CZ20023227A3

CZ20023227A3 - Karbamátové inhibitory kaspázy a jejich pouľití

Info

Publication number: CZ20023227A3
Application number: CZ20023227A
Authority: CZ
Inventors: David Bebbington; Jean-Damien Charrier; David Kay; Ronald Knegtel; Julian Golec; Michael Mortimore; John Studley
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Incorporated
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2003-01-15
Also published as: EP1268425A2; AU4961901A; EA200201030A1; EE200200550A; US20020028803A1; PE20011267A1; DE60132567D1; NZ521639A; EP1268425B1; CN1994298A; PT1268425E; PL358430A1; JP2008266348A; DK1268425T3; ATE384695T1; NO20024661D0; ES2296742T3; PL201081B1; HUP0301472A2; KR20020086711A

Description

Karbamátové inhibitory kaspázy a jejich použití

Oblast techniky

Vynález je z oblasti lékařské chemie a týká se nových sloučenin a jejich farmaceutických přípravků, které inhibují kaspázu, jež zprostředkovává buněčnou apoptózu a záněty. Vynález se také týká způsobů použití sloučenin a farmaceutických přípravků podle tohoto vynálezu k léčení nemocí, v nichž je zahrnuta kaspážová aktivita.

Dosavadní stav techniky

Tato přihláška nárokuje prioritu vůči US provizorní patentové přihlášce 60/192,826, podané 29. března 2000.

Apoptóza, nebo jinak programovaná buněčná smrt, je zíkladním mechanismem, kterým organismus eliminuje nežádoucí buňky. Deregulace apoptózy, a to jak přehnaná apoptóza nebo její selhání, jsou zahrnuty v mnoha nemocích jako je třeba rakovina, akutní záněty a poruchy autoimunity, ischemická onemocnění a některé neurodegenerativní poruchy (viz obecně Science, 1998, 281, 1283-1312; Ellis et al., Ann. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).

Kaspázy jsou třídou cysteinových proteázových enzymů, které jsou klíčovými mediátory v signálních cestách apoptózy a buněčného rozkladu (Thornberry, Chem. Biol., 1998, 5, R97R103) . Tyto signální cesty se liší v závislosti na druhu buňky a stimulech, ovšem všechny cesty apoptózy se zdají konvergovat ke společné efektorové reakční cestě vedoucí k proteolýze klíčových proteinů. Kaspázy jsou zahrnuty jak v efektorové fázi signálního mechanismu tak i v dalším šíření proti proudu a jeho iniciaci. Protiproudé kaspázy zahrnuté ···· ·· ·· ·· ·· ···· v iniciačních událostech se aktivují a posléze aktivují další kaspázy, které jsou zahrnuty v pozdějších fázích apoptózy.

Kaspáza-1, první identifikovaná kaspáza, je také známa jako enzym konvertující interleukin nebo „ICE. Kaspáza-1 převádí interleukin-ΐβ („pIL-Ιβ) na pro-zánětlivě aktivní formu pomocí specifického štěpení pIL-Ιβ mezi Asp-116 a Ala117. Kromě kaspázy-1 je zde také jedenáct dalších známých lidských kaspáz, které se všechny specificky štěpí na aspartylových zbytcích. Bylo také pozorováno, že mají výrazné požadavky na nejméně čtyři aminokyselinové zbytky na Nterminálním konci štěpeného místa.

Kaspázy se klasifikují do tří skupin v závislosti na aminokyselinové sekvenci, která je preferována nebo se primárně rozpoznává. Bylo ukázáno, že skupina kaspáz, zahrnující kaspázy 1, 4 a 5, preferuje hydrofóbní aromatické aminokyseliny v poloze 4 N-terminálního řetězce štěpeného místa. Další skupina, zahrnující kaspázy 2, 3 a 7, rozeznává aspartylové zbytky v obou polohách 1 a 4 terminálního řetězce štěpeného místa, a s výhodou sekvenci Asp-Glu-X-Asp. Třetí skupina, zahrnující kaspázy 6, 8, 9 a 10, toleruje mnohé aminokyseliny v primárně rozpoznávané sekvenci, ovšem zdá se, že preferuje zbytky s rozvětvenými alifatickými postranními řetězci jako jsou valin a leucin v poloze 4.

Kaspázy byly také rozděleny podle jejich funkce vnímání. První podskupina se skládá z kaspázy 1 (ICE), 4 a 5. Bylo ukázáno, že tyto kaspázy jsou zahrnuty v pro-zánětlivém cytokinovém působení a hrají tedy důležitou roli při zánětech. Kaspáza-1, nej studovanější enzym této skupiny, aktivuje IL-Ιβ prekurzor proteolytickým štěpením. Tento enzym proto hraje klíčovou roli v zánětlivé odezvě. Kaspáza 1 je také zahrnuta v působení faktoru indukujícího interferon gamma (IGIF nebo IL-18), který stimuluje produkci interferonu

gamma, klíčového imunoregulátoru, který moduluje způsob prezentace antigenu, T-buněčnou aktivaci a buněčnou adhezi.

Zbývající kaspázy tvoří druhou a třetí podskupinu. Tyto enzymy mají ústřední důležitost v itracelulární signální reakční cestě vedoucí k apoptóze. Jedna podskupina se skládá z enzymů, zahrnutých v iniciačních událostech apoptózové reakční cesty, včetně transdukce signálů z plasmatické membrány. Členy této podskupiny zahrnují kaspázu 2, 8, 9a 10. Další podskupina, skládající se z apoptózy 3, 6 a 7, je zahrnuta v konečném protiproudém štěpení, které vede v systematické rozbití a buněčnou smrt pomocí apoptózy. Kaspázy zahrnuté v protiproudé signálové transdukci aktivují souproudé kaspázy, které poté vyřazují mechanismus opravy DNA, fragmntují DNA, rozebírají buněčný cytoskeleton a na závěr bourají buňku na fragmenty.

U enzymových substrátů byla určena sekvence čtyř aminokyselin primárně rozpoznávaných kaspázami. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272, 9677-9682 (1997); Thornberry et al.,

J. Biol. Chem. 272, 17907-17911 (1997). Znalost sekvence čtyř aminokyselin primárně rozpoznávaných kaspázami byla využita pro design kaspázových inhibitorů. Byly připraveny reverzibilní tetrapeptidové inhibitory, mající strukturu CH₃CO- [P4] - [P3] - [P2] -CH (R) CH₂CO₂H, kde P2 až P4 představují optimální rozpoznávanou aminokyselinovou sekvenci a R je aldehyd, nitril nebo keton, schopný vázání ke kaspázovému cysteinovému sulfhydrylu. Ráno a Thornberry, Chem. Biol., 4, 149-155 (1997); Mjalli, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689-2692 (1993); Nicholson et al., Nátuře 376, 37-43 (1995). Byly připraveny irevirzibilní inhibitory založené na analogických tetrapeptidových rozpoznávacích sekvencích, kde R je acyloxymethylketon -COCH₂OCOR' . R' je například případně substituovaný fenyl jako je 2,6-dichlorbenzyloxy a kde R je

COCH2X, kde X je odstupující skupina jako je F nebo Cl. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J. Med. Chem. 37, 563-564 (1994).

Užitečnost kaspázových inhibitorů pro léčení mnoha svacích onemocnění, spojených se zvýšenou buněčnou apoptózou byla demonstrována s využitím peptidických kaspázových inhibitorů. Například, na hlodavčím modelu bylo ukázáno, že kaspázové inhibitory redukují velikost infarktu a inhibují kardiomyocytovou apoptózu po infarktu myokardu, redukují objem léze a snižují neurologický deficit vzniklý po infarktu, redukují post-traumatickou apoptózu a neurologický deficit při traumatických poraněních mozku, jsou efektivní při léčení fulminantní destrukce jater a zlepšují přežití po endotoxickém šoku. Yaoita et al., Circulation, 97, 276 (1998); Endres et al., J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238, (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al., J. Neuroscience, 17, 7415 (1997); Rodriquez et al., J. Exp. Med., 184, 2067 (1996); Grobmyer et al., Mol. Med., 5, 585 (1999).

Obecně, výše popsané peptidické inhibitory jsou velmi účinné proti některým kaspázovým enzymům. Ovšem tato účinnost se ne vždy odráží v buněčných modelech apoptózy. Kromě toho jsou peptidové inhibitory typicky charakteristické nežádoucími farmakologickými vlastnostmi jako je slabá orální absorpce, slabá stabilita a rychlý metabolismus. Plattner a Norbeck, v Drug Discovery Technologies, Clark a Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, Anglie, 1990) .

Jsou popsány modifikované · peptidové inhibitory. WO 91/15577 a WO 93/05071 popisují peptidové ICE inhibitory vzorce:

Z-Q₂-Asp-Qi • · · · · • · • · ·· kde Z je N-terminální chránící skupina; Q₂ je O až 4 aminokyselin a Qi je elektronegativní odstupující skupina.

WO 99/18781 popisuje dipeptidové kaspázové inhibitory vzorce:

kde Ri je N-terminální chránící skupina, AA je zbytek přírodní α-aminokyseliny nebo β-aminokyseliny; R₂ je vodík nebo CH₂R₄, kde R₄ je elektronegativní odstupující skupina a R₃ je alkyl nebo vodík.

WO 99/47154 popisuje dipeptidové kaspázové inhibitory vzorce:

kde Ri je terminální chránící skupina; AA je zbytek nepřirodní α-aminokyseliny nebo β-aminokyseliny a R₂ je případně substituovaný alkyl nebo vodík.

WO 00/023421 popisuje (substituované) acyldipeptidové apoptózové inhibitory mající vzorec:

JDO2R³ kde n je 0, 1 nebo 2, q je 1 nebo 2, A je zbytek určité přírodní nebo nepřírodní aminokyseliny, B je vodíkový atom, deuteriový atom, C1-10 alkyl s rovným nebo rozvětveným řetězcem, cykloalkyl, fenyl, substituovaný fenyl, naftyl, substituovaný naftyl, 2-benzoxazolyl, substituovaný 2oxazolyl, (CH₂)_mcykloalkyl, (CH₂)_mfenyl, (CH₂)_mheteroaryl, halomethyl, CO₂R¹³, CONR¹⁴R¹⁵, CH2ZR¹⁶, CH2OCOaryl,

CH₂OCO(substituovaný aryl), CH₂OCO(heteroaryl),

CH₂OCO (substituovaný heteroaryl) nebo CH₂OPO (R¹⁷) R¹⁸, kde R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ a R¹⁸ jsou definované ve vynálezu; R² je vybrán ze skupiny obsahující vodík, alkyl, cykloalkyl, fenyl, substituovaný fenyl, (CH₂)_mNH₂; R³ je vodík, alkyl, cykloalkyl, (cykloalkyl)alkyl, fenylalkyl nebo substituovaný fenylalkyl; X je CH₂, C=0, 0, S, NH, C=ONH nebo CH₂OCONH; a Z je kyslíkový nebo sírový atom.

WO 97/24339 popisuje inhibitory enzymu konvertujícího interleukin-ΐβ vzorce:

O ,iA

ΆΑ^ΑΑ,-Ν-Υ H kde Rl reprezentuje H, alkyl, alkoxy, karbocyklickou skupinu, heterocyklickou skupinu a různé další skupiny; AA¹ a AA² jsou jednoduché vazby nebo aminokyseliny a Y reprezentuje skupinu vzorce:

o kde Tet kruh představuje tetrazolový kruh a Z reprezentuje mimo jiné alkylen, alkenylen, O, S, SO a S0₂.

EP 618223 popisuje ICE inhibitory vzorce:

R-A^A^X-A³ kde R je vodík, chránící skupina nebo případně kruhem substituovaný PhCHO; a-hydroxy- nebo a-aminokyselinový zbytek; A₂ je a-hydroxykyselinový zbytek nebo a-aminokyselina nebo Ai a A₂ tvoří společně psudodipeptid nebo dipeptidmimetický zbytek; X je zbytek odvozený od Asp, kde A3 je CH₂XiCOYi, CH₂OY₂, CH₂SY₃ nebo CH₂(CO)mY₆, kde X_x je O nebo S, m je O nebo 1 a Y_x, Y₂, Y3 a Υβ jsou případně substituované cyklické alifatické nebo arylové skupiny.

0

0 0 0 0

WO 98/16502 popisuje mimo jiné ICE inhibitory vzorce:

kde Rl a R2 jsou podle popisu v přihlášce a pyrrolidinový kruh je substituován různými skupinami.

Zatímco bylo popsáno množství kaspázových inhibitorů, není zřejmé, zda všechny vykazují odpovídající farmakologické vlastnosti, které by byly terapeuticky zajímavé. Je tedy pokračující zájem o malé molekuly kaspázových inhibitorů, které by byly účinné, stabilní a propustné pro membrány, aby byly účinnými inhibitory apoptózy in vivo. Takové sloučeniny by byly extrémně užitečné při léčení výše zmíněných onemocnění, kde hrají roli kaspázové enzymy.

Podstata vynálezu

Bylo shledáno, že sloučeniny podle tohoto vynálezu a jejich farmaceutické přípravky jsou účinné jako inhibitory kaspáz a buněčné apoptózy. Tyto sloučeniny mají obecný vzorec I:

kde:

Z je kyslík nebo síra,

R¹ je vodík, -CHN₂, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo ~CH₂Y,

R je Ci_i₂alifatický zbytek, aryl, aralkyl, heterocyklyl nebo heterocyklylalkyl,

Y je elektronegativní odstupující skupina, ···· ·· ·· ·· ·· ····

R² je CO2H, CH2CO2H nebo estery, amidy nebo jejich isostery,

R³ je skupina schopná napasování do S2 submísta kaspázy,

R⁴ a R⁵ tvoří společně s intervenujícím dusíkem mono-, binebo tricyklický heterokruhový systém, mající 1 až 6 heteroatomů, vybraných ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají inhibiční vlastnosti vůči spektru kaspázových cílů s dobrou účinností u buněčného modelu apoptózy. Kromě toho, tyto sloučeniny mají dobrou buněčnou penetraci a farmakokinetické vlastnosti, a jako následek jejich vlastností, vykazují dobrou účinnost vůči onemocněním, v nichž jsou zahrnuty kaspázy.

Detailní popis vynálezu

Tento vynález zajišťuje nové sloučeniny a jejich farmaceuticky přijatelné deriváty, které jsou užitečné jako kaspázové inhibitory. Vynález také zajišťuje způsoby použití sloučenin k inhibování kaspázové aktivity a k léčení onemocnění vyvolaných kaspázami. Tyto sloučeniny mají obecný vzorec I:

I kde:

Z je kyslík nebo síra,

R¹ je vodík, -CHN₂, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y,

R je Ci-i2alifatický zbytek, aryl, aralkyl, heterocyklyl nebo heterocyklylalkyl,

Y je elektronegativní odstupující skupina,

R² je CO2H, CH2CO2H nebo estery, amidy nebo jejich isostery,

R³ je skupina schopná napasování do S2 submísta kaspázy, • · « thienyl, oxazolyl,

V tomto vynálezu se používají následující definice, pokud není uvedeno jinak. Termín „alifatický označuje v tomto vynálezu Ci až C12 uhlovodík s rovným nebo rozvětveným řetězcem, který je úplně nasycený nebo který obsahuje jednu nebo více nenasycených jednotek. Například, vhodné alifatické skupiny zahrnují substituovanou nebo nesubstituovanou lineární, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou, alkenylovou nebo alkynylovou skupinu a jejich hybridy jako jsou (cykloalkyl)alkyl, (cykloalkenyl)alkyl nebo (cykloalkyl)alkenyl. Termín „alkyl použitý samotný nebo jako část větší skupiny označuje jak rovné tak i rozvětvené řetězce obsahující jeden až dvanáct uhlíkových atomů. Když je termín alkyl použit jako část větší skupiny, jako třeba aralkyl nebo heteroaralkyl, bude alkylová část přednostně obsahovat jeden až šest uhlíků. Termín „halogen označuje F, Cl, Br nebo I. Termín „aryl označuje monocyklickou nebo polycyklickou aromatickou kruhovou skupinu mající pět až čtrnáct atomů, jako třeba fenylová, naftylová nebo anthrylová skupina. Termín „heterocyklická skupina označuje nasycený nebo nenasycený monocyklický nebo polycyklický kruhový systém, obsahující jeden nebo více heteroatomů a s velikostí kruhu od tří do devíti atomů jako jsou např. furanyl, pyrrolyl, pyrrolinyl, pyrrolidinyl, dioxolanyl, thiazolyl, imidazolyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, pyrazolyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl, morfolinyl, pyranyl, pyridinyl, piperidinyl, dioxanyl, dithianyl, thiomorfolinyl, pyridazinyl, • » • 4 · 4 ···· · · · · · · · 9 9 999 9 999 999 4 • · · · · 9 9 9 9

9999 99 99 99 9· 9999 pyrimidinyl, pyrazinyl, piperazinyl, triazinyl, trithianyl, indolizinyl, indolyl, isoindolyl, indolinyl, benzofuranyl, benzothiofenyl, indazolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, purinyl, chinolizinyl, chinolinyl, isochinolinyl, cinnolinyl, ftalazinyl, chinazolinyl, chinoxalinyl, 1,8-naftyridinyl, pteridinyl, chinuklidinyl, karbazolyl, akridinyl, fenazinyl, fenothiazinyl, nebo fenoxazinyl. „Heteroaryl označuje heterocyklický kruh, který je aromatický. Rozumí se, že sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou omezeny na ty, které existují v přírodě jako stabilní chemické sloučeniny.

Termín „karbocyklická skupina označuje nasycený monocyklický nebo polycyklický uhlovodíkový kruhový systém mající tři až čtrnáct uhlíkových atomů, který může být kondenzován k aryiové nebo heterocyklické skupině. Příklady zahrnují cyklohexyl, cyklopentyl, cyklobutyl, cyklopropyl, indanyl, tetrahydronaftyl a podobně.

„Alifatický, alkyl, aryl, heteroaryl, heterocyklyl nebo karbocyklyl, použité samotné nebo jako část větší skupiny, označují nesubstituované nebo substituované skupiny. Jsou-li substituovány, mohou tyto skupiny obsahovat jeden nebo více substituentů. Příklady vhodných substituentů zahrnují halogen, -R, -OR, -OH, -SH, -SR, chráněný OH (jako třeba acyloxy), fenyl (Ph), substituovaný Ph, -OPh, substituovaný -OPh, -N0₂, -CN, -NH₂, -NHR, -N(R)₂, -NHCOR, -NHCONHR, -NHC0N(R)₂, -NRCOR, -NHC0₂R, -CO₂R, -C0₂H, -COR, -CONHR, -CON(R)₂, -S(O)₂R, -SONH₂, -S(O)R, -S0₂NHR, -NHS(O)₂R, =0, =s, =NNHR, =NNR₂, =N-0R, =NNHC0R, =NNHC0₂R, =NNHS0₂R, nebo =NR, kde R je alifatická skupina nebo substituovaná alifatická skupina.

Substituovatelný dusík na heterocyklickém kruhu může být případně substituovaný. Vhodné substituenty na dusíku • 9 9 • · 99

9

9 9 9

9999 99

9 9 zahrnují R, COR, S (O)2R a CO2R, kde R je alifatická skupina nebo substituovaná alifatická skupina.

Dusík a síra mohou být v jejich oxidované formě a dusík může být v kvarternizované formě.

Termín „elektronegativní odstupující skupina má definici známou odborníkům v oboru (viz March, Advanced Organic Chemistry, 4. vydání, John Wiley & Sons, 1992). Příklady elektronegativních odstupujících skupin zahrnují halogeny jako jsou F, Cl, Br, I, aryl a alkynyl sulf ony loxy skupiny, trifluormethansulfonyloxyskupina, OR, SR, -0C=0(R), -0P0 (R⁶) (R⁷) , kde R je alifatická skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, karboxylová skupina, alkylkarbocyklická skupina a R⁶ a R⁷ jsou nezávisle vybrány z R nebo OR.

Když je R² skupina ve formě esteru nebo amidu, podléhají sloučeniny podle tohoto vynálezu metabolickému štěpení na odpovídající karboxylové kyseliny, které jsou aktivními kaspázovými inhibitory. Protože podléhají metabolickému štěpení, není konkrétní druh esterové nebo amidické skupiny kritický pro provedení tohoto vynálezu. Struktura skupiny R²se může pohybovat od relativně jednoduchého diethylamidu až ke steroidnímu esteru. Příklady esterů R² karboxylové kyseliny zahrnují, ovšem nejsou limitovány, Ci_i2alifatiku, jako je alkyl mající jeden až šest atomů uhlíku nebo C3-iocykloalkyl, aryl, jako je fenyl, aralkyl jako je třeba benzyl nebo fenethyl, heterocyklyl nebo heterocyklylalkyl. Příklady vhodných R² heterocyklických kruhů zahrnují, ovšem výčet není omezen, 5-ti až 6-tičlenné heterocyklické kruhy mající jeden nebo dva heteroatomy jako je piperidinyl, piperazinyl nebo morfolinyl.

Amidy R² karboxylových kyselin mohou být primární, sekundární nebo terciální. Vhodné substituenty na amidovém dusíku zahrnují (výčet není úplný) jednu nebo více skupin • · · φ φφφφ φφφφ · φ · φ φ φφφ φ φφφ φφφ φ φφφφφ φφφφ «·Φ· φφ φφ φφ φφ φφφφ nezávisle vybraných z alifatických, arylových, aralkylových, heterocyklylových nebo heterocyklylalkylových skupin popsaných výše pro R² esterového alkoholu. Podobně jsou do působnosti tohoto vynálezu zahrnuty další proléky. Viz Bradley D. Ariderson, Prodrugs for Improved CNS Delivery v Advanced Drug Delivery Reviews (1996), 19, 171-202.

Isostery nebo bioisostery R² karboxylových kyselin, esterů a amidů vyplývají z náhrady atomu nebo skupiny atomů za vzniku nové sloučeniny s podobnými biologickými vlastnostmi jako má mateřská karboxylové kyselina nebo ester. Bioisosterní náhrada může být provedena fyzikálně-chemicky nebo topologicky. Příklad isosterní náhrady karboxylové kyseliny je CONHSO₂(alkyl) jako třeba CONHSO₂Me.

R³ může být skupina schopná vniknutí do S2 submísta kaspázy. Tyto skupiny jsou známé z mnoha kaspázových inhibitorů, které byly popsány (viz W091/15577, W093/05071, W099/18781, W099/47154, 25 WO00/023421, W09724339, EP618223, W09816502, které jsou všechny popsány výše. Kromě toho jsou také známé struktury několika kaspázových enzymů včetně S-2 submísta. Reference kaspázových struktur zahrnují následující: Blanchard H, et al., J. Mol. Bíol. 302 (1) , 916 (2000) ; Wei Y, et al. , Chem. Biol. 7 (6) :423-32 (2000); Lee D, et al., J Biol. Chem. 275(21):16007-14 (2000); Blanchard H, et al., Structure Fold Des. 7(9):1125-33 (1999); Okamoto Y, et al, Chem. P.áarm. Bul3. (Tokyo) 47(1):11-21 (1999); Margolin N, et al, J. Biol. Chem. 272(11):7223-8 (1997); Walker NP, et al., Cell 78(2):343-52 (1994); a Wilson KP, et al., Nátuře 370 (6487):270-5 (1994).

Zda se skupina vejde do S2 submísta bude záviset na konkrétní uvažované kaspáze. Velikost submísta se bude pohybovat od malého S-2 submísta kaspázy-3, které dovoluje skupiny až do velikosti C4 alifatické skupiny, až do • · · · · · ·· ·· relativně velkého submísta, dovolujícího skupinu mající molekulární hmotnost až kolem 140 Daltonů, jako je třeba naftylová skupina. Velikost, společně s elektronovým typem R³skupiny, budou mít vliv na kaspázovou selektivitu inhibitoru. Z výše uvedených referencí může odborník v oboru snadno zjistit, zda je skupina schopná přednostně proniknout do S-2 submísta kaspázy, např. s využitím standardních programů pro molekulární modelování jako je Quanta nebo Macromodel.

R³ skupina zahrnuje takové, které jsou vybrány ze skupiny obsahující vodík, postranní řetězec přírodní aaminokyseliny nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu mající molekulovou hmotnost až do vybrané z alifatických, arylových, heterocyklylových a heterocyklylalkylových skupin. Příklady R³ alifatických skupin zahrnují methyl, ethyl, propyl, cyklopropyl, butyl, isobutyl, sek.butyl, cyklobutyl, pentyl,

140 Daltonů, aralkylových, isopropyl, terč.butyl, cyklohexyl. indenyl a zahrnují imidazolinyl, cyklopentyl, hexyl, a Příklady R³ arylových skupin zahrnují fenyl, naftyl. Příklady R³ heterocyklických skupin pyrrolidinyl, pyrrolinyl, imidazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, piperidinyl, morfolinyl, thiomorfolinyl, piperazinyl, homopiperidinyl, a chinuklidinyl. Příklady R³ heteroarylových skupin zahrnují furanyl, thienyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, furazanyl, triazolyl, thiadiazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, indolyl, isoindolyl, indolinyl, benzofuranyl, benzothiofenyl, indazolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, purinyl, chinolinyl, chinolizinyl, chinoxalinyl, cinnolinyl, naftyridinyl, ftalazinyl, pteridinyl, isochinolinyl, chinazolinyl, chromanyl, a • · · · • · · · * · • ··♦ · · · · • ♦ · · · ♦ ·· ·· * · ·· · ·

isochromanyl. Každá skupina může obsahovat jeden nebo více substituentů podle výše uvedeného popisu.

R⁴ a R⁵ tvoří společně s intervenujícím dusíkem mono-, binebo tricyklický heterokruhový systém, mající 1 až 6 heteroatomů, s výhodou 1 až 4 heteroatomy. Takovéto kruhy zahrnují substituovaný nebo nesubstituovaný indol, isoindol, indolin, indazol, purin, dihydropyridin, benzimidazol, imidazol, imidazolin, pyrrol, pyrrolidin, pyrrolin, pyrazol, pyrazolin, pyrazolidin; triazol, piperidin, morfolin, thiomorfolin, piperazin, karbazol, fenothiazin, fenoxazin, dihydrofenazin, dihydrocinnolin, dihydrochinoxalin, tetrahydrochinolin, tetrahydroisochinolin, dihydronaftyridin, tetrahydronaftyridin, dihydroakridin, 5H-dibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin, β-karbolin, pyrido[4,3b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen, 3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin. Vhodné substituenty na R⁴ nebo R⁵zahrnují jeden nebo více substituentů nezávisle vybraných ze skupiny obsahující halogen, -R, -OR, -OH, -SH, -SR, chráněný OH (jako je acyloxy), fenyl (Ph), substituovaný Ph, -OPh, substituovaný -OPh, -NO2, -CN, -NH2, -NHR, -N(R)2/ -NHCOR, -NHCONHR, -NHCON(R)₂, -NRCOR, -NHCO₂R, -CO₂R, -CO₂H, -COR, -CONHR, -CON(R)₂, -S(O)₂R, -SONH₂, -S(O)R, -SO₂NHR, nebo -NHS(O)2R, kde každý R je nezávisle vybrán z alifatické skupiny nebo substituované alifatické skupiny.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu, kde R² je COOH, jsou gamma keto kyseliny, které mohou existovat v roztoku buď jako otevřené forma 1 nebo jako cyklický hemiketal 2. V tomto vynálezu zahrnuje reprezentace jedné izomerní formy zároveň i formu druhou. Podobně může docházet k cyklizaci, když R2 je CH2COOH a rozumí se, že takto cyklizované izomery jsou zahrnuty když je zde prezentována forma s otevřeným kruhem.

9« · · · > « · ·

9 »· « 9 9 9 »9 ·

9 9*9 999999 9 9 · 9 9 · 9 9··

99·· 9* 9* 99 1* 9999

Podobně bude odborníkovi v oboru zřejmé, že určité sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou existovat v tautomerních formách nebo hydratovaných formách, přičemž všechny takovéto sloučeniny jsou zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, struktury zde uvedené také zahrnují všechny stereochemické formy struktury, to jest R a S konfigurace každého asymetrického centra. Proto do rozsahu platnosti tohoto vynálezu spadají jednotlivé stereochemické izomery, stejně jako enantiomerní a diastereomerní směsi sloučenin podle tohoto vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, struktury uvedené v tomto vynálezu také zahrnují sloučeniny, které se liší v přítomnosti jednoho nebo více isotopově obohacených atomů. Například, do rámce platnosti vynálezu patří sloučeniny mající struktury podle tohoto vynálezu s tou výjimkou, že je vodík nahrazen deuteriem nebo triciem, nebo je uhlík nahrazen uhlíkem ¹³C nebo ¹⁴C uhlíkem.

Jedno provedení tohoto vynálezu se týká sloučenin, které mají jeden nebo více, s výhodou všechny následující rysy:

(i) Z je kyslík.

(ii) R¹ je vodík, -R, -CH2OR, -CH2SR nebo -CH2Y. Výhodněji R¹je -CH2OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y. Ještě výhodněji R¹ je -CH2Y. Nej výhodně ji R¹ je -CH2F.

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster.

(iv) R³ je skupina mající molekulární hmotnost až do asi 140

4- 0· 0« «0 ·0 · 0 0 0 0 0 · · 0

0 00 0 ·0· <00 »

0 < · 0 ··* 0 · · 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0000 00 0W 0· 00 0*00

Daltonů, jako jsou alifatická nebo aralkylová skupina. Výhodněji, R³ je C1-C4 alkyl, který je skupinou, která se vejde do S2 submísta mnoha kaspáz.

(v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří monocyklický, bicyklický nebo tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 atomů v kruhu.

Klíčovým rysem sloučenin podle tohoto vynálezu je heterokruhový systém vytvořený R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem. Bicyklické nebo tricyklické heterocyklické nebo heteroarylové kruhy jsou preferovány nad monocyklickými kruhy. Preferované provedení se tedy týká sloučenin majících jeden nebo více, a přednostně všechny, následující rysy: (i) Z je kyslík, (ii) Rl je vodík, -R, -CH2OR, -CH2SR nebo -CH2Y, výhodněji R¹ je -CH2OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y, ještě výhodněji R¹ je -CH2Y a nej výhodně ji R¹ je -CH2F.

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isostery.

(iv) R³ je skupina mající molekulární hmotnost až do asi 140 Daltonů, jako jsou alifatická nebo aralkylová skupina, výhodněji, R³ je C1-C4 alkyl a/nebo R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří monocyklický, bicyklický nebo tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 atomů v kruhu.

Příklady preferovaných monocykických kruhů zahrnují indol, isoindol, indolin, indazol, benzimidazol, thieno[3,2b]pyrrol, dihydrochinoxalin, dihydrocinnolin, dihydronaftyridin, tetrahydronaftyridin, tetrahydrochinolin, a tetrahydroisochinolin, nejvýhodněji indol nebo indolin. Příklady tricyklických kruhů zahnuje karbazol, fenothiazin, β-karbolin, pyrido[4,3-b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia• · « · ···· ·· ·· ·· ·· ····

2,10-diazaanthracen, 3,6,9-triazafluoren, fenoxazin, dibenzoazepin, dihydro-dibenzoazepin, dihydrophenazin, dihydroakridin nebo dihydrofenanthridin, nejvíce preferovány jsou karbazol,fenothiazin nebo dihydrofenanthridin.

Konkrétní příklady sloučenin vzorce I jsou uvedeny v Tabulce 1.

• to • · to « ···· · *·· · · « ·· ··· ······ · · ··· ·· · ··· ···· ·· ·· ·· ·· ····

Tabulka 1. Příklady sloučenin vzorce I (Z je kyslík)

··· ···· * · · i9 .· ;··. ♦ : : .:: .* ···· ·· ·» ·. ·. ....

číslo	Struktura
5
	Μ* ° A °
6	aX	xqH
	řj yvS	if^F o
7	XX íVy^oA M o /\	,CCl,H jf^F 0
8	jO	χα,Η
	ΐρ^Ζ\|^^ΝΧΐΓ°^>ϊΗ	O
9	jO	.CQjH
	σγΑ	ιτΆ 0
10	rf	^.cqH
	uYv

• · · ·

4 4 4 ··4 4

• · · • · · 9 ·

číslo	Struktura
23
24
25
26
27
28	O a /\ ó

···· ···· · · « • · · ♦ · ·····« · · • · · ♦ · ···· ···· ·· ·» ·9 ·· «···

číslo	Struktura
29	c^A-Φ·'
30
31	yO θ XOzH N^jjjsJ O ^H O
32	JO _o .CO₂H ίιΥίΛη π ^F V ° >\ ^H θ
33	.N JLJ θ .CO₂H ₁X<^NY⁰V^nA_í^f M 0 ^H 0
34	JU _Q .COzH Μ θ >\ ^H 0

• ·

44

4 4

4 • 4 44 • 4#

4 4 4

4 4

4444 44

4#

4444

číslo	Struktura
35	£5 _o >»₂H iíj^Ts ^F θ /'x ^{H 0}
36	yO ₀ yCO₂H ií^YyS ^F v ° Λ °
37	Z⁵*! 0 •W o ^H o
38	_SJQ ₀ JXW
39	Λ o r^n 0Y^aV^F
40	,P 0 Α» uCv »'
41	jO JL Xn ⁰ jl°^h °η₃ο-·Ύ °

číslo	Struktura
42	o Aon niV °
43	A « ⁰ f°^H \|Γη^χΝΊΓ^'^>χ«^^^Ν'ιΓ^χχ'^ρ°hAh₃ ^{H 0}
44	jfA ° °yV o Z™ ° HaC/S^n °
45	<A· ° ^hoyV o A» (''VY^vSfAr''^
46	0 AoH ÓXvT
47	°γΡ o Aon Ο,^ΑοΗ,Η °
48	Λ jO jl η^νΎ o γ°η \|j^z^^NY'⁰><^N^jj^F ⁰H^Ahs^H °

·* Φ· • · ·

• · ·

Po vyhodnocení mnoha R⁴-N-R⁵ heterocyklických kruhů bylo zjištěno, že tricyklické sloučeniny, kde koncové kruhy jsou v podstatě koplanární, vykazují překvapivě širokou kaspázovou aktivitu ve srovnání s acyyklickými analogy nebo jinými tricyklickými kruhovými systémy, které nejsou prakticky koplanární. Této téměř koplanarity může být dosaženo, když střední kruh tricyklického kruhového systému je 5-ti nebo 6ti členný kruh, jako je karbazolový nebo fenothiazinový kruh.

Kromě toho, v podstatě koplanární tricyklické kruhové systémy, stejně jako bicklické kruhové systémy jako je indol a indolin, vykazují lepší kaspázovou aktivitu než odpovídající sloučeniny, kde R⁴-N-R⁵ heterocyklický kruh je monocyklický kruh jako je piperidin, piperazin nebo morfolin.

Preferované provedení tohoto vynálezu se týká sloučenin vzorce I, kde R⁴-N-R⁵ je tricyklický kruhový systém mající 1 až 6 heteroatomů, s výhodou 1 až 4 heteroatomy, vybrané ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru, kde koncové kruhy kruhového systému mají 5 až 7 kruhových atomů a středový kruh má 5 až 6 kruhových atomů.

Jeden z aspektů tohoto vynálezu se týká sloučenin obecného vzorce II:

II kde X je vazba

S-, -0-, -CH₂ nebo -NH- a Z, R¹, R² a R³ jsou popsané výše. Když X je -CH₂-, každý z methylenových vodíků může být případně nahrazen se skupinou -OR, -OH, -SR, chráněnou OH (jako je acyloxy), -CN, ·♦ <<

• · 0 • ··« • · ·♦ ·**·

-nh₂, -NHR, -N(R)₂, -NHCOR, -NHCONHR, -NHCON(R)₂, -NRCOR, -NHC0₂R, ~C0₂R, -C0₂H, -COR, -CONHR, -CON(R)₂, -S(O)₂R, -SONH₂, -S(O)R, -S0₂NHR, -NHS(O)₂R, =0, =S, =NNHR, =NNR₂, =N-OR, =NNHCOR, =NNHC0₂R, =NNHSO₂R, nebo =NR, kde R je C1-4 alifatická skupina. Když X je -NH-, vodík skupiny NH může být nahrazen s alkylem, skupinou CO(alkyl), skupinou CO₂(alkyl) nebo skupinou S0₂(alkyl). Preferované skupiny pro R¹, R² a R³ jsou popsány výše.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být obecně připraveny metodami známými odborníkům v oboru pro přípravu analogických sloučenin, jak je ilustrováno pomocí níže uvedeného reakčního schématu a pomocí následujících preparativnich příkladů.

Schéma 1

HO^COaR

R³ p5 * Ň ^^0.,00^ Z R³ <?

^r5'ⁿyX

Z R³

O^,CO₂H h₂n

OH «?*

R³

I

Y .

Z R³

Reakční činidla: (a) R⁵-N=C=Z (2), (b) NaOH/THF/H₂O, (c)

EDC/DMAP/HOEt, (d) i. Dess-Martin periodinan, (ii) TFA/DCM.

Výše uvedené schéma I ukazuje syntetickou cestu vedoucí ·· ·

* · • · ·· • · • 4 · · » • · · · ©·· · · • 49 4 9 k získání sloučenin, kde R⁴ je vodík. Reakce isokyanátu nebo isothiokyanátu 2 s derivátem kyseliny mléčné vede ke vzniku karbamátu 3. Esterová skupina 3 se hydrolyzuje s využitím báze nebo je-li esterem terc-butylová skupina s využitím trifluoroctové kyseliny za vzniku kyseliny 4, která se potom kondenzuje s aminoalkoholem 5. V závislosti na druhu R¹ a R²může být použit aminoketon namísto aminoalkoholu, čímž se obchází následující oxidační krok. V případě fluormethylketonu, kde R¹ je CH2F, může být aminoalkohol 5 získán podle metody popsané v Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693. Na závěr se hydroxylové skupina ve sloučenině 6 oxiduje a vzniklá sloučenina se nechá reagovat odpovídajícím způsobem podle druhu substituentu R². Například, když produkt vyžaduje, aby R² byla karboxylová kyselina, potom R² ve sloučenině 6 je s výhodou ester a finální krok ve schématu je hydrolýza.

Výchozí isokyanáty nebo isothiokyanáty 1 jsou komerčně dostupné nebo mohou být vyrobeny reakcemi aminu s fosgenem nebo fosgenovým ekvivalentem (nebo thiofosgenem pro přípravu thioisokyanátů) v přítomnosti báze jako je triethylamin. Laktátové deriváty jsou komerčně dostupné nebo mohou být vyrobeny reakcí aminokyseliny s diazotačním činidlem jako je NaNO₂.

Schéma II

N;

Reakční činidla: (a) CDI/THF, (8)/THF.

(b) MeOTf/CH₂Cl₂, (C) R⁴R⁵NH

Schéma 2 ukazuje syntetickou cestu k získání sloučenin vzorce I podle tohoto vynálezu, kde R⁴ je alkylová skupina nebo kde R⁴ a R⁵ tvoří společně kruh. Reakce laktátového derivátu 2 s 1,1'-karbonyldiimidazolem (CDI) dává imidazolát 7. Methylace sloučeniny 7 pomocí methyl-triflatu, následovaná reakcí s aminem 8 (viz J. Med. Chem., (1996), 39, 982) poskytuje intermediát 3. Schéma I ukazuje jak může být sloučenina 3 převedena na sloučeninu I.

Schéma III _r«_r6nhX_cí -i—

Z R

9 3

Reakční činidla: (a) COC1₂/CH₂C1₂, (b) 1/THF

Alternativní cestou k přípravě sloučenin I podle tohoto vynálezu, kde R⁴ je alkylová skupina nebo kde R⁴ a R⁵ společně vytváří kruh, je ukázána na výše uvedeném Schématu III. Reakce aminu 8 s fosgenem vede ke karbamoylchloridovému intermediátu 9. Reakce 9 s laktátovým derivátem 1 poskytuje intermediát 3.

Schéma IV

R⁴

HO^COgR * _> CI^O COaR _ ^b fr ϊ ΐ ^R O

10 3

Reakční činidla: (a) CI3COC(0)Cl/THF, (b) R⁴R⁵NH (8), NaOH, Bu₄NBr.

Schéma IV ukazuje syntetickou cestu vedoucí k získání sloučenin podle tohoto vynálezu, kde R⁴ je vodík nebo alkylová skupina, nebo kde R⁴ a R⁵ společně tvoří kruh.

y· ··· ·»·· ···

0·· 99·· ·· » • · 9 9 9 9 999 999 9 9 9 9 9 9 0 0 0 0

0000 00 »0 99 99 9999

Reakce hydroxyesteru 1 s fosgenem nebo fosgenovým ekvivalentem jako je difosgen nebo trifosgen vede k chlorformiátovému intermediátu 10. Reakce sloučeniny 10 s aminem 8 poskytuje intermediát 3.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou navrženy k inhibování kaspázy. Sloučeniny podle tohoto vynálezu tedy mohou být stanoveny pokud jde o jejich schopnost inhibovat apoptózu, uvolňovat IL-ΐβ nebo přímo ovlivňovat kaspázovou aktivitu. Stanovení každé ze zmíněných aktivit jsou uvedeny níže v oddíle Testování a jsou také známy odporníkům v oboru.

Jedno z provedení tohoto vynálezu se týká přípravků obsahujících sloučeninu vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky akceptovatelný nosič.

Jestliže se v těchto přípravcích použije farmaceuticky přijatelná sůl podle tohoto vynálezu, jsou tyto soli přednostně odvozeny od anorganických nebo organických kyselin a bází. Mezi takovéto soli patří:acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzenesulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kamforát, kamfrsulfonát, cyklopentanpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, ethansulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydroiodid, 2hydroxyethansulfonát, laktát, maleát, methansulfonát, 2naftalensulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartarát, thiokyanát, tosylát a undekanoát.

Bazické soli zahrnují amonné soli, soli alkalických kovů, jako jsou sodné nebo draselné soli, soli kovů alkalických zemin jako jsou vápenaté nebo hořečnaté soli, soli s organickými bázemi jako jsou dicyklohexylaminové soli, Nmethyl-D-glukami a soli s aminokyselinami jako je arginin, lysin a pod.

44 4 • t ♦ · · ·

4

4494

Také skupiny obsahující bazický dusík mohou být kvarternizovány pomocí takových činidel jako jsou halogenidy s krátkými alkyly, jako jsou methyl, ethyl, propyl a butylchlorid, bromidy a jodidy; dialkylsulfáty jako jsou dimethylsulfát, diethylsulfát a diamylsulfát, halogenidy s delšími řetězci jako jsou decylchlorid, laurylchlorid, myristylchlorid a stearylchlorid, bromidy a jodidy, aralkylhalidy jako je benzylbromid a fenethylbromid nebo jiné. Takto se získávají vodo-dispergovatelné nebo v oleji dispergovatelné produkty.

Sloučeniny použité v přípravcích podle tohoto vynálezu a způsoby jejich výroby mohou být modifikovány přidáním vhodných funkčních skupin kvůli zvýšení selektivních biologických vlastností. Tyto modifikace jsou známy v oboru a zahrnují takové, které zvyšují biologickou penetraci do daného biologického systému (např. do krve, lymfatického systému, centrální nervové soustavy), zvyšují dostupnost orálním podáváním, zvyšují rozpustnost čímž dovolují podávání pomocí injekcí, mění metabolismus a mění rychlost vylučování.

Farmaceuticky akceptovatelné nosiče, které mohou být použity v přípravcích podle tohoto vynálezu, zahrnují (výčet není úplný): iontoměniče, alumina, stearát hlinitý, lecithin, sérové proteiny, jako jsou lidský sérový albumin, pufrovací sloučeniny jako jsou fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný, parciální glyceridové směsi nasycených rostlinných mastných kyselin, voda, soli nebo elektrolyty jako je protaminsulfát, hydrogenfosforečnan disodný, kaliumhydrogenfosfát, chlorid sodný, zinečnaté soli, koloidní silikagel, magnesium-trisilikát, polyvinylpyrrolidon, látky na bázi celulosy, polyethylenglykol, sodná karboxymethylcelulosa, polyakryláty, vosky, polyethylen32

9

9 9 9 9 9 ·

polypropylen blokové polymery, polyethylenglykol a vlněný tuk.

Podle preferovaného provedení tohoto vynálezu se přípravek formuluje pro farmaceutickou aplikaci savcům, s výhodou lidem.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být podávány orálně, parenterálně, inhalačními spreji, místně, rektálně, nasálně, bukálně, vaginálně nebo pomocí implantovaných reservoárů. Termín „parenterálně se zde používá pro subkutánní, intravenosní, intramuskulární, intraartikulární, intrasynoviální, intrasternální, intrathekální, intrahepatické, intralesionální a intrakraniální injekční nebo infuzní techniky. S výhodou se přípravky podávají orálně nebo intravenosně.

Sterilní injektovatelné formy přípravků podle tohoto vynálezu mohou být vodné nebo olejové suspenze. Tyto suspenze mohou být formulovány technikami známými v oboru s využitím vhodných dispergačních nebo smáčecích činidel a suspenzačních činidel. Sterilní injektovatelné přípravky mohou být také sterilní injektovatelné roztoky nebo suspenze v netoxických parenterálně přijatelných ředidlech nebo rozpouštědle, např. jako roztoky v 1,3-butandiolu. Mezi akceptovatelnými vehikuly a rozpouštědly, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, patří voda, Ringerův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho se běžně používají fixované oleje jako rozpouštědla nebo suspenzní médium. Pro tyto účely může být použit libovolný nedráždivý fixovaný tuk včetně syntetických mono- nebo di-glyceridů. Mastné kyseliny, jako je kyselina olejová a její glyceridové deriváty, jsou užitečné při přípravě injektovatelných přípravků, jako jsou přírodní farmaceuticky akceptovatelné oleje jako je olivový olej nebo ricinový olej, obzvláště v jejich ·

0 ··· • 0

0» • I

0 • « • 0 ··

0· • 0 · 0 0 0 0 00*0 • « · • » 0» polyoxyethylovaných verzích. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou také obsahovat ředidla nebo disperganty na bázi alkoholů s dlouhými řetězci, jako je karboxymethylcelulosa nebo podobná dispergační činidla, která jsou běžně používána ve formulacích farmaceuticky přijatelných dávkových forem včetně emulzí a suspenzí. Pro potřeby přípravků podle tohoto vynálezu se mohou použít i další běžně používané surfaktanty jako je Tweens, Spans a další emulgační činidla nebo zesilovače biokompatibility, které se běžně využívají při výrobě farmaceuticky přijatelných tuhých, kapalných nebo jiných dávkových forem.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být podávány v libovolné orálně akceptovatelné dávkové formě včetně (výčet není vyčerpávající) kapslí, tablet, vodných suspenzí nebo roztoků. V případě tablet pro orální podávání mohou být také přidány běžně používané nosiče jako jsou laktosa a obilný škrob, lubrikační činidla jako je magnesiumstearát. Pro orální podávání ve formě kapslí zahrnují užitečná ředidla laktosu a sušený obilný škrob. Jsou-li pro orální podávání požadovány vodné suspenze, kombinuje se aktivní složka s emulgačními a suspendačními činidly. Pokud se to požaduje, mohou být také přidána některá sladidla, chuťová nebo barvící činidla.

Alternativně mohou být farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu podávány ve formě čípků pro rektální podávání. Tyto mohou být připraveny smícháním činidla s vhodným nedráždivým excipientem, který je tuhý za laboratorní teploty ovšem přechází na kapalinu při tělesné teplotě a tedy bude v konečníku tát ta uvolňování aktivní látky. Tyto materiály zahrnuji kakaové máslo, včelí vosk a polyethylenglykoly.

·* · · « · ··· • ··» ···· li , • · » , · , ,,· · , , ,

Β Β Β Βφ β < Β * ··*·· ·♦ ·· ·· ·· ··,·

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány místně, obzvláště když cílové místo léčení zahrnuje oblasti nebo orgány snadno dostupné pro místní aplikaci, včetně nemocí očí, kůže nebo spodního zažívacího traktu. Vhodné formulace pro místní podávání se snadno připraví pro každou z těchto jmenovaných oblastí nebo pro každý orgán.

Přípravky pro místní použití pro léčení spodního zažívacího traktu mohou být provedeny v rektálních čípkových přípravcích (viz výše) nebo ve vhodných klystýrových přípravcích. Mohou být také použity místně transdermální náplasti.

Pro místní aplikace mohou být farmaceutické přípravky formulovány ve vhodných mazáních obsahujících aktivní složku suspendovanou nebo rozpuštěnou v jednom nebo více nosičích. Nosiče pro místní podávání sloučenin podle tohoto vynálezu zahrnují (výčet není úplný) minerální olej, kapalné petrolátum, bílé petrolátum, propylenglykol, polyoxyethylen, polyoxypropylen, emulgovatelné vosky a vodu. Alternativně, farmaceutické přípravky mohou být formulovány ve vhodné pleťové vodě nebo krému, obsahujícím aktivní sloučeninu suspendovanou nebo rozpuštěnou v jednom nebo více farmaceutických nosičích. Vhodné nosiče zahrnují (výčet není úplný) minerální olej, sorbitan monostearát, polysorbát 60, cetylesterový vosk, cetarylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a voda.

Pro oftalmické použití mohou být farmaceutické přípravky formulovány jako mikronizované suspenze v isotonické, pH adjustované sterilní solance nebo s výhodou jako roztoky v isotonické, pH adjustované solance, a to buď bez nebo s preservativy jako je benzylalkonium-chlorid. Alternativně • · • ·

mohou být farmaceutické přípravky pro oftalmické využití formulovány v mazání jako je petrolatum.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány nasálním aerosolem nebo inhalací. Tyto přípravky se připravují podle technik dobře známých v oboru farmaceutických přípravků a mohou být vyrobeny jako roztoky v solance, s využitím benzylalkoholů nebo jiného vhodného preservativa, promotéru absorpce kvůli zvýšení biokompatibility, fluorovaných uhlovodíků a/nebo dalších konvenčních rozpouštěcích nebo dispergačních činidel.

Výše popsané přípravky jsou obzvláště užitečné v terapeutických aplikacích při léčení nemocí vyvolaných IL1, apoptózou vyvolaných onemocněních, zánětlivých onemocněních, autoimunitních onemocněních, destruktivní poruše kostí, proliferativních poruchách, infekčních onemocněních, degenerativním onemocnění, nemocech spojených s buněčnou smrtí, nemoci spojené s nadměrným konzumováním alkoholu, nemocích přenášených viry, uveitis, zánětlivé peritonitidy, osteoarthritidy, pankreatitidy, astmatu, syndromu respirační nedostatečnosti u dospělých, glomerulonefritidy, revmatické arthritidy, systemické lupus erythematosus, sklerodermy, chronické thyroiditigy, Graveovy nemoci, autoimunitní gastritidy, diabetů, autoimunitní hemolytické anemie, autoimunitní neutropenie, thrombocytopenie, chronické aktivní hepatitis, myasthenie gravis, zánětlivého onemocnění střev, Crohnovy nemoci, psoriázy, atopické dermatitidy, zjizvení, odmítnutí štěpu u hostitele, odmítnutí transplantovaných orgánů, osteoporosy, leukémie a příbuzných poruch, myelodysplastického syndromu, mnohočetné poruchy kostí vyvolané myelomem, akutní myelogenní leukémie, chronická myelogenní leukémie, metastatického melanomu, Karposiho sarkomu, násobného myelomu, haemorrhagického šoku, sepse, septického šoku, popálenin, Shigellosis, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, Huntingtonovi nemoci, Kennedyho nemoci, prionové nemoci, cerebrlní ischémie, epilepsie, myokardální ischémie, akutního a chronického onemocnění srdce, myokardiálního infarktu, kongestivního srdečního selhání, atherosklerosy, náhradě koronárních tepen, spinální muskulární atrofie, amyotrofické laterální sklerosy, vícenásobné sclerosy, HlV-vyvolané encefalitidy, stárnutí, alopecie, neurologikého poškození vyvolaného mrtvicí, ulcerativní kolitidy, traumatického mozkového poškození, zranění míchy, hepatitidy-B, hepatitidyC, hepatitidy-G, žluté horečky, dengue horečky nebo japonské encefalitidy, různých forem jaterních nemocí, renálního onemocnění, polyaptické nemoci ledvin, gastrického onemocnění vyvolaném H. pylori a onemocnění způsobeného dvanácterníkovým vředem, HIV infekce, tuberkulosy a meningitidy. Sloučeniny a přípravky podle tohoto vynálezu jsou také užitečné při léčení komplikací spojených s bypasem koronárních tepen a jako komponenty imunoterapie pro léčení různých forem rakoviny.

Množství sloučeniny přítomné ve výše popsaných přípravcích by mělo být dostatečně veliké pro vyvolání detekovatelného snížení závažnosti onemocnění nebo kaspázové aktivity a/nebo buněčné apoptózy podle měření libovolnou metodou stanovení popsanou v příkladech.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou také užitečné ve způsobech chránění buněk, jako třeba v takových, které jsou vyžadovány při transplantaci orgánů nebo při ochraně krevních produktů. Podobná využití kaspázových inhibitorů byla popsána (Schierle et al., Nátuře Medicine, 1999, 5, 97). Způsob zahrnuje léčení buněk nebo tkání, které mají být ochráněny, s roztokem zahrnujícím kaspázový inhibitor. Potřebné množství kaspázového inhibitoru bude záviset na účinnosti inhibitoru '9'· • · » · ttt» 9 · 9 · * · Φ pro daný buněčný typ a na požadovaném časovém intervalu pro ochranu buněk před apoptickou buněčnou smrtí.

Podle dalšího provedení může přípravek podle tohoto vynálezu dále zahrnovat další terapeutické činidlo. Tyto činidla zahrnují (výčet není úplný) thrombolitická činidla jako je tkáňový plasminogenní aktivátor a streptokináza. Když je použito další činidlo, může být druhé činidlo podáváno buď jako oddělená dávková forma nebo jako součást jediné dávkové formy se sloučeninou nebo přípravkem podle tohoto vynálezu.

Mělo by být chápáno, že konkrétní dávkování a léčebný režim pro konkrétního pacienta budou záviset na mnoha faktorech, včetně aktivity konkrétní použité sloučeniny, věku, tělesné hmotnosti, celkovém zdraví, pohlaví, dietě, době podávání, rychlosti vylučování, kombinaci léků a rozhodnutí ošetřujícího lékaře a na závažnosti konkrétní léčené nemoci. Množství aktivní sloučeniny bude také záviset na konkrétní sloučenině a dalších terapeutických činidlech, jsou-li přítomna v přípravku.

V preferovaném provedení poskytuje vynález způsob léčení savců, majících jednu z dříve zmíněných nemocí, zahrnující krok podávání výše uvedeného farmaceuticky přijatelného přípravku zmíněným savcům. V tomto provedení, pokus se pacientovi podává další terapeutické činidlo nebo kaspázový inhibitor, může být podáváno společně se sloučeninou podle tohoto vynálezu v jediné dávkové formě nebo odděleně v oddělené dávkové formě. Když je podáváno jako oddělená, dávková forma, může být další kaspázový inhibitor nebo činidlo podáváno před tím, ve stejné době nebo až následně po podání farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího sloučeninu podle tohoto vynálezu.

Za účelem lepšího pochopení tohoto vynálezu jsou dále uvedeny preparativní příklady a příklady testování sloučenin • · · · · · ··· ···· ·· ·· «· ·· *··· podle tohoto vynálezu. Tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nejsou zamýšleny jako limitující pro rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady popisují syntetické postupy pro přípravu vybraných sloučenin podle tohoto vynálezu.

Příklad 1 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(kaaarbazolkarbamoyloxy-butyrylamino]pentanová kyselina

Metoda A:

terc-Butylester kyseliny (S)-2-(chlorkarbamoyloxy)-3-methylbutanové

K roztoku difosgenu (4,55 g) v THF (34 ml) byl při 0 °C přikapán roztok terc-butylesteru kyseliny (S)-2-hydroxy-3methylbutanové (přípravu viz Tetrahedron Lett., (1993), 7409) (4,0 g) a pyridinu (1,82 g) ve 34 ml THF během 25 minut. Vzniklá směs byla ponechána zahřát na laboratorní teplotu během 4 hod. Směs byla poté zfiltrována přes vrstvu celitu a

.. .. ........

• · 9 9 · · 9 «99 ···· · · · · * · ·

9 9 9 ······ · 9 • · · · · · · · · • 99« <9 99 ·· 99 9999 filtrát byl zkoncentrován za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn ve 200 ml diethyletheru a byl opět zfiltrován přes vrstvu celitu. Filtrát byl zkoncentrován za sníženého tlaku za vzniku světle žlutého oleje (5,27 g) : 1H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 0,98-1,10 (6H, m), 1,55 (9H, s), 2,30 (1H, m) , 4,83 (1H, m) .

Metoda B:

terc-butylester (S)-3-methyl-2-(karbazolkarbamoyloxy)butanové kyseliny

K roztoku karbazolu (15,15 g) v dichlormethanu (180 ml) a THF (142 ml) byl při 0 °C přidán granulovaný hydroxid sodný (5,45 g) následovaná tetrabutylamonium bromidem (2,93 g) . Vzniklá směs byla míchána 30 minut a poté byl přikapán roztok chlorformiátu (21,41 g) v 81 ml THF během 55 minut. Směs byla poté ponechána zahřát na laboratorní teplotu přes noc. Pak byl přidán dichlormethan (11) a 350 ml vody a organická fáze byl odstraněna. Vodná fáze byla extrahována s dichlormethanem (2 x 250 ml) a spojené organické extrakty byly promyty solankou (200 ml), sušeny nad síranem horečnatých, zfiltrovány a zkoncentrovány. Zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie (0-5% ethylacetát/hexan) za vzniku titulní

sloučeniny ve	formě bezbarvého oleje	(29.3 g)	: ⁷H	NMR (400
MHz, CDCI3) δ	1,15-1,23	(6H, m) , 1,55	(9H, s),	2,52	(1H, m),
5,27 (1H, d),	7,36-7,57	(4H, m), 8,03	(2H, d) ,	8,47	(2H, d).

• ·

Metoda C:

(S)-3-Methyl-2-(karbazolkarbamoyloxy)butanová kyselina

OH

Trifluoroctová kyselina (84 ml) byla přikapána k ledem chlazenému roztoku terc-butylesteru (S)-3-methyl-2(karbazolkarbamoyloxy)butanové kyseliny (4,11 g) v bezvodém dichlormethanu (300 ml). Směs byla míchána při 0 °C po dobu 2 h a poté 1 hod při laboratorní teplotě. Směs byla zkoncentrována za sníženého tlaku a zbytek byl poté rozpuštěn v suchém dichlormethanu a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Tento proces byl několikrát opakován kvůli odstranění přebytečné trifluoroctové kyseliny. To vedlo ke vzniku kyseliny ve formě světle zelené gumy (3,30 g) : ’ή NMR (400 MHz, CDC1₃) Ó 1,12-1,37 (6H, m) , 2,70 (1H, m) , 5,47 (1H, m) , 7,32-7,56 (4H, m), 8,00 (2H, d), 8,37 (2H, d).

Metoda D tert-Butylester kyseliny (3S/R,4S/R]-5-fluor-4-hydroxy-3((S)-3-methyl-2-(karbazol)-karbamoyloxy-butyrylamido)pentanové • -'Τ'

Míchaný roztok kyseliny (S)-3-methyl-2(karbazolkarbamoyloxy)butanové, terc-butylesteru 3-amino-5fluor-4-hydroxy-pentanové kyseliny (2,42 g) , HOBt (1,58 g), DMAP (1,49 g)a THF (80 ml) byl ochlazen na 0 °C a poté bylo přidáno EDC (2,42 g) . Směs byla ponechána zahřát na laboratorní teplotu během 16 hod a poté zkoncentrována za sníženého tlaku. Zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie (15-45% ethyl-acetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě bílé pěny (4,60 g) : *H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,09-1,50 (15H, m), 2,49-2,80 (3H,m), 3,20-3,62 (1H, m) , 3,92-4,58 (4H, m) , 5,32-5,42 (1H, d) , 6, 86 (1H, brm), 7,40-7,55 (4H, m) , 8,02 (2H, d) , 8,35(2H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCI3) -229,6, -229,7, -230,8, 231,4.

Metoda E tert-Butylester kyseliny [3S/R]-5-fluor-4-oxo-3-[(S)-3methyl-2-(karbazolkcarbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové

Míchaný roztok terc-butylesteru [3S/R,4S/R]-5-fluor-4hydroxy-3-((S)-3-methyl-2-(karbazol)-karbamoyloxybutyrylamido)-pentanové kyseliny (4,60 g) v bezvodém dichlormethanu (100 ml) byl nechán reagovat s 1,1,1triacetoxy-5 1,1,-dihydro-1,2-benziodoxol-3(1H)-oněm (4,68g) při 0 °C. Vzniklá směs byla míchána 2 hod při 0 °C, naředěna s ethyl-acetátem a poté nalita do 1:1 směsi nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nasyceného

0 0 0 0 0 000 «000 00 0· 00 0· 0000 vodného roztoku thiosíranu sodného. Organická vrstva byla odstraněna a vodná vrstva byla znovu extrahována s ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly sušeny nad síranem hořečnatým a zkoncentrovány. Zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie (10-40% ethyl-acetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky (3,96 g) : ’η NMR (400 MHz, CDC1₃) Ó 1,85 (4,5H, s), 1,94-1,31 (6H, m), 1,36 (4,5H, s), 2,59 (1H, m), 2,70-3,11 (2H, m), 4,91-5,31 (3H, m), 5,405,49 (1H, m) , 7,25 (1H, brs), 7,42 (2H, m) , 7, 53 (2H, m) ,

8,04 (2H, m) , 8,35 (2H, m) ; ¹⁹F NMR (376MHz, CDC1₃) -232,0, -232,1.

Příklad IA [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno -výše pro Metodu C. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (88% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1721,2,

1695,6, 1664,9, 1449,,8, 1378,1, 1198,9, 1040,1, 758,5 cm^-1; ’h NMR (400MHz, d₆-DMSO) δ 1,10 (6H, brm), 2,41 (1H, m) ,

2,54-3,04 (2H, m) , 4,31-4,82 (1,6H, m, CH₂F) , 5,10-5,41 (2,4H, m}, 7,45 (2H, m) , 7,57 (2H, m) , 8,22 (2H, m) , 8,30 (2H, m) , 8,51-8,99 (1H, brm), 12,60 (1H, brs); ¹³C NMR (100MHz, de-DMSO) δ 19,0, 19,1, 19,3, 30,4, 30,5, 30,6, 32,9,

34,5, 34,7, 47,3, 47,4, 52,0, 52,3, 80,4, 80,8, 83,2, 83,4, 83,4, 85,1, 85,2, 116,2, 116,3, 124,1, 125,7, 125,9, 137,9, • · · «

151,7, 151,9, 152,0, 168,8, 169,0, 169,2, 172,0, 172,1,

173,1, 173,2, 202,2, 202,4, 202,5, 202,6; ¹⁹F NMR (376MHz, d₆DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -230,5 (t), -230,9(t) ,

-232,9(t) , -233,0 (t); MS (ESI +ve) 443(M+H).

Příklad 2 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(3-chlorkarbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (99% poslední krok); IR (tuhá fáze) 1721,2,

1690,5, 1664,9, 1444,7, 1367,9, 1209,1, 1040,1 cm'¹; ^XH NMR (400MHz, d₆-DMSO) 5 1,02-1,13 (6H, m) , 2,40 (1H, m) , 2,502,99 (2H, m) , 4,30-4,85 {1,6H, m), 5,09-5,48 (2,4H, m) , 7,48 (1H, m) , 7,56-7,66 (2H, xn), 8,20-8,32 (3H, m), 8,39 (1H, m) , 8,55-8,99 (1H, brm) , 12,5 (1H, br) , ¹³C NMR (100 MHZ, dg-DMSO)

δ 18,1, 18,9, 19,1, 30,4, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0,
52,3,	80,6, 80,9, 81,1, 83,4, 83,43, 85,1,	, 85,2,	103,8,
104,0,	117,0, 119,3, 121,3, 122,3, 124,3,	124,7,	127,2,
127,4,	127,9, 128,5, 136,5, 138,4, 151,5,	151,6,	151,7,
168,7,	168,9, 169,0, 169,1, 172,0, 172,1,	173,1,	173,2,
202,2,	202,4, 202,44, 202,8 (C) ; ¹⁹F NMR (376	MHz, d₆-	DMSO)
-226,6	(t) , -226,8 (t) 230,4 (t), -230,9 (t),	-231,0	(t),
-232,8	(t), -232,84 (t), -232,9 (t) ; MS (ESI	+ve) 477	(M+H) .

• 4

4 • · · «· ···«

Příklad 3 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(3,ódichlorkarbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (99% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1721,2,

1659,7, 1470,3, 1434,4, 1367,9, 1209,1, 1075,9, 1045,2 cm'¹; ^XH NMR (400MHz, dg-DMSO) δ 0,98-1,14 (6H, m) , 2,30-2,50 (1H, m) , 2,50-3,01 (2H, m) , 4,29-4,84 (1,5H, m) , 5,09-5,41 (2,5H, m), 7,66 (2H, m), 8,19-8,29 (2H, m), 8,45 (2H, m) , 8,57-8,99 (1H, brm) , 12,60 (1H, br, OH); ¹³C NMR (100 MHz, d₅-DMSO) δ

15.5, 19,1, 19,2, 30,4, 30,45, 30,6, 33,0, 34,5, 34,7, 47,3,

47.5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,1, 81,2, 83,4, 84,43, 85,1, 85,2,

117,8, 121,1, 126,3, 128,4, 128,7, 136,9, 151,2, 151,4,

168,6, 168,8, 168,9, 168,95, 172,0, 172,04, 173,1, 173,14,

202,2, 202,3, 202:4, 202,6; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -230,4 (t), -230,8 (t) , -232,8 (t) ,

-232,9 (t); MS (ESI +ve) 511/513(M+H).

Příklad 4 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(2-chlorkarbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Metoda F:

4'-Chlor-2-nitrobifenyl

K roztoku 2-bromnitrobenzenu (646 mg) v 17 ml THF bylo pod dusíkovou atmosférou palladium (0) (900 mg) , laboratorní teplotě přidáno tetrakis(trifenylfosfin) Vzniklá směs byla míchána 20 min při a poté byl přidán roztok 4chlorfenylboronové kyseliny (1,0 g) v 17 ml ethanolu a vzniklá směs byla míchána při laboratorní teplotě 1 h. Pak byl přidán 2M roztok uhličitanu sodného (17 ml) a reakční směs byla uahřívána 2 h k refluxu. Směs byla poté nechána ochladit a byla zkoncentrována za sníženého tlaku, Zbytek byl rozpuštěn ve 100 mkl ethyl-acetátu a vodná vrstva byla odstraněna. Organická fáze byla promyta se solankou (20 ml), sušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a zkoncentrována. Zbytek byl čištěn flash chromatografií na silikagelu (0-10% ethylacetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě žluté tuhé látky (646 mg): ’Ή NMR (400MHz, CDCI3) δ 7,24-7,31 (2H, m) , 7,41-7,47 (3H, m), 7,52 (1H, m); 7,65 (1H, m), 7,90 (1H, d) .

φ· *< φφ φφφφ

Metoda G 2-Chlorkarbazol Cl

Směs 4'-chlor-2-nitrobifenylu (640 mg) a triethylfosfitu (1,9 ml) byla zahřívána 3 hod při 150°C. Směs byla poté nechána ochladit a byla čištěna pomocí flash chromatografie (5-10% ethyl-acetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě bílé tuhé látky (382 mg): ^XH NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7,127,23 (2H, m), 2,40 (1H, m), 7,46-7,54 (2H, m), 8,12 (2H, d).

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (99% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1731,4,

1695,6, 1664,9, 1424,2, 1367,9, 1326,9, 1193,7, 1045,2 cm'¹; ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 1,58-1,70 (6H, m) , 2,85-3,10 (1H, m), 3,10-3,54 (2H, m) , 4,85-5,39 (1,4H, m) , 5,65-5,98 (2,6H, m) , 7,94-8,20 (3H, m) , 8,73-8,90 (4H, m) , 9,10-9,56 (1H, brm) , 13,2 (1H, br) ; ¹³C NMR (100MHz,ds-DMSO) δ 17,7, 17,9, • « * · ·· · · 4 ·· ·» ····

19,0, 19,1, 19,2, 30,4, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 52,0, 52,3,

80,6, 80,9, 81,1, 83,4, 83,43, 85,1, 85,2, 104,0, 117,1,

121,0, 122,1, 124,2, 124,4, 124,6, 124,8, 7,29,0, 132,0,

138,2, 138,4, 151,6, 151,61, 168,7, 168,9, 169,0, 172,0, 172,05, 202,4, 202,42, 202,6; ¹⁹F NMR (376MHz, d₆-DMSO)

-225,99 (t), -226,2 (fc) , -229,8 (t), -230,3 (t) , -232,3 (t) , -232,4 (t); MS (ESI +ve), 477 (M+H).

Příklad 5 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(2,3dichlorcarbazole)-karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. 2,3-Dichlorkarbazol byl připraven podobným způsobem jako bylo popsáno v metodách F a G. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (98% poslední krok) : IR (tuhá fáze) 1721,2, 1659,7, 1434,4, 1367,9, 1204,0, 1188,6, 1045,2 cm’¹; ^XH NMR (400 MHz, d₆-DMS0) δ 1,04-1,14 (6H, m) , 2,29-2,48 (1H, m) , 2,53-3,00 (2H, m), 4,30-4,84 (1,7H, m) , 5,09-5,41 (2,3H, m) , 7,49 (1H, m) , 7,63 (1H, m) , 8,20-8,33 (2H, m) , 8,42-8,49 (1H, m) , 8,62 (1H; m) , 8,80-9,00 (1H, brm) , 12,5 (1H, br) ; ¹³C NMR (100 MHz, dg-DMSO) δ 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 47,5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,0, 81,2, 83,4, 85,1, 85,2, 116,3, 117,9, 121,5, 122,4,

124,1, 124,6, 126,1, 126,6, 129,0, 129,7, 136,8, 138,5, • · · · Β · · 9 9 · • ·♦· « · · · 9 9 9

4 494 949494 9 9

9 9 4 4 9 9 4 4

4044 ·· 99 44 99 4444

151,4, 151,45, 168,6, 168,9, 172,0, 172,03, 173,1, 202,2,

202,3, 202,4, 202,5; ¹⁹F NMR, (376 MHz; d₆-DMSO) 226,6 (t) ,

-226,8 (t), -230,3 (t) , -230,8 (t), -232,8 (t), -232,9 (t); MS (ESI +ve) 513 (M+H).

Příklad 6 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2- (2-trifluormethyl)karbazol-karbamoyloxy-butyrylamino]pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. 2-Trifluormethylkarbazol byl připraven podobným způsobem jako bylo popsáno v metodách F a G. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (85% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1731,4, 1695,6, 1695,7, 1434,4,

1321,8, 1198,9, 1122,1, 1065,7 cm'¹; ^XH NMR (400 MHz, d₆DMSO) δ 1,06-1,15 (6H, m), 2,42 (1H, m), 2,50-3,01 (2H, m),

4,29-4,83 (1,6H, m), 5,08-5,42 (2,4H, m), 7,53 (1H, m}, 7,68 (1H, m), 7,83 (1H, m), 8,29-8,40 (2H, m), 8,48 (1H, m), 8,64 (1H, m) , 8,80-9,01 (1H, m) , 12,60 (1H, brs); ¹³C NMR (100

MHz, d₆-DMSO) δ 17,4, 17,6, 19,0, 19,1, 30,4, 31,0, 32,9,

34.5, 34,7, 52,0, 52,3, 80,7, 80,9, 81,1, 81,1, 83,4, 85,1,

113,3, 116,3, 120,7, 120,9, 123,6, 124,4, 126,2, 127,2,

127.5, 127,8, 128,1, 128,9, 137,2, 138,9, 151,6, 168,6,

169,0, 172,0, 202,2, 202,3, 202,4, 202,6; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -60,4 (s), -226,6 (t), -226,8 (t), -229,9 (t),

-230,4 (t), -231,0 (t), -232,9 (t), 233,0 (t) ; MS (ESI +ve) • 0

0

0 000 ·00 0

0 0 0 0 0

00 00 0000

0 • 00 0 * « • ···

511 (M+H).

Příklad 7 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(2-methylkarbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (90% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1726,3,

1700,7, 1664,9, 1552,2, 1460,0, 1552,2, 1460,0, 1367,9,

1332,0, 1209,1, 1193,7, 1040,1 cm'¹; NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 1,01-1,19 (6H, m) , 2,30-3,00 (6H, m) , 4,29-4,85 (1,5H, m), 5,11-5,52 (2,5H, m), 7,29 (1H, m), 7,45 (1H, m) , 7, 55 (1H, m) , 8,05-8,18 (3H, m) , 8,27 (1H, m) , 8,50-9,10 (1H, brm) ,

12,50	(1H, brs);	¹³C NMR (100	MHz, de-DMSO) δ 17,7,	18,0,
L9,0,	19,1, 19,2,	22,2, 30,4,	30,5, 30,6, 30,6, 33,0,	34,5,
34,7,	47,4, 52,0,	52,3, 52,7,	80,3, 80,6, 80,7, 80,8,	83,2,
83,4,	83,5, 85,2,	85,2, 103,8,	, 104,0, 116,2, 116,3,	116,6,
120,3,	120,4, 123	,4, 124,0,	125,2, 125,8, 127,3,	137,5,
137,9,	138:2, 151	,7, 151,9,	151,9, 168,8, 169,0,	169,2,
169,2,	172,0, 172	,1, 173,1,	173,2, 202,3, 202,4,	202,5,
202,6;	19F NMR (376MHz, d6DMSO)	-226,55 (t), -226,76 (t),
-230,43 (t), -230,89 (t), -232,	84 (t), -232,97 (t).

Příklad 8 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-2-(karbazol-karbamoyloxy)butyrylamino]-pentanová kyselina • ♦ · « · · • · · · • 9 · 9 • · • ··· • 9

999 9

9 9 9

99 9999

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Chlorf ormiát byl připraven z tercbutylesteru (S)-2-hydroxybutanové kyseliny jako bylo popsáno v metodě A. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (90% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1716,1, 1654,6, 1449,8,

1372,9, 1326,9, 1204,0, 1050,4, 1029,9 cm'¹; ^ΧΗ NMR (400 MHz, de-DMSO) δ 1,03-1,12 (3H, m) , 1,96-2,15 (2H, m) , 2,50-3,01 (2H, m) , 4,31-4,82 (1,8H, m) , 5,11-5,43 (2,2H, m), 7,45 (2H,

m), 7	,59 (2H, m) , 8,18-	8,32	(4H, m) , 8,58-9,05	(1H,	brm) ,
12,60	(1H, brs) ; ¹³C NMR	(100	MHz, d₆-DMSO) δ 9,8,	9,9,	9,94,
24,9,	25,1, 25,2, 33,0,	34,6,	34,7, 47,4, 52,0,	52,3,	77,1,

77,3, 77,4, 77,45, 83,4, 83,5, 85,2, 85,22, 1,16,3, 120,6,

124,0, 125,7, 127,9 , 137,9, 151,5, 151,7, 169,5, 169,8,

172,0, 172,1, 173,1, 202,3, 202,4, 202,5, 202,6; ¹⁹F NMR (376 MHz, dg-DMSO) -226, 6 (t) , -226, 8 (t) , -230,4 (t) , -231,0 (t) , 232,9 (t), -233,0 (t).

Příklad 9 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3,3-dimethyl-2-(karbazolkarbamoyloxy)-butyrylamino]-pentanová kyselina

O · · ·· «······

9 · · ♦ · 999 9 · 4 9 4 9 4 9 9 9 4 9 9

4444 49 99 94 44 9494

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Chlor formiát byl připraven z tercbutylesteru (S)-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanové kyseliny (přípravu viz Tetrahedron Lett., (1993), 7409) jak bylo popsáno v metodě A. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (94% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1782,7, 1721,2, 1526,6,

1444.7, 1373,0, 1332,0, 1301,3, 1198,9, 1117,0, 1040,1, 753,3 cm’¹; ^XH NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,15 (9H, s) , 2,50-2,98 (2H, m), 4,29-4,88 (1,5H, m) , 4,97-5,45 (2,5H, m) , 7,45 (2H, m) , 7,,59 (2H, m) , 8,23 (2H, m) , 8,33 (2H, m) , 8,50-8,97 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); ¹³C NMR (100 MHz, d6-DMSO) δ 27,3,

33,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8, 35,1, 52,5, 52,9, 83,5, 83,9, 84,0, 84,1, 84,3, 85,7, 85,73, 116,7, 116,8, 121,2, 124,6,

124,64, 126,2, 128,4, 138,4, 152,2, 152,4, 152,5, 168,4,

168.7, 168,8, 168,9, 172,6, 172,65, 173,6, 5 202,6, 202,8,

202,9, 203,0; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,5 (t) , -226,6 (t), -230,9 (t), -231,5 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 457(M+H).

Příklad 10 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-2-(2-chlorkarbazolkarbamoyloxy-

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Chlorformiát byl připraven z tercbutylesteru (S)-2-hydroxybutanové kyseliny jak bylo popsáno v metodě A. 2-Chlorkarbazol byl připraven podle popisu • · • · «· ·♦*· ·· • ♦ · ·· ·· « · · • · · • » · ·· ·«·« v Metodě F-G. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (77% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1733,03, 1699,89, 1662,97,

1448,18, 1423,38, 1369,84, 1332,48, 1215,16, 1199,62,

1052,26, 2033,17, 764,57, 747,53, 720,08, 651,85 cm’¹; ^XH NMR (400 MHz, dg-DMSO) δ 1,06-1,10 (3H, m) , 2,01-2,09 (2H, m) ,

2,53-2,98 (2H, m) , 4,34-4,78 (1,6H, m) , 5,14-5,39 (2,4H, m) , 7,45-7,61 (3H, m) , 8,24-8,31 (4H, m) , 8,63-8,99 (IH, brm),

12,50 (IH, brs); ¹³C NMR (100 MHz, d₆-DMSO) δ 9,7, 23,7, 25,

0, 31,3, 34,6, 34,8, 52,0, 52,3, 77,4, 77,6, 83,4, 85,2,

110.9, 111,6, 116,2, 116,3, 119,0, 119,4, 120,7, 120,9,

121.9, 122,1, 124,2, 124,3, 124,6, 124,8, 126,3, 128,3,

130,2, 132,0, 138,1, 138,4, 151,3, 169,6, 172,1; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,60 (t) , -226,83 (t) , -230,34 (t) , -231,88 (t), -232,84 (t), -232,99 (t) .

Příklad 11 [3S/R] -5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(indol)karbamoyloxybutyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách A-E. Produkt byl izolován jako bílá tuhá látka (92% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1731,4,

1664,9, 1536,8, 1454,9, 1393,5, 1326,9, 1239,8, 1035,0 cm-1; ^XH NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 1,30-1,62 (6H, m) , 2,79 (IH, m) , 3,00-3,48 (2H, m), 4,77-5,04 (1,6H, m) , 5,42-5,88 (2 , 4H,

m), 7,29 (IH, m), 7,70-7,90 (2H, m) , 8,10-8,31 (2H, m), 8,518,63 (IH, m), 8,91-9,45 (IH, m), 13,0 (IH, brs); ¹³C NMR (100 MHz, d₆-DMSO) δ 15,5, 17,3, 17,6, 18,9, 19,2, 30,6, 32,9, « · · • 4

44

9 4 • 4 4 • ·9·

4 · • · » 9 «49 4* 4449

34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 65,3, 80,0, 80,3, 80,5, 83,4,

83,41,	85,1,	85,2, 104,02, 108,7, 108,71,	108,8,	114,9,
122,0,	123,5,	125,0, 126,3, 130,5, 135,0,	150,4,	168,8,
169,0,	169,1,	169,14, 172,0, 172,1, 173,1,	202,2,	202,4,

202,5, 202,6; ¹⁹F NMR (376 MHz, dg-DMSO) -226,1 (t) , -226,3 (t), -230,0 (t), -230,5 (t), 232,3 (t) , -232,4 (t) , -232,5 (t), -232,6 (t); MS (ESI +ve) 393 (M+H).

Příklad 12 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(fenothiazin)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Metoda H:

terc-butylester (S)-3-methyl-2-(fenothiazin)-karbamoyloxymáselné kyseliny

K míchanému roztoku terc-butylesteru (S)-2-hydroxy-3methylbutanové kyseliny (příprava viz Tetrahedron Lett., (1993), 7409) (300 mg) v 5 ml THF byl při 0 °C přidán hydrid sodný (60% suspenze v minerálním oleji, 72 mg). Vzniklá směs byla míchána 30 min a poté byl přidán fenothiazin-10karbonylchlorid (450 mg) a směs byla ponechána zahřát na

04 • · 4

0··

0« • 00 0 00 0

0· • 0

0 • ·

0

0000 • 0 0

00 ·· • 90 · laboratorní teplotu během 12 hod. Reakční směs byla naředěna s ethylacetátem (15 ml) a vodou (3 ml) . Organická fáze byla oddělena vodná fáze byla extrahována s 2 x 5 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy byly poté promyty solankou (5 ml), sušeny nad síranem hořečnatým, zfiltrovány a zkoncentrovány. Zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie (0-10% ethylacetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě bezbarvého oleje (528 mg): ¹H NMR (400 NMR, CDCI3) δ 0,750,96 (6H,m), 1,58 (9H, s), 2,20 (1H, m) , 4,86 (1H, d) , 7,127,45 (6H, m) , 7, 70 (2H, m).

(S)-3-methyl-2-(fenothiazin)-karbamoyloxy-butanová kyselina

Deprotekce terc-butylesteru (S)-3-methyl-2-(fenothiazin)karbamoyloxy-máselné kyseliny (528 mg) s využitím trifluoroctové kyseliny podle popisu v metodě C poskytla kyselinu ve formě tuhé bílé látky (440 mg): ¹H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,77-1,00 (6H, m), 2,29 (lH, m), 5,02 (1H, d), 7,157,48 (6H, m), 7,70 (2H, m).

Příklad 12 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(fenothiazin)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina e· ·« ·· ·©, ·» • · · ··«· · · · • ··© 4 4 4 4 4 · 4

4 4 9 9 499 4 4 4 4

9 9 4 4 9 4 9 4

4444 44 44 94 44 4494

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách C-E. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (98% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1782,7,

1710,9, 1521,5, 1465,2, 1260,3, 1219,4, 1168,1, 1045,2; 758,5 cm*¹; ^XH NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0,64-0,87 (6H, m) , 1,96-2,16 (1H, m), 2,40-2,98 (2H, m) , 4,50-5,42 (4H, m), 7,28 (2H,

m) , 7,39 (2H, m) , 7,49 (2H, m) , 7,68 (2H, brm), 7,88-8,91 (1H, brm), 12,61 (1H, brs) ; ¹³C NMR (100 MHz, d₆-DMSO) δ

16.8, 17,1, 19,0, 19,2, 30,3, 30,5, 33,0, 33,2, 34,5, 34,8, 47,3, 52,0, 52,4, 79,3, 79,6, 79,7, 83,4, 83,5, 85,1, 85,2,

103.8, 127,1, 127,2, 127,3, 127,4, 131,4, 138,0, 138,1,

152,6, 152,8, 158,82, 169,3, 169,5, 169,7, 172,0, 172,1,

172,13, 202,3, 202,4, 202,6, 202,8; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -230,3 (t), -231,3 (t), -232,9 (t) , -233,0 (t); MS (ESI +ve) 475 (M+H).

Příklad 13 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(2chlorfenothiazin)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

O • · • ·

Metoda I:

2-Chlorfenothiazin karbamoylchlorid

K suspenzi 2-chlorfenothiazinu (2 g) přidán difosgen (3,4 g) . Směs byla teplotu 140 °C za sníženého chromatografie v xylenu (20 ml) byl zahřívána 18 hod na Směs pak byla ochlazena a xylen byl odstraněn tlaku. Zbytek byl čištěn pomocí flash (2-5% ethyl-acetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě hnědé tuhé látky (2,04 g) : ¹H NMR (400 MHz, CDC1₃) 8 7,26-7 ,43 (4H, m) , 7,45-7,51 (1H, m) , 7,597,68 (2H, m).

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách H a C-E. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky pomocí reverzní HPLC (61% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1732, 1460, 1365, 1207 cm'¹ ; ^XH NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0,70-0,87 (6H, m) , 2,02-2,10 (1H, m) ,

2,58-2,90 (2H, m) , 4,34-5,37 (4H, m) , 7,27-7,88 (7H, m) , • 0

8,31-8,81 (1H, m) ; ¹³C NMR (100MHz, d₆-DMSO) δ 16,7/16,9, 18,9/19,1, 30,3/30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,6/80,0, 84,2/84,3, 127,0, 127,3, 127,3, 127,6, 128,0, 129,0, 130,5,

130,9, 131,7, 137,5/137,5, 139,1/139,1, 152,3/152,5, 169,6/169,7, 172,0/172,1, 202,3/202,7 (2d, J 14,1/14,0; ¹⁹F NMR (376 MHz, dg-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -233,0 (t) ,

-233,1 (t) .

Příklad 14 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(3chlorfenothiazin)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách Η, I a C-E. Fenothiazin byl připraven podle postupu popsaného v J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (89% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1717, 1527, 1469, 1350, 1322, 1217,

1042 cm'¹;	^XH NMR	(400 MHz,	de-DMSO) δ 0,67-0,85 (6H,	m) ,
2,00-2,06	(1H, m),	2,58-2,87	(2H, m) , 4,33-4,86 (2,6H,	m) ,
5,12-5,36	(1,4H, m)	, 7,27-7,	30 (1H, m) , 7,38-7,51 (3H,	m) ,
7,63-7,68	(3H, m),	8,24-8,82	(1H, m) ; ¹³C NMR (100 MHz,	de-

DMSO) δ 17,3/17,6 (CH3), 19,4/19,5 (CH3), 30,8/30,8, 35,0/35,3, 52,5/52,9, 80,0/80,1, 84,7/84,8, 127,2, 127,3,

127,6, 127,9, 128,6, 130,7, 131,2, 133,7, 136,9/137,0,

137,8/137,8, 153,0/153,2, 170,1/170,2, 172,5/172,6, 202,9/203,2; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,7 (br) , -226,9 (br), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 509/511(M+H).

Příklad 15 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(3,7dichlorfenothiazin)-karbamoylo-butyrylamino]pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách Η, I a C-E. Fenothiazin byl připraven podle postupu popsaného v J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky pomocí reverzní HPLC (76% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1793, 1721, 1521, 1465, 1317, 1214, 1086, 1044 cm'¹; ^XH NMR (400 MHz, d₆-DMSO), δ 0,71-0,76 (3H, m), 0,84-0,88 (3H, m) , 2,05-2,12 (1H, m) ,

	2,58-2,92	(2H, m) , 4,31-4,87	(2,5H,	m) ,	5,09-5,36 (1,5H, m),
	7,47-7,56	(2H, m) , 7,67-7,71	(2H,	m) ,	7,72-7,81 (1H, m) ,
«	8,39-8,87	(1H, m); ¹³C	NMR	(100	MHz, de-DMSO) δ

16,7/16,7/17,0, 19,0/19,1/19,2/19,3, 30,3/30,3/30,4, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,8/80,1, 84,2/84,3, 127,3, 127,4,

127,7, 128,5, 129,2, 129,7, 131,4/131,4, 132,0, 133,1/133,2, 136,4/136,5, 138,8/138,9, 152,2/152,3, 169,5/169,6, 172,0/172,1, 202,4/202,5; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,5 (br) , -226,8 (t), -232,9 (t), -233,0 (br).

• 4 • 4

Příklad 16 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(3,4dichlorfenothiazin)-karbamoyloxy-butyrylamino] pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách Η, I a C-E. Fenothiazin byl připraven podle postupu popsaného v J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky pomocí reverzní HPLC (58% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1736, 1436, 1365, 1222, 1050 cm'¹; ^XH NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,66-0,85 (6H, m) , 2,00-2,08 (1H, m) , 2,57-2,93 (2H, m), 4,30-5,35 (4H, m) , 7,31-7,71 (6H, m) , 8,27-8,83 (1H, m) ; ¹³C NMR (100 MHz; d6DMSO) δ 16,8/17,1, 19,0/19,1, 30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,7/80,0, 84,2/84,3, 179,2/178,6, 127,1, 127,3, 127,5,

128,2, 128,5, 128,5, 129,6, 130,0, 133,7, 137,3/137,3, 137,6/137,6, 152,5, 169,5/169,5, 172,0/172,1, 202,3; ¹⁹F NMR, (376MHz, d₆-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -232,9 (t).

Příklad 17 ···· ·· [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(9,10-dihydrofenanthridin)-karbamoyloxy-butyrylamino]pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách Η, I a C-E. 9,10-Dihydrofenanthridin byl připraven podle postupu popsaného v J. Chem. Soc. (1951), 3207-3211. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky pomocí reverzní HPLC (56% poslední krok): IR (tuhá fáze)

1732,	1365, 1226, 1212,	1203	cm-l; ^XH NMR (400 MHz,	d₆-DMSO)
δ 0,84	(6H, m), 2,05	(1H,	m) , 2,55-2,90 (2H, m)	, 4,28-
5,36 (6H, m), 7,26-7,43	(5H,	m) , 7,75-7,77 (1H, m),	7,89-
7,91 (	2H, m), 8,24-8,81	(1H,	m}; ¹³C NMR (100 MHz,	dg-DMSO)
δ 17	,1/17,4, 18,9/19	,0,	30,3/30,4, 34,4/34,8,	46,9,

51,9/52,4, 79,0/79,4, 84,2/84,3, 123,8, 124,3, 125,1, 125,7,

126,2, 128,0, 128,2, 128,3, 128,5, 131,5, 134,1, 136,9,

153,1, 170,0/170,1, 172,0/172,1, 202,4/202,8; ¹⁹F NMR (376MHz, ds-DMSO) -226,7 (br) , -226,9 (br) , -233,1 (t) ; MS (ESI -ve) 455 (M-H).

Příklad 18

1-(l-karboxymethyl3-fluor-2-oxo-propylkarbamoyl)-2methylpropyl ester dibenzo[b,f]azepin-5-karboxylové kyseliny

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách Η, I a C-E. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (100% poslední krok) : IR (tuhá fáze)

1791.2, 1714,9, 1683,4, 1525,6, 1492,6, 1370,1, 1325,6,

1229.3, 1212,5, 1053,4, 1032,7, 798,4 cm'¹; ²H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0,50 +0,68 (6H, 2 x m) , 1,90 (1H, m) , 2,54-2,93 (2H, m) , 4,20-5,44 (4H, m), 7,02 (2H, s), 7,30-7,80 (8H, m) ; ¹³C NMR (100 MHz, d₆-DMSO) 8 18,73, 19,17, 30,34, 34,56,

52,18, 84,37, 127,92, 128,61, 128,69, 129,63, 130,83, 134,40, 153,90, 169,64, 172,23, 202,29, 202,43, 202,63 202,76; ¹⁹F

NMR (376MHz, d₆-DMSO) -226,83 (t), -226,87 (t), -232,93 (t), -233,07 (t), -233,10 (t) , -233,32 (t) ; MS (ESI +ve) 469 (M+H).

Příklad 19

1- (l-Karboxymethyl-3-f luor-2-oxopropylkarbamoyl) -2-methylpropyl ester 10,11-dihydrodibenzo[b, f]azepin-5-karboxylové kyseliny

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách Η, I a C-E. Produkt byl izolován ve • · • ····»· · · k · · · · · «· ·· ·· ···· formě bílé tuhé látky (100% poslední krok) : IR (tuhá fáze)

1796,9, 1683,9, 1521,8, 1491,5, 1368,3, 1324,8, 1278,6,

1213,4, 1201,9, 1108,0, 1056,4, 931,1, 776,5, 746,7 cm’¹; ¹H

NMR (400 MHz, dg-DMSO) δ 0,50-0,95 (6H, m) , 1,90 (1H, m) ,

2,55-3,00 (2H, m) , 4,20-5,30 (8H, m) , 7,10-7,50 (8H,m); ¹³C

NMR (100 MHz, d₆-DMSO) δ 15,24, 16,79, 39,44, 52,43, 78,36,

84,34, 126,80, 127,89, 128,43, 130,29, 136,29, 154,09,

169,58, 170,03, 172,19, 173,12, 202,28, 202,42; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,76 (t) , -233,01 (t) , -233,11 (t) , -233,38 (t); MS (ESI +ve) 47KM+H).

Příklad 20 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-((S)-2,3-dihydroindol-1karbamoyloxy-3-methyl-butyrylamino)-pentanová kyselina

Metoda J:

Benzylester kyseliny (S)-2-(imidazolkarbamoyloxy)-3methylbutanové

K míchanému roztoku benzylesteru (S)-2-hydroxy-3methylbutanové kyseliny (přípravu viz J. Med. Chem., (1996), 39, 982, 1,5 g) ve 20 ml THF byl přidán karbonyldiimidazol (1,17 g) a vzniklá směs byla míchána 12 h při laboratorní teplotě. Reakční směs byla zkoncentrována za sníženého tlaku a zbytek byl rozpuštěn ve 30 ml ethyl-acetátu. Roztok byl

4

4499 • 4 4 449 promyt 1% roztokem kyseliny fosforečné (20 x 10 ml), potom 10 ml solanky, sušen nad síranem hořečnatým, zfiltrován a zkoncentrován za sníženého tlaku za vzniku titulní sloučeniny ve formě bezbarvého oleje (1,89 g): ¹H NMR, (400 MHz, CDCI3) δ 1,02 (3H, d), 1,11 (3H, d) , 2,47 (1H, m) , 5,15 (1H, d) ,

5,18-5,32 (2H, m) , 7,11 (1H, s), 7,18-7,60 (6H, m), 8,20 (1H, m) .

Metoda K:

Benzylester kyseliny (S)-(2,3-dihydroindol-l-karbamoyloxy)-3methylbutanové

K míchanému roztoku benzylesteru kyseliny (S)—2— (imidazolkarbamoyloxy)-3-methylbutanové (355 mg) v 7 ml THF byl při 0 °C přidán methyl-trifluormethansulfonát (0,13 ml). Vzniklý roztok byl ponechán zahřát na laboratorní teplotu 12 hod. Reakční směs byla zkoncentrována za sníženého tlaku a zbytek byl rozpuštěn ve 30 ml ethyl-acetátu. Roztok byl promyt nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml), potom 1M roztokem chlorovodíkové kyseliny (2x5 ml), potom solankou (5 ml) , sušen nad síranem hořečnatým, zfiltrován a zkoncentrován. Zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie (5-7% ethyl-acetát/hexan) za vzniku titulní sloučeniny ve formě bezbarvého oleje (342 mg) : ¹H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,86-1,18 (6H, m) , 2,35 (1H, m) , 3,08-3,25 (2H, m), 4,05-4,25 (2H, m), 4, 95-5,32 <3H, m), 6,95-7,91 (9H, m).

Metoda L:

ΦΦ ·

• ·

44 > * Φ

ΦΦΦΦ ·4

4 4 9 • 9 9 4

99499 · 4 • · · ♦

9 94 4444 (S)-(2,3-dihydroindol-l-karbamoyloxy)-3-methylbutanová kyselina

K míchanému roztoku benzylesteru (S)-(2,3-dihydroindol-lkarbamoyloxy)-3-methylbutanové kyseliny (342 mg) ve 25 ml methanolu bylo přidáno 10% palladium na uhlíku (80 mg). Směs byla hydrogenována při laboratorní teplotě po dobu 2 hod. Směs byla zfiltrována přes celit a filtrát byl zkoncentrován za vzniku titulní sloučeniny ve formě bezbarvého oleje (255 mg): ³H NMR (400 MHz,CDCl₃) Ó 0,95-1,21 (6H, m) , 2,40 (1H, m) , 3,20 (2H, m), 4,01-4,25 (2H, m), 4,95-5,15 (1H, m), 6,977,99 15 (4H, m).

Příklad 20 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-((S)-2,3-dihydroindol-l-karbamoyloxy3-methyl-butyrylamino)-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodách C-E. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (94% poslední krok): IR (tuhá fáze) 1680,2, 1485,6, 1413,9, 1137,4, 1050,4, 758,5 cm’¹; ^XH NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,95 (6H, brm), 2,17 (1H, brm), 2,50-2,94 (2H, m) , 3,12 (2H, brm), 3,84-4,23 (2H, brm), 4,27-5,39 <4H, m) , 6,98 (1H, m), 7,22 (2H, m) , 7,67 (1H, brm), 7,78-8,30 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); ¹³C NMR (100 MHz, d6-DMSO) δ 17,2, 19,0,

99 • · · ·0 ··

0 9 9 9 *

0 0 0 9 9

00099 9 9 *099 • 0 00 0000

19.2, 27,3, 30,4, 30,6, 32,9, 34,5, 34,6, 47,3, 47,35, 52,0,

52.2, 78,3, 83,4, 85,1, 104,0, 114,2, 1,23,0, 125,4, 127,5,

131,,7, 170,0, 172,07, 172,1, 173,2, 173,25, 202,3, 202,5,

202,6; ¹⁹F NMR (376 MHz, d₆-DMSO) -226,7 (t) , -226, 8 (t) ,

-233 ,1 (t), -233,3 (t); MS (ESI +ve) 395 (M+H).

Příklad 21

Diethylamid [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové kyseliny

Metoda M:

K míchanému roztoku kyseliny (Příklad 1, připravená podle popisu v Metodách A-E) (100 mg) ve 2 ml THF byl při 0 °C přidán diethylamin (16 mg) v 0,5 ml THF, následován přídavkem 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-(ethylkarbodiimid) hydrochloridu, EDC (48 mg) . Směs byla poté zahřáta během 12 hod na laboratorní teplotu. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a zbytek byl čištěn pomocí flash chromatografie (50-60% ethyl-acetát/hexan) za vzniku amidu ve formě bílé tuhé látky (54 mg); ¹H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 0,691,38 (12H, m) , 2,42-3,37 (7H, m) , 4,85-4,92 (1H, m) , 5,015,55 (3H, m), 7,31-7,70 (5H, m), 7,90-8,05 (2H, m) , 8,25-8, 42 (2H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz, CDC1₃) -232, 6 (t) , -232,8 (t) ; MS (ESI +ve) 498(M+H).

Ethylamid [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (62%) : ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 0,96-1,31 (9H,

m), 2,21-2,45 (1H, m), 2,48-2,80 (2H, m) , 3,15-3,48 (2H, m) , 4,23-4,76 (3H, m) , 5,05-5,42 (1H, m) , 6,42-6,84 (1H, m) ,

7,38-7,60 (4H, m) , 7,95-8,09 (2H, m), 8,20-8,41 (2H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz, CDC1₃) -223,8 (t), -224,5 (t), -226,5 (t),

-227,1 (t), -231,9 (t), -232 (t); MS (ESI +ve) 452 (M+H₂O).

Příklad 23

Piperazinamid [3S/R] -5-fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2(karbazol)-karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanová kyselina,

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (78%) : ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,10-1,35 (6H,

m), 1,80-3,55 (14H, m) , 4,82-4,98 (1H, m) , 5,00-5,45 5 (3H, m), 7,38-7,60 (5H, m) , 7,95-8,08 (2H, m), 8,27-8,45 (2H, m);

99 99 99

9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 *9 99 9999 ¹⁹F NMR (376 MHz, CDC1₃) -232,5 (t) , -232,7 (t) ; MS (ESI +ve) 525 (M+H).

Příklad 24

Ν,Ν-dimethylaminoethylamid kyseliny [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3[(S)-3-methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]pentanové

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (49%) : ^ΧΗ NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,14-1,31 (6H, m) , 1,88-3,04 (13H, m) , 3,88-4,41 (3H, m), 4,57-4,74 (1H, m) ,

5,33-5,61 (1H, m) , 6,86-7,12 (1H, m) , 7,33-7,56 (4H, m) ,

8,01-8,05 (2H, m) , 8,27-8,41 (2H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz, CDC1₃) -222,4 (t), -222,5 (t); MS (ESI +ve) 513 (M+H).

Příklad 25 [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanamid

Method N:

• · · · · · * • « 999 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 ·· 99 9999

K míchanému roztoku [3S/R]-5-fluor-4-oxo-3-methyl-2(karbazol-karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové kyseliny z Příkladu 1 (150 mg) v 1,5 ml dichormethanu a dimethylformamidu (0,075 ml) byl přidán karbonyldiimidazol (66 mg) . Směs byla míchána 2 hod při 0 °C přičemž byl během té doby probubláván amoniak. Směs byla naředěna s ethylacetátem/10% vodným roztokem hydrogensíránu draselného. Organická fáze byla odstraněna a vodná fáze byla extrahována s ethyl-acetátem. Spojené organické vrstvy byly sušeny nad síranem hořečnatým, zfiltrovány a zkoncentrovány. Zbytek byl čištěn pomoci flash chromatografií (5% methanol/dichlormethan) za vzniku amidu ve formě bílé tuhé látky (80 mg), ^ΤΗ NMR (400 MHz, CDC1₃) 1,10-1,28 (6H; m) ,

2,12-2,75 (3H, m) , 4,10-4,85 (4H, m) , 5,29 (1H, m) , 6,36,

6,55,	6,78, 6,98 (1H, 4	x s) , 7,17 (1H, m) ,	7,42	(2H, m),
7,50	(2H, m) , 7,99	(2H,	20 m) , 8,29 (2H, m) ;	¹⁹f	NMR (376
MHz,	CDC1₃) -225,47	(t) ,	226,00 (t), -227,33	(t)	, -227,50
(t) ,	-228,43 (t); MS	(ESI	+ve) 424 (M-H₂O+H).

Příklad 26

Cyklohexylester kyseliny [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (37%) : ⁷Η NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 0,90-1,80 (16H,

m), 2,59 (1H, m) , 2,75-3,15 (2H, m), 4,40 (0,5H, m) , 4,64 • · « · • Φ · ·* ··

Φ φ Φ • · ♦ •· ···· (0,5Η, m) , 4,95-5,45 (4Η, m) , 7,25 (1Η, m) , 7,42 (2Η, m) ,

7,52 (2Η, m) , 8, 05 (2Η, m) , 8,36 (2Η, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz , CDC1₃) -231,95 (t), -232,08 (t).

Příklad 27 n-Propylester kyseliny [3S/R]-5-Fluor-4-oxo-3-[(S)-3methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (82%) : ^XH NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 0,80 (3H, m) ,

1,13-1,36	(6H,	m), 1,42	(1H, m), 1,58 (1H, m) , 2	,60 (1H, m) ,
2,80-3,08	(2H,	m) , 3,70	(1H, m), 3,98 (1H, m), 4,	92-5,50 (4H,
m), 7,21	(1H,	m) , 7,40	(2H, m) , 7,50 (2H, m) ,	8,00 (2H,m),
8,32 (2H,	m) ;	¹⁹F NMR	(376 MHz, CDCI3) 232,00	(t), -232,01
(t); MS (ESI +ve) 485 (M+H).

Příklad 28

Isopropylester kyseliny [3S/R]-5-fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové kyseliny

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo • · · · · * ··· · ·· φ · • ♦ · • · ·· • · · ♦ · ·

9· ·» • · · • β * • · · ♦ * ♦ ·· ·«·· popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (7%) : hi NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 0,90-1,33 (12H,

m), 2,55 (1H, m), 2,78-3,15 (2H, m), 4,80-5,50 (5H,

m) , 7,25 (1H, brs), 7,43 (2H, m) , 7,55 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,36 (2H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz CDC1₃) -232,00 (t) ,

-232,03 (t).

Příklad 29

Methylester kyseliny [3S/R]-5-fluor-4-oxo-3-[(S)-3-methyl-2(karbazol) karbamoyloxy-butyrylamino] -pentanové

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě M. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (81%) : ^ΧΗ NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 1,20 (6H, m) ,

2,58 (1H,	m) ,	2,80-3,05	(2H, m) , 3,42, 3,61 (3H,	2 x	s) ,
4,98-5,26	(3H,	m) , 5,41	(1H, m) , 7,20 (1H, brs),	7,45	(2H,
m), 7,55	(2H,	m) , 8,04	(2H, m), 8,35 (2H, m) . ¹⁹F	NMR	(376

MHz, CDCI3) -231,99 (t), -232,00 (t); MS (ESI +ve) 457 (M+H).

Příklad 30

Cholesterolester kyseliny [3S/R]-5-fluor-4-oxo-3-[(S)-3methyl-2-(karbazol)karbamoyloxy-butyrylamino]-pentanové

90 • 0 0

0 9 0 • 0 · · · ·

9009 99

99 09 00

0 0 0 · 9 ·

9« 9 9 9 9 • 900900 9 9 • 9 9 0 0 · • 9 00 09 0999

Sloučenina byla připravena podobným způsobem jako bylo popsáno výše v Metodě N, s využitím karbonyldiimidazolu jako kondenzačního činidla. Produkt byl izolován ve formě bílé tuhé látky (12%) : NMR (400 MHz, CDC1₃) δ0,65-2,35 (47H,

m) , 2,58 (1H, m) , 2,75-3,15 (2H, m) , 4,25 (0,5H, m) , 4,48 (0,5H, m) , 4,97-5,46 (5H, m) , 7,30 (1H, m) , 7,44 (2H, m), 7,58 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,33 (1H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz CDCI3) -231,91 (t) , -232,03 (t) . Byl také izolován odpovídající ketal ve formě bílé tuhé látky (21%) : NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,65-2,10 (48H, m) , 2,35-3,15 (2H, 3xm) ,

3,42-3,69 (1H, m) , 4,10-4,96 (4H, m), 5,15-5,65 (2H, m), 6,78 (1H, m) , 7,45 (2H, m), 7,57 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,34 (2H, m) ; ¹⁹F NMR (376 MHz, CDC1₃) -230,57 (t) , -230,67 (t) .

Metody testování

Stanovení enzymu

Stanovení kaspázové inhibice je založeno na štěpení fluorogenního substrátu rekombinantními lidskými kaspázami 1, -3, -7 nebo -8. Stanovení se provádí v podstatě stejným způsobem jako je popsáno v Garcia-Calvo et al., (J. Biol. Chem., 273 (1998), 32608-32613), s využitím substrátů specifických pro každý enzym. Substrát pro Kaspázu-1 je Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-methylkumarín. Substrát pro »0 0000 • · 9· • 0 0 0 0*·

0

0» •••Φ 00

00 0

0«

Kaspázy-3, -7 a -8 je Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4methylkumarín.

Pozorovaná změna enzymové aktivace při určité koncentraci ihlibitoru, k_Obs/ byla spočtena přímým fitováním dat na rovnici odvozenou v Thornberry et al. (Biochemistry 33 (1994), 3943-3939) s využitím počítačového programu pro nelineární analýzu nejmenších čtverců (PRISM 2.0, GraphPad software). K získání rychlostních konstant druhého řádu, ki_nact, hodnoty k_Obs byly vyneseny proti jejich odpovídajícím inhibičním koncentracím a ki_nact hodnoty byly následně spočteny pomocí počítačvé lineární regrese. Mnoho sloučenin podle tohoto vynálezu, testovanách proti kaspáze-1, vykazuje kinact hodnoty mezi 25000 a 1500000 M¹s'¹, proti kaspáze-3 vykazují k_inact hodnoty mezi 9000 a 1500 000 M^_1s¹, proti kaspáze-8, vykazují kinact hodnoty mezi 10 000 a 700 000 M'¹s'¹.

Inhibice vylučování IL-lb ze směsné populace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC)

Zpracování pre-IL-Ιβ kaspázou-1 může být měřeno v buněčné kultuře s využitím mnoha buněčných zdrojů. Lidské PBMC získané ze zdravých donorů poskytují smíšenou populaci lymfocytů a mononukleárních buněk, které produkují spektrum interleukinů cytokinů jako odezvu na mnoho tříd fyziologických stimulátorů.

Experimentální postup

Testovaná sloučenina byla rozpuštěna v dimethylsulfoxidu (DMSO, Sigma #D-2650) za vzniku 100 mM zásobního roztoku. Ten byl naředěn v kompletním médiu obsahujícím RPMI obsahující 10% tepelně aktivovaného FCS (Gibco BRL #10099-141), 2mM LGlutaminu (Sigma, #G-7513), 100U penicilinu a 100 gg/ml streptomycinu (Sigma, #P-7539). Konečná koncentrace testované «41 0« »0 0* »0· «0 « 0 0 0 « 0 · 0 0 0

000 0 0 0 0 0 0 0

00» 000000 0 0 0»0 0» 0 000

0000 «0 00 00 00 0000 sloučeniny se pohybuje od 100 μΜ až do 6 nM v rozmezí osmi ředících stupňů. Nejvyšší koncentrace testované sloučeniny je ekvivalentní 0,1% DMSO u stanovení.

Lidské PBMC jsou izolovány z Buffy Coats získaných z krevní banky s využitím centrifugace na Ficoll-Paque leukocyte separačním médiu (Amersham, #17-1440-02) a buněčné stanovení bylo provedeno ve sterilní 96 jamkové desce s plochým dnem (Nunc). Každá jamka obsahuje 100 μΐ buněčné suspenze, 1 x 10⁵ buněk, 50 μΐ roztoků sloučeniny a 50 μΐ LPS (Sigma #L-3012) při konečné koncentraci 50 ng/ml. Kontrola sestává z buněk +/- LPS stimulovaných a série naředění s DMSO stejným způsobem jako u sloučeniny. Desky byly inkubovány 16 až 18 hod při 37 °C v 5% atmosféře CO₂ a 95% vzdušné vlhkosti.

Po 16 až 18 hod byla kapalina sebrána po centrifugací desek při 100 x g při 18 °C po dobu 15 minut a stanoveny na obsah IL-Ιβ. Měření zralého IL-ΐβ v kapalině bylo provedeno s využitím Quantikine stavebnice (R&D Systems) podle instrukcí výrobce. Koncentrace zralého IL-Ιβ od 600 do 1500 pg/ml bylo pozorováno u PBMC v pozitivních kontrolních j amkách.

Inhibiční schopnost sloučenin může být vyjádřena jako hodnota IC50, což je koncentrace inhibitoru, při které 50% zralého IL-Ιβ je detekováno v kapalině ve srovnání s pozitivním kontrolním vzorkem. Tabulka 5 ukazuje inhibici vylučování IL-Ιβ z mononukleárních buněkperiferní krve pro vybrané sloučeniny podle tohoto vynálezu, získaných výše popsanou metodou.

Vybrané sloučeniny byly testovány tímto stanovením a vykázaly schopnost inhibice vylučování IL-lb d hodnotami mezi 0,04 μΜ a 20 μΜ.

• 4 · • · · * •••a ··

Stanovení Anti-Fas indukované apoptózy

Buněčná apoptóza může být indukována vázáním Fas ligandu (Fasl) k jeho receptorů, CD95 (Fas) . CD95 je jeden z rodiny odpovídajících receptorů známých jako smrtící receptory, které mohou spouštět apoptózu v buňkách prostřednictvím aktivace kaspázové enzymové kaskády. Proces je iniciován vázáním adapterové molekuly FADD/MORT-1 k cytoplasmatické doméně CD-95 komplexu receptor-ligand. Kaspáza-8 poté váže FADD a aktivuje se, iniciuje kaskádu událostí, zahrnujících aktivaci poproudé kaspázy a následné buněčné apoptózy. Apoptóza může být také indukována v buněčné expresi CD95 eg Jurkat E6.1 T buněk buněčné linie lymfomu, s využitím protilátky, spíše než FasL, k zesíťování buněčného povrchu CD95. Anti-Fas-indukovaná apoptóza se také spouští prostřednictvím aktivace kaspázy-8. To poskytuje základy buněčného stanovení k hledání sloučenin schopných inhibice apoptózy zprostředkované kaspázou-8.

Experimentální procedura

Jurkat E6.1 buňky byly kultivovány v kompletním médiu obsahujícím RPMI-1640 (Sigma) + 10% séra telecího plodu (Gibco BRL č. 10099-141) + 2 mM L-glutaminu (Sigma č. G7513). Buňky byly sebrány v log fázi růstu. 100 ml buněk při koncentraci 5-8 x 10⁵ buněk/ml byly převedeny do sterilních 50 ml Falcon centrifugačních zkumavek a byly centrifugovány po dobu 5 minut při 100 x g při laboratorní teplotě. Kapalina byla odstraněna a spojené pelety buněk byly opět suspendovány ve 25 ml kompletního média. Buňky byly spočteny a hustota byla adjustována pomocí kompletního média na hodnotu 2 x 10⁶buněk/ml.

Testovaná sloučenina byla rozpuštěna v dimethylsulfoxidu (DMSO) (Sigma Č. D-2650) za vzniku 100 mM zásobního roztoku.

99 94 ·4

9 9 9 9 9 9

9 999 999 4

9 9 9 9 9

99 99 9994 ν· ·* • · · • ··· * · I • · 9949 99

Ten byl naředěn na 400 μΜ v kompletním médiu, poté sterilně naředěn v 96 jamkové desce před přidáním na desku pro buněčné stanovení.

100 μΐ buněčné suspenze (2 x 10⁶ buněk) bylo přidáno do každé jamky sterilní 96-ti jamkové desky s kulatým dnem (Costar č. 3790) . Pak bylo na desku přidáno 50 μΐ roztoku sloučeniny při konkrétním naředění a 50 μΐ anti-Fas protilátky, klonu CH-11 (Kamiya č. MC-060) o finální koncentraci 10 ng/ml. Byly zavedeny kontrolní jamky bez protilátky a bez sloučeniny, ovšem se sterilním roztokem DMSO jako kontrolního vehikula. Desky byly inkubovány 16 až 18 hod při 37 °C v 5% atmosféře CO₂ a 95% vzdušné vlhkosti.

Apoptóza buněk se měří pomocí kvantifikace DNA fragmentace s využitím sady „Cell Death Detection Assay od Boehringer-Mannheim, č. 1544 675. Po inkubaci po dobu 16 až 18 hod byly desky centrifugovány při 100 x g při laboratorní teplotě po dobu 5 minut. 150 μΐ kapaliny bylo odstraněno a nahrazeno se 150 μΐ čerstvého kompletního média. Buňky byly poté sebrány a do každé jamky bylo přidáno 200 μΐ lyzního pufru dodávaného se sadou pro stanovení. Buňky byly triturovány za účelem zajištění kompletní lýzy a inkubovány 30 minut při 4 °C. Desky byly poté 10 minut centrifugovány při 1900 x g a kapalina naředšna 1:20 v dodávaném inkubačním pufru. 100 μΐ tohoto roztoku bylo poté stanoveno podle pokynů výrobce dodávaných společně se sadou. OD₄₀5nm bylo měřeno 20 minut po přidání finálního substrátu ve čtečce desek SPECTRAmax Plus (Molecular Devices). OD₄osnm se vynáší proti koncentraci sloučeniny a hodnoty IC50 pro sloučeninu se spočtou s využitím programu pro fitování křivek SOFTmax Pro (Molecular Devices) a s použitím čtyřparametrického fitování.

·· · · ·· ·* ·· ··· ···· · · · • · · · · ·· · · · .'

Vybrané sloučeniny byly testovány tímto stanovením a vykazují inhibici Fas-indukovanou apoptózu Jurkat buněk s hodnotami IC50 mezi 0,001 μΜ a 0,15 μΜ.

Zatímco jsme popsali mnohá provedení tohoto -vynálezu, je zřejmé, že námi uvedené základní příklady mohou být pozměněny za získání dalších provedení, která využívají sloučeniny a způsoby podle tohoto vynálezu. Je proto vhodné definovat rozsah tohoto vynálezu pomocí následujících nároků, spíše než pomocí konkrétních provedení, která mohou být reprezentována pomocí příkladů.

Claims

Patentové nároky

1. Způsob léčení nemocí u pacientů,zmírňovaných pomocí kaspázového inhibitoru, vyznačující se tím, že se pacientovi potřebujícímu takovéto léčení podává terapeuticky účinné množství sloučeniny vzorce I:

nebo jejího farmaceuticky přijatelného derivátu, kde:

Z je kyslík nebo síra;

R¹ je vodík, -CHN₂, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

R je Ci_i₂alifatický zbytek, aryl, aralkyl, heterocyklyl nebo heterocyklylalkyl;

Y je elektronegativní odstupující skupina;

R² je CO₂H, CH₂CO₂H nebo estery, amidy nebo jejich isostery;

R³ je skupina schopná vejít se do S2 submísta kaspázy;

R⁴ a R⁵ tvoří společně s intervenujícím dusíkem mono-, binebo tricyklický heterokruhový systém, mající 1 až 6 heteroatomů, vybraných ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru.
2. Způsob léčení podle nároku 1, vyznačující se t i m,že sloučenina má jeden nebo více z následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je vodík, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je skupina mající molekulární hmotnost až do asi 140 • · »· · · · ·

Daltonů, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří monocyklický, bicyklický nebo tricyklický kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 kruhových atomů.
3. Způsob léčení podle nároku 2,vyznačující se tím, že sloučenina má následující rysy:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je vodík, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je skupina mající molekulární hmotnost až do asi 140 Daltonů, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří monocyklický, bicyklický nebo tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až

7 kruhových atomů.
4. Způsob léčení podle nároku 3, vyznačující se tím, že R¹ je -CH₂Y.
5. Způsob léčení podle nároku 4,vyznačující se tím, že R¹ je -CH2F a R³ je Ci_4alkylová skupina.
6. Způsob léčení podle nároku 5,vyznačující se tím, že R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří bicyklický nebo tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 kruhových atomů.
7. Způsob léčení podle nároku 6, vyznačující se tím, že R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří • · • · ·· tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 kruhových atomů.
8. Způsob léčení podle nároku Ί, vyznačující se tím, že středový kruh tricyklického kruhového systému je 5ti až 6-ti členný kruh.
9. Způsob léčení podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že sloučenina má jeden nebo více následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří kruh vybraný ze skupiny obsahující indol, isoindol, indolin, indazol, purin, dihydropyridin, benzimidazol, imidazol, imidazolin, pyrrol, pyrrolidin, pyrrolin, pyrazol, pyrazolin, pyrazolidin, triazol, piperidin, morfolin, thiomorfolin, piperazin, karbazol, fenothiazin, fenoxazin, dihydrofenazin, dihydrocinnolin, dihydrochinoxalin, tetrahydrochinolin, tetrahydroisochinolin, dihydronaf tyridin, tetrahydronaftyridin, dihydroakridin, β-karbolin, pyrido[4,3b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen,

3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
10. Způsob léčení podle nároku 9, vyznačující se tím, že sloučenina má jeden nebo více následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO2H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří kruh vybraný ze skupiny obsahující indol, isoindol, indolin, indazol, benzimidazol, imidazol, pyrrolidin, pyrazol, triazol, piperidin, morfolin, thiomorfolin, piperazin, karbazol, fenothiazin, fenoxazin, dibenzoazepin, dihyddro-dibenzoazepin, dihydrofenazin, dihydrocinnolin, dihydrochinoxalin, tetrahydrochinolin, tetrahydroisochinolin, dihydronaftyridin, tetrahydronaftyridin, dihydroakridin, β-karbolin, pyrido[4,3b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen,

3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
11. Způsob léčení podle nároku 10, vyznačující se tím, že sloučenina má jeden nebo více následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je -CH2OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří substituovaný nebo nesubstituovaný kruhový systém vybraný ze skupiny obsahující karbazol, fenothiazin, indol, indolin, 5Hdibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin, βkarbolin, pyrido[4,3-b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia2,10-diazaanthracen, 3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
12. Způsob léčení podle nároku 11, vyznačující se tím, že Z je kyslík; R¹ je -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y; R² je

CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster; R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, a R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří substituovaný nebo nesubstituovaný kruhový systém vybraný ze skupiny obsahující karbazol, fenothiazin, indol, indolin, 5H-dibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5Hdibenzo[b,f]azepin, β-karbolin, pyrido[4,3-b]indol, 2,3,9triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen, 3,6,9triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
13. Způsob léčení podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že R¹ je -CH₂Y.
14. Způsob léčení podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m, že R¹ je -CH₂F.
15. Způsob léčení podle nároku 1,vyznačující se tím, že sloučenina je vybrána ze sloučenin uvedených v Tabulce 1.
16. Způsob léčení podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučenina je vybrána z následujících:

o « · 999 999999 9 9 • 99 99 9 9 9 ·

9999 99 99 99 99 9999
17. Způsob léčení podle nároků 1 až 16, vyznačuj ící se t í m, že nemoc nebo léčení je vybráno ze skupiny obsahující nemoci vyvolané IL-1, onemocnění vyvolaná apoptózou, zánětlivá onemocnění, autoimunitní onemocnění, destruktivní poruchu kostí, proliferativní poruchu, infekční onemocnění, degenerativní onemocnění, nemoc spojenou s buněčnou smrtí, nemoci spojené s nadměrným konzumováním alkoholu, nemoci přenášené viry, uveitis, zánětlivou peritonitidu, osteoarthritidu, pankreatitidu, astma, syndrom respirační nedostatečnosti u dospělých, glomerulonefritidu, revmatickou arthritidu, systemický lupus erythematosus, skleroderma, chronickou thyroiditidu, Graveovu nemoc, autoimunitní gastritidu, diabetes, autoimunitní hemolytickou anemii, autoimunitní neutropenii, thrombocytopenii, chronickou aktivní hepatitis, myasthenii gravis, zánětlivé onemocnění střev, Crohnovu nemoc, psoriázu, atopickou dermatitidu, zjizvení, odmítnutí štěpu u hostitele, odmítnutí transplantovaných orgánů, osteoporosu, leukémii a příbuzné poruchy, myelodysplastický syndrom, mnohočetné poruchy kostí vyvolané myelomem, akutní myelogenní leukémii, chronickou myelogenní leukémii, metastatický melanom, Karposiho sarkom, mnohočetný myelom, haemorrhagický šok, sepsi, septický šok, popáleniny, Shigellosis, Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc, Huntingtonovu nemoc, Kennedyho nemoc, prionové nemoci, cerebrální ischémii, epilepsii, myokardální ischémii, akutní a chronické onemocnění srdce, myokardiální infarkt, kongestivní srdeční selhání, atherosklerosu, náhradu koronárních tepen, spinální muskulární atrofii, amyotrofickou laterální sklerosu, vícenásobnou sklerosu, HIV-vyvolanou encefalitidu, stárnutí, alopecii, neurologiké poškození vyvolané mrtvicí, ulcerativní kolitidu, traumatické mozkové poškození, zranění míchy, hepatitidu-B, hepatitidu-C, • 9 • · ·· • · · · • · · ·

9 999 9 9 hepatitidu-G, žlutou horečku, dengue horečnaté onemocnění nebo japonskou encefalitidu, různé formy jaterních nemocí, renální onemocnění, polyaptické nemoci ledvin, gastrické onemocnění vyvolané H. pylori a onemocnění způsobené dvanácterníkovým vředem, HIV infekci, tuberkulosu a meningitidu, léčení komplikací spojených s bypasem koronárních tepen nebo imunoterapii pro léčení různých forem rakoviny.
18. Způsob léčení podle nároků 1 až 16, vyznačuj ící se t í m, že se sloučenina používá pro léčení komplikací spojených se zavedením bypasu koronárních tepen.
19. Způsob léčení podle nároků 1 až 16, vyznačuj ící se t í m, že se sloučenina používá pro preservaci buněk, přičemž zmíněná metoda zahrnuje krok vykoupání buněk v roztoku sloučeniny nebo jejího farmaceuticky přijatelného derivátu.
20. Způsob léčení podle nároků 1 až 16, vyznačuj ící se t í m, že se sloučenina používá pro transplantovaný orgán nebo preservaci krevních produktů.
21. Způsob léčení podle nároků 1 až 16, vyznačuj ící se t i m, že se sloučenina používá jako složka imunoterapie pro léčení rakoviny.
22. Sloučenina vzorce I:

I • · • · nebo její farmaceuticky přijatelný derivát, kde:

Z je kyslík nebo síra;

R¹ je vodík, -CHN₂, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

R je Ci-i₂alifatický zbytek, aryl, aralkyl, heterocyklyl nebo heterocyklylalkyl;

Y je elektronegativní odstupující skupina;

R² je CO₂H, CH₂CO₂H nebo estery, amidy nebo jejich isostery;

R³ je skupina schopná vejít se do S2 submísta kaspázy;

R⁴ a R⁵ tvoří společně s intervenujícím dusíkem mono-, binebo tricyklický heterokruhový systém, mající 1 až 6 heteroatomů, vybraných ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru.
23. Sloučenina podle nároku 22, kde sloučenina má jeden nebo více z následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je vodík, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je skupina mající molekulární hmotnost až do 140 Dalton nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří monocyklický, bicyklický nebo tricyklický kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 kruhových atomů.
24. Sloučenina podle nároku 23, kde sloučenina má následující rysy:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je vodík, -R, -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

0 0 • 0 • ·

0 0 0· • 0 · · 0 0 0 0 0 000 0 0 (iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je skupina mající molekulární hmotnost až do 140 Dalton, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří monocyklický, bicyklický nebo tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až

7 kruhových atomů.
25. Sloučenina podle nároku 24, kde R¹ je -CH₂Y.
26. Slučenina podle nároku 25, kde R¹ je -CH₂F a R³ je alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku.
27. Sloučenina podle nároku 26, kde R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří bicyklický nebo tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 kruhových atomů.
28. Sloučenina podle nároku 27, kde R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří tricyklický heterocyklický nebo heteroarylový kruhový systém, kde každý kruh systému má 5 až 7 kruhových atomů.
29. Sloučenina podle nároku 28, kde středový kruh tricyklického kruhového systému je 5-ti nebo 6-ti členný kruh.
30. Sloučenina podle nároku 22, kde sloučenina má jeden nebo více následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

·»·· • · ·· • · · • · · · • · · · • ··· · · • ·· » ·t (iv) R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří kruh vybraný ze skupiny obsahující indol, isoindol, indolin, indazol, purin, dihydropyridin, benzimidazol, imidazol, imidazolin, pyrrol, pyrrolidin, pyrrolin, pyrazol, pyrazolin, pyrazolidin, triazol, piperidin, morfolin, thiomorfolin, piperazin, karbazol, fenothiazin, fenoxazin, dihydrofenazin, dihydrocinnolin, dihydrochinoxalin, tetrahydrochinolin, tetrahydroisochinolin, dihydronaftyridin, tetrahydronaftyridin, dihydroakridin, β-karbolin, pyrido[4,3b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen,

3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
31. Sloučenina podle nároku 30, kde sloučenina má jeden nebo více následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(iv) R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, nebo (v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří kruh vybraný ze skupiny obsahující indol, isoindol, indolin, indazol, benzimidazol, imidazol, pyrrolidin, pyrazol, triazol, piperidin, morfolin, thiomorfolin, piperazin, karbazol, fenothiazin, fenoxazin, dibenzoazepin, dihydro-dibenzoazepin, dihydrofenazin, dihydrocinnolin, dihydrochinoxalin, tetrahydrochinolin, tetrahydroisochinolin, dihydronaftyridin, tetrahydronaftyridin, dihydroakridin, β-karbolin, pyrido[4,3b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen, • · · · • · · · • tt·· · · • tt · • tttt ·· · tttttt •tttttt ·♦ ·· ·· ·· tttttttt

3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
32. Sloučenina podle nároku 31, kde sloučenina má jeden nebo více následujících rysů:

(i) Z je kyslík;

(ii) R¹ je -CH₂OR, -CH₂SR nebo -CH₂Y;

(iii) R² je CO₂H nebo ester, amid nebo jejich isoster;

(v) R⁴ a R⁵ společně s intervenujícím dusíkem tvoří substituovaný nebo nesubstituovaný kruhový systém vybraný ze skupiny obsahující karbazol, fenothiazin, indol, indolin, 5Hdibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin, βkarbolin, pyrido[4,3-b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia2,10-diazaanthracen, 3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
33. Sloučenina podle nároku 32, kde Z je kyslík; R¹ je -CH2OR, -CH2SR nebo -CH2Y; R² je CO2H nebo ester, amid nebo jejich isoster; R³ je alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, a R⁴ a R⁵společně s intervenujícím dusíkem tvoří substituovaný nebo nesubstituovaný kruhový systém vybraný ze skupiny obsahující karbazol, fenothiazin, indol, indolin, 5H-dibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin, β-karbolin, pyrido[4,3b]indol, 2,3,9-triazafluoren, 9-thia-2,10-diazaanthracen,

3,6,9-triazafluoren, thieno[3,2-b]pyrrol nebo dihydrofenanthridin.
34. Sloučenina podle nároku 33, kde R¹ je -CH₂Y.
35. Sloučenina podle nároku 34, kde R¹ je -CH₂F.

• 4 a a « a a a aaa a* aaaa • a a · • ··· a • a aaa aaa a a • aaa a« a· aa
36. Sloučenina podle nároku 22, kde sloučenina je vybrána ze sloučenin uvedených v Tabulce 1.
37. Slučenina podle nároku 22, kde sloučenina je vybrána z následujících:
38. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároků 22 až 37 a farmaceuticky přijatelný nosič.