ES2208627T3 - Procedimiento de cultivo de acaros, preparacion nutritiva para este procedimiento, y preparacion de extractos alergenicos a partir de estos acaros. - Google Patents
Procedimiento de cultivo de acaros, preparacion nutritiva para este procedimiento, y preparacion de extractos alergenicos a partir de estos acaros.Info
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Abstract
Medio de cultivo y de producción de ácaros y, en particular, de ácaros pertenecientes a una al menos de las especies siguientes: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini o tropicalis, Pyroglyphus africanus y Euroglyphus maynei, caracterizado por estar desprovisto de elementos o de proteínas humanas o animales y por contener, en cantidades eficaces, una pluralidad de aminoácidos en forma particulada con una granulometría inferior a 250 microm o en forma liofilizada.
Description
Procedimiento de cultivo de ácaros, preparación
nutritiva para este procedimiento, y preparación de extractos
alergénicos a partir de estos ácaros.
La presente invención se relaciona con un
procedimiento de cultivo de ácaros para la producción de extractos
alergénicos de ácaros, así como con formulaciones nutritivas
destinadas a su utilización en estos procedimientos.
Se describe un procedimiento de cultivo de ácaros
en la patente US 6129935.
Diferentes especies de ácaros son utilizadas para
prepara extractos alergénicos empleados en formulaciones de
alergología para servir, por ejemplo, de pruebas de alergología
in vivo o in vitro, o también de preparaciones
desensibilizantes administradas a los pacientes.
Entre estos ácaros, se encuentran, en particular,
las especies siguientes: Dermatophagoides pteronyssinus,
Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini o tropicalis,
Pyroglyphus africanus y Euroglyphus maynei, que son
ácaros domésticos que se nutren principalmente de escamas
humanas.
Para producir estos ácaros, se utilizan
clásicamente medios de cultivo que contienen escamas humanas
convenientemente tratadas y autoclavadas para la inactivación de
virus, bacterias y agentes transmisibles no convencionales, tales
como los priones. Los ácaros así producidos permiten obtener, por
extracción, extractos alergénicos de una gran calidad y
prácticamente desprovistos de alergenos de otro origen susceptibles
de provocar reacciones cruzadas que puedan hacer que las pruebas
sean erróneas o que sean susceptibles de inducir alergias.
Se conocen otros procedimientos de cultivo de
ácaros que utilizan medios nutritivos a base de proteínas, tales
como huevos de camarón o polvo de hígado de cerdo. Estos medios
permiten obtener producciones satisfactorias, pero llevan consigo
substancias no acaroideas, en particular de origen animal, que
pueden ser alergizantes y/o con potencial infeccioso.
Aunque los procedimientos de inactivación
utilizados para tratar las escamas humanas destinadas al cultivo de
ácaros sean de una eficacia extremadamente elevada y aunque las
contaminaciones por agentes infecciosos convencionales o no sean
altamente improbables, es, sin embargo, deseable utilizar, para
cultivar los ácaros, medios nutritivos de origen no humano y no
animal y desprovistos de elementos susceptibles de ser
alergénicos.
La presente invención se propone, pues, ofrecer
un procedimiento de cultivo y de producción de ácaros y, en
particular, de ácaros de las especies antes citadas, limitando al
máximo el riesgo de presencia de agentes infecciosos de origen
animal o humano.
Otro objetivo de la invención es ofrecer un
procedimiento tal que permita un rendimiento importante de
ácaros.
Otro objetivo aún de la invención es mejorar
eventualmente la antigenicidad de los ácaros destinados a ser usados
o extraídos para formar las formulaciones finales.
Otro objeto aún de la invención es permitir
eliminar fácilmente una gran parte del medio de cultivo.
La invención tiene por objeto un procedimiento de
cultivo y de producción de ácaros y, en particular, de ácaros
pertenecientes a una al menos de las especies siguientes:
Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia
kulagini o tropicalis, Pyroglyphus africanus y
Euroglyphus maynei, caracterizado por cultivar los ácaros en
medio desprovisto de elementos o de proteínas humanas o animales y
que contiene, en cantidades eficaces, una pluralidad de aminoácidos
en forma particulada con una granulometría inferior a 250 \mum, o
en forma liofilizada.
Se puede obtener la granulometría buscada de
aminoácidos por trituración de los aminoácidos, individualmente o en
mezcla.
De forma equivalente, los aminoácidos pueden ser
obtenidos por disolución de los aminoácidos y liofilización después.
En este caso, se prefiere que la liofilización dé como resultado
partículas de tamaño inferior a 250 \mum.
Se entiende que, en el medio según la invención,
sólo algunos de los ácidos pueden haber sido triturados y/o
liofilizados, en particular en función de sus características
físicas, por ejemplo su solubilidad, y, según sea el caso, se
pueden añadir determinados ácidos tal cual a la mezcla.
La invención se basa en el descubrimiento de que,
si se utilizan tal cual (sin trituración y/o sin
solubilización-liofilización y/o sin adición de
sales) los aminoácidos comercialmente disponibles, los ácaros se
cultivan extremadamente mal y los rendimientos son muy bajos.
Sorprendentemente, las mezclas de aminoácidos que tienen las
características definidas en la invención dan como resultado
rendimientos comparables, incluso superiores, a los rendimientos
clásicos que utilizan escamas humanas.
Las mezclas de aminoácidos incluyen,
preferiblemente, la mayoría o la totalidad de los aminoácidos
constitutivos naturales de las proteínas. Por mayoría se entiende
al menos un 50%, por ejemplo un 60 a un 80%, de los veinte
aminoácidos constitutivos naturales de las proteínas o de
aminoácidos equivalentes asimilables. Se pueden añadir también, sin
embargo, aminoácidos no constitutivos, o substituir algunos de los
aminoácidos con aminoácidos no constitutivos de proteínas.
En un modo de realización particular, se puede
utilizar ventajosamente una mezcla de aminoácidos que se aproxime a
la composición de la queratina o de la capa córnea.
Sin embargo, en variantes de la invención, se
pueden utilizar también mezclas de aminoácidos que se aproximen a la
composición de los huevos de camarones o de la soja. En otras
formulaciones, se puede alejar de esta distribución.
Las proporciones respectivas de los aminoácidos
pueden aproximarse a las proporciones cuantitativas de los
aminoácidos en substancias tales como la queratina o la capa córnea,
los huevos de camarón o la soja, pero no se exige en modo alguno
una identidad de distribución en proporción, mientras que los
aminoácidos individuales estén presentes en cantidad suficiente.
El medio nutritivo que lleva la mezcla de
aminoácidos del procedimiento según la invención puede llevar
también otros elementos habituales de medios nutritivos para
ácaros, destinados a aportar un complemento nutritivo o a dar al
medio una textura apropiada para el desarrollo y la multiplicación
de los ácaros, así como sales.
Así, se prefiere incorporar, en el medio de
cultivo, germen de trigo y/o de levadura, en particular levadura de
pan, y/o cianocobalamina y/o d-biotina. El medio
puede aún llevar otras vitaminas.
El germen de trigo es preferiblemente calentado
para suprimir cualquier riesgo de alergenicidad.
En el procedimiento según la invención, se lleva
el medio de cultivo, que contiene la mezcla de aminoácidos, a un
grado de humedad conveniente, habitual para los ácaros que se
cultivan, y se mantiene a la temperatura habitual conveniente. Las
duraciones del cultivo pueden ser, por ejemplo, de tres meses y se
preferirán duraciones clásicas de 2 a 5 meses.
La invención tiene igualmente por objeto los
medios de cultivo que contienen las mezclas de aminoácidos según la
invención.
La invención tiene también por objeto los
procedimientos de preparación de extractos o de formulaciones de
alergenos obtenidas a partir de los ácaros cultivados por el
procedimiento según la invención.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán al leer la descripción siguiente, hecha a modo de ejemplo
no limitativo.
Se realizaron cultivos simultáneamente en medios
de aminoácidos según los ejemplos 1 y 3 y sobre escamas humanas
según el ejemplo 2.
Este ejemplo describe un procedimiento de cultivo
en un medio que contiene una preparación comercial de
aminoácidos.
Se prepara un medio de cultivo que contiene
germen de trigo, cianocobalamina, levadura de pan y
D-biotina.
El germen de trigo es autoclavado a 121ºC durante
20 minutos y luego triturado y tamizado a través de un tamiz de 250
\mum.
Se tritura la cianocobalamina y se tamiza a
través de un tamiz de 250 \mum de poro.
Se calienta la levadura de pan a 122ºC durante 2
a 3 minutos y luego a entre 100 y 135ºC durante 12 segundos en un
tambor cuya velocidad de giro es de 5 vueltas por minuto y se
calienta después a 100ºC durante 15 minutos.
Se obtuvo la preparación comercial de aminoácidos
de la sociedad Frésénius-Kabi France S.A. Su
composición es la siguiente, csp 1 L de agua PPI:
| - | L-alanina | 3,8 g |
| - | L-arginina | 4,2 g |
| - | ácido L-aspártico | 5,2 g |
| - | clorhidrato de L-cisteína monohidratada | |
| expresado en L-cisteína/L-cistina | 1,7 g |
| - | ácido L-glutámico | 11,5 g |
| - | glicina | 2,7 g |
| - | L-histidina | 3,1 g |
| - | L-isoleucina | 5,0 g |
| - | L-leucina | 6,7 g |
| - | clorhidrato de L-lisina, expresado en L-lisina | 5,0 g |
| - | L-metionina | 2,4 g |
| - | L-fenilalanina | 7,0 g |
| - | L-prolina | 10,3 g |
| - | L-serina | 9,6 g |
| - | L-treonina | 3,8 g |
| - | L-triptófano | 1,3 g |
| - | L-tirosina | 0,6 g |
| - | L-valina | 5,5 g |
| - | Cloruro de calcio dihidrato | 0,44 g |
| - | Sulfato de magnesio heptahidrato | 0,493 g |
| - | Hidróxido de sodio | 2,6 g |
| - | Hidróxido de potasio | 0,70 g |
| - | Cloruro de potasio | 0,078 g |
Se liofiliza la solución y se criba el
liofilizado recogido a través de un tamiz vibratorio de 250 \mum
de poro.
Se prepara el medio propiamente dicho de la forma
siguiente:
Para 600 g de medio:
Se pesan 252 g de germen de trigo tamizado, 252 g
de levadura tamizada, 90 g de la solución de aminoácidos liofilizada
y tamizada, 5,4 g de cianocobalamina tamizada y 0,6 g de
D-biotina, homogeneizándose el conjunto en un
homogeneizador y tamizándolo luego a través de un tamiz de 400
\mum de poro. Se acondiciona el medio en frascos tapados
identificados y se puede conservar en cámara fría a una temperatura
comprendida entre +2ºC y +8ºC.
Se efectúa el cultivo propiamente dicho del modo
siguiente:
Se siembran los medios preparados con inóculo de
cultivos de siembra clásica de Dermatophagoides pteronisynus.
Se efectúa el cultivo en frascos a una temperatura de 25ºC, con un
grado de humedad del 75%. Se realizan las tomas en épocas
diferentes. Se liofilizan después los medios recogidos y se extraen
al 5% en solución de bicarbonato de amonio, 4 g/l durante 24 horas
a +4ºC y se centrifugan luego a 3.000 revoluciones por minuto
durante 15 minutos a +4ºC. Se recoge el sobrenadante y se filtra
después a través de un filtro Millex HV de 0,45 \mum de poro
(Millipore).
En los extractos obtenidos, se cuantifica la
actividad alergénica total (por inhibición de Rast), las proteínas
(por la técnica de Lowry y/o la técnica de Bradford) y los
alergenos mayores Der p 1 y Der p 2 (con ayuda de los kits de
medición habituales).
El resultado de la inhibición de Rast es
expresado en IR/ml (IR: índice de reactividad), siendo cuantificados
los extractos en comparación con un extracto de referencia cuya
actividad es de 100 IR/ml.
El medio del ejemplo 2 es idéntico al del ejemplo
1, con la diferencia de que la solución comercial liofilizada de
aminoácidos es substituida por una preparación de escamas
humanas.
Estas escamas son autoclavadas en bolsitas a
134ºC durante 18 minutos. Se depositan luego las escamas en bandejas
inoxidables metidas en una estufa a 37ºC durante 1 a 2 semanas. Se
trituran luego las escamas y se criban con tamices de 500 y 250
\mum.
Se trata después el polvo de escamas recogido con
acetona y se deja decantar durante 24 horas. Se elimina el
sobrenadante. Se procede luego a una última operación de lavado con
acetona. Se recoge la pella, que se reparte en capas delgadas sobre
bandejas y que recubre de una hoja de aluminio perforada. Se seca
esta substancia bajo campana y finalmente se criba con un tamiz
vibratorio de 250 \mum.
En lugar de los 90 g de mezcla de aminoácidos, el
medio de cultivo de este ejemplo contiene 90 g de la preparación de
escamas humanas antes citada.
El medio de cultivo contiene germen de trigo,
cianocobalamina y levadura según los ejemplos 1 y 2.
Se prepara una mezcla de aminoácidos de la forma
siguiente:
En un recipiente, se vierten 10 litros de agua
destilada estéril y se solubilizan los siguientes aminoácidos:
| - | L-alanina | 17,2 g |
| - | L-arginina | 26,4 g |
| - | clorhidrato de L-cisteína monohidratada | 4,4 g |
| - | glicina | 49,6 g |
| - | L-histidina | 5,2 g |
| - | L-isoleucina | 13,2 g |
| - | clorhidrato de L-lisina | 20,0 g |
| - | L-metionina | 8,0 g |
| - | L-prolina | 8,8 g |
| - | L-serina | 44,0 g |
| - | L-treonina | 13,6 g |
| - | L-valina | 13,6 g |
| - | L-triptófano | 1,3 g |
| - | L-fenilalanina | 20,8 g |
| - | L-leucina | 34,8 g |
| - | ácido L-glutámico | 64,4 g |
| - | ácido L-aspártico | 9,7 g |
Se liofiliza luego la solución y se criba el
liofilizado recogido a través de un tamiz vibratorio de 250 \mum
de poro.
Se trituran por separado 6,5 g de ácido aspártico
y 4,0 g de tirosina.
Para preparar el medio, se añaden a los 252 g de
germen de trigo, 252 g de levadura, 5,4 g de cianocobalamina y 0,6 g
de D-biotina 79,5 de la mezcla liofilizada antes
citada, 6,5 g de ácido aspártico triturado y 4,0 g de tirosina
triturada.
Se homogeneiza el conjunto y se criba después
sobre 400 \mum. Después de la siembra, se efectúa el cultivo como
en los ejemplos 1 y 2.
Los resultados comparativos de los ejemplos 1 a 3
figuran en la tabla 1 para un primer ciclo de cultivo, después de 3
meses, y en las tablas 2 y 3 para un segundo ciclo de cultivo (los
ácaros cultivados sobre un medio dado son resembrados sobre el
mismo medio), después de 2,5 meses y de 3 meses,
respectivamente:
Actividad alergénica total, razones proteicas, de
Der p 1 y Der p 2 en los extractos 1/20 de Dermatophagoides
pteronyssinus cultivado sobre diferentes medios después de tres
meses de cultivo
| Medio que contiene | Aminoácidos | Escamas humanas | Aminoácidos |
| (ejemplo 1) | (ejemplo 2) | (ejemplo 3) | |
| Actividad alergénica | 263 | 284 | 573 |
| total (IR/ml) | |||
| Razón proteica (\mug/ml; | 537 | 544 | 217 |
| técnica de Bradford) | |||
| Razón proteica (\mug/ml; | 5.689 | 6.446 | 5.538 |
| técnica de Lowry) | |||
| Der p 1 (\mug/ml) | 187,5 | 231,5 | 69,0 |
| Der p 2 (\mug/ml) | 2,0 | 2,5 | 10,0 |
Actividad alergénica total, razones proteicas, de
Der p 1 y Der p 2 en los extractos 1/20 de Dermatophagoides
pteronyssinus cultivado en un segundo ciclo sobre diferentes
medios después de dos meses y medio de cultivo
| Medio que contiene | Aminoácidos | Escamas humanas | Aminoácidos |
| (ejemplo 1) | (ejemplo 2) | (ejemplo 3) | |
| Actividad alergénica | 617 | 713 | 195 |
| Total (IR/ml) | |||
| Razón proteica (\mug/ml; | 328 | 371 | 75 |
| técnica de Bradford) | |||
| Der p 1 (\mug/ml) | 83,0 | 138,0 | 8,5 |
| Der p 2 (\mug/ml) | 19,5 | 19,5 | 3,0 |
Actividad alergénica total, razones proteicas, de
Der p 1 y Der p 2 en los extractos 1/20 de Dermatophagoides
pteronyssinus cultivado en un segundo ciclo sobre diferentes
medios después de tres meses de cultivo
| Medio que contiene | Aminoácidos | Escamas humanas | Aminoácidos |
| (ejemplo 1) | (ejemplo 2) | (ejemplo 3) | |
| Actividad alergénica | 631 | 486 | 192 |
| total (IR/ml) | |||
| Razón proteica (\mug/ml; | 363 | 411 | 110 |
| técnica de Bradford) | |||
| Der p 1 (\mug/ml) | 206,0 | 267,5 | 23,0 |
| Der p 2 (\mug/ml) | 14,0 | 4,5 | 5,0 |
Se ve que, si el cultivo sobre aminoácidos
siguiendo el ejemplo 3 da buenos resultados después de un primer
ciclo de cultivo, da malos resultados en un segundo ciclo de
cultivo. Este ejemplo no está, pues, adaptado al cultivo rutinario
de ácaros.
En cambio, el cultivo sobre aminoácidos siguiendo
el ejemplo 1 parece bien adaptado, puesto que no sólo son
satisfactorios los resultados después de dos ciclos de cultivo,
sino que, además, están muy próximos a los resultados obtenidos con
las escamas humanas, que constituyen la alimentación natural de los
ácaros en cuestión. La debilidad relativa de los resultados
obtenidos del primer ensayo es ciertamente imputable a un tiempo de
cultivo demasiado importante (una recogida a los dos meses y medio
habría dado ciertamente mejores resultados).
Claims (18)
1. Medio de cultivo y de producción de ácaros y,
en particular, de ácaros pertenecientes a una al menos de las
especies siguientes: Dermatophagoides pteronyssinus,
Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini o tropicalis,
Pyroglyphus africanus y Euroglyphus maynei,
caracterizado por estar desprovisto de elementos o de
proteínas humanas o animales y por contener, en cantidades eficaces,
una pluralidad de aminoácidos en forma particulada con una
granulometría inferior a 250 \mum o en forma liofilizada.
2. Medio según la reivindicación 1,
caracterizado por contener aminoácidos obtenidos por
trituración de aminoácidos.
3. Medio según la reivindicación 2,
caracterizado por contener también aminoácidos liofilizados
y/o tal cuales comerciales.
4. Medio según la reivindicación 1,
caracterizado por contener aminoácidos liofilizados y
aminoácidos tal cuales comerciales.
5. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado por contener sales.
6. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado por el hecho de que la mezcla de aminoácidos
contiene al menos un 50% de los aminoácidos constitutivos naturales
de las proteínas o sus equivalentes.
7. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado por el hecho de que la mezcla de aminoácidos
reproduce el espectro de los aminoácidos constitutivos de la
queratina o de la capa córnea.
8. Medio según una de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado por el hecho de que la mezcla de aminoácidos
reproduce el espectro de los aminoácidos presentes en los huevos de
camarón o en la soja.
9. Medio según una de las reivindicaciones 7 y 8,
caracterizado por el hecho de que las proporciones
respectivas de los aminoácidos están próximas a las proporciones
cuantitativas de los aminoácidos y de las sales en substancias
tales como la queratina o la capa córnea o los huevos de camarón o
la soja.
10. Medio según una de las reivindicaciones 1 a
9, caracterizado por contener igualmente otros elementos
habituales de medios nutritivos para ácaros, destinados a aportar un
complemento nutritivo y/o a dar al medio una textura apropiada para
el desarrollo y la multiplicación de los ácaros.
11. Medio según la reivindicación 10,
caracterizado por contener además germen de trigo y/o
levadura, en particular levadura de pan, y/o cianocobalamina y/o
d-biotina.
12. Medio según una de las reivindicaciones 1 a
11, caracterizado por poder contener soja.
13. Medio según una de las reivindicaciones 1 a
12, caracterizado por contener al menos un 50% de los
aminoácidos siguientes:
- L-alanina
- L-arginina
- ácido L-aspártico
- L-cisteína/cistina
- ácido L-glutámico
- glicina
- L-histidina
- L-isoleucina
- L-leucina
- L-lisina
- L-metionina
- L-fenilalanina
- L-prolina
- L-serina
- L-treonina
- L-triptófano
- L-tirosina
- L-valina
14. Medio según la reivindicación 13,
caracterizado por contener los aminoácidos en las
proporciones siguientes, para un total de 93,711 g:
15. Procedimiento de cultivo y de producción de
ácaros y, en particular de ácaros pertenecientes a una al menos de
las especies siguientes: Dermatophagoides pteronyssinus,
Dermatophagoides farinae, Blomia kulagini o tropicalis,
Pyroglyphus africanus y Euroglyphus maynei,
caracterizado por cultivar los ácaros en un medio según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado por llevar el medio de cultivo, que contiene la
mezcla de aminoácidos, a un grado de humedad conveniente, habitual
para los ácaros que se cultiva, y mantenerlo a la temperatura
habitual conveniente.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 15 y 16, caracterizado por efectuar el
cultivo durante 2 a 5 meses.
\newpage
18. Procedimiento de obtención de una preparación
de alergenos, caracterizado por realizar una extracción de
los alergenos del cultivo según una de las reivindicaciones 15 a
17.
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