NO325062B1

NO325062B1 - Karbamat-kaspase-inhibitorer samt anvendelse derav

Info

Publication number: NO325062B1
Application number: NO20024661A
Authority: NO
Inventors: Julian M C Golec; David John Bebbington; Jean-Damien Charrier; David Kay; Ronald Knegtel; Michael Mortimore; John Studley
Original assignee: Vertex Pharma
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2008-01-28
Also published as: AR027993A1; CN100358869C; US20040053920A1; DE60132567D1; EE200200550A; EP1268425B1; KR20020086711A; EA005740B1; JP2008266348A; KR100858640B1; DE60132567T2; IL151829A; US20020028803A1; PL201081B1; IL151829A0; WO2001072707A2; US7074782B2; WO2001072707A3; TWI318207B; PE20011267A1

Abstract

Denne oppfinnelse tilveiebringer kaspase-inhibitorer med formel (I): hvori Z er oksygen eller svovel; Rer hydrogen, -CHN,R, CHOR, CHSR eller -CHY; Y er en elektronegativ avgående gruppe; Rer COH, CHCOH eller estere, amider eller isosterer derav; Rer en gruppe som er i stand til å passe inn i S2-undersetet i et kaspaseenzym; R4 og Rer tatt sammen med det tilstøtende nitrogen og danner en heterocyklisk ring, og R er som beskrevet i beskrivelsen.Forbindelsene er effektive inhibitorer av apoptose og IL-lp-sekresjon.

Description

Oppfinnelsens område

Denne oppfinnelse vedrører området medisinsk kjemi og gjelder anvendelse av en forbindelse med formel I som angitt i krav 1 for fremstilling av et medikament og forbindelser med formel I som angitt i krav 19 samt farmasøytiske sammensetninger derav, som inhiberer kaspaser som medierer celleapoptose og inflammasjon.

Bakgrunnen for oppfinnelsen

Apoptose, eller programmert celledød, er en hovedmekanisme hvorved organismene eliminerer uønskede celler. Dereguleringen av apoptose, enten usedvanlig stor apoptose eller feilslått apoptose, har vært delaktig i flere sykdommer, så som kreft, akutte inflammatoriske og autoimmune forstyrrelser, iskemiske sykdommer og visse neurodegenerative forstyrrelser (se generelt Science, 1998, 281, 1283-1312; Ellis et al., Ann. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).

Kaspaser er en familie av cysteinproteaseenzymer som er nøkkelmediatorer i de signaliserende reaksjonsveier for apoptose og cellefjerning (Thornberry, Chem. Biol., 1998, 5, R97-R103) . Disse signaliserende reaksjonsveier varierer avhengig av celletype og stimulus, men alle apoptosereaksjonsveier synes å konvergere ved en felles effektorisk reaksjonsvei som fører til proteolyse av nøkkelproteiner. Kaspaser er involvert i både effektorfasen av den signaliserende reaksjonsvei og videre oppstrøms ved dens initiering. Oppstrømskaspasene involvert i initieringsforeteelser blir aktivert og aktiverer i sin tur andre kaspaser som er involvert i apoptosens senere faser.

Kaspase-1, den første identifiserte kaspase, er også kjent som interleukinkonverterende enzym eller "ICE." Kaspase-1 konverterer forløpsinterleukin-ip ("pIL-iP") til den proinflammatoriske aktive form ved spesifikk spaltning av pIL-ip mellom Asp-116 og Ala-117. Foruten kaspase-1 er der også elleve andre kjente humane kaspaser, som alle spaltes spesifikt ved aspartylrester. Det er også iakttatt at de har strenge fordringer om minst fire aminosyrerester på den N-terminale side av spaltningsstedet.

Kaspasene er blitt klassifisert i tre grupper avhengig av aminosyresekvensen som er foretrukket eller primært gjenkjent. Gruppen av kaspaser, som omfatter kaspasene 1, 4 og 5, har vist seg å foretrekke hydrofobe aromatiske aminosyrer i posisjon 4 på den N-terminal side av spaltningsstedet. En annen gruppe som omfatter kaspasene 2, 3 og 7, gjenkjenner aspartylrester ved begge posisjoner 1 og 4 på den N-terminale side av spaltningsstedet, og fortrinnsvis en sekvens av Asp-Glu-X-Asp. En tredje gruppe, som omfatter kaspasene 6, 8, 9 og 10, tolererer mange aminosyrer i den primære gjenkjennelsessekvens, men synes å foretrekke rester med forgrenede, alifatiske sidekjeder, så som valin og leucin i posisjon 4.

Kaspasene er også blitt gruppert i henhold til sin oppfattede funksjon. Den første underfamilie består av kaspasene 1 (ICE), 4 og 5. Disse kaspaser har vist seg å være involvert i proinflammatorisk cytokinbearbeiding, og derfor spiller de en viktig rolle i inflammasjon. Kaspase-1, det mest studerte enzym i denne klasse, aktiverer IL-ip-forløperen ved proteolytisk spaltning. Dette enzym spiller derfor en nøkkelrolle i den inflammatoriske respons. Kaspase-1 er også involvert i bearbeidingen av interferon gammainduserende faktor (IGIF eller IL-18) som stimulerer produksjonen av interferon gamma, en nøkkelimmunoregulator som modulerer antigenpresentasjon, T-celleaktivering og celleadhesjon.

De gjenværende kaspaser utgjør den andre og tredje underfamilie. Disse enzymer er av sentral viktighet i de intracellulære signaliserende reaksjonsveier som fører til apoptose. En underfamilie består av enzymene som er involvert i initieringen av foreteelser i den apoptotiske reaksjonsvei, inklusive transduksjon av signaler fra plasma-membranen. Medlemmer av denne underfamilie omfatter kaspasene 2, 8, 9 og 10. Den andre underfamilie, bestående av effektorkaspasene 3, 6 og 7, er involvert i de endelige spaltningsforeteelser nedstrøms som resulterer i systematisk nedbrytning og celledød ved apoptose. Kaspaser involvert i den signaltransduksjonen oppstrøms aktiverer kaspasene nedstrøms, som deretter ødelegger DNA's re-parasjonsmekanismer, fragmenterer DNA, demonterer cellens cytoskjelett og fragmenterer til slutt cellen.

En fireaminosyresekvens som primært gjenkjennes av kaspasene, er blitt bestemt for enzymsubstrater. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272, 9677-9682,

(1997); Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272, 17907-17911, (1997). Kjennskap til den fireaminosyresekvens som primært gjenkjennes av kaspasene, er blitt anvendt for å utvikle kaspaseinhibitorer. Reversible tetrapeptidinhibitorer er blitt fremstilt med strukturen CH3CO- [P4] - [ P3 ] - [P2 ] -CH (R) CH2CO2H hvor P2 til P4 representerer en optimal aminosyregjenkjennelsesfrekvens, og R er et aldehyd, nitril eller keton som er i stand til å bindes til kaspasens cysteinsulfhydryl. Rano og Thornberry, Chem. Biol. 4, 149-155 (1997); Mjalli, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689-2692 (1993); Nicholson et al., Nature 376, 37-43 (1995). Irreversible inhibitorer basert på den analoge tetrapeptidgjenkjennelsesfrekvens er blitt fremstilt hvor R er et acyloksymetylketon - C0CH20C0R' . R' er eksemplifisert ved et eventuelt substituert fenyl så som 2,6-diklorbenzoyloksy, og hvor R er COCH2X hvor X er en avgående gruppe så som F eller Cl. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J Med. Chem. 37, 563-564 (1994).

Nytten av kaspaseinhibitorer til å behandle mange forskjellige sykdomstilstander hos pattedyr forbundet med en økning i cellulær apoptose er blitt vist under anvendelse av peptidiske kaspaseinhibitorer. For eksempel, i gnagermodeller, har kaspaseinhibitorer vist seg å redusere infarktstørrelsen og inhibere kardiomyocytt-apoptose etter myokardialt infarkt, å redusere lesjonsvolumet og den nevrologiske mangel som er et resultat av slag, å redusere post-traumatisk apoptose og nevrologisk mangel i traumatisk hjerneskade, å være effektiv i behandlingen av fulminant leverdestruksjon og å forbedre overlevelsen etter endotoksisk sjokk. Yaoita et al., Circulation, 97, 27 6 (1998); Endres et al., J Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238, (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al., J Neuro-science, 17 , 7 415 (1997); Rodriquez et al., J. Exp. Med., 184, 2067 (1996); Grobmyer et al., Mol. Med., 5, 585 (1999) .

Generelt er de peptidiske inhibitorer beskrevet ovenfor meget kraftige mot noen av kaspaseenzymene. Imidlertid gjenspeiles denne kraft ikke alltid i cellemodeller for apoptose. Dessuten karakteriseres peptid-inhibitorer vanligvis ved uønskede farmakologiske egenskaper, så som dårlig oral absorpsjon, dårlig stabilitet og hurtig metabolisme. Plattner og Norbeck, i Drug Discovery Technologies, Clark og Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, England, 1990) .

Det fins rapporter om modifiserte peptidinhibitorer. WO 91/15577 og WO 93/05071 beskriver peptid-ICE-inhibitorer med formelen:

Hvori Z er en N-terminal beskyttende gruppe; Q2 er 0 til 4 aminosyrer; og Qi er en elektronegativ avgående gruppe.

WO 99/18781 beskriver dipeptidkaspase-inhibitorer med formelen:

hvori Ri er en N-terminal beskyttende gruppe; AA er en rest av en naturlig a-aminosyre eller p-aminosyre; R2 er hydrogen eller CH2R4 hvor R4 er en elektronegativ avgående gruppe; og R3 er alkyl eller hydrogen.

WO 99/47154 beskriver dipeptid-kaspase-inhibitorer med formelen:

hvori Ri er en N-terminal beskyttende gruppe; AA er en rest av en ikke-naturlig a-aminosyre eller P~ aminosyre; og R2 er eventuelt substituert alkyl eller hydrogen. WO 00/023421 beskriver (substituerte) acyldipeptidapoptose-inhibitorer med formelen:

hvor n er 0, 1, eller 2; q er 1 eller 2; A er en rest av en viss naturlig eller ikke-naturlig aminosyre; B er et hydrogenatom, et deuteriumatom, rettkjedet eller forgrenet Ci-ioalkyl, cykloalkyl, fenyl, substituert fenyl, naftyl, substituert naftyl, 2-benzoksazolyl, substituert 2-oksazolyl, (CH2) mcykloalkyl, (CH2) mfenyl,

(CH2)m(substituert fenyl), (CH2)m(l- eller 2-naftyl), (CH2)mheteroaryl, halogenmetyl, C02R<13>, CONR14R15, CH2ZR<16>, CH2OCOaryl, CH2OCO (substituert aryl), CH2OCO (heteroaryl) , CH2OCO (substituert heteroaryl) , eller CH2OPO (R17)R1<8>, hvor R<13>, R14, R15, R<16>, R17 og R<18> er de-finert i søknaden; R2 er valgt fra en gruppe inneholdende hydrogen, alkyl, cykloalkyl, fenyl, substituert fenyl, (CH2)mNH2; R<3> er hydrogen, alkyl, cykloalkyl, (cykloalkyl)alkyl, fenylalkyl, eller substituert fenylalkyl; X er CH2, C=0, 0, S, NH, C=0NH eller CH20C0NH; og Z er et oksygen- eller et svovelatom.

WO 97/24339 beskriver inhibitorer av interleukin-i<p>— omformerenzym med formelen: hvori R<1> representerer H, alkyl, alkoksy, en karbocyklus, en heterocyklus og forskjellige andre grupper; AA<1> og AA<2> er enkeltbindinger eller aminosyrer; og Y representerer en gruppe med formel:

hvori Tet-ringen representerer en tetrazolring; og Z representerer, inter alia, alkylen, alkenylen, 0, S, SO, og S02.

EP 618223 beskriver ICE-inhibitorer med formelen:

hvori R er H, en beskyttende gruppe eller et eventuelt ring-substituert PhCH20; Ai er en a-hydroksy- eller a-aminosyrerest; A2 er en a-hydroksysyrerest eller a-aminosyre, eller Ai og A2 danner sammen et pseudodipeptid eller en dipeptid-mimerende rest; X er en rest avledet fra Asp hvori A3 er CH2XiCOYi, CH2OY2, CH2SY3 eller CH2(CO)mY6 hvori Xx er 0 eller S, m er 0 eller 1, og Yi, Y 2, Y3 og Y6 er eventuelt substituerte cykliske alifatiske eller aryliske grupper.

WO 98/16502 beskriver inter alia ICE-inhibitorer med formelen:

hvori Ri og R2 er som beskrevet i søknaden, og pyrroli-dinringen er substituert av forskjellige grupper.

Selv om et antall kaspase-inhibitorer er blitt rapportert, er det ikke klart om de har de egnede farmakologiske egenskaper slik at de er terapeutisk nyttige. Derfor er der et kontinuerlig behov for småmolekylære kaspase-inhibitorer som er potente og stabile og trenger igjennom membraner for å gi effektiv inhibering av apoptose in vivo. Slike forbindelser ville være særdeles nyttige i behandlingen av de tidligere nevnte sykdommer hvor kaspase-enzymer spiller en rolle.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er nå blitt funnet at forbindelsene ifølge denne oppfinnelse og farmasøytiske sammensetninger derav er effektive som inhibitorer av kaspaser og celleapoptose. Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse med formel I:

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav ved fremstilling av et medikament, hvori: Z er oksygen; R<1> er -CH2Y; Y er halogen; R<2> er C02H, CH2CO2H, C02(Ci-6alkyl), CH2C02 (Ci_6alkyl) , C02 (cykloheksyl), CONH(Ci-6alkyl) , CH2CON(Ci-6alkyl) 2, CONHCH2CH2N(CH3)2,

R<3> er Ci-6alkyl; og

R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et bi- eller tricyklisk hetero-ringsystem med 1-6 hetero-atomer valgt fra nitrogen eller svovel, hvori nevnte ring er valgt fra karbazol, indol, fenotiazin, dihydrofenantridin, dibenzoazepin, dihydrodibenzoazepin eller indolin, hvori nevnte ring eventuelt er substituert med halogen, Ci-6alkyl eller CF3.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse har inhiberende egenskaper overfor et utvalg av kaspase-mål med god virkning i cellemodeller for apoptose. I tillegg vil disse forbindelser ha god cellegjennomtrengning og farmakokinetiske egenskaper, og som en følge av sin kraft har de god virkning mot sykdommer hvor kaspaser er delaktige.

Denne oppfinnelse tilveiebringer nye forbindelser med formel I

eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav, hvori: Z er oksygen;

R<1> er -CH2Y;

Y er halogen;

R<2> er C02H, CH2CO2H, C02(Ci-6alkyl), CH2C02 (Ci-6alkyl) ,

C02 (cykloheksyl), CONH (Ci-6alkyl) , CH2CON (Ci_6alkyl) 2, CONHCH2CH2N(CH3)2,

R<3> er Ci-6alkyl; og

Anvendt heri skal de følgende definisjoner gjelde, hvis intet annet er sagt. Uttrykket "Ci-6alkyl" anvendt alene eller som en del av en større gruppe refererer til både rette og forgrenede kjeder inneholdende et til seks karbonatomer. Uttrykket "halogen" betyr F, Cl, Br eller I.

Når R<2->gruppen er i form av en ester eller amid, gjennomgår foreliggende forbindelser metabolisk spaltning til de tilsvarende karboksylsyrer, som er de aktive kaspaseinhibitorer. Fordi de gjennomgår metabolisk spaltning, er den nøyaktige natur til ester- eller amidgruppen ikke kritisk for anvendeligheten av denne oppfinnelse. Strukturen til R<2->gruppen kan variere fra det relativt enkle dietylamid til en steroid ester.

R<3> kan i prinsippet være enhver gruppe som er i stand til å passe inn i S2-undersetet i en kaspase, men er i foreliggende oppfinnelse Ci-6alkyl. Slike grupper er kj ent fra de mange kaspaseinhibitorer som er blitt rapportert (se W091/15577, W093/05071, W099/18781, W099/47154, W000/023421, W09724339, EP618223, W09816502, som alle er beskrevet ovenfor). Videre er strukturene for flere av kaspaseenzymene inklusive S-2-undersetene også kjent. Referanser til kaspasestrukturen omfatter følgende: Blanchard H, et al., J. Mol. Biol. 302(1), 9-16 (2000); WeiY, et al., Chem. Biol.

7 ( 6 ) :42 3-32 (2000) ; Lee D, et al., J Biol. Chem. 275(21) :16007-14 (2000); Blanchard H, et al., Structure Fold Des. 7(9):1125-33 (1999); Okamoto Y, et al, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 47(1):11-21

(1999); Margolin N, et al, J. Biol. Chem. 272 (11) :7223-8 (1997); Walker NP, et al., Cell 78(2):343-52 (1994); og Wilson KP, et al., Nature 370(6487) :270-5 (1994) .

Hvorvidt en gruppe vil passe inn i S-3-undersetet vil avhenge av den spesielle kaspase som betraktes. Størrelsen av undersetet vil variere fra det lille S-2-undersete i kaspase-3 som kan motta en gruppe op til størrelsen av en Cj-alifatisk gruppe til et relativt stort undersete som kan motta en gruppe med en molekyl vekt opp til omkring 140 Dalton, så som en naftylgruppe. Størrelsen, sammen med den elektroniske natur, på R<3->gruppen vil ha innflytelse på kaspaseselektiviteten av inhibitoren. Fra henvisningene angitt ovenfor vil en fagkyndig person lett forvisse seg om en gruppe er i stand til på gunstig måte å passe inn i et S-2-undersete i en kaspase, for eksempel, ved å bruke normale molekylære modellprogrammer, så som Quanta eller Macromodel.

Forbindelser ifølge denne oppfinnelse hvor R<2> er COOH, er gamma-ketosyrer, som kan foreligge i løsning som enten den åpne form 1 eller den cykliserte hemiketalform 2. Representasjonen heri av den ene isomere form er ment å skulle omfatte den andre. På lignende måte kan cyklisering også opptre hvor R<2> er CH2OOH, og slike cykliserte isomerer er ment å være innbefattet når den åpne ringform er representert heri .

På samme måte vil det være åpenbart for en fagkyndig person at visse forbindelser ifølge denne oppfinnelse kan forekomme i tautomere former eller hydratiserte former, og alle slike former av forbindelsene er innenfor omfanget av oppfinnelsen. Hvis intet annet er sagt, er strukturene avbildet heri også ment å skulle omfatte alle stereokjemiske former av strukturen; dvs. R- og S-konfigurasjonene for hvert asymmetriske senter. Derfor er enkle stereokjemiske isomerer samt enantiomere og diastereomere blandinger av foreliggende forbindelser innenfor omfanget av oppfinnelsen. Hvis intet annet er sagt, er strukturene avbildet heri også ment å skulle omfatte forbindelser som adskiller seg bare ved nærvær av en eller flere isotopisk anrikede atomer.

Spesifikke eksempler på forbindelsene I er vist i Tabell 1.

Tabell 1. Eksempler på forbindelser med formel I ( Z er oksygen)

Etter å ha vurdert mange R<4->N-R<5->heterocykliske ringer ble det funnet at tricykliske forbindelser hvor endringene er i alt vesentlig på samme plan, viser overraskende overlegen stor kaspaseaktivitet sammenlignet med acykliske analoger eller andre tricykliske ringsystemer som ikke er hovedsakelig på samme plan. Denne vesentlige ko-planhet kan oppnås når den midterste ring i det tricykliske ringsystem er en 5- eller 6-leddet ring, så som i en karbazol- eller fenotiazinring.

Videre gir disse hovedsakelig ko-plane tricykliske ringsystemer, samt bicykliske ringsystemer, så som indol og indolin, bredere kaspase-aktivitet enn de tilsvarende forbindelser hvor den R<4->N-R<5->heterocykliske ring er monocyklisk, så som piperidin, piperazin eller morfolin.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse kan generelt fremstilles ved hjelp av metoder som er kjent for fagkyndige personer for analoge forbindelser, som illustrert ved de generelle skjemaer nedenfor og ved de preparative eksempler som følger.

Skjema I

Reagenser: (a) R<5->N=C=Z (2); (b) NaOH/THF/H20; (c) EDC/DMAP/HOBt; (d) i. Dess-Martin-perjodinan, (ii)

TFA/DCM

Skjema I ovenfor viser en synteserute for å oppnå forbindelser hvor R<4> er et hydrogen. Omsetning av et isocyanat eller tioisocyanat 2 med et melkesyrederivat 1 frembringer karbamat 3. Estergruppen i 3 hydrolyseres med base eller, når esteren er en t-butylgruppe, med trifluoreddiksyre for å tilveiebringe syre 4, som deretter kobles med aminoalkohol 5. Avhengig av R' og R<2>'s natur kan et aminoketon anvendes, istedenfor aminoalkohol, hvilket unngår det påfølgende oksidasjonstrinn. Når det gjelder fluormetylketoner hvor R' er CH2F, kan aminoalkoholen 5 oppnås i henhold til metoden beskrevet av Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693. Til slutt oksideres hydroksyl-gruppen i forbindelse 6, og den resulterende forbindelse behandles passende i henhold til R<2>'s natur. For eksempel, hvis produktet I krever at R<2> er en karboksylsyre, da er R2 i 6 fortrinnsvis en ester, og det avsluttende trinn i skjemaet er en hydrolyse.

Utgående isocyanater eller tioisocyanater 1 er kommersielt tilgjengelig eller kan fremstilles ved omsetning av et amin med fosgen eller en fosgenekvivalent (eller tiofosgen for fremstilling av tioisocyanater) i nærvær av en base, så som trietylamin. Laktatderivatene er kommersielt tilgjengelige eller kan fremstilles ved omsetning av en aminosyre med et diazoteringsreagens, så som med NaN02.

Skjema II

Reagenser: (a) CDI/THF; (b) MeOTf/CH2Cl2i (c) R<4>R<5>NH (8) /THF.

Skjema II ovenfor viser en synteserute for å oppnå forbindelsene I ifølge denne oppfinnelse hvor R<4> er en alkylgruppe, eller når R<4> og R<5> sammen danner en ring. Omsetning av laktatderivatet 2 med 1,1'-karbonyldiimidazol (CDI) gir imidazolatet 7. Metylation av 7 med metyltriflat, etterfulgt av omsetning med amin 8 (se J. Med. Chem., (1996), 39, 982) tilveiebringer mellomproduktet 3. Skjema I ovenfor viser hvordan 3 kan omdannes til I.

Skjema III

Reagenser: (a) C0C12/CH2Cl2i (b) 1/THF.

En alternativ synteserute for å oppnå forbindelsene I ifølge denne oppfinnelse hvor R<4> er en alkylgruppe, eller når R<4> og R<5> sammen danner en ring, er vist i Skjema III ovenfor. Behandling av amin 8 med fosgen gir et karbamoylkloridmellomprodukt 9. Omsetning av 9 med laktatderivat 1 tilveiebringer mellomprodukt 3.

Skjema IV

Reagenser: (a) C13C0C(0)Cl/THF; (b) R4R5NH (8), NaOH, Bu4NBr.

Skjema IV ovenfor viser en synteserute for å oppnå forbindelser ifølge denne oppfinnelse hvor R<4> er et hydrogen eller en alkylgruppe, eller når R4 og R<5> sammen danner en ring. Omsetning av hydroksyester 1 med fosgen eller en fosgenekvivalent, så som difosgen eller trifosgen fører til klorformiatmellomprodukt 10. Omsetning av 10 med amin 8 tilveiebringer mellomprodukt 3.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse er utformet for å inhibere kaspaser. Derfor kan forbindelsene ifølge denne oppfinnelse undersøkes med hensyn til deres evne til å inhibere apoptose, frigivelsen av IL-ip eller kaspaseaktivitet direkte. Undersøkelser med hensyn til hver av aktivitetene er beskrevet nedenfor i testavsnittet og er også kjent i faget.

En utførelsesform av denne oppfinnelse vedrører en sammensetning omfattende en forbindelse med formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Hvis farmasøytisk akseptable salter av forbindelsene ifølge denne oppfinnelse utnyttes i disse sammensetninger, er saltene fortrinnsvis avledet fra uorganiske eller organiske syrer og baser. Innbefattet blant slike syresalter er de følgende: acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, kamferat, kamfersulfonat, cyklopentanpropionat, diglukonat, dodecylsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glyserofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroksyetansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenyl-propionat, pikrat, pivalat, propionat, suksinat, tartrat, tiocyanat, tosylat og unde-kanoat. Basesalter omfatter ammoniumsalter, alkalime-tallsalter, så som natrium- og kaliumsalter, jordalkali-metallsalter, så som kalium- og magnesiumsalter, salter med organiske baser, så som dicykloheksylaminsalter, N-metyl-D-glukamin og salter med aminosyrer, så som arginin, lysin og så videre.

Dessuten kan de basiske nitrogen-inneholdende grupper være kvaternisert med slike midler som lavere alkylhalogenider, så som metyl-, etyl-, propyl- og butylklorid, -bromid og - jodid; dialkylsulfater, så som dimetyl-, dietyl-, dibuty-1 og diamylsulfater, langkjedede halogenider så som decyl-, lauryl-, myristyl- og stearylklorider, bromider og jodider, aralkylhalogenider, så som benzyl og fenetylbromider og andre. Vann- eller oljeløselige eller dispergerbare produkter oppnås da.

Forbindelsene anvendt i sammensetningene og anvendelsene ifølge denne oppfinnelse kan også modifiseres ved å tilføye passende funksjonaliteter for å forsterke selektive biologiske egenskaper. Slike modifikasjoner er kjent i faget og omfatter de som øker biologisk inntrengen inn i et gitt biologisk system (f. eks. blod, lymfesystem, det sentrale nervesystem), øker oral tilgjengelighet, øker oppløseligheten for å muliggjøre administrasjon ved injeksjon, endrer metabolismen og endrer

ekskresj onshastigheten.

Farmasøytisk akseptable bærere som kan anvendes i disse sammensetninger omfatter, men er ikke begrenset til, ionebyttere, alumina, aluminumstearat, lecitin, serumproteiner, så som humant serumalbumin, buffersubstanser så som fosfater, glycin, sorbinsyre, kaliumsorbat, partielle glyseridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter, så som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloid silisiumoksid, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosebaserte substanser, polyetylenglykol, natrium-karboksymetylcellulose, polyakrylater, vokser, polyetylen-polyoksypropylen-blokkpolymerer, polyetylenglykol og ullfett.

I henhold til en foretrukken utførelsesform er sammensetningene ifølge denne oppfinnelse formulert for farmasøytisk administrasjon til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske.

Slike farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt, parenteralt, ved inhalasjonsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukkalt, vaginalt eller via et implantert reservoir. Uttrykket "parenteral" som anvendes heri, omfatter subkutan, intravenøs, intramuskulær, intraartikulær, intrasynovial, intrasternal, intratekal, intrahepatisk, intralesjonal og interkraniell injeksjon eller infusjonsteknikker. Fortrinnsvis administreres sammensetningene oralt eller intravenøst.

Sterile injiserbare former av sammensetningene ifølge denne oppfinnelse kan være vandige eller oljeaktige suspensjoner. Disse suspensjoner kan formuleres i henhold til teknikker som er kjent i faget under anvendelse av passende dispergerende eller fuktende midler og suspenderende midler. Den sterile injiserbare fremstilling kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i en ikke-toksisk parenteralt akseptabel diluent eller løsningsmiddel, for eksempel som en løsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vehikler og løsnings-middelsmidler som kan anvendes, er vann, Ringers løsning og isotonisk natriumkloridløsning. I tillegg anvendes sterile, ikke-flyktige oljer konvensjonelt som løsningsmiddel eller suspenderende medium. For dette formål kan enhver mild ikke-flyktig olje anvendes, inklusive syntetiske mono- eller diglyserider. Fettsyrer, så som oljesyre og dens glyceridderivater er nyttige i fremstillingen av injiserbare midler, hvilke er naturlige farmasøytisk akseptable oljer, så som olivenolje eller ricinusolje, spesielt i deres polyoksyetylerte versjoner. Disse ol j eløsninger eller suspensjoner kan også inneholde en langkjedet alkoholfortynner eller disper-sjonsmiddel, så som karboksymetylcellulose eller lignende dispergerende midler som vanligvis anvendes i formuleringen av farmasøytisk akseptable doseringsformer inklusive emulsjoner og suspensjoner. Andre vanligvis anvendte overflateaktive midler, så som Tweens, Spans og andre emulgeringsmidler eller biotilgjengelighetsforsterkere som vanligvis anvendes i fremstillingen av farmasøytisk akseptable faste, flytende eller andre doseringsformer, kan også anvendes for formulerings formål.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge denne oppfinnelse kan administreres oralt i enhver oralt akseptabel doseringsform inklusive, men ikke begrenset til, kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller løsninger. Når det gjelder tabletter for oral bruk, omfatter bærere som vanligvis anvendes, laktose og maisstivelse. Smøremidler, så som magnesiumstearat, tilsettes også vanligvis. For oral administrasjon i en kapsel form omfatter nyttige fortynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner er påkrevet for oral bruk, kombineres den aktive ingrediens med emulgerende og suspenderende midler. Hvis ønskelig, kan visse søtningsstoffer, aroma-eller fargestoffer også tilsettes.

Alternativt kan de farmasøytiske sammensetninger ifølge denne oppfinnelse administreres i form av suppositorier for rektal administrasjon. Disse kan fremstilles ved å blande middelet med et passende ikke-irriterende eksipiens som er fast ved romtemperatur, men flytende ved den rektale temperatur og derfor vil smelte i rektum og frigi medisinen. Slike materialer omfatter kakaosmør, bivoks og polyetylenglykoler'.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge denne oppfinnelse kan også administreres topisk, spesielt når

målet for behandlingen omfatter områder eller organer som er lett tilgjengelige for topisk påføring, inklusive sykdommer i øynene, huden eller den lavere tarmkanal. Passende topiske formuleringer er lette å fremstille for hvert av disse områder eller organer.

Topisk påføring for den lavere tarmkanal kan utføres i en rektal suppositoriumformulering (se ovenfor) eller i en passende klystérformulering. Topisk-transdermale plastere kan også anvendes.

For topisk påføring kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en passende salve inneholdende den aktive komponent suspendert eller oppløst i en eller flere bærere. Bærere for topisk administrasjon av forbindelsene ifølge denne oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, mineralolje, flytende petrolatum, hvit petrolatum, propylenglykol, polyoksyetylen, polyoksypropylenforbindelse, emulgerende voks og vann. Alternativt kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en passende lotion eller krem inneholdende de aktive komponenter suspendert eller oppløst i en eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Passende bærere omfatter, men er ikke begrenset til, mineralolje, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetylestervoks, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.

For oftalmisk bruk kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres som finfordelte suspensjoner i isotonisk, pH-tilpasset steril saltløsning, eller fortrinnsvis som løsninger i isotonisk, pH-tilpasset steril saltløsning, enten med eller uten et konserveringsmiddel, så som benzylalkoniumklorid. Alternativt, for oftalmisk bruk, kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en salve, så som petrolatum.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge denne oppfinnelse kan også administreres ved nasal aerosol eller inhalering. Slike sammensetninger fremstilles i henhold til teknikker som er velkjent i faget farmasøytisk formulering og kan fremstilles som løsninger i saltløsning, under anvendelse av benzylalkohol eller andre passende konserveringsmidler, absorpsjonsfremmere for å forsterke biotilgjengeligheten, fluorkarboner og/eller andre konvensjonelle oppløsende eller dispergerende midler.

De ovenfor beskrevne sammensetninger er spesielt nyttige i terapeutiske anvendelser vedrørende en IL-l-mediert sykdom, en apoptosemediert sykdom, en inflammatorisk sykdom, en autoimmun sykdom, en destruktiv benforstyrrelse, en proliferativ forstyrrelse, en smittsom sykdom, en degenerativ sykdom, en sykdom forbundet med celledød, et altfor stort alkoholinntak, en virusmediert sykdom, uveitit, inflammatorisk peritonitt, osteoartritt, pankreatitt, astma, sjokklungesyndrom (adult respiratory distress syndrome), glomerulonefritt, revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus, skleroderma, kronisk tyreoditt, Graves sykdom, autoimmun gastritt, diabetes, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun nøytropeni, trombocytopeni, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom, psoriasis, atopisk dermatitt, arrdannelse, transplantat-mot-vert-sykdom, organtransplantatavstøtning, osteoporose, levkemier og relaterte forstyrrelser, myelodysplastisk syndrom, multippel myelom-relatert benforstyrrelse, akutt myeloisk levkemi, kronisk myeloisk levkemi, metastatisk melanom, Kaposis sarkom, multippelt myelom, hemoragisk sjokk, sepsis, septisk sjokk, forbrenninger, Shigellosis, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Kennedys sykdom, prion-sykdom, cerebral iskemi, epilepsi, myokardiskemi, akutt og kronisk hjertesykdom, myokardinfarkt, kongestiv hjertesvikt, aterosklerose, koronar- arteriebypass-transplantasjon, spinal muskelatropi, amyotrofisk lateral sklerose, multippel sklerose, HIV-relatert encefalitt, aldring, alopeci, nevrologisk skade på grunn av slag, ulcerøs kolitt, traumatisk hjerneskade, ryggmargsskade, hepatitt-B, hepatitt-C, hepatitt-G, gul feber, denguefeber eller japanesisk encefalitt, forskjellige former av leversykdom, renal sykdom, polyaptisk nyresykdom, H. pylori-forbundet gastrisk og duodenal ulcussykdom, HIV-infeksjon, tuberkulose og meningitt. Forbindelsene og sammensetninger er også nyttige for behandling av komplikasjoner forbundet med koronar arteriebypass-transplantasjon og som en komponent i immunterapi for behandling av forskjellige former av kreft.

Mengden av forbindelse som er nærværende i de ovenfor beskrevne sammensetninger bør være tilstrekkelig for å bevirke en påviselig minskning i sykdommens alvor eller i kaspaseaktiviteten og/eller celleapoptose, målt ved enhver av analysene beskrevet i eksemplene.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelse er også nyttige i medikamenter som anvendes for å bevare celler, som kan være nødvendige for en organtransplantasjon eller for å konservere blodprodukter. Lignende anvendelser for kaspaseinhibitorer er blitt rapportert (Schierle et al., Nature Medicine, 1999, 5, 97). Anvendelsen medfører å behandle cellene eller vevet som skal bevares med en løsning omfattende kaspaseinhibitoren. Mengden av kaspaseinhibitor som er nødvendig, vil avhenge av effektiviteten av inhibitoren for den gitte celletype og tiden som er nødvendig for å bevare cellene fra apoptotisk celledød.

Sammensetningene ifølge denne oppfinnelse kan videre omfatte et annet terapeutisk middel. Slike midler omfatter, men er ikke begrenset til, trombolytiske midler så som vevplasminogenaktivator og streptokinase. Når et andre middel er anvendt, kan det andre middel administreres enten som en separat doseringsform eller som en del av en eneste doseringsform med forbindelsene eller sammensetninger ifølge denne oppfinnelse.

Det bør også være underforstått at en spesifikk dosering og behandlingskur for den enkelte pasient vil avhenge av mange forskjellige faktorer, inklusive aktiviteten av den spesifikke forbindelse som anvendes, alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, kjønnet, kostholdet, administrasjonstiden, utskillelseshastigheten, medisinkombinasjonen og den behandlende leges vurdering og alvoret i den spesielle sykdom som behandles. Mengden av aktiv ingredienser vil også avhenge av den spesielle forbindelse og andre terapeutiske midler, hvis nærværende, i sammensetningen.

Forbindelser med formel I kan anvendes for å fremstille medikamenter for å behandle et pattedyr som har en av de tidligere nevnte sykdommer, omfattende trinnet å administrere til nevnte pattedyr et farmasøytisk akseptabelt medikament beskrevet ovenfor. Hvis pasienten også får et annet terapeutisk middel eller en kaspaseinhibitor, kan det leveres sammen med forbindelsen ifølge denne oppfinnelse i en eneste doseringsform, eller som en separat doseringsform. Hvis det administreres som en separat doseringsform, kan den andre kaspaseinhibitor eller det terapeutiske middel administreres før, samtidig eller etter administrasjon av en farmasøytisk akseptabel sammensetning omfattende en forbindelse ifølge denne oppfinnelse.

For at denne oppfinnelse kan forstås bedre, angis følgende fremstillings- og testeksempler. Disse eksempler er bare for illustrasjonens skyld og skal ikke oppfattes som begrensende for omfanget av oppfinnelsen i noen måte.

Synteseeksempler

De følgende eksempler tilveiebringer synteseprosedyrer for utvalgte forbindelser ifølge denne oppfinnelse.

Eksempel 1

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Metode A: (S)-2-(klorkarbamoyloksy)-3-metylsmørsyre, tert-butylester

Til en løsning av difosgen (4,55g) i THF (34 ml) ved 0°C ble tilsatt en løsning av (S)-2-hydroksy-3-metylsmørsyre-tert-butylester (for fremstillingsmetode se Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) (4, Og) og pyridin (l,82g) i THF (34 ml) dråpevis i løpet av 25 minutter.

Den resulterende blanding fikk anta romtemperatur i løpet av 4 timer. Blandingen ble deretter filtrert gjennom celitt, og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble oppløst på nytt i dietyleter (200 ml) og igjen filtrert gjennom celitt. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som en lysegul olje (5,27g): <1>H NMR (400MHz, CDC13) 5 0, 98-1, 10 (6H, m) , 1,55 (9H, s), 2,30 (1H, m) , 4 . 8 3 (1H, m) .

Metode B: (S)-3-metyl-2-(karbazol-karbamoyloksy)-smørsyre, tert-butylester

Til en løsning av karbazol (15,15g) i diklormeten (180 ml) og THF (142 ml) ved 0 °C ble tilsatt granulert natriumhydroksid (5,45g) etterfulgt av

tetrabutylammoniumbromid (2,93g). Den resulterende

blanding ble omrørt i 30 min, deretter ble en løsning av klorformiat (21,41g) i THF (81 ml) tilsatt dråpevis i løpet av 55 min. Blandingen fikk deretter anta romtemperatur over natten. Diklormetan (11) og vann (350 ml) ble deretter tilsatt, og den organiske fase ble fjernet. Den vandige fase ble deretter ekstrahert med diklormetan (2 x 250 ml), og de kombinerte organiske løsninger ble vasket med vann (200 ml), deretter saltoppløsning (200 ml), tørket (magnesiumsul f at) , filtrert og konsentrert. Resten ble renset ved hjelp av flash-kromatografi (0-5 % etylacetat/heksan) for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som en fargeløs olje (29, 3g): <X>H NMR (400MHz, CDC13) 5 1,15-1,23 (6H, m) , 1,55 (9H, s), 2,52 (1H, m), 5,27 (1H, d), 7,36-7, 57 (4H, m) , 8,03 (2H, d), 8,47 (2H, d).

Metode C:

(S)-3-metyl-2-(karbazol-karbamoyloksy)-smørsyre

Trifluoreddiksyre (84 ml) ble tilsatt dråpevis til en omrørt iskald løsning av (S)-3-metyl-2-(karbazol-karbamoyloksy) - smørsyre, tert-butylester (4.11g) i vannfritt DCM (300 ml) . Blandingen ble omrørt ved 0°C i 2h, deretter ved romtemperatur i lh. Blandingen ble konsentrert under redusert trykk, og deretter ble resten oppløst i tørt DCM, og løsningsmiddelet ble igjen fjernet under redusert trykk. Prosessen ble gjentatt flere ganger for å fjerne overskudd av trifluoreddiksyre. Dette gav syren som en lysegrønn gummi (3,30 g) : <1>E NMR (400MHz, CDC13) 5 1,12-1,37 (6H, m) , 2,70 (1H, m), 5,47 (1H, m), 7,32-7,56 (4H, m), 8,00 (2H, d) , 8,37 (2H, d) .

Metode D:

[3S/R, W4S/R]-5-fluor-4-hydroksy-3-((S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamido)-pentansyre, tert-butylester

En omrørt blanding av (S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-smørsyre (3,30g), 3-amino-5-fluor-4-hydroksy-pentansyre-tert-butylester (2,42g), HOBt (l,58g), DMAP (l,49g) og THF (80 ml) ble avkjølt til 0°C, deretter ble EDC (2,24g) tilsatt. Blandingen fikk anta romtemperatur i løpet av 16h, deretter ble den konsentrert under redusert trykk. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (15-45% etylacetat/heksan)for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som et hvitt skum (4, 60g) : 1H NMR (400MHz, CDC13) 5 1,09-1,50 (15H, m) , 2, 49-2, 80 (3H, m) , 3,20-3, 62 (1H, m) , 3,92-4,58 (4H, m), 5,32-5,42 (1H, d) , 6,86 (1H, brm) , 7,40-7,55 (4H, m), 8,02 (2H, d), 8,35 (2H, m) ; 19F NMR (376MHz, CDC13) -229, 6, -229,7, -230, 8, - 231, 4 .

Metode E: [3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, tert-butylester

En omrørt løsning av [3S/R, W4S/R]-5-fluor-4-hydroksy-3-((S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamido)-pentansyre, tert-butylester (4,60g) i vannfritt DCM (100 ml) ble behandlet med 1,1,1-triacetoksy-1,1-dihydro-1, 2-benziodoksol-3 (1H) -on (4, 68g) ved 0°C. Den resulterende blanding ble holdt ved 0 °C i 2 timer, fortynnet med etylacetat, deretter helt i en 1:1-blanding av mettet vandig natriumhydrogenkarbonat og mettet vandig natriumtiosulfat. Det organiske lag ble fjernet, og det vandige lag ble ekstrahert på nytt med etylacetat. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble tørket (magnesiumsulfat) og konsentrert. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (10-40% etylacetat/heksan)for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (3,96g): <X>H NMR (400MHz, CDC13) 5 1,85 (4,5H, s), 1-94-1,31 (6H, m), 1,36 (4,5H, s), 2,59 (1H, m), 2,70-3,11 (2H, m), 4,91-5,31 (3H, m) , 5,40-5,49 (1H, m) , 7,25 (1H, brs), 7,42 (2H, m) , 7,53 (2H, m) , 8,04 (2H, m) , 8,35 (2H, m) ; <19>F NMR (376MHz, CDC13) -232, 0, -232, 1 .

Eksempel IA

[3S/R] -5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av en lignende prosedyre som beskrevet ovenfor i Metode C. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (88 % siste trinn): IR (fast) 1721,2, 1695,6, 1664,9, 1449,8, 1378,1, 1198, 9, 1040, 1, 758,5 cm<-1>; 1H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,10 (6H, brm) , 2,41 (1H, m) , 2,54-3,04 (2H, m) , 4,31-4,82 (1,6H, m, CH2F), 5,10-5,41 (2,4H, m), 7,45 (2H, m), 7,57 (2H, m), 8,22 (2H, m), 8,30 (2H, m), 8,51-8,99 (1H, brm), 12,60 (1H, brs); <13>C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 19,0, 19,1, 19,3, 30,4, 30,5, 30,6, 32,9, 34,5, 34,7, 47,3, 47,4, 52,0, 52,3, 80,4, 80,8, 83,2, 83,4, 83,4, 85,1, 85,2, 116,2, 116.3, 124,1, 125,7, 125,9, 137,9, 151,7, 151,9, 152,0, 168,8, 169,0, 169,2, 172,0, 172,1, 173,1, 173,2, 202,2, 202.4, 202,5, 202, 6; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -230,5(t), -230,9(t), -232,9(t),

-233,0 (t); MS (ESI +ve) 443 (M+H) .

Eksempel 2

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(3-klorkarbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (99 % siste trinn): IR (fast) 1721,2, 1690,5, 1664,9, 1444,7, 1367,9, 1209,1, 1040,1 cm"<1>; <X>H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,02-1,13 (6H, m), 2,40 (1H, m) , 2,50-2, 99 (2H, m) , 4,30-4,85 (1,6H, m) , 5,09-5,48 (2,4H, m) , 7,48 (1H, m) , 7,56-7, 66 (2H, m) , 8,20-8,32 (3H, m) , 8,39 (1H, m) , 8,55-8, 99 (1H, brm), 12,5 (1H, br); 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 18,1, 18,9, 19,1, 30,4, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 80,6, 80,9, 81,1, 83,4, 83,43, 85,1, 85,2, 103,8, 104,0, 117,0, 119,3, 121,3, 122,3, 124,3, 124,7, 127,2, 127,4, 127,9, 128,5, 136,5, 138,4, 151,5, 151,6, 151,7, 168,7, 168,9, 169,0, 169,1, 172,0, 172,1, 173,1, 173,2, 202,2, 202,4, 202,44, 202,8 (C); 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t) - 230,4 (t), -230,9 (t), -231,0 (t), - 232,8 (t), -232,84 (t), -232,9 (t); MS (ESI +ve) 477(M+H).

Eksempel 3

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(3,6-diklor-karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (99 % siste trinn): IR (fast) 1721,2, 1659,7, 1470,3, 1434,4, 1367,9, 1209,1, 1075,9, 1045,2 cm"1; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 0,98-1,14 (6H, m) , 2,30-2,50 (1H, m) , 2,50-3,01 (2H, m) , 4,29-4,84 (1,5H, m) , 5,09-5,41 (2,5H, m) , 7,66 (2H, m), 8,19-8,29 (2H, m) , 8,45 (2H, m) , 8,57-8,99 (1H, brm), 12,60 (1H, br, OH) ; 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 15,5, 19,1, 19,2, 30,4, 30,45, 30,6, 33,0, 34,5, 34,7, 47,3, 47,5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,1, 81,2, 83,4, 84,43, 85,1, 85,2, 117,8, 121,1, 126,3, 128,4, 128,7, 136,9, 151,2, 151,4, 168,6, 168,8, 168,9, 168,95, 172,0, 172,04, 173,1, 173, 14, 202,2, 202, 3, 202,4, 202, 6; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226. 6 (t) , -226. 8 (t), -230, 4 (t), -230,8 (t), - 232, 8 (t), -232, 9 (t); MS (ESI +ve) 511/513 (M+H).

Eksempel 4

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(2-klorkarbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Metode F:

4'-klor-2-nitrobifenyl

Til en løsning av 2-bromnitrobenzen (64 6 mg) i THF (17 ml) under nitrogen ble tilsatt

tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0) (900 mg). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 20 min, deretter ble en løsning av 4-klorfenylborsyre (1,0 g) i etanol (17 ml) tilsatt, og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. 2M natriumkarbonat (17 ml) ble deretter tilsatt, og reaks j onsblandingen ble oppvarmet til tilbakeløp i 2 timer. Blandingen fikk deretter avkjøles og ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble oppløst i etylacetat (100 ml), og det vandige lag ble fjernet. Den organiske fase ble vasket med saltoppløsning (20 ml), tørket (magnesiumsulfat), filtrert og konsentrert. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (0-10 % etylacetat/heksan)for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som et gult fast stoff (646 mg): <1>H NMR (400MHz, CDC13) 8 7, 24-7, 31 (2H, m) , 7,41-7,47 (3H, m) , 7,52 (1H, m), 7,65 (1H, m), 7,90 (1H, d).

Metode G:

2-klorkarbazol

En blanding av 4'-klor-2-nitrobifenyl (640 mg) og trietylfosfitt (1,9 ml) ble oppvarmet ved 150 °C i 3 timer. Blandingen fikk deretter avkjøles og ble renset ved hjelp av flashkromatografi (5-10 % etylacetat/heksan) for å tilveiebringe undertittel forbindelsen som et hvitt fast stoff (382 mg): <X>H NMR (400MHz, d6-DMSO) 5 7,12-7,23 (2H, m), 2,40 (1H, m), 7,46-7,54 (2H, m), 8,12 (2H,

d) .

Eksempel 4

[3S/R] -5-fluor-4-okso-3- [ (S) -3-metyl-2- (2-klorkarbazol) - karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (99 % siste trinn) : IR (fast) 1731,4, 1695,6, 1664,9, 1424,2, 1367,9, 1326,9, 1193,7, 1045,2 cm"1; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,58-1,70 (6H, m) , 2,85-3,10 (1H, m) , 3,10-3,54 (2H, m) , 4,85-5,39 (1,4H, m), 5, 65-5,98 (2,6H, m) , 7,94-8,20 (3H, m), 8,73-8,90 (4H, m) , 9,10-9,56 (1H, brm), 13,2 (1H, br); 13C NMR (100MHz, de-DMSO) 5 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 19,2, 30,4, 30,5, 33, 0, 34,5, 34,7, 52,0, 52,3, 80, 6, 80,9, 81, 1, 83,4, 83,43, 85,1, 85,2, 104,0, 117,1, 121,0, 122,1, 124,2, 124,4, 124,6, 124,8, 129,0, 132,0, 138,2, 138,4, 151,6, 151,61, 168,7, 168,9, 169,0, 172,0, 172,05, 202,4, 202,42, 202, 6; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -225. 99 (t) , -226,2 (t) , -229. 8 (t), -230,3 (t), -232,3 (t), -232,4 (t); MS (ESI +v6) 477 (M+H) . Eksempel 5 [3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(2,3-diklorkarbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. 2,3-Diklorkarbazol ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene F og G. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (98 % siste trinn): IR (fast) 1721,2, 1659,7, 1434,4, 1367, 9, 1204, 0, 1188, 6, 1045,2 cm" 1; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,04-1,14 (6H, m) , 2,29-2,48 (1H, m), 2,53-3,00 (2H, m) , 4,30-4,84 (1,7H, m) , 5,09-5,41 (2,3H, m), 7,49 (1H, m) , 7,63 (1H, m), 8,20-8,33 (2H, m) , 8,42-8,49 (1H, m) , 8,62 (1H,- m) , 8,80-9,00 (1H, brm), 12,5 (1H, br); <13>C NMR (lOOMHz, d6-DMSO) 8 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 30,5, 33,0, 34,5, 34,7, 47,5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,0, 81,2, 83,4, 85,1, 85,2, 116,3, 117,9, 121,5, 122.4, 124,1, 124,6, 126,1, 126,6, 129,0, 129,7, 136,8, 138.5, 151,4, 151,45, 168,6, 168,9, 172,0, 172,03, 173,1, 202,2, 202,3, 202,4, 202, 5; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) 226, 6 (t), -226, 8 (t) , -230, 3 (t) , -230, 8 (t) , -232,8 (t), -232,9 (t) ; MS (ESI +ve) 513 (M+H). Eksempel 6 [3S/R] -5-fluor-4-okso-3- [ (S) -3-metyl-2- (2-trif luormetyl) - karbazol-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. 2-trifluormetylkarbazol ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene F og G. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (85 % siste trinn): IR (fast) 1731,4, 1695,6, 1695,7, 1434,4, 1321,8, 1198,9, 1122, 1, 1065,7 cm<-1>; <X>H NMR (400MHz, d6-DMSO) 5 1,06-1,15 (6H, m), 2,42 (1H, m) , 2,50-3,01 (2H, m), 4,29-4,83 (1,6H, m), 5,08-5,42 (2,4H, m), 7,53 (1H, m) , 7,68 (1H, m), 7,83 (1H, m), 8,29-8,40 (2H, m) , 8,48 (1H, m), 8,64 (1H, m) , 8,80-9,01 (1H, m) , 12,60 (1H, brs); <13>C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 17,4, 17, 6, 19, 0, 19, 1, 30, 4, 31,0, 32,9, 34,5, 34,7, 52,0, 52,3, 80,7, 80,9, 81,1, 81,1, 83,4, 85,1, 113,3, 116,3, 120,7, 120,9, 123,6, 124,4, 126,2, 127,2, 127,5, 127,8, 128,1, 128,9, 137,2, 138,9, 151,6, 168,6, 169,0, 172,0, 202,2, 202,3, 202,4, 202,6; 19F NMR (376MHz, de-DMSO) -60,4 (s), -226, 6 (t) , -226,8 (t), -229, 9 (t) , -230,4 (t), -231,0 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 511 (M+H).

Eksempel 7

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[ (S)-3-metyl-2- (2-metylkarbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (90 % siste trinn): IR (fast) 1726,3, 1700,7, 1664,9, 1552,2, 1460,0, 1552,2, 1460,0, 1367,9, 1332,0, 1209,1, 1193,7, 1040,1 cm"1; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,01-1,19 (6H, m) , 2,30-3,00 (6H, m) , 4,29-4,85 (1,5H, m), 5,11-5,52 (2,5H, m), 7,29 (1H, m), 7,45 (1H, m) , 7,55 (1H, m) , 8,05-8,18 (3H, m) , 8,27

(1H, m), 8,50-9,10 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); 13C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 17,7, 18,0, 19,0, 19,1, 19,2, 22,2, 30,4, 30,5, 30,6, 30,6, 33,0, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 52,7, 80,3, 80,6, 80,7, 80,8, 83,2. 83,4, 83,5, 85,2, 85,2, 103,8, 104,0, 116,2, 116,3, 116,6, 120,3, 120,4, 123,4, 124,0, 125,2, 125,8, 127,3, 137,5, 137,9, 138,2, 151,7, 151,9, 151,9, 168,8, 169,0, 169,2, 169,2, 172,0, 172,1, 173,1, 173,2, 202, 3, 202, 4, 202, 5, 202, 6; 19F NMR (376MHz, de-DMSO) -226,55 (t), -226,76 (t), -230,43 (t), -230,89 (t), -232,84 (t), -232,97 (t).

Eksempel 8

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-2-(karbazol-karbamoyloksy) -butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Klorformiatet ble fremstilt fra (S)-2-hydroksysmørsyre, tert-butylester som beskrevet i metode A. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (90 % siste trinn): IR (fast) 1716,1, 1654,6, 1449,8, 1372,9, 1326,9, 1204,0, 1050,4, 1029,9 cm"l; 1H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,03-1,12 (3H, m) , 1,96-2,15 (2H, m), 2,50-3,01 (2H, m) , 4,31-4,82 (1,8H, m) , 5,11-5,43 (2,2H, m), 7,45 (2H, m), 7,59 (2H, m), 8,18-8,32 (4H, m) , 8. 58-9,05 (1H, brm), 12,60 (1H, brs); 13C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 9, 8, 9, 9, 9, 94, 24, 9, 25, 1, 25,2, 33,0, 34,6, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3,77,1, 77,3, 77,4, 77,45, 83,4, 83,5, 85,2, 85,22, 116,3, 120,6, 124,0, 125,7, 127,9, 137,9, 151,5, 151,7, 169,5, 169,8, 172,0, 172, 1, 173, 1, 202, 3, 202, 4, 202, 5, 202, 6; <19>F NMR (376MHz, de-DMSO) -226,6 (t), -226,8 (t), -230,4 (t), - 231,0 (t), - 232,9 (t), -233,0 (t).

Eksempel 9

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3,3-dimetyl-2-(karbazol-karbamoyloksy) -butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Klorformiatet ble fremstilt fra (S)-2-hydroksy-3, 3-dimetylsmørsyre, tert-butylester (for fremstillingsmetode se Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) som beskrevet i metode A. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (94 % siste trinn): IR (fast) 1782,7, 1721,2, 1526,6, 1444,7, 1373,0, 1332,0, 1301,3, 1198,9, 1117, 0, 1040, 1, 753, 3 cm"<1>;

1H NMR (400MHz, d6-DMSO) 5 1,15 (9H, s), 2, 50-2, 98 (2H, M) , 4,29-4,88 (1,5H, m) , 4,97-5,45 (2,5H, m), 7,45 (2H, m), 7,59 (2H, m) , 8,23 (2H, m), 8,33 (2H, m) , 8,50-8,97 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 5 27,3, 33,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8, 35,1, 52,5, 52,9, 83,5, 83,9, 84,0, 84,1, 84,3, 85,7, 85,73, 116,7, 116,8, 121,2, 124,6, 124,64, 126,2, 128,4, 138,4, 152,2, 152,4, 152,5, 168,4, 168,7, 168,8, 168,9, 172,6, 172, 65, 173, 6, 202, 6, 202, 8, 202, 9, 203, 0; 19F NMR (376MHz, de-DMSO) -226,5 (t), -226, 6 (t) , -230, 9 (t), - 231,5 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 457

(M+H) .

Eksempel 10

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-2-(2-klorkarbazol-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Klorformiatet ble fremstilt fra (S)-2-hydroksysmørsyre, tert-butylester som beskrevet i metode A. 2-Klorkarbazol ble fremstilt som beskrevet i metodene F-G. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (77 % siste trinn): IR (fast) 1733,08, 1699,89, 1662,97, 1448,18, 1423,38, 1369,84, 1332,48, 1215,16, 1199,62, 1052,26, 1033,17, 764,57, 747,53, 720,08, 651,85 cm"<1>; 1H NMR (400MHz, de-DMSO) 5 1,06-1,10 (3H, m) , 2,01-2,09 (2H, m) , 2,53-2, 98 (2H, m) , 4,34-4,78 (1, 6H, m) , 5,14-5,39 (2,4H, m), 7,45-7,61 (3H, m), 8,24-8,31 (4H, m) , 8,63-8,99 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); 13c NMR (lOOMHz, d6-DMSO) 8 9,7, 23,7, 25,0, 31,3, 34,6, 34,8, 52,0, 52,3, 77,4, 77,6, 83,4, 85,2, 110, 9, 111,6, 116,2, 116,3, 119,0, 119,4, 120,7, 120,9, 121,9, 122,1, 124,2, 124,3, 124,6, 124,8, 126,3, 128,3, 130,2, 132,0, 138,1, 138,4, 151,3, 169,6, 172,1; <19>F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226, 60 (t) , -226,83 (t), -230,34 (t), -231,88 (t), -232,84 (t), -232,99 (t) .

Eksempel 11

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[ (S) -3-metyl-2 (indol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene A-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (92 % siste trinn): IR (fast) 1731,4, 1664,9, 1536,8, 1454,9, 1393,5, 1326,9, 1239,8, 1035,0 cm"<1>; 1H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 1,30-1. 62 (6H, m), 2,79 (1H, m) , 3,00-3,48 (2H, m), 4,77-5,04 (1,6H, m), 5,42-5,88 (2,4H, m) , 7,29 (1H, m) , 7,70-7,90 (2H, m), 8,10-8,31 (2H, m) , 8,51-8,63 (1H, m) , 8,91-9,45 (1H, m), 13,0 (1H, brs); <19>C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 15,5, 17,3' 17, 6, 18, 9, 19,2, 30, 6, 32,9, 34,5, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 65,3, 80,0, 80,3, 80,5, 83,4, 83,41, 85,1, 85,2, 104,02, 108,7, 108,71, 108,8, 114,9, 122,0, 123,5, 125,0, 126,3, 130,5, 135,0, 150,4, 168,8, 169,0, 169,1, 169,14, 172,0, 172,1, 173,1, 202,2, 202,4, 202,5, 202,6; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226,1 (t) , -226,3 (t), -230,0 (t), -230,5 (t), - 232,3 (t), -232,4 (t), -232,5 (t), - 232,6 (t); MS (ESI +ve) 3 9 3 (M+H). Eksempel 12 [3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[ (S)-3-metyl-2-(fonotiazin) - karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Metode H: (S)-3-metyl-2-(fonotiazin)-karbamoyloksy-smørsyre, tert-butylester

Til en omrørt løsning av (S)-2-hydroksy-3-metylsmørsyre-tert-butylester (for fremstillingsmetode se Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) (300mg) i THF (5 ml) ved 0°C ble tilsatt natriumhydrid (60 % suspensjon i mineralolje, 72mg). Den resulterende blanding ble omrørt i 30 minutter deretter ble fenotiazin-10-karbonylklorid (450mg) tilsatt, og blandingen fikk oppvarmes til omgivelsestemperatur i løpet av 12 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med etylacetat (15 ml) og vann (3 ml). Den organiske fase ble separert, og den vandige fase ble ekstrahert med 2x5 ml etylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter ble deretter vasket med saltoppløsning (5 ml), tørket (magnesiumsulfat), filtrert og konsentrert. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (0-10 % etylacetat/heksan) for å tilveiebringe

undertittel forbindelsen som en fargeløs olje (528mg) :

<1>H NMR (400MHz, CDC13) 5 0,75-0, 96 (6H,m), 1,58 (9H, s) , 2,20 (1H, m), 4,86 (1H, d), 7,12-7,45 (6H, m), 7,70 (2H, m) . ( S)- 3- metyl- 2-( fonotiazin)- karbamoyloksy- smørsyre

Avbeskyttelse av (S)-3-metyl-2-(fonotiazin)-karbamoyloksy-smørsyre, tert-butylester (528mg) under anvendelse av tri f luoreddiksyre som beskrevet i metode C gav syren som et hvitt fast stoff (440 mg): <1>E NMR (400MHz, CDCI3) 5 0,77-1,00 (6H, m), 2,29 (1H, m), 5,02 (1H, d), 7,15-7,48 (6H, m), 7,70 (2H, m) .

Eksempel 12

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(fonotiazin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene C-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (98 % siste trinn): IR (fast) 1782,7, 1710,9, 1521,5, 1465,2, 1260,3, 1219,4, 1168,1, 1045,2, 758,5 cm"<1>; <X>H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 0,64-0,87 (6H, m), 1,96-2,16 (1H, m), 2,40-2,98 (2H, m) , 4, 50-5, 42 (4H, m) , 7,28 (2H, m) , 7,39 (2H, m), 7,49 (2H, m), 7,68 (2H, brm), 7,88-8,91 (1H, brm), 12,61 (1H, brs);13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 16,8, 17,1, 19,0, 19,2, 30,3, 30,5, 33,0, 33,2, 34,5, 34,8, 47,3, 52,0, 52,4, 79,3, 79,6, 79,7, 83,4, 83,5, 85,1, 85,2, 103,8, 127,1, 127,2, 127,3, 127,4, 131,4, 138,0, 138,1, 152,6, 152,8, 158,82, 169,3, 169,5, 169,7, 172,0, 172,1, 172,13, 202,3, 202,4, 202,6, 202, 8; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226, 6 (t), -226, 8 (t),

-230,3 (t), -231,3 (t), -232,9 (t), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 475 (M+H)

Eksempel 13

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(2-klorfonotiazin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Metode I:

2-klorfenotiazinkarbamylklorid

Til en suspensjon av 2-klorfenotiazin (2g) i xylen (20 ml) ble tilsatt difosgen (3,4g) . Blandingen ble oppvarmet til 140 °C i 18 timer. Blandingen ble deretter avkjølt, og xylenet ble fjernet under redusert trykk. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (2-5 % etylacetat/heksan) for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som et brunt fast stoff (2,04g): <X>H NMR (400MHz,CDC13) 5 7,26-7, 43 (4H, m) , 7,45-7,51 (1H, m) , 7, 59-7, 68 (2H, m) .

Eksempel 13

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2- (2-klorfonotiazin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H og C-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff ved revers f ase-HPLC (61 % siste trinn) : IR (fast) 17 32, 1460, 1365, 1207 cm"<1>; 1H NMR (4 0 OMH z, d6-DMSO) 8 0, 70-0, 87 (6H, m) , 2,02-2,10 (1H, m) , 2,58-2,90 (2H, m) , 4, 34-5,37 (4H, m) , 7,27-7,88 (7H, m) , 8,31-8,81 (1H, m) ; <13>C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 16, 7/16, 9, 18, 9/19, 1, 30, 3/30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,6/80,0, 84,2/84,3, 127,0, 127,3, 127,3, 127,6, 128,0, 129,0, 130,5, 130,9, 131,7,

137,5/137,5, 139,1/139,1, 152,3/152,5, 169,6/169,7, 172,0/172,1, 202,3/202,7 (2d, J 14,1/14,0; <19>F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226, 6 (t) , -226, 8 (t), -233,0 (t) , - 233,1 (t).

Eksempel 14

[3S/R] -5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(3-klorfonot-iazin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H, I og C-E. Fenotiazinet ble fremstilt i henhold til prosedyrer beskrevet i J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (89 % siste trinn): IR (fast) 1717, 1527, 1469, 1350, 1322, 1217, 1042 cm" 1; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 5 0, 67-0, 85 (6H, m) , 2,00-2,06 (1H, m), 2,58-2, 87 (2H, m) , 4, 33-4,86 (2, 6H, m), 5,12-5,36 (1,4H, m), 7,27-7,30 (1H, m), 7,38-7,51 (3H, m) , 7, 63-7, 68 (3H, m) , 8, 24-8, 82 (1H, m); 13C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 17,3/17,6 (CH3) , 19,4/19,5 (CH3) , 30,8/30,8, 35,0/35,3, 52,5/52,9, 80,0/80,1, 84,7/84,8, 127,2, 127,3, 127,6, 127,9, 128,6, 130,7, 131,2, 133,7, 136,9/137,0, 137,8/137,8, 153,0/153,2, 170,1/170,2, 172, 5/172, 6, 202, 9/203,2; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) - 226,7 (br), -226,9 (br), -233,0 (t); MS (ESI +ve) 509/511 (M+H).

Eksempel 15

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(3,7-diklor-fonotiazin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H, I og C-E. Fenotiazinet ble fremstilt i henhold til prosedyrer beskrevet i J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff ved reversfase-HPLC (76 % siste trinn): IR (fast) 1793, 1721, 1521, 1465, 1317, 1214, 1086, 1044 cm"<1>; 1H NMR (400MHz, de-DMSO) (5 0,71-0,76 (3H, m) , 0,84-0,88 (3H, m), 2,05-2,12 (1H, m) , 2,58-2,92 (2H, m) , 4,31-4,87 (2,5H, m), 5,09-5,36 (1,5H, m) , 7,47-7,56 (2H, m) , 7,67-7,71 (2H, m) , 7,72-7,81 (1H, m) , 8, 39-8, 87 (1H, m) ; <13>C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 16,7/16,7/17,0,

19,0/19,1/19,2/19,3, 30,3/30,3/30,4, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,8/80,1, 84,2/84,3, 127,3, 127,4, 127,7, 128,5, 129,2, 129,7, 131,4/131,4, 132,0, 133,1/133,2, 136,4/136,5, 138,8/138,9, 152,2/152,3, 169,5/169,6, 172, 0/172, 1, 202, 4/202,5; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) - 226, 5 (br), -226, 8 (t) , -232, 9 (t) , -233, 0 (br).

Eksempel 16

[3S/R] -5-fluor-4-okso-3- [ (S) -3-metyl-2-(3,4-diklorf onotia-zin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H, I og C-E. Fenotiazinet ble fremstilt i henhold til prosedyrer beskrevet i J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff ved reversfase-HPLC (58 % siste trinn) : IR (fast) 1736, 1436, 1365, 1222, 1050 cm"<1>; <X>H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 0, 66-0, 85 (6H, m) , 2,00-2,08 (1H, m) , 2,57-2, 93 (2H, m) , 4,30-5,35 (4H, m) , 7,31-7,71 (6H, m) , 8,27-8, 83 (1H, m) ; 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 16,8/17,1, 19,0/19,1, 30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,7/80,0, 84,2/84,3, 179,2/178,6, 127,1, 127,3, 127,5, 128,2, 128,5, 128,5, 129,6, 130,0, 133,7, 137,3/137,3, 137,6/137,6, 152,5, 169, 5/169,5, 172, 0/172, 1, 202,3; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226, 6 (t), -226,8 (t) , -232, 9 (t).

Eksempel 17

[3S/R]N-5-fluor-4-okso-3- [ (S) -3-metyl-2- (9,10-dihydrofenantridin)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H, I og C-

E. 9, 10-dihydrofenantridin ble fremstilt som beskrevet i J. Chem. Soc. (1951), 3207-3211. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff ved reversfase-HPLC (56 % siste trinn): IR (fast) 1732, 1365, 1226, 1212, 1203 cm"<1>; 1H NMR (400MHz, de-DMSO) 5 0,84 (6H, m) , 2,05 (1H, m) , 2,55-2,90 (2H, m), 4,28-5,36 (6H, m) , 7,26-7,43 (5H, m) , 7,75-7,77 (1H, m), 7,89-7,91 (2H, m) , 8,24-8,81 (1H, m) ; <13>C NMR (100MHz, de-DMSO) 8 17,1/17,4, 18,9/19,0, 30,3/30,4, 34,4/34,8, 46,9, 51,9/52,4, 79,0/79,4, 84,2/84,3, 123,8, 124,3, 125,1, 125,7, 126,2, 128,0, 128,2, 128,3, 128,5, 131,5, 134,1, 136,9, 153,1, 170,0/170,1, 172,0/172,1, 202,4/202,8; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226,7 (br), -226,9 (br), -233,1 (t); MS (ESI -ve) 455 (M-H).

Eksempel 18

Dibenzo[b,f]azepin-5-karboksylsyre 1-(1-karboksymetyl-3-fluor-2-okso-propylkarbamoyl)-2-metyl-propylester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H, I og C-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (100 % siste trinn): IR (fast) 1791,2, 1714,9, 1683,4, 1525,6, 1492,6, 1370,1, 1325,6, 1229,3, 1212,5, 1053,4, 1032,7, 798,4 cm"1; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 0, 50 +0, 68 (6H, 2 x m) , 1,90 (1H, m) , 2,54-2,93 (2H, m) , 4,20-5,44 (4H, m), 7,02 (2H, s), 7,30-7, 80 (8H, m) ; 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 18,73, 19,17, 30,34, 34,56, 52,18, 84,37, 127,92, 128,61, 128,69, 129,63, 130,83, 134,40, 153,90, 169,64, 172,23,-202,29, 202, 43, 202, 63 202,76; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226,83 (t), -226,87 (t), -232,93 (t), -233,07 (t), - 233,10 (t), -233,32 (t); MS (ESI +ve) 469(M+H). Eksempel 19 10,11-dihydro-dibenzo[b,f]azepin-5-karboksylsyre 1-(1-karboksymetyl-3-fluor-2-okso-propylkarbamoyl)-2-metyl-propylester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene H, I og C-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (100 % siste trinn): IR (fast) 1796,9, 1683,9, 1521,8, 1491,5, 1368,3, 1324,8, 1278,6, 1213,4, 1201,9, 1108,0, 1056,4, 931,1, 776,5, 746,7 cm<-1>; <X>H NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 0, 50-0,95 (6H, m) , 1,90 (1H, m) , 2, 55-3, 00 (2H, m) , 4,20-5,30 (8H, m) , 7,10-7,50 (8H, m) ; 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 15,24, 16,79, 39,44, 52,43, 78,36, 84,34, 126,80, 1227,89, 128,43, 130,29, 136,29, 154,09, 169,58, 170, 03, 172, 19, 173, 12, 202,28, 202, 42; 19F NMR (376MHz, de-DMSO) -226,76 (t), -233,01 (t), -233,11 (t), -233,38 (t); MS (ESI +ve) 471 (M+H).

Eksempel 20

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-((S)-2, 3-dihydroindol-l-karbamoyloksy-3-metyl-butyrylamino)-pentansyre

Metode J: (S)-2-(imidazolkarbamoyloksy)-3-metylsmørsyre, benzylester

Til en omrørt løsning av (S)-2-hydroksy-3-metylsmørsyre-benzylester (for fremstilling se J. Med. Chem., (1996), 39, 982, l,5g) i THF (20 ml) ble tilsatt karbonyldiimidazol (l,17g), og den resulterende blanding omrørt ved romtemperatur i 12h. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk, og resten ble oppløst på nytt i etylacetat (30 ml). Løsningen ble vasket med 1 % fosforsyre (2x 10 ml, deretter saltoppløsning (10 ml), tørket (magnesiumsulfat), filtrert og konsentrert for å tilveiebringe undertittel forbindelsen som en fargeløs olje (l,89g): <1>H NMR (400MHz, CDC13) 5 1,02 (3H, d) , 1,11 (3H, d) , 2,47 (1H, m), 5,15 (1H, d), 5,18-5,32 (2H, m) , 7,11 (1H, s), 7,18-7,60 (6H, m) , 8,20 (1H, m).

Metode K: (S)-(2,3-dihydroindol-l-karbamoyloksy)-3-metylsmørsyre, benzylester

Til en omrørt løsning av (S)-2-(imidazolkarbamoyloksy)-3-metylsmørsyre-benzylester (355 mg) i THF (7 ml) ved 0°C ble tilsatt metyltri f luormetansul f onat (0,13 ml). Den resulterende løsning ble omrørt i 30min. Indolin (280 mg) ble deretter tilsatt og blandingen fikk oppvarmes til romtemperatur i løpet av 12 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk, og resten ble oppløst på nytt i etylacetat (30 ml). Løsningen ble vasket med mettet natriumbikarbonat løsning (5ml) deretter LM saltsyre (2x5 ml), deretter saltoppløsning (5 ml), tørket (magnesiumsulfat), filtrert og konsentrert. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (5-7 % etylacetat/hek-san) for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som en fargeløs olje (342mg) : <X>H NMR (400MHz, CDC13) 5 0-86-1, 18 (6H, m), 2,35 (1H, m), 3,08-3,25 (2H, m) , 4,05-4,25 (2H, m) , 4, 95-5, 32 (3H, m) , 6,95-7,91 (9H, m) .

Metode L:

(S)-(2, 3-dihydroindol-l-karbamoyloksy)-3-metylsmørsyre

En omrørt løsning av (S)-(2,3-dihydroindol-l-karbamoyloksy ) -3-metylsmørsyre, benzylester (342 mg) i metanol (25 ml) ble tilsatt 10 % palladium på karbon (80 mg) . Blandingen ble hydrogenated ved romtemperatur i 2 timer. Blandingen ble deretter filtrert gjennom celitt, og filtratet ble konsentrert for å tilveiebringe undertittelforbindelsen som en fargeløs olje (255 mg): <X>H NMR (4 00MHz, CDC13) 5 0, 95-1,21 (6H, m) , 2,40 (1H, m) , 3,20 (2H, m) , 4,01-4,25 (2H, m) , 4,95-5,15 (1H, m) , 6,97-7, 99 (4H, m) .

Eksempel 20

[3S/R] -5-fluor-4-okso-3-((S)-2,3-dihydroindol-l-karbamoyloksy-3-me tyl-bu tyr yl amino) -pentansyre

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metodene C-E. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (94 % siste trinn): IR (fast) 1680,2, 1485,6, 1413,9, 1137,4, 1050,4, 758, 5 cm"<1>; XH NMR (400MHz, d6-DMSO) 8 0, 95 (6H, brm), 2,17 (1H, brm), 2, 50-2,94 (2H, m) , 3,12 (2H, brm), 3,84-4,23 (2H, brm), 4,27-5, 39 (4H, m) , 6,98 (1H, m) , 7,22 (2H, m) , 7,67 (1H, brm), 7, 78-8, 30 (1H, brm), 12,50 (1H, brs); 13C NMR (100MHz, d6-DMSO) 8 17,2, 19,0, 19,2, 27,3, 30, 4, 30, 6, 32, 9, 34, 5, 34,6, 47,3, 47,35, 52,0, 52,2, 78,3, 83,4, 85,1, 104,0, 114,2, 123,0, 125,4, 127,5, 131,7, 170,0, 172,07, 172,1, 173,2, 173,25, 202,3, 202,5, 202, 6; 19F NMR (376MHz, d6-DMSO) -226,7 (t), -226, 8 (t), -233,1 (t), -233,3 (t); MS (ESI +ve) 395(M+H). Eksempel 21 [3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, dietylamid

Metode M:

Til en omrørt løsning av syre (Eksempel 1; fremstilt som beskrevet i metodene A-E) (100 mg) i THF (2 ml) ved 0 °C ble tilsatt dietylamin (16 mg) i THF (0,5 ml), etterfulgt av 1-(3-dimetylaminopropyl) -3- (etylkarbodiimidhydroklorid, EDC) (48 mg). Blandingen ble deretter oppvarmet til romtemperatur i løpet av 12 timer. Løsningsmiddel ble fjernet under redusert trykk, og resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (50-60% etylacetat/heksan) for å tilveiebringe amidet som et hvitt fast stoff (54 mg) ;

<X>H NMR (400MHz, CDC13) 8 0, 69-1,38 (12H, m) , 2,42-3,37 (7H, m) , 4,85-4,92 (1H, m) , 5,01-5,55 (3H, m) , 7,31-7,70 (5H, m) , 7,90-8,05 (2H, m) , 8,25-8, 42 (2H, m) ; 19F NMR (376MHz, CDC13) -232, 6 (t), -232, 8 (t) ; MS (ESI +ve) 498 (M+H)

Eksempel 2 2

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[ (S)-3-metyl-2- (karbazol) - karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, etylamid

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (62 %) : <X>H NMR (400MHz, CDCI3) 5 0, 96-1, 31 (9H, m) , 2,21-2,45 (1H, m) , 2,48-2,80 (2H, m) , 3,15-3,48 (2H, m) , 4,23-4,76 (3H, m), 5,05-5,42 (1H, m), 6,42-6,84 (1H, m) , 7,38-7, 60 (4H, m) , 7,95-8,09 (2H, m) , 8,20-8,41 (2H, m) ; <19>F NMR (376MHz, CDCI3) -223, 8 (t) , -224, 5 (t) , -226, 5 (t), -227,1 (t), -231,9 (t), -232 (t); MS (ESI +ve) 452 (M+H20) . Eksempel 23 [3S/R] -5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, piperazinamid

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (78 %) : <X>H NMR

(400MHz, CDCI3) 5 1,10-1,35 (6H, m) , 1,80-3,55 (14H, m) , 4,82-4,98 (1H, m) , 5,00-5,45 (3H, m) , 7,38-7, 60 (5H, m) ,

7,95-8,08 (2H, m) , 8,27-8,45 (2H, m) ; 19F NMR (376MHz, CDCI3) -232, 5 (t), -232,7 (t) ; MS (ESI +ve) 525 (M+H).

Eksempel 24

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, N, N-dimetylamino-etylamid

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (49 %) : <X>H NMR (400MHz, CDCI3) 5 1,14-1,31 (6H, m) , 1,88-3,04 (13H, m) , 3,88-4,41 (3H, m) , 4,57-4,74 (1H, m) , 5,33-5,61 (1H, m) , 6,86-7,12 (1H, m), 7,33-7,56 (4H, m) , 8,01-8,05 (2H, m) , 8,27-8,41 (2H, m) ; 19F NMR (376MHz, CDC13) -222,4 (t),

-222,5 (t); MS (ESI +ve) 513 (M+H).

Eksempel 25

[3S/R] -5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentanoamid

Metode N:

Til en omrørt løsning av [3S/R]-5-fluor-4-okso- 3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre fra Eksempel 1 (150 mg) i diklormetan (1,5 ml) og dimetylformamid (0,075 ml) ble tilsatt karbonyldiimidazol

(66 mg). Blandingen ble omrørt i 2 timer, deretter avkjølt til 0 °C mens ammoniakk ble boblet igjennom. Blandingen ble fortynnet med etylacetat/10 %

kaliumhydrogensulfatløsning. Den organiske fase ble fjernet, og den vandige fase ble ekstrahert med etylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket i løpet av magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert. Resten ble renset ved hjelp av flashkromatografi (5 % metanol/diklormetan) for å tilveiebringe amidet som et

hvitt fast stoff (80 mg); <X>H NMR (400MHz,CDC13) 1,10-1,28 (6H, m), 2,12-2,75 (3H, m) , 4,10-4,85(4H, m) , 5,29 (1H, m) , 6,36,6,55, 6,78, 6,98 (1H, 4 x s) , 7,17 (1H, m) , 7,42 (2H, m), 7,50 (2H, m), 7,99 (2H, m) , 8,2 9 (2H, m) ; <19>F NMR (376MHz,CDC13) -225, 47 (t) , - 226,00 (t) , -227,33 (t) , - 227,50 (t), -228,43 (t) ; MS (ESI +ve) 424 (M-H20+H) .

Eksempel 2 6

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, cykloheksylester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (37 %) : XH NMR (400MHz, CDCI3) 8 0,90-1, 80 (16H, m) , 2,59 (1H, m) , 2,75-3,15 (2H, m) , 4,40 (0,5H, m) , 4,64 (0,5H, m) , 4, 95-5, 45 (4H, m) , 7,25 (1H, m), 7,42 (2H, m), 7,52 (2H, m) , 8. 05 (2H, m), 8. 36 (2H, m) ; 1<9>F NMR (376 MHz, CDC13) -231, 95 (t), - 232,08 (t) .

Eksempel 27

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, n-propylester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (82 %) : XH NMR (400MHz, CDCI3) 5 0, 80 (3H, m) , 1,13-1,36 (6H, m) , 1,42 (1H, m) , 1,58 (1H, m) , 2,60 (1H, m) , 2,80-3,08 (2H, m), 3,70 (1H, m) , 3,98 (1H, m) , 4,92-5,50 (4H, m) , 7,21 (1H, m), 7,40 (2H,

m), 7,50 (2H, m), 8,00 (2H,m), 8,32 (2H, m) ; <19>F NMR (376 MHz, CDCI3) -232,00 (t), -232,01 (t); MS (ESI +ve) 485

(M+H).

Eksempel 2 8

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, isopropylester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i Metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (7 %) : XH NMR (400MHz, CDCI3) 5 0, 90-1, 33 (12H, m) , 2,55 (1H, m) , 2,78-3,15 (2H, m) , 4,80-5,50 (5H, m) , 7,25 (1H, br s) , 7,43 (2H, m), 7,55 (2H, m), 8,05 (2H, m) , 8,36 (2H, m) ; 19F NMR (376 MHz CDCI3) -232. 00 (t), -232, 03 (t).

Eksempel 29

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, metylester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode M. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (81 %) : 5 <X>H NMR (400 MHz CDC13) 1,20 (6H, m ), 2,58 (1H, m) , 2,80-3,05 (2H, m) , 3,42, 3,61 (3H, 2 x s), 4,98-5,26 (3H, m), 5,41 (1H, m) , 7,20 (1H, br s), 7,45 (2H, m), 7,55 (2H, m), 8,04 (2H, m), 8,35 (2H, m); <19>F NMR (376 MHz CDC13) -231,99 (t), -232,00 (t) ; MS (ESI +ve) 457 (M+H).

Eksempel 30

[3S/R]-5-fluor-4-okso-3-[(S)-3-metyl-2-(karbazol)-karbamoyloksy-butyrylamino]-pentansyre, kolesterolester

Denne forbindelse ble fremstilt under anvendelse av lignende prosedyrer som beskrevet i metode N, under anvendelse av karbonyldiimidazol som koblingsreagens. Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (12 %) ^H NMR (400MHz, CDCI3) 5 0, 65-2,35 (47H, m) , 2,58 (1H, m) , 2,75-3,15 (2H, m), 4,25 (0,5H, m), 4,48 (0,5H, m), 4,97-5,46 (5H, m) , 7,30 (1H, m) , 7,44 (2H, m) , 7,58 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,33 (1H, m) ; 19F NMR (376 MHz CDC13) -231,91 (t), - 232,03 (t). Det tilsvarende ketal ble også isolert som et hvitt fast stoff (21 %) : <X>H NMR (400 MHz CDC13) 5 0,65-2,10 (48H, m), 2,35-3,15 (2H, 3xm), 3,42-3,69 (1H, m) , 4,10-4,96 (4H, m) , 5,15-5,65 (2H, m) , 6,78 (1H, m), 7,45 (2H, m), 7,57 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,34 (2H, m) ; 19F NMR (376 MHz CDC13) -230, 57 (t) , -230, 67 (t) .

Testmetoder

Enzymanalyse

Undersøkelsene med hensyn til kaspaseinhibisjon er basert på spaltning av et fluorogent substrat ved hjelp av de rekombinante, rensede humane Kaspaser -1, -3, -7 eller -8. Undersøkelsene utføres i hovedsakelig på samme måte som rapportert av Garcia-Calvo et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998), 32 608-32 613), under anvendelse av et substrat som er spesifikt for hvert enzym. Substratet for Kaspase-1 er Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-metyl kumarin. Substratet for Kaspasene -3, -7 og -8 er Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metylkumarin.

Den observerte hastighet for enzyminaktiveringen ved en spesiell inhibi torkonsentras j on, kQbS/ databehandles ved direkte tilpasninger av dataene til ligningen avledet av Thornberry et al.

(Biochemistry 33 (1994), 3943-3939) under anvendelse av en ikke-lineær minste kvadraters metode i et dataprogram (PRISM 2,0; GraphPad programvare). For å oppnå hastighetskonstanten av annen orden, klnact, fremstilles k0bS-verdien grafisk mot sine respektive inhibi torkonsentras j oner, og klnact-verdiene beregnes deretter ved datastyrt lineær regresjon. Mange av foreliggende forbindelser som ble testet hadde mot kaspase-1, klnact-verdier mellom 25000 og 1500000M_1s_<1>; mot kaspase-3, kinact-verdier

mellom 9000 og 1500000 M 1s 1; mot kaspase-8, kinact-verdier mellom 10000 og 700000 M_1s_1.

Inhibisjon av IL- ip- sekresjon fra en blandet populasjon av perifere mononukleære blodceller ( PBMC)

Prosessgangen for pre-IL-ip ved kaspase-1 kan måles i en cellekultur under anvendelse av mange forskjellige cellematerialer. Human PBMC oppnådd fra friske donorer tilveiebringer en blandet populasjon av 1ymfocyttiske og mononukleære celler som frembringer et spektrum av interleukiner og cytokiner som svar på mange klasser av fysiologiske stimulatorer.

Eksperimentell prosedyre

Test forbindelsen oppløses i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma #D-2650) for å tilveiebringe en 100 mM stamløsning. Denne fortynnes i komplett medium bestående av RPMI inneholdende 10 % varmeinaktivert FCS (Gibco BRL #10099-141), 2mM L-glutamin (Sigma, #G-7513), 100U penicillin og 100 ug/ml streptomycin (Sigma #P-7539). Sluttkonsentrasjonen av testforbindelse er fra 100 uM ned til 6 nM i løpet av åtte fortynningstrinn. Den høyeste konsentrasjon av testforbindelsen er ekvivalent med 0,1 % DMSO i analysen.

Human-PBMC isoleres fra gulhvite hinner oppnådd fra blodbanken under anvendelse av sentrifugering på Ficoll-Paque leukocyttisk separasjonsmedium (Amersham, #17-1440-02), og celleanalysen utføres i en steril 9 6-brønners flatbunnet plate (Nunc) . Hver brønn inneholder 100 \ il av cellesuspensjonen, 1 x IO<5> celler, 50 ul forbindelsefortynninger og 50 ul av LPS (Sigma #L-3012) ved 50 ng/ml sluttkonsentrasjon. Kontrollene består av celler +/-LPS-stimulasjon og en seriefortynning av DMSO fortynnet på samme måte som forbindelsen. Platene inkuberes i 16-18h ved 37 °C i 5 % C02 & 95 % fuktighetsatmosfære.

Etter 16-18 h høstes supernatantene etter å ha sentrifugert platene ved 100 x g ved 18 °C i 15 min og analyseres med hensyn til deres IL-ip-innhold. Måling av modent IL-ip i supernatanten utføres under anvendelse av "Quantikine kits" (R&D Systemer) i henhold til fabrikantens instruksjoner. Nivået av modent IL-ip på omkring 600-1500 pg/ml iakttas for PBMC i positive kontrollbrønner.

Inhibitorisk potens hos forbindelsene kan representeres ved en ICso-verdi, som er konsentrasjonen av inhibitor ved hvilken 50 % av det modne IL-ip påvises i supernatanten sammenlignet med de positive kontroller. Tabell 5 viser inhibisjonen av IL-ip-sekresjon fra perifere mononukleære blodceller for valgte forbindelser ifølge denne oppfinnelse bestemt ved hjelp av ovennevnte metoder.

Valgte forbindelser er blitt testet i denne analyse og har vist seg å inhibere IL-ip-frigivelse med IC50-verdier mellom 0,04uM og 20uM.

Anti- Fas- indusert apoptoseanalyse

Celleapoptose kan induseres ved binding av en Fas-ligand (Fasl) til dens reseptor, CD95 (Fas). CD95 er en reseptor av en familie av relaterte reseptorer, kjent som dødsreseptorer, som kan utløse apoptose i celler via aktivering av kaspaseenzymkaskaden. Prosessen initieres ved binding av adaptermolekylet FADD/MORT-1 til det cytoplasmiske domene i CD-95-reseptor-ligandkomplekset. Kaspase-8 binder deretter FADD og blir aktivert, under initiering av en kaskade av foreteelser som medfører aktivering av nedstrømskaspaser og påfølgende celleapoptose. Apoptose kan også induseres i celler som uttrykker CD95 eg Jurkat E6.1 T-cellelymfom cellelinje, under anvendelse av et antistoff, snarere enn FasL, for å fornette celleoverflatisk CD95. Anti-Fas-indusert apoptose utløses også via aktivering av kaspase-8. Dette tilveiebringer grunnlaget for en cellebasert analyse for å skille ut forbindelser for inhibisjon av den kaspase-8-medierte apoptotiske reaksjonsvei.

Eksperimentell prosedyre

Jurkat E6.1 celler dyrkes i komplett medium bestående av RPMI-1640 (Sigma No) + 10 % føtalt kalveserum (Gibco BRL No. 10099-141) + 2mM L-glutamin (Sigma No. G-7513) . Cellene høstes i log-fasen for veksten. 100 ml celler ved 5-8xl0<5 >celler/ml overføres til sterile 50ml Falcon sentrifugerør og sentrifugeres i 5 minutter ved 100xg ved romtemperatur. Supernatanten fjernes, og de kombinerte cellepellets suspenderes på nytt i 25ml komplett medium. Cellene telles og tettheten justeres til 2xl0<6>celler/ml med komplett medium.

Testforbindelsen oppløses i dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma No. D-2650) for å tilveiebringe en lOOmM stamløsning. Denne fortynnes til 4 00pM i komplett medium, fortynnes deretter serielt i en 96 brønners plate før tilsetningen til celleanalyseplaten.

100^1 av cellesuspensjonen (2xl0<6> celler) tilsettes til hver brønn i en steril 96 brønners rundbunnet multiplate (Costar No. 3790). 50ul av forbindelsesløsningen ved passende fortynning og 50ul_ anti-Fas-antistoff, klon CH-11 (Kamiya No.MC-060) ved en sluttkonsentrasjon på lOng/ml tilsettes til brønnene. Kontrollbrønner settes opp minus antistoff og minus forbindelse, men med en seriefortynning av DMSO som vehikkelkontroll. Platene inkuberes i 16-18 timer ved 37°C i 5% C02 og 95% fuktighet.

Apoptosen av cellene måles ved kvantifisering av DNA-fragmenteringen under anvendelse av en "Cell Death Detection Assay" fra Boehringer-Mannheim, No. 1544 675. Etter inkubasjon i 16-18 timer sentrifugeres analyseplatene ved lOOxg ved romtemperatur i 5 minutter. 150ul av supernatanten fjernes og erstattes med 150ul nyfremstilt komplett medium. Cellene høstes deretter, og 200ul av lysebufferen levert i analysesettet tilsettes til hver brønn. Cellene tritureres for å sikre komplett oppløsning og inkuberes i 30 minutter ved 4°C. Platene sentrifugeres deretter ved 1900xg i 10 minutter, og supernatantene fortynnes 1:20 i inkubasjonsbufferen som fulgte med. 100^1 av denne løsning analyseres deretter i henhold til fabrikantens instruksjoner som fulgte med settet. OD^snm måles 20 minutter etter tilsetning av sluttsubstratet i en SPECTRAmax Plus-plateavleser (Molecular Devices) . OD^snm fremstilles grafisk mot forbindelseskonsentrasjonen, og ICso-verdiene for forbindelsene beregnes under anvendelse av kurvetilpasningsprogrammet SOFTmax Pro (Molecular Devices) under anvendelse av de fire parameteres tilpasnings-valg.

Valgte forbindelser er blitt testet i denne undersøkelse og har vist seg å inhibere Fas-indusert apoptose av Jurkat-celler med ICso-verdier mellom 0,001uM og 0,15uM.

Selv om vi har beskrevet et antall utførelsesformer av denne oppfinnelse, er det åpenbart at våre grunnleggende eksempler kan endres for å tilveiebringe andre utførelsesformer som utnytter forbindelsene og fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelse. Derfor vil det være forståelig at omfanget av denne oppfinnelse bør defineres av de medfølgende krav og ikke av de spesifikke utførelsesformer som er blitt presentert ved hjelp av eksempler.

Claims

1. Anvendelse av en forbindelse med formel I: eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav ved fremstilling av et medikament, hvori: Z er oksygen; R<1> er -CH2Y; Y er halogen; R<2> er C02H, CH2CO2H, C02(Ci-6alkyl), CH2C02 (Ci-6alkyl) , C02 (cykloheksyl), CONH(Ci-6alkyl) , CH2CON(Ci-6alk<y>l) 2, CONHCH2CH2N(CH3)2, R<3> er Ci-6alkyl; og R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et bi- eller tricyklisk hetero-ringsystem med 1-6 hetero-atomer valgt fra nitrogen eller svovel, hvori nevnte ring er valgt fra karbazol, indol, fenotiazin, dihydrofenantridin, dibenzoazepin, dihydrodibenzoazepin eller indolin, hvori nevnte ring eventuelt er substituert med halogen, Ci-6alkyl eller CF3.

2. Anvendelse ifølge krav 1 hvori R2 er CO2H eller C02 (Ci-6alkyl) .

3. Anvendelse ifølge krav 2 hvori R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et bicyklisk eller tricyklisk heterocyklisk eller heteroaryl ringsystem valgt fra karbazol, indol, fenotiazin, dihydrofenantridin, 5H-dibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin eller indolin.

4 . Anvendelse ifølge krav 3 hvori R<1> er -CH2F og R<3> er en Ci-4alkylgruppe.

5. Anvendelse ifølge krav 4 hvori R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et tricyklisk heterocyklisk eller heteroarylisk ringsystem valgt fra karbazol, fenotiazin, dihydrofenantridin, 5H-dibenzo-[b,f]azepin eller 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin.

6. Anvendelse ifølge krav 5 hvori nevnte ringsystem er valgt fra karbazol, fenotiazin eller dihydrofenantridin.

7. Anvendelse ifølge krav 1 hvori forbindelsen har ett eller flere av følgende trekk: (i) R<2> er C02H eller C02 (Ci_6alkyl) ; (ii) R<3> er Ci-4alkyl; eller (iii) R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner en ring valgt fra indol, indolin, karbazol, fenotiazin, dibenzoazepin, dihydrodibenzoazepin eller dihydrofenantridin.

8. Anvendelse ifølge krav 7 hvori R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner en ring valgt fra indol, indolin, karbazol, fenotiazin eller dihydrofenantridin.

9. Anvendelse ifølge krav 7 hvori forbindelsen har ett eller flere av følgende trekk: (i) R2 er C02H eller C02 (Ci_6alkyl) ; (ii) R3 er Ci-4alkyl; eller (iii) R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et substituert eller usubstituert ringsystem valgt fra karbazol, fenotiazin, indol, indolin, 5H-dibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepin eller dihydrof enantridin.

10. Anvendelse ifølge krav 9 hvori R2 er C02H eller C02 (Ci-6alkyl) ; R3 er Ci-4alkyl; og R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et substituert eller usubstituert ringsystem valgt fra karbazol, fenotiazin, indol, indolin, 5H-dibenzo [b, f] azepin, 10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepin eller dihydrof enantridin.

11. Anvendelse ifølge krav 9 hvori R<1> er -CH2F.

12. Anvendelse ifølge krav 1 hvori forbindelsen er valgt fra de følgende forbindelser

13. Anvendelse ifølge krav 1 hvori forbindelsen er valgt fra de følgende:

14. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13 hvor nevnte medikament anvendes for behandling eller forebygging av en sykdom valgt fra en IL-l-mediert sykdom, en apoptosemediert sykdom, en inflammatorisk sykdom, en autoimmun sykdom, en destruktiv benforstyrrelse, en proliferativ forstyrrelse, en smittsom sykdom, en degenerativ sykdom, en sykdom forbundet med celledød, et altfor stort alkoholinntak, en virusmediert sykdom, uveitt, inflammatorisk peritonitt, osteoartritt, pankreatitt, astma, sjokklungesyndrom, glomerulonefritt, revmatoid artritt, systemisk lupus erythematosus, skleroderma, kronisk tyreoditt, Graves sykdom, autoimmun gastritt, diabetes, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun nøytropeni, trombocytopeni, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom, psoriasis, atopisk dermatitt, arrdannelse, transplantat-mot-vert-sykdom, organtransplantatavstøtning, osteoporose, levkemier og relaterte forstyrrelser, myelodysplastisk syndrom, multippel myelom-relatert benforstyrrelse, akutt myeloisk levkemi, kronisk myeloisk levkemi, metastatisk melanom, Kaposis sarkom, multippelt myelom, hemoragisk sjokk, sepsis, septisk sjokk, forbrenninger, Shigellosis, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Kennedys sykdom, prion-sykdom, cerebral iskemi, epilepsi, myokardiskemi, akutt og kronisk hjertesykdom, myokardinfarkt, kongestiv hjertesvikt, aterosklerose, koronararteriebypass-transplantasjon, spinal muskelatropi, amyotrofisk lateralsklerose, multippel sklerose, HIV-relatert encefalitt, aldring, alopeci, nevrologisk skade på grunn av slag, ulcerøs kolitt, traumatisk hjerneskade, ryggmargsskade, hepatitt-B, hepatitt-C, hepatitt-G, gul feber, denguefeber eller Japansk encefalitt, forskjellige former av leversykdom, renal sykdom, polyaptisk nyresykdom, H. pylori-forbundet gastrisk og duodenal ulcussykdom, HIV-infeksjon, tuberkulose, meningitt, en behandling for komplikasjoner forbundet med koronararteriebypass-transplantater eller en immunterapi for behandling av forskjellige former av kreft.

15. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13 hvori nevnte medikament anvendes for å behandle komplikasjoner forbundet med koronararteriebypass-transplantater.

16. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 13, hvori nevnte medikament anvendes til preservering av celler.

17. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 13, hvor nevnte medikament anvendes til en organtransplantasjon eller for preservering av blodprodukter.

18. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 13, hvor nevnte medikament anvendes som en komponent i immunterapi for behandling av kreft.

19. Forbindelse av formel I: eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav, hvori: Z er oksygen; R<1> er -CH2Y; Y er halogen; R<2> er C02H, CH2C02H, C02 (Ci-6alkyl), CH2C02 (Ci-6alkyl) , C02 (cykloheksyl), CONH(Ci-6alkyl) , CH2CON(Ci-6alkyl) 2, CONHCH2CH2N(CH3)2,R<3> er Ci-6alkyl; og R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et bi- eller tricyklisk hetero-ringsystem med 1-6 hetero-atomer valgt fra nitrogen eller svovel, hvori nevnte ring er valgt fra karbazol, indol, fenotiazin, dihydrofenantridin, dibenzoazepin, dihydrodibenzoazepin eller indolin, hvori nevnte ring eventuelt er substituert med halogen, Ci-6alkyl eller CF3.

20. Forbindelse ifølge krav 19 hvori R<2> er CO2H eller C02 (Ci-6alkyl.

21. Forbindelse ifølge krav 20 hvori R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et bicyklisk eller tricyklisk heterocyklisk eller heteroarylisk ringsystem valgt fra karbazol, indol, fenotiazin, dihydrofenantridin, 5H-dibenzo[b,f]azepin, 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin eller indolin.

22. Forbindelse ifølge krav 21 hvori R<1> er -CH2F og R<3 >er en Ci-4alkylgruppe.

23. Forbindelse ifølge krav 22 hvori R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et tricyklisk heterocyklisk eller heteroarylisk ringsystem valgt fra karbazol, fenotiazin, dihydrofenantridin, 5H-dibenzo-[b,f]azepin eller 10,ll-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin.

24. Forbindelse ifølge krav 23 hvori nevnte ringsystem er valgt fra karbazol, fenotiazin eller dihydrofenantridin.

25. Forbindelse ifølge krav 19 hvori forbindelsen har ett eller flere av følgende trekk: (i) R<2> er C02H eller C02 (Ci_6alkyl) ; (ii) R<3> er Ci_4alkyl; eller (iii) R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner en ring valgt fra indol, indolin, karbazol, fenotiazin, dibenzoazepin, dihydrodibenzoazepin eller dihydrofenantridin.

26. Forbindelse ifølge krav 25 hvori R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner en ring valgt fra indol, indolin, karbazol, fenotiazin eller dihydrofenantridin.

27. Forbindelse ifølge krav 25 hvori forbindelsen har ett eller flere av følgende trekk: (i) R<2> er C02H eller C02 (Ci_6alkyl) ; (ii) R<3> er Ci-4alkyl; eller (iii) R4 og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et substituert eller usubstituert ringsystem valgt fra karbazol, fenotiazin, indol, indolin, 5H-dibenzo [b, f] azepin, 10, ll-dihydro-5H-dibenzo [b, f] - azepin eller dihydrofenantridin.

28. Forbindelse ifølge krav 27 hvori R<2> er C02H eller C02 (Ci-6alkyl) ; R3 er Ci_4alkyl; og R<4> og R<5> tatt sammen med det tilstøtende nitrogen danner et substituert eller usubstituert ringsystem valgt fra karbazol, fenotiazin, indol, indolin, 5H-dibenzo [b, f] azepin, 10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepin eller dihydrof enantridin.

29. Forbindelse ifølge krav 28 hvori R<1> er -CH2F.

30. Forbindelse ifølge krav 19 hvori forbindelsen er valgt fra de følgende forbindelser

31. Forbindelse ifølge krav 19 hvori forbindelsen er valgt fra de følgende:

32. Farmasøytisk sammensetning omfattende en forbindelse ifølge et av kravene 19-31 og en farmasøytisk akseptabel bærer.