DE60200065T2

DE60200065T2 - Verfahren zur Züchtung von Hausstaubmilben, Herstellung der Nährkultur für dieses Verfahren und Verfahren zur Herstellung von allergenem Protein dieser Hausstaubmilben

Info

Publication number: DE60200065T2
Application number: DE60200065T
Authority: DE
Inventors: Claude Andre; Thierry Batard
Original assignee: Stallergenes SA
Current assignee: Stallergenes SA
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2022-02-23
Also published as: DK1236394T3; FR2821623B1; ES2208627T3; EP1236394B1; ATE252314T1; EP1236394A1; DE60200065D1; FR2821623A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kulturverfahren für Acari zur Produktion von Extrakten von Acari-Allergenen sowie Nährstoffformulierungen, die zur Verwendung in diesen Verfahren bestimmt sind. Ein Verfahren zur Kultur von Acari ist im U.S.-Patent 6129935 beschrieben.
Verschiedene Acari-Spezies werden zur Herstellung von Allergenextrakten verwendet, die in allergologischen Formulierungen eingesetzt werden, in denen sie zum Beispiel für allergologische In-vivo- oder In-vitro-Tests oder auch als desensibilisierende Zubereitungen dienen, die an Patienten verabreicht werden.
Unter den Acari findet man insbesondere die nachstehenden Spezies: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini oder tropicalis, Pyroglyphus africanus und Euroglyphus maynei, die Hausmilben sind und sich hauptsächlich von menschlichen Schuppen ernähren.
Herkömmlicherweise verwendet man zur Produktion von Acari Kulturmedien, die menschliche Schuppen enthalten, die angemessen behandelt und autoklaviert sind, um Viren, Bakterien und nicht übliche übertragbare Agenzien, wie Prionen, zu inaktivieren. Die so produzierten Acari ermöglichen es, mittels Extraktion Allergenextrakte in großer Menge und praktisch frei von Allergenen anderen Ursprungs zu erhalten. Diese können Kreuzreaktionen nach sich ziehen, welche die Tests fehlerhaft oder zur Induktion von Allergien fähig machen können.
Andere Verfahren zur Kultur von Acari sind bekannt, wobei man Nährmedien auf der Basis von Proteinen, wie Garneleneiern oder Schweineleberpulver, einsetzt. Mit diesen Medien lassen sich zufriedenstellende Produktionen erzielen, aber sie umfassen nicht-milbeneigene Substanzen, insbesondere tierischen Ursprungs, die allergenisch und/oder potenziell infektiös sein können.
Obwohl die Inaktivierungsverfahren, die zur Behandlung der für die Acari-Kultur bestimmten menschlichen Schuppen eingesetzt werden, eine extrem hohe Wirksamkeit besitzen, und obwohl Kontaminationen mit üblichen oder nicht üblichen infektiösen Agenzien sehr unwahrscheinlich sind, ist es dennoch wünschenswert, zur Kultivierung von Acari Nährmedien eines nicht menschlichen und nicht tierischen Ursprungs zu verwenden, die frei von Bestandteilen sind, die allergenisch sein könnten.
Die vorliegende Erfindung bietet somit die Bereitstellung eines Verfahrens zur Kultur und Produktion von Acari und insbesondere Acari der vorstehend genannten Spezies bereitzustellen, wobei das Risiko für das Vorhandensein infektiöser Agenzien tierischen oder menschlichen Ursprungs maximal beschränkt ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines solchen Verfahrens, welches eine erhebliche Ausbeute an Acari ermöglicht.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist gegebenenfalls die Verbesserung der Antigenizität von Acari, die zur Herzustellung der endgültigen Formulierungen verwendet oder extrahiert werden sollen.
Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, die leichte Beseitigung eines großen Teil des Kulturmediums zu ermöglichen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kultur und zur Produktion von Acari und insbesondere von Acari mindestens einer der folgenden Spezies: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini oder tropicalis, Pyroglyphus africanus und Euroglyphus maynei, dadurch gekennzeichnet, dass die Acari in einem Medium kultiviert werden, das keine menschlichen oder tierischen Bestandteile oder Proteine enthält und, in wirksamen Mengen, eine Mehrzahl von Aminosäuren in Teilchenform mit einer Granulometrie unter 250 μm oder in lyophilisierter Form umfasst.
Die gewünschte Granulometrie der Aminosäuren kann durch Zerkleinerung der Aminosäuren, einzeln oder im Gemisch, erhalten werden.
Äquivalent können die Aminosäuren durch Lösen von Aminosäuren und anschließende Lyophilisierung erhalten werden. In diesem Fall ist bevorzugt, dass die Lyophilisierung zu Teilchen mit einer Größe unter 250 μm führt.
Selbstverständlich können in dem erfindungsgemäßen Medium nur einige der Säuren zerkleinert und/oder lyophilisiert worden sein, insbesondere in Abhängigkeit von ihren physiologischen Eigenschaften, zum Beispiel ihrer Löslichkeit, und gegebenenfalls können einige Säuren als solche zum Gemisch gegeben werden.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass die Acari sich äußerst schlecht kultivieren lassen und die Ausbeuten sehr klein sind, wenn man die kommerziell erhältlichen Aminosäuren als solche (ohne Zerkleinerung und/oder ohne Solubilisation/Lyophilisation und/oder ohne Zugabe von Salzen) verwendet. Überraschenderweise führen die Gemische von Aminosäuren mit den in der Erfindung definierten Eigenschaften zu Ausbeuten, die vergleichbar, wenn nicht höher sind als die herkömmlichen Ausbeuten unter Verwendung menschlicher Schuppen.
Die Gemische von Aminosäuren umfassen vorzugsweise den Großteil oder die Gesamtheit der Aminosäuren, die natürliche Bestandteile von Proteinen sind. Mit Hauptteil sind mindestens 50%, zum Beispiel 60 bis 80%, der zwanzig Aminosäuren, die natürliche Bestandteile von Proteinen sind, oder von vergleichbaren assimilierbare Aminosäuren gemeint. Man kann jedoch ebenso Aminosäuren zugeben, die keine wesentlichen Be standteile sind, oder bestimmte Aminosäuren durch Aminosäuren austauschen, die keine Bestandteile von Proteinen sind.
Bei einer besonderen Ausführungsform kann man vorteilhafterweise ein Gemisch von Aminosäuren herstellen, das der Zusammensetzung von Keratin oder der Lederhaut nahe kommt.
Bei Varianten der Erfindung kann man jedoch ebenfalls Gemische von Aminosäuren einsetzen, die der Zusammensetzung von Garneleneiern oder Soja nahe kommen. In anderen Formulierungen kann man sich von dieser Verteilung entfernen.
Die jeweiligen Anteile der Aminosäuren können sich an die quantitativen Anteile der Aminosäuren in Substanzen annähern, wie Keratin oder der Lederhaut, den Eiern von Garnelen oder Soja, aber eine Identität der Verteilung der Anteile wird keinesfalls beansprucht, solange die einzelnen Aminosäuren in einer ausreichenden Menge vorliegen.
Das Nährmedium, das das Gemisch von Aminosäuren des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst, kann ebenfalls andere übliche Bestandteile von Nährmedien für Acari, die sowohl dazu bestimmt sind, eine Nahrungsergänzung beizusteuern, als auch dem Medium die richtige Beschaffenheit für die Entwicklung und Vermehrung von Acari zu verleihen, sowie Salze umfassen.
Somit ist bevorzugt, in das Kulturmedium Weizenkeime und/oder Hefe, insbesondere Bäckerhefe, und/oder Cyanocobalamin und/oder D-Biotin zu geben. Das Medium kann auch andere Vitamine umfassen.
Die Weizenkeime werden vorzugsweise erhitzt, um jegliches Risiko einer Allergenizität auszuschalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Kulturmedium, das das Gemisch von Aminosäuren enthält, auf einen angemessenen Feuchtigkeitsgrad gebracht, der für die kultivierten Acari üblich ist, und bei der gewöhnlichen angemessenen Temperatur gehalten. Die Dauer der Kultur kann zum Beispiel drei Monate betragen, und eine übliche Dauer von 2 bis 5 Monaten ist bevorzugt.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Kulturmedien, welche die erfindungsgemäßen Gemische von Aminosäuren enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Verfahren zur Herstellung von Extrakten oder Formulierungen von Allergenen, die ausgehend von den Acari erhalten werden, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gezüchtet werden.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beschreibung deutlich, die als nicht beschränkendes Beispiel gegeben wird.
Kulturen wurden gleichzeitig in Aminosäuremedien gemäß den Beispielen 1 und 3 und auf menschlichen Schuppen gemäß Beispiel 2 durchgeführt.
Beispiel 1:
Dieses Beispiel beschreibt ein Kulturverfahren in einem Medium, das eine kommerzielle Zubereitung von Aminosäuren enthält.
Es wird ein Kulturmedium hergestellt, das Weizenkeime, Cyanocobalamin, Bäckerhefe und D-Biotin enthält.
Die Weizenkeime werden bei 121°C für 20' autoklaviert, dann zerkleinert und durch ein Sieb von 250 μm gesiebt.
Das Cyanocobalamin wird zerkleinert und durch ein Sieb mit einer Porosität von 250 μm gesiebt.
Die Bäckerhefe wird bei 122°C für 2 bis 3', dann zwischen 100 und 135°C für 12" in einer Trommel mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute und dann bei 100°C für 15' erhitzt.

Die kommerzielle Aminosäurezubereitung wurde von der Firma Fresenius-Kabi France S. A. erhalten. Sie hat die folgenden Zusammensetzung, Q. s. 1 l PPI-Wasser:

L-Alanin	3,8 g
L-Rrginin	4,2 g
L-Asparaginsäure	5,2 g
L-Cysteinchlorhydratmonohydrat, ausgedrückt als L-Cystein/L-Cystin	1,7 g
L-Glutaminsäure	11,5 g
Glycin	2,7 g
L-Histidin	3,1 g
L-Isoleucin	5,0 g
L-Leucine	6,7 g
L-Lysinchlorhydrat, ausgedrückt als L-Lysin	5,0 g
L-Methionin	2,4 g
L-Phenylalanin	7,0 g
L-Prolin	10,3 g
L-Serin	9, 6 g
L-Threonin	3,8 g
L-Tryptophan	1,3 g
L-Tyrosin	0,6 g
L-Valin	5,5 g
Calciumchloriddihydrat	0,44 g
Magnesiumsulfatheptahydrat	0,493 g
Natriumhydroxid	2,6 g
Kaliumhydroxid	0,70 g
Kaliumchlorid	0,078 g

Die Lösung wird lyophilisiert, und das gewonnene Lyophilisat wird durch ein vibrierendes Sieb mit einer Porosität von 250 μm gesiebt.
Das Medium im eigentlichen Sinne wird auf die nachstehende Weise hergestellt:
Für 600 g Medium:
Es werden 252 g gesiebte Weizenkeime, 252 g gesiebte Hefen, 90 g der Lösung der lyophilisierten und gesiebten Aminosäuren, 5,4 g gesiebtes Cyanocobalamin und 0,6 g D-Biotin eingewogen, zusammen in einem Homogenisator homogenisiert und dann über ein Sieb mit einer Porosität von 400 μm gesiebt. Das Medium wird in beschrifteten, verschlossenen Flaschen konditioniert und kann im Kühlraum bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C aufbewahrt werden.
Die Kultur im eigentlichen Sinne erfolgt auf die nachstehende Weise:
Die hergestellten Medien werden mit einer herkömmlichen Probe von Animpfkulturen von Dermatophagoides pteronysinnus angeimpft. Die Kultur erfolgt in Flaschen bei einer Temperatur von 25°C und einem Feuchtigkeitsgrad von 75%. Die Entnahmen erfolgen zu verschiedenen Zeitpunkten. Die gewonnenen Medien werden anschließend lyophilisiert und zu 5% in einer 4 g/l Natriumbicarbonatlösung für 24 Stunden bei +4°C extrahiert, dann bei 3000 Umdrehungen pro min für 15 min bei +4°C zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und dann über ein Millex-HV-Filter mit einer Porosität von 0,45 μm (Millipore) filtriert.
In den erhaltenen Extrakten werden die gesamte allergenische Aktivität (mittels Rast-Hemmung), die Proteine (mithilfe der Technik von Lowry und/oder der Technik von Bradford) sowie die Hauptallergene Der p 1 und Der p 2 (mithilfe üblicher Nachweiskits) bestimmt.
Das Ergebnis der Rast-Hemmung wird als IR/ml ausgedrückt (IR: Reaktivitätsindex), wobei die Extrakte im Vergleich zu einem Bezugsextrakt bestimmt werden, dessen Aktivität 100 IR/ml beträgt.
Beispiel 2:
Das Medium des Beispiels 2 ist identisch zu dem des Beispiels 1, mit dem Unterschied, dass die kommerzielle Lösung lyophilisierter Aminosäuren durch eine Zubereitung menschlicher Schuppen ersetzt wird.
Diese Schuppen werden in Säckchen bei 134°C für 18' autoklaviert. Die Schuppen werden anschließend auf Inox-Tabletts überführt, die bei 37°C für 1 bis 2 Wochen in einen Trockenofen gestellt werden. Die Schuppen werden anschließend zerkleinert und mit Sieben von 500 und 250 μm gesiebt.
Das gesammelte Schuppenpulver wird dann mit Aceton behandelt, und man lässt es sich für 24 Stunden absetzen. Der Überstand wird verworfen. Dann wird ein letzter Wascharbeitsgang mit Aceton durchgeführt. Das Sediment wird gewonnen, das man in dünnen Schichten auf Tabletts verteilt und mit einer perforierten Aluminiumfolie abdeckt. Diese Substanz wird unter einem Abzug getrocknet und dann abschließend mit einem vibrierenden 250-μm-Sieb gesiebt.
Neben 90 g des Aminosäuregemischs umfasst das Kulturmedium dieses Beispiels 90 g der vorstehenden Zubereitung menschlicher Schuppen.
Beispiel 3:
Das Kulturmedium umfasst die gleichen Weizenkeime, das gleiche Cyanocobalamin und die gleiche Hefe wie in den Beispielen 1 und 2.

Es wird ein Gemisch von Aminosäuren auf die folgende Weise hergestellt:
In einem Behälter werden 10 Liter steriles destilliertes Wasser vorgelegt und darin die folgenden Aminosäuren solubilisiert:

L-Alanin	17,2 g
L-Arginin	26,4 g
L-Cysteinchlorhydratmonohydrat	4,4 g
Glycin	49,6 g
L-Histidin	5,2 g
L-Isoleucin	13,2 g
L-Lysinchlorhydrat	20,0 g
L-Methionin	8,0 g
L-Prolin	8,8 g
L-Serin	44,0 g
L-Threonin	13,6 g
L-Valin	13,6 g
L-Tryptophan	1,3 g
L-Phenylalanin	20,8 g
L-Leucin	34,8 g
L-Glutaminsäure	64,4 g
L-Asparaginsäure	9,7 g

Die Lösung wird anschließend lyophilisiert, und das gewonnene Lyophilisat wird durch ein vibrierendes 250-μm-Sieb gesiebt.
Getrennt werden 6,5 g Asparaginsäure und 4,0 g Tyrosin zerkleinert.
Zur Herstellung des Mediums werden zu 252 g Weizenkeimen, 252 g Hefen, 5,4 g Cyanocobalamin und 0,6 g D-Biotin 79,5 g des vorstehenden lyophiliserten Gemischs, 6,5 g zerkleinerte Asparaginsäure und 4,0 g zerkleinertes Tyrosin hinzugefügt.
Das Ganze wird homogenisiert und dann durch 400 μm gesiebt. Nach Animpfen wird die Kultur wie in den Beispielen 1 und 2 durchgeführt.
Die vergleichenden Ergebnisse der Beispiele 1 bis 3 sind in der Tabelle 1 für einen ersten Kulturzyklus nach 3 Monaten und in den Tabellen 2 und 3 für einen zweiten Kulturzyklus (die in einem gegebenen Medium kultivierten Acari werden erneut im gleichen Medium angeimpft) nach 2,5 Monaten bzw. 3 Monaten dargestellt:
TABELLE 1
Gesamt-Allergenaktivität und Proteinanteile von Der p 1 und Der p 2 in 1/20stel der Extrakte von Dermatophagoides pteronyssinus, die in verschiedenen Medien kultiviert wurden, nach drei Monaten Kultur
TABELLE 2
Gesamt-Allergenaktivität und Proteinanteile von Der p 1 und Der p 2 in 1/20stel der Extrakte von Dermatophagoides pteronyssinus, die in verschiedenen Medien während eines zweiten Zyklus kultiviert wurden, nach zweieinhalb Monaten Kultur
TABELLE 3
Gesamt-Allergenaktivität und Proteinanteile von Der p 1 und Der p 2 in 1/20stel der Extrakte von Dermatophagoides pteronyssinus, die in verschiedenen Medien während eines zweiten Zyklus kultiviert wurden, nach drei Monaten Kultur
Es ist ersichtlich, dass die Kultur auf Aminosäuren gemäß Beispiel 3 schlechte Ergebnisse in einem zweiten Kulturzyklus erbringt, obgleich in einem ersten Kulturzyklus gute Ergebnisse liefert. Dieses Beispiel ist somit nicht auf die Routinekultur von Acari anwendbar.
Dagegen scheint die Kultur auf Aminosäuren gemäß Beispiel 1 gut geeignet zu sein, weil nicht nur die Ergebnisse nach zwei Kulturzyklen zufriedenstellend sind, sondern diese auch sehr nahe bei den Ergebnissen liegen, die mit den menschlichen Schuppen erhalten werden, welche die natürliche Nahrung der hier in Frage kommenden Acari darstellen. Die relativ schwachen Ergebnisse, die im ersten Test erhalten wurden, sind sicher auf die ganz erhebliche Kulturdauer zurückzuführen (eine Gewinnung nach zweieinhalb Monaten hätte sicher bessere Ergebnisse erbracht).

Claims

Medium zur Kultur und zur Produktion von Acari (Milben) und insbesondere von Acari mindestens einer der folgenden Spezies: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini oder tropicalis, Pyroglyphus africanus und Euroglyphus maynei, dadurch gekennzeichnet, dass es keine menschlichen oder tierischen Bestandteile oder Proteine enthält und dass es, in wirksamen Mengen, eine Mehrzahl von Aminosäuren in Teilchenform mit einer Granulometrie unter 250 μm oder in lyophilisierter Form umfasst.
Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Aminosäuren umfasst, die durch eine Feinzerkleinerung von Aminosäuren erhalten werden.
Medium nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es zudem lyophilisierte Aminosäuren und/oder Aminosäuren, wie handelsüblich, umfasst.
Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es lyophilisierte Aminosäuren und Aminosäuren, wie handelsüblich, umfasst.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es Salze enthält.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Aminosäuren mindestens 50% der Aminosäuren, die natürliche Bestandteile von Proteinen sind, oder deren Äquivalente enthält.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Aminosäuren das Spektrum der Aminosäuren wiedergibt, die Bestandteile von Keratin oder der Lederhaut sind.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Aminosäuren das Spektrum der Aminosäuren wiedergibt, die in den Eiern von Garnelen oder in Soja vorliegen.
Medium nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Anteile der Aminosäuren nahezu die quantitativen Anteile der Aminosäuren und Salze in solchen Substanzen sind, wie Keratin oder der Lederhaut oder den Eiern von Garnelen oder Soja.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zudem andere, für Nährmedien für Acari übliche Bestandteile enthält, die eine Nahrungsergänzung beisteuern sollen und/oder dem Medium eine geeignete Beschaffenheit für die Entwicklung und Vermehrung von Acari geben sollen.
Medium nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem Weizenkeime und/oder Hefe, insbesondere Bäckerhefe, und/oder Cyanocobalamin und/oder D-Biotin enthält.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es Soja enthalten kann.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 50% der nachstehenden Aminosäuren enthält: L-Alanin L-Arginin L-Asparaginsäure L-Cystein/Cystin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin
Medium nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuren in den folgenden Anteilen für insgesamt 93,711 g umfasst: L-Alanin 3,g g L-Arginin 4,2 g L-Asparaginsäure 5,2 g L-Cysteinchlorhydratmonohydrat, ausgedrückt als L-Cystein/L-Cystin 1,7 g L-Glutaminsäure 11,5 g Glycin 2,7 g L-Histidin 3,1 g L-Isoleucin 5,0 g L-Leucine 6,7 g L-Lysinchlorhydrat,ausgedrückt als L-Lysin 5,0 g - L-Methionin 2,4 g - L-Phenylalanin 7,0 g - L-Prolin 10,3 g - L-Serin 9, 6 g - L-Threonin 3,8 g - L-Tryptophan 1,3 g - L-Tyrosin 0,6 g - L-Valin 5,5 g - Calciumchloriddihydrat 0,44 g - Magnesiumsulfatheptahydrat 0,493 g - Natriumhydroxid 2,6 g - Kaliumhydroxid 0,70 g - Kaliumchlorid 0,078 g
Verfahren zur Kultur und zur Produktion von Acari (Milben) und insbesondere von Acari mindestens einer der folgenden Spezies: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini oder tropicalis, Pyroglyphus africanus und Euroglyphus maynei, dadurch gekennzeichnet, dass die Acari in einem Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 14 kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium, das das Gemisch von Aminosäuren enthält, auf einen angemessenen Feuchtigkeitsgrad gebracht wird, der für die kultivierten Acari üblich ist, und bei der angemessenen Normaltemperatur gehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur für 2 bis 5 Monate durchgeführt wird.
Verfahren zur Gewinnung einer Zubereitung von Allergenen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Extraktion von Allergenen aus einer Kultur nach einem der Ansprüche 15 bis 17 vorgenommen wird.