weise hergestellt. Gereinigtes Eigelblecithin (6,0 g) und 50,0 mg der Verbindung (2) wurden zu 50 g gereinigtem Sojaöl zugegeben, und diese Materialien wurden durch Erwärmen bei 40 bis 45°C geschmolzen. Zu der Schmelze wurden 11,5 mg Glycerin (The Pharmacopoeia of Japan) zugegeben, und dann destilliertes Wasser zur Injektion verwendet, um eine Gesamtmenge von 500 ml zu erhalten. Die resultierende Mischung wurde mittels eines Homomischers zu einer groben Emulsion (coarse emulsion) geformt. Die grobe Emulsion wurde 5 mal durch einen Menton-Gorin-Homogenisator unter einem Druck von 600 kg/cm² gedrückt, wodurch es fein emulgiert wurde. Als Ergebnis wurde eine homogenisierte, sehr feine Zubereitung der Verbindung (2-MS) erhalten. Die mittlere Partikelgrösse und die Partikelgrössenverteilung der so hergestellten Zubereitung der Verbindung (2-MS) wurde durch einen Nicomp 370/Autodilute Submicron Particle Sizer (ein Produkt von Pacific Scientific) gemessen. Die mittlere Partikelgrösse betrug 0,15 bis 0,3 μm, und die Partikelgrössenverteilung war so, dass keine Partikel enthalten waren, die 1 μm oder mehr messen.
TESTBEISPIEL 1 – In vitro-Plättchenaggregation
Kollagen-induzierte in vitro-Plättchenaggregation: Es wurde untersucht, ob die erfindungsgemässen Verbindungen die Plättchenaggregation, die durch Kollagen induziert wird, inhibieren würden.
Untersuchte Wirkstoffe:
Die Verbindungen der Beispiele (Verbindungen (1) bis (9) und (11)) wurden in Experimenten verwendet. Diese Verbindungen wurden jeweils mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um Endkonzentrationen von 1 × 10^–7 M, 3 × 10^–7 M, 1 × 10^–6 M, 3 × 10^–6 M, 1 × 10^–5 M, 3 × 10^–5 M, und 1 × 10^–4 M zu erhalten.
Indomethacin wurde als positive Kontrolle verwendet. Indomethacin wurde in Methanol gelöst und dann mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um Endkonzentrationen von 1 × 10^–6 M, 3 × 10^–6 M, und 1 × 10^–5 M zu erhalten.
Physiologische Kochsalzlösung wurde als negative Kontrolle verwendet.
Zubereitung der Plättchen:
Nachdem ein männliches JW-Kaninchen (SPF, 2,5 Monate alt) anästhetisiert worden war, wurde Blut aus der Karotidarterie in ein Röhrchen entnommen, das 3,8% Natriumcitrat (Citral, Yamanouchi Pharmaceutical) enthielt. Das Röhrchen wurde bei 900 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um den Überstand (PRP, plättchenreiche Plasmafraktion) abzutrennen. Der Rückstand wurde für weitere 15 Minuten bei 2.500 U/min zentrifugiert, um den Überstand (PPP, plättchenarme Plasmafraktion) zu erhalten.
Messung der Transmission:
Die PPP (plättchenarme Plasmafraktion) wurde in eine Küvette gegeben und die Küvette wurde in einem 37°C-Inkubator für PPP eines Aggregometers (Hematracer 240 12ch, hergestellt von MCM) montiert. Dann wurden 200 μl der PRP (plättchenreichen Plasmafraktion) in eine Küvette gegeben, und die Küvette wurde in einem Reaktor für PRP montiert. Unter Rühren mit einem Magnetrührer wurde die Transmission von PPP zu T_{650 nm} = 100% korrigiert, und die Transmission von PRP wurde zu T_{650 nm} = 0% durch automatische Einstellung für 30 Sekunden korrigiert.
Die Studiensubstanz (20 μl) wurde in einer vorbestimmten Konzentration in die Küvette gegeben, und 30 Sekunden später wurden 20 μl (Endkonzentration 0,2 μg/ml) Kollagen (hergestellt von MCM) zugegeben. Anschliessende Veränderungen der Transmission wurden für 5 Minuten aufgezeichnet. Wenn die Plättchen aggregieren, erhöht sich die Transmission. Wenn die Aggregation ihr Maximum erreicht hatte, wurde die Transmission T bei maximaler Aggregation mit der Transmission T₀ der negativen Kontrolle verglichen, und die Aggregationsinhibierungsrate wurde als Prozentsatz unter Verwendung der folgenden Gleichung ausgedrückt: Aggregationsinhibierungsrate = (1 – T/T0) × 100
Aus der erhaltenen Aggregationsinhibierungskurve wurde eine Regressionsgleichung durch Annäherung vom linearen Typ abgeleitet. IC₅₀, der Punkt bei 50%-iger Inhibierung, wurde aus der Aggregationsgleichung berechnet.
Die Aggregationsinhibierungskurve ist in 1 gezeigt.
IC₅₀, der Punkt bei 50%-iger Inhibierung der Plättchenaggregation, ist in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1 50% Inhibierungspunkt der Plättchenaggregation
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen (1) bis (9) und (11) die Plättchenaggregation praktisch zum gleichen Grad wie Indomethacin unterdrückten.
Somit wurde bestätigt, dass die erfindungsgemässen Verbindungen, die durch die Formel (I) dargestellt werden, worin n in C_nH_(2n-2m) eine ganze Zahl von 6 bis 20 ist, und die Unsättigungszahl m in C_nH_(2n-2m) eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, eine die Plättchenaggregation unterdrückende Wirkung besitzen.
In vitro-Plättchenaggregation durch verschiedene Induzierer:
Als nächstes wurde die Unterdrückung der Plättchenaggregation durch die erfindungsgemässen Verbindungen auf dieselbe Weise wie oben beschrieben, unter Verwendung von nicht nur Kollagen, sondern auch Arachidonsäure, ADP, Thrombin, Serotonin, Epinephrin und U46619 (Pseudo-Thromboxan A2-Substanz) als Induzierer untersucht.
Als Plättchen wurden auch Plättchen verwendet, die aus Ratten und Meerschweinchen sowie Kaninchen präpariert wurden.
Die Herstellung der Aggregationsinduzierer wurde auf die folgende Weise durchgeführt:
Kollagen und ADP wurden von MCM erworben und in Übereinstimmung mit dem Herstellungsverfahren, das in den den erworbenen Produkten beiliegenden Beschreibungen beschrieben ist, verwendet. Serotonin, Epinephrin und Thrombin wurden von Sigma erworben und als Lösungen in physiologischer Kochsalzlösung zur Injektion (Otsuka Pharmaceutical Factory) verwendet. Arachidonsäure wurde von Cayman erworben und in physiologischer Kochsalzlösung zur Injektion (Otsuka Pharmaceutical Factory) unter Verwendung des Ultraschalloszillators vom Eintauchtyp (US150, Nippon Seiki, Durchmesser des Spitzenendes ca. 3,5 mm) dispergiert. U46619 (Pseudo-Thromboxansubstanz) wurde von Funakoshi erworben und in physiologischer Kochsalzlösung zur Injektion (Otsuka Pharmaceutical Factory) gelöst, wenn es verwendet wurde.
Kollagen (0,1 bis 1 μg/ml), Arachidonsäure (1 mM), ADP (1 μM), Thrombin (1 E/ml), Serotonin (100 μM), Epinephrin (100 bis 200 μM) und U46619 (3 μM) wurden verwendet.
Verbindung (2) wurde als Studienwirkstoff verwendet. Indomethacin wurde als positive Kontrolle zur Messung der Unterdrückung der Plättchenaggregation, die durch Kollagen induziert wird, verwendet.
IC₅₀, der Punkt bei 50%-iger Inhibierung der Plättchenaggregation, wurde bestimmt und ist in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 50% Inhibierungspunkt, IC₅₀, für in vitro-Plättchenaggregation durch verschiedene Induzierer

k.A.: = keine Aggregation

Im Fall der Kollagen-induzierten Aggregation betrug der 50%-Aggregations-Inhibierungspunkt der Verbindung (2) etwa (11 ± 7) × 10^–6 M bzw. (9,0 ± 6,0) × 10^–6 M, wenn die Plättchen aus der Ratte oder dem Meerschweinchen verwendet wurden. Diese Befunde zeigten, dass Verbindung (2) eine die Plättchenaggregation inhibierende Wirkung aufweist, die nahezu vergleichbar zu Indomethacin ist, wie im Fall, in dem Kaninchenplättchen verwendet wurden.
Im Fall der Aggregation, die durch Arachidonsäure, ADP und Thrombin induziert wurde, wurde gefunden, dass Verbindung (2) entweder die Plättchenaggregation nicht inhibierte, oder, selbst wenn es die Plättchenaggregation inhibierte, der Grad der Inhibierung sehr gering war, wenn die Plättchen aus dem Kaninchen, der Ratte oder dem Meerschweinchen verwendet wurden.
Der Grund, warum in einigen der Experimente keine Daten erhalten wurden, könnte gewesen sein, dass bei den Tiergattungen Unterschiede der Plättchenaktivität vorlagen und die Empfindlichkeit eines bestimmten Plättchens gegenüber einem bestimmten Induzierer gering war.
Die gleichen Ergebnisse wie oben beschrieben wurde in den Experimenten unter Verwendung von Verbindung (1) erhalten.
Somit wurde gezeigt, dass die erfindungsgemässen Verbindungen in der Lage sind, selektiv die Plättchenaggregation, die von Kollagen induziert wird, zu unterdrücken.
Menschliche in vitro-Plättchenaggregation:
Herstellung von Humanplättchen:
Von jeder der Oberarmvenen menschlicher Freiwilliger wurden 10 ml Blut pro Person unter Verwendung einer 18G-Injektionsnadel abgenommen. Das Blut wurde sanft in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen eingetropft, das 100 ml 3,8%-iges Natriumcitrat (Citral, Yamanouchi Pharmaceutical) enthielt. Das Röhrchen wurde mit einem Stopfen verschlossen und langsam zum Mischen umgedreht. Dann wurde das Blut bei 900 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen (plättchenreiche Fraktion, plättchenreiches Plasma, PRP). Der Rückstand für weitere 15 Minuten bei 2.500 U/min zentrifugiert, um den Überstand (plättchenarme Fraktion, plättchenarmes Plasma, PPP) zu erhalten. Die Plättchendichte der PRP wurde mit einem Blutzellenzähler (Sysmex) gemessen und mit PPP verdünnt, um die Plättchendichte auf 300.000 Plättchen/μl einzustellen.
Die Herstellung der Aggregationsinduzierer wurde auf die gleiche Weise durchgeführt wie sie zuvor beschrieben wurde.
Für jedes Experiment wurden die Dosen der Induzierer so gewählt, dass man die beste Bewertung der Wirkung der zu untersuchenden Substanz erhielt. Das heisst, die Konzentration jedes Induzierers, bei der sich klar eine Aggregation in Gegenwart einer negativen Kontrolle (physiologische Kochsalzlösung) entwickeln, jedoch nicht übermässig sein würde, wurde für jedes Experiment gewählt.
Falls die Aggregation durch eine hohe Konzentration an ADP oder eine hohe Konzentration an Epinephrin induziert wird, findet andererseits eine primäre Aggregation statt, und dann schreitet die sekundäre Aggregation unter der Wirkung als Auslöser von α-Körnchen (PDGF, Serotonin, ADP usw.), das aus aktivierten Plättchen freigesetzt wird, fort. In der vorliegenden Studie wurde die Wirkung der zu untersuchenden Substanz auf die sekundäre Aggregation aufgrund von ADP oder Epinephrin ebenfalls untersucht.
Wenn Serotonin allein verwendet wird, verursacht es eine minimale Plättchenaggregation. Daher wurde eine Kombination von Serotonin und Kollagen oder eine Kombination von Serotonin und ADP als Induzierer verwendet. Die Dosis des Induzierers wurde für jedes Experiment durch Untersuchung der Dosis eines jeden Induzierers, der eine Aggregation verursachte, wenn er allein verwendet wurde, und Kombinieren von Dosen, die geringer waren als die Dosen, die keine Aggregation verursachten, gewählt. Wenn z.B. Serotonin in alleiniger Verwendung bei einer Dosis von 1 mM eine Aggregation verursachte, jedoch eine geringe Aggregation bei einer Dosis von 0,5 mM, und falls ADP alleine bei einer Dosis von 0,25 mM eine Aggregation verursachte, jedoch keine Aggregation bei einer Dosis von 0,11 mM verursachte, wurden die Dosen zu 0,25 mM Serotonin + 0,05 mM ADP gewählt.
Verbindung (2) wurde als zu untersuchende Substanz verwendet, und die Herstellung der Induzierer wurde auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Die Messung der Transmission wurde auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben durchgeführt.
IC₅₀, der Punkt bei 50%-iger Inhibierung der Plättchenaggregation, wurde bestimmt und ist in der folgenden Tabelle 3 gezeigt.
Wie in der Tabelle gezeigt, wurde die aggregationsunterdrückende Wirkung der Verbindung (2) beobachtet, egal welcher Induzierer die Aggregation verursachte. Insbesondere wurde die unterdrückende Wirkung von Verbindung (2) gegenüber ADP-induzierter sekundärer Aggregation, Epinephrin-induzierter sekundärer Aggregation, Serotonin-induzierter Aggregation oder Kollagen-induzierter Aggregation klar beobachtet. Die Werte des 50%-Inhibierungspunktes, IC₅₀, gegenüber den entsprechenden Induzierern, waren wie folgt:
(5,7 ± 2,6) × 10^–7 M (sekundäre ADP-Aggregation)
(2,7 ± 1,2) × 10^–6 M (sekundäre Epinephrinaggregation)
(3,0 ± 1,6) × 10^–6 M (Serotonin + ADP)
(1,5 ± 0,8) × 10^–6 M (Serotonin + Kollagen) und
(1,3 ± 0,2) × 10^–5 M (Kollagen)
TESTBEISPIEL 2 – Ex vivo-Plättchenaggregation
Untersuchung der Entstehung der pharmazeutischen Wirksamkeit:
Verbindung (2) wurde in einer Dosis von 10 mg/kg in die Schwanzader männlicher SD-Ratten (SPF, 8 Wochen alt) verabreicht. Das Blut wurde zu drei Zeitpunkten, 10 Minuten, 30 Minuten und 1 Stunde nach der Verabreichung, abgenommen. Aus den genommenen Blutproben wurden Plättchen hergestellt, und diese wurden verwendet, um die Aggregationsrate zu studieren, wenn die Plättchenaggregation durch 0,3 bis 6 μg/ml Kollagen induziert worden war. In einer Kontrollgruppe wurden die Aggregationsraten nach Verabreichung eines Lösungsmittels (physiologische Kochsalzlösung) gemessen. Die Herstellung der Plättchen und die Messung der Aggregationsraten wurden auf die gleiche Weise wie in Testbeispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Zu jedem der Zeitpunkte – 10 Minuten, 30 Minuten und 1 Stunde nach Verabreichung der Verbindung (2) – war die Plättchenaggregation im Vergleich zur Lösungsmittelgruppe unterdrückt worden. Es wurde gefunden, dass die unterdrückende Wirkung so war, dass die Plättchenaggregation 1 Stunde nach der intravenösen Verabreichung stärker unterdrückt wurde als 10 Minuten oder 30 Minuten nach der Verabreichung. Daher wurde der Zeitpunkt der Messung in anschliessenden Experimenten zu 1 Stunde nach der Verabreichung bestimmt.
Es wird angenommen, dass der Grund, warum die Plättchenaggregation 1 Stunde nach der intravenösen Verabreichung stärker unterdrückt worden war als 10 oder 30 Minuten nach der intravenösen Verabreichung ist, dass die Verbindung sich allmählich in eine aktive Form im Blut verändern kann und ihre Metaboliten zur Aktivität beitragen können.
Studie der Dosisabhängigkeit:
Es wurde untersucht, ob die erfindungsgemässe Verbindung die ex vivo-Plättchenaggregation dosisabhängig unterdrückt. Verbindung (2) wurde als Studiensubstanz verwendet, und ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) wurde als Kontrolle verwendet.
Die Verbindung (2) wurde in einer Dosis von 1, 0,1, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0003 oder 0,0001 mg/kg in die Rattenschwanzader verabreicht. Das Blut wurde 60 Minuten nach der Verabreichung abgenommen, und Plättchen wurden aus dem Blut hergestellt. Die Plättchenaggregation wurde durch 4 bis 7 μg/ml Kollagen unter Verwendung der Plättchen induziert. Die Zubereitung der Plättchen und die Messung der Aggregationsrate wurden auf die gleiche Weise wie in Testbeispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
In den Gruppen, die 1, 0,1, 0,01 oder 0,001 mg/kg der Verbindung (2) erhielten, wurde die Plättchenaggregation im Vergleich mit der Lösungsmittel-behandelten Gruppe unterdrückt. Bei der 0,0001 mg/kg-Gruppe wurde auch die Plättchenaggregation, die durch Kollagen bei einer niedrigen Konzentration von 4 μg/ml induziert worden war, im Vergleich mit der Lösungsmittel-behandelten Gruppe unterdrückt, obwohl die Unterdrückungswirkung schwach war.
Der Wert des 50%-igen Inhibierungspunkts, IC₅₀, betrug 630 ± 36 ng/kg, wenn er aus den Daten berechnet wird, die erhalten werden, wenn die Plättchenaggregation durch 4 μg/ml Kollagen induziert worden war. Dieser IC₅₀-Wert der Unterdrückung der ex vivo-Plättchenaggregation ist etwa 1.000 mal höher als der herkömmlicher GPIIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten.
Separat wurde Verbindung (5), die als Studiensubstanz verwendet wurde, intravenös in einer Dosis von 0,1 mg/kg verabreicht. Das Blut wurde 1 Stunde nach der intravenösen Verabreichung abgenommen, und Plättchen wurden aus dem Blut hergestellt. Die Plättchenaggregation wurde durch 1 bis 6 μg/ml Kollagen unter Verwendung der Plättchen induziert. Die Herstellung der Plättchen und die Messung der Aggregationsrate wurden auf die gleiche Weise wie in Testbeispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Es wurde gefunden, dass Verbindung (5) ebenfalls die Plättchenaggregation unterdrückt.
Diskussion:
Die inhibierende Wirkung auf die ex vivo-Plättchenaggregation, die in diesem Beispiel gezeigt wird, wird mit der oben beschriebenen Inhibierungswirkung der in vitro-Plättchenaggregation verglichen.
Es kann angenommen werden, dass der IC₅₀-Wert von 630 ng/kg, der in den ex vivo-Experimenten erhalten wurde, eine Dosis ist, bei der die Blutkonzentration der Verbindung (2) 26 nM erreicht, wenn man die Menge des Rattenblutes mit etwa 60 ml/kg abschätzt. Dieser Wert ist geringer als der IC₅₀-Wert von 2,1 ± 0,8 μM in den in vitro-Experimenten und stellt eine geringe Konzentration, die etwa 1/80 des letzteren Wertes ist, dar.
Das heisst, die inhibierende Wirkung auf die ex vivo-Plättchenaggregation zeigt nicht nur, dass die Plättchenaggregation nicht nur einfach durch die erfindungsgemässen Verbindungen unterdrückt wird. Diese Wirkung legt auch die Möglichkeit nahe, dass z.B. die erfindungsgemässen Verbindungen die Wechselwirkung zwischen Neutrophilen und Plättchen unterdrücken, die an der Plättchenaggregation teilnehmen, oder dass die erfindungsgemässen Verbindungen metabolisiert werden und die Plättchenaggregation in vivo stark unterdrückt wird, während die Metaboliten auf die Plättchen wirken.
TESTBEISPIEL 3 – Ex vivo-Plättchenaggregation nach oraler
Verabreichung
Verbindung (2) wurde in einer Dosis von 10,1 oder 0,1 mg/kg oral als Einzeldosis an Ratten unter Verwendung einer Probennadel verabreicht. Ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) wurde als Kontrolle verabreicht.
Das Blut wurde 2 Stunden nach der Verabreichung abgenommen und Plättchen wurden aus dem Blut hergestellt. Die Plättchenaggregation wurde durch 2 bis 4 μg/ml Kollagen unter Verwendung der Plättchen induziert. Die Herstellung der Plättchen und die Messung der Aggregationsrate wurden auf die gleiche Weise wie in Testbeispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Die Plättchenaggregation wurde im Vergleich mit der Lösungsmittel-behandelten Gruppe stark bei den Gruppen unterdrückt, die Verbindung (2) erhielten.
Das heisst, es wurde gezeigt, dass die erfindungsgemässen Verbindungen in der Lage sind, die Plättchenaggregation zu unterdrücken, sogar wenn sie oral absorbiert werden.
TESTBEISPIEL 4 – Rollagen-induziertes Plötzlicher-Tod-
Modell bei Mäusen
Als vorläufige Studie der Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen auf ein in vivo-pathophysiologisches Modell wurde untersucht, ob die erfindungsgemässe Verbindung den Kollagen-induzierten plötzlichen Tod von Mäusen unterdrücken würde. In diesem Modell werden pulmonale Kapillare durch grosse Mengen Kollagen verstopft und ein plötzlicher Tod wird durch Sauerstoffmangel verursacht. Es wurde beobachtet, ob die erfindungsgemässe Verbindung die Plättchenaggregation im Körper des Tieres unterdrücken würde, um somit einen plötzlichen Tod zu inhibieren.
1 Stunde nachdem ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) oder 30 μg/kg der Verbindung (2) intravenös an Mäuse verabreicht worden war, wurden 37,5 mg/kg Kollagen in die Schwanzader verabreicht. 1 Stunde später wurde die Überlebensrate zwischen den Gruppen verglichen. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Überlebensrate in der Lösungsmittelgruppe: 2/10 Mäuse
Überlebensrate in der Gruppe mit Verbindung (2): 7/10 Mäuse
Verbindung (2) zeigte eine höhere Überlebensrate als bei der Lösungsmittelgruppe.
TESTBEISPIEL 5 – Ratten-Laurinsäure-induziertes peripheres Kreislauffehlfunktionsmodell
(1) Verabreichung nach Induzierung von Beinnekrose:
Ein Ratten-Laurinsäure-induziertes peripheres Kreislauffehlfunktionsmodell, das als peripheres Kreislauffehlfunktionsmodell weitverbreitet verwendet wird, wurde eingesetzt, um die Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen auf ein in vivo-pathophysiologisches Modell von Kreislauffehlfunktionen zu untersuchen.
Laurinsäure (1,5 mg/Tier) wurde in die Oberschenkelarterie von Ratten verabreicht, um Beinnekrose zu induzieren. 6 Stunden nach der Laurinsäureverabreichung wurde Verbindung (2) intravenös als Anfangsbehandlung verabreicht und wurde dann wiederholt einmal täglich für 14 Tage verabreicht.
Die Einzeldosis der Verbindung (2) wurde auf 10 μg/kg, 30 μg/kg oder 100 μg/kg gewählt, um zu untersuchen, ob diese Verbindung die Beinnekrose dosisabhängig verbessern würde. Ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) wurde als Kontrolle verabreicht.

Der Fortschritt der Fuss/Bein-Läsionen wurde 3, 7, 10 und 14 Tage nach der Laurinsäureverabreichung beobachtet und durch das folgende Beinnekrose-Bewertungssystem bewertet. Die Punktzahl wurde jedem der Finger zugeordnet und die Summe der Punktzahlen der entsprechenden Finger wurde als Läsionsindex genommen. Falls die Fehlfunktion sich auf den plantaren Bereich ausweitete, wurden weitere 5 Punkte hinzugezählt.

Punktzahl 0:	keine Läsion
Punktzahl 1:	Schwärzung ist auf die Zehenspitzen beschränkt
Punktzahl 2:	Schwärzung weitet sich auf den Fingerbereich aus
Punktzahl 3:	Nekrose des Fingers
Punktzahl 4:	Verlust des Fingers

Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass Verbindung (2) die Beinnekrose-Punktzahl dosisabhängig verbessert.
(2) Verabreichung vor der Induzierung der Beinnekrose:
Ein Test wurde auf die gleiche Weise wie in (1) durchgeführt, ausser dass die Verabreichung der Verbindung (2) 1 Stunde vor der Behandlung mit Laurinsäure gestartet wurde, dann wurde Verbindung (2) 6 Stunden nach der Verabreichung von Laurinsäure verabreicht, und Verbindung (2) wurde weiterhin wiederholt 1 mal täglich für 14 Tage verabreicht. Ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) wurde in ähnlicher Weise als Kontrolle verabreicht.
Der Fortschritt der Fuss/Bein-Läsionen wurde 3, 7, 10 und 14 Tage nach der Verabreichung von Laurinsäure beobachtet und durch das obige Beinnekrose-Bewertungssystem bewertet.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass Verbindung (2) die Beinnekrose-Punktzahl dosisabhängig verbessert.
Nach vorheriger Verabreichung linderte Verbindung (2) die Fehlfunktion signifikant in Dosen von 30 und 100 μg/kg und neigte dazu, die Fehlfunktion sogar in einer Dosis von 10 μg/kg zu lindern.
(3) Verabreichung einer O/W-Emulsionszubereitung vor der Induzierung der Beinnekrose:
Ein Test wurde auf die gleiche Weise wie in oben unter (2) durchgeführt.
Jedoch wurde Verbindung (2-MS) (Einzeldosis: 100 μg/kg als Menge des Wirkstoffs) das in Beispiel 14 hergestellt wurde, als Studienwirkstoff verwendet, Palux (eingetragene Handelsmarke) (Lipo PGE1, Taisho Pharmaceutical: Einzeldosis beträgt 5 μg/kg als Wirkstoffmenge) oder Novastan (eingetragene Handelsmarke) (Argatroban, Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals: Einzeldosis beträgt 1 mg/kg als Wirkstoffmenge) wurde als positive Kontrolle verwendet, und ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) wurde als negative Kontrolle verwendet.
Der Fortschritt der Fuss/Bein-Läsionen wurde 3, 7, 10 und 14 Tage nach der Laurinsäureverabreichung beobachtet und durch das obige Beinnekrose-Punktzahlsystem bewertet.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass Verbindung (2-MS) stärker wirksam als Argatroban ist und die Beinnekrose-Punktzahl zu einem Grad verbesserte, der dem von Lipo PGE1 vergleichbar ist.
TESTBEISPIEL 6 – Pseudo-Blutgefäss-in vitro-Entzündungsmodell
Ein Report besagt, dass, wenn entzündendes Cytokin TNFα die Adhäsion von Molekülen der vaskulären Endothelialzellen induziert und Entzündungen verursacht, daraufhin Neutrophile an die Entzündungsstelle migrieren, was die Entzündung verstärkt. Starke Entzündung zerstört die Homöostase der Kreislauforgane, was zu einem Fortschreiten von Arteriosklerose führt. Daher wurde eine Studie durchgeführt, ob die erfindungsgemässen Verbindungen eine entzündungshemmende Wirkung in einem Pseudo-Blutgefäss-in vivo-Entzündungsmodell unter Verwendung von TNFα als Entzündungsinduzierer aufweisen.
Etablierung des Pseudo-Blutgefäss-in vitro-Entzündungsmodells:
Das Pseudo-Blutgefäss-in vitro-Entzündungsmodell wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in "A Lecture on Biopharmaceutical Experiments, 12 Inflammation and Allergy II, Seiten 327–341" (herausgegeben von Kazuo Ouchi, Hirokawa Publishing Company, veröffentlicht am 15. Mai 1993) beschrieben ist, hergestellt.
Transwells (Kurabo Industries), die durch eine poröse Polycarbonatmembran mit 3 μm-Poren in eine obere und eine untere Kammer getrennt sind, wurden verwendet. Eine Schicht von Rinder-Endothelialzellen wurde auf die untere Oberfläche der Membran aufgebracht und für 80 Minuten bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Dann wurde eine Suspension von Fluoreszenz-markierten Neutrophilen zu der oberen Kammer des Transwell zugegeben. Simultan wurde TNFα in der Zellsuspension in der oberen Kammer zu einer Endkonzentration von 50, 25 oder 17 ng/ml suspendiert.
Das heisst, in dem obigen Modell wird ein Zustand imitiert, in dem das Phänomen, dass Neutrophile von der oberen Kammer durch die Schicht von vaskulären Endothelialzellen in die untere Kammer wandern und Neutrophile an die Schicht endothelialer Zellen anhaften, worin als Reaktion auf TNFα innerhalb der Blutgefässe Neutrophile von innerhalb der Blutgefässe an die Entzündungsstelle migrieren.
Die Untersuchung zeigte, dass die Anzahl der Neutrophile, die von der oberen Kammer durch die Schicht vaskulärer Endothelialzellen in die untere Kammer wandern, und die Anzahl der Neutrophile, die an die Schicht endothelialer Zellen anhaften, auf eine Weise anstieg, die von der Konzentration von TNFα abhängt. Das heisst, es wurde gezeigt, dass TNFα Entzündung verursacht.
Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen auf die Wechselwirkung zwischen Neutrophilen und vaskulären Endothelialzellen:
Als nächstes wurde eine Studie durchgeführt, wie Verbindung (1) oder Verbindung (2) die Wechselwirkung zwischen Neutrophilen und vaskulären Endothelialzellen beeinflussen würde, wobei das obige Pseudo-Blutgefässin vitro-Entzündungsmodell verwendet wurde.
Verbindung (1) oder Verbindung (2) wurde in der oberen Kammer des Transwell zu einer Endkonzentration von 30, 3 oder 0,3 μM zusammen mit einer Suspension der Neutrophilen und 50 ng/ml von TNFα plaziert. Auf dieselbe Weise wie oben beschrieben wurde die Anzahl der Neutrophile, die von der oberen Kammer durch die Schicht vaskulärer Endothelialzellen in die untere Kammer wandern, und die Anzahl der Neutrophile, die an die Schicht endothelialer Zellen anhaftet, gemessen. Auf Grundlage dieser Zahlen wurde die Migrationsrate der Neutrophile (%) berechnet. Die Neutrophil-Migrationsrate wurde als Relativwert (%) der Anzahl der wandernden Neutrophile in der mit Wirkstoff behandelten Gruppe in Bezug auf die Anzahl der migrierenden Neutrophile in der negativen Kontrollgruppe (physiologische Kochsalzlösung) gemessen.
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Verbindung (1) und Verbindung (2) unterdrückten jeweils die Neutrophilenwanderung dosisabhängig.
Das heisst, es wurde die Möglichkeit vorgeschlagen, dass sowohl Verbindung (1) als auch Verbindung (2) gegenüber der Wechselwirkung zwischen den Neutrophilen und den vaskulären Endothelialzellen unterdrückend wirken und in die Wirkung der Entzündungshemmung wirken.
Da Verbindung (1) oder (2) in einer entzündungshemmenden Weise wirkt, wird erwartet, dass Verbindung (1) oder (2) die Homöostase der Kreislauforgane beibehalten kann und in die Wirkung der Linderung pathologischer Zustände wirkt.
TESTBEISPIEL 7 – Fotosensibilisierung-induziertes
Verstopfungsmodell der mittleren Cerebralarterie bei Ratten
Ein Fotosensibilisierung-induziertes Verstopfungsmodell der mittleren Cerebralarterie bei Ratten, das weitverbreitet als Modell für die akute Phase/chronische Phase des Gehirninfarkts verwendet wird, wurde verwendet, um die Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen auf ein in vivo-Kreislauffehlfunktions-pathophysiologisches Modell zu untersuchen.
Nachdem Ratten ein rosa Bengalfarbstoff (20 mg/kg) intravenös injiziert worden war, wurde die mittlere Cerebralarterie mit grünem Laserlicht (Wellenlänge: 540 nm) für 10 Minuten bestrahlt, um arteriellen Infarkt aufgrund von aktiven Sauerstoffspezies zu induzieren. Nach Vollendung der Bestrahlung mit Laserlicht wurde Verbindung (2) intravenös verabreicht.
Die Dosis von Verbindung (2) wurde auf 1 mg/kg gesetzt und es wurde untersucht, ob diese Verbindung den Gehirninfarkt lindern würde. Ein Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung) wurde als Kontrolle intravenös verabreicht.
Das Fortschreiten des Gehirninfarkts wurde 24 Stunden nach der Laserlichtbestrahlung beobachtet. Eine querlaufende Sektion (1 mm Dicke) des herausgenommenen Gehirns wurde zubereitet und in Triphenyltetrazolium getränkt, um lebendes Gewebe rot zu färben. Ein Infarkt war weiss und unterschied sich klar von dem lebenden Gewebe. Somit wurde die Fläche des Infarkts gemessen und die Infarktrate (der Anteil der Fläche des Infarkts zu der querlaufenden Sektion des Gehirns) wurde zur Verwendung in der Bewertung berechnet.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass Verbindung (2) den Gehirninfarkt lindert.
TESTBEISPIEL 8 – Ratten-Karotidarterie-Tunica intima-
Verdickungsmodell
Ein Ratten-Karotidarterie-Tunica intima-Verdickungsmodell, das weithin als post-PTCA-Restenosemodell verwendet wird, wurde eingesetzt, um die Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen auf ein in vivo-Kreislauffehlfunktionspathophysiologisches Modell zu untersuchen.
Die Spitze eines Ballonkatheters (Fogarty catheter 2Fr, Baxter) wurde durch die Ratten-Oberschenkelarterie eingeführt und zu der Karotidarterie geführt. Luft (0,3 ml) wurde in den Ballon injiziert, um den Ballon aufzublasen. Mit dem Ballon in aufgeblasenem Zustand wurde der Ballonkatheter aus dem Aortabogen herausgezogen. Auf diese Weise wurde die Tunica intima der Karotidarterie dreimal verletzt. Die Emulsionszubereitung vom O/W-Typ der Verbindung (2) (Verbindung (2-MS)), die in Beispiel 14 hergestellt worden war, wurde wiederholt einmal täglich intravenös verabreicht, was 1 Woche vor der Verletzung der vaskulären Tunica Intima begann, und einmal täglich für 2 Wochen sogar nach der Verletzung der vaskulären Tunica Intima wiederholt verabreicht.
Die Einzeldosis der Verbindung (2-MS) wurde auf 100 μg/kg oder 300 μg/kg (als Wirkstoffmenge) gesetzt, um zu untersuchen, ob diese Verbindung die Verdickung der vaskulären Tunica Intima dosisabhängig unterdrücken würde. Eine Emulsionszubereitung vom O/W-Typ, die die Verbindung (2) nicht enthält, wurde als negative Kontrolle verabreicht. Enalapril (Sigma) wurde als positive Kontrolle verwendet und in einer Dosis von 30 mg/kg einmal täglich mittels der oralen Route auf die gleiche Weise wie oben beschrieben verabreicht.
Die Verdickung der vaskulären Tunica Intima wurde 2 Wochen nach der Verletzung bewertet. Eine querlaufende Sektion der herausgenommenen Karotidarterie wurde mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt und die Fläche des Blutgefässlumens, die Fläche, die mit der internen elastischen Lamina umgeben war, und die Fläche, die mit der externen Lamina umgeben war, wurde gemessen. Die Verdickung der Tunica Intima wurde unter Verwendung des Verhältnisses der Fläche der neogenetischen Tunica Intima (die Fläche, die von dem internen elastischen Lamina umgeben war – (Minus) der Fläche des Blutgefässlumens) zu der Fläche der Tunica media (die Fläche, die von dem externen elastischen Lumina umgeben war – (Minus) der Fläche, die von dem internen elastischen Lamina umgeben war) gemessen.
Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Es wurde klar gezeigt, dass Verbindung (2-MS) die Verdickung der Tunica intima dosisabhängig unterdrückt. Die Wirkungskraft bei 300 μg/kg der Verbindung (2-MS) war nahezu vergleichbar zu der von 30 mg/kg Enalapril.
TESTBEISPIEL 9 – Studie der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen vom synthetischen Typ
Die Wirkung der Studiensubstanz auf die Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen wurde untersucht.
Es wird spekuliert, dass mit dem Fortschreiten von Arteriosklerose vaskuläre glatte Muskelzellen vom kontraktiven Typ in den synthetischen Typ transformiert werden, und während entzündende Cytokine, wie PDGF, sekretiert werden, werden vaskuläre glatte Muskelzellen proliferiert, was im Fortschreiten arteriosklerotischer Läsionen resultiert (Roth-Hypothese).
Somit wurde die Wirkung der Verbindung (2) auf die Zellproliferation vaskulärer glatter Muskelzellen auf die folgende Weise gemessen:
Die Ratten-Karotidarterie-Tunica intima wurde durch Behandlung mit einem Ballon (ballooning) gerieben und vaskuläre glatte Muskelzellen wurden durch Explantatkultur hergestellt. 2 Wochen später wurden diese Zellen in einem DMEM-Kulturmedium (Gibco), das 10% fötales Rinderserum enthielt, kultiviert. Die Kulturen wurden mehrere Male zur Stabilisierung kultiviert und dann mit einer Zelldichte von 5 × 10³ Zellen/cm² zur Verwendung in Experimenten gepflanzt. Verbindung (2) wurde in Kombination mit 50 ng/ml des Wachstumsfaktors PDGF (Sigma) zu den obigen gepflanzten Zellen zugegeben, und 24 Stunden später wurde die Zelldichte mittels BrdU-Assay gemessen (Science '82. 218, Seite 474, Cytometry '85, 6, Seite 584). Die Zelldichte in Abwesenheit des Wirkstoffs wurde als Kontrolle gemessen.
Es wurde gefunden, dass Verbindung (2) die Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen konzentrationsabhängig bei einer Konzentration von 0,3 bis 3 μm unterdrückt. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Relative Anzahl glatter Muskelzellen (%) = [Zellanzahl in der experimentellen Gruppe]/[Zellanzahl in der Kontrolle] × 100
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT:
Die erfindungsgemässen Verbindungen können in potenter Weise die Plättchenaggregation unterdrücken (insbesondere die Plättchenaggregation, die durch Kollagen induziert wird), können Entzündungen unterdrücken und zeigen eine herausragende prophylaktische oder therapeutische Wirkung auf Kreislauferkrankungen (z.B. thrombotische Erkrankungen, arteriosklerotische Erkrankungen oder hyperlipämische Erkrankungen).

Claims

Aliphatische Verbindung der Formel (II) oder ein Stereoisomer derselben oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der aliphatischen Verbindung oder des Stereoisomers:
worin A gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nH_(2n-2m)- darstellt, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 22 bezeichnet und m eine Unsättigungszahl darstellt, welche eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist, l eine Zahl von 0 bis 10 darstellt, R eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann, und R^A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann.
Aliphatische Verbindung, Stereoisomer derselben oder pharmazeutisch akzeptables Salz der aliphatischen Verbindung oder des Stereoisomers gemäß Anspruch 1, worin die aliphatische Verbindung (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-[2-(1-methylpyrrolidin-2-yl)ethyl]docosahexaenoamid ist.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung des Anspruchs 1, welches umfaßt: Reaktion einer Verbindung der Formel (VI'):
worin l, R und R^A wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einem Reaktionsprodukt, das durch eine Reaktion zwischen einer Verbindung der Formel A-CO-OH [worin A CH₃C_nH_(2n-2m)- darstellt (worin n und m wie in Anspruch 1 definiert sind)] und (COCl)₂ gebildet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Unterdrücken von Plättchenaggregation, worin die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil die Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Vermeiden oder Behandeln von Kreislaufkrankheiten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil die Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Vermeiden oder Behandeln von obstruktiver Arteriosklerose, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil die Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Unterdrücken von Entzündungen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil die Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Behandeln von Gehirninfarkt, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil die Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Behandeln oder Vermeiden von Restenose nach PTCA, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil die Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Unterdrücken von Plättchenaggregation, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil eine aliphatische Verbindung der Formel (III) oder ein Stereoisomer hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der aliphatischen Verbindung oder des Stereoisomers umfaßt:
worin A ein gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nH_(2n-2m)- darstellt, worin n eine Zahl von 4 bis 22 bezeichnet und m eine Unsättigungszahl darstellt, was eine Zahl von 0 bis 7 ist, l eine Zahl von 0 bis 10 darstellt, R eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann, und R^A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, worin der aktive Bestandteil (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(4-methylpiperazin-1-yl)docosahexaenoamid oder ein optisches Isomer hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Docosahexaenoamids oder des optischen Isomers ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Unterdrücken von Entzündungen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als aktiven Bestandteil eine aliphatische Verbindung der Formel (III) oder ein Stereoisomer hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der aliphatischen Verbindung oder des Stereoisomers umfaßt:
worin A ein gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nH_(2n-2m)- darstellt, worin n eine Zahl von 4 bis 22 bezeichnet und m eine Unsättigungszahl darstellt, was eine Zahl von 0 bis 7 ist, l eine Zahl von 0 bis 10 darstellt, R eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann, und R^A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin der aktive Bestandteil (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(4-methylpiperazin-1-yl)docosahexaenoamid oder ein optisches Isomer hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Docosahexaenoamids oder des optischen Isomers ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung beim Vermeiden oder Behandeln von Kreislaufkrankheiten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine aliphatische Verbindung der Formel (III) oder ein Stereoisomer hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der aliphatischen Verbindung oder des Stereoisomers umfaßt:
worin A ein gegebenenfalls substituiertes CH₃C_nH_(2n-2m)- darstellt, worin n eine Zahl von 4 bis 22 bezeichnet und m eine Unsättigungszahl darstellt, was eine Zahl von 0 bis 7 ist, l eine Zahl von 0 bis 10 darstellt, R eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann, und R^A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, die geradkettig oder verzweigt sein kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin die Kreislaufkrankheit obstruktive Arteriosklerose ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin die Kreislaufkrankheit Gehirninfarkt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin die Kreislaufkrankheit Restenose nach PTCA ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, worin der aktive Bestandteil (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(4-methylpiperazin-1-yl)docosahexaenoamid oder ein optisches Isomer hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Docosahexaenoamids oder des optischen Isomers ist.