CZ304351B6 - Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů - Google Patents
Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304351B6 CZ304351B6 CZ2012-428A CZ2012428A CZ304351B6 CZ 304351 B6 CZ304351 B6 CZ 304351B6 CZ 2012428 A CZ2012428 A CZ 2012428A CZ 304351 B6 CZ304351 B6 CZ 304351B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- breeding
- mite
- mites
- excrements
- growth medium
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů, který zahrnuje jak kroky chovu roztočů, tak kroky extrakce antigenů, kde jako zdroj čistých exkrementů domácích roztočů o minimální čistotě 95 % obj. slouží exkrementy adherované na povrch stěn chovné nádoby během chovu. V průběhu chovu roztočů je použito pouze 1 až 5 mg růstového média na 1 cm.sup.2.n. plochy chovného prostoru, růstové médium nikdy netvoří souvislou vrstvu a je přidáváno postupně. Chov roztočů od jeho založení trvá maximálně 8 týdnů, přičemž otáčením chovných nádob s kulturami roztočů během chovu v pravidelných časových intervalech dojde k rovnoměrné adhezi exkrementů na všechny stěny chovné nádoby. Po pokrytí chovných nádob exkrementy roztočů v souvislé vrstvě je odstraněno zbytkové růstové médium, které neslouží jako zdroj exkrementových antigenů roztočů, a následně jsou po předchozí chladové paralýze odstraněni na stěnách adherovaní živí roztoči, čímž jsou získány (i) roztočové exkrementy minimální čistoty 95 % obj. adherované na stěny chovných nádob, (ii) živí roztoči minimální čistoty 95 % obj. a (iii) zbytkové růstové médium obsahující méně než 50 % obj. živých roztočů. Extrakce antigenů z exkrementů roztočů adherovaných na stěnách chovné nádoby o minimální čistotě 95 % obj. se provádí za třepání vodou přímo v prostoru chovné nádoby po skončení chovu roztočů, čímž se přímo získá proteinový extrakt z exkrementů, z něhož je po centrifugaci získán supernatant. K validaci složení a integrity takto připravených antigenů z exkrementů roztočů je po lyofilizaci supernatantu využito bez jakýchkoliv dalších čisticích kroků vzorku fing
Description
Oblast techniky
Řešení se týká způsobu chovu domácích (prachových a skladištních) roztočů pro přípravu roztočových exkrementových antigenů s vysokou integritou. Řešení se také týká způsobu zpracování chovu roztočů pro získání velmi čisté exkrementové frakce a živých jedinců separovaných od zbytkového růstového média bez použití prosívání.
Dosavadní stav techniky
Alergie představují celosvětově jeden z hlavních zdravotních problémů a roztoči vyskytující se v prachu domácností jsou nej významnějšími původci alergizujících agens v prostředí domácností. Domácí roztoči zahrnují různé volně žijící roztoče, kteří obývají lidská obydlí - jsou jimi především prachoví roztoči Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssynus, Dermatophagoides microceras, Blomia tropicalis. Mezi domácí roztoče patří i některé druhy skladištních roztočů, zejména z čeledí Acaridae, Glycyphagidae a Chortoglyphydae, jelikož byli identifkováni také v prachu domácností. Prachoví a skladištní roztoči jsou navzájem úzce příbuzní, mají obdobnou životní strategii, jejich fyziologie i alergeny (antigeny), které produkují, jsou si biochemicky podobné.
Nejvýznamnějším zdrojem roztočových alergenů (antigenů) jsou roztočové exkrementy, které obsahují proteiny, zejména enzymy, původem z trávicího traktu roztočů, produkované během života jedince.
Jako zdroj roztočových alergenů (antigenů) je používáno zbytkové růstové médium (SGM), které obsahuje různá stádia živých roztočů, mrtvé roztoče a zbytky těl roztočů, exkrementy, další exkrety a zbytky potravy.
Frakce obsahující exkrementy a těla roztočů jsou získávány prosíváním zbytkového růstového média. Prosetá frakce zbytkového růstového média obsahující živé roztoče se používá buď pro získání antigenů, nebo jako násadka nového chovu. Pokud je frakce prosetých roztočů použita pro založení nového chovu, je právě prosívání krokem, při němž je zvýšená možnost kontaminace chovu jinými roztoči nebo mikroorganismy. Antigeny z exkrementů roztočů jsou získávány buď přímou extrakcí ze zbytkového růstového média, nebo extrakcí frakcí získaných prosetím zbytkového růstového média.
Pro produkci prachových a skladištních roztočů se používají různé skleněné a plastové lahve, lahvičky pro kultivaci tkáňových kultur a baňky a také plastové pytle. Pro velkou produkci roztočů a roztočových antigenů se používají desítky až stovky gramů růstového média v jednom chovném prostoru (např. 25 g média na 250 ml baňku), růstové médium tvoří souvislou vrstvu.
Domácí roztoči jsou známí jako potravně nenároční živočichové; v přirozeném prostředí domácností, kromě prostředí skladových zásob, není přítomno velké množství potravy.
Jak potvrdila recentní studie Brunetto B et al., Allergy 65:184-90, 2010, komerčně dostupné antigeny používané pro diagnostické účely jsou v současnosti různé kvality, obsahující různé typy antigenů a některé z nich klíčové antigeny neobsahují. Z klíčových antigenů jsou sledovány především alergeny 1. a 2. hlavní skupiny, konkrétně alergeny prachových roztočů Der fl, Der ť2 a Der pl a Der p2. Jak je známo, prachoví, ale i skladištní roztoči, jsou producenti mnoha dalších, buď již prokázaných nebo potenciálních alergenních proteinů. V současnosti je popsáno 24 tříd alergenů roztočů, z nichž většina je derivována trávicím traktem a je defekována exkrementy
-1 CZ 304351 B6 roztočů. Zároveň ne všechny antigeny, které jsou původem z těl roztočů, jsou přítomny v exkrementech.
Domácí roztoči mají relativně krátký životní cyklus a v optimálních podmínkách se vyvine např. Dermatophagoides pteronyssinus z vajíčka do dospělce za 3 až 4 týdny, dospělci Dermatophagoides pteronyssinus žijí 4 až 6 týdnů. Celkový životní cyklus zahrnující všechna vývojová stádia roztočů trvá v optimálních podmínkách kolem 10 týdnů. Životní cyklus je u jednotlivých domácích roztočů obdobný, dospělosti může byt dosaženo i rychleji, životní cyklus může být na druhou stranu i delší. Skladištní roztoči mají obecně rychlejší rozmnožovací schopnost než roztoči prachoví. Je známo, že jedinec prachového roztoče dokáže vyloučit průměrně 20 exkrementů denně. Pokud je doba, kterou stráví roztoči v chovu delší, než je jejich celý životní cyklus, pak se v růstovém médiu hromadí mrtví jedinci, kteří se navíc v čase rozpadají, degradují. Čím déle trvá chov roztočů, tím více je obsaženo tělních fragmentů ve zbytkovém růstovém médiu, ideálně by měl proto chov roztočů pro přípravu antigenů představovat maximálně jednu generační dobu života roztočů nebojí příliš nepřesahovat.
Čím déle trvá chov roztočů v jednom chovném prostoru, tím více je narušena integrita antigenů, může docházet k degradaci epitopů antigenů. Jak známo, každý protein, a organicky materiál vůbec, degraduje alespoň parciálně v čase. Proto je minimalizace času, který stráví antigeny defekované roztoči od doby defekace po dobu uskladnění (zmražení) nebo extrakce antigenů, velmi důležitá.
Chov roztočů je nezbytné v jeho průběhu vizuálně kontrolovat pod binokulární lupou, proto je vhodné, aby chovná nádoba byla z průhledného materiálu. Při vizuální kontrole chovu roztočů se projeví nevýhoda použití relativně velkého množství růstového média, neboť i řádově milimetrová souvislá vrstva růstového média znesnadňuje vizuální inspekci materiálu.
Složení trávicích enzymů, a tedy antigenové složení exkrementů produkovaných roztoči, je závislé na složení růstového média (diety). Růstové médium je různého složení, vždy však obsahuje směs bílkovin, zdroj vitamínů, cukrů a tuků.
Zbytkové růstové médium je pro získání antigenů homogenizováno mechanickými homogenizéry nebo se používá na difúzi založená extrakce. Extrakčními roztoky pro získání antigenů jsou různé vodné roztoky solí nebo samotná destilovaná voda.
Nevýhodou současného stavu chovu domácích (prachových i skladištních) roztočů tedy je: (i) při chovech roztočů je používáno nadbytečné množství počátečního růstového média, a tudíž trvá velmi dlouho (i mnoho měsíců) od doby založení chovu, než veškeré (většina) množství růstového média projde trávicím traktem roztočů a je vyloučeno ve formě exkrementů; (ii) pro přípravu antigenů bohatých na exkrementové antigeny je používáno zbytkové růstové médium, které obsahuje nejen exkrementy, ale i mnoho mrtvých jedinců a jejich fragmentů, extrakty ze zbytkového růstového média jsou různé kvality a často neobsahují ani klíčové antigeny; (iii) jakýkoliv materiál degraduje v čase, zejména organický, a se zvyšujícím se časovým intervalem od času defekace exkremetů po samotnou extrakci antigenů se zvyšuje riziko narušení integrity antigenů pro diagnostické, imunomodulační nebo detekční účely; (iv) souvislá, byť slabá vrstva růstového média znesnadňuje přehlednou inspekci chovu roztočů pro kontrolu jeho vývoje a zjištění případné kontaminace; (v) je obtížné získávat čisté exkrementy, které jsou nabalené na růstové, resp. zbytkové růstové, médium; (vi) frakce obsahující roztoče a jejich exkrementy jsou získávány prosíváním ze zbytkového růstového média; (vii) integrita složení antigenů je kontrolována ELISA testy na omezené množství antigenů nebo jednorozměrnou proteinovou analýzou a není ověřována integrita antigenů v extraktech komplexně.
-2CZ 304351 B6
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů, který zahrnuje jak kroky chovu roztočů, tak kroky extrakce antigenů, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že jako zdroj čistých exkrementů domácích roztočů o minimální čistotě 95 % obj. slouží exkrementy adherované na povrch stěn chovné nádoby během chovu, v průběhu chovu roztočů je použito pouze 1 až 5 mg růstového média na 1 cm2 plochy chovného prostoru, růstové médium nikdy netvoří souvislou vrstvu a je přidáváno postupně, chov roztočů od jeho založení trvá maximálně 8 týdnů, přičemž otáčením chovných nádob s kulturami roztočů během chovu v pravidelných časových intervalech dojde k rovnoměrné adhezi exkrementů na všechny stěny chovné nádoby, po pokrytí chovných nádob exkrementy roztočů v souvislé vrstvě je odstraněno zbytkové růstové médium, které neslouží jako zdroj exkrementových antigenů roztočů, a následně jsou po předchozí chladové paralýze odstraněni na stěnách adherovaní živí roztoči, čímž jsou získány (i) roztočové exkrementy minimální čistoty 95 % obj. adherované na stěny chovných nádob, (ii) živí roztoči minimální čistoty 95 % obj. a (iii) zbytkové růstové médium obsahující méně než 50 % obj. živých roztočů, extrakce antigenů z exkrementů roztočů adherovaných na stěnách chovné nádoby o minimální čistotě 95 % obj. se provádí za třepání vodou přímo v prostoru chovné nádoby po skončení chovu roztočů, čímž se přímo získá proteinový extrakt z exkrementů, z něhož je po centriíugaci získán supematant, k validaci složení a integrity takto připravených antigenů z exkrementů roztočů je po lyofilizaci supematantu využito bez jakýchkoliv dalších čisticích kroků vzorku fingerprintové analýzy pomocí dvourozměrné proteomické analýzy a/nebo western blot analýzy.
Způsob podle vynálezu je charakterizován tím, že pro získání živých domácích roztočů o minimální čistotě 95 % obj. je využito jejich adheze na plochy materiálu chovné nádoby, odkud se následně odstraní po předchozí chladové paralýze při 4 °C na 30 minut, nebo při nižší teplotě, ale kratším čase.
Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že kontrola chovu domácích roztočů v původních chovných nádobách probíhá pravidelně jednou týdně a v posledních dvou týdnech alespoň 2x týdně, přičemž při každé kontrole jsou chovné nádoby otáčeny.
Nedostatky, které mají současné způsoby chovu domácích (prachových a skladištních) roztočů pro přípravu exkrementových antigenů, odstraňuje způsob podle vynálezu s minimalizovaným množstvím použitého růstového média a tedy i s minimalizovaným podílem zbytkového růstového média na konci chovu, která vede k přípravě roztočových exkrementových antigenů s vysokou integritou v časovém úseku intervalově kratším než je jeden průměrný životní cyklus roztočů, tj. maximálně do 8 týdnů. Nedostatky současného způsobu zpracování chovu roztočů pro získání čistých exkrementů (minimální čistoty 95 % obj.) a čistých živých jedinců (minimální čistoty 95 % obj.) odstraňuje způsob podle vynálezu, který umožňuje separaci vzorků přímo v chovném prostoru a nevyžaduje prosívání zbytkového růstového média, které je nepříjemné a nebezpečné. Navíc zbytkové růstové médium netvoří zdroj pro získávání exkrementů. Mechanismem získání čistých exkrementů je jejich adheze na stěny chovné nádoby, zvýšené adheze je dosaženo minimálním použitím růstového média a otáčením chovných nádob v průběhu chovu. Obdobně je mechanismem získání živých roztočů jejich adheze na stěny chovné nádoby.
Předmětem vynálezu je tedy způsob chovu domácích (prachových a skladištních) roztočů pro získání exkrementů minimální čistoty 95 % obj. v co nejkratším časovém úseku tak, aby byla zároveň co nejméně ohrožena integrita antigenů, a tudíž nebyl dán prostor ke znehodnocování antigenů v čase ještě před extrakcí. Podstata chovu roztočů spočívá podle vynálezu v tom, že je v celém průběhu chovu použito minimální množství růstového média a chov roztočů pro produkci exkrementů trvá maximálně 8 týdnů. Při počáteční veliké populaci roztočů lze docílit pokrytí chovné nádoby exkrementy za podstatně kratší čas, ideálně je využito chovných nádob typu plochých lahviček s filtrovým uzávěrem, jako jsou lahvičky používané pro kultivaci tkáňových kul-3CZ 304351 B6 tur. Růstové médium je do chovných nádob přednostně dávkováno intervalově po malých částech, řádově však miligram na cm2 plochy chovného prostoru, v průběhu celého chovu je dle provedení použito cca 2 až 3 mg/cm2 růstového média, čímž je docíleno co největšího poměru vyprodukovaných exkrementů, s minimálním množstvím použitého růstového média, a tedy i minimálního obsahu zbytkového růstového média na konci chovu. Minimální množství použitého růstového média umožňuje také bezproblémovou inspekci chovu pod binokulární lupou pro zjištění vývoje chovu a zjištění případné kontaminace.
Pro získání čistých (minimální čistoty 95 % obj.) exkrementů separovaných od zbytkového růstového média je dle vynálezu využito adheze čerstvě defekovaných exkrementů roztočů na povrch materiálu chovného prostoru. Pro získání exkrementů a přípravu antigenů z exkrementů roztočů tedy není využíváno zbytkové růstové médium, ale pouze exkrementy adherované na stěny chovného prostoru.
Předmětem vynálezu je dále otáčení chovné nádoby v časových intervalech, u ploché nádoby, např. typu ploché lahvičky, o 180°, což zabezpečuje rovnoměrnou adhezi čerstvě defekovaných exkrementů roztočů na všechny stěny chovné nádoby. Pokrytí stěn exkrementy se kontroluje pod binokulární lupou; v momentu, kdy jsou stěny chovné nádoby dostatečně pokryté z obou stran adherovanými exkrementy, jsou po odstranění veškerého, na stěny neadherovaného obsahu (tj. zbytkového růstového média a roztočů), přímo v chovných nádobách extrahovány antigeny z vysoce čistých roztočových exkrementů (minimální čistoty 95 % obj.).
Předmětem vynálezu je také odstranění, respektive izolace živých jedinců (minimální čistoty 95 % obj.) adherovaných na stěny chovné nádoby. Tyto roztoče je pak možné použít přímo pro založení dalšího chovu nebo pro izolaci antigenů. Před odstraněním zbytkového růstového média se chovná nádoba otočí tak, aby se jedinci rovnoměrně adherovali i na protější stěnu, poté se odstraní zbytkové růstové médium, to se vysype (i) buď přímo do jiné chovné nádoby, nebo (ii) do jiné sběrné nádoby. K odstranění živých roztočů adherovaných na stěny chovného prostoru se využije skutečnosti, že jsou poikilotermními živočichy (nekontrolují svoji tělesnou teplotu) a je možné je chladově paralyzovat. Chovná nádoba se umístí alespoň na 30 minut do chladového prostoru 0 až 4 °C (případně se použije nižší teploty v kratším časovém úseku), víkem dolů, roztoči ze stěn buď sami popadají směrem k víku, nebojsou pak snadno odstranitelní vyklepnutím. Získaní roztoči se využijí buď pro extrakci antigenů, nebo pro založení dalšího chovu roztočů.
Podle vynálezu je zbytkové růstové médium obsahující živé roztoče (méně než 50 % obj.) využito pro získávání čistých roztočů využitelných především pro zakládání nového chovu, nikoliv pro extrakci antigenů. Předmětem vynálezu je tedy i to, že adheze živých roztočů na povrch stěn se využije při získání dalších živých jedinců (minimální čistoty 95 % obj.) ze zbytkového růstového média odstraněného z chovných nádob. Zbytkové růstové médium se umístí do čisté chovné nádoby nebo jiné nádoby, nechají se rozutéct a adherovat živí roztoči, a poté se zbytkové růstové médium odstraní vyklepáním, stejně jako při jeho odstranění z chovné nádoby pro produkci antigenů. Živí roztoči zůstanou adherováni na stěny. Získaní roztoči se využijí buď pro založení dalšího chovu, nebo po jejich odstranění z chovných nádob pro extrakci antigenů.
Antigeny z exkrementů jsou podle vynálezu extrahovány přímo z chovných nádob, za třepání, na 4 °C přechlazenou ultračistou destilovanou vodou. Extrahované proteiny, po následné centrifugaci, odebrání supematantu a jeho lyofilizaci (nebo jiném způsobu zahuštění), je možné bez dalších úprav přímo použít k imunochemickým analýzám pomocí western blot analýzy a pro fingerprintovou analýzu pomocí dvourozměrné elektroforézy.
Podle vynálezu lze způsob chovu, adheze exkrementů na stěny chovné nádoby pro přípravu antigenů a validace integrity, využít pro přípravu antigenů pro široké spektrum volně žijících skladištních a prachových roztočů, zejména pak na roztoče rodu Dermatophagoides, Blomia, Lepidoglyphus, Glycyphagus, Tyrophagus, Acarus, Chortoglyphus, Carpoglyphus, Aeroglyphus.
-4CZ 304351 B6
Principu adheze na stěny chovné nádoby je tedy využito i v případě, kdy je růstové médium modifikováno, jako např. pro roztoče Carpoglyphus lactis, kdy je použitým růstovým médiem sušené ovoce v celistvém tvaru, případně rozkrájené na menší kusy, obdobně je možné využít dalších modifikací růstového média v celistvém stavu pro tento i jiný druh roztoče.
Získané vzorky proteinů jsou využitelné pro farmaceutické účely, zejména pro imunodiagnostické účely jako je determinace alergií, pro využití v detekčních systémech či pro imunomodulační účely.
Přehled obrázků na výkresech
Na přiloženém obr. 1 je příklad porovnání chovu Dermatophagoides farinae (A) souvislou vrstvou růstového média po 16 týdnech a (B) minimálním množstvím růstového média po 8 týdnech.
Porovnání demonstruje, že v případě B jsou stěny plně pokryty exkrementy a roztoči, zatímco v případu A není ani přes dvojnásobnou dobu kultivace dosaženo obdobného výsledku.
Na obr. 2 je příklad chovu Dermatophagoides farinae v čase 0 a v čase 4 týdny. Obr. 2 sestává z částí A, B, C a D. Legenda k obr. 2:
MA - agregace roztočů; GM - růstové médium
A - Prázdná chovná nádoba
B - Obsah chovné nádoby po 4 týdnech - pohled horizontální; povrch chovné nádoby je pokryt živými roztoči.
C - Obsah chovné nádoby po 4 týdnech - pohled vertikální, obsah sklepán do rohu; povrch chovné nádoby je pokiyt živými roztoči.
D - Obsah chovné nádoby po 4 týdnech - obsah sklepán do rohu; povrch chovné nádoby je pokryt živými roztoči.
Na obr. 3 je příklad adherovaných exkrementů Dermatophagoides farinae na stěny chovné nádo35 by po 6 týdnech bez aplikace otáčení chovné nádoby. Obr. 3 sestává z částí A a B. Legenda k obr. 3:
F - exkrementy; M - roztoči; GM - růstové médium
A - Detail spodní plochy chovné nádoby s růstovým médiem; povrch je pokryt exkrementy v rovnoměrné vrstvě a je vhodný pro extrakci antigenů.
B - Detail svrchní plochy chovné nádoby; povrch není téměř vůbec pokryt exkrementy a není vhodný pro extrakci antigenů.
Na obr. 4 je příklad adherovaných exkrementů Dermatophagoides farinae na stěny chovné nádoby po osmi týdnech s aplikací otočení chovné nádoby o 180° a přidáním růstového média v 6. týdnu. Obr. 4 sestává z částí A, B, C, D a E. Legenda k obr. 4:
M - roztoči; MA - agregace roztočů; SGM - zbytkové růstové médium
A - Obsah chovné nádoby po 8 týdnech - pohled horizontální, povrch chovné nádoby je pokryt exkrementy v rovnoměrné vrstvě a živými roztoči, zbytkové růstové médium obsahující ještě relativně velké množství živých roztočů, ale také mrtvé roztoče je sklepnuto do rohu.
-5CZ 304351 B6
B - Zbytkové růstové médium je odstraněno z chovné nádoby, v té zbydou roztoči a exkrementy adherované na stěny.
C - Získaní čistí roztoči po jejich odstranění z 18 chovných nádob za pomocí chladové paralýzy. Roztoči vytváří četné agregace.
D - Zbytkové růstové médium odstraněno z 18 chovných nádob.
E - Plochy chovné nádoby zbaveny roztočů a zbytkového růstového média; povrch je pokryt exkrementy v rovnoměrné vrstvě a je vhodný pro extrakci antigenů.
Na obr. 5 je příklad konce chovu Dermatophagoides farinae po 8 týdnech pod binokulární lupou: povrch je pokryt exkrementy v rovnoměrné vrstvě, v chovné nádobě je mnoho živých roztočů a minimum zbytkového růstového média.
Na obr. 6 je detail stěn chovné nádoby s Dermatophagoides farinae po odstranění zbytkového růstového média pod binokulární lupou. Stěny chovné nádoby jsou pokryty adherovanými exkrementy a roztoči, kteří vytvářejí agregace. Růstové, resp. zbytkové růstové médium, není prakticky přítomno. Legenda k obr. 6:
M - roztoči; MA - agregace roztočů
Na obr. 7 jsou získané vzorky po zpracování chovu Dermatophagoides farinae. Obr. 7 se sestává z částí A, B a C.
A - Exkrementy adherované na stěny chovné nádoby (minimální čistoty 95 % obj.).
B - Čistí živí roztoči (minimální čistoty 95 % obj.).
C - Zbytkové růstové médium obsahující živé (méně než 50 % obj.) a mrtvé roztoče.
Na obr. 8 je příklad western blot analýzy po separaci proteinů 14 % SDS-PAGE prokazující imunoreaktivitu exkrementových antigenů Dermatophagoides farinae pomocí sér 10 pacientů s diagnostikovanou alergií na prachové roztoče. Extrahované antigeny obsahují hlavní sledované ant geny Der fl a Der f2, ale i mnoho dalších antigenů. Reaktivita pacientů je individuální. Legenda k obr. 8:
Der fl a Der £2 - hlavní roztočové alergeny; 1-10 - čísla pacientů
Na obr. 9 je příklad dvourozměrné elektroforetické analýzy antigenů extrahovaných vodou z exkrementů Dermatophagoides pteronyssynus (A) a Dermatophagoides farinae (B). 50 pg proteinů bylo separováno isoelektrofokusací pl 3-7,7 cm stripm v prvním rozměru a 14 % tris glycin elektroforézou v druhém rozměru. Proteiny byly vizualizovány fluorescenčně sypro ruby.
Způsob podle vynálezu byl původci s úspěchem ověřen v laboratořích Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i., Praha. CZ a v Medicínském centru Praha s.r.o. CZ.
Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.
-6CZ 304351 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava čistých roztočů a antigenů z exkrementů Dermatophagoides farinae. Druhem roztoče byl prachový roztoč Dermatophagoides farinae (Hughes 1961).
Růstovým médiem pro chov roztočů byla standardní chovná dieta o složení (i) ovesné vločky, (ii) granule pro psy, (iii) bio sušené vločkové krmení pro rybičky, (iv) sušené pivovarské kvasinky, (v) želatina, vše smíchané v hmotnostním poměru (10:10:3:2:1 w/w), homogenizováno rozemletím.
Roztoči minimální čistoty 95 obj. % byli umístěni do 18 lahviček pro tkáňové kultury, každá s povrchem 25 cm2. Do každé lahvičky bylo umístěno cca 20 mg růstového média. Chovné nádoby byly umístěny do exsikátoru nasyceným NaCl, chov probíhal v temnu při teplotě 25 °C.
Chov byl zpočátku každý týden, posledních 14 dní 2x týdně, vizuálně kontrolován pod binokulární lupou pro zjištění případné kontaminace. V případě potřeby bylo přidáno růstové médium o hmotnosti cca 20 až 40 mg. Chovné nádoby byly při každé inspekci otáčeny. Osmy týden od zahájení chovu byly obě strany chovných nádob pokryty exkrementy.
Zbytkové růstové médium obsahující i živé roztoče bylo ze všech chovných nádob odstraněno po předchozím otočení o 180° na 20 min. Chovná nádoba, do které bylo přemístěno zbytkové růstové médium, byla předem zvážena a byla zjištěna celková hmotnost odstraněného obsahu, která činila celkem 825 mg, což při celkové ploše 18 chovných nádob 450 cm2 činí 45,8 mg na jednu chovnou nádobu a 1,83 mg na cm2. Chovné nádoby byly umístěny na 30 minut do 4 °C víkem dolů, a poté byli do jiné předvážené chovné nádoby odstraněni čistí roztoči (minimální čistoty 95 obj. %). Celková hmotnost takto získaných roztočů činila 553 mg, přepočítáno na jednu 25 cm2 chovnou nádobu, byl výtěžek 30,7 mg čistých roztočů. Celkově na každou chovnou nádobu bylo odstraněno 76,5 mg materiálu.
Do každé chovné nádoby bylo pipetováno 10 ml, na 4 °C předchlazené ultračisté destilované vody. Extrakce probíhala na ledu za třepání na kývavé třepačce po dobu 10 min na každé ze dvou velkých plochých stran. Poté byl obsah přelit do skleněné baňky, každá chovná nádoba byla vypláchnuta dalšími dvěma objemy 5 ml ledové vody a extrakt byl smíchán dohromady. Celkem bylo takto získáno 18 x 20 ml extraktu, tj. 360 ml. Obsah byl promíchán a třepán 20 min při 4 °C a přerozdělen do centrifugačních flakonů, poté byl ještě obsah promíchán, a následně centrifugován při 10 000 x g, při 4 °C, po dobu 15 minut. Supematant byl odstraněn a po smíchání částí dohromady lyofilizován.
Totální výtěžek proteinů, dle metody Bradford, činil pro Dermatohagoides farinae 3464,2 pg na 295 ml supematantu. Při celkové ploše 450 cm2 osmnácti 25 cm2 chovných nádob činil výtěžek proteinů 7,7 pg na 1 cm2 chovné nádoby.
Příklad 2
Příprava antigenů z exkrementů Dermatophagoides farinae. Dermatophagoides pteronyssynus. Lepidoglyphus destructor. Druhy roztočů byli prachoví roztoči Dermatophagoides farinae (Hughes 1961) a Dermatophagoides pteronyssynus (Trouessart 1897) a skladištní roztoč Lepidoglyphus destructor (Schrank 1871).
-7CZ 304351 B6
Roztoči byli chováni a kontrolováni obdobným způsobem popsaným v příkladu 1. Zbytkové růstové médium a roztoči byli z chovných nádob odstraněni analogicky příkladu 1. Chov pro Dermatophagoides farinae a Dermatophagoides pteronyssynus trval 8 týdnů, v případě Lepidoglyphus destructor trval chov 6 týdnů.
Roztoči i zbytkové růstové médium byli odstraněni do 50 ml plastových flakonů. Čistí roztoči byli použiti pro založení nových chovů.
Totální výtěžek proteinů, dle metody Bradford, činil pro Dermatohagoides farinae 3033,9 pg na 190 ml supematantu. Při celkové ploše 300 cm2 dvanácti 25 cm2 lahviček činil výtěžek proteinů 10,1 pg na 1 cm2 plochy chovné nádoby.
Totální výtěžek proteinů, dle metody Bradford, činil pro Dermatohagoides pteronyssynus 2935,8 pg na 183 ml supematantu. Při celkové ploše 300 cm2 dvanácti 25 cm2 lahviček činil výtěžek proteinů 9,79 pg na 1 cm2 plochy chovné nádoby.
Totální výtěžek proteinů, dle metody Bradford, činil pro Lepidoglyphus destructor 2856,3 pg na 190 ml supematantu. Při celkové ploše 300 cm2 dvanácti 25 cm2 lahviček činil výtěžek proteinů 9,52 pg na 1 cm2 plochy chovné nádoby.
Příklad 3
Příprava antigenů Carpoglyphus Iactis, typ růstové médium sušené ovoce - sušená meruňka. Druhem domácího roztoče byl skladištní roztoč Carpoglyphus Iactis (Linnaeus 1758).
Růstovým médiem pro chov roztočů byly bio sušené meruňky. Sušené meruňky byly rozkrájeny na 8 kusů, 2 až 3 kusy byly umístěny do 25 cm2 lahviček pro tkáňové kultury.
Roztoči byli chováni a kontrolováni obdobným způsobem popsaným v příkladu 1. Zbytkové růstové médium a roztoči byli z chovných nádob odstraněni analogicky příkladu 1.
Lahvičky byly umístěny do exsikátoru nasyceným KCI při 25 °C. Po sedmi týdnech byly po odstranění růstového média extrahovány antigeny z exkrementů adherovaných na povrch chovných nádob analogicky příkladu 1.
Totální výtěžek proteinů, dle metody Bradford, činil pro Caro pglyphus Iactis 405,5 pg v 160 ml supematantu. Při celkové ploše 200 cm2 osmi 25 cm2 chovných nádob činil výtěžek proteinů 2,03 pg na 1 cm2 plochy chovné nádoby.
Průmyslová využitelnost
Novy způsob chovu domácích roztočů umožňuje získat kvalitní roztočové antigeny z jejich exkrementů, které jsou klíčovým prvkem pro diagnostiku alergií (testování imunoreaktivity), imunomodulace a detekční nástroje založené na imunochemických metodách.
Použitá literatura : Brunetto B et al., Allergy 65:184-90, 2010
2: Colloff MJ et Spieksma FThM, Clin Exp Allergy 22:823-830, 1992
3: Colloff MJ, Dust mites. CSIRO Publishing and Springer Science, Dortrecht, Netherlands, 2009
-8CZ 304351 B6
4: Erban T, PLOS ONE 6: e22860,2011
5: Erban T et Hubert J, Exp Appl Acarol 44:199-212, 2008
6: HartBJ, Allergy 53:13-17,1998
7: Hughes AM, Technical bulletin edition. HerMajesty's Stationery Office, London, 1976 8: IUIS List of Allergens http://www.allergen.org/
9: Liu T, Lin Y. Ann Allergy Asthma lmmunol. 80:177-183,1998 10: Platts-Mills TA et Woodfolk JA. lmmunol Rev 242:51-68, 2011 11 : Smith G et al., patent application number US 20120076825 12: Tovey et al., Nátuře 289:592-593, 1981 13: Vazquez et al., patent application number US 20100024048
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů, který zahrnuje jak kroky chovu roztočů, tak kroky extrakce antigenů, vyznačující se tím, že jako zdroj čistých exkrementů domácích roztočů o minimální čistotě 95 % obj. slouží exkrementy adherované na povrch stěn chovné nádoby během chovu, v průběhu chovu roztočů je použito pouze 1 až 5 mg růstového média na 1 cm2 plochy chovného prostoru, růstové médium nikdy netvoří souvislou vrstvu a je přidáváno postupně, chov roztočů od jeho založení trvá maximálně 8 týdnů, přičemž otáčením chovných nádob s kulturami roztočů během chovu v pravidelných časových intervalech dojde k rovnoměrné adhezi exkrementů na všechny stěny chovné nádoby, po pokiytí chovných nádob exkrementy roztočů v souvislé vrstvě je odstraněno zbytkové růstové médium, které neslouží jako zdroj exkrementových antigenů roztočů, a následně jsou po předchozí chladové paralýze odstraněni na stěnách adherovaní živí roztoči, čímž jsou získány (i) roztočové exkrementy minimální čistoty 95 % obj. adherované na stěny chovných nádob, (ii) živí roztoči minimální čistoty 95 % obj. a (iii) zbytkové růstové médium obsahující méně než 50 % obj. živých roztočů, extrakce antigenů z exkrementů roztočů adherovaných na stěnách chovné nádoby o minimální čistotě 95 % obj. se provádí za třepání vodou přímo v prostoru chovné nádoby po skončení chovu roztočů, čímž se přímo získá proteinový extrakt z exkrementů, z něhož je po centrifugaci získán supematant, k validaci složení a integrity takto připravených antigenů z exkrementů roztočů je po lyofilizaci supematantu využito bez jakýchkoliv dalších čistících kroků vzorku fingerprintové analýzy pomocí dvourozměrné proteomické analýzy a/nebo western blot analýzy.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro získání živých domácích roztočů o minimální čistotě 95 % obj. je využito jejich adheze na plochy materiálu chovné nádoby, odkud se následně odstraní po předchozí chladové paralýze při 4 °C na 30 minut, nebo při nižší teplotě, ale kratším čase.
- 3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že kontrola chovu domácích roztočů v původních chovných nádobách probíhá pravidelně jednou týdně a v posledních dvou týdnech alespoň 2x týdně, přičemž při každé kontrole jsou chovné nádoby otáčeny.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2012-428A CZ304351B6 (cs) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2012-428A CZ304351B6 (cs) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2012428A3 CZ2012428A3 (cs) | 2014-01-02 |
| CZ304351B6 true CZ304351B6 (cs) | 2014-03-19 |
Family
ID=49775858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2012-428A CZ304351B6 (cs) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ304351B6 (cs) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059445A1 (en) * | 2001-03-01 | 2003-03-27 | Claude Andre | Process for cultivating mites, nutrient preparation for this process, and preparation of allergenic extracts from these mites |
| WO2008119762A1 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Alk-Abelló A/S | A method for mite production |
-
2012
- 2012-06-25 CZ CZ2012-428A patent/CZ304351B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059445A1 (en) * | 2001-03-01 | 2003-03-27 | Claude Andre | Process for cultivating mites, nutrient preparation for this process, and preparation of allergenic extracts from these mites |
| WO2008119762A1 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Alk-Abelló A/S | A method for mite production |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Han-Il Ree et al. Mass culture of house dust mites, Dermatophagoides farinae and D. pteronyssinus (Acari : Pyroglyphidae). Med. Entomol. Zool., 1997, 48, 109-116. * |
| Yella L et al. Population growth and allergen accumulation of Dermatophagoides pteronyssinus cultured at 20 and 25 °C. Exp. Appl. Acarol., 2011, 53, 103-119. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2012428A3 (cs) | 2014-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stock et al. | Nematode parasites, pathogens and associates of insects and invertebrates of economic importance | |
| EP2136619B1 (en) | A method for mite production | |
| Evans et al. | A simple centrifugation method for improving the detection of Ostreid herpesvirus-1 (OsHV-1) in natural seawater samples with an assessment of the potential for particulate attachment | |
| RU2593778C2 (ru) | Фармацевтический продукт, содержащий экстракт(ы) аллергена клещей, и способ его получения | |
| Coffey et al. | Ocean acidification leads to altered micromechanical properties of the mineralized cuticle in juvenile red and blue king crabs | |
| Jackson et al. | In vitro methods for the primary screening of plant products for direct activity against ruminant gastrointestinal nematodes | |
| Zanin et al. | Affinity purification of protein complexes in C. elegans | |
| Tomalty et al. | Laboratory-scale isolation of insect antifreeze protein for cryobiology | |
| Shropshire et al. | An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia | |
| CZ304351B6 (cs) | Způsob přípravy exkrementových antigenů domácích roztočů | |
| Piou et al. | Honey bee larval hemolymph as a source of key nutrients and proteins offers a promising medium for Varroa destructor artificial rearing | |
| Álvarez et al. | Chemical synthesis and functional analysis of VarvA cyclotide | |
| Krizkova-Kudlikova et al. | Comparison of detection methods for Acarus siro (Acari: Acaridida: Acarididae) contamination in grain | |
| Sonier et al. | Mytilus edulis and Styela clava assimilate picophytoplankton carbon through feces and pseudofeces ingestion | |
| Reiss et al. | An agar plate method for culturing hookworm larvae: analysis of growth kinetics and infectivity compared with standard coproculture techniques | |
| Quarmby | Deflagellation | |
| Pomés | Cockroach and other inhalant insect allergens | |
| Hoareau et al. | Mass Purification Protocol for Drosophila melanogaster Wing Imaginal Discs: An Alternative to Dissection to Obtain Large Numbers of Disc Cells | |
| Russell et al. | A protocol for generating germ-free Heligmosomoides polygyrus bakeri larvae for gnotobiotic helminth infection studies | |
| Tuo et al. | A two-step method to generate highly-purified nematode eggs from feces: sucrose flotation followed by density gradient centrifugation using lymphocyte separation medium | |
| Davis et al. | A hymenopteran odorant alerts flies to bury eggs | |
| Massey et al. | Humidity determines penetrance of a latitudinal gradient in genetic selection on the microbiota by Drosophila melanogaster | |
| Mulyawan et al. | Unraveling the floral preference: Bee pollen identification and characterization of Tetragonula laeviceps | |
| Bhattacharyya | Further evidence of cannibalism and partial carnivorism in Drosophila species larvae | |
| Nisha et al. | Investigation of in Vitro Culturing Method for Ascaris lumbricoides Eggs in Laboratory: From Soil to Bench. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180625 |