ES2295171T3

ES2295171T3 - Inhibidores de caspasa y sus usos.

Info

Publication number: ES2295171T3
Application number: ES01941972T
Authority: ES
Inventors: Jean-Damien Vertex Pharmaceuticals Inc. CHARRIER; Guy Vertex Pharmaceuticals Ltd. BRENCHLEY
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-06-07
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2021-06-05
Also published as: US7829561B2; US20110003824A1; IL152845A0; US20090023739A1; AU2001275279B2; DE60131160T2; DE60131160D1; KR20030025235A; US20020045623A1; WO2001094351A1; AU7527901A; US7407964B2; EP1289993B1; EP1289993B9; US7968716B2; JP2003535865A; ATE377010T1; EP1289993A1; CA2409015A1

Abstract

Un compuesto de fórmula I: o uno de sus derivados farmacéuticamente aceptables, en el que: R1 es -CH2Y; en el que Y es F R2 es CO2H, o un éster, o amida, en el que los ésteres de ácidos carboxílicos R2 se seleccionan de un grupo alifático C1-12, seleccionado de alquilo C1-6 o cicloalquilo C3-10, arilo, seleccionado de fenilo, aralquilo, seleccionado de bencilo o fenetilo, heterociclilo o heterociclilalquilo, por lo cual los anillos de heterociclilo se seleccionan de anillos heterocíclicos de 5-6 miembros que tienen uno o dos heteroátomos, seleccionados de piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo. y las amidas de ácidos carboxílicos R2 pueden ser primarias, secundarias o terciarias, los sustituyentes adecuados sobre el nitrógeno de la amida son, uno o más grupos independientemente seleccionados de los grupos alifático, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo descritos anteriormente para su alcohol del éster R2; X2-X1 es N=C, CH=C o C(=O)-N; El anillo C es un anillo de benceno fusionado sin sustituir; n es 0, o 1; y cada carbono metilénico en el anillo A está opcional e independientemente sustituido con =O, o con uno o más de halógeno, alquilo C1-4, o alcoxi C1-4.

Description

Inhibidores de caspasa y sus usos.

Referencia a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente de EE.UU. provisional 60/209.929, presentada el 7 de junio de 2000, los contenidos de la cual están incorporados en la presente invención por referencia.

Campo de la invención

Esta invención está en el campo de la química médica, y se refiere a nuevos compuestos, y a sus composiciones farmacéuticas, que inhiben caspasas que actúan como mediadores en la apoptosis celular e inflamación. La invención se refiere también al uso de los compuestos y composiciones farmacéuticas de esta invención para la preparación de composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades en las que está implicada la actividad de caspasa.

Antecedentes de la invención

La apoptosis, o muerte celular programada, es un mecanismo principal por el cual los organismos eliminan las células indeseadas. La desregulación de la apoptosis, o la apoptosis excesiva o el fallo para experimentarla, ha estado implicada en varias enfermedades tales como cáncer, trastornos inflamatorios agudos y autoinmunitarios, enfermedades isquémicas, y ciertos trastornos neurodegenerativos (véase de manera general Science, 1998, 281, 1283-1312; Ellis et al., Ann. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).

Las caspasas son una familia de enzimas cisteín-protesasas, que son mediadores clave en las vías de señalización de la apoptosis y desguace celular (Thornberry, Chem. Biol., 1998, 5, R97-R103). Estas vías de señalización varían dependiendo del tipo celular y del estímulo, pero todas las vías de apoptosis parecen converger en una vía efectora común que conduce a la proteinólisis de proteínas clave. Las caspasas están implicadas tanto en la fase efectora de la vía de señalización como además en etapas anteriores, en su iniciación. Las caspasas de las etapas anteriores implicadas en los sucesos de iniciación son activadas, y sucesivamente, activan otras caspasas que están implicadas en las fases posteriores de la apoptosis.

La caspasa-1, la caspasa identificada en primer lugar, es también conocida como enzima convertidora de interleucina, o "ICE". La caspasa-1 convierte el precursor de la interleucina-1\beta ("pIL-1\beta") en la forma activa proinflamatoria, mediante escisión específica de pIL-1\beta entre Asp-116 y Ala-117. Además de la caspasa-1, hay también otras once caspasas humanas conocidas, todas de las cuales escinden específicamente en los restos aspartilo. También se ha observado que tienen requisitos rigurosos para al menos cuatro restos de aminoácido en el lado del extremo N del sitio de escisión.

Las caspasas se han clasificado en tres grupos, dependiendo de la secuencia de aminoácidos que es preferida o reconocida en primer lugar. El grupo de caspasas, que incluye caspasas-1, -4, y -5, ha mostrado preferir aminoácidos aromáticos hidrófobos en posición 4 en el lado del extremo N del sitio de escisión. Otro grupo que incluye caspasas-2, -3, y -7, reconoce restos de aspartilo, tanto en la posición 1 como en la 4, en el lado del extremo N del sitio de escisión, y preferiblemente, una secuencia de Asp-Glu-X-Asp. Un tercer grupo, que incluye caspasas-6, -8, -9, y -10, tolera muchos aminoácidos en la secuencia de reconocimiento primaria, pero parece que prefiere restos con cadenas laterales alifáticas ramificadas, tales como valina y leucina en posición 4.

Las caspasas han sido agrupadas también conforme a su función percibida. La primera subfamilia consiste en caspasas-1 (ICE), -4, y -5. Se ha mostrado que estas caspasas están implicadas en los procesos de las citocinas proinflamatorias, y por lo tanto, juegan un papel importante en la inflamación. La caspasa-1, la enzima más estudiada de esta clase, activa el precursor de IL-1\beta mediante escisión proteolítica. Esta enzima juega por lo tanto un papel clave en la respuesta inflamatoria. La caspasa-1 está implicada también en los procesos del factor inductor de interferón-\gamma (IGIF o IL-18), que estimula la producción de interferón-\gamma, un inmunorregulador clave que modula la presentación de antígeno, la activación de las células T, y la adhesión celular.

Las caspasas restantes forman la segunda y tercera subfamilias. Estas enzimas son de una importancia fundamental en las vías de señalización intracelular que conducen a la apoptosis. Una subfamilia consiste en las enzimas implicadas en los sucesos de iniciación de la vía apoptótica, que incluyen la transducción de señales desde la membrana plasmática. Los miembros de esta subfamilia incluyen caspasas-2, -8, -9, y -10. La otra subfamilia, que consiste en las caspasas efectoras -3, -6, y -7, está implicada en los sucesos de escisión posteriores finales, que dan como resultado la descomposición sistemática y muerte de la célula por apoptosis. Las caspasas implicadas en la transducción de señales de las etapas anteriores activan las caspasas de las etapas posteriores, las cuales inutilizan luego los mecanismos de reparación del ADN, fragmentan el ADN, desmantelan el citoesqueleto de la célula, y finalmente fragmentan la célula.

Se ha determinado para sustratos enzimáticos una secuencia de cuatro aminoácidos reconocida en primer lugar por las caspasas. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272, 9677-9682, (1997); Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272, 17907-17911, (1997). Se ha usado el conocimiento de la secuencia de cuatro aminoácidos reconocida en primer lugar por las caspasas para diseñar inhibidores de caspasas. Se han preparado inhibidores tetrapeptídicos reversibles que tienen la estructura CH_{3}CO-[P4]-[P3]-[P2]-CH(R)-CH_{2}CO_{2}H, en la que P2 a P4 representan una secuencia óptima de reconocimiento de aminoácidos, y R es un aldehído, nitrilo o cetona, capaz de unirse al sulfhidrilo de la cisteína de la caspasa. Rano y Thornberry, Chem. Biol. 4, 149-155 (1997); Mjalli, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689-2692; Nicholson et al., Nature 376, 37-43 (1995). Se han preparado inhibidores irreversibles basados en la secuencia de reconocimiento tetrapeptídica análoga, en la que R es una aciloximetilcetona COCH_{2}OCOR'. R' se ejemplifica mediante un fenilo opcionalmente sustituido, tal como 2,6-diclorobenzoiloxi, y en la que R es COCH_{2}X en el que X es un grupo saliente tal como F o Cl. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J. Med. Chem. 37, 563-564 (1994).

La utilidad de inhibidores de caspasas para tratar diversas enfermedades de mamíferos asociadas con un aumento de la apoptosis celular, se ha demostrado usando inhibidores de caspasas peptídicos. Por ejemplo, en modelos de roedores, se ha mostrado que los inhibidores de caspasas reducen la extensión del infarto e inhiben la apoptosis de los cardiomiocitos después de un infarto de miocardio, para reducir el volumen de la lesión y el déficit neurológico que resulta del ictus, para reducir la apoptosis postraumática y el déficit neurológico en lesiones cerebrales traumáticas, para ser eficaces en el tratamiento de fallo hepático fulminante, y para mejorar la supervivencia después de un choque endotóxico. Yaoita et al., Circulation, 97, 276 (1998); Endres et al. J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238, (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al., J. Neuroscience, 7, 7415 (1997); Rodríguez et al., J. Exp. Med., 184, 2067 (1996); Grobmyer et al., Mol. Med., 5, 585 (1999).

En general, los inhibidores peptídicos descritos anteriormente son muy potentes frente a algunas de las enzimas caspasas. Sin embargo, su potencia no se ha reflejado siempre en modelos celulares de apoptosis. Además, los inhibidores peptídicos se caracterizan típicamente por propiedades farmacológicas indeseables, tales como una mala absorción por vía oral, poca estabilidad, y un metabolismo rápido. Plattner y Norbeck, en Drug Discovery Technologies, Clark and Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, England, 1990).

Reconociendo la necesidad de mejorar las propiedades farmacológicas de los inhibidores de caspasas peptídicos, se ha informado de inhibidores peptídicos de aminoácidos no naturales y peptidomiméticos.

El documento de patente EP618223 describe péptidos que inhiben la liberación de interleucina 1-\beta de fórmula:

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en la que R es un hidrógeno, un grupo protector de amino o hidroxi, o benciloxi con anillo sustituido opcionalmente, A_{3} es -CH_{2}-X_{1}-CO-Y_{1}; -CH_{2}-O-Y_{2}; o -CH_{2}-S-Y_{3}; en el que X_{1} es O o S, y Y_{1}, Y_{2}, y Y_{3} son como se define en la memoria descriptiva.

El documento de patente WO 97/22619 describe inhibidores de la ICE que contienen una unidad de ácido piperázico:

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en la que R_{1} es CO_{2}H o reemplazo bioisostérico de CO_{2}H; R_{2} es H, alquilo, arilo, heteroarilo, o CH_{2}Y; R_{3} es H, R, COOR, CON(R)_{2}, SO_{2}R, SO_{2}NHR, COCH_{2}OR, COCOR, COCOOR, o COCON(R)_{2}; Y es OR, SR, o -OC=O(R); y R es H, un grupo aromático o alquílico.

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El documento de patente WO 9816502 describe inhibidores de la ICE que contienen una unidad de prolina:

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en la que R_{1} es alquilo o N(R_{3})_{2}; R_{2} es H, o OCH_{2-}Arilo; y R_{3} se selecciona de diversos grupos.

Dolle et al. (J. Med. Chem. 37, 563, (1994)) informan de inhibidores de la ICE que contienen una unidad de ácido pipecólico:

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El documento de patente WO 95/3538 se refiere a compuestos que son inhibidores de la enzima convertidora de IL-1\beta (ICE), composiciones que los comprenden, y su uso frente a enfermedades en las que IL-1 actúa como mediador.

El documento de patente WO 98/11109 está dirigido a compuestos inhibidores de la familia ICE/ced-3 tricíclicos, composiciones que los comprenden, y su uso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias, y neurodegenerativas, y para la prevención de lesiones isquémicas.

El documento de patente WO 95/33751 describe lactamas bicíclicas fusionadas como inhibidores de enzimas ICE, composiciones que las comprenden, y su uso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.

Aunque se ha informado de varios inhibidores de caspasas, no está claro si poseen las propiedades farmacológicas apropiadas para ser útiles terapéuticamente. Por lo tanto, hay una necesidad continuada de inhibidores de caspasas de moléculas pequeñas que sean potentes, estables, y penetren en las membranas, para proporcionar una inhibición eficaz de la apoptosis in vivo. Tales compuestos serían extremadamente útiles en el tratamiento de las enfermedades anteriores en las que las enzimas caspasas juegan un papel.

Sumario de la invención

Se ha encontrado ahora que los compuestos de esta invención y sus composiciones farmacéuticas son eficaces como inhibidores de caspasas y apoptosis celular. Estos compuestos tienen la fórmula general I:

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en la que:

R^{1} es -CH_{2}Y; en el que Y es F

R^{2} es CO_{2}H, CH_{2}CO_{2}H, o uno de sus ésteres, o amidas;

X_{2}-X_{1} es N=C, CH=C o C(=O)-N

El anillo C es un anillo de benceno fusionado sin sustituir;

n es 0, o 1; y

\quad: cualquier posición metilénica en el anillo A está opcional e independientemente sustituida con =O, o con uno o dos grupos seleccionados de halógeno, alquilo C_{1-4}, o alcoxi C_{1-4}.

Los compuestos de esta inhibición tienen propiedades potentes de inhibición a través de un intervalo de dianas de caspasas, con buena eficacia en modelos celulares de apoptosis, y son útiles para tratar enfermedades en las que las caspasas actúan como mediadores, tales como las descritas más adelante.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona nuevos compuestos, y sus derivados farmacéuticamente aceptables, que son útiles como inhibidores de caspasas. La invención proporciona también el uso de compuestos para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la actividad de caspasa, y para tratar enfermedades en las que las caspasas actúan como mediadores en mamíferos. Estos compuestos tienen la fórmula general I:

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en la que:

R^{1} es -CH_{2}Y;

Y es F;

R^{2} es CO_{2}H, o uno de sus ésteres, o amidas;

X_{2}-X_{1} es N=C, CH=C o C(=O)-N;

El anillo C es un anillo de benceno fusionado sin sustituir;

n es 0, o 1; y

\quad: cada carbono metilénico en el anillo A está opcional e independientemente sustituido con =O, o con uno o más halógenos, alquilo C_{1-4}, o alcoxi C_{1-4}.

Cuando el grupo R^{2} está en forma de un éster o amida, los presentes compuestos experimentan escisión metabólica hasta los ácidos carboxílicos correspondientes, que son los inhibidores de caspasas activos. Porque experimentan escisión metabólica, la naturaleza precisa del grupo de éster o amida no es crítica para el funcionamiento de esta invención. Los ésteres en la estructura del grupo R^{2} se seleccionan de ésteres de ácidos carboxílicos R^{2} seleccionados de un grupo alifático C_{1-12}, seleccionado de alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-10}, arilo, seleccionado de fenilo, aralquilo, seleccionado de bencilo o fenetilo, heterociclilo o heterociclilalquilo, por lo cual los anillos de heterociclilo se seleccionan de anillos heterocíclicos de 5-6 miembros que tienen uno o dos heteroátomos, seleccionados de piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo.

Las amidas de ácidos carboxílicos R^{2} pueden ser primarias, secundarias, o terciarias. Los sustituyentes adecuados sobre el nitrógeno de la amida son, uno o más grupos seleccionados independientemente de los grupos alifático, arilo, aralquilo, heterociclilo, o heterociclilalquilo descritos anteriormente para el alcohol del éster R^{2}.

Los compuestos de esta invención en los que R^{2} es CO_{2}H, \gamma-cetoácidos, o \delta-cetoácidos respectivamente, pueden existir en disolución, o como la forma abierta 1, o como la forma ciclada de hemicetal 2 (y = 1 para \gamma-cetoácidos, y =2 para \delta-cetoácidos). La representación en la presente invención de cualquiera de las dos formas isómeras pretende incluir la otra.

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Asimismo, será evidente para un experto en la técnica que ciertos compuestos de esta invención pueden existir en formas tautómeras o formas hidratadas, estando todas de tales formas de los compuestos dentro del alcance de la invención. A menos que se indique de otra manera, las estructuras representadas en la presente invención pretenden incluir también todas las formas estereoquímicas de la estructura; es decir, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico. Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos únicos, así como las mezclas de enantiómeros y diastereómeros de los compuestos de la presente invención, están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique de otra manera, las estructuras representadas en la presente invención pretenden incluir también compuestos que se diferencian solamente en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto por el reemplazo de un hidrógeno con un deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono con un carbono enriquecido con ^{13}C- o ^{14}C-, están dentro del alcance de esta invención.

Los compuestos de esta invención tienen propiedades de inhibición a través de un intervalo de dianas de caspasas, con buena eficacia en modelos celulares de apoptosis. Además, se espera que estos compuestos tengan una buena penetración en las células y buenas propiedades farmacocinéticas y, como consecuencia de su potencia, tengan buena eficacia frente a enfermedades en las que estén implicadas las caspasas.

El anillo C es un anillo de benceno fusionado sin sustituir.

Los compuestos preferidos de esta invención son compuestos de fórmula I que tienen las siguientes características:

(a) R^{1} es -CH_{2}Y en el que Y es F;

(b) R^{2} es CO_{2}H o uno de sus ésteres;

(c) X_{2}-X_{1} es N=C, CH=C o C(=O)-N;

(d) El anillo C es un benceno; y

(e) n es 0 o 1.

Los sistemas de anillos tricíclicos representativos de fórmula I incluyen los proporcionados en la tabla 1. La tabla 2 que sigue muestra ejemplos representativos específicos de compuestos de fórmula I.

TABLA 1 Ejemplos de sistemas tricíclicos de fórmula I en los que el anillo C es un anillo de benceno fusionado

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TABLA 2 Ejemplos de compuestos de fórmula I

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Los compuestos de esta invención pueden preparase en general por métodos conocidos por los expertos en la técnica para compuestos análogos, como se ilustra mediante el esquema general I siguiente, y mediante los ejemplos preparativos que siguen.

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Esquema I

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El sistema tricíclico de anillos 1 se prepara generalmente como un éster (véanse los esquemas 2-4). El éster 1 (R es cualquier radical orgánico adecuado) es hidrolizado en primer lugar usando una base o, cuando el éster es un grupo t-butílico, usando ácido trifluoroacético. El ácido 2 se acopla luego con el aminoalcohol 3. Dependiendo de la naturaleza de R^{1} y R^{2}, puede usarse una aminocetona, en lugar del aminoalcohol, lo que evita la etapa de oxidación posterior. En el caso de fluorometilcetonas en las que R^{1} es CH_{2}F, el aminoalcohol 3 puede obtenerse conforme al método de Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693. Finalmente, el hidroxilo del compuesto 4 se oxida, y el compuesto se trata apropiadamente según la naturaleza de R^{2}. Por ejemplo, si se necesita que en el producto I R^{2} sea un ácido carboxílico, entonces R^{2} en 3 es preferiblemente un éster, y la etapa final del esquema es una hidrólisis (alternativamente, si es éster es un éster terc-butílico, la etapa final es el tratamiento con ácido trifluoroacético).

Los ésteres tricíclicos originales 1 pueden prepararse como se esboza en los esquemas II, III y IV, para 1a, 1b, y 1c, respectivamente, como se muestra a continuación:

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Esquema II

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Los ésteres tricíclicos 1a, en los que X_{2}-X_{1} es N=C, pueden prepararse como se esboza en el esquema II. El aminoácido de partida 5 se convierte en primer lugar en la sal de diazonio, y luego se trata con azida sódica en acetato sódico acuoso, para obtener el azido-ácido 6. El azido-ácido 6 se acopla luego con la lactama 7, mediante condensación del cloruro de ácido de 6 (preparado in situ a partir de la reacción de 6 con cloruro de tionilo), con la sal de litio de la lactama 7 (preparada por reacción de LDA con 7) para proporcionar 8. La reacción de aza-Wittig intramolecular de 8, usando trifenilfosfina y xileno a reflujo, proporciona los ésteres tricíclicos 1a.

Los ésteres tricíclicos 1b, en los que X_{1} y X_{2} son ambos carbono, pueden prepararse como se esboza en el esquema III.

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Esquema III

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El ácido aromático de partida sustituido en orto 9 es bromado en primer lugar (NBS en cloroformo), para proporcionar el bromuro 10. El cloruro de ácido de 10 (preparado por reacción de 10 con cloruro de tionilo) se hacer reaccionar luego con la sal de litio de la lactama 7 (preparada por reacción de LDA con la lactama 7) para obtener 11. La reacción de 11 con fosfito de trietilo proporciona 12, que experimenta una reacción Wittig-Horner intramolecular en presencia de una base en THF, para obtener los ésteres tricíclicos 1b.

Esquema IV

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Los ésteres tricíclicos 1c, en los que X_{2}-X_{1} es C(=O)-N, pueden prepararse por reacción de ésteres heterocíclicos de tipo 13 con anhídridos aromáticos 14, como se esboza en el esquema IV anterior.

Los ésteres heterocíclicos originales 7 y 13 usados en los esquemas II, III y IV, o sus ácidos o derivados, o están disponibles comercialmente o pueden prepararse utilizando métodos habituales. El ácido heterocíclico original 7, en el que n es cero, está disponible comercialmente (ácido piroglutámico). Además, el ácido piroglutámico puede estar sustituido en posición 4 usando diversos electrófilos, conforme a métodos habituales (J. Ezquerra et al. Tetrahedron, 1993, 49, 8665-8678; J.D. Charrier et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 2199-2202). El éster heterocíclico original 7, en el que n es uno, puede prepararse conforme a los procedimientos descritos en la parte experimental de más adelante. El ácido heterocíclico original 7, en el que n es dos, puede prepararse mediante métodos habituales (Perrotti et al., Ann. Chim (Rome), 1966, 56, 1368). Los ésteres heterocíclicos originales 13, en los que n es cero, pueden prepararse mediante métodos de la bibliografía (M.R. Mish et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 35, 8379-8380); y los ésteres heterocíclicos originales 13, en los que n es uno, pueden prepararse mediante métodos de la bibliografía (Y. Nakamura et al., Chem. Lett., 1991, 11, 1953-1956).

Los compuestos de esta invención están diseñados para inhibir las caspasas. Por lo tanto, los compuestos de esta invención pueden analizarse para determinar su capacidad para inhibir la apoptosis, la liberación de IL-1\beta o la actividad de caspasa directamente. Los análisis para cada una de las actividades son conocidos en la técnica, y están descritos más adelante en detalle en la sección de ensayos.

Una realización de esta invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula I o uno de sus derivados farmacéuticamente aceptables, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Si las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención se utilizan en estas composiciones, las sales derivan preferiblemente de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Están incluidas entre tales sales de ácidos las siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, camforato, camforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, y undecanoato. Las sales de bases incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas, tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etcétera.

También, los grupos que contienen nitrógenos básicos pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruro, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfatos de dialquilo, tales como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, dodecilo, miristilo, y estearilo, haluros de aralquilo, tales como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. Se obtienen mediante los cuales productos solubles o dispersables en agua o aceite.

Un "derivado farmacéuticamente aceptable" quiere decir cualquier sal, éster, o sal de un éster, u otro derivado de un compuesto de esta invención farmacéuticamente aceptable que, tras administración a un receptor, es capaz de proporcionar, o directa o indirectamente, un compuesto de esta invención o uno de sus metabolitos o residuos activos de manera inhibidora. Los derivados o profármacos particularmente favoritos son los que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención, cuando tales compuestos se administran a un paciente (por ejemplo, permitiendo que un compuesto administrado por vía oral sea absorbido más fácilmente en la sangre), o que mejoran la administración del compuesto original en un compartimiento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) relativo a la especie original.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en estas composiciones incluyen, pero no están limitados a, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, seroproteínas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas glicerídicas parciales de ácidos grasos vegetales saturados, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógenofosfato disódico, hidrógenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato magnésico, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.

Conforme a una realización preferida, las composiciones de esta invención están formuladas para administración farmacéutica a un mamífero, preferiblemente un ser humano.

Tales composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante inhalación por pulverización, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, o por medio de un reservorio implantado. La expresión "parenteral", como se usa en la presente invención, incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal, o técnicas de infusión. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía oral o intravenosa.

Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden estar formuladas conforme a técnicas conocidas en la técnica que usan agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una disolución o suspensión inyectable estéril, en un diluyente o disolvente atóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse está el agua, disolución de Ringer y disolución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Con este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados glicerídicos son útiles en la preparación de composiciones inyectables, como son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas disoluciones o suspensiones oleosas pueden contener también un diluyente o dispersante que es un alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares, que se usan comúnmente en la formulación de formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables, que incluyen emulsiones y suspensiones. También pueden usarse con fines de formulación otros tensioactivos usados comúnmente, tales como Tweens, Spans, y otros agentes emulsionantes o mejoradores de la biodisponibilidad, que se usan comúnmente en la fabricación de formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables sólidas, líquidas, u otras.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por vía oral, en cualquier forma farmacéutica aceptable por vía oral que incluyen, pero no están limitadas a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o disoluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los excipientes que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes, tales como estearato magnésico. Para administración por vía oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz secado. Cuando se necesitan suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, pueden añadirse también ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes, o colorantes.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado, que sea sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal, y por lo tanto se funda en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas, y polietilenglicoles.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse también por vía tópica, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante administración tópica, que incluyen enfermedades oculares, de la piel, o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos.

La administración tópica para el tracto intestinal inferior puede llevarse a cabo con una formulación de supositorio rectal (véase anteriormente), o en una formulación de enema adecuada. También pueden usarse parches transdérmicos tópicamente.

Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas pueden estar formuladas en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más excipientes. Los excipientes para administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina filante, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden estar formuladas en una loción o crema adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticas pueden estar formuladas como suspensiones micronizadas en disolución salina estéril isotónica con pH ajustado, o, preferiblemente, como disoluciones en disolución salina estéril isotónica con pH ajustado, con o sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticas pueden estar formuladas en una pomada tal como vaselina.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse también mediante aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones se preparan conforme a técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica, y pueden prepararse como disoluciones en disolución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

Las composiciones descritas anteriormente son particularmente útiles en aplicaciones terapéuticas relacionadas con una enfermedad en la que IL-1 actúa como mediador, una enfermedad en la que la apoptosis actúa como mediador, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad ósea destructiva, un trastorno proliferativo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad degenerativa, una enfermedad asociada con la muerte celular, una enfermedad por un excesivo consumo de alcohol, y una enfermedad vírica. Tales enfermedades incluyen uveítis, peritonitis inflamatoria, artrosis, pancreatitis, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda, glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado, esclerodermia, tiroiditis crónica, enfermedad de Graves-Basedow, gastritis autoinmunitaria, diabetes, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutrocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia, hepatitis activa crónica, miastenia grave, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, soriasis, dermatitis atópica, cicatrización, enfermedad injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órganos, osteoporosis, leucemias y trastornos relacionados, síndrome mielodisplásico, enfermedad ósea relacionada con el mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, choque hemorrágico, septicemia, choque septicémico, quemaduras, sigelosis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, enfermedad de Kennedy, enfermedades priónicas, isquemia cerebral, epilepsia, isquemia miocárdica, cardiopatías agudas y crónicas, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, ateroesclerosis, injerto de derivación de la arteria coronaria, atrofia muscular espinal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, encefalitis relacionada con el VIH, envejecimiento, alopecia, daño neurológico debido al ictus, colitis ulcerosa, lesión cerebral traumática, lesión medular, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis G, fiebre amarilla, fiebre del dengue, o encefalitis Japonesa, diversas formas de hepatopatías, nefropatías, nefropatía poliquística, úlcera gástrica y úlcera duodenal asociadas a H. pylori, infección por el VIH, tuberculosis, y meningitis. Los compuestos y composiciones son útiles también en el tratamiento de las complicaciones asociadas con injertos de derivación de la arteria coronaria, y como un componente de la inmunoterapia para el tratamiento de diversas formas de cáncer.

La cantidad de compuesto presente en las composiciones descritas anteriormente debe ser suficiente para provocar una disminución detectable de la gravedad de la enfermedad, o de la actividad de caspasa y/o de la apoptosis celular, determinados mediante cualquiera de los análisis descritos en los ejemplos.

Los compuestos de esta invención son útiles también en métodos para conservar células, tales como los que se pueden necesitar para un trasplante de órganos, o para conservar hemoderivados. Se ha informado de usos similares para inhibidores de caspasas (Schierle et al., Nature Medicine, 1999, 5, 97). El método implica el tratamiento de las células o el tejido que ha de conservarse con una disolución que comprende el inhibidor de caspasas. La cantidad de inhibidor de caspasas que se necesita dependerá de la eficacia del inhibidor para el tipo celular dado, y del tiempo que se necesita para conservar las células de la muerte celular apoptótica.

Conforme a otra realización, las composiciones de esta invención pueden comprender además otro agente terapéutico. Tales agentes incluyen, pero no están limitados a, agentes trombolíticos tales como activador del plasminógeno tisular y estreptocinasa. Cuando se usa un segundo agente, el segundo agente puede administrarse o como forma farmacéutica distinta o como parte de una única forma farmacéutica con los compuestos o composiciones de esta invención.

También debe de entenderse que la posología específica y el tratamiento para cualquier paciente particular dependerán de varios factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de eliminación, combinación de fármacos, y el criterio del médico y la gravedad de la enfermedad particular que se está tratando. La cantidad de ingredientes activos dependerá también del compuesto particular y del otro agente terapéutico, si está presente, en la composición.

En una realización preferida, la invención proporciona el uso de una composición farmacéuticamente aceptable descrita anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero, que tenga una de las enfermedades mencionadas anteriormente. En esta realización, si al paciente se le administra también otro agente terapéutico o inhibidor de caspasas, puede administrarse junto con el compuesto de esta invención en una única forma farmacéutica, o, como forma farmacéutica distinta. Cuando se administra como forma farmacéutica distinta, el otro inhibidor de caspasas o agente puede administrarse antes de, al mismo tiempo que, o después de la administración de una composición farmacéuticamente aceptable que comprenda un compuesto de esta invención.

Para que esta invención se comprenda más completamente, se muestran los siguientes ejemplos preparativos y de ensayo. Estos ejemplos tienen solamente un fin ilustrativo, y no han de interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera.

Experimental

En los siguientes ejemplos, los ^{19}F RMN son con desacoplamiento de ^{1}H, y todos los picos son singletes a menos que se indique de otra manera.

Ejemplo 1 Ácido [3S/R(1S)]-3-(2,3-dihidro-1H-9-oxo-pirrolo[2,1-b]-quinazolin-1-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-pentanoico

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Método A

Éster terc-butílico del ácido (S)-1-(2-azido-benzoil)-5-oxo-pirrolidin-2-carboxílico

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Se trató una disolución agitada del éster terc-butílico de (2S)-5-oxo-prolina (T. Kolasa y M.J. Miller, J. Org. Chem., 1990, 55, 1711-1721) (1,13 g, 6,13 mmoles) en THF anhidro (15 ml), a -78ºC, con LDA (9,19 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 15 min. Se añadió luego gota a gota una disolución de cloruro de 2-azidobenzoílo (T. Okawa, T. Sugimori, S. Eguchi, y A. Kakehi, Heterocycles, 1998, 47, 1, 375-382) (6,13 mmoles) en THF anhidro (5 ml), y la mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 1 h, antes de extinguirse con NH_{4}Cl acuoso saturado. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura ambiente, y la capa orgánica se lavó con NH_{4}Cl acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}), se filtró, y se evaporó, para obtener un aceite que se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo al 20% en hexano), para obtener el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (1,67 g, 82%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,53 (9H, s), 2,14 (1H, m), 2,43 (1H, m), 2,55 (1H, m), 2,69 (1H, m), 4,79 (1H, dd, J = 9,2, 3,2 Hz), 7,19-7,22 (2H, m), 7,36 (1H, m), 7,49 (1H, m). ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 22,1 (CH_{2}), 28,3 (CH_{3}), 31,9 (CH_{2}), 59,3 (CH), 83,0 (C), 118,7 (CH), 125,0 (CH), 127,9 (C), 129,1 (CH), 131,9 (CH), 137,9 (C), 167,5 (C), 170,2 (C), 173,6 (C).

Método B

Éster terc-butílico del ácido (S)-2,3-dihidro-1H-9-oxo-pirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carboxílico

16

Se añadió trifenilfosfina en porciones (1,19 g, 4,54 mmoles) a una disolución de ácido (3S/R)-5-fluoro-4-oxo-3-[((S)-9-oxo-1,2,3,9-tetrahidropirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carbonil)-amino]-pentanoico (1,36 g, 4,12 mmoles) en xileno (60 ml), a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que cesó el desprendimiento de nitrógeno (aproximadamente, 1 h), y luego se mantuvo a reflujo durante 20 h. Los compuestos volátiles se evaporaron, y el residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo al 50% en hexano), para obtener el compuesto del título como un aceite incoloro (1,05 g, 89%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,44 (9H, s), 2,26 (1H, m), 2,51 (1H, m), 3,06 (1H, m), 3,20 (1H, m), 4,99 (1H, dd, J = 9,5, 2,8 Hz), 7,39 (1H, m), 7,59 (1H, m), 7,68 (1H, m), 8,21 (1H, m). ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 24,6 (CH_{2}), 28,3 (CH_{3}), 31,5 (CH_{2}), 60,4 (CH), 83,3 (C), 120,9 (C), 126,7 (CH), 126,9 (CH), 127,2 (CH), 134,7 (CH), 149,5 (C), 159,4 (C), 160,8 (C), 169,3 (C).

Método C

Ácido (S)-2,3-dihidro-1H-9-oxo-pirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carboxílico

17

Una disolución del éster terc-butílico del ácido (1S)-9-oxo-1,2,3,9-tetrahidropirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carboxílico (1,01 g, 3,53 mmoles) en THF (20 ml), se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, y el residuo se disolvió en DCM seco. Este procedimiento se repitió varias veces para retirar el exceso de TFA. La goma se trituró con éster dietílico, se filtró, y se lavó varias veces con éter dietílico, para obtener el compuesto del título como un polvo blanco (620 mg, 76%): ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 2,40 (1H, m), 2,71 (1H, m), 3,19 (1H, m), 3,27 (1H, m), 4,91 (H intercambiable), 5,19 (1H, dd, J = 9,8, 2,8 Hz), 7,53 (1H, m), 7,69 (1H, m), 7,85 (1H, m), 8,23 (1H, m).

Método D

Éster terc-butílico del ácido [3S/R, 4S/R, (1S)]-3-(2,3-dihidro-1H-9-oxo-pirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carboxamido)-5-fluoro-4-hidroxi-pentanoico

18

Una mezcla de ácido (S)-9-oxo-1,2,3,9-tetrahidropirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carboxílico (0,10 g, 0,434 mmoles), éster terc-butílico del ácido 3-amino-5-fluoro-4-hidroxi-pentanoico (0,099 g, 0,48 mmoles), 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) (0,065 g, 0,48 mmoles), y 4-(N,N-dimetilamino)piridina (DMAP) (0,058 g, 0,48 mmoles) en THF anhidro (7 ml), se trató con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (0,092 g, 0,48 mmoles), a 0ºC con agitación. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 18 h, después de las cuales se concentró a presión reducida, para obtener una goma. Ésta se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (AcOEt), para obtener el compuesto del título como un polvo blanco (155 mg, 85%): ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 1,41 (9H, m), 1,99-3,07 (6H, m), 3,53-4,55 (4H, m), 4,91-5,12 (1H, m), 5,37-5,62 (1H, m), 7,42 (1H, m), 7,63 (1H, m), 7,80 (1H, m), 8,08 (1H, m), 8,29-8,57 (1H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6}) \delta -226,5, -226,5, -226,7, -226,7, -227,9, -228,0, -229,0, -229,0.

Método E

Éster terc-butílico del ácido [3S/R,(1S)]-3-(2,3-dihidro-1H-9-oxo-pirrolo[2,1-b]-quinazolin-1-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-pentanoico

19

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Se trató una disolución del éster terc-butílico del ácido [3S/R(1S)]-5-fluoro-4-hidroxi-3-(9-oxo-1,2,3,9-tetrahidropirrolo[2,1-b]-quinazolin-1-carboxamido)-pentanoico (0,147 g, 0,35 mmoles) en DCM anhidro (7 ml), con 1,1,1-triacetoxi-1,1-dihidro-1,2-benziodoxol-3(1H)-ona (0,297 g, 0,70 mmoles), con agitación a 0ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 18 h, después de las cuales se diluyó con DCM y se lavó sucesivamente con Na_{2}SO_{3}.5H_{2}O acuoso al 10%, NaHCO_{3} acuoso saturado, y salmuera. La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y concentró para obtener una goma. Ésta se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (MeOH al 5% en DCM), para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (113 mg, 77%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,35-1,42 (9H, 2s), 2,37-2,62 (2H, m), 2,76-2,82 (1H, m), 2,88-2,97 (1H, m), 3,05-3,12 (1H, m), 3,35-3,42 (1H, m), 4,85-5,30 (4H, m), 7,41-7,89 (4H, m), 8,19-8,23 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 24,1/24,2 (CH_{2}), 28,2/28,3 (CH_{3}), 32,0 (CH_{2}), 36,6 (CH_{2}), 52,8/52,9 (CH), 60,8/60,8 (CH), 82,7/82,7 (C), 84,7/84,8 (CH_{2}F), 120,0 (C), 126,8 (CH), 126,9/127,0 (CH), 127,4 (CH), 135,1 (CH), 149,4/149,5 (C), 159,5 (C), 161,5/161,6 (C), 169,4/169,7 (C), 170,2/170,3 (C), 202,6/202,8 (C); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) \delta -231,9, -232,5.

Método F

Ácido [3S/R(1S)]-3-(2,3-dihidro-1H-9-oxo-pirrolo[2,1-b]-quinazolin-1-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-pentanoico

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Se añadió TFA (4 ml) a una disolución agitada enfriada con hielo del éster terc-butílico del ácido [3S/R(1S)]-5-fluoro-4-oxo-3-(9-oxo-1,2,3,9-tetrahidropirrolo[2,1-b]quinazolin-1-carboxamido)-pentanoico (80 mg, 0,19 mmoles), en DCM anhidro (4 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 0,5 h, luego a temperatura ambiente durante 0,5 h. La mezcla se concentró a presión reducida, y luego el residuo se disolvió en DCM seco. Este procedimiento se repitió varias veces para retirar el exceso de TFA. La goma se trituró con éter dietílico, y el sólido resultante se recogió por filtración. El sólido se lavó varias veces con éter dietílico, para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (65 mg, 94%): IR (sólido) 2366, 1793, 1675, 1557, 1194, 1137 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 2,04-2,13 (1H, m), 2,48-3,18 (5H, m), 4,33-5,42 (4H, m), 7,50 (1H, m), 7,64 (1H, m), 7,82 (1H, m), 8,10 (1H, m), 9,06-9,14 (1H, m), 12,61 (1H, sa); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 24,2/24,3 (CH_{2}) 31,0/31,1 (CH_{2}), 34,6/34,8 (CH_{2}), 52,1/52,6 (CH), 60,0/60,3 (CH), 84,3/84,4 (2xd, J = 177,9, 177,7 Hz, CH_{2}F), 120,47 (C), 126,2 (CH), 126,5 (CH), 127,0 (CH), 134,9 (CH), 149,3 (C), 149,3 (C), 160,1 (C), 160,7/160,8 (C), 170,6 (C), 172,1/172,2 (C), 202,4/202,7 (2xd, J = 14,0, 14,0 Hz, CO); ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6}) \delta -226,6 (t), -226,9 (t), -230,2 (t), -231,6 (t), -233,0 (t), -233,1 (t), -75,5 (s, TFA, 1 eq.); EM (bombardeo con átomos rápidos (FAB+ve), alta resolución (HR)) calculado para C_{17}H_{17}N_{3}O_{5}F (MH^{+}) 362,115224, hallado 362,115448.

Ejemplo 2 Ácido [3S/R(9S)]-5-fluoro-4-oxo-3-(11-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-11H-pirido[2,1-b]quinazolin-9-carboxamido)-penta- noico

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Método G

Éster di-terc-butílico del ácido (S)-piperidin-1,2-dicarboxílico

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A una disolución del éster terc-butílico del ácido (S)-piperidin-2-carboxílico (M. Egbertson y S.J. Danishefsky, J. Org. Chem., 1989, 54, 1, 11-12) (5,78 g, 31,2 mmoles) en CH_{3}CN (30 ml), a 0ºC, se añadió DMAP (763 mg, 6,2 mmoles), seguido de BOC_{2}O (10,22 g, 46,8 mmoles). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante 20 h. Los disolventes se evaporaron a presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo al 10% en hexano). Se obtuvo el compuesto del título como un aceite incoloro, que cristalizó dejándolo estar (8,33 g, 94%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,21-1,32 (2H, m), 1,47-1,48 (18H, 2s), 1,59-1,72 (3H, m), 2,18 (1H, m), 2,85-3,00 (1H, m), 3,89-4,01 (1H, 2d, J = 11,9 Hz), 4,47-4,58 (1H, 2 sa).

Método H

Éster di-terc-butílico del ácido (S)-6-oxo-piperidin-1,2-dicarboxílico

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A una disolución vigorosamente agitada de RuCl_{3}.H_{2}O (2,39 g, 11,5 mmoles) y NaIO_{4} (24,6 g, 115,0 mmoles) en agua (250 ml), se añadió éster di-terc-butílico del ácido (S)-piperidin-1,2-dicarboxílico (8,22 g, 28,8 mmoles) en acetato de etilo (250 ml), a temperatura ambiente. Después de agitar durante 4 h, la mezcla de reacción se separó, y la capa acuosa se lavó con acetato de etilo. A las capas orgánicas combinadas se añadió ^{i}PrOH (2,5 ml), y la agitación continuó durante 2 h para destruir el exceso de RuO_{4}. El precipitado se retiró por filtración a través de un bloque de Celite, y las aguas de filtrado se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo al 30% en hexano), para obtener el compuesto del título como un aceite amarillo pálido, que cristalizó dejándolo estar (6,69 g, 78%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,49 (9H, s), 1,52 (9H, s), 1,75-1,82 (2H, m), 1,97-2,06 (1H, m), 2,15-2,21 (1H, m), 2,41-2,61 (2H, m), 4,59 (1H, dd, J = 3,5 Hz).

Método I

Éster terc-butílico del ácido (S)-6-oxo-piperidin-2-carboxílico

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A una disolución del éster di-terc-butílico del ácido (S)-6-oxo-piperidin-1,2-dicarboxílico (6,30 g, 21,0 mmoles) en acetato de etilo (50 ml), se añadió HCl 1,1 M en acetato de etilo (28,7 ml, 31,5 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, luego se lavó con agua, NaHCO_{3} acuoso saturado, y salmuera. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó, para obtener el compuesto del título como un aceite amarillo que cristalizó dejándolo estar (3,11 g, 74%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,49 (9H, s), 1,74-1,94 (3H, m), 2,18 (1H, m), 2,29-2,44 (2H, m), 3,95-3,98 (1H, m), 6,32 (1H, sa);C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 19,9 (CH_{2}), 25,9 (CH_{2}), 28,4 (CH_{3}), 31,4 (CH_{2}), 55,7 (CH), 83,0 (C), 170,4 (C), 171,9 (C).

Ácido [3S/R(9S)]-5-fluoro-4-oxo-3-(11-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-11H-pirido[2,1-b]quinazolin-9-carboxamido)-penta- noico

25

Éste se preparó a partir del éster terc-butílico del ácido (S)-6-oxo-piperidin-2-carboxílico, usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-F. El producto se aisló como un sólido blanco (139 mg, 95%): IR (sólido) 2361, 2342, 1727, 1665, 1560, 1198, 1126 cm^{-1};H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 1,66-1,78 (2H, m), 2,14-2,17 (2H, m), 2,72 (2H, m), 2,92 (2H, m), 4,52-4,60 (1H, m), 4,80-5,30 (3H, m), 7,45-7,49 (1H, m), 7,58-7,60 (1H, m), 7,79-7,83 (1H, m), 8,06-8,09 (1H, m), 8,91 (1H, m), 12,51 (1H, sa);C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 16,6/16,7 (CH_{2}), 26,2/26,2 (CH_{2}), 31,7/31,8 (CH_{2}), 55,3/55,7 (CH), 120,2/120,2 (C), 126,4 (CH), 126,4 (CH), 126,4 (CH), 134,9 (CH), 147,5 (C), 155,2 (C), 161,8 (C), 171,2 (C); las señales del resto Asp demasiado anchas para ser detectadas por ^{1}H y ^{13}C; ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6}) \delta -233,0 (a).

Ejemplo 3 Ácido [3S/R(3S)]-3-(2,3-dihidro-1H-5-oxo-pirrolo[1,2-b]isoquinolin-3-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-pentanoico

26

Método J

Éster terc-butílico del ácido (S)-1-(2-bromometilbenzoil)-5-oxo-pirrolidin-2-carboxílico

27

Una disolución agitada de ácido \alpha-bromo-toluico (L. Garuti, A. Ferranti, M. Roberti, E. Katz, R. Budriesi y A. Chiarini, Pharmazie, 1992, 47, 295-297) (1,0 g, 4,7 mmoles) en SOCl_{2} (3,4 ml) se calentó a 80ºC durante 2 h. El disolvente se evaporó, y el residuo se disolvió en tolueno. Este procedimiento se repitió varias veces, para retirar el exceso de SOCl_{2}, y para obtener finalmente el cloruro de ácido deseado como un aceite amarillo. Una disolución agitada del éster terc-butílico de (2S)-5-oxo-prolina (T. Kolasa, y M.J. Miller, J. Org. Chem., 1990, 55, 1711-1721) (861 mg, 4,7 mmoles) en THF anhidro (15 ml), se trató a -78ºC con LDA (7,0 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 15 min. Se añadió luego gota a gota una disolución del cloruro de 2-\alpha-bromo-toluoílo, preparado anteriormente, en THF anhidro (5 ml), y la mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 1 h, antes de extinguirse con NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se separó. La capa orgánica se lavó con NH_{4}Cl acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó, para obtener un aceite que se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo al 30% en hexano), para obtener el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (1,46 g, 82%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,55 (9H, s), 2,12-2,19 (1H, m), 2,38-2,59 (2H, m), 2,67-2,76 (1H, m), 4,54 (1H, d, J = 10,5 Hz), 4,70 (1H, d, J = 10,5 Hz), 4,86 (1H, dd, J = 9,0, 3,7 Hz), 7,36-7,50 (4H, m);C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 22,0 (CH_{2}), 28,4 (CH_{3}), 30,5 (CH_{2}), 32,0 (CH_{2}), 59,2 (CH), 83,2 (C), 128,3 (CH), 128,4 (CH), 131,0 (CH), 131,0 (CH), 135,2 (C), 135,5 (C), 169,6 (C), 170,4 (C), 173,6 (C).

Método K

Éster terc-butílico del ácido (S)-1-[2-(dietoxifosforilmetil)-benzoil]-5-oxo-pirrolidin-2-carboxílico

28

Una mezcla del éster terc-butílico del ácido (S)-1-(2-bromometilbenzoil)-5-oxo-pirrolidin-2-carboxílico (898 mg, 2,4 mmoles) y fosfito de trietilo (432 mg, 2,4 mmoles), se calentó a 70ºC durante 4 h. Después de enfriar, el residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo), para obtener el compuesto del título como un aceite viscoso transparente (872 mg, 84%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,17 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,26 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,53 (9H, s), 2,07-2,14 (1H, m), 2,43-2,69 (3H, m), 3,12 (1H, dd, J = 22,4, 15,0 Hz), 3,62 (1H, dd, J = 22,1, 15,0 Hz), 3,84-4,06 (4H, m), 4,87 (1H, dd, J = 8,9, 4,8 Hz), 7,31-7,46 (4H, m).

Método L

Éster terc-butílico del ácido (S)-2,3-dihidro-1H-5-oxo-pirrolo[1,2-b]isoquinolin-3-carboxílico

29

A una disolución del éster terc-butílico del ácido (S)-1-[2-(dietoxifosforilmetil)-benzoil]-5-oxo-pirrolidin-2-carboxílico (865 mg, 1,97 mmoles) en THF (15 ml), a -40ºC, se añadió gota a gota LHMDS 1,0 M en THF (1,97 ml, 1,97 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a -40ºC durante 1 h, se dejó calentar a 0ºC durante 1 h, se agitó a 0ºC durante 1 h, y se dejó calentar a 7ºC durante 30 min, antes de extinguirse con NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (x 2). Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo al 20% en hexano), para obtener el compuesto del título como un aceite incoloro que cristalizó dejándolo estar (286 mg, 51%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,47 (9H, s), 2,29 (1H, m), 2,47 (1H, m), 3,06 (1H, m), 3,19 (1H, m), 5,08 (1H, m), 6,42 (1H, s), 7,41-7,49 (2H, m), 7,63 (1H, m), 8,37 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 25,8 (CH_{2}), 26,9 (CH_{3}), 28,7 (CH_{2}), 60,4 (CH), 81,3 (C), 99,3 (CH), 123,7 (C), 124,6 (CH x 2), 126,5 (CH), 131,2 (CH), 137,3 (C), 142,4 (C), 160,2 (C), 168,7 (C).

Ácido [3S/R(3S)]-3-(2,3-dihidro-1H-5-oxo-pirrolo[1,2-b]isoquinolin-3-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-pentanoico

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Éste se preparó a partir del éster terc-butílico del ácido (S)-2,3-dihidro-(1H)-5-oxo-pirrolo[1,2-b]isoquinolin-3-carboxílico, usando procedimientos similares a los descritos en los métodos C-F. El producto se aisló como un sólido blanco (102 mg, 89%): IR (sólido) 2356, 1742, 1655, 1588, 1209 cm^{-1};H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 2,07-2,12 (1H, m), 2,40-2,93 (3H, m), 3,07-3,18 (2H, m), 4,34-5,45 (4H, m), 6,56-6,57 (1H, 2s), 7,41-7,45 (1H, m), 7,60-7,70 (2H, m), 8,11-8,16 (1H, m), 8,63-9,06 (1H, m), 12,49 (1H, sa); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 26,7/26,8 (CH_{2}) 29,8/29,9 (CH_{2}), 34,6/34,9 (CH_{2}), 52,0/52,7 (CH), 61,4/61,7 (CH), 84,4/84,5 (2xd, J = 177,7, 177,3 Hz, CH_{2}F), 99,6/99,7 (CH), 124,4/124,4 (C), 125,8 (CH), 126,2 (CH), 126,9 (CH), 127,0 (CH), 138,6 (C), 145,4/145,4 (C), 160,6 (C), 171,1/171,2 (C), 172,1/172,2 (C), 202,4/202,9 (CO); ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6}) \delta -226,6 (t), -226,9 (t), -233,1 (t), -233,3 (t); EM (FAB+ve, HR) calculado para C_{18}H_{17}N_{2}O_{5}F (MH^{+}) 361,119975, hallado 361,120247.

Ejemplo 4 Ácido [3S/R(4S)]-5-fluoro-4-oxo-3-(6-oxo-1,2,3,4-tetrahidro-6H-benzo[b]quinolizin-4-carboxamido)-pentanoico

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Éste se preparó a partir del éster terc-butílico del ácido (S)-6-oxo-piperidin-2-carboxílico, usando procedimientos similares a los descritos en los métodos J-L y C-F. El producto se aisló como un sólido blanco (108 mg, 91%): IR (sólido) 2361, 2337, 1736, 1641, 1365, 1217 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 1,66 (2H, m), 2,08-2,13 (2H, m), 2,53-2,94 (4H, m), 4,29-4,69 (1H, m), 5,10-5,44 (3H, m), 6,43-6,46 (1H, m), 7,39-7,43 (1H, m), 7,54-7,56 (1H, m), 7,65-7,71 (1H, m), 8,09-8,14 (1H, m), 8,42-8,96 (1H, m, NH), 12,51 (1H, sa, OH); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 16,7/16,8 (CH_{2}) 26,9/27,0 (CH_{2}), 28,9/29,0 (CH_{2}), 34,5/34,8 (CH_{2}), 52,1/52,8 (CH), 54,9/55,2 (CH), 84,3/84,5 (J = 177,7, 177,1 Hz, CH_{2}F), 103,8/103,8 (CH), 123,9 (C), 125,5 (CH), 125,8 (CH), 127,3 (CH), 132,9 (CH), 137,1 (C), 141,0/141,1 (C), 162,7 (C), 172,1/172,2 (C), 172,2/172,3 (C), 202,6/203,1 (J = 14,6, 13,8 Hz, CO); ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6}) \delta -226,6 (t), -226,9 (t), -233,2 (t), -233,4 (t).

Ejemplo 5 Ácido [3S/R(1S)]-3-(6,11-dioxo-1,2,3,4-tetrahidro-piridazino[1,2-b]ftalazin-1-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-penta- noico

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Método M

Éster metílico del ácido (S)-6,11-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropiridazino[1,2-b]ftalazin-1-carboxílico

33

Una disolución del hidrocloruro del éster metílico del ácido (S)-hexahidropiridazin-3-carboxílico (Y. Nakamura, C.J. Shin, Chem. Lett., 1991, 11, 1953-1956) (370 mg, 2,05 mmoles), anhídrido ftálico (318 mg, 2,15 mmoles), y diisopropiletilamina (291 mg, 2,25 mmoles), se calentó en tolueno (5 ml) durante 2 h. La mezcla de reacción se enfrió luego, y se separó entre acetato de etilo y HCl diluido. La fase orgánica se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó. El residuo se recristalizó en hexano y se filtró, para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (562 mg, 82%): ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 1,59 (1H, m), 1,96 (1H, m), 2,17 (1H, m), 2,55 (1H, m), 3,38 (1H, m), 3,70 (3H, s), 4,89 (1H, m), 5,74 (1H, m), 7,89 (2H, m), 8,16 (2H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 21,2 (CH_{2}), 25,7 (CH_{2}), 46,0 (CH_{2}), 53,8 (CH), 58,1 (CH_{3}), 129,0 (CH), 129,1 (CH), 130,1 (C), 130,6 (C), 135,3 (CH), 135,7 (CH), 160,4 (C), 162,4 (C), 171,7 (C).

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Método N

Ácido (S)-6,11-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropiridazino[1,2-b]ftalazin-1-carboxílico

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A una disolución agitada del éster metílico del ácido (S)-6,11-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropiridazino[1,2-b]ftalazin-1-carboxílico (1,078 g, 3,93 mmoles) en MeOH (35 ml), se añadió KOH (232 mg, 4,12 mmoles) en MeOH (11 ml), a 0ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 20 h, y luego se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo, y la disolución resultante se extrajo con agua. La fase acuosa se acidificó con HCl 2,0 M, y luego se extrajo varias veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El residuo se recristalizó en éter dietílico, y se obtuvo el compuesto del título como un sólido blanco (744 mg, 73%): ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 1,80 (1H, m), 1,97 (1H, m), 2,16 (1H, m), 2,56 (1H, m), 3,36 (1H, m), 4,83-4,88 (2H, m), 5,71 (1H, m), 7,90 (2H, m), 8,26 (2H, m)

Ácido [3S/R(1S)]3-(6,11-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropiridazino-[1,2-b]ftalazin-1-carboxamido)-5-fluoro-9-oxo-pentanoico

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Éste se preparó a partir del ácido (S)-6,11-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropiridazino[1,2-b]ftalazin-1-carboxílico, usando procedimientos similares a los descritos en los métodos D-F. El producto se aisló como un sólido blanco (349 mg, 85%): IR (sólido) 2356, 2337, 1736, 1651, 1617, 1603, 1346, 1226, 1212 cm^{-1};H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 1,62 (1H, m), 1,85 (1H, m), 2,11 (2H, m), 2,33 (1H, m), 2,70 (1H, m), 3,33 (1H, m), 4,54-4,96 (4H, m), 5,48 (1H, m), 7,87-7,94 (2H, m), 8,13-8,19 (2H, m), 8,72 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) (las señales para el resto Asp no son visibles) \delta 18,8 (2 picos, CH_{2}) 24,9/24,1 (CH_{2}), 43,7 (CH_{2}), 56,7/56,8 (CH), 127,4/127,5 (CH_{ar}), 128,5 (2 picos, C_{ar}), 129,2 (C_{ar}), 133,8/134,2 (CH_{ar}), 157,3 (CO), 159,4/159,6 (CO), 170,0 (CO); ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6} + una gota de TFA) \delta -232,7, -232,8; EM (FAB+ve, HR) calculado para C_{18}H_{18}N_{3}O_{6}F (MH^{+}) 392,125789, hallado 392,125420.

Ejemplo de referencia 6

Ácido [3S/R(5S)]-(9,10-dioxo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-1,4,8a,10a-tetraazaantraceno-5-carboxamido)-5-fluoro-4-oxo-3-pentanoico (no incluido en la presente invención)

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Éste se preparó a partir de furo[3,4-b]pirazina-5,7-diona, usando procedimientos similares a los descritos en los métodos M-N y D-F. El producto se aisló como un sólido blanco (150 mg, 90%): IR (sólido) 1818, 1740, 1637, 1542, 1477, 1418, 1402, 1345, 1288, 1220, 1182, 1149, 1134, 1140, 1050, 934 cm^{-1};H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 1,57 (1H, m), 1,85 (1H, m), 2,10 (1H, m), 2,50-2,95 (2H, m, CH_{2} Asp), 3,49 (1H, m), 4,22-4,72 (2,5H, m), 5,12 (1,5H, m), 5,46 y 5,55 (1H, 2 x m), 8,85 (1H, m), 9,16 (2H, d); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 18,8/19,1 (CH_{2}) 24,8/25,2 (CH_{2}), 32,9/33,1/34,5/34,6 (CH_{2}), 43,5/44,0/44,1 (CH_{2} Asp), 52,4/52,6 (CH), 57,3/57,4/57,6 (CH), 84,2/84,3 (J = 178,5, 179,3 Hz, CH_{2}F), 140,9/141,0 (C), 141,5 (C), 149,9 (CH), 150,0/150,1 (CH), 156,2/156,3/156,3 (C), 158,4/158,4/158,8 (C), 169,4/169,5/169,8/169,8 (C), 172,0/173,1 (C=O), 202,4/202,5 (J = 14,6, 14,3 Hz, C=O); ^{19}F RMN (376 MHz, DMSO-d_{6}) \delta -226,54 (t), -227,1 (t), -229,9 (t), -232,7 (t), -232,8 (t).

Ejemplo 7 Análisis enzimáticos

Los ensayos para determinar la inhibición de caspasas están basados en la escisión de un sustrato fluorógeno mediante caspasas-1, -3, -7 ó -8 humanas purificadas recombinadas. Los análisis se llevan a cabo de la misma manera esencialmente que los descritos por García-Calvo et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998), 32608-32613), usando un sustrato específico para cada enzima. El sustrato para la caspasa-1 es Acetil-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-metil-cumarina. El sustrato para las caspasas-3, -7, y -8, es Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metil-cumarina.

La velocidad observada de inactivación enzimática, con una concentración de inhibidor particular, k_{obs}, se computariza mediante ajuste directo de los datos de la ecuación obtenida por Thornberry et al. (Biochemistry 33 (1994), 3943-3939), usando un programa de ordenador de análisis por mínimos cuadrados no lineal (PRISM 2.0; software GraphPad). Para obtener la constante de velocidad de segundo orden, k_{inact}, los valores de k_{obs} se representan frente a sus concentraciones de inhibidor respectivas, y los valores de k_{inact} se calculan posteriormente mediante regresión lineal computarizada.

La tabla 3 siguiente muestra la inhibición de la actividad de caspasa-1 para un compuesto seleccionado de esta invención, determinada por el método anterior.

TABLA 3 Actividad de caspasa-1

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La tabla 4 siguiente muestra la inhibición de la actividad de caspasa-3 para un compuesto seleccionado de esta invención, determinada por el método anterior.

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TABLA 4 Actividad de caspasa-3

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La tabla 5 siguiente muestra la inhibición de la actividad de caspasa-7 para un compuesto seleccionado de esta invención, determinada por los métodos anteriores.

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TABLA 5 Actividad de caspasa-7

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La tabla 6 siguiente muestra la inhibición de la actividad de caspasa-8 para un compuesto seleccionado de esta invención, determinada por los métodos anteriores.

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TABLA 6 Actividad de caspasa-8

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Ejemplo 8 Inhibición de la secreción de IL-1\beta de una población mixta de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

La transformación de pre-IL-1\beta por la caspasa-1 puede determinarse en cultivos celulares usando varias fuentes celulares. Las PBMC humanas obtenidas a partir de donantes sanos proporcionan una población mixta de linfocitos y monocitos, que produce un espectro de interleucinas y citocinas en respuesta a muchas clases de estímulos fisiológicos.

Procedimiento experimental

El compuesto de ensayo se disuelve en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Nº D-2650) para obtener una disolución de partida de 100 mM. Esta se diluye en medio completo que consiste en RPMI que contiene 10% de suero de ternero fetal (STF) inactivado térmicamente (Gibco BRL Nº 10099-141), L-glutamina 2 mM (Sigma, Nº G-7513), 100 U de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina (Sigma Nº P-7539). El intervalo de concentración final del compuesto de ensayo es desde 100 \muM hasta 6 nM en ocho etapas de dilución. La concentración más alta del compuesto de ensayo es equivalente a DMSO al 0,1% en el análisis.

Se aíslan PBMC humanas a partir de capas leucocíticas obtenidas a partir de un banco de sangre, usando centrifugación en un medio de separación de leucocitos Ficoll-Paque (Amersham, Nº 17-1440-02), y el análisis celular se lleva a cabo en una placa estéril de fondo plano de 96 pocillos (Nunc). Cada pocillo contiene 100 \mul de la suspensión celular, 1 x 10^{5} células, 50 \mul de las diluciones del compuesto y 50 \mul de LPS (Sigma Nº L-3012), con una concentración final de 50 ng/ml. Los testigos consisten en células con estimulación +/- LPS, y diluciones sucesivas de DMSO diluido de la misma manera que el compuesto. Las placas se incuban durante 16-18 h a 37ºC en CO_{2} al 5% y una atmósfera de 95% de humedad.

Después de 16-18 h, los sobrenadantes se recogen después de centrifugar las placas a 100 x g, a 18ºC durante 15 min, y se analizan para determinar su contenido de IL-1\beta. La determinación de la IL-1\beta madura en el sobrenadante se lleva a cabo usando los kits Quantikine (R&D Systems) conforme a las instrucciones del fabricante. Se observan concentraciones de IL-1\beta madura de aproximadamente 600-1500 pg/ml para PBMC en pocillos de testigos positivos.

La potencia de inhibición de los compuestos puede representarse mediante un valor de CI_{50}, que es la concentración de inhibidor a la que 50% de la IL-1\beta madura es detectada en el sobrenadante, comparada con los testigos positivos. La tabla 7 muestra la inhibición de la secreción de IL-1\beta por células mononucleares de sangre periférica, para compuestos seleccionados de esta invención, determinada por los métodos anteriores.

TABLA 7 Inhibición de la secreción de IL-1\beta por PBMC

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Ejemplo 9 Análisis de apoptosis inducida por Anti-Fas

La apoptosis celular puede inducirse por la unión del ligando Fas (Fas L) a su receptor, CD95 (Fas). CD95 es uno de una familia de receptores relacionados, conocidos como receptores de muerte, que pueden desencadenar la apoptosis en células por medio de la activación de la cascada enzimática de las caspasas. El proceso se inicia por la unión de la molécula adaptadora FADD/MORT-1 al dominio citoplasmático del complejo ligando-receptor CD95. La caspasa-8 se une luego a FADD y se activa, iniciando una cascada de sucesos que implican la activación de las caspasas de las etapas posteriores, y la apoptosis celular posterior. La apoptosis puede ser inducida también en células que expresan CD95, por ejemplo la estirpe celular de linfoma de linfocitos T Jurkat E6.1, usando un anticuerpo, antes que Fas L, para el entrecruzamiento de CD95 en la superficie celular.

La apoptosis inducida por anti-Fas se desencadena también mediante la activación de la caspasa-8. Esto proporciona la base de un análisis basado en células para cribar compuestos para la inhibición de la vía apoptótica en la que la caspasa-8 actúa como mediador.

Procedimiento experimental

Se cultivan células Jurkat E6.1 en un medio completo que consiste en RPMI-1640 (Sigma No) + 10% de suero de ternero fetal (Gibco BRL Nº 10099-141) + L-glutamina 2 mM (Sigma Nº G-7513). Las células se recogen en la fase logarítmica de crecimiento. Se transfieren 100 ml de células con 5-8 x 10^{5} células/ml a tubos para centrifugación estériles Falcon de 50 ml, y se centrifugan durante 5 minutos a 100 x g, a temperatura ambiente. El sobrenadante se retira, y los sedimentos celulares combinados se resuspenden en 25 ml de medio completo. Las células se cuentan, y se ajusta la densidad a 2 x 10^{6} células/ml con medio completo.

El compuesto de ensayo se disuelve en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Nº D-2650), para obtener una disolución de partida 100 mM. Esta se diluye hasta 400 \muM en medio completo, luego se diluye sucesivamente en una placa de 96 pocillos antes de la adición a la placa de análisis celular.

Se añaden 100 \mul de la suspensión celular (2 x 10^{6} células) a cada pocillo de una placa estéril de tipo "cluster" de fondo redondo de 96 pocillos (Costar Nº 3790). Se añaden a los pocillos 50 \mul de la disolución del compuesto con la dilución apropiada, y 50 \mul de anticuerpo anti-Fas, clon CH-11 (Kamiya Nº MC-060), con una concentración final de 10 ng/ml. Los pocillos testigo se preparan sin anticuerpo y sin compuesto, pero con diluciones sucesivas de DMSO como vehículo testigo. Las placas se incuban durante 16-18 h a 37ºC, en CO_{2} al 5% y 95% de humedad.

La apoptosis de las células se determina mediante determinación cuantitativa de la fragmentación de ADN usando un kit de análisis para la detección de muerte celular "Cell Death Detection Assay" de Boehringer-Mannheim, Nº 1544 675. Después de incubación durante 16-18 h, las placas de análisis se centrifugan a 100 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se retiran 150 \mul del sobrenadante, y se remplazan con 150 \mul de medio completo nuevo. Las células se recogen luego, y se añaden a cada pocillo 200 \mul del tampón de lisis proporcionado en el kit de análisis. Las células se trituran para asegurar una lisis completa, y se incuban durante 30 minutos a 4ºC. Las placas se centrifugan luego a 1900 x g durante 10 minutos, y los sobrenadantes se diluyen 1:20 en el tampón de incubación proporcionado. Se analizan luego 100 \mul de esta disolución, exactamente según las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit. Se mide la DO_{405 nm} 20 minutos después de la adición del sustrato final en un lector de placas SPECTRAmax Plus (Molecular Devices). Se representa la DO_{405 nm} frente a la concentración del compuesto, y se calculan los valores de CI_{50} usando el programa de ajuste de curvas SOFTmax Pro (Molecular Devices), usando la opción de ajuste de cuatro parámetros.

La tabla 8 muestra los resultados de la actividad de compuestos seleccionados de esta invención en el análisis de apoptosis inducida por FAS.

TABLA 8 Actividad en el análisis de apoptosis inducida por FAS

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Se apreciará que el alcance de esta invención ha de definirse por las reivindicaciones adjuntas antes que por las realizaciones específicas, que se han representado a modo de ejemplo.

Claims

1. Un compuesto de fórmula I:

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o uno de sus derivados farmacéuticamente aceptables, en el que:

R^{1} es -CH_{2}Y; en el que Y es F

\quad: R^{2} es CO_{2}H, o un éster, o amida, en el que los ésteres de ácidos carboxílicos R^{2} se seleccionan de un grupo alifático C_{1-12}, seleccionado de alquilo C_{1-6} o cicloalquilo C_{3-10}, arilo, seleccionado de fenilo, aralquilo, seleccionado de bencilo o fenetilo, heterociclilo o heterociclilalquilo, por lo cual los anillos de heterociclilo se seleccionan de anillos heterocíclicos de 5-6 miembros que tienen uno o dos heteroátomos, seleccionados de piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo.

\quad: y las amidas de ácidos carboxílicos R^{2} pueden ser primarias, secundarias o terciarias, los sustituyentes adecuados sobre el nitrógeno de la amida son, uno o más grupos independientemente seleccionados de los grupos alifático, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo descritos anteriormente para su alcohol del éster R^{2};

X_{2}-X_{1} es N=C, CH=C o C(=O)-N;

El anillo C es un anillo de benceno fusionado sin sustituir;

n es 0, o 1; y

\quad: cada carbono metilénico en el anillo A está opcional e independientemente sustituido con =O, o con uno o más de halógeno, alquilo C_{1-4}, o alcoxi C_{1-4}.

2. El compuesto de la reivindicación 1, dicho compuesto seleccionado de los compuestos:

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3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. Un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para tratar un estado o enfermedad en mamíferos que se mitiga por tratamiento con un inhibidor de caspasas.

5. Un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para tratar una enfermedad o estado, seleccionado de una enfermedad en la que IL-1 actúa como mediador, una enfermedad en la que la apoptosis actúa como mediador, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad ósea destructiva, un trastorno proliferativo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad degenerativa, una enfermedad por un excesivo consumo de alcohol, una enfermedad vírica, o una enfermedad asociada con la muerte celular.

6. Un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para tratar una enfermedad o estado seleccionado de uveítis, peritonitis inflamatoria, artrosis, pancreatitis, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda, glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado, esclerodermia, tiroiditis crónica, enfermedad de Graves-Basedow, gastritis autoinmunitaria, diabetes, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutrocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia, hepatitis activa crónica, miastenia grave, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, soriasis, dermatitis atópica, cicatrización, enfermedad injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órganos, osteoporosis, leucemias y trastornos relacionados, síndrome mielodisplásico, enfermedad ósea relacionada con el mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, choque hemorrágico, septicemia, choque septicémico, quemaduras, sigelosis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, enfermedad de Kennedy, enfermedades priónicas, isquemia cerebral, epilepsia, isquemia miocárdica, cardiopatías agudas y crónicas, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, ateroesclerosis, injerto de derivación de la arteria coronaria, atrofia muscular espinal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, encefalitis relacionada con el VIH, envejecimiento, alopecia, daño neurológico debido al ictus, colitis ulcerosa, lesión cerebral traumática, lesión medular, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis G, fiebre amarilla, fiebre del dengue, o encefalitis Japonesa, diversas formas de hepatopatías, nefropatías, nefropatía poliquística, úlcera gástrica y úlcera duodenal asociadas a H. pylori, infección por el VIH, tuberculosis, meningitis, un tratamiento para complicaciones asociadas con injertos de derivación de la arteria coronaria, o una inmunoterapia para el tratamiento de diversas formas de cáncer.

7. Un compuesto conforme a la reivindicación 5 para tratar complicaciones asociadas con injertos de derivación de la arteria coronaria.

8. Un método para conservar células, comprendiendo dicho método la etapa de bañar las células en una disolución de un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. Un método para conservar un órgano para trasplante de órganos, o para conservar un hemoderivado, que comprende la etapa de bañar el órgano o el hemoderivado en una disolución de un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Un compuesto conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para inmunoterapia para el tratamiento de cáncer.