WO2002102770A1 - Nouveau compose aliphatique, technique de synthese et technique d'utilisation - Google Patents

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WO2002102770A1
WO2002102770A1 PCT/JP2002/006067 JP0206067W WO02102770A1 WO 2002102770 A1 WO2002102770 A1 WO 2002102770A1 JP 0206067 W JP0206067 W JP 0206067W WO 02102770 A1 WO02102770 A1 WO 02102770A1
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acceptable salt
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PCT/JP2002/006067
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Tadakazu Tamai
Kazuyoshi Yoshikai
Masazumi Nishikawa
Kunio Ogasawara
Itsuki Murota
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Maruha Corporation
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    • C07D295/28—Nitrogen atoms
    • C07D295/32—Nitrogen atoms acylated with carboxylic or carbonic acids, or their nitrogen or sulfur analogues
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    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, attached to ring carbon atoms
    • C07D207/09—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical

Definitions

  • the present invention relates to novel aliphatic compounds, medicaments containing them, suppression of platelet aggregation, suppression of inflammation and their use in the prevention or treatment of cardiovascular diseases.
  • the platelets When the blood platelets come into contact with the subendothelial tissue after the vascular cells have been damaged and detached, the platelets in the blood cause adhesion and agglutination reactions, which lead to the formation of blood clots and thrombosis and other vascular disorders. cause.
  • platelet functions such as adhesion and aggregation functions
  • stimulants such as collagen, arachidonic acid, ADP, thrombin, serotonin, or epinephrine stimulate each receptor on the platelet membrane
  • stimulation is transmitted. It is thought that the glycoprotein complex GPI lb-IIIa on the membrane can bind to fibrinogen in the blood via the system, and platelets are cross-linked and aggregated.
  • antiplatelet drugs are those that act on stimulatory receptors and those that act on the stimulus transduction system (PG metabolism inhibitors, involved in cAMP metabolism ) And GPIIb-IIIa.
  • GPIIb-IIIa receptor antagonists block the end point of the above-mentioned platelet response, thus inhibiting any platelet response regardless of the cause of the platelet response.
  • conventional GPIIb / IIIa receptor antagonists The efficacy of a single dose is about 0.1 to 1 mg I kg by intravenous administration, which is not sufficiently strong.
  • the present inventors have conducted extensive research and as a result, have newly discovered a compound represented by the following general formula I or a stereoisomer thereof, and have newly discovered this compound (hereinafter, including its stereoisomer, including its stereoisomer).
  • the compound was found to exhibit a much stronger inhibitory effect on platelet aggregation than conventional GPIIb / IIIa receptor antagonists, and also to exhibit an anti-inflammatory effect.
  • This effort is based on this finding, and its purpose is to provide a novel aliphatic compound, a method for producing the same, and a medicament.
  • the present invention provides a compound of the general formula I
  • A is CH 3 C n H ( 2n- 1 2m )-(n is any integer between 4 and 22; m is an unsaturated number; 0 to 7 Which is any integer between).
  • R is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched, and R A is hydrogen. Or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched) or a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of the compounds of the present invention (compounds:! To 9) on platelet aggregation in a dose-dependent manner at i n V i t ro, similarly to indomethacin.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time of the action of the compound of the present invention (Compound 2) to suppress platelet aggregation in eXVivo.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the compound of the present invention (Compound 2) on platelet aggregation in a dose-dependent manner in eXvivo.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of the compound of the present invention (compound 5) on platelet aggregation in eXVivo.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the compound of the present invention (Compound 2) on inhibiting platelet aggregation by oral absorption.
  • FIG. 6 is a graph showing that in the case of administration of the compound of the present invention after induction of leg necrosis, the death score is improved in a peripheral circulation disorder model in a dose-dependent manner.
  • FIG. 7 is a graph showing that in the case of administration of the compound of the present invention before the induction of leg necrosis, the necrosis score is improved in a peripheral circulation disorder model in a dose-dependent manner.
  • Figure 8 shows that administration of an O / W emulsion of the compound of the present invention before leg necrosis induction improves the necrosis score in a peripheral circulation disorder model in a dose-dependent manner. It is rough.
  • FIG. 9 is a graph showing that the compounds of the present invention (Compounds 1 and 2) exert an inhibitory effect on the migration of neutrophils to vascular endothelial cells.
  • FIG. 10 is a graph showing that the compound of the present invention (Compound 2) improves cerebral infarction in a middle cerebral artery occlusion model.
  • FIG. 11 is a graph showing that the O / W emulsion preparation of the compound of the present invention suppresses intimal hyperplasia in a dose-dependent manner in a post-PTCA restenosis model.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of the compound of the present invention (Compound 2) on inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells in a concentration-dependent manner. '' Best mode for carrying out the invention
  • an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched include methyl, ethyl, monopropynole, isopropyl, —butyl, isobutyl, t ⁇ r ⁇ -butyl, sec-butyl, 1-pentynole, tert-amyl, 3-methylbutyl, neopentyl, —hexynole, n-heptyl, —octynole, —nonyl, 3-decyl And an alkyl group such as a group.
  • Optionally substituted CH 3 be C n H (2 n _ 2ra ) - " means a CH 3 C n H (2 n _ 2m) one having an optional substituent.
  • Examples of the optional substituent include a hydroxyl group, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, and an aryl group.
  • cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms include a cyclopropyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a hexyl group and a heptyl group.
  • aryl group examples include a phenyl group.
  • alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched are as described above.
  • Preferred embodiments of the compounds of the general formula I of the present invention include the following.
  • A—CONH— (CH 2 ) one preferred substitution position is carbon adjacent to N—R.
  • R is preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl and dibutyl, more preferably methyl and diethyl, and most preferably a methyl group.
  • R A is preferably hydrogen, but when R A is an alkyl group, it preferably has 1 to 6 carbon atoms, and more preferably has 1 to 4 carbon atoms.
  • a substitution position in the ring of R A is preferably a position that is not adjacent to N—R.
  • 1 is preferably any integer between 0 and 3.
  • n is preferably any integer between 6 and 22, and more preferably any integer between 14 and 22.
  • m is preferably any integer between 1 and 7, and more preferably any integer between 2 and 6.
  • the optional substituent of A preferably does not affect the solubility of the compound of formula I.
  • the substituent is alkyl, it is preferably one having a low molecular weight, for example, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and more preferably a methyl group.
  • Preferred substitution positions are those that are not adjacent to the amide bond, for example, positions 3 to 23, more preferably positions 3 to 20.
  • a preferred example of A having a substituent is, in the case of a derivative having a substituent 0H, the hydroxylation of docosahexaenoic acid (DHA) or the hydroxylation of eicosapentaenoic acid (EPA). Although it may be derived from a conductor, it is more preferably derived from a hydroxylated derivative of docosahexaenoic acid (DHA).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the configuration of the hydroxylated derivative may be in the (R) configuration or the (S) configuration.
  • DHA docosahexanoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • 12-OH-EPA eicosapentaenoic acid
  • the preferred compounds of the present invention include the following compounds, their optical isomers or their optical isomers. And pharmaceutically acceptable salts.
  • the stereoisomer in the present invention is meant to include any optical isomer of (R), (S) and racemate, and any geometric isomer of cis, trans and mixtures thereof. In geometric isomerism, cis is preferred.
  • the pharmaceutically acceptable salts in the present invention include, for example, salts with mineral acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, methanesulfone Acids and salts with organic acids such as benzenesulfonic acid.
  • mineral acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid
  • acetic acid such as acetic acid, oxalic acid
  • lactic acid tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, methanesulfone Acids and salts with organic acids such as benzenesulfonic acid.
  • salts such as hydrochloride, citrate and maleate are preferred.
  • the compound of the present invention can selectively inhibit platelet aggregation, particularly platelet aggregation induced by collagen. As shown in the results of the experiments described below, the compound of the present invention exhibited an inhibitory effect on platelet aggregation in ex vivo, which was lower than that of a conventional GPIIb / IIIa receptor antagonist. Stronger than the ones.
  • the compound of the present invention can suppress inflammation caused by inflammatory site such as TN Fa and PDGF.
  • the compound of the present invention can be used for preventing or treating cardiovascular diseases.
  • a circulatory disease refers to a disease in which the circulation state of blood and lymph is impaired, causing damage to tissues and cells, for various reasons such as platelet aggregation, inflammatory cytokines such as TNFa and PDGF. Includes everything that occurs. Examples include thrombotic, atherosclerotic or hyperlipidemic diseases.
  • thrombotic disease refers to a state in which blood vessels are obstructed by thrombus, and is classified into arterial thrombosis and venous thrombosis.
  • Arterial thrombosis is mainly caused by atherosclerosis, coronary thrombus causes myocardial infarction, and cerebral artery thrombus causes cerebral infarction.
  • Venous thrombosis includes superficial and deep vein thrombosis, for example, deep vein thrombosis.
  • Thrombotic diseases include, for example, unstable angina, myocardial infarction, infarction associated with a prosthetic valve, transplant vascular occlusion after coronary artery bypass surgery, transient ischemic attack, cerebral infarction, atherosclerotic peripheral artery Obstruction, erythromelalgia (thrombocythemia), thrombosis of hemodialysis shunt, exertional angina, reocclusion after PTCA, occlusion after vascular reconstruction surgery, etc. (“Thrombosis treatment” Medical Review, 1 The first edition was published on June 20, 1996, written by Yasuo Ikeda).
  • arteriosclerotic disease refers to a state in which the wall thickness of the artery is thickened and the elasticity is lost.
  • Arteriosclerosis includes three types: atherosclerosis, Monkeberg-type arteriosclerosis, and small arteriosclerosis.
  • Arteriosclerotic diseases include cerebral infarction and cerebral hemorrhage in the cerebral artery, ischemic heart disease such as myocardial infarction and angina in the coronary artery, aortic aneurysm, aortic aneurysm in the aorta, and renal sclerosis in the renal artery. This can lead to renal failure and peripheral artery sclerosis.
  • the hyperlipidemic disease refers to a condition in which serum cholesterol and / or triglyceride levels are increased, and examples thereof include hypercholesterolemia and hyperneutral lipidosis.
  • Each compound of the present invention can be administered orally or parenterally (injection, external preparation, suppository, etc.).
  • the dosage may range from about 0.000001 to about 100 mg I kg body weight / day, once or several times daily, more preferably from about 0.0001 to about 10 mg I kg body weight / day. A range of once or several times a day is preferred. This dose can be appropriately adjusted according to the type of disease, age, weight, and symptoms of the patient.
  • compositions are prepared by adding the compound of the present invention to conventional excipients, bulking agents, binders, disintegrants, pH regulators, dissolving agents, etc., and using conventional formulation techniques to produce tablets and pills. , Capsules, granules, powders, solutions, emulsions, suspensions, injections and the like.
  • Excipients and bulking agents include, for example, lactose, magnesium stearate, starch, talc, gelatin, agar, pectin, acacia, olive oil, sesame oil, liquor opater, ethylenedalicol, and others commonly used Can be raised.
  • an antioxidant such as tocopherol
  • the preparation can be encapsulated with an inclusion agent such as cyclodextrin, or the preparation can be encapsulated with a film such as gelatin.
  • the compound can be prepared as an OZW-type emulsion preparation (emulsion) using a phospholipid or a nonionic surfactant as an emulsifier as described in JP-A-6-298642.
  • the emulsifiers can be used alone or in combination of two or more. The addition amount may be appropriately determined, but is preferably 0.01 to 10% (W / V), preferably 0.01 to 5% (W / V). It is.
  • the phospholipids soybean-derived phospholipids, egg yolk-derived phospholipids, lysolecithin, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylserine and the like can be used alone or in combination.
  • non-surfactant examples include a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer having a molecular weight of 500 to 1500 (for example, Pluronic F-68), a molecular weight of 100 to 100; Polyalkylene glycol having a molecular weight of 100, a polyoxyalkylene copolymer having a molecular weight of 100 to 200, a hydrogenated castor oil polyoxyalkylene derivative, a castor oil polyoxyalkylene derivative, and glycerin.
  • Pluronic F-68 Pluronic F-68
  • a fatty acid ester, a polyglycerin fatty acid ester, a sorbitan fatty acid ester, a polyoxyethylene castor oil, a hydrogenated castor oil, a polyoxyethylene alkyl ether, a sucrose fatty acid ester and the like are preferably used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • the compound of the present invention can be produced as follows.
  • R is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched.
  • R A is hydrogen or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may be linear or branched.
  • Formula VIII compound A—C ⁇ 2 —R, [R, is hydrogen or carbon number :! Represents an alkyl group of from 4 to 4, wherein A is an optionally substituted CH 3 C n CH ( 2n—2 () — (n is any integer between 4 and 22; Which represents a saturation number and represents a force between 0 and 7 and an integer)] as a starting material.
  • the amine of formula VI as a starting material can be synthesized according to a conventional method.
  • the starting carboxylic acid or ester of the formula VIII can be synthesized according to a conventional method.
  • an ester it can be produced from the corresponding carboxylic acid or a salt thereof by a usual ester forming reaction.
  • the corresponding carboxylic acid or The salt can be synthetic or natural. Synthetic products are better in terms of economy, but natural products are preferable because they have less toxicity. Natural products include, for example, those separated and purified from fish and the like.
  • the method of introducing a substituent in the synthesis includes a method commonly used by those skilled in the art, for example, a method of introducing a substituent into a carboxylic acid or esterol of the formula VIII by a substitution or addition reaction.
  • the substituent is an alkyl group
  • CH 3 C n H - it can be introduced with an alkylating agent (2 n 2m) CO OH.
  • the substituent when it is an 0H group, it may be synthesized by hydroxylating naturally occurring DHA and fractionating it by HPLC or the like, and there is no particular limitation.
  • 10-200 mM DHA is added as a substrate to a suspension of cell lines derived from human leukocytes such as rainbow trout gill cells, epithelial cells, mammalian platelets, or RBL-1 at 1 to 50 ° C at 10 to 37 ° C. It can also be obtained by reacting for a minute.
  • each 0H derivative was extracted using an organic solvent (chloroform, methanol, ethyl acetate, acetonitrile, etc.). It can be fractionated by HPLC or thin-layer chromatography using a developing solvent (e.g., chloroform, methanol, ethyl acetate, acetonitrile, water, trifluoroacetic acid, etc.), but not limited to these methods. Absent. Also, each 0H derivative can be prepared by a selective synthesis method using a site-specific enzyme. 4-OH-DHA ⁇ 10-0H-DHA, 11-OH-DHA, 14-OH-DHA, 8-OH-DHA, and 17-OH-DHA (S-isomer) It is marketed by industry and can be obtained.
  • an organic solvent chloroform, methanol, ethyl acetate, acetonitrile, etc.
  • a developing solvent e.g., chloroform, methanol, ethyl
  • the amine of formula VI or the phenolic acid or esternole of formula VIII may be separated or used as dissolved in a solvent.
  • amidation method is not limited, it can be generally synthesized by a mixed acid anhydride method.
  • the following method is given.
  • the compounds of the present invention can be prepared by reacting a reactant of an amine of formula VI with a trialkylaluminum, especially (CH 3 ) 3 A1, with an ester of formula VI II.
  • a reactant of an amine of formula VI with a trialkylaluminum, especially (CH 3 ) 3 A1, with an ester of formula VI II.
  • the reaction is illustrated in detail using the following scheme (for convenience, where the ester of Formula VIII is not substituted with a substituent).
  • the formation reaction of the VII compound in the first step is carried out by reacting an amine of the formula VI (preferably an acid addition salt such as a hydrochloric acid salt) with (CH 3 ) 3 A1.
  • This reaction is preferably performed in an aromatic hydrocarbon solvent (eg, toluene, xylene, benzene) under cooling.
  • (CH 3 ) 3 A1 is preferably 0.5 to 5.0 equivalents to 1 equivalent of the VI compound.
  • the second step is carried out by reacting the VIII conjugate obtained in the first step with an ester of the formula VIIII.
  • This reaction is preferably performed in an aromatic hydrocarbon solvent (eg, toluene, xylene, benzene) under heating.
  • the reaction temperature is 40-70. C is preferred.
  • the reaction temperature preferably does not exceed about 70 ° C., as the product is liable to decompose.
  • the reaction time is preferably 1 to 5 hours.
  • ester of the formula VIII I is 0.5 to 5 equivalents to 1 equivalent of the VII compound.
  • a carboxylic acid of formula VI II A—CO—OH [A is an optionally substituted CH 3 C n H ( 2n ⁇ 2m ) — (n is any integer between 4 and 22, and m is Represents an unsaturated number, and is an integer between 0 and 7).
  • the compound of the present invention can also be obtained by reacting
  • Step 1 above The reaction to form an acid chloride by the reaction of the carboxylic acid of formula VIII with (COC 1) 2 is performed in an aromatic hydrocarbon solvent (eg, toluene, xylene, benzene) under cooling. Is preferred. At this time, for one equivalent of the carboxylic acid of the formula VIII: A—CO—OH, (COC 1) 2 is: It is preferably from 5 to 5 equivalents.
  • an aromatic hydrocarbon solvent eg, toluene, xylene, benzene
  • Second step The reaction between the acid chloride obtained in the first step and the amine of the formula VI is carried out in a chlorocarbon solvent (for example, dichloromethane, chloroform) or an aromatic carbon solvent. (Eg, toluene, xylene, benzene).
  • the reaction temperature is preferably 15 to + 5 ° C.
  • the reaction temperature does not exceed about + 5 ° C, as the product is prone to decomposition.
  • the reaction time is preferably 0.5 to 5 hours.
  • the amount of the amine of the formula VI is preferably 1 to 5 equivalents relative to 1 equivalent of the acid chloride.
  • the compound of the present invention can be isolated and purified according to a conventional method (filtration, solvent extraction, recrystallization, reprecipitation, chromatography, or the like), if necessary.
  • the stereoisomer can be a stereochemically pure isomer by selecting an appropriate raw material or, in the case of a mixture of stereoisomers, by chromatography or racemic resolution.
  • Example 1 Synthesis of (4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) — N _ (4-methylbiperazine-1 1 —inole) docosahexaconamide (Compound 1)
  • 0.84 ml of a 15% Me 3 Al solution in n-hexane is mixed with 1.34 ml of toluene dried using MS 4A, and cooled in an ice-methanol bath while cooling 2- (3-aminopropyl) 1-1 in 0.6 ml of toluene.
  • 2-(2-aminopropyl) 1-1 in 0.6 ml of toluene.
  • -0.167 g of methylpyrrolidine was added dropwise over about 1 minute (internal temperature-15 ° C). After stirring for 20 minutes, the temperature was raised to 20 ° C., and 0.6 ml of toluene of 0.42 g (1.2 mmol) of DHA ethyl ester was added dropwise (internal temperature: 20 ° C.).
  • Ph 3 P (5.04 g, 19.2 mmol) was added to a solution of the above mixture (2.48 g) in CH 3 CN (60 ml), and then CBr 4 (6.37 g, 19.2 mmol) in CH 3 CN (15 ml) was added under ice cooling. The solution was added dropwise, followed by stirring at room temperature for 15 hours. The reaction liquid was condensed under reduced pressure, the residue was purified on silica gel force column chromatography (Si0 2 150 g, AcOEt) to (5 ⁇ -5- (Puromomechinore) - 1 - methylpyrrolidin - 2-one (2.68 g, 98 , 5%).
  • Raney- ⁇ (1.5 ml) was added to a solution of 2-((2v3 ⁇ 4-1-methinole-5-thioxopyrrolidine-2-yl) ethanenitrile (1.36 g, 8.8 mmol) in EtOH (30 ml) and added for 24 hours.
  • the mixture was heated to reflux (the raw material did not completely disappear by TLC), the inorganic matter was removed by filtration, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was removed.
  • Compound 2-MS An OZW emulsion preparation of Compound 2 (Compound 2-MS) was prepared as follows. 6.0 g of purified egg yolk lecithin and 50.0 mg of compound 2 were added to 50.0 g of purified soybean oil, and dissolved by heating at 40 to 45 ° C. After adding 11.5 mg of glycerin to the Japanese Pharmacopoeia, the total amount was made up to 500 ml with distilled water for injection, and the mixture was subjected to coarse milking using a homomixer. This was passed five times using a Menton-Gaulin type homogenizer under a pressure of 600 kg / cm 2 to perform fine emulsification. This resulted in a very fine, homogenized compound 2-MS formulation.
  • Physiological saline was used as a negative control.
  • the aggregation inhibition curve is shown in FIG.
  • IC 5 the 50% P stopping point for platelet aggregation. are shown in Table 1 below.
  • n of C n H ( 2n- 1m ) is any integer between 6 and 20, and the number of unsaturations m is any one between 0 and 6. It was confirmed that the platelet with an integer of ⁇ ⁇ ⁇ had a platelet aggregation inhibitory action. In vitro platelet aggregation by various inducers.
  • the preparation of the aggregation inducer was performed as follows.
  • Collagen and ADP were purchased from MCM and used according to the attached preparation method.
  • Serotonin, epinephrine, and thrombin were purchased from Sigma and dissolved in saline for injection (Otsuka Pharmaceutical Factory).
  • Arachidonic acid was purchased from Cayman and dispersed in saline for injection (Otsuka Pharmaceutical Factory) using a throw-in type ultrasonic oscillator (Nippon Seiki US150, tip tip ⁇ 3.5 thigh).
  • U46619 simulated tropoxane was purchased from Funakoshi Co., Ltd. and dissolved in saline for injection (Otsuka Pharmaceutical Factory).
  • Collagen (0.1 to: 1 ⁇ g Zm 1), arachidonic acid (l mM), ADP (1 x M), thrombin (1 U / m 1), serotonin (100 / M), epinephrine (100 0-200 ⁇ M) and U46661 (3 ⁇ ⁇ ) were used.
  • Compound 2 was used as a test drug.
  • indomethacin was used, and the inhibition of platelet aggregation induced by collagen was measured.
  • Blood was collected from each of the forearm veins of the volunteers using an 18G needle at a rate of 10 ml per person. Blood was gently dropped into a 15. ml Falcon tube containing 1 ml of 3.8% sodium taenoate (Yamanouchi Pharmaceutical, Chitral), and the lid was closed. After that, the blood was centrifuged at room temperature for 10 minutes at 900 rpm, and the supernatant (multiple platelet fraction, platelet rich plasma, PRP) was collected. The residue was further centrifuged at 2,500 rpm for 15 minutes to obtain a supernatant (platelet poor fraction, platelet poor plasma, PPP). The platelet density of PRP was measured with a hemocytometer (Sysmec Corporation) and diluted with PPP to adjust the platelet density to 300,000 / 1.
  • a hemocytometer Sysmec Corporation
  • the preparation of the aggregation inducer was performed in the same manner as described above.
  • the dose of the inducer was determined for each experiment.
  • the concentration of the inducer was set for each experiment.
  • alpha-granules (PDGF, serotonin, ADP, etc.) released from activated platelets are triggered following primary aggregation, and secondary aggregation occurs again. proceed. This time, ADP or Epinephrine The effect of the test substance on the secondary agglutination due to is also investigated.
  • Serotonin alone is unlikely to cause platelet aggregation. Therefore, a combination of serotonin + collagen or serotonin + ADP was used as an inducing substance.
  • the doses were determined for each experiment with doses that did not induce aggregation of each substance alone, and doses that did not induce aggregation were set and used in combination. For example, if serotonin alone causes 1 mM but hardly causes 0.5 mM, whereas ADP alone causes 0.25 mM but not 0.11 ⁇ , serotonin 0.25 mM + ADP 0.05 mM was set.
  • test substance was Compound 2, and the preparation was performed in the same manner as described above.
  • the transmittance was measured in the same manner as described above.
  • SD male rats (SPF, 8 weeks old) Administer 1 Omg / kg of compound 2 to the tail vein, collect blood at 10 minutes, 30 minutes, and 1 hour after administration, and collect the prepared platelets. Using this, the aggregation rate when platelet aggregation was induced with 0.3 to 6 ⁇ g / ml of collagen was examined. As a control group, the agglutination rate of those to which a solvent (physiological saline) was administered was measured. Preparation of platelets and measurement of the aggregation rate were performed in the same manner as in Test Example 1.
  • Platelet aggregation was suppressed at 10 minutes, 30 minutes and 1 hour after administration of Compound 2 compared with the vehicle administration group, but the effect was observed at 10 minutes or 30 minutes after administration. 1 hour after intravenous administration, platelet aggregation was more strongly suppressed. Therefore, the measurement points in the following experiments were set one hour later.
  • Rats were dosed with 1, 0.1, 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003, or 0.0001 mg / kg of Compound 2 in the tail vein. Blood was collected 60 minutes later, and platelet aggregation was induced with 4-7 ⁇ g / ml collagen using the prepared platelets. Preparation of platelets and measurement of the aggregation rate were performed in the same manner as in Test Example 1.
  • Platelet aggregation was suppressed in the compound 2 administration group at 1, 0.1, 0.011, or 0.001 mg / kg as compared with the vehicle administration group. In the group administered with 0.0001 mg I kg, platelet aggregation was suppressed in the induction of collagen at a low concentration of 4 ⁇ g / ml, although platelet aggregation was suppressed as compared with the group administered with the solvent.
  • Fig. 4 shows the results.
  • Compound 5 was also found to inhibit platelet aggregation.
  • the effect of ex vivo inhibition of platelet aggregation shown in this example is compared with that of in vitro.
  • IC 5 obtained in ex vivo experiments.
  • a value of 630 ng / kg can be inferred to be the dose at which the blood concentration of compound 2 reaches 26 nM, if the rat blood volume is estimated to be approximately 60 ml I kg.
  • This value is IC 5 in vitro. It is more dilute than the value of 2, 1 ⁇ 0.8 ⁇ M, which means a low concentration of about 1/80.
  • the action of ex vivo inhibition of platelet aggregation is not limited to simply inhibiting platelet aggregation by the compound of the present invention, for example, suppressing the interaction between neutrophils and platelets involved in platelet aggregation.
  • the compound of the present invention is metabolized, and the metabolite exerts an effect on platelets while platelet aggregation is strongly suppressed in the body.
  • a single oral dose of 10, 2 or 0.1 mg / kg of compound 2 was given to rats using a probe.
  • a solvent physiological saline
  • the survival rate of the compound 2 administration group was 7/10
  • the compound 2 showed a higher survival rate than the solvent group.
  • a rat rat phosphate-induced peripheral circulatory disorder model which is widely used as a peripheral circulatory disorder model, was used.
  • the single dose of Compound 2 was set to 10 ⁇ g / kg, 30 ⁇ g / kg or 100 ⁇ g / kg, and it was examined whether dose necrosis was improved in a dose-dependent manner.
  • a vehicle physiological saline
  • the test was performed in the same manner as in (1) above. However, administration of Compound 2 was started 1 hour before lauric acid treatment, then administered 6 hours after lauric acid administration, and repeated once a day for 14 days. As a control, a solvent (physiological saline) was similarly administered.
  • Figure 7 shows the results. It was shown that Dangidou 2 improved the leg death score in a dose-dependent manner.
  • Example 14 the compound 2-MS prepared in Example 14 (single dose: 100 / g / kg as active ingredient) was used, and Palux (registered trademark) (Lipo PG El, Taisho) was used as a positive control.
  • Palux registered trademark
  • Lipo PG El, Taisho a positive control.
  • Pseudovascular in vitro inflammation model was performed according to the method described in Biopharmaceutical Science Laboratory Course, 12 Inflammation and Allergic Diseases, li p. 327-341 (edited by Kazuo Oozaki, Hirokawa Shoten, published May 15, 1993). Created.
  • transwell manufactured by Krabo
  • a transwell manufactured by Krabo
  • a porous polycarbonate membrane with a pore size of 3 ⁇ m
  • one layer of calcium endothelial cells was attached to the bottom of the membrane, and the temperature was adjusted to 37 ° C. 5% C0 2 under the conditions, and incubated for 80 minutes.
  • a fluorescently labeled neutrophil suspension is added to the upper chamber of the transfer well, and at the same time, TN Fa is added to the cell suspension in the upper chamber to a final concentration of 50, 25 or 17 ng / ml. Suspended.
  • neutrophils penetrating from the upper chamber through the vascular endothelial cell layer and penetrating to the lower chamber, and adhering to the endothelial cell layer are favorable in response to TNFo! It mimics the movement of neutrophils from blood vessels to inflamed sites.
  • Both Compound 1 and Compound 2 inhibited neutrophil penetration in a concentration-dependent manner.
  • both Compound 1 and Compound 2 act to suppress the interaction between neutrophils and vascular endothelial cells, and may act in the direction of anti-inflammatory. Since Compound 1 or 2 acts anti-inflammatory, it is considered that Compound 1 or 2 may maintain the circulatory organ homeostasis and act in the direction of improving the disease state.
  • Rats were intravenously injected with Rose Bengal dye (20 mg / kg), and the middle cerebral artery was irradiated with green laser light (wavelength 540 nm) for 10 minutes to induce arterial occlusion by reactive oxygen species.
  • Compound 2 was intravenously administered after the end of laser light irradiation.
  • the dose of Yidani Compound 2 was 1 mg / kg, and it was examined whether cerebral infarction was improved.
  • a solvent physiological saline
  • Transected sections (1 thigh thickness) of the excised brain were prepared and immersed in trifenyltetrazolium, and the living tissues were stained red. Since the infarcted area became white and could be clearly distinguished from the living tissue, the infarcted area was measured, and the infarcted area ratio (the ratio of the infarcted area to the cross section of the brain) was used for evaluation.
  • a rat carotid intimal hyperplasia model which is widely used as a restenosis model after PTCA, was used.
  • the tip of a balloon catheter (Fogty catheter 2 Fr, Butterstar) was inserted from the rat large J9 retreated artery and guided to the carotid artery. Air (0.3 mL) was injected into the balloon, and the balloon was inflated. With the balloon inflated, the Nolan catheter was withdrawn to the aortic arch and the carotid intima was injured three times.
  • the OZW-type emulsion (Compound 2-MS) of compound 2 prepared in Example 14 was administered intravenously once a day, and 2 weeks after the intimal injury. Repeated intravenous administration once a day.
  • the single dose of Compound 2-MS was set to 100 // g I kg or 300 y g I kg (each as an active ingredient), and the ability to suppress intimal hyperplasia in a dose-dependent manner was examined.
  • a negative control a compound containing no! /! OZW emulsion was administered.
  • enalapril Sigma was used as a positive control, and 30 mg / kg was orally administered once a day in the same manner as described above.
  • Intimal thickening was assessed 2 weeks after injury. Hematoxylin-Eosin (HE) staining was performed on the excised cross section of the carotid artery, and the vascular lumen area, the area surrounded by the inner elastic plate, and the area surrounded by the outer elastic plate were measured. Neointimal area (area surrounded by inner elastic plate-area of blood vessel lumen) Intima using ratio to media area (area surrounded by outer elastic plate-area surrounded by inner elastic plate) Thickening was evaluated.
  • HE Hematoxylin-Eosin
  • test substance The effect of the test substance on vascular smooth muscle cell proliferation was examined.
  • vascular smooth muscle cells With the progression of atherosclerosis, vascular smooth muscle cells are transformed from contractile to synthetic, and vascular smooth muscle cells proliferate while secreting inflammatory cytokines such as PDGF. (Loss's hypothesis).
  • Vascular smooth muscle cells prepared by the Explant culture method were cultured in a DMEM medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum, subcultured several times and stabilized, and then 5 ⁇ 10 3 cells / cm 2 The cells were seeded at a cell density of 5% and used for the experiment.
  • Compound 2 was added to the above cells in combination with 50 ng / ml of growth factor PDGF (Sigma), and 24 hours later, BrdU Atssei (Science '82, 218, p. 474, Cytometry, 85, 6, p. 584) The cell density was measured by As a control, the cell density was measured when no drug was added.
  • Relative smooth muscle cell number% [cell number in experimental group] I [cell number in control] x 100
  • the compounds of the present invention can strongly inhibit platelet aggregation (particularly, platelet aggregation induced by collagen), can suppress inflammation, and can prevent cardiovascular diseases (eg, thrombotic diseases, arteriosclerosis). Disease or hyperlipidemic disease).
  • platelet aggregation particularly, platelet aggregation induced by collagen
  • cardiovascular diseases eg, thrombotic diseases, arteriosclerosis. Disease or hyperlipidemic disease.

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Description

明細書 新規脂肪族化合物、 合成方法、 利用方法 技術分野
本発明は新規脂肪族化合物、 これを含有する医薬、 血小板凝集の抑制、 炎症の 抑制ならぴに循環器系疾患の予防もしくは治療におけるこれらの使用とに関する。 背景技術
血液中の血小板は、 血管內皮細胞が傷害され剥離したあとの内皮下組織に接触 すると、 そこで粘着、 凝集反応をおこし、 この反応は血栓の形成をもたらし、 血 栓症をはじめとした血管障害を引き起こす。
そこで、 このような疾患の予防及び治療において、 血小板機能を解明し、 血小 板凝集をレヽかに抑制することがよいかを考えることが重要である。
現在、 血小板機能のうち粘着及び凝集機能に関しては、 コラーゲン、 ァラキド ン酸、 ADP、 トロンビン、 セロトニン、 或いはェピネフリンなどの刺激物質が血 小板膜上のそれぞれの受容体に刺激を与えると、 刺激伝達系を介して膜上の糖タ ンパク複合体 G P I l b— I I I aが血液中のフイブリノ一ゲンと結合すること ができるようになり、 血小板が互いに架橋され凝集することになると考えられて いる。
上記刺激剤として働くものの作用に関しては いまだ不明な点が多いが コラ 一ゲンを含む各種の刺激は、 フォスフォリパーゼ A 2の活性ィ匕によりリン脂質か らァラキドン酸を生成し、できたァラキドン酸はシクロォキシゲナーゼ (C O X) によってプロスタグランジン（P G) G 2と P GH2へ、さらにトロンボキサン（T X) A2へと代謝されることが考えられている。
また、 上記刺激剤の作用に相違があり、 例えば、 ェピネフリンとコラーゲン以 外の血小板への刺激は細胞外から C aィオンを流入させ、 C a貯蔵顆粒から C a イオンを動員することによって細胞内 C aイオン濃度を上昇させ、 G P I l b— I I I aの構造変化と収縮タンパクの収縮を起こし、 血小板凝集と放出反応を惹 起することが認められているが、 一方、 コラーゲンにはそのような反応は認めら れていない。
このような血小板機能の発現機構の点で、 現在開発されている抗血小板薬は、 刺激受容体に作用するもの、 刺激伝達系に作用するもの （P G代謝系阻害薬、 c AMP代謝に関与するもの）、 G P I I b— I I I aに作用するものに分類されて いる。
G P I I b— I I I a受容体拮抗薬は、 上記血小板反応の終末点を阻害するの で、 血小板反応の原因に関係なくあらゆる血小板反応を阻害するが、 その一方、 従来の GPIIb/IIIa受容体拮抗薬の効力は、 単回投与の有効用量は静脈内投与で 0, 1〜1 mg I kg程度であり十分強いと,はいえない。
従って、 血小板凝集を強く抑制する抗血小板薬が望まれている。
発明の開示
本発明者らは、 上記の点に鑑み、 銳意研究を行った結果、 下記一般式 Iで示さ れる化合物若しくはその立体異性体を新たに発見し、 この化合物 （以下、 その立 体異性体を含めて 「本発明化合物」 という） 力 従来の GPIIb/IIIa受容体拮抗薬 より非常に強い血小板凝集の抑制作用を示し、 さらに抗炎症作用を示すことを見 出した。 本努明はこの知見に基づくものであり、 その目的は、 新規な脂肪族化合 物、 その製造方法及び医薬を提供する事にある。
本発明は、 一般式 I
R
Figure imgf000004_0001
(式中、 Aは、 置換されてもよい CH 3 C nH (2 n一 2 m)― (nは 4から 2 2の間のいずれ かの整数であり、 mは不飽和数を表し、 0から 7の間のいずれかの整数である） を表し、
1は 0から 1 0の間のいずれかの整数であり、 sは 0または 1であり、 sが 0の 場合は p + q = 4若しくは 5であり、 sが 1の場合は p + q = 3若しくは 4である 力 いずれの場合も pか qのいずれかが 1以上の整数である、 Rは炭素数 1〜1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基であり、 RAは水素または炭素数 1〜 1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基である） で表される脂肪族化合物若しく はその立体異性体、 またはそれらの製薬学的に許容される塩に関する。
(上記式 Iにおける Aの定義の C H 3 C nH (2 n_2m)一の不飽和結合の位置に関し ては、 アミド結合 NH C Oの" の位置を 1とし、 隣の炭素に順番に 2， 3 , 4 …と番号をつけて位置を示し、 以下の説明に用いる。）
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明化合物 （化合物：！〜 9 ) がインドメタシンと同様に i n V i t r oで用量依存的に血小板凝集を抑制する作用を示すグラフである。
図 2は、 本発明化合物 （化合物 2 ) が e X V i v oで血小板凝集を抑制する作 用の経時的変化を示すグラフである。
図 3は、 本発明化合物 （化合物 2 ) が e X v i v oで用量依存的に血小板凝集 を抑制する作用を示すグラフである。
図 4は、 本発明化合物 （化合物 5 ) が e X V i v oで血小板凝集を抑制する作 用を示すグラフである。
図 5は、 本発明化合物 （化合物 2 ) が経口吸収により血小板凝集を抑制する作用 を示すグラフである。
図 6は、 脚壊死誘発後本発明化合物投与の場合、 末梢循環障害モデルにおいて壌 死スコアが用量依存的に改善されることを示すグラフである。
図 7は、 脚壊死誘発前本発明化合物投与の場合、 末梢循環障害モデルにおいて壊 死スコアが用量依存的に改善されることを示すグラフである。
図 8は、脚壊死誘発前本発明化合物の O/W型ェマルジョン製剤を投与した場合、 末梢循環障害モデルにおいて壊死スコアが用量依存的に改善されることを示すグ ラフである。
図 9は、 本発明化合物 （化合物 1及ぴ 2 ) 力 好中球の血管内皮細胞への移動に 抑制的に作用していることを示すグラフである。
図 1 0は、 本発明化合物 (化合物 2 ) が中大脳動脈閉塞モデルにおいて脳梗塞を 改善することを示すグラフである。
図 1 1は、 本発明ィヒ合物の O/W型ェマルジョン製剤が P T C A後再狭窄モデル において用量依存的に血管内膜肥厚を抑制することを示すグラフである。
図 1 2は、 本発明化合物 (化合物 2 ) が濃度依存的に血管平滑筋細胞増殖の抑制 作用を示すグラフである。 ' 発明を実施するための最良の形態
本発明化合物の式 Iにおける定義について説明する。
「炭素数 1力 ら 1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基」の具体例としては、 メチル基、 ェチル基、 一プロピノレ基、 イソプロピル基、 —ブチル基、 イソブ チル基、 t β r ί一ブチル基、 s e c—プチル基、 一ペンチノレ基、 t e r t— アミル基、 3—メチルプチル基、ネオペンチル基、、 —へキシノレ基、 n—へプチ ル基、 —ォクチノレ、 —ノニル基、 3—デシル基などのアルキル基があげられ る。
「置換されてもよい C H3 C nH (2 n_2ra)—」 とは、 任意の置換基を有する CH 3 C nH (2 n_ 2m)一を意味する。
任意の置換基の例としては、 水酸基、 ハロゲン原子、 炭素数 1から 1 0の直鎖 でも分枝鎖でもよいアルキル基、 炭素数 3から 7のシクロアルキル基、 ァリール 基があげられる。
「炭素数 3から7のシクロアルキル基」 の具体例としては、 シクロプロピル基、 シク口ブチル基、 シク口ペンチル基、 シク口へキシル基およぴシク口へプチル基 などがあげられる。 .
「ァリール基」 の具体例としては、 フエニル基などがあげられる。
「炭素数 1から 1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基」 の具体例は、 上記の 通りである。 本発明の一般式 Iの化合物に関して、 好ましい態様としては、 以下のものがあ げられる。
p及ぴ qは、 p = q = 2が好ましい。
本発明は、 前記一般式 Iの化合物が下記の一般式 I Iの化合物である化合物を 提供する （本化合物は、 一般式 I中 s = 0、 p = q = 2に相当する）。
一般式 I I
Figure imgf000007_0001
(式中 R、 RA、 A、 1は式 Iの記号の字義と同一である。）
上記一般式 I Iにおいて、 A— C O NH— (CH 2) ,一の好ましい置換位置は、 N— Rに隣接する炭素である。 本発明は、 前記一般式 Iの化合物が下記の一般式 I I Iの化合物である化合物 を提供する （本ィヒ合物は、 一般式 I中 s = l、 p = q = 2に相当する）。
一般式 I I I
Figure imgf000007_0002
III
(式中 R、 RA、 A、 1は式 Iの記号の字義と同一である。） 上記一般式 I I Iにおいて、 A— CONH— (CH2) ,—の好ましい置換位置 は、 ピぺラジン環の窒素原子である。 本発明の一般式 I~I I Iの化合物において、 好ましい態様は以下のものがあ げられる。
Rは、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル及ぴブチルが好ましく、 メチ ル及ぴェチルがさらに好ましく、 メチル基が最も好まし 、。
RAは、 水素が好ましいが、 RAがアルキル基の場合は、 好ましくは炭素数 1〜 6であり、 さらに好ましくは炭素数 1〜4である。 また、 RAの環における置換 位置ほ N— Rに隣接しない位置が好ましい。
1は、 好ましくは、 0から 3の間のいずれかの整数である。
nは、 好ましくは、 6から 22の間のいずれかの整数であり、 より好ましくは、 14力 ら 22の間のいずれかの整数である。
mは、好ましくは、 1から 7の間のいずれかの整数であり、 より好ましくは、 2から 6の間のいずれかの整数である。
Aの好ましい例は、 ドコサへキサェン酸 （n = 20、 m= 6) やエイコサペン タエン酸 （n=18、 m=5) に由来するものであるが、 これに限定されない。
Aの定義の CH3CnH (2n_2m)一の不飽和結合の位置に関しては、 n = 16の 場合には、位置 9、 12、 15であり、 n= 18の場合には、位置 5、 8、 11、 14、 17であり、 n = 20の場合には、 位置 4、 7、 10、 13、 16、 19 が好ましい。
Aの任意の置換基は、 式 Iィ匕合物の溶解度に影響を与えないものが好ましい。 置換基がアルキルの場合は、 分子量が小さいもの、 例えば、 炭素数 1〜4のアル キル基が好ましく、 さらに好ましくは、 メチル基である。
好ましい置換位置はァミド結合に近接しない位置であり、 例えば、 位置 3から 2 3、 さらに好ましくは位置 3から 20である。
置換基を有する Aの好ましい例は、置換基 0Hを有する誘導体の場合、 ドコサへ キサェン酸 (DHA) の水酸化誘導体又はエイコサペンタエン酸 （EPA) の水酸化誘 導体由来があげられるが、 ドコサへキサェン酸（DHA) の水酸化誘導体由来がより 好ましい。 水酸化誘導体の立体配置は （R) 配置でも （S ) 配置でも構わない。
ドコサへキサェン酸 （DHA) の水酸化誘導体の例は 4 - OH - DHA、 10 - OH - DHA, 11 - OH - DHA、 14 - OH - DHA、 8 - OH - DHA、 および 17 - OH - DHAがあげ られるが、 これに限定されない。
エイコサペンタエン酸 （EPA) の水酸化誘導体の例は 12 - OH - EPAがあげられ るが、 これに限定されない。 （上記水酸化誘導体： J. W. Karanian et al. , The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (1994) 270, 1105 - 1109 本発明化合物の好ましレヽ化合物には以下の化合物、 その光学異性体 たはそれ らの製薬学的に許容される塩があげられる。
(4Z, 11, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) - N - [ 2—（ 1 -メチルピロリジン- 2 -ィル) ェチル] ドコサへキサェンアミ ド
(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z， 19Z) — N— ( 4 ― メチルピペラジン一 1—ィル） ド コサへキサェンアミ ド
N - [ 2 - ( 1 一 メチルピロリジン- 2 -ィル）ェチル]力プリルアミド
N - [ 2—（ 1 - メチルピロリジン- 2 -ィル）ェチル] ミリスチンァミド
9Z- N 一 [ 2 - ( 1 一 メチルピロリジン— 2 -ィル）ェチル]ォレインアミド (9Z, 12Z) - N - [ 2—（ 1 - メチルピロリジン- 2 -ィル）ェチル]リノールァミ ド、
(9Z, 12Z, 15Z) - N - [ 2—（ 1 一 メチルピロリジン一 2 -ィル)ェチル]リノレン アミド
(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) - N - [ 2— ( 1 一メチノレピロリジン - 2 -ィル）ェチル]ェ ィコサペンタエンアミ ド
(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) — N — [ 2—（ 1 一メチルピロリジン— 2 -ィル) メチノレ] ドコサへキサェンアミド及ぴ
(4Z, 11, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) — N— [ 3—（ 1 一メチノレピロリジン - 2 -ィル) プロピル] ドコサへキサェンァミド
本発明化合物のさらに好ましい化合物は以下のものである。 式 I Vの （4Z， 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) - N - ( 4 - メチルビペラジン一 1一 ィル） ドコサへキサェンアミド、 その光学異性体またはそれらの製薬学的に許容 される塩及ぴ
Figure imgf000010_0001
式 Vの（4Z, 11, 10Z, 13Z， 16Z, 19Z) - N — [ 2— ( 1 —メチルピロリジン— 2 - ィル） ェチル] ドコサへキサェンアミドまたはその光学異性体 （例えば、 2 S体、 2 R体） またはそれらの製薬学的に許容される塩
Figure imgf000010_0002
本発明における立体異性体とは、 （R)、 （S )及びラセミ体のいずれの光学異性、 並びにシス、トランス及ぴその混合物のいずれの幾何異性を含むことを意味する。 幾何異性では、 シスが好ましい。
また、 本発明におけるその製薬学的に許容しうる塩とは、 例えば硫酸、 塩酸、 リン酸などの鉱酸との塩、 酢酸、 シユウ酸、 乳酸、 酒石酸、 フマール酸、 マレイ ン酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などである。 この中で塩酸塩、 クェン酸塩、 マレイン酸塩などの塩が好ましい。
本発明化合物は血小板凝集、 特にコラーゲンによって惹起される血小板凝集を 選択的に抑制することができる。 後述の実験の結果に示されるように、 本発明化 合物は、 ex vivoでの血小板凝集抑制効果が、 従来の GPIIb/IIIa受容体拮抗薬の ものより強い。
また、 本発明化合物は、 TN F a、 P D G Fなどの炎症性サイト力インによつ て引き起こされる炎症を抑制することができる。
本発明化合物は、 循環器系疾患を予防または治療するために用いることができ る。
ここで、 循環器系疾患とは、 血液およびリンパの循環状態が障害され、 組織や 細胞に障害をおこしている疾患をいい、 血小板凝集、 T N F a , P D G Fなどの 炎症性サイトカインなど種々な原因で生じるものすベて包含する。 例としては、 血栓性疾患、 動脈硬化性疾患または高脂血疾患があげられる。
ここで、 血栓性疾患とは、 血栓によって血管が閉塞した状態をいい、 動脈血栓 症及び静脈血栓症に分けられる。動脈血栓は、主として動脈硬化に合併して生じ、 冠状動脈の血栓は、 心筋梗塞の原因となり、 また、 脳動脈の血栓は、 脳梗塞の原 因となる。 静脈血栓症は、 表在静脈や深部静脈の血栓症があり、 例えば、 深部静 脈血栓症があげられる。
血栓性疾患とは、 例えば、 不安定狭心症、 心筋梗塞、 人工弁に伴う梗塞症、 冠 動脈パイパス術後の移植血管閉塞、 一過性脳虚血発作、 脳梗塞、 動脈硬化性末梢 動脈閉塞、肢端紅痛症（血小板血症)、血液透析シャントの血栓、労作性狭心症、 PTCA後の再閉塞、 血管再建術後の閉塞など （「血栓症治療」 メディカルレビュー 社発行、 1 9 9 6年 6月 2 0日第 1版発行、 池田康夫著） があげられる。
ここで、 動脈硬化性疾患は、 動脈壁力 S肥厚し、 弾性を失った状態をいい、 動脈 硬化には、 ァテローム （粥状） 硬化、 メンケベルグ型動脈硬化、 細小動脈硬化の 3型がある。動脈硬化性疾患には、脳動脈では、脳梗塞及び脳出血、冠動脈では、 心筋梗塞や狭心症などの虚血性心疾患、 大動脈では、 大動脈瘤、 大動脈解鱸、 腎 動脈では、 腎硬化症や れによる腎不全、 末梢動脈では閉塞性動脈硬化症があげ られる。
ここで、 高脂血性疾患とは、 血清コレステロールおよび、 ないしはトリグリセ リ ド値が增加した病態をいい、 例えば、 高コレステロール症や高中性脂質症があ けられる。 本発明に於ける各ィ匕合物は経口または非経口 （注射剤、 外用剤、 坐剤など） で 投与することができる。 その投与量は、 約 0. 000001〜約 100 mg I kg体重/日を 1日 1回又は数回の範囲が好適である力 更に好ましくは、約 0. 0001〜約 10 mg I kg体重/日を 1日 1回又は数回の範囲が好適である。 この投与量は疾患の種類、 患者の年齢、 体重、 症状により適宜増減することができる。
本発明の化合物を医薬として用いるためには、 固体組成物、 液体組成物および その他の組成物のレ、ずれの形態でもよく、必要に応じて最適のものが選択される。 医薬組成物は、本発明の化合物を常用の賦形剤、 増量剤、 結合剤、崩壊剤、 pH調 節剤、 溶角爭剤、 などを添加し、 常用の製剤技術によって、 錠剤、 丸剤、 カプセル 剤、 顆粒剤、 粉剤、 液剤、 乳剤、 懸濁剤、 注射剤などに調製することができる。 賦形剤、 増量剤としては、例えば、乳糖、 ステアリン酸マグネシウム、デンプン、 タルク、 ゼラチン、 寒天、 ぺクチン、 アラビアゴム、 ォリーブ油、 ゴマ油、 力力 ォパター、 エチレンダリコールなどやその他常用されるものをあげることができ る。
製剤の酸ィ匕を防止するためには、 酸化防止剤 （トコフエロール等） を添加した り、 シクロデキストリン等の包接剤で包接したり、 ゼラチン等の皮膜でカプセル 化することができる。
更に、 前記化合物を、 乳化剤としてリン脂質あるいは非イオン界面活性剤を用 いて、 OZW型ェマルジョン製剤 （乳剤） として、 特開平 6— 2 9 8 6 4 2に記 载のように調製することができる。 乳化剤は、 単独あるいは 2種以上組み合わせ て使用でき、 添加量は、適宜でよいが、 0 . 0 0 1〜1 0 % (W/V) 好ましく は 0. 0 1〜5 % (W/V) である。 ， リン脂質としては、 大豆由来リン脂質、 卵黄由来リン脂質、 リゾレシチン、 フ ォスファチジルコリン (レシチン）、 フォスファチジルセリンなどの単独あるいは 組み合わせが使用可能である。 非界面活性剤としては、 分子量 5 0 0〜 1 5 0 0 0のポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレンプロック共重合体 （例えば、 プ ルロニック F— 6 8 )、分子量 1 0 0 0〜； 1 0 0 0 0のポリアルキレングリコール、 分子量 1 0 0 0〜 2 0 0 0 0のポリオキシアルキレン共重合体、 硬化ヒマシ油ポ リォキシアルキレン誘導体、 ヒマシ油ポリォキシアルキレン誘導体、 グリセリン 脂肪酸エステル、 ポリグリセリン脂肪酸エステル、 ソルビタン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレンヒマシ油、 硬化ヒマシ油、 ポリオキシエチレンアルキルエー テル、 ショ糖脂肪酸エステルなどの単独あるいは組み合わせが好適に用いられる がこれに限定されない。
本発明の化合物は、 以下のように製造することができる。
式 V Iのァミン
R
Figure imgf000013_0001
VI
(式中、 1は 0から 1 0の間のいずれかの整数であり、 sは 0または 1であり、 s が 0の場合は p + q = 4若しくは 5であり、 sが 1の場合は p + q = 3若しくは 4 であるが、 いずれの場合も pか qのいずれかが 1以上の整数である、 Rは炭素数 1〜 1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基であり、 R Aは水素または炭素数 1〜1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基である） と、
式 V I I I化合物： A— C〇2— R， [R， は水素または炭素数:！〜 4のアルキ ル基を示し、 Aは、 置換されてもよい CH 3 C n CH (2 n—2∞)— (nは 4から 2 2の間のいずれかの整数であり、 mは不飽和数を表し、 0から 7の間のいずれ 力 ^整数である）を表す]で示される化合物とを出発原料として、アミド化方法に よって製造することができる。
出発原料の式 V Iのアミンは、 常法に従って合成することができる。
出発原料の式 V I I Iのカルボン酸またはエステルは、 常法に従って合成する ことができる。 エステルの場合は、 対応するカルボン酸またはその塩から通常の エステル形成反応によつて製造することができる。 上記対応するカルボン酸また はその塩は、 合成品でも天然品でもよレ、。 経済性の点では合成品の方がよいが、 天然品の方が毒性がより少ない点で好ましい。 天然品は、 例えば、 魚類などから 分離、 精製したものがあげられる。
式 V I I Iのカルボン酸またはエステルが置換基を有するものも、 天然品でも 合成品でもよい。
合成で置換基を導入する方法は、 当業者に通常用いられる方法、 例えば、 式 V I I Iのカルボン酸またはエステノレに、 置換または付加反応によって置換基を導 入する方法があげられる。
置換基がアルキル基の場合は、 C H 3 C nH (2 n— 2m) C O OHにアルキル化剤を 用いて導入することができる。
また、 置換基が 0H基の場合は、 天然由来の DHAを水酸ィ匕し、 これを HPLCなど によって分画することにより合成してもよく、 特に制限はない。 例えば、 ニジマ ス鰓細胞や上皮細胞、 哺乳動物血小板、 あるいは RBL-1などのヒト白血球由来株 化細胞懸濁液に 10〜200mMの DHAを基質として加え、 10〜37°Cにて 1〜50分間反 応させて得ることもできる。 反応液を酸性 （ギ酸、 酢酸、 トリクロ口酢酸などに より） にすることによって反応を停止し、各 0H誘導体を有機溶媒（クロ口ホルム、 メタノール、 酢酸ェチル、 ァセトニトリルなど） を用いて抽出した後、 展開溶媒 (クロ口ホルム、 メタノール、 酢酸ェチル、 ァセトニトリル、 水、 トリフルォロ 酢酸など） によって HPLC、 あるいは薄層クロマトグラフィーなどの方法によって 分画することができるが、 これらの方法に限定されるものではない。 また、各 0H 誘導体は部位特異的な酵素を用いた選択的な合成法によって調製することもでき る。 なお、 4— OH - DHAゝ 10— 0H— DHA、 11— OH— DHA、 14 - OH - DHA、 8 - OH一 DHA, および 17 - OH - DHA (これらの S体） などは、 和光純薬工業より市 販されており、 入手することが可能である。
出発原料を合成によって得る場合には、 式 V Iのァミンまたは式 V I I Iの力 ノレボン酸またはエステノレは、 分離してもよく、 または溶媒に溶解したまま用いる こともできる。
アミド化方法は、 限定されるものではないが、 混合酸無水物法で一般的に合成 できる。 ここでは、 例えば、 下記方法をあげる。 ( 1 ) We i n r e b方法
式 V Iのァミンとトリアルキルアルミニウム、 特に （CH3) 3 A 1との反応物 に、 式 VI I Γのエステルを反応させることにより、 本発明化合物は製造するこ とができる。その反応を以下のスキームを用いて詳細に説明する （スキームでは、 便宜上、 式 VI I Iのエステルが置換基で置換されていない場合を示す)。
Figure imgf000015_0001
VII
Figure imgf000015_0002
'上記第 1工程の V I I化合物の生成反応は、式 V Iのアミン (好ましくは、塩酸 塩などの酸付加塩） と （CH3) 3A1とを反応させることによっておこなう。 こ の反応は、 芳香族炭化水素溶媒 （例えば、 トルエン、 キシレン、 ベンゼン） 中、 冷却下でおこなうことが好ましレ、。 このとき、 V I化合物の 1当量に対し、 （CH3) 3A1は、 0. 5〜5. 0当 量であることが好ましい。 ·
上記第 2工程は、 第 1工程で得られた VI Iィ匕合物に、 式 VI I Iのエステル を反応させることによっておこなう。 この反応は、芳香族炭化水素溶媒（例えば、 トルエン、 キシレン、 ベンゼン） 中、 加熱下でおこなうことが好ましい。 反応温 度は、 40〜70。Cが好ましい。 反応温度は、 生成物が分解しやすいので、 約 7 0°Cを超えないことが好ましい。 反応時間は、 1〜5時間が好ましい。
このとき、 VI I化合物の 1当量に対し、 式 VI I Iのエステルは、 0. 5〜 5当量であることが好ましい。
(2) (COC 1) 2を用いる方法
式 VI I Iのカルボン酸： A— CO— OH [Aは、置換されてもよい CH3Cn H (2n-2m)— （nは 4から 22の間のいずれかの整数であり、 mは不飽和数を 表し、 0から 7の間のいずれかの整数である） を表す]で示されるィ匕合物と
(COC 1 ) 2との反応によって生じる酸塩ィ匕物に、
式 V I '
R
2)X-NH2
Figure imgf000016_0001
(p、 q、 s、 1、 R及び RAは上記で定義した通りである） のァミン
を反応させることによつても本発明化合物を得ることができる。
上記第 1工程：式 VI I Iのカルボン酸と （COC 1) 2との反応による酸塩 化物の生成反応は、 芳香族炭化水素溶媒 （例えば、 トルエン、 キシレン、 ベンゼ ン） 中、 冷却下でおこなうことが好ましい。 このとき、式 V I I Iのカルボン酸： A— C O— O Hの 1当量に対し、 （C O C 1 ) 2は、 ：！〜 5当量であることが好ましい。
上記第 2工程：第 1工程で得られた酸塩ィ匕物と式 V Iのァミンとの反応は、 炭 化氷素溶媒（例えば、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム）、 あるいは芳香族炭ィ匕水素 溶媒 （例えば、 トルエン、 キシレン、 ベンゼン） 中でおこなうことが好ましい。 反応温度は、 一 5〜+ 5 °Cが好ましい。反応温度は、生成物が分解しやすいので、 約 + 5 °Cを超えないことが好ましい。 反応時間は、 0 . 5〜5時間が好ましい。 このとき、 酸塩化物の 1当量に対し、 式 V Iのァミンは、 1〜5当量であるこ とが好ましい。
いずれの製法でも反応終了後、必要に応じて、 常法 （ろ過、溶媒抽出、再結晶、 再沈殿又はクロマトグラフィーなど） に従って、 本発明の化合物を単離、 精製す ることができる。
また、 立体異性体は、 適当な原料を選択することにより、 または立体異性体の 混合物の場合にはクロマトグラフィー若しくはラセミ分割法により、 立体化学的 に純粋な異性体を得ることができる。
実施例
以下、 実施例及ひ 験例によって本発明をさらに詳細に説明するが、 これは本 発明の技術範囲を限定するものではない。 (実施例 1) (4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) — N _ ( 4 -メチルビペラジン一 1 —ィノレ） ドコサへキサ工ンアミド （化合物 1) の合成
15% Me3Al の n -へキサン溶液 10. 3 mlにモレキュラーシープ MS 4Aを用い て乾燥したトルエン 15 mlを混合し、氷 -メタノール浴で冷却しながら、 1 -ァ ミノ - 4 -メチルビペラジン 1. 69 ml ( 14. 1 ramol) を約 2分間かけながら滴 下した （内温く 7°C) o 1一アミノー 4—メチノレビペラジンを、最後にトルエン 2 mlを用いて洗いこんだ。 35分間撹拌した後、室温まで温度を上げ、 ドコサへキ サェン酸ェチルエステル （以下、 DHAェチルエステルという） 5. 0 g ( 14. 0 ramol) のトルエン 6 mlを 6分間かけて滴下した （内温 25〜26°C)。 70。Cにて 2時間 撹拌した後氷冷し、 0. 67 N塩酸 24 mlを滴下した（内温 39°Cまで上昇した)。 10 7
分間撹拌し、 水、 酢酸ェチルを加えた後セライトろ過、 分液し、 有機層を飽和食 塩水 20 mlで 2回洗浄した。 無水硫酸ナトリゥムで乾燥した後、 32°C水浴上に て減圧濃縮することによって、 標題化合物を得、 これを、 シリカゲルカラムクロ マトグラフィー （移動相： CHC 1 3→Ac OE t→CHC 1 3： Me OH (4 ： 1)) し、 その後、 さらにシリカゲ^;レカラムクロマトグラフィー （移動相： CHC 1 3： Me OH ( 1 9 ： 1 ) することによって精製し、 NMRによって下記構造 であることを確認した （収量 5.4 g、 純度 9 5%)。
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
(実施例 2) (4Ζ, 7Ζ, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) — Ν — [ 2—（ 1 — メチノレピロリジ ン- 2 -ィル)ェチル] ドコサへキサェンアミド （化合物 2) の合成
15% Me3Alの n-へキサン溶液 10.3 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 15 mlを混合し、 氷 -メタノール浴で冷却しながら、 2 - ( 2 -ァミノェチル) - 1 -メチルピロリジン 2.03 ml ( 14.1 nimol) を約 2分間かけながら滴下した （内 温一 7→+8°C)。最後にトルエン 2 mlを用いて洗いこんだ。 20分間撹拌した後、 室温まで温度を上げ、 DHAェチルエステル 5.0 g ( 14.0 mmol)のトルエン 6 ml を 2分間かけて滴下した（内温 28〜29°C)。 70°Cにて 2時間撹拌した後氷冷し、 0.67 N塩酸 24 mlを滴下した （内温 12~27°C)。 10分間撹拌し、 水、 酢酸ェチ ルを加えた後セライトろ過、 N a OHを少量加えて分液し、 有機層を飽和食塩水 20 mlで 2回洗浄した。 無水硫酸ナトリゥムで乾燥した後、 32°C水浴上にて減圧 濃縮することによって、標題ィ匕合物を得た （収量 4.7g)。 これを、 シリカゲル力 ラムクロマトグラフィー （移動相： CHC 13： MeOH (19 ： 1→9 ： 1)) することによつて精製し、 NMRによつて下記構造であることを確認した。
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
(実施例 3) N - [2—（ 1 —メチノレピロリジン— 2ーィル)ェチル]カプリルァミ ド （化合物 3) の合成
15% Me3Al の n -へキサン溶液 1.48 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 1.0mlを混合し、 氷 -メタノール浴で冷却しながら、 2 - ( 2 -ァミノェチル） - 1 -メチルピロリジン 0.25 ml ( 1.16 mmol) を約 2分間かけながら滴下し た。 20分間撹拌した後、 室温まで温度を上げ、 力プリル酸ェチルエステル 0.2 g ( 1-16 miol)の トルエン 0.5 mlを 1分間かけて滴下した。 70°Cにて 2時間 撹拌した後氷冷し、 ュ N NaOHを 滴下した。 10分間撹拌し、 水、 酢酸ェチ ノレを加えた後、 分液し、 有機層を飽和食塩水 20 mlで 2回洗浄した。 無水硫酸マ グネシゥムで乾燥した後、 30°C水浴上にて減圧濃縮することによって、標題化合 物を得た （収量 0.22 g)。 これを、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （移動 相： CHC I 3 : MeOH (19 ： 1→9 ： 1)) することによって精製し、 NM R及びマススぺクトルによって下記構造であることを確認した。
Figure imgf000020_0001
分子量： 254.41
Figure imgf000020_0003
Figure imgf000020_0002
(実施例 ) N -「 2—（ 1 - メチルピロリジン- 2 -ィル）ェチル] ミリスチン アミド （化合物 4) の合成
15% Me3Alの n -へキサン溶液 1.00 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 1.00 ml を混合し、 氷― メタノール浴で冷却しながら、 2一 ( 2 -アミノエチ ル） - 1 - メチルピロリジン 0· 17 ml ( 0.78 mmol) を約 2分間かけながら滴 下した。 20分間撹拌した後、 室温まで温度を上げ、 ミリスチン酸ェチルエステ ル 0.2 g ( 0.78 mmol) の トルエン 0.5 mlを 1分間かけて滴下した。 70°Cに て 2時間撹拌した後永冷し、 1 N NaOH溶液を滴下した。 10分間撹拌し、 水、 酢酸ェチルを加えた後、分液し、有機層を飽和食塩水 20mlで 2回洗浄した。 無 水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 30°C水浴上にて減圧濃縮することによって、 標題化合物を得た （収量 0.25 g)。 これを、 シリカゲル力ラムクロマトグラフィ 一 （移動相： CHC l 3 :MeOH (19 ： 1→9 ： 1)) することによって精製 し、 NMR及ぴマススぺクトルによって下記構造であることを確認した。
Figure imgf000021_0001
分子量： 338.566
Figure imgf000021_0003
Figure imgf000021_0002
(実施例 5) 9Z-N- [ 2—（ 1 -メチルピロリジン - 2 -ィル)ェチル]才レインァ ミ ド (化合物 5) の合成
15% Me3Alの n -へキサン溶液 12.3 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 18 mlを混合し、 氷 -メタノール浴で冷却しながら、 2- (2 -ァミノェチル） - 1 - メチルピロリジン 2.42 ml ( 16.7 mmol) を約 5分間かけながら滴下した。 最後にトルエン 2mlを用いて洗いこんだ。 20分間撹拌した後、室温まで温度を 上げ、 ォレイン酸メチルエステル 5.0 g ( 16.9 mmol)のトルエン 7 mlを 2分 間かけて滴下した。 70°Cにて 2.5時間撹拌した後氷冷し、 0.67 N塩酸 30 ml を滴下した。 1 N N a OH水溶液を約 100 m 1加え、 乍酸ェチル約 100m ' 1で抽出した。その際、水層の pHは 9〜10であった。有機層を飽和食塩水 20 mlで 2回洗浄した。 無水硫酸ナトリゥムで乾燥した後、 32°C水浴上にて減圧濃 縮することによって、 標題化合物を得た。 これを、 シリカゲルカラムクロマトグ ラフィー （富士シリシァ、 BW · 8 0 S 1 5 0 g、 移動相： CHC 1 3： Me O H (9 ： 1→4 ： 1→3 ： 1 (V/V))) することによって精製し、 3 5°C水浴 上にて減圧濃縮し、 4. 0 9 g (1 0. 4mmo 1、 収率 6 2%) の微黄色液体 を得た。 NMRによつて下記構造であることを確認した。
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
(実施例 6) (9Z, 12Z)-N 一 [2—（ メチルピロリジン-一 2 -ィル)ェチル] リノールアミド （化合物 6) の合成
15% Me3Al の n -へキサン溶液 0.83 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 0.7 mlを混合し、 氷 -メタノール浴で冷却しながら、 2 - （ 2—アミノエチノレ) - 1 -メチルピロリジン 0.14 ml ( 0.98 mmol) を約 2分間かけながら滴下し た。 20分間撹拌した後、 室温まで温度を上げ、 リノール酸ェチルエステル 0.2 g ( 0.65 賺 ol) の トルエン 0.4 mlを 1分間かけて滴下した。 70°Cにて 2時 間撹拌した後氷冷し、 1 N NaOH溶液 10 ml を滴下した （内温 12〜27。C)。 10 分間撹拌し、 水、 酢酸ェチルを加えた後、 分液し、 有機層を飽和食塩水 20mlで 2回洗浄した。無水硫酸マグネシゥムで乾燥した後、 30°C水浴上にて減圧濃縮す ることによって、標題化合物を得た （収量 0.114g)。 これを、 シリカゲルカラム クロマトグラフィー （移動相： CHC 1 3 : Me OH (1 9 ： 1→9 ： 1)) する ことによって精製し、 NMR及びマススぺクトルによって下記構造であることを 確認した。
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
(実施例 7) (9Z, 12Z, 15Z)-N - 「2—（ 1 - メチルピロリジン - 2—ィル)ェチ ル]リノレンァミド （化合物 7) の合成
15% Me3Al の n -へキサン溶液 1.99 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 0.6 mlを混合し、 永 -メタノール浴で冷却しながら、 2 -（ 2 -アミノエチノレ） - 1 -メチルピロリジン 0.23 ml ( 1.56 mrnol) を約 1分間かけながら滴下し た。 20分間撹拌した後、室温まで温度を上げ、 リノレン酸ェチルエステル 0.2 g ( 0.65蘭 ol)のトルエン 0.2 mlを 1分間かけて滴下した。 70°Cにて 2時間 撹拌した後氷冷し、 INNaOH溶液 10 mlを滴下した。' 10分間撹拌し、 水、 酢酸 ェチルを加えた後、 分液し、有機層を飽和食塩水 20mlで 2回洗浄した。 無水硫 酸マグネシウムで乾燥した後、 30°C水浴上にて減圧濃縮することによって、標題 化合物を得た（収量 0.13g)。 これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移 動相： CHC 13： MeOH (19 ： 1→9 ： 1)) することによって精製し、 N MR及びマススぺクトルによって下記構造であることを #mした。
Figure imgf000024_0003
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Figure imgf000024_0002
(実施例 8) (5Z， 8Z， HZ, 14Z, 17Z) - N— 「 2— ( 1 メチルピロリジン— 2—ィ ル）ェチル 1 エイコサペンタエンアミド （化合物 8) の合成
15% Me3Alの n -へキサン溶液 12.3 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 18 mlを混合し、 氷 -メタノール浴で冷却しながら、 2 - ( 2 -ァミノェチル） - 1 -メチルピロリジン 2.42 ml ( 16.7 mmol) を約 5分間かけながら滴下した。 20 分間撹拌した後、室温まで温度を上げ、エイコサペンタエン酸ェチルエステル 4.5 g ( 13.6 mmol)のトルエン 7 mlを 2分間かけて滴下した。 70°Cにて 2.5時間 撹拌した後氷冷し、 0.67 N M 30 mlを滴下した。 1 N Na OH水溶液を約 100 m 1カロえ、 酢酸ェチル約 100mlで抽出した。 その際、 水層の p Hは 9 〜 10であった。有機層を飽和食塩水 20 mlで 2回洗浄した。無水硫酸ナトリウ ムで乾燥した後、 32°C7浴上にて減圧濃縮することによって、標題化合物を得た。 これを、 シリカゲノレカラムクロマトグラフィー (富士シリシァ、 BW · 80 S 1 50 g、 移動相： CHC l 3 :MeOH (9 ： 1→4 ： 1→3 ： 1 (V/V))) することによつて精製し、 35 °C水浴上にて減圧濃縮し、 3. 2 g (収率 57 %) の微黄色液体を得た。 NMRによって下記構造であることを確認した。
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
(実卿 9) (4Z, 7Z, 10Z, 13Z, Ί6Ζ, 19Z) — N - [( 1 メチルピロリジン - 2 -ィル）メチル] ドコサへキサェンァミド （化合物 9 ) の合成
15% Me3Al の n -へキサン溶液 3.2 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 5 ml を混合し、 氷 - メタノール浴で冷却しながら、 2 -アミノメチル - 1 - メ チルピロリジン 0.6g をトルエン溶液（2ml)として約 2分間かけながら滴下した (内温一 10→+0°C)。 20分間撹拌した後、 12°Cまで温度を上げ、 DHAェチルエス テル 1.56 g (4.38讓 ol)のトルエン 2 mlを 2分間かけて滴下した （内温 10〜 13。C)。 70°Cにて 2.5時間撹拌した後氷冷し、 0.67N塩酸 7.5 mlを滴下した。 IN NaOH 35mlを加えた後酢酸ェチルで 2回抽出し、 水、 飽和食塩水 20ml で 2回洗浄した。 無水硫酵ナトリウムで乾燥した後、 40°C水浴上にて減圧濃縮す ることによって、 標題化合物を得た。 これを、 シリカゲルカラムクロマトグラフ ィー （移動相： CHC 1 a： Me OH (50 ： 1→9 ： 1)) することによって精 製し （1. 4g、 3. 3翻 ol 収率 75%)、 NMRによって下記構造であること を確認した。
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Figure imgf000026_0002
(実施例 10) (4Z, 7Z， 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)-N—「 2—（ 1 —メチルピロリジン一 2 -ィル)ェチル] ドコサへキサェンアミド (化合物 10) の合成
粗ドコサへキサェン酸 （DHA) 2.1 g とトルエン 10 mlを混合し、 氷冷しな がら （COC 1) 。0.93 ml ( 10.6讓 ol)を加え、 室温にて 2時間攪拌した。 40°C水浴上にて減圧濃縮、 トルエンを加えて再び減圧濃縮し、 黄色液体の粗 DH A酸塩化物を得た。 2— ( 2 -ァミノェチル） - 1' -メチルピロリジン 3 ml ( 21 議 ol) と CH2C 122 Om 1を加え、 氷冷下、 粗 DH A酸塩ィ匕物全量を加えた。 氷冷下 1時間攪拌し、 CH2 C 1 23 0 m 1、 氷水 50 m 1を加え、 分液漏斗を用 い有機層を分取、 1M HC 1 3 Om 1にて洗浄、 水にて 2度洗浄し、 Na 2 S 04で乾燥し、 シリカグレカラムクロマトグラフィー （シリカ 5 0 g、 移動相： n—へキサン：酢酸ェチル (9 ： 1→3 ： 1) することによって精製し、 淡黄色 液体 1. 9 g (収率 7 3 %) を得た。 NM Rによつて実施例 2と同一の化合物で あることを確認した。
(実施例 1 1) (4Z, 7Z, 1QZ, 13Z, 16Z, 19Z) - N - [3— ( 1 - メチルピロリ ジン- 2 -ィル)プロピル] ドコサへキサェンアミド (化合物 1 1) の合成
15% Me3Al の n -へキサン溶液 0.86 mlに MS 4Aを用いて乾燥したトルエン 1.34 mlを混合し、氷 -メタノール浴で冷却しながら、 トルエン 0.6ml中 2 - (3 -ァミノプロピル）一 1 -メチルピロリジン 0.167gを約 1分間かけながら滴下 した （内温 - 15°C)。 20分間撹拌した後、 20°Cまで温度を上げ、 DHAェチルエス テル 0.42 g ( 1.2 mmol)のトルエン 0.6 ml を滴下した （内温 20°C)。 70°Cに て 3時間撹拌した後氷冷し、 0.67 N塩酸 2.1 mlを滴下し、 1 N N a O H水 溶液 10mlを加え、酢酸ェチルにて抽出した後、水、飽和食塩水にて洗浄した。無 水硫酸ナトリゥムで乾燥した後、 減圧濃縮した。 これをシリ力ゲル力ラムクロマ トグラフィー （移動相： CHC 1 3： Me OH (50 : 1→9 ： 1→4 ： 1 )) す ることによって精製し、 0. 2 1 gの標題化合物（収量 0. 46mmol、収率 3 9%、 純度 9 7. 9 %) を得た。 NM Rによって下記構造であることを確認した。
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
(実施例 1 2 ) Ν - [2- ( (25) -卜メチノレピロリジン- 2 -ィル)ェチル]
iAZ, 1Z, 107, 13Z, 16Z, 19 -ドコサへキサェンァミド (化合物 2の 2 S体) の合成
( 1 ) (55) - 5- [ ( iari -プチルジメチルシリルォキシ）メチル]ピ口リジン - 2 -オン (55) -5 -（ヒドロキシメチル) - 2 -ピロリジノン（3. 14 g, 27. 3 圆 ol) の CH2C12 (85 ml)溶液に， イミダゾール (4. 09 g, 60 raraol) と 4 -ジメチルァミノピリジン (100 mg, 0. 82腦 ol) を加え， ついで氷冷下塩化 iari-プチルジメチルシリル (4. 53 g, 30 腿 ol) の CH2C12 (15 ml) 溶液を加え， 室温 で 15時間撹拌した。 溶媒を減圧 下留去後， 残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー (Si02 300 g, Me0H-CHCl3 5： 95 v/v) に付し， (55) - 5 - [ ( tert-プチ ジメチルシリノレォキシ)メチル]ピ口リ ジン - 2-オン (6. 22 g， 99. 5%) を得た： [ a ] D 27+42. 32 (c 1. 136, CHC13) . IR v max (film ) cm"1: 3242, 1697. ¾—蘭 R (CDC13) δ : 5.79 (1H， br), 3.80-3.71 (1H, m)， 3.63 (1H， dd, 9.9， 3.8 Hz), 3. 4 (1H， dd, =9.9, 7.7 Hz), 2.44-2.26 (2H, m), 2.24-2.11 (1H, m)， 1.80-1.67 (1H, m), 0.89 (9H, s)， 0.06 (6H， s). MS m/z: 230 (M++1), 214 (M+— 15)， 172 (100%). HRMS: 計算値 C10H20N02Si: 214.1263 (M+- 15). 実測値： 214.1240 (M+-15) .
(2) (5S)-5-l(tert -1 -メチルピロリジン - 2 -オン
NaH (60% oil disp. 778 mg, 19.4 mmol) の THF (70 ml) 懸濁液に， 氷冷下 (5^一 5 - [ ( eri -プチルジメチルシリルォキシ）メチル]ピロリジン - 2-ォン (3.71 g, 16.2 mmol) の THF (10 ml) 溶液を滴下し， ついで室温で 30分間撹拌した。 これに氷冷下 Mel (5.0' ml, 81 mmol) を加え， 室温で 15時間撹拌した。 氷冷下 sat. NH4C1水 (50ml)を加え， 溶媒を減圧下留去した。 «查を水で希釈後， AcOEt (50 ml x 3) で抽出し， 有機層は MgS04で乾燥した。 溶媒を減圧下留去後， 残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Si02 150 g， MeOH-CHCl3 3:97 v/v) に 付し， (5S) -5- [ ( ieri-ブチルジメチルシリルォキシ）メチル] -トメチルピロリジン - 2 -オン（3.86 g, 97.9%)を得た： [o;]D 29+3.46 (c 1.13, CHC13) . IR vmax (film ) cm—1: 1682. -蘭 (CDC13) δ： 3.73 (1H， dd, 10.2， 3.3 Hz), 3.60 (1H, dd, 10.2， 4.1 Hz), 3.55 (1H, quint, .1 Hz), 2.85 (3H， s)， 2.50-2.37 (1H， m)， 2.35-2.23 (1H， m), 2.15-2.01 (1H, m)， 1.89-1.77 (1H， m)， 0.89 (9H， s), 0.06 (3H, s)， 0.05 (3H, s). MS m/z: 228 (M+ - 15)， 186， 98 (100%) . HRMS: 計 算値 CuH22N02Si : 228.1420 (M+-15). 実測値： 228.1441 (M 15).
(3) (5S) -5- (ブロモメチル) -卜メチルピ口リジン - 2-オン
(56) -5- [ ( ieri-プチルジメチルシリルォキシ）メチル メチルピロリジン - 2 - オン（3.84 g， 15.8 mmol) の THF (100 ml) 溶液に Bu4NF (1 mol THF溶液， 17.5 ml, 17.5 mmol)を加え， 室温で 15時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮後， 残渣 をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー (Si02 150 g, MeOH-CHCl3 1： 9 v/v) に 付し，（5 - 5 -（ヒドロキシメチル) -1-メチルピロリジン- 2 -オンを分離不可能な不 純物との混合物 (2.46 g) として得た。
上記混合物 （2.46 g) の C CN (35 ml) 溶液に Ph3P (4.13 g， 15.75 mmol) を 加え， ついで氷冷下 CBr4 (5.22 g, 15.75 mmol) の CH3CN (10 ml) 溶液を滴下し、 ついで室温で 15時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮後， 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー （Si02150g, AcOEt)に付し， （5 - 5 -（プロモメチル)- 1- メチルピロリジン- 2 -オン （2.57g， 84.7%)を得た： IR vmax (film ) cm—1: 1688. ¾-NMR (CDC13) δ： 3.81 (IH, sextet, 4.1 Hz), 3.53 (IH, d, J^ .1 Hz), 2.84 (3H, s)， 2.62-2.46 (IH, m), 2.42-2.27 (IH, m)， 2.26-2.14 (IH, m), 2.01-1.88 (IH, m). MS m/z: 193 (M++2), 191 (M+)， 98 (100%). HRMS: 計算値 C6H1()N0Br: 190.9945 (M+). 実測値： 190.9935 (M+).
(4) 2- ( (25) - 1 -メチル- 5 -ォキソピロリジン - 2 -ィル）エタンニトリル
(5 - 5- (プロモメチル） - 1 -メチルピロリジン- 2 -オン（1.31 g， 6.8 mmol) の CH3CN (25 ml) 溶液に KCN (886 mg, 13.6 mmol) , NaCN (666 mg, 13.6 mmol)と 18 -クラウン - 6 (207 mg, 1.02 mmol) を加え， 43時間加熱還流した。 無機物を ろ別後， AcOEt (50 ml) で希釈し， sat. NaCl水 （30 ml) で洗浄後， MgS04で乾 燥した。溶媒を減圧下留去後，残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー （Si02 50 g, MeOH-CHCl31:9 v/v) に付し， 2_((25)- 1 -メチル- 5-ォキソピロリジン- 2 - ィル)エタンニトリルを分離困難な不純物との混合物 （1.05 g) として得た： IR V max (film) cm—1: 2246, 1685. -賺 (CDC13) δ： 3.85-3.76 (IH, m), 2.88 (3H， s)， 2.68 (IH, dd, 17.0， 4.4 Hz), 2.61 (1H， dd, 17.0， 6.0 Hz) , 2.62-2.48 (IH, m), 2. 6-2.30 (2H, m)， 2.00-1.86 (1H， m). MS m/z: 138 (M+)， 98 (100%). HRMS: 計算値 C7H1QN20: 138.0793 (M+). 実測値： 138.0794 (M+). (5) 2 -（(26) -1 -メチル -5 -チォキソピロリジン- 2 -ィル） エタンニトリル
2-（(2 -1 -メチル -5-ォキソピロリジン - 2-ィル）エタンニトリル（1.05 g, 7.6 mmol)のベンゼン （25 ml)溶液に Lawesson試薬（東京化成製） （1.54g， 3.8 mmol) を加え， 2時間加熱還流した。 溶媒を減圧下留去後， 残渣をシリカゲルカラムク 口マトグラフィー （Si0260 g, MeOH - CHC131:9 v/v) に付し， 2 -（(2 —1 -メチル -5-チォキソピロリジン- 2 -ィル） エタンニトリル (941 mg, 80.6%) を得た： IR v max (film ) cm-1: 2246. ¾ -蘭 R (CDC13) δ ： 4.20-4.10 (IH, m)， 3.30 (3H, s)， 3.25-2.98 (2H， m)， 277 (IH, dd, 月 7.0， 4.9 Hz), 2.68 (IH, dd, J=\l.0, 6.6 Hz), 2.50-2.36 (IH, m), 2.06-1.94 (IH, m). MS m/z: 154 (M+)， 114 (100%) . HRMS: 計算値 C7H1QN2S: 154.0565 (M+). 実測値： 154.0561 (M+).
(6) N-[2-( (26) -卜メチルピロリジン- 2 -ィノレ）ェチル]
{AZ, 1Z, 10 , 13 16Z, 19 -ドコサへキサェンアミド
2 -（（25) -1 -メチル -5-チォキソピロリジン -2-ィノレ）エタンニトリル（940 mg， 6.1 mmol) の EtOH (30 ml) 溶液に Raney- Ni (1.5 ml) を加え， 24時間加熱還流した (TLCで原料は完全に消失しなかった）. 無機物をろ別後， 溶媒を減圧下留去後， 残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー （Si0240 g, MeOH-CHCl31： 9 v/v) に 付し， 2_((25)- 1-メチルピロリジン- 2-ィル)エタンニトリルを分離困難な不純物 との混合物 (195 mg) として得た。
LiAl¾ (88 mg, 2.3 mmol) の THF (10 ml) 懸濁液に 2 -（（2 -1-メチルピロリ ジン- 2-ィル）エタンニトリル混合物 (195 rag) の THF (5 ml) 溶液を氷冷下， 少 しずつ撹拌下に滴下した。 ついで 15分間加熱還流した。 冷後， c. 40Hを加え， 反応混合物は Celiteを用いてろ過し， ろ液は溶媒を減圧下留去後，残查に CH2C12 を加え， K2C03乾燥した。 溶媒を減圧下留去した。 得られた粗生成物 2-((25)-1- メチルピロリジン- 2-ィル）ェチルァミンに CH2C12 (8 ml) を加え， ついで DHA— C1 (150 mg, 0.43 ramol) の CH2C12 (2 ml) 溶液を加え， 室温で 15時間撹拌し た。 反応液を減圧下濃縮後， 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Si02 30 NH40H水で飽和させた MeOH - CHC131:9 v/v) に付し， 標題ィ匕合物（157 mg， 22.4%)を得た： [ a]D 24 - 6.85 (c0.928, CHC13) . ¾ - NMR (CDC13) δ ： 6.71 (IH, br) , 5.45-5.26 (12 H, m), 3.52-3.40 (IH, m)， 3.28-3.16 (1H， m), 3.09-3.01 (IH, m), 2.90-2.77 (10H, m), 22.44-2.35 (2H， m)， 2.31 (3H, s)， 2.29—2.02 (6H， m), 1.97-1.82 (1H， m), 1.80—1.51 (5H, m), 0.97 (3H, t， J=7.7 Hz) . (実施例 1 3 ) ΛΚ2— ((2 — - 1 -メチルピロリジン- 2 -ィル）ェチル]
( Z, 1Z, 10 , 13 19 -ドコサへキサェンァミド （化合物 2の 2 R体） の合成
(1) (5J -5- [ ( eri-ブチルジメチルシリルォキシ）メチル]ピロリジン- 2-ォン (5τΐ -5 -（ヒドロキシメチル) - 2-ピロリジノン（4.03 g， 35 mmol) の C C12 (85 ml) 溶液に， イミダゾール（5.24 g， 77匪 ol)を加え， ついで氷冷下塩ィヒ tert - プチルジメチルシリル (4.53 g， 30腿 ol) の CH2C12 (15 ml) 溶液を加え， 室温 で 15 時間 撹拌した。 溶媒を減圧下留去後，'残渣をシリカゲルカラムクロマトダラ フィー (Si02300 g, MeOH-CHCl35:95 v/v) に付し， （5^) - 5- [(iert -プチルジメ チルシリルォキシ）メチル]ピロリジン- 2-オン（7.92 g, 98.7%) を得た： [ o; ]D 25 - 47.44 (c 1.80, CHC13) .
(2) (5d -5- [ ( ieri -プチルジメチルシリノレォキシ)メチル] - 1 -メチルピロリジン -2 -オン
NaH (60% oil disp. 1.20 g, 30 mmol) の THF (100 ml) 懸濁液に， 氷冷下 (5d -5- [ ( er-プチ/レジメチルシリルォキシ）メチル]ピ口リジン - 2 -オン (5.73 g, 25 mmol) の THF (20 ml) 溶液を滴下し， ついで室温で 30分間撹拌した。 こ れに氷冷下 Mel (7.8 ml, 125 mmol) を加え， 室温で 15時間撹拌した。 氷冷下 sat. NH4C1水 （50ml)を加え， 溶媒を減圧下留去した。 残查を水で希釈後， AcOEt (50 ml x 3) で抽出し， 有機層は MgS04で乾燥した。.溶媒を減圧下留去後， 残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Si02250 g, Me0H-CHCl3 3:97 v/v) に 付し， 5 - [(ieri -プチルジメチルシリルォキシ）メチル メチルピロリジン -2 -オン (6.00 g, 98.8%)を得た。 (3) (5Λϋ- 5 -（プロモメチル) -卜メチルピロリジン- 2 -オン
(5Jd -5- [ ( ieri-ブチルジメチルシリルォキシ）メチル] -トメチルピロリジン - 2- オン （3.43 g, 14.1 mmol) の THF (100 ml) 溶液に Bu4NF (1 mol THF溶液， 14.1 ml, 14.1 mmol) を加え， 室温で 15時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮後， 残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Si02150 g, MeOH- CHC131:9 v/v) に 付し， 5 -（ヒドロキシメチル) -1 -メチルピロリジン- 2 -オンを分離不可能な不 純物との混合物 (2.48 g) として得た。
上記混合物 （2.48 g) の CH3CN (60 ml) 溶液に Ph3P (5.04 g， 19.2 mmol) を 加え， ついで氷冷下 CBr4 (6.37 g， 19.2 mmol) の CH3CN (15 ml) 溶液を滴下し、 ついで室温で 15時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮後， 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー (Si02150 g, AcOEt) に付し， (5^-5- (プロモメチノレ) - 1 -メチルピロリジン - 2-オン（2.68 g， 98, 5%) を得た。
(4) 2 -（（2 -トメチル- 5 -ォキソピロリジン- 2 -ィル）エタンニトリル
(5Λ -5- (プロモメチノレ） -1-メチルピロリジン- 2-オン （2,67g, 13.9 mmol) の CH3CN (60 ml) 溶液に KCN (1.26 g, 25.7 mmol), NaCN (2.78 mg， 42.7 mmol) と 18 -クラウン- 6 (793 mg, 3 mmol) を加え， 44時間加熱還流した。 無機物をろ 別後， AcOEt (50 ml) で希釈し， sat. NaCl水 （30 ml) で洗浄後， MgS04で乾燥 した。 溶媒を減圧下留去後， 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Si02 100 g, MeOH-CHCl31:9 v/v) に付し， 2- ((2J0—1-メチル -5-ォキソピロリジン - 2- ィル)エタンニトリルを分離困難な不純物との混合物 (1.49 g) として得た。
(5) 2- ((2τ¾- 1 -メチル - 5-チォキソピロリジン- 2-ィル） エタンニトリル
2— ((2^—1 -メチルー 5-ォキソピロリジン— 2—ィル）エタンニトリル (1.48 g， 10.7 mmol) のベンゼン （40 ml) 溶液に Lawesson試薬 （東京化成製） （2.26 g, 5.6 ramol) を加え， 2時間加熱還流した。 溶媒を減圧下留去後， 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー (Si0280 g, MeOH-CHCl3 5:95 v/v) に付し， 2- — 1 -メチル- 5 -チォキソピロリジン - 2 -ィル) エタンニトリル（1.36 g， 82.8%)を得た。 (6) ΛΚ2 -（(27¾- 1 -メチルピロリジン- 2-ィル）ェチル]
ΊΖ, 107, 16 , 19 -ドコサへキサェンァミド
2-((2v¾- 1 -メチノレ- 5 -チォキソピロリジン— 2 -ィル）エタンニトリル（1.36 g, 8.8 mmol) の EtOH (30 ml) 溶液に Raney- Νί (1.5 ml) を加え， 24時間加熱還流 (TLC で原料は完全に消失しなかった)。無機物をろ別後， 溶媒を減圧下留去後，残渣を シリカゲル力ラムクロマトグラフィー （Si02 40 g， MeOH- CHC13 1： 9 v/v) に付し， 2 -（ (2^ -1 -メチルピロリジン - 2 -ィル)エタンニトリルを分離困難な不純物との混 合物 （498 mg) として得た。
LiAlH4 (130 mg, 3. 4 mmol) の THF (15 ml) 懸濁液に 2-（ (2^) - 1 -メチルピロリ ジン- 2-ィル)エタンニトリル混合物 （249 mg) の THF (5 ml) 溶液を氷冷下， 少 しずつ撹拌下に滴下した。 ついで 45分間加熱還流した。 冷後， c. NH40Hを加え， 反応混合物は Celiteを用いてろ過し， ろ液は溶媒を減圧下留去後， 残渣に CH2C12 を加え， K2C03乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた粗生成物 2- ( (2^ -卜メチ ルビ口リジン- 2-ィル）ェチルァミン (257 mg)'に CH2C12 (12 ml) を加え， ついで DHA-C1 (350 mg, 1. 01 mmol) の C C12 (3 ml) 溶液を加え， 室温で 15時間撹 拌した。 反応液を減圧下濃縮後， 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Si02 30 g, c. N 0H水で飽和させた MeOH- CHC13 1 : 9 v/v) に付し， 標題化合物 (314 rag, 35. 8%) を得た： [ a ] D 2 +2. 74 (c 0. 786, CHC13) (実施例 1 4 ) 化合物 2の OZW型ェマルジヨン製剤（以下、 化合物 2 - MSとい う）の作製
化合物 2の OZW型ェマルジヨン製剤 （化合物 2 - MS)を以下の様に作製し た。 50. 0 g精製大豆油に 6. 0 g精製卵黄レシチン、 50. 0 mgの化合物 2を加え、 40 - 45°Cで加熱溶解させた。 これに 11. 5 mg日本薬局方グリセリンを加えた後、 注射用蒸留水を用いて全量を 500 ml とし、 ホモミキサーで粗乳ィ匕を行なった。 これをマントン -ゴーリン型ホモジナイザーを用いて 600 kg / cm2の加圧下で 5 回通過させ、精乳化を行なった。これにより均質化された極めて微細な化合物 2 - MS製剤を得た。 こうして作製した化合物 2 - MS製剤の平均粒子径、 粒度分布を Nicomp 370 / Autodilute Submicron Particle Sizer ( Pacit ic Scientific社 製)で測定したところ、平均粒子径は 0. 15〜0. 3 μ πιであり、粒度分布については 1 μ m以上の粒子を含有しなかつた。 (試験例 1) in vitro血小板凝集
コラーゲンによる in vitro血小板凝集
コラーゲンにより惹起される血小板凝集を本発明化合物が阻止するかどうかを 検討した。 実施例の化合物 （化合物:!〜 9及び 1 1) を用い、 各々生理食塩水にて希釈し て、 終濃度が 1 X 10— 7M、 3 x 10— 7M、 l x l 0"6M, 3 x 10— 6M、 1 x 10一5 M、 3 10_5M及ぴ 1 x 10一4 Mとなるようにした。
陽†生対照として、 インドメタシンを用い、 メタノールに溶解後、 生理食塩水に て希釈して、終濃度が 1 X 1 0— 6M、 3 1 0一6 M及ぴ 1 x 1 0一5 Mとなるよう にした。
陰性対照として生理食塩水を用いた。
血小板の調製：
JW系雄ゥサギ （SPF、 2. 5ヶ月齢） を麻酔した後、 頸動脈から採血し、 3. 8%クェン酸ナトリウム （山之內製薬、 チトラール） を入れたチューブに血 液を採取した。これを室温にて 9 00 r p mにて 10分間遠心分離することで上澄 (PRP、 多血小板区分） を分取し、 残さをさらに 2500 r pmにて 15分間 遠心分離することで上澄 (PPP 少血小板区分） を得た。
透過度の測定
ァグリゴメーター （へマトレーサー 240 1 2 c h、 MCM社製） の P P P (少血小板区分） 用 3 7。C保温槽に P P Pをキュベットに入れて装着した。 次に PRP (多血小板区分） 200 ^ 1をキュベット内に添加し PRP用反応槽に装 着した。 マグネチックスターラーで攪拌しながら 30秒間、 自動調整によって P P Pの透過度 T 650nm= l 0 0%、 1 ?の透過度1：65011„1= 00/0に捕正した。 所定濃度の被験物質 20 μ 1をキュべット内に添加し、 3 0秒後にコラーゲン (MCM社製） 20 μ 1 (終濃度 0. 2 μ g/m l ) を加え、 その後の透過度の 変化を 5分間記録した。 血小板が凝集すると透過度が上昇する。 凝集がピークに 達した最大凝集時の透過度 Tを陰性対照の透過度 T。と比較し、 以下の式を用い て凝集阻止率を百分率表示した。 凝集阻止率 = (1-Τ/Τ0) χ 100
得られた凝集阻止曲線より線形近似によつて回帰式を求め、 50%阻止点. IC50を算 出した。
凝集阻止曲線を図 1に示す。
血小板凝集の 50%P且止点である IC5。を以下の表 1に示す。
表 1
血小板凝集の 50%阻止点
被験薬物 ic50
インドメタシン (5.0±1.6) X 10—6
化合物 1 (7.9±1.3) X 1(T6 M
化合物 2 (1.5±2.0) X 10 M
化合物 3 (8.1±3.3) X 10—6 M
化合物 4 (42 ±22) X 10 -6 M
化合物 5 (5.6 ±2.8) X 10 M
化合物 6 (2.1±0.1) X 10— 6 M
化合物 7 (3· 7 ±1.9) X 10-6 M
化合物 8 (3.7±1.9) X 10 M
化合物 9 (1.5±0.9) X 10一6 M
化合物 11 (4.2土 2.2) X 10一6 M
ィ匕合物 1〜9及び 11は、インドメタシンとほぼ同等に血小板凝 集を抑制することが示された。
従って、 式 Iの本発明化合物において、 CnH (2n一 2m)の nが、 6から 20の間 のいずれかの整数のもの、 及び不飽和数 mが、 0から 6の間のいずれかの整数の ものについて、 血小板凝集抑制作用があることが確認された。 種々の惹起剤による in vitro血小板凝集
次に、 惹起剤として、 コラーゲンの他に、 ァラキドン酸、 ADP、 トロンビン、 セロトニン、 ェピネフリン及び U46619 (トロンボキサン A2疑似物質） を 用い、 本発明の化合物の血小板凝集の抑制を上記と同様に検討した。 血小板としては、 ゥサギの他にラット及びモルモットから調製した血小板も用 いた。
凝集惹起剤の調製は以下のように行った。
コラーゲン及ぴ ADPは M CM社より購入し添付調製方法に従って用いた。セロ トニン、 ェビネフリン、及ぴトロンビンは Sigma社より購入し、 注射用生理食塩 水 （大塚製薬工場） に溶解して用いた。 ァラキドン酸は Cayman社より購入し、 注射用生理食塩水 （大塚製薬工場） に投げ込み型超音波発振機 （日本精機 US 150、 チップ先端 Φ 3. 5 腿程度） を用いて分散させた。 U 46619 (トロンポキサン疑 似物） はフナコシ （株） より購入し注射用生理食塩水 （大塚製薬工場） に溶解し て用いた。
コラーゲン （0 . 1〜： 1 μ g Zm 1 )、 ァラキドン酸 （l mM)、 ADP (1 x M) , トロンビン ( 1 U/m 1 )、 セロトニン ( 1 0 0 / M)、 ェピネフリン （1 0 0〜 2 0 0 μ M) 及ぴ U 4 6 6 1 9 { 3 μ Μ) を用いた。
被験薬物として、 化合物 2を用いた。 陽性対照としては、 インドメタシンを用 レ、、 コラーゲンによつて惹起される血小板凝集の抑制を測定した。
血小板凝集の 50%阻止点である IC5。を求め、 以下の表 2に示す。 表 2
種々惹起剤による in vitro血小板凝集に対する化合物 2の 50%抑制点
Figure imgf000037_0001
注 Ν . Α. ：惹起されず
コラーゲンで凝集惹起した場合、 ラット或いはモノレモッ トのいずれの血小板を 用いた場合でも、化合物 2による 50%凝集阻止点はそれぞれ凡そ （11士 7) X 10—6 M (9. 0 土 6. 0) Χ 1(Γ6 Μであり、 ゥサギ血小板を用いた場合と同様、 インドメ タシンとほぼ同等の血小板凝集阻止作用を示した。
一方、 ァラキドン酸、 ADP、 トロンビンによって凝集惹起した際、 ゥサギ、 ラ ット或いはモルモット何れの血小板を用いた場合でも、化合物 2は、血小板凝集 を阻止しないか、 P且止してもその程度が非常に弱いことがわかった。 . 尚、 一部データがとれなかったのは、 血小板の活性に動物種差があり、 惹起剤 感受性が低レヽためであったと考えられる。
また、 化合物 1についても実験したところ、 上記と同様な結果が得られた。 従って、 本願化合物は、 コラーゲンによって惹起される血小板凝集を選択的に 抑制することができることが示された。 ヒト in vitro血小板凝集
ヒト血小板の調製：
ポランティアのヒ トの各大腕静脈より、 18G注射針を用いて 1人あたり 10 ml づっ採血した。 3.8%タエン酸ナトリウム （山之内製薬、 チトラール） 1 mlを入 れた 15. mlファルコンチューブに血液を静かに滴下、 蓋を閉めてゆっくり転倒混 和した。 その後、 血液を室温にて 900 rpmにて 10分間遠心分離し、 上澄 （多血 小板画分、 platelet rich plasma, PRP)を分取した。 残渣を更に 2, 500 rpmにて 15分間遠心分離した上澄 （貧血小板画分、 platelet poor plasma, PPP)を得た。 PRPの血小板密度を血球計測器 (シスメック社) で測定し、 PPPで希釈して血小 板密度を 30万 / 1に調整した。
凝集惹起剤の調製は、 上記と同様に行つた。
被験物質の作用を最大限に引き出す為、 各実験毎に惹起物質の用量設定を行つ た。 つまり、 陰性対照 （生理食塩水） ではつきりと凝集させるものの、 過剰凝集 とならなレ、惹起物質濃度を各実験毎に設定した。
一方、 高濃度 ADP或いは高濃度ェピネフリンで惹起した場合、 一次凝集に引き 続き、 活性化血小板より放出される alpha顆粒 ( PDGF、 セロトニン、 ADPなど） が引金となって、 再度、 二次凝集が進行する。 今回、 ADP、 或いはェピネフリン による二次凝集に及ぼす被験物質の作用も検討した。
セロトニンは単独では血小板凝集を起こし難レ、。 そこで、セロトニン +コラー ゲン、 或いはセロトニン + ADPの組み合せで惹起物質として用いた。 用量設定は、 それぞれの物質単独で凝集惹起しない用量を各実験毎に検討し、 凝集惹起しない 用量以下を設定して組み合せて用いた。 例えば、 セロトニン単独で 1 mMでは惹 起するものの、 0. 5 mMで殆ど惹起せず、 一方、 ADP単独で 0, 25 mMで惹起する ものの 0. 11 π で惹起しない場合、 セロ トニン 0. 25 mM + ADP 0. 05 mMを設定 した。
被験物質は化合物 2を用い、 調製は上述-と同様に行なった。
透過度の測定も上述と同様に行なった。
血小板凝集の 50%阻止点である IC5。を求め、 以下の表 3に示す。 表 3
ヒト in vitro血小板凝集に対する化合物 2の 50%抑制点 IC 50
Figure imgf000039_0001
その結果、 表に示す様に、 何れの惹起剤によって凝集した場合にも、 化合物 2 による凝集抑制作用を観察する事ができたが、 特に、 ADP二次凝集、ェピネフリ ン二次凝集、 セロトニン、或いはコラーゲン惹起で、ィ匕合物 2による抑制作用を はっきりと観察できた。 それぞれの惹起剤での 50%抑制点 IC5。 jま、 ( 5. 7土 2. 6) X 10"7M ( ADP二次凝集）、 （ 2. 7 ± 1. 2) X 10— 6M (ェビネフリン二次凝集）、 ( 3. 0± 1. 6) Χ 1(Γ6Μ (セロ トニン + ADP) ( 1. 5±0. 8) X 10— 5M (セロ トニン +コ ラーゲン）、 ( 1. 3±0. 2) X 10-5M (コラーゲン) だった。 JP02/06067
(試験例 2 ) ex vivo血小板凝集
薬効の発現時間の検討
S D系雄ラット （S P F、 8週齢） 尾静脈に 1 O mg / kg の化合物 2を投与し て、 投与後 10分、 30分及び 1時間後の 3時点にて採血し、 調製した血小板を 用いて、 0 . 3〜6 μ g / ml のコラーゲンで血小板凝集を惹起し 際の凝集率 を検討した。 対照群として、 溶媒 （生理食塩水） を投与したものの凝集率を測定 した。 血小板の調製及び凝集率の測定は試験例 1と同様に行った。
その結果を図 2に示す。
化合物 2の投与 10分、 30分及ぴ 1時間後のいずれの時点でも、溶媒投与群と 比較して、 血小板凝集は抑制されたが、 その作用は、 投与後 10分、 或いは 30 分の時点よりも、静脈投与 1時間後に、 より強く血小板凝集が抑制を受けること がわかつた。 従つて、 以下の実験の測定点を 1時間後にした。
尚、 静脈投与後 10分、 或いは 30分の時点よりも、 静脈投与 1時間後に、 よ り強く血小板凝集が抑制を受けていることについては、本化合物が血中に於いて、 徐々に活性体に変化し、その代謝産物が活性に寄与している可能性が考えられる。 用量依存性の検討
本発明の化合物が、 ex vivo血小板凝集を用量依存的に抑制するかどうカゝ検討 した。 被験物質として、化合物 2を用い、 対照として、 溶媒 （生理食塩水） を用 いた。
ラット尾静脈に 1、 0. 1、 0. 01、 0. 003、 0. 001、 0. 0003若しくは 0. 0001 mg / kgの化合物 2を投与した。 60分後に採血し、調製した血小板を用いて、 4〜7 μ g / mlのコラーゲンで血小板凝集を惹起した。 血小板の調製及び凝集率の測定は 試験例 1と同様に行った。
その結果を図 3に示す。
1、 0. 1、 0. 01若しくは 0. 001 mg / kgの化合物 2投与群に於て溶媒投与群 と比較して血小板凝集が抑制された。 0. 0001 mg I kg投与群でも、 4 μ g / ml の低濃度コラーゲン惹起に於て、 作用は弱いが、 溶媒投与群と比較して血小板凝 集が抑制された。
50%抑制点 I C5。値は、 4 μ g / mlコラーゲンで惹起した場合のデータから 算出すると、 630 ±36 n g / kgだった。 この ex vivoでの血小板凝集抑制の I C 5。値は、 従来の GPIIb/IIIa受容体拮抗薬のものより 1千倍ほど強い。
また、 被験物質として化合物 5を用いて、 0. 1mg / kg静脈投与して、 静脈投与 1時間後に採血し、 調製した血小板を用いて、 1〜 6 μ g / mlのコラーゲンで 血小板凝集を惹起した。 血小板の調製及び凝集率の測定は試験例 1と同様に行つ た。
その結果を図 4に示す。
化合物 5も血小板凝集を抑制することがわかった。 この実施例で示された ex vivoの血小板凝集阻止の作用を上記 in vitroのもの と比較する。
ex vivo実験で得られた IC5。値 630 ng / kgは、 ラット血液量を凡そ 60 ml I kgと見積もると、 化合物 2の血中濃度が 26 nMに達する投与量と推測する事が できる。 この値は、 in vitroでの IC5。値 2, 1 ±0· 8 μ Mより希薄であり、 約 1 / 80の低濃度という事になる。
即ち、 ex vivo血小板凝集阻止の作用は、 単純に血小板凝集が本発明化合物に よって抑制を受けるだけでなく、 例えば、 血小板凝集に関与する好中球と血小板 との間の相互作用を抑制したり、 または本発明化合物が代謝を受け、 代謝産物が 血小板に作用を及ぼしながら、 体内で強く血小板凝集が抑制を受けている可能性 が考えられる。
(試験例 3 ) 経口投与後の ex vivo血小板凝集
化合物 2の 10、 1または 0. 1 mg / kgをゾンデ針を用いてラットに、 単回 経口投与した。 対照として溶媒 （生理食塩水） を投与した。
投与 2時間後に採血し、 調製した血小板を用いて、 2〜4 μ g / mlのコラー ゲンで血小板 を惹起した。 血小板の調製及び凝集率の測定は試験例 1と同様 に行った。
その結果を図 5に示す。
ィ匕合物 2投与群は、 溶媒投与群と比較して、 強く血小板凝集が抑制を示した。 つまり、 本発明化合物は経口吸収によっても血小板凝集を抑制できることが示さ れた。
(試験例 4) コラーゲン誘導性マウス突然死モデル
本発明化合物が in vivo病態モデルに及ぼす作用の予備検討として、 コラーゲ ン誘導性マウス突然死を抑制するかどう力検討した。 当該モデルは多量のコラー ゲンによつて肺毛細血管が栓塞を受け、酸素欠乏により突然死するものである 1 本発明ィヒ合物が動物体内で、 血小板凝集を抑制する事によって、 突然死を抑制す るかどうかを観察した。
溶媒 （生理食塩水）、 或いは化合物 2の 30//g/kgをマウスに静脈投与した 1 時間後、 コラーゲン 37.5 mg I kgを尾静脈で投与した。 1時間後に、 その生残 率を比較したところ以下の結果となった。
溶媒群の生残率 2匹 / 10匹
化合物 2投与群の生残率は 7匹 / 10匹 ，
ィ匕合物 2が、 溶媒群と比較して高い生残率を示した。
(試験例 5) ラットラゥリン酸誘発末梢循環障害モデル
(1) 脚壊死誘発後投与
本発明化合物の in vivo循環障害病態モデルに及ぼす影響を調べるために、 末 梢循環障害モデルとして一般に広く用いられている、 ラットラゥリン酸誘発末梢 循環障害モデルを用いた。
ラット大腿動脈内にラウリン酸 （1. 5mgZ匹） を投与し、 脚壊死を誘発し た。 ラウリン酸投与 6時間後に化合物 2 を初回静脈内投与し、 その後、 1 日 1 回 14日間反復投与した。
化合物 2の 1回投与量は、 10 μ g/k g、 30 μ g/k gまたは 100 μ g ノ k gとし、 用量依存的に脚壊死を改善するかどうかを検討した。 対照として溶 媒 （生理食塩水） を投与した。
足肢病変進行度の観察を、 ラウリン酸投与 3、 7、 10及び 14日後に行い、 以下の却壊死スコアによって評価した。 各指毎にスコア付けを行い、 各指のスコ ァの総和を病変指数とした。 さらに障害が足躕部に及ぶ場合は 5ポイントを加え た。
スコア 0 ：病変なし
スコア 1 ：黒変が爪先部に限られる
スコア 2 ：黒変が指部におよぶ
スコア 3 ：指の壊死
スコア 4 ：指の脱落 その結果を図 6に示す。ィ匕合物 2が用量依存的に脚壊死スコアを改善すること が示された。
( 2 ) 脚壊死誘発前投与
上記（ 1 ) と同様に試験を行つた。但し、ラウリン酸処置 1時間前より化合物 2 の投与を開始し、次に、 ラウリン酸投与 6時間後に投与し、 さらに、 1日 1回 14 日間反復投与した。 対照として溶媒 （生理食塩水） を同様に投与した。
足肢病変進行度の観察を、 ラウリン酸投与 3、 7、 1 0及び 1 4日後に行い、 上記脚壊死スコアによつて評価した。
その結果を図 7に示す。ィ匕合物 2が用量依存的に脚壌死スコアを改善すること が示された。
前投与の場合、 3 0、 1 0 0 μ g /k g投与量で有意に障害を軽減し、 1 0 μ g /k g投与量でも障害を軽減する傾向が見られた。
( 3 ) 脚壌死誘発前投与一 O/W型ェマルジョン製剤の場合
上記 （2 ) と同様に試験を行なった。
但し、 被験薬物として、 実施例 1 4で調製した化合物 2 - MS ( 1回投与量：有 効成分量として 100 / g / kg) とし、 陽性対照として Palux (登録商標） （Lipo PG El、大正製薬 ： 1回投与量は有効成分量として 5 g / kg)、或いは Novastan (登 録商標） ( Argatroban、三菱東京製薬 ： 1回投与量は有効成分量として 1 mg / kg) を用い、 陰性対照として溶媒 （生理食塩水） を用いた。
足肤病変進行度の観察を、 ラウリン酸投与 3、 7、 10、 及び 14日後に行ない、 上述脚壊死スコアによつて評価した。 この結果を図 8に示す。 化合物 2 - MS力 S Argatrobanより強く、 また lipo PG Elと同等に脚壊死スコアを改善する事が示された。
(試験例 6) 疑似血管 in vitro炎症モデル
炎症性サイトカイン TNF αが血管内皮細胞の接着分子を誘導し炎症を惹起す ると炎症部位に好中球が移動し、 さらに炎症を悪化させるという報告がある。 重 度の炎症は循環器の恒常性を破錠させ、動脈硬化を進行させると考えられている。 そこで、 TNF αを惹起剤として用いた疑似血管 in vitro炎症モデルにおいて、 本発明化合物が抗炎症作用を有するかどうカゝ検討した。
疑似血管： in vitro炎症モデルの確立
疑似血管 in vitro炎症モデルは、 生物薬科学実験講座、 12炎症とアレルギ 一 l i p. 327-341 (大內和雄編集、広川書店、平成 5年 5月 15日発行） に記載の方法に従つて作成した。
3 μ m孔の多孔性ポリカーボネート膜により上室と下室とに区切られたトラン スゥエル （クラボー社製） を用い、 上記膜の底面に一層のゥシ内皮細胞を付着さ せ、 37°C、 5%C02条件下、 80分間培養した。 次に、 トランスゥエル上室 に蛍光標識した好中球浮遊液を加え、 同時に、 TN Faを終濃度 50、 25若し くは 1 7n g/mlとなるように上室の細胞浮遊液に懸濁した。
つまり、 上記モデルでは、 好中球が、 上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下 室へ透過すること、 及び、 内皮細胞層に粘着することは、 血管内部の TNFo!に 応答して好中球が血管内より炎症部位に移動してゆくことを疑似している。
検討の結果、 上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下室へ透過した好中球数、 及び、内皮細胞層に粘着した好中球数が TNFひ濃度依存的に増加した。つまり、 TNF αが炎症を惹起していることが実証された。
好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する本発明化合物の影響 ' 次に、 上記疑似血管 in vitro炎症モデルを用いて、 好中球と血管内皮細胞と の相互作用に、 化合物 1或いは化合物 2がどのように影響するカゝ検討した。
トランスゥエル上室に、ィヒ合物 1或いは化合物 2を、 どちらも、 30、 3、 あ るいは 0. 3 μ Μの終濃度で、 好中球浮遊液を T NFa 50n g//mlとともに 上室に入れ、 上記と同様、 上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下室へ透過した 好中球数、 及び、 内皮細胞層に粘着した好中球数を測定し、 それから好中球移動 率 （％) を算出した。 好中球移動率は、 陰性対照群 （生理食塩水） での好中球移 動数に対する薬物投与群での好中球移動数を相対値 (%) として表示した。 その結果を図 9に示す。
化合物 1或いは化合物 2は、 どちらも、濃度依存的に好中球透過を抑制した。 つまり、化合物 1と化合物 2は、 どちらも、好中球と血管内皮細胞の相互作用 に対して抑制的に働き、 抗炎症の方向に作用している可能性が示唆された。 化合物 1或いは 2は抗炎症的に作用する事より、 ィ匕合物 1或いは 2は循環器 の恒常性を維持し、 病態を改善する方向に作用する可能性が考えられる。
(試験例 7 ) 光増感誘導ラット中大脳動脈閉塞モデル
本発明化合物の in vivo循環障害病態モデルに及ぼす影響を調べるために、 脳 梗塞急性期 ·慢性期モデルとして一般に広く用いられている光増感法誘導ラット 中大脳動脈閉塞モデルを用いた。
ラットにローズベンガル色素 （ 20 mg / kg) を静脈内注射後、 中大脳動脈に緑 色レーザー光 （波長 540 nm) を 10分間照射し活性酸素種による動脈閉塞を誘発 した。 レーザー光照射終了後に化合物 2を静脈投与した。
ィ匕合物 2の投与量は 1 mg / kgとし、 脳梗塞を改善するかどうかを検討した。 対照として溶媒 （生理食塩水） を静脈投与した。
脳梗塞進行度の観察をレーザー光照射の 24時間後に行なった。 摘出した脳の 横断切片 （ 1 腿厚） を作製し、 トリフエニルテトラゾリゥムに浸して生組織を 赤色に染色した。 梗塞領域は白色となり生組織と明確に区別できたので、 梗塞面 積を測定し梗塞領域率 （脳の横断切片に対する梗塞面積の割合） を算出して評価 に用いた。
その結果を図 1 0に示す。 ィ匕合物 2が脳梗塞を改善する事が示された。 (試験例 8 ) ラット類動脈内膜肥厚モデル
本発明化合物の in vivo循環障害病態モデルに及ぼす影響を調べるために、 PTCA後再狭窄モデルとして一般に広く用いられているラット頸動脈内膜肥厚モ デノレを用いた。
ラット大 J9退動脈よりバルーンカテーテル（フォガティーカテーテル 2 Fr、バタ スター社） 先端を揷入し頸動脈まで導いた。 バルーン内に空気 ( 0. 3 mL) を注入 してバルーンを膨らませた状態で大動脈弓までノ レーンカテーテルを引き抜き頸 動脈内膜を 3回障害した。血管内膜障害の 1週間前より、実施例 1 4で作製した 化合物 2の OZW型ェマルジヨン製剤 （化合物 2 - MS) を 1日 1回反復静脈 投与し、 また、 血管内膜障害後も 2週間、 1 日 1回ずつ反復静脈投与した。 化合物 2 - MSの 1回の投与量は 100 // g I kg、 または 300 y g I kg (各々有 効成分量として）とし用量依存的に血管内膜肥厚を抑制するかどう力を検討した。 陰性対照として化合物 2が含有されていな!/ヽ OZW型ェマルジョン製剤を投与し た。 また、陽性対照としてェナラプリル（ Sigma社） を用い、上記と同様に 30 mg / kgを 1日 1回経口経路で投与した。
血管内膜肥厚を障害後 2週間目に評価した。 摘出した頸動脈の横断切片を Hematoxylin - Eosin ( HE)染色し、 血管内腔面積、 内弾性板で囲まれた面積、 及 ぴ外弾性板で囲まれた面積を測定した。新生内膜面積 (内弾性板で囲まれた面積 - 血管内腔面積）の中膜面積（外弾性板で囲まれた面積 -'内弾性板で囲まれた面積） に対する比を用いて内膜肥厚を評価した。
その結果を図 1 1に示す。 ィヒ合物 2 - MS が用量依存的に内膜肥厚を抑制する 事が明かとなった。 その作用強度は化合物 2 - MS 300 /z g/kgでェナラプリル 30 rag / kgとほぼ同等だった。
(試験例 9 ) 合成型血管平滑筋細胞増殖試験
被験物質にっレヽて血管平滑筋細胞増殖への作用を検討した。
動脈硬ィヒ症の進行に伴って血管平滑筋細胞が収縮型から合成型に形質転換し、 PDGFなどの炎症性サイトカインを分泌しながら血管平滑筋細胞が増殖し動脈硬 化巣が進展すると考えられている （ロスの仮説)。
従って、化合物 2による血管平滑筋細胞増殖への作用を以下の様に測定した。 ラット類動脈内膜をバルーニングによって擦過し、 2週間後にェクスプラント 法 （Explant culture)によって調製した血管平滑筋細胞を 10%牛胎児血清を含ん だ DMEM培地 （Gibco)にて培養し、 数回継代し安定させた後、 5 X 1 0 3細胞 / cm2の細胞密度に蒔種し実験に用いた。 増殖因子 PDGF ( Sigma社） 50 ng / ml と併せて化合物 2を上述細胞に添加し、 24時間後、 BrdUアツセィ（ Science ' 82， 218, p. 474、 Cytometry、85， 6， p. 584) によって細胞密度を測定した。 コン トローノレとして、 薬剤無添加の場合の細胞密度を測定した。
その結果、化合物 2は 0. 3〜： 3 μ Μ濃度において濃度依存的に血管平滑筋細胞増 殖を抑制した。 その結果を図 1 2に示す。
相対的平滑筋細胞数％= [実験群での細胞数] I [コントロールでの細胞数] X 100
産業上の利用可能性
本発明の化合物は、 血小板凝集 （特に、 コラーゲンによって惹起される血小板 凝集）を強く抑制することができ、炎症を抑制することができ、循環器系疾患（例 えば、 血栓性疾患、 動脈硬化性疾患または高脂血性疾患） に対して優れた予防若 しくは治療効果を示す。

Claims

請求の範囲
1 . 式 I
R
Figure imgf000048_0001
(式中、
Aは、 置換されてもよい C H 3 C nH (2 n一 2m) — （nは 4から 2 2の間のいずれ かの整数であり、 mは不飽和数を表し、 0から 7の間のいずれかの整数である） を表し、
1は 0から 1 0の間のいずれかの整数であり、 sは 0または 1であり、 s力 S Oの 場合は p + q = 4若しくは 5であり、 sが 1の場合は p + q = 3若しくは 4である が、 いずれの場合も p及ぴ qは、 pか qのいずれかが 1以上の整数であり、 Rは 炭素数 1〜1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基であり、 RAは水素または 炭素数 1〜1 0の直鎖でも分枝鎖でもよいアルキル基である） で表される脂肪族 化合物若しくはその立体異性体、 またはそれらの製薬学的に許容される塩。
2. 式 I I
Figure imgf000049_0001
II
(式中、
Aは、 置換されてもよい CH3CnH (2n一 2m) — （nは 4から 22の間のいずれ かの整数であり、 mは不飽和数を表し、 0から 7の間のいずれかの整数である） を表し、
1は 0から 10の間のいずれかの整数であり、 Rは炭素数 1〜 10の直鎖でも 分枝鎖でもよいアルキル基であり、 RAは水素または炭素数 1〜： 10の直鎖でも 分枝鎖でもよいアルキル基である）で表される、請求項 1に記載の脂肪族化合物、 若しくはその立体異性体、 またはそれらの製薬学的に許容される塩。
3. 式 I I I
R
ノ
N
A 顧 ノ
〇
III
(式中、
Aは、 置換されてもよい CH3CnH (2n一 2m) — （nは 4から 22の間のいずれ かの整数であり、 mは不飽和数を表し、 0から 7の間のいずれかの整数である） を表し、
1 は 0から 1 0の間のいずれかの整数であり、 Rは炭素数 1〜 1 0の直鎖でも分 枝鎖でもよいアルキル基であり、 RAは水素または炭素数 1〜 1 0の直鎖でも分 枝鎖でもよいアルキル基である） で表される、 請求項 1に記載の脂肪族化合物若 しくはその立体異性体、 またはそれらの製薬学的に許容される塩。
4. (4Z, 11, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) - N - [ 2—（ 1 —メチルピロリジン— 2 - ィル） ェチル] ドコサへキサェンアミ ド若しくはその光学異性体またはそれらの 製薬学的に許容される塩。
5 . (4Z, 11, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z) - N - ( 4 -メチルビペラジン一 1一ィル） ドコサへキサェンアミド若しくはその光学異性体またはそれらの製薬学的に許容 される塩。
6 . A— C O— OH [Aは、 置換されてもよい CH 3 C n C H (2n一 2m) — （n及 び mは請求項 1で定義した通りである） を表す]で示されるィ匕合物と、
(C O C 1 ) 2との反応生成物に、
式 V I
R
-腿 2
Figure imgf000050_0001
VI
( p、 q、 s、 1、 R及ぴ RAは請求項 1で定義した通りである） の化合物を 反応させることを含む請求項 1の化合物を製造する方法。
7 . 請求項 1〜請求項 5のいずれか 1項に記載の化合物またはその製薬学的に 許容される塩を有効成分として含有する、 血小板凝集を抑制する為の医薬。
8 . 請求項 1〜請求項 5のいずれか 1項に記載の化合物またはその製薬学的に 許容される塩を有効成分として含有する、 循環器系疾患を予防または治療する為 の医薬。
9 . 請求項 1〜請求項 5のいずれか 1項に記載の化合物またはその製薬学的に 許容される塩を有効成分として含有する、 閉塞性動脈硬ィヒ症を予防または治療す る為の医薬。
1 0. 請求項 1〜請求項 5のいずれか 1項に記載の化合物またはその製薬学的 に許容される塩を有効成分として含有する、 炎症を抑制する為の医薬。
1 1 . 請求項 1〜請求項 5のいずれか 1項に記載の化合物またはその製薬学的 に許容される塩を有効成分として含有する、 脳梗塞を治療するための医薬。
1 2. .請求項 1〜請求項 5のいずれか 1項に記載の化合物またはその製薬学的 に許容される塩を有効成分として含有する、 PTCA後の再狭窄を治療または予防す るための医薬。
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