DE60131160T2

DE60131160T2 - Caspase-inhibitoren und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60131160T2
Application number: DE60131160T
Authority: DE
Inventors: Jean-Damien Vertex Pharmaceuticals I Charrier; Guy Vertex Pharmaceuticals Ltd. Oxon BRENCHLEY
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-06-07
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2021-06-06
Also published as: EP1289993B9; IL152845A0; WO2001094351A1; US20090023739A1; CA2409015A1; EP1289993B1; KR20030025235A; JP2003535865A; EP1289993A1; AU7527901A; US7829561B2; ATE377010T1; US7968716B2; US7407964B2; DE60131160D1; US20020045623A1; ES2295171T3; US20110003824A1; AU2001275279B2

Description

Kreuzverweis zu verwandten Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität zu der vorläufigen US Patentanmeldung 60/209,929, eingereicht am 7. Juni 2000, der Inhalt davon ist hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der medizinischen Chemie und sie betrifft neue Verbindungen und Arzneimittel davon, welche Caspasen hemmen, die die Zell-Apoptose und die Entzündung vermitteln. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und Arzneimittel zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Caspasewirkung in Verbindung stehen.
Fachlicher Hintergrund
Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein Hauptmechanismus, durch welchen Organismen unerwünschte Zellen entfernen. Die Deregulierung von Apoptose, entweder eine übermäßige Apoptose oder das Versagen, sie zu durchlaufen, steht mit einer Anzahl von Krankheiten, wie Krebs, eine akute Entzündung und Autoimmunerkrankungen, ischämische Krankheiten und bestimmte neurodegenerative Störungen, in Verbindung (vgl. im allgemeinen Science, 1998, 281, 1283–1312; Ellis et al., Am. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).
Caspasen sind eine Familie von Cysteinproteaseenzymen, welche die maßgebenden Vermittler bei den Signalwegen für Apoptose und Zellzerlegung sind (Thornberry, Chem. Biol., 1998, 5, R97–R103). Diese Signalwege verändern sich abhängig vom Zelltyp und dem Reiz, aber alle Apoptosewege scheinen an einem gemeinsamen Effektor-Signalweg, welcher zur Proteolyse von Schlüsselproteinen führt, zusammenzulaufen. Caspasen sind sowohl in der Effektor-Phase des Signalweges als auch stromaufwärts bei dessen Einleitung einbezogen. Die stromaufwärts gerichteten Caspasen, welche in der Einleitung von Ereignissen einbezogen sind, werden aktiviert und aktivieren dann wieder andere Caspasen, welche in den späteren Phasen von Apoptose einbezogen sind.
Die Caspase-1, die erste identifizierte Caspase, ist auch als Interleukin umwandelndes Enzym oder "ICE" bekannt. Caspase-1 wandelt den Vorläufer Interleukin-1β ("pIL-1β") zu der aktiven pro-Entzündungsform durch eine spezifische Spaltung von pIL-1β zwischen Asp-116 und Ala-117 um. Neben Caspase-1 gibt es auch elf andere bekannte menschliche Caspasen, wobei alle spezifisch an Aspartylresten gespalten werden. Es wurde auch festgestellt, dass sie zwingenden Anforderungen für mindestens vier Aminosäurereste an der N-terminalen Seite der Spaltstelle entsprechen.
Die Caspasen wurden in drei Gruppen, abhängig von der Aminosäuresequenz, die bevorzugt oder zuerst erkannt wurde, eingeteilt. Bei der Gruppe von Caspasen, welche die Caspasen 1, 4 und 5 einschließt, wurde gezeigt, dass sie hydrophobe aromatische Aminosäuren an der Stellung 4 an der N-terminalen Seite der Spaltstelle bevorzugen. Eine andere Gruppe, welche die Caspasen 2, 3 und 7 einschließt, besitzt Aspartylreste an den beiden Stellungen 1 und 4 an der N-terminalen Seite der Spaltstelle und vorzugsweise eine Sequenz von Asp-Glu-X-Asp. Eine dritte Gruppe, welche die Caspasen 6, 8, 9 und 10 einschließt, toleriert viele Aminosäuren in der ersten Erkennungssequenz, aber sie scheint Reste mit verzweigten aliphatischen Seitenketten, wie Valin und Leucin, an der 4-Stellung zu bevorzugen.
Die Caspasen wurden auch nach ihrer erkannten Funkton eingeteilt. Die erste Untergruppe besteht aus den Caspasen-1 (ICE), 4 und 5. Bei diesen Caspasen hat es sich erwiesen, dass sie bei der Prozessierung von pro-Entzündungscytokin eingeschlossen sind und deshalb eine wichtige Rolle bei der Entzündung spielen. Caspase-1, das am meisten untersuchte Enzym dieser Klasse, aktiviert den IL-1β-Vorläufer durch proteolytische Spaltung. Dieses Enzym spielt deshalb eine Schlüsselrolle bei dem Ansprechen einer Entzündung. Caspase-1 ist auch bei der Entwicklung des Interferon Gamma induzierenden Faktors (IGIF oder IL-18) einbezogen, welcher die Erzeugung von Interferon Gamma stimuliert, einer Schlüsselsubstanz für die Immunregulation, welche die Antigendarstellung, die T-Zellaktivierung und die Zelladhäsion moduliert.
Die übrigen Caspasen bilden die zweite und dritte Untergruppe. Diese Enzyme sind von zentraler Bedeutung bei den intrazellulären Signalwegen, welche zu Apoptose führen. Eine Untergruppe besteht aus den Enzymen, welche beim Einleiten von Ereignissen auf dem apoptischen Weg, einschließlich dem Umformen von Signalen aus der Plasmamembarn, einbezogen sind. Mitglieder dieser Untergruppe schließen die Caspasen-2, 8, 9 und 10 ein. Die andere Untergruppe, bestehend aus den Effektor-Caspasen 3, 6 und 7, sind in den letzten stromabwärts gerichteten Spaltungsereignissen einbezogen, welche die systematische Auflösung und den Tod der Zelle durch Apoptose ergeben. Caspasen, welche in die stromaufwärts gerichtete Signaltransduktion einbezogen sind, aktivieren die stromabwärts gerichteten Caspasen, welche dann den DNA-Reparaturmechanismus unbrauchbar machen, DNA zerstückeln, das Zellzytoskelett abbrechen und schließlich die Zelle zerstückeln.
Eine vierte Aminosäuresequenz, welche zuerst durch die Caspasen erkannt wurde, wurde für Enzymsubstrate ermittelt. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272, 9677–9682 (1997); Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272, 17907–17911 (1997). Die Kenntnis über die vier Aminosäuresequenzen, welche zuerst durch die Caspasen erkannt wurden, wurde zur Gestaltung von Caspase-Inhibitoren verwendet. Reversible Tetrapeptid-Inhibitoren wurden mit der Struktur CH₃CO-[P4]-[P3]-[P2]-CH(R)CH₂CO₂H hergestellt, wobei P2 bis P4 eine optimale Aminosäureerkennungssequenz darstellt und R ein Aldehyd, Nitril oder Keton, geeignet zur Bindung an das Caspasecysteinsulfhydryl, ist. Rano und Thornberry, Chem. Biol. 4, 149–155 (1997); Mjalli et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689–2692 (1993); Nicholson et al., Nature 376, 37–43 (1995). Irreversible Inhibitoren, basierend auf der analogen Tetrapeptiderkennungssequenz, wurden hergestellt, wobei R ein Acyloxymethylketon -COCH₂OCOR' ist. R' ist durch eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe, wie 2,6-Dichlorbenzoyloxy, als Beispiel erläutert, und wobei R für COCH₂X steht, wobei X eine Abgangsgruppe, wie F oder Cl, ist. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J. Med. Chem. 37, 563–564 (1994).
Der Nutzen von Caspase-Inhibitoren, eine Reihe von Erkrankungen bei Säugern zu behandeln, welche mit einer Erhöhung der zellulären Apoptose in Zusammenhang stehen, wurde unter Verwendung von peptidischen Caspase-Inhibitoren gezeigt. In Nagetiermodellen wurde, zum Beispiel, gezeigt, dass Caspase-Inhibitoren die Schwere eines Infarkts vermindern und die kardiomyocyte Apoptose nach einem Myokardinfarkt inhibieren, das Läsionsvolumen und das neurologische Defizit, welches durch den Schlaganfall entsteht, vermindern, die posttraumatische Apoptose und das neurologische Defizit bei einer traumatischen Hirnschädigung vermindern, und dass sie bei der Behandlung einer plötzlich ausbrechenden Leberzerstörung wirksam sind und das Überleben nach einem endotoxischen Schock verbessern. Yaoita et al., Circulation, 97, 276 (1998): Endres et al., J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238 (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al., J. Neuroscience, 17, 7415 (1997); Rodriguez et al., J. Exp. Med., 184, 2067 (1996); Grobmyer et al., Mol. Med., 5, 585 (1999).
Im Allgemeinen sind die vorstehend beschriebenen peptidischen Inhibitoren sehr stark wirkend gegen einige Caspaseenzyme. Jedoch diese Wirksamkeit zeigte sich nicht immer in zellulären Modellen von Apoptose. Außerdem sind Peptidinhibitoren typischerweise durch unerwünschte pharmakologische Eigenschaften, wie schlechte orale Absorption, schlechte Stabilität und einen schnellen Metabolismus, gekennzeichnet. Plattner und Norbeck, in Drug Discovery Technologies, Clark und Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, England, 1990).
Über das Erkennen der Notwendigkeit zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften der peptidischen Caspase-Inhibitoren, peptidomimetischen und nicht natürlichen Aminosäurepeptid-Inhibitoren wurde berichtet.
EP 618223 offenbart Peptide, welche die Interleukin-1-beta-Freisetzung hemmen, der Formel:
wobei R ein Wasserstoffatom, eine Amino- oder Hydroxyschutzgruppe oder gegebenenfalls eine im Ring substituierte Benzyloxygruppe bedeutet, A₃ -CH₂-X₁-CO-Y₁; -CH₂-O-Y₂; oder -CH₂-S-Y₃ ist; wobei X₁ für O oder S steht und Y₁Y₂ und Y₃ wie in der Beschreibung definiert sind.
WO 97/22619 offenbart ICE-Inhibitoren, welche eine piperazinische Säureeinheit enthalten:
wobei R₁ CO₂H oder einen bioisosteren Ersatz von CO₂H bedeutet; R₂ ein Wasserstoffatom, Alkyl, Aryl, Heteroaryl oder CH₂Y bedeutet; R₃ ein Wasserstoffatom, R, COOR, CON(R)₂, SO₂R, SO₂NHR, COCH₂OR; COCOR, COCOOR oder COCON(R)₂ bedeutet; Y OR, SR oder -OC=O(R) ist; und R ein Wassrestoffatom, ein aromatischer oder Alkylrest ist.
WO 9816502 offenbart ICE-Inhibitoren, welche eine Prolineinheit enthalten:
wobei R₁ Alkyl oder N(R₃)₂ bedeutet; R₂ ein Wasserstoffatom oder OCH₂ Aryl ist; und R₃ aus veschiedenen Resten ausgewählt ist.
Dolle et al. (J. Med. Chem. 37, 563 (1994)) beschreiben ICE-Inhibitoren, welche eine Pipecolinsäureeinheit enthalten:
WO 95/3538 betrifft Verbindungen, welche Inhibitoren des IL-1β-Umwandlungsenzyms (ICE) sind, Zusammensetzungen, welche sie umfassen, und die Verwendung davon gegen IL-1 vermittelte Erkrankungen.
WO 98/11109 ist auf tricyclische ICE/ced-3 Gruppe-Inhibitor-Verbindungen, Zusammensetzungen, welche sie umfassen, und ihre Verwendung zur Behandlung von Entzündungs-, Autoimmun- und neurodegenerativen Krankheiten und zur Vorbeugung von ischämischen Schädigungen gerichtet.
WO 95/33751 offenbart kondensierte bicyclische Lactame als ICE-Enzym-Inhibitoren, Zusammensetzungen, welche sie enthalten, und ihre Verwendung zur Behandlung von Entzündungs- und auf dem Immunsystem basierenden Erkrankungen.
Obwohl eine Anzahl von Caspase-Inhibitoren beschrieben wurde, ist es nicht klar, ob sie die geeigneten pharmakologischen Eigenschaften besitzen, um therapeutisch nützlich zu sein. Deshalb besteht ein weiterer Bedarf für Caspase-Inhibitoren mit kleinem Molekül, die wirksam und stabil sind und die Membran penetrieren, um eine wirksame Hemmung von Apoptose in vivo bereitzustellen. Solche Verbindungen würden sehr nützlich zur Behandlung der vorstehend erwähnten Krankheiten sein, wobei Caspaseenzyme eine Rolle spielen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass erfindungsgemäße Verbindungen und Arzneimittel davon wirksam als Inhibitoren von Caspasen und zelluläre Apoptose sind. Diese Verbindungen haben die allgemeine Formel I:
wobei:
R¹ -CH₂Y ist, wobei Y für F steht;
R² CO₂H, CH₂CO₂H oder ein Ester oder Amid davon ist;
X₂-X₁ N=C, CH=C oder C(=O)-N ist;
Ring C ein kondensierter unsubstituierter Benzolring ist;
n für 0 oder 1 steht; und
jeder Methylenkohlenstoff im Ring A gegebenenfalls und unabhängig mit =O oder mit einem oder zwei von Halogen, C_1-4-Alkyl oder C_1-4-Alkoxy substituiert ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen wirksame Hemmungseigenschaften über einen Bereich von Caspasezielen mit guter Wirkung bei zellulären Modellen von Apoptose auf und sie sind nützlich zur Behandlung von Caspase vermittelten, nachstehend beschriebenen, Krankheiten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verbindungen und pharmazeutisch verträgliche Derivate davon bereit, die als Caspase-Inhibitoren nützlich sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Hemmung der Caspasewirkung und zur Behandlung von durch Caspase vermittelten Krankheitszuständen in Säugern bereit. Diese Verbindungen haben die allgemeine Formel I:
wobei:
R¹ -CH₂Y ist,
Y für F steht;
R² CO₂H oder ein Ester oder Amid davon ist;
X₂-X₁ N=C, CH=C oder C(=O)-N ist;
Ring C ein kondensierter unsubstituierter Benzolring ist;
n 0 oder 1 ist; und
jeder Methylenkohlenstoff im Ring A gegebenenfalls und unabhängig mit =O oder mit einem oder mehreren von Halogen, C_1-4-Alkyl oder C_1-4-Alkoxy substituiert ist.
Wenn der R²-Rest in Form eines Esters oder Amids vorliegt, erfahren die vorliegenden Verbindungen eine metabolische Spaltung zu den entsprechenden Carbonsäuren, welche die wirksamen Caspase-Inhibitoren sind. Da sie eine metabolische Spaltung erfahren, ist die genaue Art des Esters- oder Amidrestes nicht entscheidend für die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung. Die Ester in der Struktur des R²-Restes sind aus Ester von R² Carbonsäuren ausgewählt, welche aus C_1-12-aliphatischen Resten ausgewählt sind, welche aus C_1-6-Alkyl oder C_3-10-Cycloalkyl, Aryl ausgewählt sind, welche aus Phenyl, Aralkyl ausgewählt sind, welche aus Benzyl oder Phenethyl, Heterocyclyl oder Heterocyclylalkyl ausgewählt sind, wobei R²-Heterocyclylringe ausgewählt sind aus 5- bis 6-gliedrigen heterocyclischen Ringen mit ein oder zwei Heteroatomen, ausgewählt aus Piperidinyl, Piperazinyl oder Morpholinyl.
Amide von R² Carbonsäuren können primäre, sekundäre oder tertiäre Amide sein. Geeignete Substituenten an dem Amidstickstoff sind ein oder mehrere Reste, die unabhängig ausgewählt sind aus den aliphatischen, Aryl-, Aralkyl-, Heterocyclyl- oder Heterocyclylalkylresten, welche vorstehend für den R² Esteralkohol beschrieben sind.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wobei R² CO₂H beziehungsweise γ-Ketosäuren oder δ-Ketosäuren bedeutet, können in Lösung als entweder die offene Form 1 oder die cyclisierte Hemiketalform 2 (y = 1 für γ-Ketosäuren, y = 2 für δ-Ketosäuren) vorliegen. Die Darstellung einer isomeren Form hier bedeutet den Einschluss der anderen Form.
Für Fachleute im Fachgebiet wird es ebenfalls ersichtlich sein, dass bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung in tautomeren Formen oder in Hydratformen vorliegen können, alle diese Formen der Verbindungen liegen im Schutzbereich der Erfindung. Wenn es nicht anders angegeben ist, sind die hier beschriebenen Strukturen auch so zu verstehen, dass alle stereochemischen Formen der Struktur, d. h. die R- und S-Konfigurationen für jedes asymmetrische Zentrum, eingeschlossen sind. Deshalb sind einzelne stereochemische Isomere als auch enantiomere und diastereomere Gemische der vorliegenden Verbindungen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung. Wenn es nicht anders angegeben ist, sind die hier beschriebenen Strukturen auch so zu verstehen, dass Verbindungen, die sich nur in dem Vorliegen von einem oder mehreren isotopisch angereicherten Atomen unterscheiden, eingeschlossen sind. Zum Beispiel, Verbindungen mit den vorliegenden Strukturen, abgesehen von dem Ersatz eines Wasserstoffatoms durch ein Deuterium oder Tritium oder dem Ersatz eines Kohlenstoffs durch einen mit ¹³C- oder ¹⁴C-angereicherten Kohlenstoff liegen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen Inhibitoreigenschaften über den Bereich von Caspasezielen mit guter Wirksamkeit in zellulären Modellen von Apoptose auf. Außerdem wird erwartet, dass diese Verbindungen gute Zellpenetrationseigenschaften und pharmakokinetische Eigenschaften haben und deshalb durch ihre Wirksamkeit eine gute Wirkung gegen Krankheiten haben, wobei Caspasen einbezogen sind.
Ring C ist ein kondensierter unsubstituierter Benzolring.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind Verbindungen der Formel I, welche die nachstehenden Merkmale haben:

(a) R¹ ist -CH₂Y, wobei Y für F steht;
b) R² ist CO₂H oder ein Ester davon;
c) X₂-X₁ ist N=C, CH=C oder C(=O)-N;
d) Ring C ist ein Benzolring;
e) n ist 0 oder 1.

Typische tricyclische Ringsysteme der Formel I schließen die in Tabelle 1 dargestellten Ringsysteme ein. Die folgende Tabelle 2 zeigt bestimmte typische Beispiele von Verbindungen der Formel I. Tabelle 1. Beispiele für tricyclische Systeme der Formel I. wobei der Ring C ein benzokondensierter Ring ist.

Tabelle 2. Beispiele für Verbindungen der Formel I

Beispiel	R¹	R²	Ring C	n	X₁	X₂
1	CH₂F	CO₂H	Benzo	0	C	N
2	CH₂F	CO₂H	Benzo	1	C	N
3	CH₂F	CO₂H	Benzo	0	C	C-H
4	CH₂F	CO₂H	Benzo	1	C	C-H
5	CH₂F	CO₂H	Benzo	1	N	C=O
6*	CH₂F	CO₂H	Pyrazino	1	N	C=O

* Referenzbeispiel

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können im allgemeinen nach Verfahren, welche Fachleuten im Fachgebiet für analoge Verbindungen bekannt sind, hergestellt werden, wie es durch das allgemeine nachstehende Schema I und durch die nachfolgenden Herstellungsbeispiele veranschaulicht wird. Schema I

Reagenzien: (a) TFA oder KOH/MeOH; (b) EDC/DMAP/HOBt; (c) Dess-Martin Periodinan; (d) TFA/DCM

Das tricyclische Ringsystem 1 wird im allgemeinen als ein Ester hergestellt (vgl. die Schemata 2-4). Der Ester 1 (R ist jeder geeignete organische Rest) wird zuerst unter Verwendung einer Base oder, wenn der Ester eine t-Butylgruppe ist, unter Verwendung von Trifluoressigsäure hydrolysiert. Die Säure 2 wird dann mit dem Aminoalkohol 3 gekuppelt. Abhängig von der Art von R¹ und R² kann ein Aminoketon anstelle des Aminoalkohols verwendet werden, wobei der nachfolgende Oxidationsschritt vermieden wird. Im Falle von Fluormethylketonen, wobei R¹ CH₂F ist, kann der Aminoalkohol 3 gemäß dem Verfahren von Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693 erhalten werden. Schließlich wird die Hydroxylgruppe in Verbindung 4 oxidiert und die Verbindung in geeigneter Weise gemäß der Art von R² behandelt. Wenn, zum Beispiel, das Produkt I R² benötigt, um eine Carbonsäure zu sein, dann ist R² in 3 vorzugsweise ein Ester und der letzte Schritt in dem Schema ist eine Hydrolyse (in einer anderen Ausführungsform, wenn der Ester ein tert-Butylester ist, ist der letzte Schritt eine Behandlung mit Trifluoressigsäure).
Die tricyclischen Ester 1 als Ausgangsverbindungen können, wie in den Schemata II, III und IV für 1a beziehungsweise 1b und 1c dargestellt, wie nachstehend gezeigt, hergestellt werden. Schema II

Einzelheiten: (a) NaNO₂/HCl, NaN₃/AcONa; (b) SOCl₂, Lithiumanion von Lactam 7; (c) PPh₃/Xylol.

Die tricyclischen Ester 1a, wobei X₂-X₁ N=C bedeutet, können, wie in Schema II dargestellt, hergestellt werden. Die Aminosäure 5 als Ausgangsverbindung wird zuerst in das Diazoniumsalz umgewandelt und dann mit Natriumazid in wässrigem Natriumacetat behandelt, wobei die Azdosäure 6 erhalten wird. Die Azdosäure 6 wird dann mit dem Lactam 7 durch Kondensation des Säurechlorids von 6 (in situ durch Umsetzung von 6 mit Thionylchlorid hergestellt) mit dem Lithiumsalz des Lactams 7 (hergestellt durch Umsetzung von LDA mit 7) gekuppelt, wobei 8 erhalten wird. Die intramolekulare aza-Wittig-Reaktion von 8 unter Verwendung von Triphenylphosphin und Xylol unter Rückfluss liefert die tricyclischen Ester 1a.
Die tricyclischen Ester 1b, wobei X₁ und X₂ beide Kohlenstoff bedeuten, können, wie in Schema III dargestellt, hergestellt werden. Schema III

Einzelheiten: (a) NBS, Chloroform; (b) SOCl₂, Lithiumanion von Lactam 7; (c) P(OEt)₃; (d) LHMDS, THF.

Zuerst wird die ortho-substituierte aromatische Säure 9 als Ausgangsmaterial bromiert (NBS in Chloroform), wobei das Bromid 10 bereitgestellt wird. Das Säurechlorid von 10 (hergestellt durch Umsetzung von 10 mit Thionylchlorid) wird dann mit dem Lithiumsalz des Lactams 7 (hergestellt durch Umsetzung von LDA mit dem Lactam 7) umgesetzt, wobei 11 erhalten wird. Die Umsetzung von 11 mit Triethylphosphit stellt 12 bereit, welches eine intramolekulare Wittig-Homer-Reaktion in Gegenwart einer Base in THF eingeht, wobei die tricyclischen Ester 1b erhalten werden. Schema IV

Reagenzien: (a) Diisopropylethylamin, Toluol.

Die tricyclischen Ester 1c, wobei X₂-X₁ C(=O)-N bedeutet, können durch Umsetzung von heterocyclischen Ester des Typs 13 mit aromatischen Anhydriden 14, wie vorstehend in Schema IV dargestellt, hergestellt werden.
Die heterocyclischen Ester 7 und 13 als Ausgangsstoffe, welche in den Schemata II, III und IV verwendet werden, oder die Säuren oder Derivate davon sind entweder im Handel erhältlich oder können unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden. Die heterocyclische Säure 7 als Ausgangsstoff, wobei n für 0 steht, ist im Handel erhältlich (Pyroglutaminsäure). Außerdem kann Pyroglutaminsäure in der Stellung 4 unter Verwendung von elektrophilen Substanzen nach Standardverfahren substituiert werden (J. Ezquerra et al., Tetrahedron, 1993, 49, 8665–8678; J.D. Charrier et al, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 2199–2202). Der heterocyclische Ester 7 als Ausgangsstoff, wobei n für 1 steht, kann nach den im nachstehenden experimentellen Teil beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die heterocyclische Säure 7 als Ausgangsstoff, wobei n für 2 steht, kann nach Standardverfahren hergestellt werden (Perrotti et al., Ann. Chim. (Rom), 1966, 56, 1368). Die heterocyclischen Ester 13 als Ausgangsstoffe, wobei n für 0 steht, können nach Literaturverfahren hergestellt werden (M.R. Mish et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 35, 8379–8380); und die heterocyclischen Ester 13 als Ausgangsstoffe, wobei n für 1 steht, können auch nach Literaturverfahren hergestellt werden (Y. Nakamura et al., Chem. Lett., 1991, 11, 1953–1956).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind so gestaltet, dass sie Caspasen hemmen. Deshalb können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf ihre Fähigkeit die Apoptose zu hemmen und auf die Freisetzung von IL-1β oder auf die Caspaseaktivität direkt geprüft werden. Tests für jede dieser Aktivitäten sind im Fachgebiet bekannt und sie sind nachstehend im Versuchsteil ausführlich beschrieben.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Wenn pharmazeutisch verträgliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen in diesen Zusammensetzungen verwendet werden, stammen diese Salze vorzugsweise von anorganischen oder organischen Säuren und Basen. Als Salze von Säuren sind die Folgenden eingeschlossen: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Eisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat. Salze von Basen schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit organischen Basen, wie Dicyclohexylaminsalze, N-Methyl-D-glucamin und Salze mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin und so weiter, ein.
Ebenso können die basischen Stickstoff enthaltenden Reste mit solchen Substanzen quaternisiert werden, wie niederen Alkylhalogeniden, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchlorid, Bromiden und Iodiden; Dialkylsulfaten, wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden, wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, Bromiden und Iodiden, Aralkylhalogeniden, wie Benzyl- und Phenethylbromiden, und anderen. Dabei werden in Wasser oder in Öl lösliche oder dispergierbare Produkte erhalten.
Ein "pharmazeutisch verträgliches Derivat" bedeutet jedes pharmazeutisch verträgliche Salz, jeden Ester, jedes Salz eines Ester oder ein anderes Derivat einer erfindungsgemäßen Verbindung, welches bei der Verabreichung an einen Empfänger in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt eine erfindungsgemäße Verbindung oder einen aktiven hemmenden Metaboliten oder einen Rest davon bereitzustellen. Besonders bevorzugte Derivate oder Pro-Arzneimittel sind die Substanzen, welche die biologische Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen erhöhen, wenn diese Verbindungen einem Patienten verabreicht werden (z. B. durch das Ermöglichen einer oral verabreichten Verbindung leichter in das Blut absorbiert zu werden) oder welche die Abgabe der Stammverbindung an ein biologisches Feld (z. B. das Gehirn oder das lymphatische System) bezogen auf die Art der Stammverbindung erhöht.
Pharmazeutisch verträgliche Träger, welche in diesen Zusammensetzungen verwendet werden können, schließen Ionenaustauscher, Tonerde, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische aus gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidale Kieselsäure, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, auf Cellulose basierende Substanzen, Polyethylenglykol, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Wollfett ein, sie sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur pharmazeutischen Verabreichung an einen Säuger, vorzugsweise an Menschen, formuliert.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral, parenteral, durch Inhalationsspray, topisch, rektal, nasal, bukal, vaginal oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Der Ausdruck "parenteral", wie er hier verwendet wird, schließt subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraarticuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale und intracraniale Injektions- oder Infusionsverfahren ein. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen oral oder intravenös verabreicht.
Sterile injizierbare Formen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können wässrige oder ölhaltige Suspensionen sein. Diese Suspensionen können gemäß Verfahren, welche im Fachgebiet bekannt sind, unter Verwendung von geeigneten Dispersions- oder Netzmitteln und Suspensionsmitteln formuliert werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel, eine Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Unter den verträglichen Trägern und Lösungsmitteln, welche angewendet werden können, sind Wasser, die Ringer Lösung und eine isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden sterile, beständige Öle üblicherweise als Lösungsmittel oder als Suspensionsmedium angewendet. Für diesen Zweck kann jedes milde, beständige Öl, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride, verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und die Glyceridderivate davon, sind bei der Herstellung von injizierbaren Mitteln nützlich, wie es auch natürliche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere die polyoxyethylierten Substanzen davon, sind. Diese Öllösungen oder Suspensionen können auch einen langkettigen Alkohol als Verdünnungsmittel oder ein Dispersionsmittel, wie Carboxymethylcellulose oder ähnliche Dispersionsmittel, welche üblicherweise in der Formulierung von pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen verwendet werden, einschließlich Emulsionen und Suspensionen, enthalten. Andere üblicherweise verwendete oberflächenaktive Mittel, wie Tweens, Spans, und andere Emulsionsmittel oder die biologische Verfügbarkeit verstärkende Mittel, welche üblicherweise bei der Herstellung von pharmazeutisch verträglichen festen, flüssigen oder anderen Dosierungsformen verwendet werden, können auch für die Zwecke der Formulierung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in jeder oral verträglichen Dosierungsform, einschließlich, aber nicht darauf eingeschränkt, Kapseln, Tabletten, wässrigen Suspensionen oder Lösungen, oral verabreicht werden. Bei Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, welche üblicherweise verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden typischerweise auch zugegeben. Zur oralen Verabreichung in Form einer Kapsel schließen nützliche Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen zur oralen Verwendung erforderlich sind, wird der Wirkstoff mit Emulsions- und Suspensionsmitteln kombiniert. Falls erwünscht, können auch bestimmte Süßstoffe, Geschmacksstoffe oder Färbemittel zugegeben werden.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Arzneimittel in Form von Suppositorien zur rektalen Verabreichung verabreicht werden. Diese können durch Mischen des Mittels mit einem geeigneten nicht reizenden Exzipienten hergestellt werden, welcher bei Raumtemperatur fest ist, aber bei rektaler Temperatur flüssig wird und deshalb im Rektum schmilzt, wobei das Arzneimittel freigesetzt wird. Diese Materialien schließen Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglykole ein.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch topisch verabreicht werden, insbesondere wenn das Ziel der Behandlung Bereiche oder Organe einschließt, welche leicht durch topische Anwendung zugänglich sind, wobei Erkrankungen des Auges, der Haut oder des tieferen Darmtrakts eingeschlossen sind. Geeignete topische Formulierungen werden leicht für jeden dieser Bereiche oder Organe hergestellt.
Die topische Anwendung für den unteren Darmtrakt kann mit einer rektalen Suppositorienformulierung (vgl. vorstehend) oder mit einer geeigneten Klistierformulierung ausgeführt werden. Topische-transdermale Pflaster können auch verwendet werden.
Für topische Anwendungen können die Arzneimittel zu einer geeigneten Salbe, enthaltend den Wirkstoff, suspendiert oder gelöst in einem oder mehreren Trägern, formuliert werden. Träger zur topischen Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen, sind aber nicht darauf eingeschränkt, Mineralöl, flüssige Vaseline, weiße Vaseline, Propylenglykol, Polyoxyethylen, Polyoxypropylen, emulgierendes Wachs und Wasser ein. In einer anderen Ausführungsform können die Arzneimittel zu einer geeigneten Lotion oder einer Creme formuliert werden, welche die Wirkstoffe suspendiert oder gelöst in einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern enthält. Geeignete Träger schließen Mineralöl, Sorbitanmonostearat, Polysorbat 60, Wachs aus Cetylestern, Cetylarylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol und Wasser ein, sie sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Zur Verwendung bei Augenkrankheiten können die Arzneimittel als mikronisierte Suspensionen in isotonischer, pH-eingestellter steriler Salzlösung oder vorzugsweise als Lösungen in isotonischer, pH-eingestellter steriler Salzlösung entweder mit oder ohne Konservierungsmittel, wie Benzylalkoniumchlorid, formuliert werden. In einer anderen Ausführungsform zur Verwendung bei Augenkrankheiten können die Arzneimittel zu einer Salbe, wie Vaseline, formuliert werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch durch ein Nasenaerosol oder durch Inhalation verabreicht werden. Diese Zusammensetzungen werden gemäß im Fachgebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannten Verfahren hergestellt und sie können als Lösungen in Salzlösung unter Verwendung von Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsförderern zur Erhöhung der biologischen Verfügbarkeit, Fluorkohlenstoffen und/oder üblichen Lösungsvermittlern und Dispersionsmitteln hergestellt werden.
Die vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen sind besonders nützlich für therapeutische Anwendungen in Bezug auf eine IL-1 vermittelte Erkrankung, eine Apoptose vermittelte Erkrankung, eine Entzündungserkrankung, eine Autoimmunerkrankung, eine destruktive Knochenerkrankung, eine proliferative Störung, eine infektiöse Erkrankung, eine degenerative Erkrankung, eine mit dem Zelltod verbundene Erkrankung, eine Erkrankung, die mit einer übermäßigen Alkoholaufnahme über die Nahrung einhergeht und eine Virus-vermittelte Erkrankung. Solche Krankheiten schließen Uveitis, entzündliche Peritonitis, Osteoarthritis, Pancreatitis, Asthma, Schocklunge, Glomerulonephritis, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Skleroderm, chronische Thyroiditis, Morbus Basedow, autoimmune Gastritis, Diabetes, autoimmune hämolytische Anämie, autoimmune Neutropenie, Thrombocytopenie, chronische aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn, Psoriasis, atopische Dermatitis, Narbenbildung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Organtransplantatabstoßung, Osteoporose, Leukämie und damit verbundene Störungen, myelodysplastisches Syndrom, mit multiplem Myelom verbundene Knochenerkrankung, akute myelogene Leukämie, chronische myelogene Leukämie, metastatisches Melanom, Kaposi-Sarkom, multiples Myelom, haemorrhagischen Schock, Sepsis, septischen Schock, Verbrennungen, Shigellose, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, Kennedy-Syndrom, Prion-Krankheit, cerebrale Ischämie, Epilepsie, myokaridale Ischämie, akutes und chronisches Herzleiden, myokardialen Infarkt, dekompensierte Herzinsuffizienz, Atherosklerose, Bypass-Transplantation der Herzkranzgefäße, spinale Muskelatrophie, amyotrophe Lateralsklerose, Multiple Sklerose, mit HIV verbundene Encephalitis, Alterung, Alopecia, neurologische Schädigung aufgrund eines Schlaganfalls, Colitis ulcerosa, traumatische Gehirnverletzung, Rückenmarksverletzung, Hepatitis B, Hepatitis-C, Hepatitis-G, Gelbfieber, Dengue-Fieber oder Japanische Encephalitis, verschiedene Formen von Lebererkrankung, Nierenerkrankung, polyaptische Nierenerkrankung, mit H. pylori verbundene Magen- und Zwölffingerdarmgeschwürerkrankung, HIV-Infektion, Tuberkulose, Meningitis ein. Die Verbindungen und Zusammensetzungen sind auch für die Behandlung von Komplikationen, die mit der Bypass-Transplantation der Herzkranzgefäße in Zusammenhang stehen und als eine Komponente zur Immuntherapie für die Behandlung verschiedener Formen von Krebs nützlich.
Die Menge der in den vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen vorliegenden Verbindungen sollte genügen, eine feststellbare Abnahme bei der Schwere der Erkrankung oder bei der Caspase-Aktivität und/oder Zellapoptose zu bewirken, wie sie durch die in den Beispielen beschriebenen Prüfungen bestimmt wurde.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch bei Verfahren zum Konservieren von Zellen nützlich, welche für eine Organtransplantation oder zum Konservieren von Blutprodukten benötigt werden können. Ähnliche Verwendungen für Caspase-Inhibitoren wurden beschrieben (Schierle et al., Nature Medicine, 1999, 5, 97). Das Verfahren schließt die Behandlung der Zellen oder von Gewebe zum Konservieren mit einer Lösung, umfassend den Caspase-Inhibitor, ein. Die Menge von benötigtem Caspase-Inhibitor hängt von der Wirksamkeit des Inhibitors für den gegebenen Zelltyp und von der Länge der Zeit ab, welche erforderlich ist, die Zellen vor dem apoptotischen Zelltod zu konservieren.
Gemäß einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen außerdem ein anderes therapeutisches Mittel umfassen. Solche Mittel schließen thrombolytische Mittel, wie einem Gewebeplasminogen-Aktivator und Streptokinase, ein, sie sind aber nicht darauf eingeschränkt. Wenn ein zweites Mittel verwendet wird, kann das zweite Mittel entweder als eine getrennte Dosierungsform oder als ein Teil einer einzigen Dosierungsform mit den erfindungsgemäßen Verbindungen oder Zusammensetzungen verabreicht werden.
Es sollte auch selbstverständlich sein, dass eine bestimmte Dosierungs- und Behandlungsweise für jeden einzelnen Patienten von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Aktivität der bestimmten angewendeten Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, der Zeit der Verabreichung, der Geschwindigkeit der Ausscheidung, der Arzneimittelkombination und der Beurteilung des behandelnden Arztes und der Schwere der behandelten besonderen Erkrankung abhängt. Die Menge der Wirkstoffe hängt auch von der einzelnen Verbindung und von dem anderen therapeutischen Mittel, falls es in der Zusammensetzung vorliegt, ab.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer vorstehend beschriebenen pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers bereit, welcher an einer der vorstehend erwähnten Krankheiten leidet. Bei dieser Ausführungsform, wenn dem Patienten auch ein anderes therapeutisches Mittel oder ein Caspase-Inhibitor verabreicht wird, kann es zusammen mit der erfindungsgemäßen Erfindung in einer einzigen Dosierungsform oder als eine getrennte Dosierungsform gegeben werden. Wenn es als eine getrennte Dosierungsform verabreicht wird, kann der andere Caspase-Inhibitor oder das andere Mittel vor, zur gleichen Zeit oder nach der Verabreichung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, verabreicht werden.
Zum genaueren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die nachstehenden präparativen Beispiele und Versuchsbeispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sie sollen in keiner Weise als Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung aufgefasst werden.
Experimenteller Teil
Bei den nachstehenden Beispielen sind ¹⁹F NMR ¹H entkuppelt und alle Peaks sind Singletts, wenn es nicht anders angegeben ist.
Beispiel 1
[3S/R(1S)]-3-(2,3-Dihydro-1H-9-oxo-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carboxamido)-5-fluor-4-oxo- pentansäure
Verfahren A:
(S)-1-(2-Azidobenzoyl)-5-oxo-pyrrolidin-2-carbonsäure-tert-butylester
Eine gerührte Lösung von (2S)-5-Oxo-prolin-tert-butylester (T. Kolasa und M.J. Miller, J. Org. Chem., 1990, 55, 1711–1721) (1,13 g, 6,13 mMol) in wasserfreiem THF (15 ml) wurde bei –78°C mit LDA (9,19 mMol) behandelt und die Umsetzung wurde 15 Minuten gerührt. Eine Lösung von 2-Azidobenzoylchlorid (T. Okawa, T. Sugimori, S. Eguchi und A. Kakehi, Heterocycles, 1998, 47, 1, 375–382) (6,13 mMol) in wasserfreiem THF (5 ml) wurde dann tropfenweise zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei –78°C gerührt bevor es mit einer gesättigten wässrigen NH₄Cl-Lösung gelöscht wurde. Die Umsetzung wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur stehen gelassen und die organische Schicht mit einer gesättigten wässrigen NH₄Cl-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft, wobei ein Öl erhalten wurde, welches durch Flash-Chromatographie (20% Ethylacetat in Hexan) gereinigt wurde, wobei die Titelverbindung als blassgelbes Öl (1,67 g, 82%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,53 (9H, s), 2,14 (1H, m), 2,43 (1H, m), 2,55 (1H, m), 2,69 (1H, m), 4,79 (1H, dd, J 9,2, 3,2 Hz), 7,19–7,22 (2H, m), 7,36 (1H, m), 7,49 (1H, m), ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 22,1 (CH₂), 28,3 (CH₃), 31,9 (CH₂), 59,3 (CH), 83,0 (C), 118,7 (CH), 125,0 (CH), 127,9 (C), 129,1 (CH), 131,9 (CH), 137,9 (C), 167,5 (C), 170,2 (C), 173,6 (C).
Verfahren B:
(S)-2,3-Dihydro-1H-9-oxo-pyrrolo[2.1-b]chinazolin-1-carbonsäure-tert-butylester
Triphenylphosphin (1,19 g, 4,54 mMol) wurde bei Raumtemperatur portionsweise zu einer Lösung von (3S/R)-5-Fluor-4-oxo-3-[((S)-9-oxo-1,2,3,9-tetrahydro-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carbonyl)-amino]-pentansäure (1,36 g, 4,12 mMol) in Xylol (60 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt bis die Entwicklung von Stickstoff beendet war (etwa 1 Stunde) und dann 20 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Die flüchtigen Stoffe wurden verdampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie (50% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, wobei die Titelverbindung als farbloses Öl (1,05 g, 89%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,44 (9H, s), 2,26 (1H, m), 2,51 (1H, m), 3,06 (1H, m), 3,20 (1H, m), 4,99 (1H, dd, J 9,5, 2,8 Hz), 7,39 (1H, m), 7,59 (1H, m), 7,68 (1H, m), 8,21 (1H, m). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 24,6 (CH₂), 28,3 (CH₃), 31,5 (CH₂), 60,4 (CH), 83,3 (C), 120,9 (C), 126,7 (CH), 126,9 (CH), 127,2 (CH), 134,7 (CH), 149,5 (C), 159,4 (C), 160,8 (C), 169,3 (C).
Verfahren C:
(S)-2,3-Dihydro-1H-9-oxo-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carbonsäure
Eine Lösung von (1S)-9-Oxo-1,2,3,9-tetrahydro-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carbonsäure-tert-butylester (1,01 g, 3,53 mMol) in TFA (20 ml) wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand in trockenem DCM gelöst. Das Verfahren wurde mehrere Male wiederholt, wobei ein Überschuss von TFA entfernt wurde. Das Gummi wurde mit Diethylether zermahlen, filtriert und mehrere Male mit Diethylether gewaschen, wobei die Titelverbindung als weißes Pulver (620 mg, 76%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 2,40 (1H, m), 2,71 (1H, m), 3,19 (1H, m), 3,27 (1H, m), 4,91 (austauschbarer H), 5,19 (1H, dd, J 9,8, 2,8 Hz), 7,53 (1H, m), 7,69 (1H, m), 7,85 (1H, m), 8,23 (1H, m).
Verfahren D:
[3S/R,4S/R,(1S]-3-(2,3-Dihydro-1H-9-oxo-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carboxamido)-5-fluor- 4-hydroxy-pentansäure-tert-butylester
Ein Gemisch von (S)-9-Oxo-1,2,3,9-tetrahydro-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carbonsäure (0,10 g, 0,434 mMol), 3-Amino-5-fluor-4-hydroxy-pentansäure-tert-butylester (0,099 g, 0,48 mMol), HOBt (0,065 g, 0,48 mMol) und DMAP (0,058 g, 0,48 mMol) in wasserfreiem THF (7 ml) wurde bei 0°C mit EDC (0,092 g, 0,48 mMol) unter Rühren behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur über 18 Stunden stehen gelassen und dann unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein Gummi erhalten wurde. Das Gummi wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc) gereinigt, wobei die Titelverbindung als weißes Pulver (155 mg, 85%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1,41 (9H, m), 1,99–3,07 (6H, m), 3,53–4,55 (4H, m), 4,91–5,12 (1H, m), 5,37–5,62 (1H, m), 7,42 (1H, m), 7,63 (1H, m), 7,80 (1H, m), 8,08 (1H, m), 8,29–8,57 (1H, m); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ –226,5, –226,5, –226,7, –226,7, –227,9, –228,0, –229,0, –229,0.
Verfahren E:
[3S/R,(1S)]-3-(2,3-Dihydro-1H-9-oxo-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carboxamido)-5-fluor-4-oxo-pentansäure-tert-buty1ester
Eine Lösung von [3S/R(1S)]-5-Fluor-4-hydroxy-3-(9-oxo-1,2,3,9-tetrahydro-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carboxamido)-pentansäure-tert-butylester (0,147 g, 0,35 mMol) in wasserfreiem DCM (7 ml) wurde mit 1,1,1-Triacetoxy-1,1-dihydro-1,2-benziodoxol-3(1H)-on (0,297 g, 0,70 mMol) bei 0°C unter Rühren behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur stehen gelassen und 18 Stunden gerührt, dann mit DCM verdünnt und nacheinander mit 10%-igem wässrigen Na₂SO₃·5H₂O, einer gesättigten wässrigen NaHCO₃Lösung und einer Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und konzentriert, wobei ein Gummi erhalten wurde. Das Gummi wurde durch Flash-Chromatographie (5% MeOH in DCM) gereinigt, wobei die Titelverbindung als weißer Feststoff (113 mg, 77%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,35–1,42 (9H, 2s), 2,37–2,62 (2H, m), 2,76–2,82 (1H, m), 2,88–2,97 (1H, m), 3,05–3,12 (1H, m), 3,35–3,42 (1H, m), 4,85–5,30 (4H, m), 7,41–7,89 (4H, m), 8,19–8,23 (1H, m); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) 24,1/24,2 (CH₂), 28,2/28,3 (CH₃), 32,0 (CH₂), 36,6 (CH₂), 52,8/52,9 (CH), 60,8/60,8 (CH), 82,7/82,7 (C), 84,7/84,8 (CH₂F), 120,0 (C), 126,8 (CH), 126,9/127,0 (CH), 127,4 (CH), 135,1 (CH), 149,4/149,5 (C), 159,5 (C), 161,5/161,6 (C), 169,4/169,7 (C), 170,2/170,3 (C), 202,6/202,8 (C); ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ –231,9, –232,5.
Verfahren F:
[3S/R(1S)]-3-(2,3-Dihydro-1H-9-oxo-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carboxamido)-5-fluor-4-oxo-pentansäure
TFA (4 ml) wurde zu einer gerührten eiskalten Lösung von [3S/R(1S)]-5-Fluor-4-oxo-3-(9-oxo-1,2,3,9-tetrahydro-pyrrolo[2,1-b]chinazolin-1-carboxamido)-pentansäure-tert-butylester (80 mg, 0,19 mMol) in wasserfreiem DCM (4 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei 0°C und dann 0,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand dann in trockenem DCM gelöst. Das Verfahren wurde mehrere Male wiederholt, wobei der Überschuss an TFA entfernt wurde. Das Gummi wurde mit Diethylether zermahlen und der erhaltene Feststoff durch Filtrieren gesammelt. Der Feststoff wurde mehrere Male mit Diethylether gewaschen, wobei die Titelverbindung als weißer Feststoff (65 mg, 94%) erhalten wurde: IR (Feststoff) 2366, 1793, 1675, 1557, 1194, 1137 cm^–1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 2,04–2,13 (1H, m), 2,48–3,18 (5H, m), 4,33–5,42 (4H, m), 7,50 (1H, m), 7,64 (1H, m), 7,82 (1H, m), 8,10 (1H, m), 9,06–9,14 (1H, m), 12,61 (1H, br s); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 24,2/24,3 (CH₂), 31,0/31,1 (CH₂), 34,6/34,8 (CH₂), 52,1/52,6 (CH), 60,0/60,3 (CH), 84,3/84,4 (2xd, J 177,9, 177,7 Hz, CH₂F), 120,47 (C), 126,2 (CH), 126,5 (CH), 127,0 (CH), 134,9 (CH), 149,3 (C), 149,3 (C), 160,1 (C), 160,7/160,8 (C), 170,6 (C), 172,1/172,2 (C), 202,4/202,7 (2xd, J 14,0, 14,0 Hz, CO); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ –226,6 (t), –226,9 (t), –230,2 (t), –231,6 (t), –233,0 (t), –233,1 (t), –75,5 (s, TFA, 1 eq); MS (FAB +ve, HR) berechnet für C₁₇H₁₇N₃O₅F (MH⁺) 362,115224, gefunden 362,115448.
Beispiel 2
[3S/R(9S)]-5-Fluor-4-oxo-3-(11-oxo-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1-b]chinazolin-9- carboxamido)-pentansäure
Verfahren G:
(S)-Piperidin-1,2-dicarbonsäure-di-tert-butylester
Zu einer Lösung von (S)-Piperidin-2-carbonsäure-tert-butylester (M. Egbertson und S.J. Danishefsky, J. Org. Chem., 1989, 54, 1, 11–12) (5,78 g, 31,2 mMol) in CH₃CN (30 ml) bei 0°C wurde DMAP (763 mg, 6,2 mMol) und dann BOC₂O (10,22 g, 46,8 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur stehen gelassen und 20 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie (10% Ethylacetat in Hexan) gereinigt. Die Titelverbindung wurde als farbloses Öl erhalten, welches beim Stehen auskristallisierte (8,33 g, 94%): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,21–1,32 (2H, m), 1,47–1,48 (18H, 2s), 1,59–1,72 (3H, m), 2,18 (1H, m), 2,85–3,00 (1H, m), 3,89–4,01 (1H, 2d, J 11,9 Hz), 4,47–4,58 (1H, 2br s).
Verfahren H:
(S)-6-Oxo-piperidin-1,2-dicarbonsäure-di-tert-butylester
Zu einer kräftig gerührten Lösung von RuCl₃·H₂O (2,39 g, 11,5 mMol) und NaIO₄ (24,6 g, 115,0 mMol) in Wasser (250 ml) wurde bei Raumtemperatur (S)-Piperidin-1,2-dicarbonsäure-di-tert-butylester (8,22 g, 28,8 mMol) in Ethylacetat (250 ml) zugegeben. Nach 4-stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch aufgeteilt und die wässrige Schicht mit Ethylacetat gewaschen. Zu den vereinten organischen Schichten wurde iPrOH (2,5 ml) zugegeben und das Rühren 2 Stunden fortgesetzt, wobei der Überschuss an RuO₄ zerstört wurde. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren durch einen Bausch von Celite entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (30% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, wobei die Titelverbindung als blassgelbes Öl erhalten wurde, welches beim Stehen auskristallisierte (6,69 g, 78%): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,49 (9H, s), 1,52 (9H, s), 1,75–1,82 (2H, m), 1,97–2,06 (1H, m), 2,15–2,21 (1H, m), 2,41–2,61 (2H, m), 4,59 (1H, dd, J 3,5 Hz).
Verfahren I:
(S)-6-Oxo-piperidin-2-carbonsäure-tert-butylester
Zu einer Lösung von (S)-6-Oxo-piperidin-1,2-dicarbonsäure-di-tert-butylester (6,30 g, 21,0 mMol) in Ethylacetat (50 ml) wurde 1,1-M HCl in Ethylacetat (28,7 ml, 31,5 mMol) zugegeben. Die Umsetzung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Wasser, einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung und einer Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft, wobei die Titelverbindung als gelbes Öl erhalten wurde, welches beim Stehen auskristallisierte (3,11 g, 74%): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,49 (9H, s), 1,74–1,94 (3H, m), 2,18 (1H, m), 2,29–2,44 (2H, m), 3,95–3,98 (1H, m), 6,32 (1H, br s); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 19,9 (CH₂), 25,9 (CH₂), 28,4 (CH₃), 31,4 (CH₂), 55,7 (CH), 83,0 (C), 170,4 (C), 171,9 (C).
[3S/R(9S)]-5-Fluor-4-oxo-3-(11-oxo-6,7,8,9-tetrahydro-11H-pyrido[2,1-b]chinazolin-9- carboxamido)-pentansäure
Diese Verbindung wurde aus (S)-6-Oxo-piperidin-2-carbonsäure-tert-butylester unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie sie in den Verfahrens A–F beschrieben wurden, hergestellt. Das Produkt wurde als weißer Feststoff isoliert (139 mg, 95%): IR (Feststoff) 2361, 2342, 1727, 1665, 1560, 1198, 1126 cm^–1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) ☐ 1,66–1,78 (2H, m), 2,14–2,17 (2H, m), 2,72 (2H, m), 2,92 (2H, m), 4,52–4,60 (1H, m), 4,80–5,30 (3H, m), 7,45–7,49 (1H, m), 7,58–7,60 (1H, m), 7,79–7,83 (1H, m), 8,06–8,09 (1H, m), 8,91 (1H, m), 12,51 (1H, br s); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 16,6/16,7 (CH₂), 26,2/26,2 (CH₂), 31,7/31,8 (CH₂), 55,3/55,7 (CH), 120,2/120,2 (C), 126,4 (CH), 126,4 (CH), 126,4 (CH), 134,9 (CH), 147,5 (C), 155,2 (C), 161,8 (C), 171,2 (C); die Signale für die Asp-Einheit sind zu breit, um in ¹H und ¹³C NMR festgestellt zu werden; ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) ☐ –233,0 (br).
Beispiel 3
[3S/R(3S)]-3-(2,3-Dihydro-1H-5-oxo-pyrrolo[1,2-b]isochinolin-3-carboxamido)-5-fluor-4-oxo-pentansäure
Verfahren J:
(S)-1-(2-Brommethylbenzoyl-5-oxo-pyrrolidin-2-carbonsäure-tert-butylester
Eine Lösung von α-Bromtoluolsäure (L. Garuti, A. Ferranti, M. Roberti, E. Katz, R. Budriesi und A. Chiarini, Pharmazie, 1992, 47, 295–297) (1,0 g, 4,7 mMol) in SOCl₂ (3,4 ml) wurde unter Rühren 2 Stunden auf 80°C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und der Rückstand in Toluol gelöst. Das Verfahren wurde mehrere Male wiederholt, wobei der Überschuss an SOCl₂ entfernt und schließlich das gewünschte Säurechlorid als gelbes Öl erhalten wurde. Eine gerührte Lösung von (2S)-5-Oxo-prolin-tert-butylester (T. Kolasa und M.J. Miller, J. Org. Chem., 1990, 55, 1711–1721) (861 mg, 4,7 mMol) in wasserfreiem THF (15 ml) wurde bei –78°C mit LDA (7,0 mMol) behandelt und die Umsetzung 15 Minuten gerührt. Eine Lösung des vorstehend hergestellten 2-α-Bromtoluylchlorids in wasserfreiem THF (5 ml) wurde dann tropfenweise zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei –78°C gerührt, bevor es mit einer gesättigten wässrigen NH₄Cl-Lösung gelöscht wurde. Die Umsetzung wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur stehen gelassen und aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten wässrigen NH₄Cl-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft, wobei ein Öl erhalten wurde, welches durch Flash-Chromatographie (30% Ethylacetat in Hexan) gereinigt wurde, wobei die Titelverbindung als blassgelbes Öl (1,46 g, 82%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,55 (9H, s), 2,12–2,19 (1H, m), 2,38–2,59 (2H, m), 2,67–2,76 (1H, m), 4,54 (1H, d, J 10,5 Hz), 4,70 (1H, d, J 10,5 Hz), 4,86 (1H, dd, J 9,0, 3,7 Hz), 7,36–7,50 (4H, m). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) ☐ 22,0 (CH₂), 28,4 (CH₃), 30,5 (CH₂), 32,0 (CH₂), 59,2 (CH), 83,2 (C), 128,3 (CH), 128,4 (CH), 131,0 (CH), 131,0 (CH), 135,2 (C), 135,5 (C), 169,6 (C), 170,4 (C), 173,6 (C).
Verfahren K:
(S)-1-[2-(Diethoxyphosphorylmethyl)benzoyl]-5-oxo-pyrrolidin-2-carbonsäure-tert-butylester
Ein Gemisch von (S)-1-(2-Brommethyl-benzoyl)-5-oxo-pyrrolidin-2-carbonsäure-tert-butylester (898 mg, 2,4 mMol) und Triethylphosphit (432 mg, 2,4 mMol) wurde 4 Stunden auf 70°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde der Rückstand durch Flash-Chromatographie (Ethylacetat) gereinigt, wobei die Titelverbindung als klares viskoses Öl (872 mg, 84%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,17 (3H, t, J 7,0 Hz), 1,26 (3H, t, J 7,0 Hz), 1,53 (9H, s), 2,07–2,14 (1H, m), 2,43–2,69 (3H, m), 3,12 (1H, dd, J 22,4, 15,0 Hz), 3,62 (1H, dd, J 22,1, 15,0 Hz), 3,84–4,06 (4H, m), 4,87 (1H, dd, J 8,9, 4,8 Hz), 7,31–7,46 (4H, m).
Verfahren L:
(S)-2,3-Dihydro-1H-5-oxo-pyrrolo[1,2-b]isochinolin-3-carbonsäure-tert-butylester
Zu einer Lösung von (S)-1-[2-(Diethoxyphosphorylmethyl)-benzoyl]-5-oxo-pyrrolidin-2-carbonsäure-tert-butylester (865 mg, 1,97 mMol) in THF (15 ml) wurde tropfenweise bei –40°C 1,0-M LHMDS in THF (1,97 ml, 1,97 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei –40°C gerührt, 1 Stunde zum Erwärmen auf 0°C stehen gelassen, 1 Stunde bei 0°C gerührt und 30 Minuten zum Erwärmen auf 7°C stehen gelassen, bevor es mit einer gesättigten wässrigen NH₄Cl-Lösung zermahlen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (2x) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (20% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, wobei die Titelverbindung als farbloses Öl erhalten wurde, welches beim Stehen auskristallisierte (286 mg, 51%): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,47 (9H, s), 2,29 (1H, m), 2,47 (1H, m), 3,06 (1H, m), 3,19 (1H, m), 5,08 (1H, m), 6,42 (1H, s), 7,41–7,49 (2H, m), 7,63 (1H, m), 8,37 (1H, m); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 25,8 (CH₂), 26,9 (CH₃), 28,7 (CH₂), 60,4 (CH), 81,3 (C), 99,3 (CH), 123,7 (C), 124,6 (CHx2), 126,5 (CH), 131,2 (CH), 137,3 (C), 142,4 (C), 160,2 (C), 168,7 (C).
[3S/R(3S)]-3-(2,3-Dihydro-1H-5-oxo-pyrrolo[1,2-b]isochinolin-3-carboxamido)-5-fluor-4-oxo-pentansäure
Diese Verbindung wurde aus (S)-2,3-Dihydro-(1H)-5-oxo-pyrrolo[1,2-b]isochinolin-3-carbonsäure-tert-butylester unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie sie bei den Verfahren C–F beschrieben wurden, hergestellt. Das Produkt wurde als weißer Feststoff (102 mg, 89%) isoliert: IR (Feststoff) 2356, 1742, 1655, 1588, 1209 cm^–1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 2,07–2,12 (1H, m), 2,40–2,93, (3H, m), 3,07–3,18 (2H, m), 4,34–5,45 (4H, m), 6,56–6,57 (1H, 2s), 7,41–7,45 (1H, m), 7,60–7,70 (2H, m), 8,11–8,16 (1H, m), 8,63–9,06 (1H, m), 12,49 (1H, br s); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 26,7/26,8 (CH₂), 29,8/29,9 (CH₂), 34,6/34,9 (CH₂), 52,0/52,7 (CH), 61,4/61,7 (CH), 84,4/84,5 (2xd, J 177,7, 177,3 Hz, CH₂F), 99,6/99,7 (CH), 124,4/124,4 (C), 125,8 (CH), 126,2 (CH), 126,9 (CH), 127,0 (CH), 138,6 (C), 145,4/145,4 (C), 160,6 (C), 171,1/171,2 (C), 172,1/172,2 (C), 202,4/202,9 (CO); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ –226,6 (t), –226,9 (t), –233,1 (t), –233,3 (t); MS (FAB +ve, HR) berechnet für C₁₈H₁₇N₂O₅F (MH⁺) 361,119975, gefunden 361,120247.
Beispiel 4
[3S/R(4S)]-5-Fluor-4-oxo-3-(6-oxo-1,2,3,4-tetrahydro-6H-benzo[b]chinolizin-4-carboxamido)-pentansäure
Diese Verbindung wurde aus (S)-6-Oxo-piperidin-2-carbonsäure-tert-butylester unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie sie bei den Verfahren J–L und C–F beschrieben wurden, hergestellt. Das Produkt wurde als weißer Feststoff (108 mg, 91%) isoliert: IR (Feststoff) 2361, 2337, 1736, 1641, 1365, 1217 cm^–1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1,66 (2H, m), 2,08–2,13 (2H, m), 2,53–2,94 (4H, m), 4,29–4,69 (1H, m), 5,10–5,44 (3H, m), 6,43–6,46 (1H, m), 7,39–7,43 (1H, m), 7,54–7,56 (1H, m), 7,65–7,71 (1H, m), 8,09–8,14 (1H, m), 8,42–8,96 (1H, m, NH), 12,51 (1H, br s, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 16,7/16,8 (CH₂), 26,9/27,0 (CH₂), 28,9/29,0 (CH₂), 34,5/34,8 (CH₂), 52,1/52,8 (CH), 54,9/55,2 (CH), 84,3/84,5, (J 177,7, 177,1 Hz, CH₂F), 103,8/103,8 (CH), 123,9 (C), 125,5 (CH), 125,8 (CH), 127,3 (CH), 132,9 (CH), 137,1 (C), 141,0/141,1 (C), 162,7 (C), 172,1/172,2 (C), 172,2/172,3 (C), 202,6/203,1 (J 14,6, 13,8 Hz, CO); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ –226,6 (t), –226,9 (t), –233,2 (t), –233,4 (t).
Beispiel 5
[3S/R(1S)]-3-(6,11-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-pyridazino[1,2-b]phthalazin-1-carboxamido)-5- fluor-4-oxo-pentansäure
Verfahren M:
(S)-6,11-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-pyridazino[1,2-b]phthalazin-1-carbonsäuremethylester
Eine Lösung von (S)-Hexahydro-pyridazin-3-carbonsäuremethylesterhydrochlorid (Y. Nakamura, C.J. Shin, Chem. Lett., 1991, 11, 1953–1956) (370 mg, 2,05 mMol), Phthalsäureanhydrid (318 mg, 2,15 mMol) und Diisopropylethylamin (291 mg, 2,25 mMol) wurde 2 Stunden in Toluol (5 ml) erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt und zwischen Ethylacetat und verdünnter HCl aufgeteilt. Die organische Phase wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde aus Hexan auskristallisiert und filtriert, wobei die Titelverbindung als weißer Feststoff (562 mg, 82%) erhalten wurde: ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,59 (1H, m), 1,96 (1H, m), 2,17 (1H, m), 2,55 (1H, m), 3,38 (1H, m), 3,70 (3H, s), 4,89 (1H, m), 5,74 (1H, m), 7,89 (2H, m), 8,16 (2H, m). ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 21,2 (CH₂), 25,7 (CH₂), 46,0 (CH₂), 53,8 (CH), 58,1 (CH₃), 129,0 (CH), 129,1 (CH), 130,1 (C), 130,6 (C), 135,3 (CH), 135,7 (CH), 160,4 (C), 162,4 (C), 171,7 (C).
Verfahren N:
(S)-6,11-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-pyridazino[1,2-b]phthalazin-1-carbonsäure
Zu einer gerührten Lösung von (S)-6,11-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-pyridazino[1‚2-b]phthalazin-1-carbonsäuremethylester (1,078 g, 3,93 mMol) in MeOH (35 ml) wurde bei 0°C KOH (232 mg, 4,12 mMol) in MeOH (11 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur stehen gelassen und 20 Stunden gerührt, dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und die erhaltene Lösung mit Wasser extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 2,0-M HCl angesäuert und dann mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde aus Diethylether kristallisiert und die Titelverbindung als weißer Feststoff (744 mg, 73%) erhalten: ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,80 (1H, m), 1,97 (1H, m), 2,16 (1H, m), 2,56 (1H, m), 3,36 (1H, m), 4,83–4,88 (2H, m), 5,71 (1H, m), 7,90 (2H, m), 8,26 (2H, m).
[3S/R(1S)]-3-(6,11-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-pyridazino[1,2-b]phthalazin-1-carboxamido)-5-fluor-4-oxo-pentansäure
Diese Verbindung wurde aus (S)-6,11-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-pyridazino[1,2-b]phthalazin-1-carbonsäure unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie sie bei den Verfahren D–F beschrieben wurden, hergestellt. Das Produkt wurde als weißer Feststoff (349 mg, 85%) isoliert: IR (Feststoff) 2356, 2337, 1736, 1651, 1617, 1603, 1346, 1226, 1212 cm^–1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1,62 (1H, m), 1,85 (1H, m), 2,11 (2H, m), 2,33 (1H, m), 2,70 (1H, m), 3,33 (1H, m), 4,54–4,96 (4H, m), 5,48 (1H, m), 7,87–7,94 (2H, m), 8,13–8,19 (2H, m), 8,72 (1H, m); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) (Signale für eine Asp-Einheit nicht sichtbar) δ 18,8 (2 Peaks, CH₂), 24,9/24,1 (CH₂), 43,7 (CH₂), 56,7/56,8 (CH), 127,4/127,5 (CHar), 128,5 (2 Peaks, Car), 129,2 (Car), 133,8/134,2 (CHar), 157,3 (CO), 159,4/159,6 (CO), 170,0 (CO); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆ + Tropfen von TFA) δ –232,7, –232,8; MS (FAB +ve, HR) berechnet für C₁₈H₁₈N₃O₆F (MH⁺) 392,125789, gefunden 392,125420.
Referenzbeispiel 6
[3S/R(5S)]-(9,10-Dioxo-5,6,7,8,9,10-hexahydro-1,4,8a,10a-tetraazaanthracen-5-carboxamido)-5-fluor-4-oxo-3-pentansäure (nicht von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen)
Diese Verbindung wurde aus Furo[3,4-b]pyrazin-5,7-dion unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie sie bei den Verfahren M–N und D–F beschrieben wurden, hergestellt. Das Produkt wurde als weißer Feststoff (150 mg, 90%) isoliert: IR (Feststoff) 1818, 1740, 1637, 1542, 1477, 1418, 1402, 1345, 1288, 1220, 1182, 1149, 1134, 1140, 1050, 934 cm^–1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1,57 (1H, m), 1,85 (1H, m), 2,10 (1H, m), 2,50–2,95 (2H, m, Asp CH₂), 3,49 (1H, m), 4,22–4,72 (2,5H, m), 5,12 (1,5H, m); 5,46 und 5,55 (1H, 2xm), 8,85 (1H, m), 9,16 (2H, d); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 18,8/19,1 (CH₂), 24,8/25,2 (CH₂), 32,9/33,1/34,5/34,6 (CH₂), 43,5/44,0/44,1 (Asp CH₂), 52,4/52,6 (CH), 57,3/57,4/57,6 (CH), 84,2/84,3 (J 178,5, 179,3 Hz, CH₂F), 140,9/141,0 (C), 141,5 (C), 149,9 (CH), 150,0/150,1 (CH), 156,2/156,3/156,3 (C), 158,4/158,4/158,8 (C), 169,4/169,5/169,8/169,8 (C), 172,0/173,1 (C=O), 202,4/202,5 (J 14,6, 14,3 HZ, C=O); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ –226,54 (t), –227,1 (t), –229,9 (t), –232,7 (t), –232,8 (t).
Beispiel 7
Enzymprüfungen
Die Prüfungen auf die Caspase-Hemmung basieren auf der Spaltung eines fluorogenen Substrats durch rekombinante gereinigte menschliche Caspasen-1, -3-, -7 oder -8. Die Prüfungen werden im Wesentlichen auf die gleiche Weise, wie die, die von Garcia-Calvo et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998), 32608–32613) beschrieben wurden, unter Verwendung eines für jedes Enzym spezifischen Substrats durchgeführt. Das Substrat für Caspase-1 ist Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-methylcumarin. Das Substrat für die Caspasen-3, -7 und -8 ist Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-methylcumarin.
Die beobachtete Geschwindigkeit der Enzyminaktivierung bei einer einzelnen Inhibitorkonzentration, k_obs, wird durch direktes Einfügen der Daten in die Gleichung, die von Thomberry et al. (Biochemistry 33 (1994), 3943–3939) stammt, unter Verwendung eines Computerprogramms einer Analyse von nicht linearen kleinsten Quadraten (PRISM 2,0; GraphPad-Software) berechnet. Um die Geschwindigkeitskonstante des zweiten Grades, k_inact, zu erhalten, werden die k_obs-Werte gegen ihre jeweilige Inhibitorkonzentrationen graphisch dargestellt und die k_inact-Werte werden anschließend durch computerisierte lineare Regression berechnet.
Die nachstehende Tabelle 3 zeigt die Hemmung der Caspase-1-Aktivität für eine ausgewählte erfindungsgemäße Verbindung, wie sie durch das vorstehende Verfahren bestimmt wurde. Tabelle 3. Caspase-1-Aktivität

Beispiel-Nummer Kinact (M^–1s^–1)

2 455000
Die nachstehende Tabelle 4 zeigt die Hemmung der Caspase-3-Aktivität für eine ausgewählte erfindungsgemäße Verbindung, wie sie durch das vorstehende Verfahren bestimmt wurde. Tabelle 4. Caspase-3-Aktivität

Beispiel-Nummer Kinact (M^–1s^–1)

1 1605 00
Die nachstehende Tabelle 5 zeigt die Hemmung der Caspase-7-Aktivität für eine ausgewählte erfindungsgemäße Verbindung, wie sie durch die vorstehenden Verfahren bestimmt wurde. Tabelle 5. Caspase-7-Aktivität

Beispiel-Nummer Kinact (M^–1s^–1)

3 229000
Die nachstehende Tabelle 6 zeigt die Hemmung der Caspase-8-Aktivität für eine ausgewählte erfindungsgemäße Verbindung, wie sie durch die vorstehenden Verfahren bestimmt wurde. Tabelle 6. Caspase-8-Aktivität

Beispiel-Nummer Caspase-8 Kinact (M^–1s^–1)

5 82000
Beispiel 8
Hemmung der IL-1β-Sekretion von gemischten Populationen der peripheren mononuclearen Blutzellen (PBMC)
Die Aufbereitung von pre-IL-1β durch Caspase-1 kann in Zellkulturen unter Verwendung einer Vielzahl von Zellquellen gemessen werden. Menschliche PBMC, welche von gesunden Spender erhalten wurden, stellen eine gemischte Population von Lymphocyten und mononuclearen Zellen bereit, welche ein Spektrum von Interleukinen und Cytokinen als Reaktion auf viele Klassen von physiologischen Stimulatoren herstellen.
Experimentelles Verfahren
Die Testverbindung wird in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma # D-2650) gelöst, wobei eine 100 mM Vorratslösung erhalten wird. Diese Lösung wird in einem vollständigen Medium verdünnt, bestehend aus RPMI, welches 10% in der Wärme inaktiviertes FCS (Gibco BRL # 10099-141), 2 mM L-Glutamin (Sigma, # G-7513), 100 U Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Sigma # P-7539) enthält. Der Endkonzentrationsbereich der Testverbindung liegt von 100 μM bis hinunter auf 6 nM über acht Verdünnungsschritte. Die höchste Konzentration der Testverbindung ist äquialent zu 0,1% DMSO in dem Test.
Menschliche PBMC werden aus Buffy Coats isoliert, welche von der Blutbank unter Verwendung der Zentrifugierung auf Ficoll-Paque Leukocyten-Trennungsmedium (Amersham, # 17-1440-02) erhalten werden und die zelluläre Prüfung wird in einer sterilen Platte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (Nunc) durchgeführt. Jeder Behälter enthält 100 μl der Zellsuspension, 1 × 10⁵ Zellen, 50 μl der Verdünnungen der Verbindung und 50 μl LPS (Sigma # L-3012) bei 50 ng/ml Endkonzentration. Die Kontrollen bestehen aus Zellen +/– LPS-Stimulierung und einer Verdünnungsreihe von DMSO, verdünnt auf die gleiche Weise wie die Verbindung. Die Platten werden 16–18 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ und bei 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Nach 16–18 Stunden werden die Überstände nach 15 Minuten langem Zentrifugieren der Platten mit 100 × g bei 18°C gewonnen und auf ihren IL-1β-Gehalt geprüft. Die Messung des ausgereiften IL-1β in dem Überstand wird unter Verwendung der Quantikine-Kits (R&D Systems) gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Mengen an ausgereiftem IL-1β von etwa 600–1600 pg/ml werden für PBMC in den Vertiefungen mit den positiven Kontrollen beobachtet.
Die Stärke der Hemmung der Verbindungen kann durch einen IC₅₀-Wert dargestellt werden, der die Konzentration des Inhibitors bedeutet, bei welcher 50% des ausgereiften IL-1β in dem Überstand, im Vergleich zu den positiven Kontrollen, ermittelt wird. Die Tabelle 7 zeigt die Hemmung der IL-1β-Sekretion von peripheren mononuclearen Blutzellen für eine ausgewählte erfindungsgemäße Verbindung, wie sie durch die vorstehenden Verfahren bestimmt wurde. Tabelle 7. Hemmung der IL-1β-Sekretion aus PBMC

Beispiel-Nummer IC₅₀ (nM)

4 569
Beispiel 9
Test der anti-Fas induzierten Apoptose
Zelluläre Apoptose kann durch die Bindung eines Fas-Liganden (FasL) an seinen Rezeptor, CD95 (Fas), induziert werden. CD95 ist einer aus einer Gruppe von verwandten Rezeptoren, bekamt als tote Rezeptoren, welche die Apoptose in Zellen über die Aktivierung der Caspaseenzymkaskade auslösen können. Das Verfahren wird durch die Biundung des Adaptermoleküls FADD/MORI-1 an den zytoplasmischen Bereich des C-95-Rezeptor- Liganden-Komplexes eingeleitet. Caspase-8 bindet dann FADD und wird aktiviert, wobei eine Kaskade von Ereignissen eingeleitet wird, die die Aktivierung von stromabwärts gerichteten Caspasen und eine folgende zelluläre Apoptose einschließt. Apoptose kann auch in Zellen induziert werden, wobei CD95, z. B. die Jurkat E6.1T Zelllymphomzelllinie, unter Verwendung eines Antikörpers besser als FasL zum Ausdruck kommt, wobei die Zelloberfläche von CD95 vernetzt wird. Anti-Fas induzierte Apoptose wird auch über die Aktivierung von Caspase-8 ausgelöst. Das stellt die Basis für einen auf Zellen basierenden Test bereit, um Verbindungen zur Hemmung des durch Caspase-8 vermittelten apoptischen Signalweges zu durchmustern.
Experimentelles Verfahren
Jurkat E6.1-Zellen werden in einem vollständigen Medium kultiviert, welches aus RPMI-1640 (Sigma Nr) + 10% fötalem Kalbsserum (Gibco BRL Nr. 10099-141) + 2 mM-L-Glutamin (Sigma Nr. G-7513) besteht. Die Zellen werden in der log-Wachstumsphase gewonnen. 100 ml Zellen bei 5–8 × 10⁵ Zellen/ml werden in sterile 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen übertragen und 5 Minuten mit 100 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die vereinten Zellpellets wieder in 25 ml des vollständigen Mediums suspendiert. Die Zellen werden gezählt und die Dichte auf 2 × 10⁶ Zellen/ml mit vollständigem Medium eingestellt.
Die Testverbindung wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma Nr. D-2650) gelöst, wobei eine 100 mM Vorratslösung erhalten wird. Diese Lösung wird auf 400 μM in ein vollständiges Medium verdünnt, dann in einer Reihe in einer sterilen 96 Behälter-Platte, vor der Zugabe zu der Zellprüfungsplatte, verdünnt.
100 μl der Zellsuspension (2 × 10⁶ Zellen) wird zu jedem Behälter einer sterilen Clusterplatte mit 96 Vertiefungen und rundem Boden (Costar Nr. 3790) zugegeben. 50 μl der Lösung der Verbindung mit der geeigneten Verdünnung und 50 μl anti-Fas-Antikörper, Clon CH-11 (Kamiya Nr. MC-060) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml werden zu den Vertiefungen zugegeben. Kontrollvertiefungen werden ohne Antikörper und ohne eine Verbindung aber mit einer Verdünnungsreihe von DMSO als Kontrollträger bereitet. Die Platten werden 16–18 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ und bei 95%iger Feuchtigkeit inkubiert.
Die Apoptose der Zellen wird durch die Quantifizierung von DNA-Fragmentierung unter Verwendung eines "Cell Death Detection Assay" von Boehringer-Mannheim Nr. 1544675 gemessen. Nach der Inkubation von 16–18 Stunden werden die Testplatten 5 Minuten mit 100 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. 150 μl des Überstands werden entfernt und durch 150 μl frisches vollständiges Medium ersetzt. Die Zellen werden dann gewonnen und 200 μl des Lysispuffers, welcher in dem Testkit bereitgestellt ist, wird zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen werden zermahlen, wobei eine vollständige Lysis sichergesteilt wird und 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Platten werden dann 10 Minuten mit 1900 × g zentrifugiert und die Überstande auf 1:20 verdünnt zu dem Inkubationspuffer gegeben. 100 μl dieser Lösung wird dann exakt gemäß den Vorschriften des Herstellers, welche mit dem Kit geliefert werden, geprüft. OD₄₀₅ nm wird 20 Minuten nach der Zugabe des Endsubstrats in einem SPECTRAmax Plus Plattenleser (Molecular Devices) gemessen. OD₄₀₅ nm wird gegen die Konzentration der Verbindung graphisch dargestellt und die IC₅₀-Werte für die Verbindungen werden unter Verwendung des Kurven-Einrichtungsprogramms SOFTmax Pro (Molecular Devices) unter Verwendung der vier Parameter Einrichtungsoption berechnet.
Die Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der Aktivität der ausgewählten erfindungsgemäßen Verbindung bei der FAS induzierten Apoptoseprüfung. Tabelle 8. Aktivität bei der FAS induzierten Apoptoseprüfung

Beispiel-Nummer IC₅₀ (nM)

6* 168

* Referenzbeispiel

Es ist selbstverständlich, dass der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche statt durch die spezifischen Ausführungsformen, welche durch Beispiele dargestellt wurden, festgelegt ist.

Claims

Verbindung der Formel I:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon, wobei: R¹ -CH₂Y ist, wobei Y für F steht; R² CO₂H oder ein Ester oder Amid davon ist, wobei die Ester von R²-Carbonsäuren ausgewählt sind aus einem C_1-12-aliphatischen Rest, ausgewählt aus C_1-6-Alkyl oder C_3-10-Cycloalkyl, Aryl, ausgewählt aus Phenyl, Aralkyl, ausgewählt aus Benzyl oder Phenethyl, Heterocyclyl oder Heterocyclylalkyl, wobei Heterocyclylringe ausgewählt sind aus 5- bis 6-gliedrigen heterocyclischen Ringen mit ein oder zwei Heteroatomen, ausgewählt aus Piperidinyl, Piperazinyl oder Morpholinyl, und Amide von R²-Carbonsäuren primäre, sekundäre oder tertiäre Amide sein können, geeignete Substituenten an dem Amid-Stickstoff ein oder mehrere Reste sind, die unabhängig aus den vorstehend für den R²-Esteralkohol beschriebenen aliphatischen, Aryl-, Aralkyl-, Heterocyclyl- oder Heterocyclylalkylresten ausgewählt sind; X₂-X₁ CH=C oder C(=O)-N ist; Ring C ein kondensierter unsubstituierter Benzolring ist; n 0 oder 1 ist; und jeder Methylenkohlenstoff im Ring A gegebenenfalls und unabhängig mit =O oder mit einem oder mehreren von Halogen, C_1-4-Alkyl oder C_1-4-Alkoxy substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus den Verbindungen
Beispiel R¹ R² Ring C n X₁ X₂ 1 CH₂F CO₂H Benzo 0 C N 2 CH₂F CO₂H Benzo 1 C N 3 CH₂F CO₂H Benzo 0 C C-H 4 CH₂F CO₂H Benzo 1 C C-H 5 CH₂F CO₂H Benzo 1 N C=O

ausgewählt ist.
Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung eines Zustands oder einer Erkrankung bei Säugern, welche(r) durch die Behandlung mit einem Caspase-Inhibitor gelindert wird.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands, ausgewählt aus einer IL-1-vermittelten Erkrankung, einer Apoptose-vermittelten Erkrankung, einer entzündlichen Erkrankung, einer Autoimmunerkrankung, einer destruktiven Knochenerkrankung, einer proliferativen Störung, einer infektiösen Erkrankung, einer degenerativen Erkrankung, einer Erkrankung, die mit der übermäßigen Alkoholaufnahme über die Nahrung einhergeht, einer Virus-vermittelten Erkrankung oder einer mit dem Absterben von Zellen verbundenen Erkrankung.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands, ausgewählt aus Uveitis, entzündlicher Peritonitis, Osteoarthritis, Pancreatitis, Asthma, Schocklunge, Glomerulonephritis, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, Skleroderm, chronischer Thyroiditis, Morbus Basedow, autoimmuner Gastritis, Diabetes, autoimmuner hämolytischer Anämie, autoimmuner Neutropenie, Thrombocytopenie, chronischer aktiver Hepatitis, Myasthenia gravis, entzündlicher Darmerkrankung, Morbus Crohn, Psoriasis, atopischer Dermatitis, Narbenbildung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Organtransplantatabstoßung, Osteoporose, Leukämie und damit verbundenen Störungen, myelodysplastischem Syndrom, mit multiplem Myelom verbundener Knochenerkrankung, akuter myelogener Leukämie, chronischer myelogener Leukämie, metastatischem Melanom, Kaposi-Sarkom, multiplem Myelom, haemorrhagischem Schock, Sepsis, septischem Schock, Verbrennungen, Shigellose, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, Kennedy-Syndrom, Prion-Krankheit, cerebraler Ischämie, Epilepsie, myokardialer Ischämie, akutem und chronischem Herzleiden, myokardialem Infarkt, dekompensierter Herzinsuffizienz, Atherosklerose, Bypass-Transplantation der Herzkranzgefäße, spinaler Muskelatrophie, amyotropher Lateralsklerose, Multipler Sklerose, mit HIV verbundener Encephalitis, Alterung, Alopecia, neurologischer Schädigung aufgrund eines Schlaganfalls, Colitis ulcerosa, traumatischer Gehirnverletzung, Rückenmarksverletzung, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis-G, Gelbfieber, Dengue-Fieber oder Japanischer Encephalitis, verschiedenen Formen von Lebererkrankung, Nierenerkrankung, polyaptischer Nierenerkrankung, mit H. pylori verbundener Magen- und Zwölffingerdarmgeschwürerkrankung, HIV-Infektion, Tuberkulose, Meningitis, einer Behandlung für Komplikationen, die mit Bypass-Transplantation der Herzkranzgefäße verbunden sind, oder einer Immuntherapie für die Behandlung verschiedener Formen von Krebs.
Verbindung nach Anspruch 5 zur Behandlung von mit Bypass-Transplantationen der Herzkranzgefäße verbundenen Komplikationen.
Verfahren zum Konservieren von Zellen, wobei das Verfahren den Schritt des Badens der Zellen in einer Lösung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Verfahren zum Konservieren eines Organs für die Organtransplantation oder zum Konservieren eines Blutprodukts, umfassend den Schritt des Badens des Organs oder Blutprodukts in einer Lösung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Immuntherapie zur Behandlung von Krebs.