ES2296742T3 - Inhibidores de caspasa de tipo carbamato y sus usos. - Google Patents

Inhibidores de caspasa de tipo carbamato y sus usos. Download PDF

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ES2296742T3 ES01922868T ES01922868T ES2296742T3 ES 2296742 T3 ES2296742 T3 ES 2296742T3 ES 01922868 T ES01922868 T ES 01922868T ES 01922868 T ES01922868 T ES 01922868T ES 2296742 T3 ES2296742 T3 ES 2296742T3
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David Bebbington
Jean-Damien Charrier
David c/o Vertex Pharmaceuticals Inc. KAY
Ronald Knegtel
Julian c/o Vertex Pharmaceuticals Inc. GOLEC
Michael C/O Vertex Pharmaceuticals Inc. Mortimore
John c/o Vertex Pharmaceuticals Inc. STUDLEY
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Vertex Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un compuesto de fórmula I:** ver fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la cual: Z es oxígeno o azufre; R1 es hidrógeno, -CHN2, R, -CH2OR, -CH2SR o -CH2Y; R es un grupo alifático C1-12, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo; Y es un grupo lábil electronegativo seleccionado entre F, Cl, Br, I, arilo y grupos alquilsulfoniloxi, trifluorometanosulfoniloxi, OR'''', SR'''', -OC=O(R'''') o -OPO(R6)(R7), en los que R'''' es un grupo alifático, un grupo arilo, un grupo aralquilo, un grupo carbocíclico, un grupo alquil-carbocíclico, un grupo heterocíclico o un grupo alquil-heterocíclico; en el que R6 y R7 se seleccionan independientemente entre R'''' o OR''''; R2 es CO2H, CH2CO2H o sus ésteres o amidas o CONHSO2-(alquilo); R3 se selecciona entre H, una cadena lateral de un alfa-aminoácido natural o un grupo sustituido o sin sustituir que tiene un peso molecular hasta 140 daltones seleccionado entre un grupo alifático, arilo, aralquilo o un anillo heterocíclico o heterocicloalquilo en el que el quedicho anillo heterocíclico o de heterocicloalquilo es un sistema de anillos monocíclico o policíclico saturado o insaturado de tres a nueve miembros en el que cada anillo contiene hasta tres heteroátomos seleccionados entre O, N o S; y R4 y R5 tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos mono-, bi- o tri-cíclico que tiene 1-6 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno o azufre.

Description

Inhibidores de caspasa de tipo carbamato sus usos.
Campo de la invención
Esta invención es del campo de la química médica y se refiere a nuevos compuestos, y sus composiciones farmacéuticas, que inhiben las caspasas que median en la apoptosis celular y la inflamación. La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas y el uso de los compuestos de esta invención para la preparación de composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades en las que está implicada la actividad de caspasas.
Antecedentes de la invención
La apoptosis o muerte celular programada es un mecanismo principal mediante el cual los organismos eliminan células no deseadas. La desregulación de la apoptosis, ya sea la apoptosis excesiva o el fallo para experimentarla, ha estado implicada en un cierto número de enfermedades como cáncer, trastornos inflamatorios agudos y autoinmunes, enfermedades isquémicas y ciertos trastornos neurodegenerativos (véase de forma general Science, 1998, 281, 1283-1312; Ellis et al., Ann. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).
Las caspasas son una familia de enzimas proteasas de cisteína que son mediadores claves en las trayectorias de señalización para la apoptosis y la desagregación celular (Thornberry, Chem. Biol., 1998, 5, R97-R103). Estas trayectorias de señalización varían dependiendo de estímulo celular, pero parece que todas las trayectorias de apoptosis convergen en una trayectoria efectiva común que conduce a la proteolisis de proteínas claves. Las caspasas están involucradas tanto en la fase efectiva de la trayectoria de señalización como adicionalmente en dirección ascendente en su inicio. Las caspasas de dirección ascendente involucradas en acontecimientos de inicio resultan activadas y, a su vez, activan otras caspasas que están involucradas en las fases posteriores de la apoptosis.
La caspasa-1, la primera caspasa identificada, es conocida también como enzima de conversión de interleucina o "ICE". La caspasa-1 convierte la interleucina-1\beta precursora ("pIL-1\beta") en la forma activa pro-inflamatoria mediante escisión específica de pIL-1\beta entre Asp-116 y Ala-117. Aparte de la caspasa-1 hay también otras once caspasas humanas conocidas, todas las cuales se escinden específicamente en residuos de aspartilo. Se observa también que tienen requisitos restringidos para al menos cuatro residuos de aminoácidos en el lado N-terminal del sitio de escisión.
Las caspasas han sido clasificadas en tres grupos dependiendo en la secuencia de aminoácidos que sea preferida o principalmente reconocida. El grupo de las caspasas que incluye caspasas 1, 4 y 5 se ha mostrado que prefieren aminoácidos aromáticos hidrófobos en la posición 4 del lado N-terminal del sitio de escisión. Otro grupo que incluye las caspasas 2, 3 y 7 reconocen residuos de aspartilo en las dos posiciones 1 y 4 en el lado N-terminal del sitio de escisión y, preferentemente, una secuencia de Asp-Glu-X-Asp. Un tercer grupo, que incluye las caspasas 6, 7, 8 y 10, tolera muchos aminoácidos en la secuencia de reconocimiento primario, pero parece que prefiere residuos con cadenas laterales alifáticas ramificadas como valina y leucina en la posición 4.
Las caspasas han sido divididas en grupos también según su función percibida. La primera subfamilia consiste en las caspasas-1 (ICE), 4 y 5. Estas caspasas se ha mostrado que están involucradas en el tratamiento de citoquinas pro-inflamatorias y, por lo tanto, desempeñan una función importante en la inflamación. La caspasa-1, la enzima más estudiada de esta clase, activa el precursor de IL-\beta mediante escisión proteolítica. Por lo tanto, esta enzima desempeña una función clave en la respuesta inflamatoria. La caspasa-1 está involucrada también en el tratamiento del factor inductor de interferón gamma (IGIF o IL-18) que estimula la producción de interferón gamma, un inmunorregulador clave que modula la presentación de antígenos, la activación de células P y la adhesión celular.
Las caspasas restantes constituyen la segunda y tercera subfamilias. Estas enzimas son de importancia crucial en las trayectorias de señalización intracelulares que conducen a la apoptosis. Una subfamilia consiste en las enzimas involucradas en acontecimientos iniciadores en la trayectoria apoptótica que incluye la transducción de señales desde la membrana de plasma. Los miembros de esta subfamilia incluyen las caspasas 2, 8, 9 y 10. La otra subfamilia, que consiste en las caspasas efectoras 3, 6 y 7, está involucrada en los acontecimientos finales de escisión en dirección descendente que dan lugar a la descomposición sistemática y la muerte de la célula por apoptosis. Las caspasas involucradas en la transducción de señales en dirección ascendente activan las caspasas en dirección descendente, que seguidamente incapacitan los mecanismos de reparación de DNA, fragmentan DNA, desmantelan la citoestructura celular y finalmente fragmentan la célula.
Ha sido determinada una secuencia de cuatro aminoácidos principalmente reconocida por las caspasas para sustratos de enzimas. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272, 96779682, (1997); Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272, 17907-17911, (1997). El conocimiento de la secuencia de cuatro aminoácidos principalmente reconocida por las caspasas ha sido usado para diseñar y inhibidores de caspasas. Han sido preparados inhibidores de tetrapéptidos reversibles que tienen la estructura CH_{3}CO-[P4]-[P3]-[P2]-CH(R)CH_{2}CO_{2}H en la que P2 a P4 representan una secuencia óptima de reconocimiento de aminoácidos y R es un aldehído, nitrilo o cetona capaz de unirse al grupo sulfhídrico de cisteína de caspasa. Rano y Thornberry, Chem. Biol. 4, 149-155 (1997); Mjalli, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689-2692 (1993); Nicholson et al., Nature 376, 37-43 (1995). Han sido preparados inhibidores irreversibles basados en la secuencia de reconocimiento de tetrapéptidos análogos en los que R es una aciloximetilcetona-COCH_{2}OCOR'. R' está ilustrada por un grupo fenilo opcionalmente sustituido como 2,6-diclorobenzoiloxi y R es COCH_{2}R en el que R es un grupo lábil como F o Cl. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J Med. Chem. 37, 563-564 (1994).
La utilidad de los inhibidores de caspasas para tratar una diversidad de estados de enfermedad de mamíferos asociados con un aumento de la apoptosis celular ha sido demostrada usando inhibidores péptidos de caspasas. Por ejemplo, en modelos de roedores, los inhibidores de caspasas se ha mostrado que reducen el tamaño del infarto e inhiben la apoptosis de cardiomiocitos después de un infarto de miocardio, para reducir el volumen de la lesión y el déficit neurológico que resulta de la apoplejía, para reducir la apoptosis post-traumática y el déficit neurológico en una lesión de traumatismo cerebral, para ser eficaz en el tratamiento de la destrucción fulminante del hígado y para mejorar la supervivencia después de un choque endotóxico. Yaoita et al., Circulation, 97, 276 (1998); Endres et al., J Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238, (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al., J Neuroscience, 17, 7415 (1997); Rodriguez et al., J. Exp. Med., 184, 2067 (1996); Grobmyer et al., Mol. Med., 5, 585 (1999).
En general, los inhibidores péptidos anteriormente descritos son muy potentes contra algunas de las enzimas de caspasas. Sin embargo, esta potencia no siempre se ha reflejado en los modelos celulares de la apoptosis. Además, los inhibidores péptidos se caracterizan normalmente por propiedades farmacológicas no deseables como una absorción oral escasa y un metabolismo rápido. Plattner and Norbeck, in Drug Discovery Technologies, Clark and Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, England, 1990).
Hay informes de inhibidores de péptidos modificados. Los documentos WO 91-15577 y WO 93/05071 describen inhibidores ICE péptidos de fórmula:
Z-Q_{2}-Asp-Q_{1}
en la que Z es un grupo protector N-terminal; Q_{2} es 0 a 4 aminoácidos y Q_{1} es un grupo lábil electronegativo.
El documento WO 99/18781 describe inhibidores de caspasas dipéptidos de fórmula:
1
en la que R_{1} es un grupo protector N-terminal; AA es un residuo de un \alpha-aminoácido o \beta-aminoácido natural; R_{2} es hidrógeno o CH_{2}R_{4} en que R_{4} es un grupo lábil electronegativo y R_{3} es alquilo o hidrógeno.
El documento WO 99/47154 describe inhibidores dipéptidos de caspasas de fórmula:
2
en la que R_{1} es un grupo protector N-terminal; AA es un residuo de un \alpha-aminoácido o \beta-aminoácido no natural y R_{2} es alquilo opcionalmente sustituido o hidrógeno.
El documento WO 00/023421 describe inhibidores de la apoptosis de acil-dipéptidos (sustituidos) que tienen la fórmula:
3
en la que n es 0, 1 ó 2; q es 1 ó 2; A es un residuo de cierto aminoácido natural o no natural; B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio, alquilo C_{1-10} de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, naftilo, naftilo sustituido, 2-benzosazolilo, 2-oxazolilo sustituido, (CH_{2})_{m}-cicloalquilo, (CH_{2})_{m}-fenilo, (CH_{2})_{m}-(fenilo sustituido), (CH_{2})_{m}-(1- ó 2-naftilo), (CH_{2})_{m}-heteroarilo, halometilo, CO_{2}R^{13,} CONR^{14}R^{15}, CH_{2}ZR^{16}, CH_{2}OCO-arilo, CH_{2}OCO-(arilo sustituido), CH_{2}OCO-(heteroarilo), CH_{2}OCO-(heteroarilo sustituido) o C_{2}OPO(R^{17})R^{1}8 en los que R^{13}, R^{14}, R^{15}, R^{16}, R^{17} y R^{18} se definen en la solicitud; R^{2} se selecciona entre un grupo que contiene hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, (CH_{2})_{m}-NH_{2}; R_{3} es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)-alquilo, fenilalquilo o fenilalquilo sustituido; X es CH_{2}, C-O, O, S, NH, C=ONH o CH_{2}gOCONH; y Z es un átomo de oxígeno o azufre.
El documento WO 97/24339 describe inhibidores de la enzima conversora interleucina-1\beta de fórmula:
4
en la que R^{1} representa H, alquilo, alcoxi, un carbociclo, un heterociclo y otros diversos grupos; AA^{1} y AA^{2} son enlaces sencillos o aminoácidos e Y representa un grupo de fórmula:
5
en la que el anillo Tet representa un anillo de tetrazol; y Z representa entre otros, alquileno, alquenileno O, S, SO y SO_{2}.
El documento EP 618223 describe inhibidores ICE de fórmula:
R-A_{1}-A_{2}-X-A_{3}
en la que R es H, un grupo protector o un anillo opcionalmente sustituido PhCH_{2}O; A_{1} es un residuo de \alpha-hidroxiácido o \alpha-aminoácido o A_{1} y A_{2} forman conjuntamente un pseudodipéptido o un residuo mimético de dipéptido; X es un residuo derivado de Asp en el que A_{3} es CH_{2}X_{1}COY_{1}, CH_{2}OY_{2}, CH_{2}SY_{3} o CH_{2}(CO)_{m}Y_{6} en el que X_{1} es O o S, m es 0 ó 1 e Y_{1}, Y_{2}, Y_{3} e Y_{6} son grupos alifáticos o arilo cíclicos opcionalmente sustituidos.
El documento WO 98/16502 describe entre otros, inhibidores ICE de fórmula:
6
en la que R_{1} y R_{2} son como se describieron en la solicitud y el anillo de pirrolidina está sustituido por diversos grupos.
Aunque ha sido expuesto un cierto número de inhibidores de caspasas, no está claro si poseen las propiedades farmacológicas apropiadas para ser terapéuticamente útiles. Por lo tanto, hay una necesidad continuada de inhibidores de caspasas de moléculas pequeñas que sean potentes, estables y penetren las membranas para proporcionar una inhibición eficaz de la apoptosis in vivo. Estos compuestos serían extremadamente útiles para tratar las enfermedades anteriormente mencionadas en las que las enzimas caspasas desempeñan una función.
Sumario de la invención
Se ha encontrado ahora que los compuestos de esta invención y sus composiciones farmacéuticas son eficaces como inhibidores de caspasas y de la apoptosis celular. Estos compuestos tienen la fórmula general I:
7
en la cual:
Z es oxígeno o azufre;
R^{1} es hidrógeno, -CHN_{2}, R, -CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y o -CH_{2}Y;
R es un grupo alifático C_{1-12}, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo;
Y es un grupo lábil electronegativo;
R^{2} es CO_{2}H, CH_{2}CO_{2}H o sus ésteres o amidas (o CONHSO_{2}-(alquilo);
R^{3} es un grupo capaz de ajustarse en el subsitio S2 de una caspasa;
R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos mono-, bi- o tri-cíclico que tiene 1-6 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno o azufre.
Los compuestos de esta invención tienen propiedades de inhibición sobre una gama de dianas de caspasas con una buena eficacia en modelos celulares de apoptosis. Además, estos compuestos tienen una buena penetración celular y propiedades farmacocinéticas y, como consecuencia de su potencia, tienen una buena eficacia contra enfermedades en las que están implicadas las caspasas.
Descripción detalla de la invención
Esta invención proporciona nuevos compuestos y sus sales farmacéuticamente aceptables, que son útiles como inhibidores de caspasas. La invención proporciona también métodos para usar los compuestos para inhibir la actividad de caspasas y para tratar estados de enfermedad mediados por caspasas. Estos compuestos tienen la fórmula general I:
8
en la cual:
Z es oxígeno o azufre;
R^{1} es hidrógeno, -CHN_{2}, R, -CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
R es un grupo alifático C_{1}-_{12}, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo;
Y es un grupo lábil electronegativo;
R^{2} es CO_{2}H, CH_{2}CO_{2}H o sus ésteres o amidas (o CONHSO_{2}-(alquilo));
R^{3} es un grupo capaz de ajustarse en el subsitio S2 de una caspasa;
R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos mono-, bi- o tri-cíclicos que tiene 1-6 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno o azufre.
Como se usan en la presente memoria descriptiva, deben ser aplicadas las siguientes definiciones salvo que se indique otra cosa. El término "alifático" cuando se usa en la presente memoria descriptiva significa hidrocarburos de C_{1}-C_{12} de cadena lineal o ramificada que están completamente saturados o que contienen una o más unidades de insaturación. Por ejemplo los grupos alifáticos adecuados incluyen alquilo lineal, ramificado o cíclico y sustituido o sin sustituir, grupos alquenilo o alquinilo y sus híbridos como (cicloalquil)alquilo o, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo. El término alquilo usado solo o como una parte de un resto mayor se refiere a cadenas tanto lineales como ramificadas que contienen uno a doce átomos de carbono. Cuando el término alquilo es usado como parte de un resto mayor, como en aralalquilo o heteroaralquilo, la parte alquílica concentrada preferentemente uno a 6 átomos de carbono. El término "halógeno" significa F, Cl, Br, o I. El término "arilo" se refiere a grupos de anillos aromáticos monocíclicos o policíclicos que tienen cinco a catorce átomos como fenilo, naftilo y antrilo. La expresión "grupo heterocíclico" se refiere a sistemas de anillos monocíclicos o policíclicos saturados e insaturados que contienen uno o más heteroátomos y un tamaño de los anillos de res a nueve como, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, dioxolanilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo, piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo, tritianilo, indolizinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, indazolilo, bencimidazolilo, benztiazolilo, purinilo, quinolizinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 1,8-naftiridinilo, pteridinilo, quinuclidinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, o fenoxazinilo. "Heteroarilo" se refiere un anillo heterocíclico que es aromático. Debe entenderse que los compuestos de esta invención están limitados a los que pueden existir en la naturaleza como compuestos químicos estables.
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La expresión "grupo carbocíclico" se refiere a sistemas de anillos carbonados monocíclicos o policíclicos saturados de 3 a 14 átomos de carbono que pueden estar condensados a grupos arilo o heterocíclicos. Ejemplos que incluyen ciclohexilo, ciclopentilo, ciclobutilo, ciclopropilo, indanilo, tetrahidronaftilo y similares.
Un grupo alifático alquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo o carbociclilo, usado solo o como parte de un resto mayor, se refiere a grupos sustituidos o sin sustituir. Cuando están sustituidos, estos grupos pueden contener uno o más sustituyentes. Ejemplos de sustituyentes adecuados incluyen halógeno, -R, -OR, -OH, -SH, -SR, OH protegido (como aciloxi), fenilo (Ph), Ph sustituido, -OPh, -OPh sustituido, -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -NHR, -N(R)_{2}, -NHCOR, -NHCONHR, -NHCON(R)_{2}, -NRCOR, -NHCO_{2}R, -CO_{2}R, -CO_{2}H, -COR, -CONHR, -CON(R)_{2}, -S(O)_{2}R, -SONH_{2}, -S(O), -SO_{2}NHR, -NHS(O)_{2}R, =O, =S, =NNHR, =NNR_{2}, =N-OR, =NNHCOR, =NNHCO_{2}R, =NNHSO_{2}R, o =NR en los que R es un grupo alifático o un grupo alifático sustituido.
Un átomo de nitrógeno sustituible en un anillo heterocíclico puede estar opcionalmente sustituido. Los sustituyentes adecuados en el átomo de nitrógeno incluyen R, COR, S(O)_{2}R y CO_{2}R, en los que R es un grupo alifático o un grupo alifático sustituido.
El átomo de nitrógeno y azufre puede estar en su forma oxidada y el átomo de nitrógeno puede estar en una forma cuaternizada.
La expresión "grupo lábil electronegativo" tiene la definición conocida por los expertos en la técnica (Véase March, Advanced Organic Chemistry, 4th Edition, John Wiley & Sons, 1992). Ejemplos de grupos lábiles electronegativos incluyen halógenos como F, Cl, Br, I, arilo y grupos alquilsulfoniloxi, trifluorometanosulfoniloxi, OR, SR, -OC=O(R), -OPO(R^{6})(R^{7}), en los que R es un grupo alifático, un grupo arilo, un grupo aralquilo, un grupo carbocíclico, un grupo alquil-carbocíclico, un grupo heterocíclico o un grupo alquil-heterocíclico y R^{6} y R^{7} se seleccionan independientemente entre R o OR.
Cuando el grupo R^{2} está en la forma de un éster o amida, los presentes compuestos experimentan una escisión metabólica a los correspondientes ácidos carboxílicos, que son los inhibidores de caspasas activos. Como experimentan una escisión metabólica, la naturaleza precisa del grupo éster o amida no es crítica para el trabajo de esta invención. La estructura del grupo R^{2} puede variara en la gama desde la dietil-amida relativamente sencilla hasta un éster esteroidal. Ejemplos de esteres de ácidos R^{2}-carboxílicos incluyen, pero sin limitación, los alifáticos C_{1-12} como alquilo C_{1}-_{6} o cicloalquilo C_{3}-_{10}, arilo como fenilo, aralquilo como bencilo o fenetilo, heterociclilo o heterociclilalquilo. Ejemplos de anillos R^{2}- heterocíclicos adecuados incluyen, pero sin limitación anillos heterocíclicos de 5-6 miembros que tienen uno o dos heteroátomos como piperinidilo, piperazionilo o morfolinino.
Las amidas de los ácidos R^{2}-carboxilicos pueden ser primarias, secundarias o terciarias. Los sustituyentes adecuados en el átomo de nitrógeno de la amina incluyen, pero sin limitación, uno o más grupos independientemente seleccionados entre grupos alifáticos, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo anteriormente descritos para el éster-alcohol de R^{2}. Análogamente, otros profármacos están incluidos dentro del alcance de esta invención. Bradley D. Anderson, "Prodrugs for Improved CNS Delivery" in Advanced Drug Delivery Reviews (1996), 19, 171-202.
Los isoésteres o bioisoésteres de ácidos carboxílicos, esteres y amidas de R^{2} resultan del intercambio de un átomo o grupo de átomos para crear un nuevo compuesto con propiedades biológicas análogas a las del ácido carboxílico o éster parental. La sustitución bioisoestérica puede estar fisicoquímica o topológicamente basada. Un ejemplo de sustitución isoesterica para un ácido carboxílico es CONHSO_{2}-(alquilo) como CONHSO_{2}Me.
R^{3} puede ser cualquier grupo capaz de ajustarse en la subunidad S2 de una caspasa. Estos grupos son conocidos a partir de los muchos inhibidores de caspasas que han sido descritos (véase los documentos WO 91/15577, WO 93/05071, WO 99/18781, WO 99/47154, WO 00/023421, WO 9724339, EP 618223, WO 9816502, todos los cuales son descritos con anterioridad). Además de ello, las estructuras de varias de las enzimas de caspasas que incluyen los subsitios S-2 son también conocidas. Las referencias a la estructura de las caspasas incluyen las siguientes: Blanchard H, et al., J. Mol. Biol. 302 (1), 9-16 (2000); Wei Y, et al., Chem. Biol. 7 (6): 42332 (2000); Lee D, et al., J Biol. Chem. 275 (21): 16007-14 (2000); Blanchard H, et al., Structure Fold Des. 7 (9): 1125-33 (1999); Okamoto Y, et al, Chem. Farm. Bull. (Tokyo) 47 (1): 11-21 (1999); Margolin N, et al, J. Biol. Chem. 272 (11): 7223-8 (1997); Walquer NP, et al., Cell 78 (2): 343-52 (1994); and Wilson KP, et al., Nature 370 (6487): 270-5 (1994).
El que un grupo encaje en el subsitio s2 dependerá de la caspasa particular que este siendo considerada. El tamaño del subsitio variará en el intervalo desde el subsitio S-2 pequeño de caspasa-3 que permite un grupo hasta el tamaño de un grupo alifático de C_{4} hasta un subsitio relativamente grande que permite un grupo que tenga un peso molecular de hasta 140 daltones, como un grupo naftilo. El tamaño, junto con la naturaleza electrónica del grupo R^{3}, ejercerán una influencia sobre la selectividad para caspasas del inhibidor. A partir de las referencias anteriormente proporcionadas, un experto en la técnica podría determinar fácilmente si un grupo es capaz de encajar favorablemente en un subsitio S-2 de una caspasa, por ejemplo, usando programas de modelación molecular estándar como Quanta o Macromodel.
Los grupos R^{3} incluyen los que son seleccionados entre hidrógeno, una cadena lateral de un \alpha-aminoácido natural o un grupo sustituido o sin sustituir que tiene un peso molecular hasta aproximadamente 140 daltones seleccionado entre grupos alifáticos, arilo, aralquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo. Ejemplos de grupos alifáticos R^{3} incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, ciclobutilo, pentilo, ciclopentilo, hexilom y ciclohexil. Ejemplos grupos arilo de R^{3} incluyen fenilo, indenilo y naftilo. Ejemplos de grupos heterocíclicos de R^{3} incluyen pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperidinilo y quinuclidinilo. Ejemplos de grupos heteroarilo de R^{3} incluyen furanilo, tienilo, pirrolilo, oxazol, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, furazanilo, triazolilo, tiadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofeno, indazolilo, bencimidazolilo, benztiazolilo, purinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinolizinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, pteridinilo, cromanilo e isocromanilo. Cada grupo puede contener uno o más sustituyentes, como se describió anteriormente.
R_{4} y R_{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que intervine forman sistemas de anillos heterocíclicos mono-, bi- o tri-cíclicos que tienen 1-6 heteroátomos, preferentemente 1-4 heteroátomos. Estos anillos incluyen indol sustituido o sin sustituir, isoindol, indolina, indazol, purina, dihidropiridina, bencimidazol, imidazol, imidazolina, pirrol, pirrolidina, pirrolina, pirazol, pirazolina, pirazolidina, triazol, piperidina, morfolina, tiomorfolina, piperazina, carbazol, fenotiazina, fenoxazina, dihidrofenazina, dihidrocinolina, dihidroquinoxalina, tetrahidroquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidronaftiridina, tetrahidronaftiridina, dihidroacridina, 5H-dibenzo[b,f]azepina, 10,11-dihidro-5H-dibenzo[b,f]azepina, \beta-carbolina, pirido[4,3-b]indol,2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diazaantraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-b]pirrol, o dihidrofenantridina. Los sustituyentes adecuados en R^{4} o R^{5} incluyen uno o más grupos independientemente seleccionados entre un halógeno, -R, -OR, -OH, -SH, -SR, OH protegido (como aciloxi), fenilo (Ph), Ph sustituido, -OPh, -OPh sustituido, -NO_{2}, -CN, -NH_{2}, -NHR, -N(R)_{2}, -NHCOR, -NHCONHR, -NHCON(R)_{2},
-NRCOR, -NHCO_{2}R, -CO_{2}R, -CO_{2}H, -COR, -CONHR, -CON (R)_{2}, -S(O)_{2}R, -SONH_{2},-S (O)R, -SO_{2}NHR o -NHS (O)_{2}R, en los que cada R se selecciona independientemente entre un grupo alifático o un grupo alifático sustituido.
Los compuestos de esta invención en los que R^{2} es COOH son gamma-cetoácidos, que pueden existir en solución en la forma 1 abierta o la forma 2 de hemicetal ciclado. La representación de la presente memoria descriptiva para cualquier forma isómera está previsto que incluya la otra. Análogamente, la ciclación se puede producir también cuando R^{2} es CH_{2}COOH, y estos isómeros ciclados se entiende que están incluidos cuando la forma abierta del anillo es representada en la presente memoria descriptiva.
9
Análogamente, será evidente para un experto en la técnica que ciertos compuestos de esta invención pueden existir en formas tautómeras o formas hidratadas, y todas estas formas de los compuestos están dentro del alcance de la invención. Salvo que se establezca otra cosa, las estructuras expuestas en la presente memoria descriptiva está previsto que incluyan todas las formas estereoquímicas de la estructura; es decir, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico. Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos únicos así como las mezclas enantiómeras y diastereómeras de los presentes compuestos están dentro del alcance de la invención. Salvo que se establezca otra cosa, las estructuras expuestas en la presente memoria descriptiva está previsto también que incluyan compuestos que difieren solamente en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto en cuanto a la sustitución de un átomo de hidrógeno con un deuterio o tritio, o la sustitución de un átomo de carbono con un átomo de carbono enriquecido ^{13}C o ^{14}C están dentro del alcance de esta invención.
Una realización de esta invención se refiere a compuestos que tienen una o más y preferentemente la totalidad de las siguientes características:
(i) Z es oxígeno.
(ii) R^{1} es hidrógeno, -R, CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y. Más preferentemente, R^{1} es -CH_{2}OR, -CH_{2}SR o CH_{2}Y. Incluso más preferentemente R^{1} es -CH_{2}Y. Lo más preferentemente, R^{1} es -CH_{2}F.
(iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster, amida o isoéster del mismo.
(iv) R^{3} es un grupo que tiene un peso molecular hasta aproximadamente 140 daltones, como un grupo alifático o aralquilo. Más preferentemente, R^{3} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} que es un grupo que encaja en el subsitio S2 de una gama de caspasas.
(v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que intervienen forman un sistema de anillos heterocíclicos o heteroarilo monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que cada anillo del sistema tiene 5-7 átomos en el anillo.
Una característica clave de los presentes compuestos es el sistema de anillos heterocíclicos formados al tomar R^{4} y R^{5} conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene. Los anillos heterocíclicos o heteroarilo bicíclicos o tricíclicos son preferidos sobre los anillos monocíclicos. Consecuentemente, una realización preferida se refiere a compuestos que tienen una o más, y preferentemente la totalidad de las siguientes características: (i) Z es oxígeno; (ii) R^{1} es hidrógeno, -R, -CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y. Más preferentemente, R^{1} es -CH_{2}OR, -CH_{2}SR o CH_{2}Y, más preferentemente R^{1} es -CH_{2}Y y lo más preferentemente, R^{1} es -CH_{2}F; (iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster, amida o isoéster del mismo; (iv) R^{3} es un grupo que tiene un peso molecular hasta aproximadamente 140 daltones, como un grupo alifático o aralquilo, más preferentemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y/o (v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que intervienen forman un sistema de anillos heterocíclicos o heteroarilo monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que cada anillo del sistema tiene 5-7 átomos en el anillo.
Ejemplos de anillos monocíclicos preferidos incluyen triazol, piperidina, morfolina, tiomorfolina, imidazol, pirrolidina, pirazol y piperazina. Ejemplos de anillos bicíclicos preferidos incluyen indol, isoindol, indolina, indazol, bencimidazol, tieno[3,2-b]pirrol, dihidroquinoxalina, dihidrocinolina, dihidronaftiridina, tetrahidronaftiridina, tetrahidroquinolina y tetrahidroisoquinolina, lo más preferentemente indol o indolina. Ejemplos de anillos tricíclicos preferidos incluyen carbazol, fenotiazina, \beta-carbolina, pirido[4,3-b]indol, 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diazaantraceno, 3,6,9-triazafluoreno, fenoxazina, dibenzoazepina, dihidro-dibenzoazepina, dihidrofenazina, dihidroacridina o dihidrofenantridina, lo más preferentemente carbazol, fenotiazina o dihidrofenantridina.
Ejemplos específicos de compuestos i se muestran en la tabla 1.
TABLA 1 Ejemplos de compuestos de Fórmula I (Z es oxígeno)
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Después de evaluar muchos anillos heterocíclicos R^{4}-N-R^{5}, se encontró que los compuestos tricíclicos en los que los anillos terminales son sustancialmente coplanares muestran una actividad de caspasa amplia sorprendentemente superior en comparación con los análogos acíclicos u otros sistemas de anillos tricíclicos que no son sustancialmente coplanares. Esta coplanaridad sustancial puede ser conseguida cuando el anillo medio del sistema de anillos tricíclico es un anillo de 5 ó 6 miembros, como en un anillo de carbazol o fenotiazina.
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Además de ello, estos sistemas de anillos tricíclicos sustancialmente coplanares, así como los sistemas de anillos bicíclicos como indol e indolina, confieren una actividad de caspasa amplia mejor que los correspondientes compuestos en los que el anillo heterocíclico de R^{4}-N-R^{5} es monocíclico como piperidina, piperazina o morfolina.
Consecuentemente, una realización preferida de esta invención se refiere a compuestos de fórmula I en la que R^{4}-N-R^{5} es un sistema de anillos tricíclico que tienen 1-6 heteroátomos, preferentemente 1-4 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre en el que los anillos terminales del sistema de anillos tienen 5-7 átomos en el anillo y el anillo medio tienen 5 ó 6 átomos en el anillo.
Un aspecto de esta invención se refiere a compuestos de fórmula II:
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en la que X es un enlace, -S-, -O-, -CH_{2}- o -NH- y Z, R^{1}, R^{2} y R^{3} son como se describieron anteriormente. Cuando X es -CH_{2}-, cada uno de los hidrógenos de metileno pueden estar sustituidos de forma opcional e independiente con -OR,
-OH, -SR, OH protegido (como aciloxi), -CN, -NH_{2}, -NHR, -N(R)_{2}, -NHCOR, -NHCONHR, -NHCON(R)_{2}, -NRCOR, -NHCO_{2}R, -CO_{2}R, -CO_{2}H, -COR, -CONHR, -CON(R)_{2}, -S(O)_{2}R, -SONH_{2}, -S(O)R, -SO_{2}NHR, -NHS(O)_{2}R, =O, =S, =NNHR, =NNR_{2}, =N-OR, =NNHCOR, =NNHCO_{2}R, =NNHSO_{2}R o =NR en los que R es un grupo alifático C_{1-4}. Cuando X es -NH-, el átomo de hidrógeno de NH puede estar sustituido con alquilo, CO(alquilo), CO_{2}(alquilo) o SO_{2}(alquilo). Los grupos preferidos para R^{1}, R^{2} y R^{3} son como se describieron anteriormente.
Los compuestos de esta invención pueden ser preparados en general mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica para compuestos análogos, como se ilustra mediante los esquemas generales siguientes y mediante los ejemplos preparativos que siguen.
Esquema I
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Reactivos: (a) R^{5}-N=C=Z (2); (b) NaOH/TF/H_{2}O; (c) EDC/DMAP/HOBt; (d) i. peryodinano de Dess-Martin, (ii) TFA/DCM.
El esquema I anterior muestra una vía sintética para obtener compuestos en los que R^{4} es un átomo de hidrógeno. La reacción de un isocianato o tioisocianato 2 con un derivado 1 de ácido láctico produce el carbamato 3. El grupo éster de 3 es hidrolizado usando un base o cuando el éster es un grupo t-butilo, usando ácido trifluoroacético para proporcionar el ácido 4, que es seguidamente acoplado con el amino-alcohol 5. Dependiendo de la naturaleza de R^{1} y R^{2}, puede ser usada una amino-cetona en lugar del amino-alcohol, lo que evita la posterior etapa de oxidación. En el caso de fluorometil-cetonas en las que R^{1} es CH_{2}F, el amino-alcohol 5 puede ser obtenido según el método de Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693, finalmente, el grupo hidroxilo en el compuesto 6 es oxidado y el compuesto resultante es tratado apropiadamente según la naturaleza de R^{2}. Por ejemplo, si el producto I requiere que R^{2} sea un ácido carboxílico, entonces R^{2} en 6 es preferentemente un éster y la etapa final en el esquema es una hidrólisis.
Los isocianatos o tioisocianatos 1 de partida están disponibles en el comercio o pueden ser preparados mediante reacción de una amina con fosgeno o una equivalente de fosgeno (o tiofosgeno para la preparación de tioisocianato) en presencia de una base como trietilamina. Los derivados de lactatos están disponibles en el comercio o pueden ser preparados mediante reacción de un aminoácido con un reactivo de diazotización como con NaNO_{2}.
Esquema II
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Reactivo: (a) CDI/TF; (b) MeOTf/CH_{2}Cl_{2}; (c) R^{4}R^{5}NH (8)/THF.
El esquema I anterior muestra una guía sintética para obtener compuestos I de esta invención en los que R^{4} es un grupo alquilo o cuando R^{4} y R^{5} forman conjuntamente un anillo. La reacción del derivado 2 de lactato con 1,1'-carbonil-diimidazol (CDI) proporciona el imidazolato 7. La metilación de 7 con triflato de metilo, seguida de reacción con la amina 8 (véase J. Med. Chem., (1996), 39, 982) proporciona el intermedio 3. El esquema I anterior muestra cómo 3 puede ser convertido en I.
Esquema III
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Reactivos: (a) COCl_{2}/CH_{2}Cl_{2}; (b) 1/THF.
Una vía sintética alternativa para obtener compuesto I de esta invención es cuando R^{4} es un grupo alquilo o cuando R^{4} y R^{5} forman conjuntamente un anillo, como se muestra en el esquema III anterior. El tratamiento de la amina 8, como fosgeno, proporciona un intermedio 9 de cloruro de carbamoilo. La reacción de 9 con un derivado 1 de lactato proporciona el intermedio 3.
Esquema IV
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Reactivos: (a) Cl_{3}COC(O)Cl/THF; (b) R^{4}R^{5}NH (8), NaOH, Bu_{4}NBr.
El esquema IV anterior muestra una vía sintética para obtener compuesto de esta invención en la que R^{4} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o cuando R^{4} y R^{5} forman conjuntamente un anillo. La reacción de hidroxi-éster 1 con fosgeno o un equivalente de fosgeno como difosgeno o trifosgeno conduce a un intermedio 10 de cloroformiato. La reacción de 10 con la amina 8 proporciona el intermedio 3.
Los compuestos de esta invención están diseñados para inhibir caspasas. Por lo tanto, los compuestos de esta invención pueden ser ensayados en cuanto a su capacidad para inhibir la apoptosis, la liberación de IL-1\beta o la actividad de caspasa directamente. Los ensayos para cada una de las actividades son descritos con posterioridad en la sección de ensayos y son también conocidos en la técnica.
Una realización de esta invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente afectable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Si las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención son utilizadas en estas composiciones, esas sales son derivadas preferentemente de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Están incluidas entre estas sales de ácidos las siguientes: acetato, adipato alginato aspartato benzoato benceno-sulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canfor-sulfonato, ciclopentanepropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glycerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroclorido, hidrobromido, hidroiodido, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales de bases incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas, como sales dicicloexilamina, N-metil-D-glucamina y sales con aminoácidos como arginina, lisina, etc.
También, los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden ser cuaternizados con agentes como haluros de alquilo inferior como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; dialquilo-sulfatos, como dimetilo, dietilo, dibutil y diamil-sulfatos, haluros de cadenas largas como cloruros, bromuros y yoduros de bencilo, laurilo, miristilo y esterilo, haluros de aralquilo como bromuro de bencilo y fenetilo y otros. Son obtenidos así productos solubles o dispersables en agua o aceites.
Los compuestos utilizados en las composiciones y los métodos de esta invención pueden ser modificados adjuntando funcionalidades apropiadas para mejorar las propiedades biológicas selectivas. Estas modificaciones son conocidas en la técnica e incluyen las que aumentan la penetración biológica en un sistema biológico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfático o sistema nervioso central), aumentan la disponibilidad oral, aumentan la solubilidad para permitir la administración mediante inyección, alteran el metabolismo y alteran la velocidad de excreción.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser usados en estas composiciones incluyen, pero sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero como albúmina de suero humano, sustancias tamponentes como fosfatos glicina, ácidos sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos como sulfato de protamina, hidrógeno-sulfato de disodio, hidrógeno-fosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de poletileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.
Según una realización preferida, las composiciones de esta invención son formuladas para una administración farmacéutica a un mamífero, preferentemente un ser humano.
Estas composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas por vía oral, parenteral, mediante pulverización para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o a través de un depósito implantado. El término "parenteral" como se usa en la presente memoria descriptiva incluye subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional y técnicas de inyección o infusión intracraneal. Preferentemente, las composiciones son administradas por vía oral o intravenosa.
Las formas inyectables esterilizadas de las composiciones de esta invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden ser formulabas según técnicas bien conocidas en el estado de le técnica usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes suspensores. La preparación inyectable esterilizada puede ser también una solución o suspensión inyectable esterilizada en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden ser empelados están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, pueden ser convencionalmente empleados aceites fijos esterilizados como un disolvente o medio de suspensión. Para esta finalidad, puede ser empleado cualquier aceite fijo blando incluidos mono- o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de productos inyectables, ya que son aceites naturales farmacéuticamente aceptables, como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceites pueden contener también un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, como carboximetil-celulosa o agentes dispersantes similares que con comúnmente usados en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptable que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos comúnmente usados, como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o mejoradores de la biodisponibilidad que son comúnmente usados en la elaboración de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables, pueden ser usados también para los fines de la formulación.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas por vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral que incluye, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos y suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para un uso oral, los vehículos que son comúnmente usados incluyen lactosa y almidón de maíz. Normalmente son añadidos también agentes lubricantes como estearato de magnesio. Para una administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz. Cuando son necesarias suspensiones acuosas para un uso oral, el ingrediente activo es combinado con agentes emulsionantes y suspensores. Si se desea, pueden ser añadidos también ciertos agentes edulcorantes, para dar sabor o colorantes.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas en la forma de supositorios para una administración rectal. Estas pueden ser preparadas mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal, y por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Estos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas también por vía tópica especialmente cuando la diana de tratamiento incluye zonas u organizo fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluidas enfermedades oculares, de la piel o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas son fácilmente preparadas para cada una de estas zonas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior pueden ser efectuada en una formulación de supositorios rectales (véase lo que antecede) o el una formulación de enema adecuada. Pueden ser usados también parches transdermales por vía tópica.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas en un ungüento adecuado que contenga el compuesto activo en suspensión o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos para una administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen pero sin limitación, aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, un compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas en una loción o crema adecuada que contenga los componentes activos en suspensión o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, monoestereato de sorbitán, polisorbato 60, cera de esteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para un uso oftálmico, las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas como suspensiones micronizadas en solución salina esterilizada isotónica de pH ajustado o, preferentemente, como soluciones en solución salina isotónica de pH ajustado, con o sin un conservante como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicas, las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas en un ungüento como petrolato.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas también mediante un aerosol o una inhalación nasal. Estas composiciones son preparadas según técnicas bien conocidas en el estado de la técnica de formulaciones farmacéuticas y pueden ser preparadas como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, favorecedores de la absorción para mejorara la biodisponibilidad, fluorocarburos y/o otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
Las composiciones anteriormente descritas son particularmente útiles en aplicaciones terapéuticas relacionadas con una enfermedad mediada por IL-1, una enfermedad mediada por apoptosis, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, un trastorno de destrucción ósea, un transtorno proliferativo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad degenerativa, una enfermedad asociada con la muerte celular, una enfermedad de consumo excesivo de alcohol en la dieta, una enfermedad mediada por virus, uveitis, peritonitis inflamatoria, ostereoartritis, pancreatitis, asma, síndrome de dificultad respiratoria en adultos, glonumeronefritis, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, escleroderma, tiroiditis crónica, enfermedad de Grave, gastritis autoinme, diabetes, anemia emolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, hepatitis activa crónica, niastemia grave, enfermedad de inflamación intestinal, enfermedad de Crohn, soriasis, dermatitis atópica, cicatrizaciones, enfermedad de injerto frente a hospedante, rechazo de transplante de órganos, osteoporosis, leucemias y trastornos relacionados, síndrome mielodisplástico, trastorno óseo relacionado con mielomas múltiples, leucemia mielogenosa aguda, leucemia milelogenosa crónica, melanoma metastático, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, choque hemorrágico, sepsis, choque séptico, quemaduras, shingelosis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, enfermedad priónica, isquemia cerebral, epilepsia, isquemia de miocardio, enfermedad cardíaca aguada y crónica, infarto de miocardio, fallo cardíaco congestivo, aterosclerosis, injerto de bypass en arterias coronarias, atrofia muscular espinal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, encefalitis relacionada con HIV, envejecimiento, alopecia, deterioro neurológico debido a apoplejía, colitis ulcerativa, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis G, fiebre amarilla, fiebre de dengue o encefalitis japonesa, diversas formas de enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad de riñón poliáptico, enfermedad de úlcera gástrica o duodenal asociada con H. pilori, infección por HIV, tuberculosis, meningitis, un tratamiento para complicaciones asociadas con injertos de bypass en arterias coronarias y como un componente de inmunoterapia para el tratamiento de diversas formas de cáncer.
La cantidad de compuesto presente en las composiciones anteriormente descritas debe ser suficiente para provocar una disminución detectable en la gravedad de la enfermedad o en la actividad de caspasas y/o apoptosis celular, al ser medida mediante cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos.
Los compuestos de esta invención son útiles también en métodos también para conservar células, como puede ser necesario para un transplante de órganos o para conservar productos sanguíneos. Han sido descritos usos similares para inhibidores de caspasas (Schierle et al., Nature Medicine, 1999, 5, 97). El método incluye tratar las células o tejido que van a ser conservados con una solución que comprende el inhibidor de caspasa. La cantidad de inhibidor de caspasa necesaria dependerá de la eficacia del inhibidor para el tipo de célula dada y el período de tiempo necesario para preservar las células de la muerte celular apoptótica.
Según otra realización, las composiciones de esta invención pueden comprender adicionalmente otro agente terapéutico. Estos agentes incluyen, pero sin limitación, agentes trombolíticos como activador de plasminógeno de tejidos y estreptoquinasa. Cuando es usado un segundo agente, el segundo agente puede ser administrado como una forma de dosificación separada o como parte de una única forma de dosificación con los compuestos o composiciones de esta invención.
Debe entenderse también que una dosificación especifica y un régimen de tratamiento para cualquier paciente particular dependerán de una diversidad de factores, que incluyen la actividad del compuestos específico empleado, la edad, peso corporal, estado general de salud, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de secreción, combinación de fármacos y el criterio del facultativo encargado y la gravedad de la enfermedad particular que este siendo tratada. Cualquier cantidad de ingredientes activos dependerá también del compuesto particular by otro agente terapéutico, si está presente, en la composición.
En una realización preferida, la invención proporciona un método para tratar un mamífero que tiene una de las enfermedades anteriormente mencionadas, que comprende las etapas de administrar a dicho mamífero una composición farmacéuticamente aceptable descrita con anterioridad. En esta realización si al paciente se le administra también otro agente terapéutico o inhibidor de caspasa, se le puede suministrar conjuntamente con el compuesto de esta invención en única forma de dosificación, o como una forma de dosificación separada. Cuando es administrado como una forma de dosificación separada, el otro inhibidor de caspasa o agente puede ser administrado antes, al mismo tiempo o a continuación de la administración de una composición farmacéuticamente aceptable que comprenda un compuesto de esta invención.
Con el fin de que esta invención se comprenda más en detalle, se exponen los siguientes ejemplos preparativos y de ensayo.
Ejemplos de Síntesis
Los siguientes ejemplos proporcionan procedimientos sintéticos para compuestos seleccionados de esta invención.
Ejemplo 1 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico 
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Método A
Éster terc-butílico de ácido (S)-2-(clorocarbamoiloxi)-3-metilbutírico 
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A una solución de difosgeno (4,55 g) en THF (34 ml) a 0ºC se añadió una solución de éster terc-butílico de ácido (S)-2-hidroxi-3-metilbutírico (para el método de preparación véase Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) (4,0 g) y piridina (1,82 g) en THF (34 ml) gota a gota durante 25 minutos. La mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla seguidamente se filtró a través de celite y el filtrado se concentró bajo presión reducida. El residuo se volvió a disolver en dietil-éter (200 ml) y se filtró nuevamente a través de celite. El filtrado se concentró bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un aceite amarillo pálido (5,27 g): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,98-1,10 (6H, m), 1,55 (9H, s), 2,30 (1H, m), 4,83 (1H, m).
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Método B
Éster terc-butílico de ácido (S)-3-metil-2-(carbazol-carbamoiloxi)-butírico
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A una solución de carbazol (15,15 g) en diclorometano (180 ml) y THF (142 ml) a 0ºC se añadió hidróxido de sodio granulado (5, 45 g) seguido de bromuro de tetrabutilamonio (2,93 g). La mezcla resultante se agitó durante 30 minutos y seguidamente se añadió gota a gota una solución de cloroformiato (21, 41 g) en THF (81 ml) durante 55 minutos. Seguidamente la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante 1 noche. Seguidamente se añadieron diclorometano (1 l) y agua (350 ml) y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo seguidamente con diclorometano (2 x 250 ml) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (200 ml), seguidamente salmuera (200 ml), se secaron (sulfato de magnesio), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía rápida (0-5% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtitulo en forma de un aceite incoloro (29,3 g): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,15-1,23 (6H, m), 1,55 (9H, s), 2,52 (1H, m), 5,27 (1H, d), 7,36-7,57 (4H, m), 8,03 (2H, d), 8,47 (2H, d).
Método C
Ácido (S)-3-metil-2-(carbazol-carbamoiloxi)-butírico
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Se añadió gota a gota ácido trifluoroacético (84 ml) a una solución enfriada con hielo y agitada de éster terc-butílico de éster terc-butilíco de ácido (S)-3-metil-2-(carbazol-carbamoiloxi)-butírico, (4,11 g) en DCM anhidro (300 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 2 h y seguidamente a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se concentró bajo presión reducida y seguidamente el residuo se disolvió en DCM seco y el disolvente se separo nuevamente bajo presión reducida. El procedimiento se repitió varias veces con el fin de separar el ácido trifluoroacético en exceso. Esto suministro el ácido en forma de una goma verde pálida (3, 30 g) ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,12-1,37 (6H, m), 2,70 (1H, m), 5,47 (1H, m), 7,32-7,56 (4H, m), 8,00 (2H, d), 8,37 (2H, d).
Método D
Éster terc-butílico de ácido [3S/R, 4S/R]-5-fluoro-4-hidroxi-3-((S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamido)-pentanoico
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Una mezcla agitada de ácido (S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butírico (3,30 g), éster terc-butílico de ácido 3-amino-5-fluoro-4-hidroxi-pentanoico (2,42 g), HOBt (1,58 g), DMAP (1,49 g) y THF (80 ml) se enfrió a 0º y seguidamente se añadió CEDC (2,24 g). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante 16 h y seguidamente se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía rápida (15-45% acetato de etilo/hexano) para suministrar el compuesto del subtítulo en forma de una espuma blanca (4,60 g): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,09-1,50 (15H, m), 2,49-2,80 (3H, m), 3,20-3,62 (1H, m), 3,92-4,58 (4H, m), 5,32-5,42 (1H, d), 6,86 (1H, brm), 7,40-7,55 (4H, m), 8,02 (2H, d), 8,35 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) \delta -229,6, -229,7, -230,8, -231,4.
Método E
Éster terc-butílico de ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
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Una solución agitada de éster terc-butilico de ácido [3S/R,4S/R]-5-fluoro-4-hidroxi-3-((S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamido)-pentanoico (4,60 g) en DCM anhidro (100 ml) se trató con 1,1,1-triacetoxi-1,1-dihidro-1,2-benciodoxol-3(1H)-ona (4,68 g) a 0ºC. La mezcla resultante se mantuvo a 0ºC durante 2 h, se diluyó con acetato de etilo, seguidamente ser vertió en una mezcla 1:1 de hidrógeno-carbonato de sodio acuoso saturado y tiosulfato de sodio acuoso saturado. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (sulfato de magnesio) y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía rápida (10-40% acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un sólido blanco (3,96 g): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,85 (4, 5H, s), 1,94-1,31 (6H, m), 1,36 (4, 5H, s), 2,59 (1H, m), 2,70-3,11 (2H, m), 4,91-5,31 (3H, m), 5,40-5,49 (1H, m), 7,25 (1H, brs), 7,42 (2H, m), 7,53 (2H, m), 8,04 (2H, m), 8,35 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) \delta -232,0, -232,1.
Ejemplo 1A
Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
28
Este se preparó usando un procedimiento similar al anteriormente descrito en el método C. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (88% en la ultima etapa): IR (sólido) 1721,2, 1695,6, 1664,9, 1449,8, 1378,1, 1198,9, 1040,1, 758,5 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,10 (6H, brm), 2,41 (1H, m), 2,54-3,04 (2H, m), 4,31-4,82 (1, 6H, m, CH_{2}F), 5,10-5,41 (2,4H, m), 7,45 (2H, m), 7,57 (2H, m), 8,22 (2H, m), 8,30 (2H, m), 8,51-8,99 (1H, brm), 12,60 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 19,0, 19,1, 19,3, 30,4, 30,5, 30,6, 32,9, 34,5, 34,7, 47,3, 47,4, 52,0, 52,3, 80,4, 80,8, 83,2, 83,4, 83,4, 85,1, 85,2, 116,2, 116,3, 124,1, 125,7, 125,9, 137,9, 151,7, 151,9, 152,0, 168,8, 169,0, 169,2, 172,0, 172,1, 173,1, 173,2, 202,2, 202,4, 202,5, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226, 6 (t), -226,8 (t), -230,5 (t),-230,9 (t),-232,9 (t),-233,0 (t); MS (ESI +ve) 443 (M+H).
Ejemplo 2 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3-clorocarbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
29
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (99% en la ultima etapa): IR (sólido) 1721,2, 1690,5, 1664,9, 1444,7, 1367,9, 1209,1, 1040,1 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,02-1,13 (6H, m), 2,40 (1H, m), 2,50-2,99 (2H, m), 4,30-4,85 (1,6H, m), 5,09-5,48 (2, 4H, m), 7,48 (1H, m), 7,56-7,66 (2H, m), 8,20-8,32 (3H, m), 8,39 (1H, m), 8,55-8,99 (1H, brm), 12,5 (1H, br); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 18,1, 18,9, 19,1, 30,4, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 80,6, 80,9, 81,1, 83,4, 83,43, 85,1, 85,2, 103,8, 104,0, 117,0, 119,3, 121,3, 122,3, 124,3, 124,7, 127,2, 127,4, 127,9, 128,5, 136,5, 138,4, 151,5, 151,6, 151,7, 168,7, 168,9, 169,0, 169,1, 172,0, 172,1, 173,1, 173,2, 202,2, 202,4, 202,44, 202,8 (C); ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226, 6 (t), -226, 8 (t) -230,4 (t), -230,9 (t), -231,0 (t), -232,8 (t), -232,84 (t), -232,9 (t); MS (ESI +ve) 477 (M+H).
Ejemplo 3 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3, 6 diclorocarbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
30
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (99% en la ultima etapa): IR (sólido) 1721,2, 1659,7, 1470,3, 1434,4, 1367,9, 1209,1, 1075,9, 1045,2 cm; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,98-1,14 (6H, m), 2,30-2,50 (1H, m), 2,50-3,01 (2H, m), 4,29-4,84 (1,5H, m), 5,09-5,41 (2,5H, m), 7,66 (2H, m), 8,19-8,29 (2H, m), 8,45 (2H, m), 8,57-8,99 (1H, brm), 12,60 (1H, br, OH); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 15,5, 19,1, 19,2, 30,4, 30,45, 30,6, 33,0, 34,5, 34,7, 47,3, 47,5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,1, 81,2, 83,4, 84,43, 85,1, 85,2, 117,8, 121,1, 126,3, 128,4, 128,7, 136,9, 151,2, 151,4, 168,6, 168,8, 168,9, 168,95, 172,0, 172,04, 173,1, 173,14, 202,2, 202,3, 202,4, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,6 (t), -226,8 (t), -230,4 (t), -230,8 (t), -232,8 (t), -232,9 (t); MS (ESI +ve) 511/513 (M+H).
Ejemplo 4 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-clorocarbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
31
Método F
4'-Cloro-2-nitrobifenilo
32
A una solución de 2-bromonitrobenceno (646 mg) en THF (17 ml) bajo nitrógeno se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (900 mg). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos y seguidamente se añadió una solución de ácido 4-clorofenilborónico (1,0 g) en etanol (17 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Seguidamente se añadió carbonato de sodio 2 M (17 ml) y la reacción se calentó a reflujo durante 2 h. Seguidamente la mezcla se dejó enfriar y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml) y la capa acuosa se separó. La fase orgánica se lavó con salmuera (20 ml) se secó (sulfato de magnesio), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida (0-10% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un sólido amarillo (646 mg): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6 7,24-7,31 (2H, m), 7,41-7,47 (3H, m), 7,52 (1H, m), 7,65 (1H, m), 7,90 (1H, d).
\newpage
Método G
2-Clorocarbazol
33 
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Una mezcla de 4'-Cloro-2-nitrobifenilo (640 mg) y fosfito de trietilo (1,9 ml) se calentó a 150ºC durante 3 h. La mezcla se dejó enfriar seguidamente y se purificó por cromatografía rápida (5-10% acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un sólido blanco (382 mg): ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 7,12-7,23 (2H, m), 2,40 (1H, m), 7,46-7,54 (2H, m), 8,12 (2H, d).
Ejemplo 4 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-clorocarbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico 
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34 
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Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (99% en la ultima etapa): IR (sólido) 1731,4, 1695,6,, 1664,9, 1424,2, 1367,9, 1326,9, 1193,7, 1045,2 CM^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,58-1,70 (6H, m), 2,85- 3,10 (1H, m), 3,10-3,54 (2H, m), 4,85-5,39 (1, 4H, m), 5,65-5,98 (2,6H, m), 7,94-8,20 (3H, m), 8,73-8,90 (4H, m), 9,10-9,56 (1H, brm), 13,2 (1H, br); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 19,2, 30,4, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 52,0, 52,3, 80,6, 80,9, 81,1, 83,4, 83,43, 85,1, 85,2, 104,0, 117,1, 121,0, 122,1, 124,2, 124,4, 124,6, 124,8, 129,0, 132,0, 138,2, 138,4, 151,6, 151,61, 168,7, 168,9, 169,0, 172,0, 172,05, 202,4, 202,42, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -225,99 (t), -226,2 (t), -229,8 (t), -230,3 (t), -232,3 (t), -232,4 (t); MS (ESI +ve) 477 (M+H).
Ejemplo 5 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2,3-diclorocarbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico 
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35 
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Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. Se preparó 2,3-Diclorocarbazol usando procedimientos similares a los descritos en los métodos F y G. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (98% en la ultima etapa): IR (sólido) 1721, 2, 1659, 7, 1434, 4, 1367, 9, 1204, 0, 1188, 6, 1045, 2 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,04-1,14 (6H, m), 2,29-2,48 (1H, m), 2,53-3,00 (2H, m), 4,30-4,84 (1,7H, m), 5,09-5,41 (2,3H, m), 7,49 (1H, m), 7,63 (1H, m), 8,20-8,33 (2H, m), 8,42-8,49 (1H, m), 8,62 (1H,-m), 8,80-9,00 (1H, brm), 12,5 (1H, br); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 47,5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,0, 81,2, 83,4, 85,1, 85,2, 116,3, 117,9, 121,5, 122,4, 124,1, 124,6, 126,1, 126,6, 129,0, 129,7, 136,8, 138,5, 151,4, 151,45, 168,6, 168,9, 172,0, 172,03, 173,1, 202,2, 202,3, 202,4, 202,5; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 226,6 (t), -226,8 (t), -230,3 (t), -230,8 (t), -232,8 (t), -232,9 (t); MS (ESI +ve) 513 (M+H).
Ejemplo 6 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-trifluorometil)-carbazol-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
36
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. Se preparó 2 trifluorometilcarbazol usando procedimientos similares a los descritos en los métodos F y G. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (85% en la ultima etapa): IR (sólido) 1731,4, 1695,6, 1695,7, 1434,4, 1321,8, 1198,9, 1122,1, 1065,7 cm^{-1}; 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) \delta 1,06-1,15 (6H, m), 2,42 (1H, m), 2,50-3,01 (2H, m), 4,29-4,83 (1,6H, m), 5,08-5,42 (2,4H, m), 7,53 (1H, m), 7,68 (1H, m), 7,83 (1H, m), 8,29-8,40 (2H, m), 8,48 (1H, m), 8,64 (1H, m), 8,80-9,01 (1H, m), 12,60 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,4, 17,6, 19,0, 19,1, 30,4, 31,0, 32,9, 34,5, 34,7, 52,0, 52,3, 80,7, 80,9, 81,1, 81,1, 83,4, 85,1, 113,3, 116,3, 120,7, 120,9, 123,6, 124,4, 126,2, 127,2, 127,5, 127,8, 128,1, 128,9, 137,2, 138,9, 151,6, 168,6, 169,0, 172,0, 202,2, 202,3, 202,4, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -60,4 (s), -226,6 (t), -226,8 (t), -229,9 (t), -230,4 (t), -231,0 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 511 (M+H).
Ejemplo 7 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-metilcarbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
37
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (90% en la ultima etapa): IR (sólido) 1726,3, 1700,7, 1664,9, 1552,2, 1460,0, 1552,2, 1460,0, 1367,9, 1332,0, 1209,1, 1193,7, 1040,1 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,01-1,19 (6H, m), 2,30-3,00 (6H, m), 4,29-4,85 (1,5H, m), 5,11-5,52 (2,5H, m), 7,29 (1H, m), 7,45 (1H, m), 7,55 (1H, m), 8,05-8,18 (3H, m), 8,27 (1H, m), 8,50-9,10 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,7, 18,0, 19,0, 19,1, 19,2, 22,2, 30,4, 30,5, 30,6, 30,6, 33,0, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 52,7, 80,3, 80,6, 80,7, 80,8, 83,2, 83,4, 83,5, 85,2, 85,2, 103,8, 104,0, 116,2, 116,3, 116,6, 120,3, 120,4, 123,4, 124,0, 125,2, 125,8, 127,3, 137,5, 137,9, 138,2, 151,7, 151,9, 151,9, 168,8, 169,0, 169,2, 169,2, 172,0, 172,1, 173,1, 173,2, 202,3, 202,4, 202,5, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226, 55 (t), -226,76 (t), -230,43 (t), -230,89 (t), -232,84 (t), -232,97 (t).
Ejemplo 8 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-2-(carbazol-carbamoilOxi)-butirilamino]-pentanoico
38
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El cloroformiato se preparó a partir de éster terc-butílico de ácido (S)-2-hidroxibutanoico como se describió en el método A. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (90% en la ultima etapa): IR (sólido) 1716,1, 1654,6, 1449,8, 1372,9, 1326,9, 1204,0, 1050,4, 1029,9 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,03-1,12 (3H, m), 1,96-2,15 (2H, m), 2,50-3,01 (2H, m), 4,31-4,82 (1,8H, m), 5,11-5,43 (2,2H, m), 7,45 (2H, m), 7,59 (2H, m), 8,18-8,32 (4H, m), 8,58-9,05 (1H, brm), 12,60 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 8 9,8, 9,9, 9,94, 24,9, 25,1, 25,2, 33,0, 34,6, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 77,1, 77,3, 77,4, 77,45, 83,4, 83,5, 85,2, 85,22, 116,3, 120,6, 124,0, 125,7, 127,9, 137,9, 151,5, 151,7, 169,5, 169,8, 172,0, 172,1, 173,1, 202,3, 202,4, 202,5, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,6 (t), -226,8 (t), -230,4 (t), -231,0 (t), 232,9 (t), -233,0 (t).
Ejemplo 9 [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3, 3-dimetil-2-(carbazol-carbamoiloxi)-butirilamino]-pentanoico
39
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El cloroformiato se preparó a partir de éster terc-butílico de ácido (S)-2-hidroxi-3,3-dimetilbutanoico (para el método de preparación véase Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) como se describió en el método A. El producto se aisló en forma de un sólido (94% en la ultima etapa): IR (sólido) 1782,7, 1721,2, 1526,6, 1444,7, 1373,0, 1332,0, 1301,3, 1198,9, 1117,0, 1040,1, 753,3 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 5 1,15 (9H, s), 2,50-2,98 (2H, m), 4,29-4,88 (1, 5H, m), 4,97-5,45 (2,5H, m), 7,45 (2H, m), 7,59 (2H, m), 8,23 (2H, m), 8,33 (2H, m), 8,50-8,97 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 27,3, 33,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8, 35,1, 52,5, 52,9, 83,5, 83,9, 84,0, 84,1, 84,3, 85,7, 85,73, 116,7, 116,8, 121,2, 124,6, 124,64, 126,2, 128,4, 138,4, 152,2, 152,4, 152,5, 168,4, 168,7, 168,8, 168,9, 172,6, 172,65, 173,6, 202,6, 202,8, 202,9, 203,0; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,5 (t), -226, 6 (t), -230,9 (t), -231,5 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 457 (M+H).
Ejemplo 10 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-2-(2-clorocarbazol-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
40
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El cloroformiato se preparó a partir de éster terc-butílico de ácido (S)-2-hidroxibutanoico como se describió en el método A. se preparó 2-clorocarbazol como se describió en los métodos F-G. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (77% en la ultima etapa): IR (sólido) 1733,08, 1699,89, 1662,97, 1448,18, 1423,38, 1369,84, 1332,48, 1215,16, 1199,62, 1052,26, 1033,17, 764,57, 747,53, 720,08, 651,85 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,06-1,10 (3H, m), 2,01-2,09 (2H, m), 2,53-2,98 (2H, m), 4,34-4,78 (1, 6H, m), 5,14-5,39 (2, 4H, m), 7,45-7,61 (3H, m), 8,24-8,31 (4H, m), 8,63-8,99 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 9,7, 23,7, 25,0, 31,3, 34,6, 34,8, 52,0, 52,3, 77,4, 77,6, 83,4, 85,2, 110,9, 111,6, 116,2, 116,3, 119,0, 119,4, 120,7, 120,9, 121,9, 122,1, 124,2, 124,3, 124,6, 124,8, 126,3, 128,3, 130,2, 132,0, 138,1, 138,4, 151,3, 169,6, 172,1; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,60 (t), -226,83 (t), -230,34 (t), -231,88 (t), -232,84 (t), -232,99 (t).
Ejemplo 11 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(indol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
41
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos A-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (92% en la ultima etapa): IR (sólido) 1731,4, 1664,9, 1536,8, 1454,9, 1393,5, 1326,9, 1239,8, 1035,0 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 1,30-1,62 (6H, m), 2,79 (1H, m), 3,00-3,48 (2H, m), 4,77-5,04 (1, 6H, m), 5,42-5,88 (2, 4H, m), 7,29 (1H, m), 7,70-7,90 (2H, m), 8,10-8,31 (2H, m), 8,51-8,63 (1H, m), 8,91-9,45 (1H, m), 13,0 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 15,5, 17,3, 17,6, 18,9, 19,2, 30,6, 32,9, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 65,3, 80,0, 80,3, 80,5, 83,4, 83,41, 85,1, 85,2, 104,02, 108,7, 108,71, 108,8, 114,9, 122,0, 123,5, 125,0, 126,3, 130,5, 135,0, 150,4, 168,8, 169,0, 169,1, 169,14, 172,0, 172,1, 173,1, 202,2, 202,4, 202,5, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,1 (t), -226,3 (t), -230,0 (t), -230,5 (t), 232,3 (t), -232,4 (t), -232,5 (t), -232,6 (t); MS (ESI +ve) 393 (M+H).
Ejemplo 12 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-t(S)-3-metil-2-(fonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
42
Método H
Éster terc-butílico de ácido (S)-3-metil-2-(fonotiazino)-carbamoiloxi-butírico
43
A una solución agitada de éster terc-butílico de ácido (S)-2-hidroxi-3-metilbutírico (para el método de preparación véase Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) (300 mg) en THF (5 ml) a 0ºC se añadió hidruro de sodio (suspensión al 60% en aceite mineral, 72 mg). La mezcla resultante se agitó durante 30 minutos y seguidamente se añadió cloruro de fenotiazina-10-carbonilo (450 mg) y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla de reacción se diluyó seguidamente con acetato de etilo (15 ml) y agua (3 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con 2 x 5 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron seguidamente con salmuera (5 ml), se secaron (sulfato de magnesio), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía rápida (0-10% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un aceite incoloro (528 mg): hhh 0,75-0,96 (6H, m), 1,58 (9H, s), 2,20 (1H, m), 4,86 (1H, d), 7,12-7,45 (6H, m), 7,70 (2H, m).
Ácido (S)-3-metil-2-(fonotiazino)-carbamoiloxi-butírico
44
La desprotección de éster terc-butílico de ácido (S)-3-metil-2-(fonotiazino)-carbamoilñoxi-butírico (528 mg) usando ácido trifluoroacético como se describió en el método C proporciono el ácido en forma de un sólido blanco (440 mg): hhh 0,77-1,00 (6H, m), 2,29 (1H, m), 5,02 (1H, d), 7,15-7,48 (6H, m), 7,70 (2H, m).
Ejemplo 12 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(fonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
45
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos C-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (98% en la ultima etapa): IR (sólido) 1782, 7, 1710, 9, 1521, 5, 1465, 2, 1260, 3, 1219, 4, 1168, 1, 1045, 2,758, 5 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,64-0,87 (6H, m), 1,96-2,16 (1H, m), 2,40-2,98 (2H, m), 4,50-5,42 (4H, m), 7,28 (2H, m), 7,39 (2H, m), 7,49 (2H, m), 7,68 (2H, brm), 7,88-8,91 (1H, brm), 12,61 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 8 16,8, 17,1, 19,0, 19,2, 30,3, 30,5, 33,0, 33,2, 34,5, 34,8, 47,3, 52,0, 52,4, 79,3, 79,6, 79,7, 83,4, 83,5, 85,1, 85,2, 103,8, 127,1, 127,2, 127,3, 127,4, 131,4, 138,0, 138,1, 152,6, 152,8, 158,82, 169,3, 169,5, 169,7, 172,0, 172,1, 172,13, 202,3, 202,4, 202,6, 202,8; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,6 (t), -226,8 (t), -230,3 (t), -231,3 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 475 (M+H).
Ejemplo 13 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-clorofonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico 
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46
Método I
Cloruro de 2-Clorofenotiazino-carbamilo
47 
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A una suspensión de 2-clorofenotiazina (2 g) en xileno (20 ml) se añadió difosgeno (3,4 g). La mezcla se calentó a 140ºC durante 18 h. La mezcla se enfrió seguidamente y el xileno se separó bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía rápida (2-5% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un sólido marrón (2,04 g): hhh 7,26-7,43 (4H, m), 7,45-7,51 (1H, m), 7,59-7,68 (2H, m).
Ejemplo 13 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2clorofonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico 
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48 
\vskip1.000000\baselineskip
Este se preparó usando procedimientos análogos a los descritos en los métodos H y C-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco mediante HPLC de fase inversa (61% en la ultima etapa): IR (sólido) 1732, 1460, 1365, 1207 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,70-0,87 (6H, m), 2,02-2,10 (1H, m), 2,58-2,90 (2H, m), 4,34-5,37 (4H, m), 7,27-7,88 (7H, m), 8,31-8,81 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 16,7/16,9, 18,9/19,1, 30,3/30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,6/80,0, 84,2/84,3, 127,0, 127,3, 127,3, 127,6, 128,0, 129,0, 130,5, 130,9, 131,7, 137,5/137,5, 139,1/139,1, 152,3/152,5, 169,6/169,7, 172,0/172,1, 202,3/202,7 (2d, J 14,1/14,0); ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,6 (t), -226,8 (t), -233,0 (t), -233,1 (t).
Ejemplo 14 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3-clorofonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
49
Este se preparó usando procedimientos análogos a los descritos en los métodos H y C-E. La fenotiazina se preparó según procedimientos descritos en la publicación J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (89% en la ultima etapa): IR (sólido) 1717, 1527, 1469, 1350, 1322, 1217, 1042 cm'; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,67-0,85 (6H, m), 2,00-2,06 (1H, m), 2,58-2,87 (2H, m), 4,33-4,86 (2, 6H, m), 5,12-5,36 (1, 4H, m), 7,27-7,30 (1H, m), 7,38-7,51 (3H, m), 7,63-7,68 (3H, m), 8,24-8,82 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,3/17,6 (CH3), 19,4/19,5 (CH3), 30,8/30,8, 35,0/35,3, 52,5/52,9, 80,0/80,1, 84,7/84,8, 127,2, 127,3, 127,6, 127,9, 128,6, 130,7, 131,2, 133,7, 136,9/137,0, 137,8/137,8, 153,0/153,2, 170,1/170,2, 172,5/172,6, 202,9/203,2; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,7 (br), -226,9 (br), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 509/511 (M+H).
Ejemplo 15 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3, 7 diclorofonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
50
Este se preparó usando procedimientos análogos a los descritos en los métodos H, I y C-E. La fenotiazina se preparó según procedimientos descritos en la publicación J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. El producto se aisló en forma de un sólido blanco mediante HPLC de fase inversa (76% en la ultima etapa): IR (sólido) 1793, 1721, 1521, 1465, 1317, 1214, 1086, 1044 cm^{-1} ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,71-0,76 (3H, m), 0,84-0,88 (3H, m), 2,05-2,12 (1H, m), 2,58-2,92 (2H, m), 4,31-4,87 (2, 5H, m), 5,09-5,36 (1,5H, m), 7,47-7,56 (2H, m), 7,67-7,71 (2H, m), 7,72-7,81 (1H, m), 8,39-8,87 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 16,7/16,7/17,0, 19,0/19,1/19,2/19,3, 30,3/30,3/30,4, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,8/80,1, 84,2/84,3, 127,3, 127,4, 127,7, 128,5, 129,2, 129,7, 131,4/131,4, 132,0, 133,1/133,2, 136,4/136,5, 138,8/138,9, 152,2/152,3, 169,5/169,6, 172,0/172,1, 202,4/202,5; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,5 (br), -226,8 (t), -232,9 (t), -233,0 (br).
Ejemplo 16 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3,4 diclorofonotiazino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
51
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos H, I y C-E. La fenotiazina se preparó según procedimientos descritos en la publicación J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. El producto se aisló en forma de un sólido blanco mediante HPLC de fase inversa (58% en la ultima etapa): IR (sólido) 1736, 1436, 1365, 1222, 1050 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,66-0,85 (6H, m), 2,00-2,08 (1H, m), 2,57-2,93 (2H, m), 4,30-5,35 (4H, m), 7,31-7,71 (6H, m), 8,27-8,83 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 5 16,8/17,1, 19,0/19,1, 30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,7/80,0, 84,2/84,3, 179,2/178,6, 127,1, 127,3, 127,5, 128,2, 128,5, 128,5, 129,6, 130,0, 133,7, 137,3/137,3, 137,6/137,6, 152,5, 169,5/169,5, 172,0/172,1, 202,3; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,6 (t), -226,8 (t), -232,9 (t).
Ejemplo 17 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(9,10-ihidrofenantridino)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
52
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos H, I y C-E. Se preparó 9,10-dihidrofenentridina como se describe en J. Chem. Soc. (1951), 3207-3211. El producto se aisló en forma de un sólido blanco mediante HPLC de fase inversa (56% en la ultima etapa): IR (sólido) 1732, 1365, 1226, 1212, 1203 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,84 (6H, m), 2,05 (1H, m), 2,55-2,90 (2H, m), 4,28-5,36 (6H, m), 7,26-7,43 (5H, m), 7,75-7,77 (1H, m), 7,89-7,91 (2H, m), 8,24-8,81 (1H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,1/17,4, 18,9/19,0, 30,3/30,4, 34,4/34,8, 46,9, 51,9/52,4, 79,0/79,4, 84,2/84,3, 123,8, 124,3, 125,1, 125,7, 126,2, 128,0, 128,2, 128,3, 128,5, 131,5, 134,1, 136,9, 153,1, 170,0/170,1, 172,0/172,1, 202,4/202,8; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226, 7 (br), -226, 9 (br),-233, 1 (t); MS (ESI-ve) 455 (M-H).
Ejemplo 18 Éster 1-(1-carboximetil-3-fluoro-2-oxo-propilcarbamoil)-2-metil-propílico de ácido dibenzo[b,f]azepino-5-carboxílico
53
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos H, I y C-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (100% en la última etapa: IR (sólido) 1791,2, 1714,9, 1683,4, 1525,6, 1492,6, 1370,1, 1325,6, 1229,3, 1212,5, 1053,4, 1032,7, 798,4 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,50 +0,68 (6H, 2 x m), 1,90 (1H, m), 2,54-2,93 (2H, m), 4,20-5,44 (4H, m), 7,02 (2H, s), 7,30-7,80 (8H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 18,73, 19,17, 30,34, 34,56, 52,18, 84,37, 127,92, 128,61, 128,69, 129,63, 130,83, 134,40, 153,90, 169,64, 172,23, 202,29, 202,43, 202,63, 202,76; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) \delta -226,83 (t), -226,87 (t), -232,93 (t), -233,07 (t), -233,10 (t), -233,32 (t); MS (ESI +ve) 469 (M+H).
Ejemplo 19 Éster 1-(1-carboximetil-3-fluoro-2-oxo-propilcarbamoil)-2-metil-propílico de ácido 10,11-dihidro-dibenzo[b,f]azepino-5-carboxílico
54
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos H, I y C-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (100% en la última etapa): IR (sólido) 1796,9, 1683,9, 1521,8, 1491,5, 1368,3, 1324,8, 1278,6, 1213,4, 1201,9, 1108,0, 1056,4, 931,1, 776,5, 746,7 ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,50-0,95 (6H, m), 1,90 (1H, m), 2,55-3,00 (2H, m), 4,20-5,30 (8H, m), 7,10-7,50 (8H, m); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) b 15,24, 16,79, 39,44, 52,43, 78,36, 84,34, 126,80, 1227,89, 128,43, 130,29, 136,29, 154,09, 169,58, 170,03, 172,19, 173,12, 202,28, 202,42; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) -226,76 (t), -233,01 (t), -233,11 (t), -233,38 (t); MS (ESI +ve) 471 (M+H).
Ejemplo 20 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-((S)-2,3-dihidroindol-1-carbamoiloxi-3-metil-butirilamino)-pentanoico 
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55 
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Método J
Éster bencílico de ácido (S)-2-(imidazolcarbamoiloxi)-3-metilbutírico 
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56 
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A una solución agitada de éster bencílico de ácido (S)-2-hidroxi-3-metilbutírico (para la preparación véase J. Med. Chem., (1996), 39, 982, 1,5 g) en THF (20 ml) se añadió carbonildiimidazol (1,17 g) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo (30 ml). La solución se lavó con ácido fosfórico al 1% (2 x 10 ml), seguidamente salmuera (10 ml), se secó (sulfato de magnesio), se filtró y se concentró para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un aceite incoloro (1,89 g): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,02 (3H, d), 1,11 (3H, d), 2,47 (1H, m), 5,15 (1H, d), 5,18-5,32 (2H, m), 7,11 (1H, s), 7,18-7,60 (6H, m), 8,20 (1H, m).
Método K
Éster bencílico de ácido (S)-(2,3-dihidroindol-1-carbamoiloxi)-3-metilbutírico 
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57 
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A una solución agitada de éster bencílico de ácido (S)-2-(imidazolcarbamoiloxi)-3-metilbutírico (355 mg) en THF (7 ml) a 0ºC se añadió trifluorometanosulfonato de metilo (0,13 ml). La solución resultante se agitó durante 30 minutos. Seguidamente se añadió indolina (280 mg) y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo se volvió a disolver en acetato de etilo (30 ml). La solución se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (5 ml) y seguidamente con ácido clorhídrico 1 M (2 x 5 ml), seguidamente con salmuera (5 ml), se secó (sulfato de magnesio) se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía rápida (5-7% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un aceite incoloro (342 mg): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86- 1,18 (6H, m), 2,35 (1H, m), 3,08-3,25 (2H, m), 4,05-4,25 (2H, m), 4,95-5,32 (3H, m), 6,95-7,91 (9H, m).
\newpage
Método L
Ácido (S)-(2,3-dihidroindol-1-carbamoiloxi)-3-metilbutírico 
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58 
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A una solución agitada de éster bencílico de ácido (S)-(2,3-dihidroindol-1-carbamoiloxi)-3-metilbutírico (342 mg) en metanol (25 ml) se añadió 10% de paladio sobre carbono (80 mg). La mezcla se hidrogenó a temperatura ambiente durante 2 horas. Seguidamente la mezcla se filtró a través de celite y el filtrado se concentró para proporcionar el compuesto del subtítulo en forma de un aceite incoloro (255 mg): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,95-1,21 (6H, m), 2,40 (1H, m), 3,20 (2H, m), 4,01-4,25 (2H, m), 4,95-5,15 (1H, m), 6,97-7,99 (4H, m).
Ejemplo 20 Ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-((S)-2,3-dihidroindol-1-carbamoiloxi-3-metil-butirilamino)-pentanoico 
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Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en los métodos C-E. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (94% en la última etapa). IR (sólido): 1680,2, 1485,6, 1413,9, 1137,4, 1050,4, 758,5 cm^{-1}; ^{1}H RMN (400 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 0,95 (6H, brm), 2,17 (1H, brm), 2,50-2,94 (2H, m), 3,12 (2H, brm), 3,84-4,23 (2H, brm), 4,27-5,39 (4H, m), 6,98 (1H, m), 7,22 (2H, m), 7,67 (1H, brm), 7,78-8,30 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); ^{13}C RMN (100 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 17,2, 19,0, 19,2, 27,3, 30,4, 30,6, 32,9, 34,5, 34,6, 47,3, 47,35, 52,0, 52,2, 78,3, 83,4, 85,1, 104,0, 114,2, 123,0, 125,4, 127,5, 131,7, 170,0, 172,07, 172,1, 173,2, 173,25, 202,3, 202,5, 202,6; ^{19}F RMN (376 MHz, d_{6}-DMSO) -226, 7 (t), -226,8 (t), -233,1 (t), -233,3 (t); MS (ESI +ve) 395 (M+H).
Ejemplo 21 Dietilamida de ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico 
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60 
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Método M
A una solución agitada de ácido (Ejemplo 1; preparado como se describió en los métodos A-E) (100 mg) en THF (2 ml) a 0ºC se añadió dietilamina (16 mg) en THF (0,5 ml) seguido de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-(etildarbodiimida, EDC) (48 mg). Seguidamente la mezcla se calentó a temperatura ambiente durante 12 horas. El disolvente se separó bajo presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía rápida (50-60% de acetato de etilo/hexano) para proporcionar la amida en forma de un sólido blanco (54 mg); ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,69-1,38 (12H, m), 2,42-3,37 (7H, m), 4,85-4,92 (1H, m), 5,01-5,55 (3H, m), 7,31-7,70 (5H, m), 7,90-8,05 (2H, m), 8,25-8,42 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -232,6 (t), -232,8 (t); MS (ESI +ve) 498 (M+H).
Ejemplo 22 Etil-amida de ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)carbamoiloxi-butirilaminol-pentanoico
61
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (62%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,96-1,31 (9H, m), 2,21-2,45 (1H, m), 2,48-2,80 (2H, m), 3,15-3,48 (2H, m), 4,23-4,76 (3H, m), 5,05-5,42 (1H, m), 6,42-6,84 (1H, m), 7,38-7,60 (4H, m), 7,95-8,09 (2H, m), 8,20-8,41 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -223,8 (t), -224,5 (t), -226,5 (t), -227,1 (t), -231,9 (t), -232 (t); MS (ESI +ve) 452 (M+H_{2}O).
Ejemplo 23 Piperazinamida de ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
62
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (78%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) (6H, m), 1,80-3,55 (14H, m), 4,82-4,98 (1H, m), 5,00-5,45 (3H, m), 7,38-7,60 (5H, m), 7,95-8,08 (2H, m), 8,27-8,45 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -232,5 (t), -232,7 (t)); MS (ESI +ve) 525 (M+H).
Ejemplo 24 N,N-Dimetilaminoetilamida de ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
63
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (49%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,14-1,31 (6H, m), 1,88-3,04 (13H, m), 3,88-4,41 (3H, m), 4,57-4,74 (1H, m), 5,33-5,61 (1H, m), 6,86-7,12 (1H, m), 7,33-7,56 (4H, m), 8,01-8,05 (2H, m), 8,27-8,41 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -222,4 (t), -222,5 (t); MS (ESI +ve) 513 (M+H).
Ejemplo 25 [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoamida
64
Método N
A una solución agitada de ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo- 3-[(S)-3-metil-2-(carbazol-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico del Ejemplo 1 (150 mg) en diclorometano (1,5 ml) y dimetilformamida (0,075 ml) se añadió carbonildiimidazol (66 mg). La mezcla se agitó durante 2 horas y seguidamente se enfrió a 0ºC mientras se hacía burbujear amoníaco a través de la misma. La mezcla se diluyó con acetato de etilo/solución al 10% de hidrógeno-sulfato de potasio. La fase orgánica se separó y la acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía rápida (5% de metanol/diclorometano) para proporcionar la amida en forma de un sólido blanco (80 mg); ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) 1,10-1,28 (6H, m), 2,12-2,75 (3H, m), 4,10-4,85 (4H, m), 5,29 (1H, m), 6,36, 6,55, 6,78, 6,98 (1H, 4 x s), 7,17 (1H, m), 7,42 (2H, m), 7,50 (2H, m), 7,99 (2H, m), 8,29 (2H, m); 19F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -225,47 (t), -226,00 (t), -227,33 (t), -227,50 (t), -228,43 (t); MS (ESI +ve) 424 (M-H_{2}O+H).
Ejemplo 26 Éster ciclohexílico de ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
65
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (37%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,90-1,80 (16H, m), 2,59 (1H, m), 2,75-3,15 (2H, m), 4,40 (0, 5H, m), 4,64 (0,5H, m), 4,95-5, 45 (4H, m), 7,25 (1H, m), 7,42 (2H, m), 7,52 (2H, m), 8,05 (2H, m), 8,36 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -231,95 (t), -232,08 (t).
Ejemplo 27 Éster n-propílico de ácido [3S/R] -5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol) carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
66
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (82%): 1H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,80 (3H, m), 1,13-1,36 (6H, m), 1,42 (1H, m), 1,58 (1H, m), 2,60 (1H, m), 2,80-3,08 (2H, m), 3,70 (1H, m), 3,98 (1H, m), 4,92-5,50 (4H, m), 7,21 (1H, m), 7,40 (2H, m), 7,50 (2H, m), 8,00 (2H, m), 8,32 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz, CDCl_{3}) -232,00 (t), -232,01 (t); MS (ESI +ve) 485 (M+H).
Ejemplo 28 Éster isopropílico de ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
67
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (7%): 1H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,90-1,33 (12H, m), 2,55 (1H, m), 2,78-3,15 (2H, m), 4,80-5,50 (5H, m), 7,25 (1H, br s), 7,43 (2H, m), 7,55 (2H, m), 8,05 (2H, m), 8,36 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz CDCl_{3}) -232,00 (t), -232,03 (t).
Ejemplo 29 Éster metílico de ácido [3S/R]-5-Fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino] -pentanoico
68
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método M. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (81%): \delta ^{1}H RMN (400 MHz CDCl_{3}) 1,20 (6H, m), 2,58 (1H, m), 2,80-3,05 (2H, m), 3,42, 3,61 (3H, 2 x s), 4,98-5,26 (3H, m), 5,41 (1H, m), 7,20 (1H, br s), 7,45 (2H, m), 7,55 (2H, m), 8,04 (2H, m), 8,35 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz CDCl_{3}) -231,99 (t), -232,00 (t); MS (ESI +ve) 457 (M+H).
Ejemplo 30 Éster de colesterol y ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazol)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanoico
69
Este se preparó usando procedimientos similares a los descritos en el método N, usando carbonildiimidazol como reactivo de acoplamiento. El producto se aisló en forma de un sólido blanco (12%): ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,65-2,35 (47H, m), 2,58 (1H, m), 2,75-3,15 (2H, m), 4,25 (0,5H, m), 4,48 (0,5H, m), 4,97-5,46 (5H, m), 7,30 (1H, m), 7,44 (2H, m), 7,58 (2H, m), 8,05 (2H, m), 8,33 (1H, m); ^{19}F RMN (376 MHz CDCl_{3}) -231,91 (t), -232,03 (t). El correspondiente cetal se aisló también en forma de un sólido blanco (21%): ^{1}H RMN (400 MHz CDCl_{3}) \delta 0,65-2,10 (48H, m), 2,35-3,15 (2H, 3xm), 3,42-3,69 (1H, m), 4,10-4,96 (4H, m), 5,15-5,65 (2H, m), 6,78 (1H, m), 7,45 (2H, m), 7,57 (2H, m), 8,05 (2H, m), 8,34 (2H, m); ^{19}F RMN (376 MHz CDCl_{3}) -230,57 (t), -230,67 (t).
Métodos de ensayo Ensayo de enzimas
Los ensayos para la inhibición de caspasas están basados en la escisión de un sustrato fluorógeno mediante caspasas 1, 3, 7 ó 8 humanas purificadas recombinantes. Los ensayos son realizados esencialmente de la misma manera que los descritos por Garcia-Calvo et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998), 32608-32613), usando un sustrato específico para cada enzima. El sustrato para caspasa-1 es acetil-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-metilcumarina. El sustrato para las caspasas 3, 7 y 8 es acetil-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metilcumarina.
La velocidad observada de inactivación de las enzimas a una concentración particular de inhibidor, k_{obs}, es tratada por ordenador mediante ajustes directos de los datos a la ecuación derivada por Thornberry et al. (Biochemistry 33 (1994), 3943-3939) usando un programa de ordenador de análisis no lineal de los cuadrados mínimos (PRISM 2.0; GraphPad software). Para obtener la constante de velocidad de segundo orden, los valores de k_{inact} y k_{obs} son representados gráficamente frente a sus respectivas concentraciones de inhibidores y los valores de k_{inact} son posteriormente calculados mediante regresión lineal por ordenador. Muchos de los presentes compuestos que fueron ensayados tenían, frente a caspasa-1, valores de k_{inact} entre 25.000 y 1.500.000 M^{-1}s^{-1}; frente a caspasa-3, valores de k_{inact} entre 9.000 y 1.500.000 M^{-1}s^{-1}; frente a caspasa-8, valores de k_{inact} entre 10.000 y 700.000 M^{-1}s^{-1}.
Inhibición de la secreción IL-1\beta a partir de una población mixta de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
El tratamiento de pre-IL-1\beta por caspasa-1 puede ser medido en un cultivo celular usando una diversidad de fuentes de células. Las PBMC humanas obtenidas de donantes sanos proporcionan una población mixta de células de linfocitos y mononucleares que producen un espectro de interleucinas y citoquinas a respuesta a muchas clases de estimuladores fisiológicos.
Procedimiento experimental
El compuesto del ensayo es disuelto en dimetil-sulfóxido (DMSO, Sigma nº D-2650) para proporcionar una solución madre 100 mM. Esta es diluida en un medio completo que consiste en RPMI que contiene FCS al 10% inactivado con calor (Gibco BRL nº 10099-141), L-glutamina 2 mM (Sigma, nº G-7513), 100 U de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (Sigma nº P-7539). El intervalo final de concentración del compuesto del ensayo es desde 100 \muM hasta 6 nM sobre ocho etapas de dilución. La concentración más elevada de compuesto del ensayo es equivalente a DMSO al 0,1% en el ensayo.
Las PBMC humanas son aisladas de capas Buffy Coats obtenidas a partir del banco se sangre usando una centrifugación en un medio de separación de leucocitos de placas Ficoll (Amersham, nº 17-1440-02) y el ensayo celular se realiza en una placa de 96 pocillos de fondo liso esterilizada (Nunc). Cada pocillo contiene 100 \mul de suspensión celular, 1 x 10^{5} células, 50 \mul de diluciones de compuesto y 50 \mul de LPS (Sigma nº L-3012) a una concentración final de 50 ng/ml. Los testigos consisten en células +/- estimulación con LPS y una dilución en serie de DMSO diluido de la misma forma que el compuesto. Las placas son incubadas durante 16-18 h a 37ºC en 5% de CO_{2} y una atmósfera de humedad del 95%.
Después de 16-18 h las materias sobrenadantes son recogidas después de centrifugar las placas a 100 x g a 18ºC durante 15 minutos y ensayadas en cuanto a su contenido de IL-1\beta. La medición de IL-1\beta madura en la materia sobrenadante se realiza usando los estuches de ensayo Quantikine (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. Son observados niveles de IL-1\beta madura de aproximadamente 600-1500 pg/ml para PBMCs en pocillos testigos positivos.
La potencia inhibidora de los compuestos puede ser representada mediante un valor de IC_{50} que es la concentración de inhibidor a la que es detectada un 50% de IL-1\beta madura en la materia sobrenadante en comparación con los testigos positivos. La tabla 5 muestra la inhibición de la secreción IL-1\beta a partir de células mononucleares de sangre periférica para compuestos seleccionados de esta invención, según se determina mediante los métodos anteriores.
Los compuestos seleccionados han sido ensayados en este ensayo y se mostró que inhiben la liberación de IL-1\beta con valores de IC_{50} entre 0,04 \muM y 20 \muM.
Ensayo de apoptosis inducida por anti-Fas
La apoptosis celular puede ser inducida mediante la unión de ligando Fas (FasL) a su receptor, CD95 (Fas). El CD95 es uno de una familia de receptores relacionados, conocidos como receptores de muerte, que pueden provocar la apoptosis en células a través de la activación de una cascada de enzimas de caspasas. El procedimiento es iniciado mediante la unión de la molécula adaptadora FDD/MORT-1 al dominio citoplásmico del complejo de receptor/ligando CD-95. La caspasa-8 se une seguidamente a FADD y resulta activada, iniciando una cascada de acontecimientos que incluye la activación de las caspasas en dirección descendente y la posterior apoptosis celular. La apoptosis puede ser inducida también en células que expresan CD95, por ejemplo, la línea celular de linfoma celular Jurkat E6.1 T, usando un anticuerpo en lugar de FasL, para reticular el CD95 de la superficie celular. La apoptosis inducida por anti-Fas es provocada también mediante la activación de caspasa-8. Esto proporciona la base de un ensayo basado en células para seleccionar compuestos para la inhibición de la trayectoria apoptótica mediada por caspasa-8.
Procedimiento experimental
Son cultivadas células Jurkat E6.1 en medio completo que consiste RPMI-1640 (Sigma nº) + 10% de suero de ternera fetal (Gibco BRL Nº 19900-141) + L-glutamina 2 mM (Sigma nº G-7513). Las células son recogidas en fase log de crecimiento. Se transfieren 100 ml de células a 5-8 x 10^{5} células/ml a tubos de centrifugadora Falcon esterilizados de 50 ml y se centrifuga durante 5 minutos a 100 x g a temperatura ambiente. La materia sobrenadante se separa y los sedimentos de células combinados se vuelven a poner en suspensión en 25 ml de medio completo. Las células se recuentan y la densidad se ajusta a 2 x 10^{6} células/ml con medio completo.
El compuesto del ensayo se disuelve en dimetil-sulfóxido (DMSO) (Sigma nº D-2650) para proporcionar una solución madre 100 mM. Esta es diluida hasta 400 \muM en medio completo, seguidamente es diluida en serie en una placa de 96 pocillos antes de la adición a la placa de ensayo celular.
Se añaden 100 \mul de la suspensión celular (2 x 10^{6} células) a cada pocillo de una placa cluster de fondo redondeado de 96 pocillos esterilizado (Costar nº 3790). Se añaden a los pocillos 50 \mul de solución del compuesto a la dilución apropiada y 50 \mul de anticuerpo anti-Fas, clon CH-11 (Kamiya nº MC-060) a una concentración final de 10 mg/ml. Los pocillos testigos son ajustados a menos anticuerpo y menos compuesto pero con una dilución en serie de DMSO como testigo de vehículo. Las placas incubadas durante 16-18 horas a 37ºC en 5% de CO_{2} y una humedad relativa de 95%.
La apoptosis de las células es medida mediante la cuantificación de la fragmentación de DNA usando un "ensayo de detección de la muerte celular" de la empresa Boehringer-Mannheim, nº 1544 675. Después de una incubación durante 16-18 horas, las placas del ensayo son centrifugadas a 100 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se separan 150 \mul de la materia sobrenadante y se sustituyen con 150 \mul de medio completo de nueva aportación. Las células son seguidamente recogidas y se añaden 200 \mul del tampón de lisis suministrado en el estuche del ensayo a cada pocillo. Las células son trituradas para asegurar una lisis completa y son incubadas durante 30 minutos a 4ºC. Las placas son seguidamente centrifugadas a 1900 x g durante 10 minutos y las materias sobrenadantes son diluidas 1:20 en el tampón de incubación proporcionado. Seguidamente se añaden 100 \mul de esta solución según las instrucciones del fabricante suministradas con el estuche del ensayo. La OD_{405}nm es medida 20 minutos después de la adición del sustrato final en un lector de placas SPECTRAmax Plus (Molecular Devices). La OD_{405}nm es representada gráficamente a la concentración de compuesto y los valores de IC50 para los compuestos son calculados usando el programa de ajuste de curvas SOFTmax Pro (Molecular Devices) usando la opción de ajuste de cuatro parámetros.
Los compuestos seleccionados han sido ensayados en este ensayo y mostraron que inhibían la apoptosis inducida por FAS de células Jurkat con valores de IC_{50} entre 0,001 \mum y 0,15 \muM.
Aunque se ha descrito un cierto número de realizaciones de esta invención, es evidente que los ejemplos básicos pueden ser alterados para proporcionar realizaciones que utilicen los compuestos y métodos de esta invención. Por lo tanto, debe apreciarse que el alcance de esta invención está definido por las reivindicaciones anejas en lugar por las realizaciones específicas, que han sido representadas a modo de ejemplo.

Claims (23)

1. Un compuesto de fórmula I:
70
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la cual:
Z es oxígeno o azufre;
R^{1} es hidrógeno, -CHN_{2}, R, -CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
R es un grupo alifático C_{1-12}, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo;
Y es un grupo lábil electronegativo seleccionado entre F, Cl, Br, I, arilo y grupos alquilsulfoniloxi, trifluorometanosulfoniloxi, OR', SR', -OC=O(R') o -OPO(R^{6})(R^{7}),
en los que R' es un grupo alifático, un grupo arilo, un grupo aralquilo, un grupo carbocíclico, un grupo alquil-carbocíclico, un grupo heterocíclico o un grupo alquil-heterocíclico;
en el que R^{6} y R^{7} se seleccionan independientemente entre R' o OR';
R^{2} es CO_{2}H, CH_{2}CO_{2}H o sus ésteres o amidas o CONHSO_{2}-(alquilo);
R^{3} se selecciona entre H, una cadena lateral de un \alpha-aminoácido natural o un grupo sustituido o sin sustituir que tiene un peso molecular hasta 140 daltones seleccionado entre un grupo alifático, arilo, aralquilo o un anillo heterocíclico o heterocicloalquilo en el que el que dicho anillo heterocíclico o de heterocicloalquilo es un sistema de anillos monocíclico o policíclico saturado o insaturado de tres a nueve miembros en el que cada anillo contiene hasta tres heteroátomos seleccionados entre O, N o S; y
R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos mono-, bi- o tri-cíclico que tiene 1-6 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno o azufre.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene una o más de las siguientes características:
(i) Z es oxígeno;
(ii) R^{1} es hidrógeno, -R, CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
(iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster o amida del mismo o CONHSO_{2}-(alquilo);
(iv) R^{3} es un grupo que tiene un peso molecular hasta 140 daltones;
(v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que cada anillo del sistema tiene 5-7 átomos en el anillo.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que el compuesto tiene las siguientes características:
(i) Z es oxígeno.
(ii) R^{1} es hidrógeno, -R, CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
(iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster o amida del mismo o CONHSO_{2}-(alquilo);
(iv) R^{3} es un grupo que tiene un peso molecular hasta 140 daltones;
(v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos o heteroarilo monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que cada anillo del sistema tiene 5-7 átomos en el anillo.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que R^{1} es -CH_{2}Y.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en el que R^{1} es -CH_{2}F y R^{3} es un grupo alquilo C_{1-4}.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en el que R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos o heteroarilo bicícliclo o tricíclico en el que cada anillo del sistema tiene 5-7 átomos en el anillo.
7. El compuesto de la reivindicación 6, en el que R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos heterocíclicos o heteroarilo tricíclico en el que cada anillo del sistema tiene 5-7 átomos en el anillo.
8. El compuesto de la reivindicación 7, en el que el anillo medio del sistema de anillos tricíclico es un anillo de cinco o seis miembros.
9. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene una o más de las siguientes características:
(i) Z es oxígeno;
(ii) R^{1} es CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
(iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster o amida del mismo o CONHSO_{2}-(alquilo);
(iv) R^{3} alquilo C_{1-4}; o
(v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un anillo seleccionado entre indol, isoindol, indolina, indazol, purina, dihidropiridina, bencimidazol, imidazol, imidazolina, pirrol, pirrolidina, pirrolina, pirazol, pirazolina, pirazolidina, triazol, piperidina, morfolina, tiomorfolina, piperazina, carbazol, fenotiazina, fenoxazina, dibenzoazepina, dihidro-dibenzoazepina, dihidrofenazina, dihidrocinolina, dihidroquinoxalina, tetrahidroquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidronaftiridina, tetrahidronaftiridina, dihidroacridina, \beta-carbolina, pirido[4,3-b]indol, 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diazaantraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-b]pirrol o dihidrofenantridina.
10. El compuesto de la reivindicación 9, en el que el compuesto tiene una o más de las siguientes características:
(i) Z es oxígeno.
(ii) R^{1} es CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
(iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster o amida del mismo o CONHSO_{2}-(alquilo);
(iv) R^{3} alquilo C_{1-4}; o
(v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un anillo seleccionado entre indol, isoindol, indolina, indazol, bencimidazol, imidazol, pirrolidina, pirazol, triazol, piperidina, morfolina, tiomorfolina, piperazina, carbazol, fenotiazina, fenoxazina, dibenzoazepina, dihidro-dibenzoazepina, dihidrofenazina, dihidrocinolina, dihidroquinoxalina, tetrahidroquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidronaftiridina, tetrahidronaftiridina, dihidroacridina, \beta-carbolina, pirido[4,3-b]indol- 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diazaantraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-b]pirrol o dihidrofenantridina.
11. El compuesto de la reivindicación 10, en el que el compuesto tiene una o más de las siguientes características:
(i) Z es oxígeno.
(ii) R^{1} es CH_{2}OR, -CH_{2}SR o -CH_{2}Y;
(iii) R^{2} es CO_{2}H o un éster o amida del mismo o CONHSO_{2}-(alquilo);
(iv) R^{3} alquilo C_{1-4}; o
(v) R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos sustituido o sin sustituir seleccionado entre carbazol, fenotiazina, indol, indolina, 5H-dibenzo[b,f]azepina, 10,11-dihidro-5H-dibenzo[b,f]azepina, \beta-carbolina, pirido[4,3-b]indol-2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diazaantraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-b]pirrol o dihidrofenantridina.
12. El compuesto de la reivindicación 11, en el que Z es oxígeno; R^{1} es -CH_{2}OR, -CH_{2}SR, o -CH_{2}Y; R^{2} es CO_{2}H o un éster, amida o isoéster del mismo; R^{3} se alquilo C_{1-4} y R^{4} y R^{5} tomados conjuntamente con el átomo de nitrógeno que interviene forman un sistema de anillos sustituido o sin sustituir seleccionado entre carbazol, fenotiazina, indol, indolina, 5H-dibenzo[b,f]azepina, 10,11-dihidro-5H-dibenzo[b,f]azepina, \beta-carbolina, pirido[4,3-b]indol-2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diazaantraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-b]pirrol o dihidrofenantridina.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en el que R^{1} es -CH_{2}Y.
14. El compuesto de la reivindicación 13, en el que R^{1} es -CH_{2}F.
15. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona entre los siguientes:
71
72
73
74
75
76
77
78 
\newpage
16. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona entre los siguientes:
79
80
17. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad en un paciente que es aliviada mediante tratamiento con un inhibidor de caspasas.
19. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad seleccionada entre una enfermedad mediada por IL-1, una enfermedad mediada por apoptosis, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, un trastorno de destrucción ósea, un transtorno proliferativo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad degenerativa, una enfermedad asociada con la muerte celular, una enfermedad de consumo excesivo de alcohol en la dieta, una enfermedad mediada por virus, uveitis, peritonitis inflamatoria, ostereoartritis, pancreatitis, asma, síndrome de dificultad respiratoria en adultos, glonumeronefritis, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, escleroderma, tiroiditis crónica, enfermedad de Grave, gastritis autoinme, diabetes, anemia emolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, hepatitis activa crónica, niastemia grave, enfermedad de inflamación intestinal, enfermedad de Crohn, soriasis, dermatitis atópica, cicatrizaciones, enfermedad de injerto frente a hospedante, rechazo de transplante de órganos, osteoporosis, leucemias y trastornos relacionados, síndrome mielodisplástico, trastorno óseo relacionado con mielomas múltiples, leucemia mielogenosa aguda, leucemia milelogenosa crónica, melanoma metastático, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, choque hemorrágico, sepsis, choque séptico, quemaduras, shingelosis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, enfermedad priónica, isquemia cerebral, epilepsia, isquemia de miocardio, enfermedad cardíaca aguada y crónica, infarto de miocardio, fallo cardíaco congestivo, aterosclerosis, injerto de bypass en arterias coronarias, atrofia muscular espinal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, encefalitis relacionada con HIV, envejecimiento, alopecia, deterioro neurológico debido a apoplejía, colitis ulcerativa, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis G, fiebre amarilla, fiebre de dengue o encefalitis japonesa, diversas formas de enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad de riñón poliáptico, enfermedad de úlcera gástrica o duodenal asociada con H. pilori, infección por HIV, tuberculosis, meningitis, un tratamiento para complicaciones asociadas con injertos de bypass en arterias coronarias o una inmunoterapia para el tratamiento de diversas formas de cáncer.
20. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para la preparación de una composición farmacéutica, en el que la composición es usada para tratar complicaciones asociadas con injertos de bypass en arterias coronarias.
21. Método in vitro para la conservación de células, en que dicho método comprende la etapa de tratar en un baño las células en una solución del compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para la preparación de una composición farmacéutica, en el que la composición es usada en relación con un trasplante de órganos o para conservar productos sanguíneos.
23. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para la preparación de una composición farmacéutica, en el que la composición es usada como un componente de inmunoterapia para el tratamiento de cáncer.
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