JPWO2002102364A1 - PPARγ作動性医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高度不飽和脂肪酸の誘導体を含む医薬組成物に関する。さらに詳しくは、本発明はPPARγ(Peroxisome proliferator−activated receptor γ:ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体γ)に作動する前記医薬組成物を提供する。
背景技術
ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体(PPAR)は、最初核内オーファン受容体として発見され、その後α、σ(あるいはβ)、γの3種類の遺伝子が同定されている。α、σ、γはそれぞれ特異的な組織分布をしており、核ホルモン受容体遺伝子群の中の一群を構成している。PPARγは脂肪組織において高度に発現し、脂肪細胞分化及び脂肪産生において重要な役割を担っていると考えられている。
血糖低下薬を探索する中で、インスリン抵抗性改善薬として開発されたチアゾリジンジオン(TZD)誘導体がPPARγのリガンドである可能性が報告された(’95 Cell.83 p.803−812)。その後6年近く経って、今なお、TZDによる血糖低下のメカニズムは混沌としているものの、現時点では、2型糖尿病(NIDDM)に於いて、インスリンシグナル破錠によって引き起こされるインスリン抵抗性を、TZDがPPARγを活性化する事によって改善し、TZDが血糖を低下させるという考え方が提案されている(’99 Cell.100 p.1863)。つまり、健常者では、膵β細胞より分泌されるインスリンが、肝臓や末梢骨格筋に於てインスリン受容体(IR)と結合し、インスリン受容体基質(IRS)経由で、糖取り込み、糖利用が亢進するが、一方、NIDDM患者では、IRS以降の伝達が弱まり、高血糖を示す(’00 Seience 289 p.37,’00 J.Clin.Inv.105,10 p.1437)。
門脇らの研究グループは、IRSサブタイプのひとつIRS−1遺伝子KOマウスを作ったところ、糖尿病には至らないもののインスリン抵抗性を示した(’00 J.Clin.Inv.105,10 p.1437)。一方、NIDDM患者では、脂肪細胞、炎症性細胞より分泌される炎症性サイトカインTNFαがIRS−1のシグナル伝達を弱める(IRSのリン酸化を抑制する)が、TZDは、TNFαによって弱められたIRS−1のリン酸化を回復した(’97 J.Clin.Inv.100 p.1863)。つまり、TZDがIRS−1の働きを良くする事によってインスリンシグナルを回復し、インスリン抵抗性を改善している事が示された。
門脇らの研究グループはPPARγの直接的な作用を検討する為、PPARγKOマウス作製を試みた。両遺伝子のホモKOマウス(null)は肺不全の胎生致死を示したので、便宜的に、ヘテロKOマウスを用いて解析したところ、ヘテロKOマウスはPPARγ遺伝子を多く持った野性型と比較して、体重減少、脂肪細胞分化抑制を示し、PPARγが飢餓に備えたエネルギー蓄積遺伝子として働いている可能性を示唆した(’99 Moll.Cell 4 p.597)。即ち、PPARγが脂肪細胞数を増加する事によってエネルギーを蓄積し、糖質や脂質の恒常性を維持していると述べている。
PPARγによるインスリンシグナル正常化と脂肪細胞分化の両作用を機作として、TZDが血糖を低下すると考えられるが、TZDは強い副作用を引き起こす問題点がある。インスリン抵抗性改善薬として市販されたTZDは深刻な肝障害を示して発売中止となったり、肝障害による死亡例が報告されているものがある。従って、TZDのような副作用を示すことのない、PPARγを経由する糖尿病治療薬が求められている。
さらに、PPARγ作動物質はNIDDM改善のみならず、高TG(トリアシルグリセロール)血症改善、降コレステロールなどの作用を示し、脂質レベルを改善することから、抗動脈硬化性、脂質代謝改善を示す可能性が指摘されている(’98 Diabetologia 41,p.257)。
一方、ロイコトリエンやプロスタグランジンなどアラキドン酸の水酸化代謝物が好中球活性化、血小板凝集、血管収縮などを経由して疼痛、組織障害や発熱を引き起こす事が知られている。また、魚油に豊富に含まれる高度不飽和脂肪酸(PUFA)であるドコサヘキサエン酸(DHA、22:6n−3)(炭素数22,n−3系列で不飽和数6の直鎖不飽和脂肪酸)やエイコサペンタエン酸(EPA、20:5n−3)(炭素数20,n−3系列で不飽和数5の直鎖不飽和脂肪酸)の水酸化がマダイやニジマスの表皮や鰓に存在する酵素、リポキシゲナーゼによって代謝されている事が報告されていた。しかし、リポキシゲナーゼ活性を持った細胞種の同定は行われていなかった。昨年、英国のAnderew F.Rowleyらの研究グループは、ニジマス鰓細胞をパーコルを用いた密度勾配によって分画し、得られた細胞集団の脂質水酸化活性を検討したところ、鰓の上皮細胞がリポキシゲナーゼ活性を示す事をつきとめた(’99 Comparative Biochemistry and Physiology 122,p.297)。
Rowleyらは、体重120−500gのニジマスの鰓をハンクス緩衝液中でミンスし、コラゲナーゼ消化で得られた細胞懸濁液をパーコルに重層、20,000×gにて15分間遠心分離して3層の細胞集団に分画した。H&E染色とPAS染色によって、3つの細胞集団が多形上皮細胞、ゴブレ上皮細胞と、それ以外の細胞である事を確認し、それぞれの細胞集団(1×107個)をCa2+イオノフォアーで刺激した後、C18ODSカラムを用いた逆相HPLCによって脂肪酸を分析した結果、上皮細胞集団がOH−DHAやOH−EPAを産生していた。つまり、以前より報告されていた魚鰓のリポキシゲナーゼ活性が上皮細胞に局在している可能性が示唆された事になる。
魚上皮細胞より見い出された水酸化PUFAの生理作用に関し、血管平滑筋収縮に及ぼす作用を、Norman Salem Jrらが検討している[J.W.Karanian et al.,The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics(1994)270,1105−1109.]。N.Salem Jrらは、C−11、C−14、C−17のモノOH−DHA、C−12のOH−EPAの4物質が、トロンボキサンA2(TX A2)類縁体U 46619(2.5micro M)によるラット大動脈平滑筋収縮を抑制し、その作用強度は14OH−DHA>17OH−DHA>11OH−DHA>12OH−EPAの順に強く、最も強い14OH−DHAによる25%阻止点IC25値は1.07±0.34micro Mだった。つまり、魚鰓より見い出された水酸化PUFAが、TX A2による血小板凝集や血管収縮を抑制し、抗炎症的に作用している可能性を示した事になる。
哺乳動物でも、リポキシゲナーゼ活性が血小板や腸上皮細胞に報告されており、例えば、ヒト血小板中で、11OH−DHA、14OH−DHAが外因性DHAから代謝される事が示されている。また、魚油を摂食させたラット血小板をCa2+イオノフォアーで刺激すると1.4micro Mの14OH−DHAが放出される事が確認されているが、先述の14OH−DHAによる血管平滑筋収縮の25%抑制点であるIC25値と比較すると、両者はほぼ同等である事が解る。つまり、哺乳動物体内に於ける14OH−DHA濃度は、抗炎症作用を発揮できる濃度域と一致する事になり、14OH−DHAが動物体内に於ける恒常性維持に積極的に関与している可能性が示唆されている。
しかし、現在までのところ、このような高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体がPPARγに作用するとの報告は出されていない。
発明の開示
本発明の目的は、新規なPPARγ作動性医薬組成物を開発し、これをPPARγが関与する各種疾患の治療薬として提供することにある。
本発明者らは、上記の点に鑑み、鋭意研究を行った結果、炭素鎖長20〜22の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体が、PPARγ作動性を示す事を見い出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、炭素鎖長20〜22の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体又はその医薬的に許容できる塩を含むPPARγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明において、PPARγ作動性医薬組成物とは、脂肪細胞などの細胞の核内受容体であるPPARγに作用してこれを活性化することにより、PPARγが関与する種々の疾患を予防、治療する医薬品をいう。
本発明はさらに、循環器系疾患を治療する為の前記PPARγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、動脈硬化症を治療する為の前記PPARγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、脂質代謝病を治療する為の前記PPARγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、糖尿病を治療する為のPPARγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、炎症性疾患を治療する為のPPARγ作動性医薬組成物を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明のPPARγ作動性医薬組成物には、有効成分として炭素鎖長20〜22の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体を含む。
本発明において、炭素鎖長20〜22の高度不飽和脂肪酸とは、炭素鎖長が20〜22であって、二重結合を3個以上含む不飽和脂肪酸をいう。二重結合は好ましくは4個以上、さらに好ましくは5個又は6個である。好ましい高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸(DHA、22:6n−3)(炭素鎖長22,n−3系列で不飽和数6の直鎖不飽和脂肪酸)やエイコサペンタエン酸(EPA、20:5n−3)(炭素鎖長20,n−3系列で不飽和数5の直鎖不飽和脂肪酸)であるが、これに限定されない。
高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体は、高度不飽和脂肪酸のいずれかの二重結合が水酸化された誘導体をいい、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体又はエイコサペンタエン酸(EPA)の水酸化誘導体が好ましく、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体がより好ましい。水酸化誘導体の立体配置は(R)配置でも(S)配置でも構わないが、(S)配置であることが好ましい。ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体として最も好ましいのは4(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA、8(S)−OH−DHA、および17(S)−OH−DHAであるが、これに限定されない。本発明のPPARγ作動性医薬組成物には、これらから選択される高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体を1種以上含むことができる。
高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体はいかなる方法で製造したものでもよく、例えば、魚類の鰓、上皮細胞などから、あるいはヒト、ラットなどの哺乳動物血小板などから分離、精製したものであってよい。また、天然由来のDHAを水酸化し、これをHPLCなどによって分画することにより合成してもよく、特に制限はない。例えば、ニジマス鰓細胞や上皮細胞、哺乳動物血小板、あるいはRBL−1などのヒト白血球由来株化細胞懸濁液に10〜200mMのDHAを基質として加え、10〜37℃にて1〜50分間反応させて得ることもできる。反応液を酸性(ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸などにより)にすることによって反応を停止し、各OH誘導体を有機溶媒(クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリルなど)を用いて抽出した後、展開溶媒(クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸など)によってHPLC、あるいは薄層クロマトグラフィーなどの方法によって分画することができるが、これらの方法に限定されるものではない。また、各OH誘導体は部位特異的な酵素を用いた選択的な合成法によって調製することもできる。なお、4(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA、8(S)−OH−DHA、および17(S)−OH−DHAについては、和光純薬工業より市販されており、入手することが可能である。
本発明のPPARγ作動性医薬組成物は、脂肪細胞などの細胞の核内受容体であるPPARγに作用してこれを活性化することにより、PPARγが関与する種々の疾患の予防、治療に有効である。PPARγが関与する疾患としては、循環器系疾患(例えば、血栓症、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞など)、動脈硬化症、脂質代謝病(例えば、高脂血症、高コレステロール症、高TG症、高LDL症など)、糖尿病(特に、NIDDM)、炎症性疾患(例えば、血管透過性亢進を原因とする種々の炎症反応)を含むが、これに限定されない。
本発明のPPARγ作動性医薬組成物は、通常、全身的または局所的に、経口的または非経口的に投与される。投与量は、疾患の種類、症状の程度、投与対象の年齢や体重などの諸条件をもとに総合的に判断し、最適な量を適宜決定するべきであり、特に限定されない。しかし、通常、成人では1日当たり経口投与の場合0.001〜100mg/kg、非経口投与の場合0.0001〜10mg/kgである。投与は必要に応じて1日1回ないし複数回に分けて行われる。
本発明の有効成分である高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体はその医薬的に許容できる塩であってもよい。医薬的に許容できる塩としては、酸付加塩類、たとえばメタンスルホン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸および臭化水素酸塩が含まれる。
本発明の医薬組成物の投与は、固体組成物、液体組成物およびその他の組成物の経口投与、注射剤、外用剤、坐剤などの非経口投与のいずれの形態であってもよく、必要に応じて最適な方法が選択される。医薬組成物は、通常の製剤化に用いられる担体、賦形剤、その他の添加剤を用いて調製することができる。製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの活性物質(有効成分)が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤または丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性または腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、2つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水および注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート80(登録商標)などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤(例えば、乳糖)、溶解補助剤(例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸)のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。また、無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の医薬組成物としては本発明の化合物の少なくともひとつを有効成分として含み、常法によって処方される外用液剤、軟膏剤、塗布剤、坐剤、経皮剤、点眼剤などが含まれる。
更に、前記有効成分を、乳化剤として、リン脂質あるいは非イオン界面活性剤を用いて、O/W型エマルジョン製剤(乳剤)として、特開平6−298642に記載のように調製することができる。乳化剤は、単独あるいは2種以上組み合わせて使用でき、添加量は、適宜でよいが、0.001〜10%(W/V)、好ましくは0.01〜5%(W/V)である。
リン脂質としては、大豆由来リン脂質、卵黄由来リン脂質、リゾレシチン、フォスファチジルコリン(レシチン)、フォスファチジルセリンなどの単独あるいは組み合わせが使用可能である。非界面活性剤としては、分子量500〜15000のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体(例えば、プルロニックF−68)、分子量1000〜10000のポリアルキレングリコール、分予量1000〜20000のポリオキシアルキレン共重合体、硬化ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステルなどの単独あるいは組み合わせが好適に用いられるがこれに限定されない。
以下の実施例に示すように、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体を用いてPPARγ作動性を試験したところ、顕著なPPARγ作動性活性を示した。すなわち、8(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA、4(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、及び17(S)−OH−DHAはいずれも、陽性対照として用いた15deoxy−PG J2と同等、あるいはそれよりも強くPPARγを作動した。
さらに、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体を遺伝的糖尿病マウスdb/dbに経口投与した結果、有意な血糖値低下作用を示した。
また、ex vivo血小板凝集試験では、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体は用量依存的に血小板凝集を抑制した。
疑似血管in vitro炎症モデルを用いた試験では、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体は好中球の粘着、透過のいずれをも抑制することが観察された。このことから、ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体は好中球と血管内皮細胞の相互作用に対して抑制的に働き、抗炎症の方向に作用している可能性が示唆され、抗炎症的に作用することにより、循環器の恒常性を維持し、病態を改善する方向に作用することが期待できる。
本発明のPPARγ作動性医薬組成物の有効成分である高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体は天然物由来物質であり、毒性などの副作用が少ないことが期待できる。従って、本発明のPPARγ作動性医薬組成物は、TZDのような副作用を示さない糖尿病治療薬、特に2型糖尿病(NIDDM)の予防薬及び/又は治療薬として特に利用価値が大きい。また、本発明のPPARγ作動性医薬組成物は、炎症性疾患の治療薬としても効果が期待できる。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例1:DHAの水酸化誘導体の調製
ニジマス(体重3g)の鰓を0.05M PBS中でミンスし、30秒間ポリトロンホモジナイザーを用いて懸濁した。150,000×gにて15分間超遠心分離して酵素液を得た。この酵素液10microlを0.9mlの0.05M PBS(1mM還元グルタチオン、25℃、pH7.8)中にて反応させた。反応液中に70mM DHAを加え、10分間酸化反応に処した後、3%ギ酸を用いてpHを4に調整して反応を停止した。反応液を酢酸エチルで抽出し、クロロフォルム:メタノール:酢酸:水(90:8:1:0.8)を展開溶媒としてHPLCを用いて脂質を分画した。生成物をGC−MSで分析し、4(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA(m/z430[M],373[M−CH3]+,340[M−HOSi(CH3)3]+)、8(S)−OH−DHA、および17(S)−OH−DHAを得た。また、これらの化合物は和光純薬から購入することもできる。
実施例2:PPARγ作動性試験
COS−1細胞にGAL4(酵母転写アクチベーター)−PPARγ融合タンパク質発現プラスミド(エフェクタープラスミド)、と併せてレポータープラスミド17M2CAT(GAL4応答配列+TKプロモーター+クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼcDNA)を導入した後、培養培地に被検物質を添加し24時間後のCAT活性を測定し、陰性対照(無添加)と比較した相対的CAT活性を算出する事でPPARγ作動性を評価した(’90 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,p.9995;’94 J.B.C.269,p.32700;’95 ibid.p.5858;’00 J.B.C.275,p.33201)。
DHA(Cayman Chemical製)及びEPA(Cayman Chemical製)各3micro Mを被検物質として実験した結果、DHAは3micro Mにて陰性対照比205±79%と有意にPPARγ転写活性を上昇させたが、一方、EPAは3micro M濃度で作用を観察できなかった。
次に、実施例1で調製した4(S)−OH−DHA、8(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA及び17(S)−OH−DHAを被検物質とし、PPARγのリガンドであることが知られている15deoxy−PG J2(Bio Mol製)を陽性対称としてPPARγ作動性を試験した。
得られた結果を図1に示す。8(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHAはそれぞれ1micro M濃度にて薬剤無添加の陰性対照群と比較して7培程度の活性を示し、4(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、及び17(S)−OH−DHAは同濃度で陰性対照比3倍前後の活性を示し、いずれも陽性対照として用いた15deoxy−PG J2と同等、あるいはそれよりも強く作動した。
実施例3:遺伝的糖尿病マウスを用いた検討
遺伝的糖尿病マウスdb/db(平均体重42g、1群6匹、入手先:三協)を用い、8(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA 100mg/kgを1週間経口投与した結果、陰性対照群(溶媒として5%アラビアゴムを投与した)と比較して有意な血糖値低下を観察できた(表1)。
実施例4:ex vivo血小板凝集試験
コラーゲンにより惹起される血小板凝集を4(S)−OH−DHAが阻止するかどうかを検討した。
(1)血小板の調製
SD系雄ラット(SPF、9週齢)を麻酔した後、腹大動脈から採血し、3.8%クエン酸ナトリウム(山之内製薬、チトラール)を入れたチューブに血液を採取した。これを室温にて900rpmにて10分間遠心分離することで上澄(PRP、多血小板画分)を分取し、残渣をさらに2500rpmにて15分間遠心分離することで上澄(PPP、貧血小板画分)を得た。
(2)透過度の測定
アグリゴメーター(ヘマトレーサー240 12ch、MCM社製)のPPP(貧血小板画分)用37℃保温槽にPPPをキュベットに入れて装着した。次にPRP(多血小板画分)200μlをキュベット内に添加しPRP用反応槽に装着した。マグネチックスターラーで撹拌しながら30秒間、自動調整によってPPPの透過度T650nm=100%、PRPの透過度T650nm=0%に補正した。
1分後にコラーゲン(MCM社製)20μlを加え、その後の透過度の変化を5分間記録した。血小板が凝集すると透過度が上昇する。凝集がピークに達した最大凝集時の透過度Tを陰性対照の透過度T0と比較し、以下の式を用いて凝集阻止率を百分率表示した。
凝集阻止率=(1−T/T0)×100
(3)薬効の発現時間の検討
SD系雄ラット(SPF、9週齢)尾静脈に10mg/kgの4(S)−OH−DHAを投与して、投与後10分、60分後の2時点にて採血し、調製した血小板を用いて、3〜6μg/mlのコラーゲンで惹起した際の凝集率を検討した。対照群として、溶媒(生理食塩水)を投与したものの凝集率を測定した。
その結果を図2に示す。
4(S)−OH−DHAの投与10分、60分後のいずれの時点でも、溶媒投与群と比較して、血小板凝集は抑制されたが、その作用はほぼ同等であった。
(4)用量依存性の検討
4(S)−OH−DHAが、ex vivo血小板凝集を用量依存的に抑制するかどうかを検討した。対照として、溶媒(生理食塩水)を用いた。ラット尾静脈に10、1、0.1mg/kgの被験物質を投与し、10分後に採血、調製した血小板を用いて、3〜6μg/mlのコラーゲンで凝集惹起した。その結果、10、1mg/kg投与群に於て溶媒投与群と比較して血小板凝集が抑制された(図3)。
実施例5:疑似血管in vitro炎症モデルによる試験
炎症性サイトカインTNFαが血管内皮細胞の接着分子を誘導し炎症を惹起すると炎症部位に好中球が移動し、さらに炎症を悪化させるという報告がある。重度の炎症は循環器の恒常性を破錠させ、動脈硬化を進行させると考えられている。
PPARγ作動性物質は血管内皮細胞において、TNFαが誘導する接着分子であるICAM−1の発現を抑制することで、炎症細胞の血管内皮細胞への接着を減弱させ、炎症を抑制する方向に働くことが報告されている(’00 Circulation 101,p.235)。
そこで、TNFαを惹起剤として用いた疑似血管in vitro炎症モデルにおいて、PPARγ作動性を有する4(S)−OH−DHAが抗炎症作用を有するかどうか検討した。
(1)疑似血管in vitro炎症モデルの確立
疑似血管in vitro炎症モデルは、生物薬科学実験講座、12炎症とアレルギーII、p.327−341(大内和雄編集、広川書店、平成5年5月15日発行)に記載の方法に従って作成した。
3μm孔の多孔性ポリカーボネート膜により上室と下室とに区切られたトランスウェル(クラボー社製)を用い、上記膜の底面に一層のウシ内皮細胞を付着させ、37℃、5%CO2条件下、80分間培養した。次に、トランスウェル上室に蛍光標識した好中球浮遊液を加え、同時に、TNFαを終濃度50、25若しくは17ng/mlとなるように上室の細胞浮遊液に懸濁した。
つまり、上記モデルでは、好中球が、上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下室へ透過すること、及び、内皮細胞層に粘着することは、血管内部のTNFαに応答して好中球が血管内より炎症部位に移動してゆくことを疑似している。
(2)好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する4(S)−OH−DHAの影響
次に、上記疑似血管in vitro炎症モデルを用いて、好中球と血管内皮細胞との相互作用に、4(S)−OH−DHAがどのように影響するかを検討した。
トランスウェル上室に、4(S)−OH−DHAを、30、3、0.3μMの終濃度で、好中球浮遊液をTNFαとともに上室に入れ、上記と同様、上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下室へ透過した好中球数、及び、内皮細胞層に粘着した好中球数を測定し、それから好中球移動率、粘着率(%)を算出した。
好中球移動率、粘着率は陰性対照群での好中球に対する薬物投与群での好中球移動数、粘着数を相対値として表示した。
その結果を図4及び図5に示す。4(S)−OH−DHAは好中球の粘着、透過どちらも抑制した。つまり、4(S)−OH−DHAは好中球と血管内皮細胞の相互作用に対して抑制的に働き、抗炎症の方向に作用している可能性が示唆された。
4(S)−OH−DHAは抗炎症的に作用することにより、循環器の恒常性を維持し、病態を改善する方向に作用する可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
図1は、種々のOH−DHA化合物のPPARγ作動性試験の結果を示すグラフである。
図2は、コラーゲンにより惹起されるex vivo血小板凝集を4(S)−OH−DHAが阻止するかどうかを検討した結果を示すグラフである。
図3は、4(S)−OH−DHAが、ex vivo血小板凝集を用量依存的に抑制するかどうかを検討した結果を示すグラフである。
図4は、好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する4(S)−OH−DHAの影響(好中球移動率(%))を示すグラフである。
図5は、好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する4(S)−OH−DHAの影響(好中球粘着率(%))を示すグラフである。
Claims (8)
- 炭素鎖長20〜22の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体又はその医薬的に許容できる塩を含むPPARγ作動性医薬組成物。
- 高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体がドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体又はエイコサペンタエン酸(EPA)の水酸化誘導体である請求項1記載のPPARγ作動性医薬組成物。
- ドコサヘキサエン酸(DHA)の水酸化誘導体が4(S)−OH−DHA、10(S)−OH−DHA、11(S)−OH−DHA、14(S)−OH−DHA、8(S)−OH−DHA、および17(S)−OH−DHAから選択される1種以上である請求項2記載のPPARγ作動性医薬組成物。
- 循環器系疾患を治療する為の請求項1〜3のいずれかに記載のPPARγ作動性医薬組成物。
- 動脈硬化症を治療する為の請求項1〜3のいずれかに記載のPPARγ作動性医薬組成物。
- 脂質代謝病を治療する為の請求項1〜3のいずれかに記載のPPARγ作動性医薬組成物。
- 糖尿病を治療する為の請求項1〜3のいずれかに記載のPPARγ作動性医薬組成物。
- 炎症性疾患を治療する為の請求項1〜3のいずれかに記載のPPARγ作動性医薬組成物。
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