KR102010436B1

KR102010436B1 - 신규 알러지 반응 검사용 조성물

Info

Publication number: KR102010436B1
Application number: KR1020180024856A
Authority: KR
Inventors: 김인식; 박범석; 홍민화; 김유리; 김상훈; 이수진; 김성열
Original assignee: 을지대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2019-08-13

Abstract

본 발명은 신규 알러지 반응 검사용 조성물에 관한 것으로서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 알러지 반응 검사용 조성물를 제공한다.

Description

신규 알러지 반응 검사용 조성물{Novel composition for testing allergy response}

본 발명은 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 알러지 반응 검사용 조성물에 관한 것이다.

알러지(allergy)는 면역 시스템의 오작동으로 보통 사람에게는 별 영향이 없는 물질이 어떤 사람에게만 두드러기, 가려움, 콧물, 기침 등의 이상 과민 반응을 일으키는 것을 의미한다. 알러지 반응은 재채기나 피부두드러기 등 경미한 불편함을 유발하는 알러지 증상에서부터 극단적인 경우 생명을 위협하는 과민성 반응(anaphylaxis)까지 다양한 증상으로 나타납니다.

알러지를 유발하는 항원을 알러젠(allergen)이라고 하는데, 대표적인 알러젠에는 집먼지 진드기(house dust mite, HDM 또는 DP), 동물의 비듬 또는 털, 곤충의 파편, 음식 먼지, 꽃가루 및 곰팡이 등이 있다. 특히 집먼지 진드기는 사람이 가장 장기간 접촉하며 생활하는 침구류 등에서 서식을 하며, 알러지성 비염 또는 천식을 유발하는 대표적인 알러젠으로 알려져 있다. 집먼지 진드기는 알러지성 질환의 50% 이상의 민감화의 원인으로 알려져 있다. 알러지를 유발하는 집먼지 진드기 중 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)와 미국 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae)의 두 가지 종류가 한국에서의 집먼지 진드기 알러젠의 대부분을 차지하고 있다.

그룹 1 알러젠은 시스테인 프로테이즈와 유사하고 그룹 3, 6, 9 알러젠은 세린 프로테이즈이다. 이러한 알러젠은 단백질 분해효소-활성화 수용체(proteinase-activated receptors, PARs)를 통해 염증 반응을 유도한다. 그룹 5, 7, 21 알러젠은 지질 결합 단백질이다. 그룹 2 알러젠은 LPS 결합 단백질이며 톨-유사 수용체 4(Toll-like receptor 4, TLR4)를 활성화시킨다. HDM 알러젠 성분은 민감성을 유도하는 경향이 있다.

TLR은 패턴 인식 수용체(PRR)의 한 유형으로 특정 미생물 리간드를 인식한다. TLR은 미생물 감염에 대한 숙주 보호에서 중요한 수용체로 알려져 있다. 감염 후 호중구와 대식 세포는 염증 부위에 충원되고 TLRs의 활성화를 통해 항균 활동을 향상시틴다. TLR은 MAP 카이네이즈와 IκB 카이네이즈와 같은 하류 신호경로를 활성화시킨 후 염증성 사이토카인의 상향조절로 이어진다. TLR4는 선천성 면역체계의 활성화와 HDM-매개 알러지 질환에 대한 필수 수용체이다.

호중구는 백혈구 중에서 가장 풍부한 유형이며 염증성 질환의 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 호중구는 병원체를 죽이고 면역반응에 관여하는 다양한 사이토카인의 발현을 조절하며, 호중구는 프로그램된 세포사멸로 인해 수명이 짧지 만 염증이나 감염 중 세포사멸을 억제하여 생존율을 연장시킨다. 세포사멸의 억제는 염증 부위에서의 호중구의 지속 및 천식과 같은 염증성 질환의 발병을 초래한다. 이전 연구에서 TLR4와 HDM 알러젠의 관계는 천식 및 알레르기 비염 환자의 호중구에서 조사되었다. 집먼지 진드기는 호중구 세포사멸과 TLR4 신호전달 경로의 활성화에 관여하는 항-세포사멸을 억제하는 강력한 요소이다. 알러지 질환의 주요 원인인 Der p 2는 재조합 TLR4에 결합하고 겹침(superposing)에 의해 MD 2와 유사한 구조를 나타냈다. Der p 2가 TLR4와 상호작용하지만, Der p 2는 호중구 세포사멸에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 새로운 항-세포사멸 인자가 TLR4에 결합하여 호중구 세포 사멸에 영향을 미칠 수 있다.

한편, 통상 어떤 사람이 알러지 반응에 대한 감수성을 갖는지 및 어떤 종류의 알러젠에 대하여 반응성을 나타내는지 확인하기 위해 알러지 검사가 수행된다. 이는, 알러지를 유발하는 원인이 개인마다 다르고 그에 따라 개별적인 치료가 필요하기 때문이다. 한 가지 이상의 알러지 유발인자에 대한 노출을 줄이면 전체 노출량이 낮아져 증상이 줄어들 수 있고, 따라서, 증상을 유발하는 알러지 유발인자를 식별할 필요가 있다. 이러한 알러지 검사에는 알레르기 감작의 지표인 혈중 알러지 항체인 IgE의 총량을 측정하는 혈액검사와 다양한 종류의 알러젠을 피부에 떨어뜨리고 바늘로 찔러, 피부로 들어가 반응이 일어나도록 하는 피부단자검사가 있다. 전자의 경우는 특정 알러젠에 대한 반응성 여부를 확인하기 어려우나 후자의 경우는 어떠한 알러젠에 대하여 환자가 반응하는지 여부를 확인할 수 있다는 점에서 개별치료법의 선정에 큰 도움을 준다. 현재 피부단자검사에 사용되는 항원은 상기 집먼지 진드기, 각종 동물 털, 다양한 식물의 꽃가루 등이 포함되고 있다. 그러나, 상기 집먼지 진드기의 경우 추출물의 형태로 접종이 되고 있어, 집먼지 진드기의 어떤 물질이 천식을 유발하는 알러젠인지 여부는 아직까지 확인되지 않고 있다.

알러지 검출방법과 관련하여, 미국 특허 US5,116,731은 알러지에 특이적인 탈과립 인자(degranulation factor)에 대한 반응으로 비만세포(mast cell), 호중구(basophil)로부터 방출되는 알러지-특이적 단백질 분해효소의 양을 측정하는 단계를 포함하는 외래 또는 자가-항원에 의해 유발되는 알러지의 검출방법을 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 어떤 천식을 유발하는 특정 알러젠에 대한 반응성 여부에 대한 분석을 하기 어렵다는 단점을 가지고 있고, 현재 사용되는 범용 피부단자검사의 경우 어떤 알러젠에 대하여 과민반응을 유발하는지 여부는 확인이 가능하나, 사용되는 알러젠이 추출물의 형태이기 때문에, 추출물 내의 어떤 물질이 원인물질인지 확인하기 어렵다는 문제점을 가지고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 아토피성 피부염, 알러지성 비염 및 천식의 유발원에 특이적인 과민 면역반응을 확인할 수 있는 보다 정밀하고 효과적인 알러진 반응 검사용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 알러지 반응 검사용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 감수성 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 알러지 반응 피부단자시험용 키트가 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알러지성 비염 또는 알러지성 천식에 걸릴 위험성이 높은 개체를 확인함으로써 사전에 이에 대한 개별적인 관리(individual care)를 할 수 있어, 막대한 사회적 비용이 소요되는 만성 알러지 질환에 대한 예방 및 치료가 가능하게 된다.

그러나, 본 발명의 효과가 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Der p X 단백질의 재조합 발현을 위해 작제된 플라스미드 DNA pMAL-c2X의 플라스미드맵(A) 및 상기 플라스미드에 포함된 Der p X의 전장 및 절단형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 아가로즈 겔 전기영동한 결과를 나타내는 사진(B)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Der p X 단백질을 MBP-Tag에 연결한 융합단백질 형태로 발현시킨 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 정제물에 대한 SDS-PAGE 전기영동 결과를 촬영한 사진이다.
도 3은 상기 MBP-Tag 연결 융합단백질을 다양한 농도의 TEV 프로테이즈로 절단한 후 절단산물을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Der p X 단백질을 TRX-Tag에 연결한 융합단백질 형태로 발현시킨 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 정제물에 대한 SDS-PAGE 전기영동 결과를 촬영한 사진이다.
도 5는 상기 TRX-Tag 연결 융합단백질을 트롬빈으로 절단한 후 절단산물을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 6은 재조합 Der p X 단백질이 TLR4에 결합함을 나타내는 단백질 결합 분석 결과를 나타내는 SDS-PAGE 전기영동 결과를 촬영한 사진이다.
도 7은 재조합 Der p X의 단백질 분해효소 활성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 Der p X 단백질이 정상인 유래의 호중구(A)및 알러지 환자 유래의 호중구(B)의 세포사멸의 억제에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 Der p X 단백질 처리시 인간 기관지상피세포 BEAS-2B에서의 MCP-1 단백질(A), IL-6(B) 및 IL-8(C)의 발현정도를 ELISA 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 Der p X 단백질 투여시 실험동물의 폐조직의 상태를 H&E 염색으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 Der p X 단백질 투여시 백혈구의 수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 Der p X 단백질 투여시 백혈구의 종류에 따른 수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

용어의 정의

본 문서에서 사용되는 용어 "알러지(allergy)"는 우리 몸의 면역체계가 특정 알레르기 유발 항원(또는 알러젠)에 반응하여 과도한 항원항체 반응이 일어나 여러 가지 증상이 일어나는 것을 의미한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "Der P X 단백질"은 유럽 집먼지 진드기(European house dust mite, Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 단백질이다(UniProtKB No.: Q8MWR6). Protease의 기능이 있다는 것이 알려져 있으나, 실제 그 기능을 하지 않으며, 아직까지 알러젠으로서의 정확한 기능이 알려져 있지 않아서, 번호를 부여받기 전까지 X(번호를 알지 못하는)라는 표현을 사용한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "면역학적 활성 단편(immunologically active fragment)"은 특정 단백질의 단편 중 면역반응을 유발할 수 있는 단편을 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 알러지 반응 검사용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 상기 알러지는 아토피성 피부염, 알러지성 천식 또는 알러지성 비염을 유발하는 알러지일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 감수성 예측용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 상기 알러지성 질환은 아토피성 피부염, 알러지성 비염 또는 알러지성 천식일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 예를 들어 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 상기 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균주사용액의 형태로 제제화할 수 있다. 제제화시 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 국소투여, 경구투여, 정맥투여, 경피투여, 흡입투여 등 다양한 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 피부단자시험용으로 사용되는 것이 일반적이기 때문에 피하투혀 또는 경피투여로 투여되는 것이 가장 바람직하다. 따라서 특히 경피투여를 위해 피부 점적 후 바늘로 찔러서 진피 내로 전달이 되도록 하는 방법을 사용하거나 최근 경피투여를 위한 제형으로 각광받는 마이크로니들 패치 또는 마이크로니늘 롤 형태로 투여될 수 있다.

상기와 같인 경피투여 또는 피하투여를 위한 부형제로는 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 Der p X 단백질을 포함하는 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 유효성분을 기준으로 0.001 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎/㎏의 양을 1회 투여할 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 알러지 반응 피부단자시험용 키트가 제공된다.

상기 키트는 하나 이상의 다른 알러지 유발원(allergen)을 포함하는 조성물을 추가로 포함할 수 있고, 상기 알러지 유발원은 꽃가루, 애완동물의 비듬 또는 털, 및 곰팡이로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

일반적 방법

시약:

Pfu DNA 중합 효소, 제한효소(BamH I, Not I), T4 DNA 라이게이즈, DNA 마커, 단백질 마커, His-Bind Agarose 수지 및 MBP-Bind Agarose 수지는 Elpis Biotech(대전, 한국)에서 구입하였다. 아가로오스, 50× TAE 완충액, Luria Bertani(LB) 배지, 카나마이신(Kanamycin), 앰피실린(Ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline hydrochloride), 이소프로필, β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), 이미다졸(Imidazole), 1 M 황산 니켈, 글리세롤 및 말토스는 LPS Solutiojn(대전, 한국)에서 구매하였다. 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)서 구매하였다. 겔 추출 키트 및 플라스미드 mini-prep 키트는 GeneAll(Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 트롬빈과 TEV protease는 Lee 박사(대전, 대한민국)로부터 공여받았다. HiTrap Q와 Superdex 200은 GE healthcare Bio-sciences(Uppsala, Sweden)에서 구입하였다. pMAL-c2X 및 pET32b 플라스미드는 Addgene(Cambridge, MA, USA)로부터 구입하였다. RPMI 1640과 우태아혈청(FBS)은 Life Technologies Inc.(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 집먼지 진드기는 한국의용절지동물은행(연세대학교, 서울)에서 입수하였다. Der p1 및 Der p2는 INDOOR biotechnologies(Charlottesville, VA, USA)로부터 구입하였다.

임상 시료:

을지대학교병원에서 경증 증상이 있는 알러지 환자를 모집하였다. 정상인은 대조군으로 모집되었다. 정상인에게는 천식이나 알레르기성 비염에 대한 병력이 없었으며 약물치료가 필요하지 않았다. 본 연구는 을지대학교의 제도검토위원회 (Board of Board)가 일반 자원봉사자들에 대하여 승인한 것이다. 이 연구에 참여한 모든 참가자는 서면동의를 얻었다.

호중구 격리 및 세포 배양:

피콜-하이파크 구배 원심분리(Ficoll-Hypaque gradient centrifugation)와 CD16 마이크로비드 자석 세포정렬 키트(CD16 microbeads magnetic cell sorting kit, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 헤파린 처리된 말초 혈액으로부터 인간 호중구를 분리하였다. 세포를 저 자극 용해 후 적혈구를 제거하기 위해 세척한 후 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 열불활성화 FBS가 함유 된 RPMI 1640 배지에서 3×0⁴ cells/㎖로 재현탁하였다.

세포 사멸의 검출:

호중구 세포사멸을 검출하기 위해 Annexin V-flourescein isothiocyanate(FITC) 세포사멸 분석 키트(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하였다. DP 추출물과 rDer p X를 포함한 자극제로 24시간 처리한 후, 분리된 호중구를 FITC-표지된 annexin V 및 propidium iodide(PI)와 함께 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 세포사멸성 호중구는 CellQuest 소프트웨어가 구비된 FACSCalibur 유세포 계측기를 사용하여 분석하였으며 Annexin V⁺/PI^-와 annexin V⁺/ PI⁺를 나타내는 세포의 백분율을 계산하였다.

통계처리:

데이터는 평균±SD로 나타내었다. 통계적 차이는 두 그룹 비교를 위한 paired t-test와 두 개 이상의 그룹의 비교를 위한 one-way ANOVA를 사용하여 분석되었다. 모든 분석은 SPSS 통계 소프트웨어 패키지(버전 10.0, Illinois, USA)를 사용하여 수행되었으며, p 값 < 0.05는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.

실시예 1: Der p X 전체 서열 및 절단 된 서열의 클로닝

PCR 주형은 Der p X 전체 형태 및 발현을 개선하기 위해 신호 서열을 제거한 절단형을 사용하였다. 하기 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 의해 증폭하였다 (포워드 프라이머: 5'-ACTACGGATCCATGAAATTCTTCTTC-3'(서열번호 3), 절단형 포워드 프라이머: 5'-ACTACGGATCCATGCAAGTTTATTGTAATGGTGCC-3'(서열번호 4)과 리버스 프라이머: 5'-ACTACGCGGCCGCTCACCAACATCGTGCAACATTAGC-3'(서열번호 5). PCR 조건은 10 ng Der p X 유전자, 5 unit/μL Pfu polymerase, 2.5 mM dNTP mix 및 10 pmol 프라이머를 증류수에 첨가하였다. PCR 시료를 95℃에서 5분간 변성시켰다. PCR 조건은 95℃ 30 초, 54℃ 30 초 어닐링, 72℃ 1분 35 회, 72℃ 7분 연장으로 설정하였다. PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하고 겔 추출 키트를 사용하여 정제 하였다. 발현벡터(pMAL-c2x, pET-32b) 및 Der p X 유전자를 제한효소로 37℃에서 2 시간 동안 절단하였다. Der p X 유전자 단편을 T4 DNA 라이게이즈를 사용하여 23℃에서 4시간 동안 반응시켜 벡터에 삽입하였다. 클로닝된 DNA를 대장균 DH5α로 형질 전환시켰다. 단일 콜로니를 항생제(80 μg/mL 암피실린)가 함유된 LB 배지에 접종 하였다. 플라스미드 mni-prep 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고 DNA 시퀀싱(Marcogen, 대전, 한국)에 의해 확인되었다(도 1).

실시예 2: 재조합 융합 단백질의 발현

2-1: MBP 태그 Der p X 단백질

pMAL-c2X-Der p X 벡터를 대장균 BL21(DE3) competent cell로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 항생제(80 μg/mL ampicillin)가 함유된 LB 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 전 배양한 세포를 500 mL LB 배지에 옮겨 37℃에서 광학 밀도가 0.6이 될 때까지 배양 하였다. 단백질 발현은 0.5 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 유도 하였다. 배양된 세포를 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수확한 다음, 수집된 세포펠렛을 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤(v/v), 1 mM PMSF) 및 초음파 처리에 의해 용해시킨 후, 4℃에서 40분 동안 13,000 rpm에서 원심분리한 상등액을 정제에 사용하였다.

2-2: TRX-His 태그 Der p X 단백질

pET32b-Der p X 벡터를 competent E. coli Origami B(DE3) 세포로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 항생제(50 μg/ml 카나마이신, 80 μg/ml 앰피실린, 10 μg/ml 테트라사이클린)가 포함된 LB 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 전 배양한 세포를 500 ml LB 배지에 옮겨 37℃에서 광학밀도가 0.6이 될 때까지 배양하고 0.5 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 발현 수준을 높이기 위해 배양 온도 조건을 밤새 18℃로 바꾸었다. 배양된 세포를 4000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하여 수확한 다음, 수집된 세포펠렛을 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 1 mM PMSF)에 재현탁시키고 초음파 처리에 의해 용해시켰다. 세포용해 후, 4℃에서 13,000 rpm, 40분 동안 원심 분리된 용해물을 정제에 사용하였다.

실시예 3: 재조합 Derp X 단백질의 정제

3-1: MBP tag Der p X 단백질의 친화도 크로마토그래피

재조합 Der p X 단백질은 친화성 크로마토그래피를 위해 아밀로즈 수지를 사용하여 일차 정제되었다. 조용해액을 결합/세척완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤(v/v))으로 평형화된 컬럼에 적재하였다. 컬럼은 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 충분히 세척된 결합/세척완충액으로 세척한 다음 용출완충액(결합/세척 완충액 + 10 mM 말토스)으로 단백질 시료를 용출시켰다. 용출된 융합단백질을 1:10(w/w)의 비율로 TEV 프로테이즈로 절단 하였다. 절단 조건은 하룻밤 동안 4℃로 설정하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, MBP-태그가 연결된 융합단백질은 정상적으로 발현이 되었고, TEV 프로테이즈로 절단시 도 3에서 나타난 바와 같이, MBP 태그가 절단되어 재조합 형태의 Der p X 단백질(rDer p X)이 정상적으로 분리됨을 확인할 수 있었다. TEV 프로테이즈의 비율을 높일수록 재조합 Der p X의 양이 증가하는 경향을 나타냈으나 1:25 이상에서는 큰 차이가 없었다.

3-2: TRX-His-Der p X 단백질의 친화도 크로마토 그래피

친화성 크로마토그래피를 위해 Ni²⁺-NTA 수지를 사용하여 재조합 Der p X 단백질을 정제하였다. 결합 완충액(20 mM Tris-HCl,pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM 이미 다졸)으로 평형화시킨 컬럼에 조용해물을 적재하였다. 상기 컬럼을 결합 완충액 및 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 60 mM 이미다졸)으로 세척한 후, 용출 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 M 이미다졸)으로 용출시킨 융합단백질을 트롬빈을 1:100(w/w)의 비율로 사용하여 절단하였다. 절단 조건은 하룻밤 동안 4℃로 설정하였다.

3-3: 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피

융합단백질을 절단한 후, 단백질을 A 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤) 및 B 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤)와 함께 HiTrap Q 칼럼에 적재하여 용출한 후, 용출된 시료의 NaCl 농도를 희석하기 위해 시료에 A 완충액을 첨가한 다음 희석된 시료를 AKTAPrime plus (GE healthcare, Sweden) 상의 Hitrap Q 컬럼에 적재하였다. 이온입자에 결합된 재조합 단백질은 NaCl 농도구배를 이용하여 용리시켰다. 최종 정제는 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 200 mM NaCl을 사용하여 Superdex 200 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다.

TRX 태그를 이용한 융합단백질의 발현 및 트롬빈을 이용한 절단 역시 도 4 및 5에서 나타난 바와 같이 성공적으로 수행되었다.

실시예 4: 단백질 결합 시험

재조합 His 태그가 부착된 TLR4 단백질을 니켈 컬럼에 넣고 정제된 rDer p X를 rDer p X와 rTLR4의 결합용 컬럼에 넣었다. 결합 시간 후, 컬럼을 세척하고 세척 및 용리 완충액으로 각각 용리시켰다. 용출된 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, Der p X가 TLR4와 결합함이 확연하게 나타났다.

실시예 5: 프로테이즈 활성 분석

총 프로테이즈 활성을 형광 프로테이즈 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석은 샘플에서 프로테이즈 활성을 평가하기위한 기질을 사용하기 위해 2.5 mg FTC-표지 카제인을 함유하였다. 기질은 더 작은 형광 표지된 단편으로 분해된다. 96-웰 플레이트, 형광 측정기-호환 적정 플레이트의 각 웰에 100 μL 샘플을 첨가 한 다음, 각 샘플에 10 μg/mL 카세인 100 μL를 첨가 하였다. 절단은 실온에서 1시간 동안 수행 하였다. 형광광도계를 사용하여 반응 혼합물의 형광신호를 485 nm에서의 여기와 538 nm에서의 방출을 측정하여 모니터링했다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, Der x P는 단백질 분해효소 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 종래에 Der x P가 단백질 분해효소라는 보고는 잘못된 것임을 알 수 있다.

실시예 6: 정상 중성구 및 알러지성 중성구에 대한 세포사멸 분석

이어, 본 발명자들은 Der p X의 효과와 DP 추출물의 호중구 세포사멸에 대한 억제효과 사이의 상관 관계를 조사하였다. Der p X의 효과를 평가하기 위해 rDer p X가 호중구 세포사멸의 조절을 변경하는지 조사하였다. 그 결과, Der p X는 대조군에 비해 용량의존적으로 정상인으로부터의 수득된 호중구 세포사멸을 유의하게 억제하였다. 아울러, 알러지 환자로부터 수득된 알러지성 호중구의 세포사멸 또한 정상 호중구의 세포사멸과 유사하게 용량 의존적으로 억제되었다(도 8A 및 8B). 이러한 결과는 Der p X가 DP 추출물에서의 호중구 세포사멸의 억제와 관련될 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 7: Der p X에 의한 기관지상피세포(BEAS-2B)에서의 염증성 사이토카인 및 케모카인 유발 효과

기관지상피세포는 천식와 같은 급만성 염증반응에서 다양한 사이토카인 및 케모카인을 생산하여 질병을 유발 또는 악화시킨다. 이에 본 발명자들은 Der p X가 인간 기관지상피세포에서의 염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.

구체적으로 사람의 기관지상피세포인 BEAS-2B 세포 6×10⁴cells/㎖에 Der p X 10 ㎍/㎖를 12 시간, 24 시간, 48 시간 처리한 후에 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1(도 9A), IL-6(도 9B), IL-8(도 9C)의 양을 측정하였으며, 이 때, 양성대조군으로 집먼지 진드기 추출물(Dp) 10 ㎍/㎖를 처리하였다.

그 결과 도 9A 내지 9C에 나타난 바와 같이, Der p X에 의해 MCP-1, IL-6, IL-8의 발현이 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, 집먼지 진드기 추출물 처리시에는 이들 사이토카인들의 발현 수순이 Der p X 처리시보다는 높지 않거나, IL-6 및 IL-8 발현에는 아무런 영향을 주지 않았다.

실시예 8: 마우스에서 Der p X 에 의한 천식질환의 유도 효과

8-1: 폐조직에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 Der p X의 천식 질환 유발효과 유무를 확인하기 위한 동물 실험을 진행하였다.

구체적으로 음성대조군으로서 인산완충용액(PBS)만 투여한 군(PBS군), PBS를 투여하고 난알부민(Ovalbumin)을 분무(nebulization)하여 흡입한 군(PBS+OVA군), Der p X만 투여한 군(Der p X군), Der p X를 투여하고 난알부민을 분무하여 흡입한 군(Der p X+OVA군)으로 구분하였다. 먼저 마우스에 2주 간격으로 PBS(100 ㎕) 또는 Der p X(100 ㎍/100 ㎕)를 복강 내 2번 투여하였다. 투여한지 1주일 후에 마취를 시킨 후 비강 내 PBS (50 ㎕) 또는 Der p X (50 ㎍/50 ㎕)를 2주 동안 매일 투여하였다. 마지막 1주 동안 매일 1시간씩 5% 난알부민을 분무하여 흡입시켰다.

그런 다음 마우스에서 기관(trachea)에 가까운 폐 조직을 적출한 후, 고정하여 파라핀 조직 블록으로 제작하였다. 그 후, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 조직 절편을 만든 다음, H&E 염색(hematoxylin & eosin stain)을 실시하여 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, PBS군은 정상소견을 나타냈으며, PBS+OVA군은 아주 약하게 폐포주위로 염증소견을 보여주었다. 반면에 Der p X군은 기관지 및 폐포에 침윤된 세포의 수가 증가하고, 폐포가 좁아져 있었으며, Der p X+OVA군은 좀 더 심한 양상이 관찰됨을 확인할 수 있었다. 이로서 Derp X가 단독으로 천식을 유발할 수 있으며, 알러젠으로 알려져 있는 난알부민을 투여한 경우 좀 더 심각한 증상을 나타냄을 확인할 수 있었다.

8-2: 백혈구 및 호산구에 대한 영향

이어 본 발명자들은 상기 실시예 2-1에서 사용한 실험동물의 폐세척액(BALF)에 존재하는 백혈구의 수를 분석하였다. 그 결과 도 11에서 나타난 바와 같이, 백혈구 수는 Der p X를 처리한 군에서 10배 이상 증가함을 확인할 수 있었다. 아울러, 본 발명자들은 상기 백혈구의 종류를 보다 상세하게 분석하였다. 그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이, 중성구의 수는 Der p X 처리 전후로 거의 존재하지 않았으나, 호산구의 경우 Der p X를 처리한 군에서 현저하게 증가함을 확인할 수 있었고, 림프구의 경우 그 정도는 다소 약하긴 하였으나, Der p X 처리시 증가함을 확인하였으며, 대식세포의 경우 오히려 Der p X 투여에 의해 현저하게 감소함을 확인하였다.

상술한 실험결과에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 Der p X 단백질은 알러지성 천식 등의 급만성 알러지 질환의 주요한 알러지원으로서 개체의 알러지성 천식에 대한 감수성을 예측하는데 매우 유용하게 사용할 수 있을뿐더러, 이들 환자의 맞춤치료를 위한 유용한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Eulji University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Novel composition for testing allergy response <130> PD18-5641 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 150 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 1 Met Lys Phe Phe Phe Thr Leu Ala Leu Phe Cys Thr Leu Ala Ile Ser 1 5 10 15 Gln Val Tyr Cys Asn Gly Ala Ala Ile Val Ser Ala Ala Arg Ser Gln 20 25 30 Ile Gly Val Pro Tyr Ser Trp Gly Gly Gly Gly Ile His Gly Lys Ser 35 40 45 Arg Gly Ile Gly Glu Gly Ala Asn Thr Val Gly Phe Asp Cys Ser Gly 50 55 60 Leu Ala Gln Tyr Ser Val Tyr Gln Gly Thr His Lys Val Leu Ala Arg 65 70 75 80 Val Ala Ser Gly Gln Tyr Ser Asp Pro Lys Cys His His Val Ala Tyr 85 90 95 Gly Ser His Gln Pro Gly Asp Leu Val Phe Phe Gly Asn Pro Ile His 100 105 110 His Val Gly Ile Val Ser Ala His Gly Arg Met Ile Asn Ala Pro His 115 120 125 Thr Gly Thr Lys Val Arg Glu Glu Asn Ile Gly Gly Asp His Ile Ala 130 135 140 Asn Val Ala Arg Cys Trp 145 150 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 2 Val Tyr Cys Asn Gly Ala Ala Ile Val Ser Ala Ala Arg Ser Gln Ile 1 5 10 15 Gly Val Pro Tyr Ser Trp Gly Gly Gly Gly Ile His Gly Lys Ser Arg 20 25 30 Gly Ile Gly Glu Gly Ala Asn Thr Val Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu 35 40 45 Ala Gln Tyr Ser Val Tyr Gln Gly Thr His Lys Val Leu Ala Arg Val 50 55 60 Ala Ser Gly Gln Tyr Ser Asp Pro Lys Cys His His Val Ala Tyr Gly 65 70 75 80 Ser His Gln Pro Gly Asp Leu Val Phe Phe Gly Asn Pro Ile His His 85 90 95 Val Gly Ile Val Ser Ala His Gly Arg Met Ile Asn Ala Pro His Thr 100 105 110 Gly Thr Lys Val Arg Glu Glu Asn Ile Gly Gly Asp His Ile Ala Asn 115 120 125 Val Ala Arg Cys Trp 130 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Der p X forward primer full-length <400> 3 actacggatc catgaaattc ttcttc 26 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Der p X forward primer truncated <400> 4 actacggatc catgcaagtt tattgtaatg gtgcc 35 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Der p X reverse primer <400> 5 actacgcggc cgctcaccaa catcgtgcaa cattagc 37

Claims

서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질을 유효성분으로 포함하는 알러지 반응 검사용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 알러지는 아토피성 피부염, 알러지성 천식 또는 알러지성 비염을 유발하는 알러지인, 조성물.
서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 감수성 예측용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 알러지성 질환은 아토피성 피부염, 알러지성 비염 또는 알러지성 천식인, 조성물.
서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 유래의 Der P X 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 알러지 반응 피부단자시험용 키트.
제5항에 있어서,
하나 이상의 다른 알러지 유발원(allergen)을 포함하는 조성물을 추가로 포함하는, 키트.
제6항에 있어서, 상기 알러지 유발원은 꽃가루, 애완동물의 비듬 또는 털, 및 곰팡이로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트.