CN101646338A - 用于螨的产生的方法 - Google Patents

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CN101646338A CN200880010084A CN200880010084A CN101646338A CN 101646338 A CN101646338 A CN 101646338A CN 200880010084 A CN200880010084 A CN 200880010084A CN 200880010084 A CN200880010084 A CN 200880010084A CN 101646338 A CN101646338 A CN 101646338A
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M·J·扎莫罗萨利拉斯
C·阿提加瓦兹奎兹
J·C·莫勒诺瑟古拉
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Abstract

用于培养和产生螨例如屋尘螨的方法，其包括在适当的条件下将螨培养于适当的固体生长培养基中，并且在适当的生产室中培养适当的时间，其特征在于将螨培养在密封的袋子中包含的培养基中。

Description

用于螨的产生的方法
发明领域
本发明涉及用于培养和生产螨例如屋尘螨(house dust mite)的方法，其包括在适当的条件下将螨培养在适当的生长培养基中，并且在适当的生产室中培养适当的时间，其特征在于将螨培养在密封的袋子内包含的培养基中。
背景
将不同物种的螨例如屋尘螨用于制备用于变应性制剂(allergyformulation)的变应原提取物，所述变应性制剂用于例如体内或体外变应性试验或用于提供给患者的脱敏制剂。
此类螨特别地包括下列物种的螨：欧洲尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)、美洲尘螨(Dermatophagoides farinae)、Blomiakulagini或热带无爪螨(Blomia tropicalis)、非洲麦食螨(Pyroglyphus africanus)和梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)。
许多现有技术资料描述了用于生产螨的工业相关方法。关于描述的螨的产量的提高，可以说现有技术基本上关注于技术因素例如新培养基、最适宜湿度、温度等上。
一般说来，对于工业相关大规模生产，现有技术使用FLASKS或备选地表达瓶(expressed bottle)来培养/饲养屋尘螨。
EP1236394B1(相应于US2003/0059445A1，Stallergenes)描述了在瓶子中进行的屋尘螨的培养(参见实施例1)。
T.Batard等人(Int Arch Allergy Immunol 2006；140：295305)描述了在塑料瓶中进行的培养(参见第296页，第2栏)。
F.C.Yi等人(Asian Pacific J.of Allergy and Immunology(1999)17：189-194)描述了在埃伦迈尔瓶(Erlenmeyer flask)中进行的屋尘螨的培养(参见第190页，中间栏)。
J.Miyamoto(Japan，J.Exp.Med.第45卷，2.p.133-138，1975)描述了在Roux瓶中进行的屋尘螨的培养(参见第134页，第2栏)。
在埃伦迈尔瓶或Roux瓶中培养屋螨(house mite)可被当作现有技术的“标准”方法。埃伦迈尔瓶的图示于本文的图1中，Roux瓶的图示于本文的图2中。
对于小规模屋尘螨的培养/生产，现有技术还描述了罐子的使用(参见例如J.Med Ent.第12卷，no.6：577-621，1976)。
还描述了在袋子/封袋(envelope)中进行螨的培养。Ivanov和Petrova在Medisinskaja Parazitoligija i Parazitarnye Bolezni，46-49，1985中描述了在密闭的5x10cm赛璐玢袋(cellophane bag)中进行的欧洲尘螨的小规模生产。根据论文的作者，通过在赛璐玢袋子中培养螨来消除霉菌感染抑制螨培养物的危险。生长培养基的量(1g)和从而可在论文中描述的赛璐玢袋子中获得的螨培养物的数量非常低。还已知赛璐玢具有非常低的透氧性，因而赛璐玢不适合用作用于螨的大规模培养的袋子材料。
其他物种的螨用于生物控制领域以减少农作物和温室中的害虫。
Crop Protection，5(2)：122-124，1986中的论文描述了通过其中在袋子中培养捕食性螨的方法进行的用于在贮藏的谷物或种子中进行螨的生物控制的捕食性螨(predator mite)普通肉食螨(Cheyletus eruditus)的大量饲养。使1kg容量的方底面粉袋装满100g莴苣种子、20.000只被捕食的螨和100-200只捕食性螨。通过折叠密封各袋子，并且将其在25℃和75％的相对湿度下保存28至35天。为了检测终止饲养的正确时间，在第28天后每隔一天检查捕食性螨对被捕食的螨的比例。
与饲养捕食性螨的上述方法相比，根据本发明的培养方法的一个重要有利方面是本发明的袋子包括透明区域，该区域允许目视检查袋子中螨的生长。一般地，用于本发明的方法的培养基的量也比上述方法中使用的培养基的量大得多。
GB 2168680描述了在微小穿孔的塑料材料或纸的封袋中进行的活的节肢动物或相似的捕食性动物的培养。该申请中描述的袋子也不允许对袋子中螨的生长进行最佳观察，因为塑料材料的穿孔可以干扰对螨生长的观察。
发明概述
有待通过本发明解决的问题是提供用于培养和生产螨的改良的方法。
解决方案基于下述发现：通过在适当的袋子例如图3中显示的纸/塑料袋中培养螨，可以显著地提高屋尘螨的产量。
图3中显示的纸/塑料袋可表征为袋子，其中：
1：一侧用可透氧的纤维素材料(例如，纸)制造；
2：另一侧用透明的塑料材料制造。塑料还可以是可透氧的；
3：袋子的大小大约为300mm(宽)x500mm(长)x可能扩展至使袋子能够包含适当量的螨培养基的大约65mm的高度。
如对于本领域技术人员来说是已知的，适当的屋尘螨生长培养基通常是固体培养基，因为螨天然生活在例如房屋中的床中或其他类似的地方。仓储螨(storage mites)也以固体材料为食，捕食性螨可以以被捕食的螨(其以固体培养基为食)为食。
使用本文中描述的袋子的优于使用瓶子(例如埃伦迈尔瓶(参见图1)或Roux瓶(参见图2))的现有技术的有利方面，包括：
A：一侧上的可透氧的(例如纸)材料具有表面区域，该区域比现有技术瓶子的顶部的相应的“洞”大得多。这为正在生长的螨提供了更好和更均匀的氧气供应，从而提供了更好的生长；
B：袋子中提高的氧气供应也提供了每物理空间单位具有更多的螨培养基的可能性。例如，250ml埃伦迈尔瓶只可装有大约30-50g培养基(参见图1)，然而图3中显示的袋子包含大约500g培养基，并且可包含甚至更多培养基(例如1200g)。在埃伦迈尔瓶中，培养基上方相对大的自由空间是必需的，因为来自瓶顶部的相对小的洞的氧气供应提供了相对有限的氧气供应；
C：此外螨培养基可以以相对薄的层存在于袋子中(将例如图3中的袋子与图1的埃伦迈尔瓶相比)。这也提供了更好的螨生长，因为螨通常生活/生长在表面上(螨天然生活在例如房屋中的床上或其他相似的“表面”位置)；
D：本文中所描述的袋子可相对容易地堆放在例如图4中显示的支架中，因而可在工业相关生产室(参见例如图4)中具有大量堆放的袋子。根据上述B点，最终的结果是袋子的使用与瓶子的使用相比显著增加了室中的生产能力(可包含更多的螨培养基)；
E：透明的例如塑料材料允许通过例如使用立体显微镜直接观察生长而不必从袋子中取出样品。当使用瓶时，使用例如立体显微镜要困难得多，并且通常必须从瓶中取出样品来分析生长状况。取出样品当然意味着污染的危险；
F：袋子在一端是开放的，因而可容易地将培养基装入袋子(参见例如图5)。与现有技术使用的瓶子(其中开口/洞要小得多)相比较，这应当能够被看出。因此，袋子的使用提供了用培养基自动(机器而非手工)填充袋子的可能性，这使工业生产更加有效。一旦袋子充满培养基并且接种了螨，在螨的实际培养/生长之前就封闭袋子的开口(参见例如图6)；
G-袋子允许直接在袋子中收获培养物并且贮存材料而无需打开；
H-袋子可以是可抛弃的(只使用一次)，从而不必清洗。与当使用埃伦迈尔瓶时使用的空间相比较，用于装空袋子的空间也是很小的；
I-当使用袋子时，由于容器而增加的重量可忽略不计，并且避免了在操作过程中损坏玻璃的危险；和
J-可密封袋子，从而使螨的逃脱和污染减少至最低限度。
如本文中工作实例中所显示的，本文中描述的袋子用于螨的工业相关生产的用途提供了至少与只装有大约30g培养基的250ml埃伦迈尔瓶(参见图1中的瓶子-培养基上方相对大的自由空间)相同的每克培养基的螨产量。为此的一个原因是袋子中更好和更均匀的氧气供应，其允许螨在袋子中有效生长，所述袋子中存在围绕培养基的相对非常小的开放空间。如根据上面很明显的是，这提供了与瓶子的使用相比，将更多袋子(即，更多培养基)置于生产室的可能性，从而可在相同的物理生产室产生多得多的螨。
本领域技术人员可常规地鉴定可用于获得本文中论述的螨的生产的有利方面的适当类型的袋子。
总地说来，本文中描述的用于螨的生产的袋子可表征为具有充分的透氧性从而获得上述有利方面的袋子。
袋子的另外的基本特征是其包括透明的区域，从而允许例如使用立体显微镜直接观察螨的生长而不必从袋子中取出样品。
因此，本发明的第一方面涉及用于培养和生产螨的方法，其包括在适当的条件下在适当的固体培养基中培养螨并且在适当的生产室中培养适当的时间，
特征在于在密封的袋子中包含的培养基中培养螨，其中：
i：袋子具有足以允许螨生长的透氧性；
ii：袋子包括透明的区域，从而允许通过例如使用立体显微镜直接跟踪螨的生长而不必从袋子中取出样品；
iii：包含正在生长/培养的螨的培养基以相对薄的层存在于袋子中，从而产生相对大的表面，所述相对薄的层定义为培养层的高度小于110mm；和
iv：密封的袋子包含至少25g培养基。
术语“培养”还可称为“饲养”。两个术语在本文中可互换使用。
定义
在论述本发明的详细的实施方案之前，提供了与本发明的主要方面相关的特定术语的定义。
所使用的与本文中描述的新型螨生产方法相关的术语“袋子”应当理解为本领域技术人员在本说明书中对该术语的理解。本领域技术人员理解袋子具有许多与瓶子或罐子不同的特征。与瓶子或罐子相比较，袋子更柔软，从而可相对容易地改变形状(例如，被折叠)。在本说明书中，可使袋子例如围绕螨培养基成形(例如，被折叠)以在袋子内具有相对小的围绕培养基的自由开放空间(参见例如本文中的图3)。“开放的袋子”在本文中指具有适合用于将培养基加入袋子内的开口的袋子(参见图5中的说明)。可密封(例如通过热封-参见本文中的图6)开口以使培养基在生产过程中封闭或装在袋子内。这样的袋子称为“密封的袋子”。
下面只以举例的方式描述本发明的实施方案。
附图
图1：250ml埃伦迈尔瓶。
图2：具有平衡颈(offset neck)的Roux培养瓶。容量为1000ml。
图3：本文中描述的具有螨培养基的密封的袋子的实例。
图4：本文中描述的堆放在支架中的袋子的实例。
图5：填充有培养基的开放袋子的实例。
图6：袋子的密封的实例。
具体实施方案的详述
袋子的透氧性
如上所述，袋子具有足以允许螨生长的透氧性。下面论述本文中相关的优选定量的透氧性参数。
如对于本领域技术人员来说是已知的，袋子的透氧性可被看作与袋子材料的孔隙度相关。根据本领域，这可按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法来测量。标准ISO 5636-3，Bendtsen法对于本领域技术人员来说是熟知的。
如按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法所测量的，本文中用于工作实例的袋子(图3中举例说明的)具有300ml/分钟的最小孔隙度。换句话说，袋子具有至少300ml/分钟的透气性，如按照标准ISO5636-3，Bendtsen法测量的。
“正常的(normal)”纸可具有大约10ml/分钟的透气性。不受限于理论，据认为具有至少5ml/分钟的透气性的袋子具有足以获得本文中描述的生产有利方面的透氧性。
因此，在优选实施方案中，袋子是具有按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法测量的至少5ml/分钟的透气性的可透氧的袋子。更优选，袋子具有按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法测量的至少50ml/分钟的透气性，更优选袋子具有按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法测量的至少150ml/分钟的透气性，和最优选袋子具有按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法测量的至少250ml/分钟的透气性。
一般来说，据认为由于实践目的，制造具有按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法测量的超过20000ml/分钟的透气性的适当的袋子是非常困难的。
如对于本领域技术人员来说是已知的，当袋子包含纤维素材料(例如纸)时优选使用标准ISO 5636-3，Bendtsen法。
本文中备选的用于测量袋子的透氧性的适当方法是已知的标准试验方法，其通过使用电量传感器(coulometric sensor)，按照已知的美国国家标准学会(American Standards National Institute)文件/标准ASTM F1307-02的标准测量通过干燥包装的氧气穿透率。
该ASTM F1307-02试验法包括用于测定氧气进入包装的稳定穿透率的方法。更特别地，该方法能用于在正常使用中密封干燥环境的包装。
本文中用于进行该ASTM F1307-02试验法的适当装置是可商购获得的装置。
ASTM F1307-02试验法事实上可用于任何适当的袋子材料(例如纸或塑料)，从而是本文中最优选的透氧性试验方法。
ASTM F1307-02试验法的单位是cm3氧气/袋/天
不受限于理论，据认为具有至少10cm3氧气/袋/天的透气性的袋子具有足以获得本文中描述的生产有利方面的透氧性。
在优选实施方案中，袋子具有按照标准的已知的试验方法测量的至少10cm3氧气/袋/天的透氧性，所述试验方法按照已知的美国国家标准学会文件/标准ASTM F1307-02的标准，通过使用电量传感器来测量通过干燥包装的氧气穿透率。更优选袋子具有至少20cm3氧气/袋/天的透氧性，更优选袋子具有至少50cm3氧气/袋/天的透氧性和最优选袋子具有至少100cm3氧气/袋/天的透氧性。
如上面所论述的，在工作实施例1中证明了通过使用本文中描述的用于螨的工业生产的袋子(参见图3中的袋子)，获得了至少与只包含大约30g培养基的250ml埃伦迈尔瓶(参见图1中的瓶-培养基上方相对大的自由空间)中相同的每克培养基的螨的产量。为此的一个原因是袋子中更好的和更均匀的氧气供应，这允许螨在袋子中有效生长，尽管在袋子中存在相对非常小的围绕培养基的开放空间。如根据上面很明显的是，与瓶子的使用相比较，这提供了使更多的袋子(即更多的培养基，从而更多的螨)置于生产室中的可能性，从而可在相同的生产室中产生多得多的螨。
分析袋子是否具有优选的透氧性的备选方法是将袋子中螨的产量与装有30g培养基并且用棉花塞封闭的的标准250ml埃伦迈尔瓶(图1的瓶中举例说明的)中的产量相比较。
因此，在优选实施方案中，袋子具有透氧性，该透氧性足以在袋子中提供与包含30g培养基并且用棉花塞密闭的250ml埃伦迈尔瓶中的产量相比至少65％的每克培养基的螨产量，其中在相同的条件下，即，使用相同的生长培养基、相同的生长条件、相同的时间和相同的生产室来培养袋子和埃伦迈尔瓶中的螨。
更优选，袋子具有足以在袋子中提供与250ml埃伦迈尔瓶(其包含30g培养基并且用棉花塞进行密闭)中的产量相比至少80％的每克培养基的螨产量的透氧性，更优选袋子具有足以在袋子中提供与250ml埃伦迈尔瓶(其包含30g培养基并且用棉花塞密闭)中的产量相比至少90％的每克培养基的螨产量的透氧性，以及最优选袋子具有足以在袋子中提供与250ml埃伦迈尔瓶(其包含30g培养基并且用棉花塞密闭)中的产量相比至少相同的每克培养基的螨产量的透氧性，其中在相同的条件下，即，使用相同的生长培养基、相同的生长条件、相同的时间和相同的生产室来培养袋子和埃伦迈尔瓶中的螨。
袋子材料和其他袋子特征
许多不同的适当的袋子材料可用于提供具有本文中相关的透氧性的袋子。
在优选实施方案中，袋子是由至少一种选自纤维素材料(例如纸)、塑料材料和织物(纺织的或非纺织的)的材料制造的袋子。还可使用此类材料的组合。
适当的塑料材料的实例包括聚丙烯、聚乙烯、PVC、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、尼龙、粘胶(viscose)和聚酯。
塑料材料可以是透明的，从而允许例如通过使用立体显微镜直接观察螨的生长/成熟而不必从袋子中取出样品。因此，优选袋子的一部分由透明塑料材料制造。
当使用例如立体显微镜通过透明材料来目测检查时，成熟通螨培养物常被分析为每视野的螨的数目(例如每克的螨的数目)。
袋子本身必须具有足够的透明区域以能够提供袋子中的螨培养物的成熟的足够观察。优选，袋子在袋子的总表面积中包含至少10％的透明区域，更优选袋子在袋子的总表面积中包含至少25％的透明区域，和更优选袋子在袋子的总表面积中包含至少50％的透明区域。在袋子的总表面积中包含至少50％的透明区域的袋子是适当的袋子，其中如图3中举例说明的，一侧由透明塑料材料制造。
适当的纤维素材料的实例包括卡纸板(cardboard)或更优选纸。
非纺织的织物通常由聚合物纤维例如聚丙烯或聚乙烯纤维制造。纺织织物可以是例如棉花。
不证自明的是，袋子应当由封闭的袋子内的螨基本上不能通过材料本身从其逃脱的材料制成(一些螨可能确实从袋子中的一些小洞逃脱但这不被理解为通过材料本身逃脱)。
一般说来，纤维素材料(优选纸)比大部分本文中相关的塑料材料更具有透氧性。在另一个方面塑料材料可以是透明的。
在优选实施方案中，袋子由纸、透明塑料材料和任选地其他适当的材料制造。
基于此，优选袋子是这样的袋子，在该袋子中：
1：袋子的一侧基本上由纤维素材料(优选纸)组成；和
2：袋子的另一侧基本上由透明塑料材料组成。
图3中举例说明了这样的袋子的实例。
术语“基本上由.....组成”应当理解为本领域技术人员在本说明书中对其的理解。本领域技术人员理解，为了具有优于瓶的使用的显著提高，上述优选袋子不必在一侧由100％的纤维材料(优选纸)组成并且在另一侧由100％的透明塑料材料组成。例如，其可在一侧包含90％的纤维材料(优选纸)并且在另一侧包含90％的透明塑料材料。
本文中使用的袋子应当优选由医学级材料制成。适当的医学级袋子的实例是适合于在高压灭菌器中对材料灭菌的袋子。许多商业袋子可在市场上购得。适合于在高压灭菌器中对材料灭菌和用于本文的工作实施例的袋子可从Westfield Medical Ltd，UK商购获得。
医学级袋子通常按照例如BS EN ISO 11607-：2006来进行标准化，并且其通常必须满足几个标准。例如，孔隙度必须低至足以避免细菌和微生物穿过；其必须对蒸汽(但不对微生物)具有足够的透性；其应当对操作处理具有足够的抗性并且其应当基本上不含可与产品接触的毒素。适当的医学级袋子通常由医用纸(Medical Paper)和塑料制造。
因此，在优选实施方案中，本文中描述的袋子是医学级袋子，其中孔隙度低至足以避免细菌和微生物穿过，从而也避免屋尘螨穿过；其对蒸汽(但不对微生物(从而不对屋尘螨))具有足够的透性；其对操作处理具有足够的抗性并且其基本上不含可与袋子内的螨接触的毒素。
袋子的大小在本发明中不是至关重要的。然而，由于实践的原因，袋子的大小优选为20mm至2000mm(宽)x40mm至4000mm(长)x可能扩展至使袋子能够包含适当量的螨培养基的适当的高度，如本发明的第一方面的第(iii)项中指出的。
图3中显示的和用于本文中工作实施例的袋子是300mm(宽)x500(长)x可能扩展至65mm的高度的袋子。
在优选实施方案中，袋子的大小是50mm至1000mm(宽)x100mm至1500mm(长)x可能扩展至使袋子能够包含相关量的螨培养基的适当的高度，如在本发明的第一方面的第(iii)项中指出的。
许多适当的袋子由便宜的材料例如纸或便宜的塑料材料制造。因此，使用本文中论述的袋子的有利方面是它们可在用于螨的生产后扔掉，即袋子不在以后的螨的生产中再使用。埃伦迈尔瓶相当贵，从而必须在使用后进行清洗以用于以后的螨的生产。
本发明的方法可用于大规模产生螨，以用于产生用于变态反应的诊断和通过免疫疗法进行的变态反应的治疗的变应原产物，还用于产生螨例如在农作物和温室中用作生物害虫控制剂的捕食性螨。
屋尘螨和仓储螨或根螨(Bulb mites)：
在本发明的一个实施方案中，螨是屋尘螨。
在另一个实施方案中，螨是仓储螨或根螨。
在优选实施方案中，螨是真螨目(Acariformes)中的螨，更优选无气门亚目(sub order Astigmata)或前气门亚目(Prostigmatais)中的螨。
本文中描述的方法可用于同时产生不同物种的螨，例如单个袋子可包含不同物种的螨。
本文中优选的真螨目、无气门亚目和前气门亚目中的螨是至少一种选自下列科的螨：Chortoglyciphidae、蚍螨科(Pyroglyphidae)、粉螨科(Acaridae)和食甜螨科(Glyciphagidae)。这些科中适当的实例是尘螨属(Dermatophagoides)、食酪螨属(Tyrophagus)、嗜鳞螨属(Lepidoglyphus)、食甜螨属(Glycyphagus)、粉螨属(Acarus)、嗜霉螨属(Euroglyphus)、无爪螨属(Blomia)、麦食螨属(Pyroglyphus)，嗜渣螨属(Chortoglyphus)或肉食螨属(Cheyletus)。此类螨中的一些螨属于称为屋尘螨的组，其他螨称为仓储螨或根螨，且可见于室尘中。
本文中非常优选的螨是选自下列种的螨：欧洲尘螨、美洲尘螨、微角尘螨(Dermatophagoides microceras)、丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)、腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)、害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、粗脚粉螨(Acarus siro)、梅氏嗜霉螨、Blomia kulagini、热带无爪螨和非洲麦食螨。
在上述组内，最优选的屋尘螨是欧洲尘螨或美洲尘螨。
捕食性螨
捕食性螨是作为害虫特别地农作物害虫(例如昆虫、线虫或蜘蛛纲动物)的捕食者的螨。一般地，捕食性螨用于常见农作物害虫例如蓟马和粉虱的控制。
大多数捕食性螨属于植绥螨科(Phytoseiidae)(蜱螨目(Acarina))并且温室中最常见的捕食性螨是瑞氏钝绥螨(Amblyseius swirskii)、智利小钝绥螨(Phytoseiulus persimilis)、加州钝绥螨(Amblyseiuscalifornicus)、黄瓜钝绥螨(Amblyseius cucumeris)、Amblyseiusdegenerans和兵下盾螨(Hypoaspismiles)。
其他捕食性螨包括Euseius tulalpharensis、西方盲走螨(Typhlodromus occidentalphalis)、梨盲走螨(Typhlodromuspyri)、Zetzellialpha malphali、Amblyseius(Iphiseius)degeneralphans、Amblyseius(Kalphampimodromus)alphaberralphans、巴氏钝绥螨(新小绥螨)(Amblyseius(Neoseiulus)balpharkeri)、Amblyseius alphandersoni、伪钝绥螨(Amblyseius(Neoseiulus)falphallalphacis)、芬兰钝绥螨(真绥螨)(Amblyseius(Euseius)finlalphandicus)、Amblyseius(Typh i odromalphalus)lalphailalphae、Amblyseius(Typhlodromalphalus)limonicus、Amblyseius(Typhlodromips)montdorensis、卵形钝绥螨(卵圆真绥螨(Amblyseius(Euseius)ovalphalis)、Amblyseius(Euseius)scutalis、Amblyseius(Euseius)stipulates和奥氏钝绥螨(Amblyseius(Neoseiulus)womersleyi)(也称为长刺钝绥螨(Amblyseius longispinosus))。该名单不是穷举的。McMurtry等人(Annual Review of Entomology 42，291-321)主要基于食性和相关生物学和形态学性状将植绥螨科中的生活阶段(life-stage)的多样性进行了分类。由于螨分类学不断地变化，被分类为捕食性螨的螨的数目和种类可发生变化(参见例如Catalogue of Phytoseiidae(Moraes等人，于2004年出版)，与只列出了1500个物种的1986年出版的之前的版本相比，其列出了2,250个物种)。
此类捕食性螨用于害虫控制的用途更详细地描述于WO2008/015393。
本发明可用于提供用于农作物和温室中的害虫控制的捕食性螨的来源。具体的捕食者将基于待控制的靶害虫和将应用捕食者的农作物来选择。
例如，捕食性螨可用于控制来自下列非穷举名单中的一种或多种害虫：叶螨属的种(Tetranychus spp.)，包括但不限于二斑叶螨(Tetranychus urticae)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus)、神泽氏叶螨(T.kanzawai)、土耳其斯坦叶螨(T.turkestani)、西方叶螨(T.occidentalis)；小爪螨属的种(Oligonychus spp.)；苹果全爪螨(Panonychus ulmi)和柑橘全爪螨(P.citri)；瘿螨(Eriophyid mites)，包括但不限于番茄刺皮瘿螨(Aculopslycopersici)、斯氏针刺瘿螨(Aculus schlectendali)、橘皱叶刺瘿螨(Phyllocoptruta oleivora)、Aceriaficus、Rhyncaphytoptusficifoliae；跗线螨(Tarsonemid mites)，包括但不限于侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、白狭跗线螨(Phytonemuspallidus)；蓟马害虫，包括但不限于西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)、花蓟马(F.intonsa)、梳缺花蓟马(F.schultzei)、烟蓟马(Thrips tabaci)、棕榈蓟马(T.palmi)、美棘蓟马(Echinothrips americanus)、温室蓟马(Heliothripshaemorrhoidalis)；和粉虱害虫，包括但不限于温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、Aleyrodes proletella、A.lonicerae。
优选地选择将不引起对农作物植物本身的损害的捕食性螨。捕食性螨可用于在下列非穷举名单中的农作物植物的一种或多种中控制害虫：番茄、甜椒(sweet pepper)、朝天椒(chilli pepper)、茄子、黄瓜、豆类、南瓜、甜瓜、草莓、树莓、香蕉、番木瓜、苹果、梨、李子、葡萄、玫瑰、菊花(clirysanthemiim)、大丁草(Gerbera)、秋海棠(Begonia)、仙客来(Cyclamen)、一品红(Poinsettia)、柑桔(Citrus)、茵芋(Skimmia)、Choiysia、瑞香(Daphne)和木兰(Magnolia)。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于提供用于控制蓟马(例如西花蓟马或烟蓟马)和/或粉虱(例如温室白粉虱或烟粉虱)的捕食性螨的来源。特别地，本发明可用于提供用于控制蓟马和/或粉虱的Amblyseius swirsldi螨的来源。
适当的固体生长培养基：
屋尘螨和一些其他螨天然地生活在房子中例如床上。屋尘螨主要以人皮肤皮屑或鳞屑为食。
然而，原则上任何适当的固体生长培养基可用于在本文中描述的袋子中进行螨的生产。
事实上，使用本文中描述的用于螨的生产的袋子的有利方面可以被看作是优于现有技术瓶子或罐子的使用的相对/相关的有利方面。对于这样的相对/相关的有利方面，培养基本身是无关的，因为为了进行足够的比较实验，研究人员在袋子和瓶中使用相同的培养基。
现有技术描述了适合用于培养本文中不同的相关螨例如层尘螨的许多不同的培养基。下面提供了相关培养基的实例的简要概述。
螨需要在其中进行它们的活动的区域或生活空间。培养容器(例如袋子或瓶子)的内表面提供的区域与可用于容器体积的区域相比较相对较小。惰性或部分惰性基质可按数量级增大区域。
推荐的用于培养螨的培养基通常包含2种组分或如果只包含一种组分，那么材料的部分是不可食用的。
事实上，所有惯常使用的培养基(食物)包含大量的蛋白质(例如来自酵母)。
已对不同培养基组分(例如：酵母、白蛋白、动物饲料、鱼饲料、脱落的人皮肤、皮屑、粉末状动物肝、大豆粉)的功效进行了大量研究。
在优选实施方案中，培养基是包含至少一种选自酵母、白蛋白、鱼衍生物、粉末状动物肝、大豆粉、乳蛋白质的水解产物、维生素、矿物质和蛋白质水解产物的组分的培养基。培养基优选包含两种或更多种此类组分。
优选可使用不包含可在致敏的患者中引起过敏性反应的变应原的蛋白质水解产物。
优选在使用前在160℃下加热并干燥培养基。通常在将培养基放入袋子前进行该步骤。
为了培养上面提及的捕食性螨，培养基中需要存在被捕食的螨。培养基还可包含用作被捕食的螨的食物的培养基。
最常使用的被捕食的螨是储藏物螨(stored product mites)例如腐食酪螨、粗脚粉螨和甜果螨(Carpoglyphus lactis)。
GB2393890公开黄瓜钝绥螨可使用腐食酪螨、热带食酪螨(T.tropicus)或粗脚粉螨来饲养。Ramakers等人(Bulletin-SROP 6(3)，203-206)公开可使用麦麸作为主要食物来源并且小粗脚粉螨(Acarusfarris)作为替代的被捕食者来进行Amblyseius mckenziei和黄瓜钝绥螨的饲养。Nomikou等人(Experimental and Applied Acarology27(1-2)，57-68)公开腐食酪螨可用作Typhlodromips(Amblyesius)swirsldi的食物来源，用于获得高捕食者/被捕食者比率。Steiner等人(Australian Journal of Entomology 42，124-130)公开腐食酪螨可用作Typhlodromips montdorensis的食物来源。WO2006/057552公开瑞氏钝绥螨可用Astigmatid螨例如来自果螨科(Carpoglyphidae)、蚍螨科、食甜螨科或粉螨科的螨来饲养。特别地，其公开甜果螨可用作用于饲养瑞氏钝绥螨的被捕食的螨。还公开了不同物种的储藏物螨用于饲养捕食性螨黄瓜钝绥螨的用途。
可使用包含至少一种选自酵母、白蛋白、鱼衍生物、粉末状动物肝、大豆粉、乳蛋白质的水解产物、维生素、矿物质和蛋白质水解产物的组分的培养基培养被捕食的螨。培养基优选包含两种或更多种此类组分。一些螨需要富含糖的食物。WO 08/015393更详细地描述了被捕食的螨的优选食物。
适当的一般培养条件
本领域技术人员已知或可常规地鉴定用于具体目的螨的适当的培养条件。一般说来，本领域内描述的在瓶子或罐子中进行培养时的培养条件可用作本文中描述的袋子中的适当培养条件。
下面提供了适当的螨培养条件的概述。
屋尘螨在室温下通常生长良好，预期几乎普遍存在于屋内的种类也可能如此。适用于螨的培养的一般温度是23℃±2℃。低于10℃和高于35℃的温度通常不适合于大部分相关的螨。本文中优选适当的温度可以是23℃±5℃。
空气湿度是个重要因素。如果相对湿度(RH)高于70％，许多相关的螨(例如美洲尘螨)能够从空气中吸取水分。太高的湿度通常是不适合的，因为如果湿度高至足以促进大量细菌或真菌生长，那么不是100％灭菌的培养基将被破坏。
一般地，可以说适当的湿度可以是70至85％RH。
适当的培养时间将取决于具体的目的螨。
取决于种类，从卵通过幼虫、第一若虫、第三若虫至成年螨虫的发育在适当的培养中可需要约1个月。
现有技术描述，对于一些培养条件，对于D.Dermatophagoides，在5至16周后获得螨培养物的最佳螨蛋白质含量(用于变应原提取)。
一般来说，对于在适宜条件下饲养的许多本文中的相关螨，培养期为1至24周，通常4至20周。
培养过程中袋子的特征
在螨的培养过程中，包含正在生长/培养的螨的培养基以相对薄的层存在于袋子内，从而产生相对大的表面。
在优选实施方案中，包含正在生长/培养的螨的培养基以相对薄的层存在于袋子中，从而产生相对大的表面，所述相对薄的层定义为培养层高度小于90mm，更优选高度小于70mm，更优选高度小于60mm和最优选高度小于55mm。
在非常优选的实施方案中，培养层的高度为10mm至50mm。
在螨的培养过程中，密封的袋子包含至少25g培养基。如上面所论述的，在螨的生产中使用袋子的一个有利方面涉及进行更有效的工业化螨生产的可能性。
因此，在优选实施方案中，密封的袋子包含至少100g培养基，更优选至少400g培养基，更优选至少750g培养基和最优选至少1000g培养基。
如上面所论述的，袋子中更好的和更均匀的氧气供应允许螨在袋子中有效生长，所述袋子中存在围绕培养基的相对小的开放空间。这提供了与瓶子的使用相比，使更多的袋子(即更多培养基)置于生产室中的可能性，从而可在相同的生产室中产生多得多的螨。
与瓶子或罐子相比，袋子更柔软，从而可相对容易地改变形状(例如，被折叠)。在本发明中，可以例如使袋子围绕螨培养基成形(例如被折叠)以在具有围绕培养基的相对小的开放空间的袋子中包含培养基(参见例如本文中的图3)。
在优选实施方案中，在尘螨的培养过程中在密封的袋子中存在相对小的自由空间，这意味着培养基占据了至少30％的具有培养基的封闭的袋子的总体积(当在尘螨的培养过程中，具有培养基的密封的袋子物理地存在于生产室中时)。更优选，培养基占据了至少50％的具有培养基的密封的袋子的总体积，更优选培养基占据了至少70％的具有培养基的密封的袋子的总体积，最优选培养基占据了至少80％的具有培养基的密封的袋子的总体积(当在尘螨的培养过程中具有培养基的密封的袋子物理地存在于生产室中时)。
术语“当具有培养基的密封的袋子物理地存在于生产室中时”应当理解为本领域技术人员在本说明书中对其的理解。例如，在图5中举例说明的开放的袋子中，存在比图3中举例说明的密封的袋子更多的自由空间。如本领域技术人员在本说明书中所理解的，图5中举例说明的开放的袋子，当其物理地存在于生产室中时，不是密封的袋子。
许多袋子用于螨培养的用途
如上面所论述的，本文中描述的袋子可相对容易地堆放于例如图4中显示的支架中，然后可将许多堆积的袋子置于工业相关的生产室(参见例如图4)中。最终的结果是与瓶子的使用相比较，袋子的使用显著增加了室中的生产能力(可具有更多的培养基，从而生产更多的螨)。
因此，在优选实施方案中，生产室容纳至少10个袋子，更优选至少50个袋子，更优选至少1000个袋子和最优选至少10000个袋子。
由于实践的原因，难以想象生产室可以如此巨大以至其可容纳超过1.000.000个袋子。
可将袋子在适当的支架系统中堆摞在一起，其中下面的袋子的上表面不与上面的袋子的下表面接触。
根据上述内容，优选将袋子堆放在图4中举例说明的适当的支架系统中。
在优选实施方案中，生产室包括具有至少2个堆摞在一起的袋子，更优选具有至少5个堆摞在一起的袋子的适当的支架系统，以及更优选生产室包括具有至少8个堆摞在一起的袋子的适当的支架系统。
使袋子堆摞在一起的有利方面是支架底部的共同/单个容器足以捕获可能从袋子逃脱的螨。该装置的实例示于图4中，其中捕获容器是金属盘。捕获容器可以有利地包含捕获材料例如石蜡或羊毛脂。
当使用瓶子时，这样的捕获容器必须围绕各个单个的瓶子放置，因为瓶子不容易堆摞在一起。
因此，在优选实施方案中，具有至少2、5或8个堆摞在一起的袋子的适当的支架系统包括支架底部的用于捕获可能从袋子逃脱的螨的共同/单个容器。
这样的捕获容器的实例是盘子例如金属或塑料盘。在优选实施方案中，捕获容器包含捕获材料例如石蜡或羊毛脂。
在优选实施方案中，生产室包括至少2个上述的适当的支架系统，更优选至少10个上述的适当的支架系统，更优选至少20个上述的适当的支架系统和最优选至少100个上述的适当的支架系统。
由于实践的原因，难以想象生产室可以如此巨大以至其可包括超过200.000个上述的适当的支架系统。
螨变应原的分离/提取
工业相关的螨的大量生产的主要目的是分离/提取螨变应原来制备用于变应性制剂的变应原提取物，所述变应性制剂用于例如体内或体外变应性试验或用于提供给患者的脱敏制剂。
可对整个培养物进行提取，由此获得来自螨和螨的排泄物颗粒的变应原。已知螨的排泄物颗粒是屋尘螨变应原的重要来源。
可通过物理方法例如筛分或在不同溶液中浮选来将螨与培养基和/或排泄物颗粒分离。
变应原原料通常经历在搅拌的条件下在pH 5-9下于水性溶液(例如盐水溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢铵溶液0.05-0.125mol/L等)中进行的提取过程。这样，变应原蛋白溶解于上清液中，然而大部分培养物的组分不溶解。
回收(例如，在离心后)上清液，并且分离具有适当kDa大小(通常大于5kDa)的变应原。换句话说，通过例如针对具有5kD的截断值的膜进行的透析、超滤或分子筛层析除去低分子量(通常低于5kDa)的“杂质”。
分离的变应原的变应原活性可通过许多已知的方法例如ELISA或Rast抑制来测定。
最后，通过加入例如适当的赋形剂来配制螨变应原产物，然后其可经历无菌过滤和冷冻干燥。提取物通常包含5-60％的组1变应原(与蛋白质的总量相比较)并且其通常还以更低的比例包含组2、3的变应原和其他物质。除了冷冻干燥的变应原提取物外，适当的终药物组合物可包含相关的药物赋形剂。药物组合物可以例如是可注射溶液或用于口服施用的组合物。
当然可进一步纯化螨变应原提取物以获得更纯的样品，该样品包含例如纯化的相关的组1变应原例如变应原Der p1(欧洲尘螨)、Derf1(美洲尘螨)、Eur m1(梅氏嗜霉螨)、Der s1(丝泊尘螨)。
在一个实施方案中，本发明涉及本文中描述的方法，其中在进行该方法后，进行适当的后续步骤以分离随后被掺入适当的药物组合物的适当的螨变应原组合物。
实施例
实施例1-在袋子中进行的螨培养
材料：
螨的种类：美洲尘螨
培养基：培养基是包含必需蛋白质水解产物、酵母、维生素和矿物质的标准螨培养基。
袋子：用于在高压灭菌器中进行材料的灭菌的袋子(其中一侧由透氧性纸材料制造，另一侧由透明塑料材料制造)。袋子的大小是300mm(宽)x500(长)x可能扩展至65mm的高度。袋子可从WestfieldMedical Ltd，UK商购获得。
培养方法：
将500g培养基放入各袋子(图5中举例说明的)。用美洲尘螨的常规种子培养物的样品接种培养基，之后封闭/密封袋子(图3中举例说明了密封的袋子)。
在生产室中，在23℃(±2℃)的温度、80％(±5％)的相对湿度(RH)下进行培养。
通过使用立体显微镜，通过透明塑料材料目视观察螨培养物的成熟。
当认为成熟是最佳的时，收获培养物。
培养物用于获得来自螨的躯体和排泄物的变应原。通过筛分分离两个级分(排泄物和躯体)。
在制备两个级分(排泄物和躯体)的提取物中，使用匀浆器(Ultraurrax)在盐水溶液中在6℃下提取变应原原料10-20分钟。这样，变应原蛋白质溶解在上清液中。
在4℃下以3000rpm离心15分钟后回收上清液。通过超滤分离具有大于5kDa的kDa大小的变应原。
通过Rast抑制分析分离的变应原的总变应原活性。通过ELISA测量特定变应原活性。
躯体级分的变应原活性分析的结果是2700μg/g Der f1。
在该实施例中，使用来自200个袋子的培养物和培养基，其是指培养200x500g＝100kg。在筛分后，获得3710g螨培养物(螨和排泄物)。获得的Der f1的总量为2700μgx3710g＝10.017g的来自200个袋子的纯化的变应原。因此，每克纯化的培养基的变应原活性是2700μg/g，但200个袋子的变应原的总量是10.017g。
实施例2-在瓶子中进行的螨的培养-用于比较
瓶子：包含30g培养基并且用棉花塞密闭的250ml埃伦迈尔瓶。
所有螨培养条件与在实施例1中用于袋子的条件相同。使用相同的生长培养基、相同的生长条件、相同的时间和相同的生产室。
观察螨培养物的成熟并且当成熟被认为是最佳时收获培养物。
如实施例1中所述进行变应原的提取和分离。
如实施例1中所述分析变应原活性。
变应原活性分析的结果是2563μg/g Der f1。
在本实施例中，使用来自600个瓶的培养基，其是指600x30g＝18kg用于培养螨。在筛分后，获得710g。获得的Der f1的总量是2563μgx710g＝1.82g的来自600个瓶的纯化的变应原。
因此，每克纯化的培养基的变应原活性是2563μg/g，但600个瓶的变应原的总量是1.82g。
可从实施例1(袋子)和实施例2(瓶子)推出的结论
对于在袋子(实施例1)中进行的螨的生产和对于在埃伦迈尔瓶(实施例2)中进行的生产，每克培养基的变应原活性是相同的。
如本文中所论述的和实施例中所举例说明的，与瓶子的使用相比较，袋子的使用使得可能在相同的生产室中具有多得多的培养基，从而当使用本文中描述的袋子时，与瓶子的使用相比较，每物理生产室的总螨变应原产量高得多。
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Claims (19)

1：用于培养和生产螨的方法，
其包括在适当的条件下将螨培养于适当的固体生长培养基中，并且在适当的生产室中培养适当的时间，
其特征在于将螨培养在包含于密封的袋子内的培养基中，其中：
i：袋子具有足以允许螨的生长的透氧性；
ii：袋子包括透明的允许观察螨的生长的区域；
iii：包含正在生长/培养的螨的培养基以高度小于110mm的相对薄的层存在；和
iv：密封的袋子包含至少25g培养基。
2.权利要求1的方法，
其中袋子是具有按照标准ISO 5636-3，Bendtsen法测量的至少150ml/分钟的透气性的可透氧的袋子；或
其中袋子具有按照已知的标准试验法测量的至少10cm3氧气/袋/天的透氧性，所述试验方法按照已知的美国国家标准学会文件/标准ASTM F1307-02的标准，使用电量传感器测量通过干燥包装的氧气穿透率；或
其中袋子具有透氧性，所述透氧性在袋子中足以提供与包含30g培养基并且用棉花塞密闭的250ml埃伦迈尔瓶中的产量相比，至少相同的每克培养基的螨产量，其中在相同的条件下培养袋子和埃伦迈尔瓶。
3.权利要求1或2的方法，其中当具有培养基的密封的袋子在尘螨的培养过程中物理地存在于生产室中时，培养基占据至少70％的具有培养基的密封的袋子的总体积。
4.权利要求1至3的任一项的方法，其中袋子由至少一种选自纤维素材料(例如纸)、塑料材料和织物(纺织的或非纺织的)的材料制造；和
其中袋子应当由其中密封的袋子内的螨基本上不能通过材料本身从其逃脱的材料制成。
5.权利要求4的方法，其中：
1：袋子的一侧基本上由纤维素材料(优选纸)组成；和
2：袋子的另一侧基本上由透明的塑料材料组成。
6.权利要求4或5的方法，其中袋子的大小是50mm至1000mm(宽)x100mm至1500mm(长)x可能扩展至权利要求1的第(iii)项中指定的使袋子能够包含适当量的螨培养基的适当高度；和其中密封的袋子包含至少400g培养基。
7.权利要求1至6的任一项的方法，其中螨是屋尘螨。
8.权利要求1至6的任一项的方法，其中螨是仓储螨。
9.权利要求1至6的任一项的方法，其中螨是至少一种选自下列物种的螨：欧洲尘螨、美洲尘螨、微角尘螨、丝泊尘螨、腐食酪螨、害嗜鳞螨、家食甜螨、粗脚粉螨、梅氏嗜霉螨、Blomia kulagini、热带无爪螨和非洲麦食螨。
10.前述权利要求1至6的任一项的方法，其中螨是捕食性螨。
11.权利要求10的方法，其中袋子包含作为捕食性螨的食物来源的被捕食的螨。
12.权利要求11的方法，其中袋子还包含用于被捕食的螨的培养基。
13.前述权利要求的任一项的方法，其中螨的培养条件是：
a：温度为23℃±5℃；
b：湿度是70至85％的相对湿度(RH)；
c：培养期是1至24周，通常4至20周。
14.前述权利要求的任一项的方法，其中包含正在生长/培养的螨的培养基以高度小于60mm的相对薄的层存在。
15.前述权利要求的任一项的方法，其中生产室包括至少50个袋子。
16.权利要求15的方法，其中生产室包括至少10个适当的支架系统，其中各支架系统是具有至少5个堆撂在一起的袋子的支架系统。
17.权利要求16的方法，其中支架系统是在支架的底部包含用于捕获可能从袋子逃脱的螨的捕获容器的支架。
18.权利要求17的方法，其中捕获容器是盘子例如金属盘；和
其中捕获容器包含捕获材料例如石蜡或羊毛脂。
19.前述权利要求的任一项的方法，其中在进行所述方法后，进行适当的后续步骤以分离随后被掺入适当的药物组合物的适当的螨变应原组合物。
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