DE60113744T2 - Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Lignocellulose-haltiger Biomasse unter Verwendung von thermostabiler Hefe - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Lignocellulose-haltiger Biomasse mit Hilfe eines Verzuckerungs- und gleichzeitigen Fermentationsverfahrens. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren, bei dem Lignocellulose-haltige Biomasse in einer Anfangsphase einer hydrothermischen Dampfexplosions-Vorbehandlung unterworfen wird, gefolgt von gleichzeitiger Hydrolyse (unter Verwendung von im Handel erhältlichen Cellulasen) und Fermentation mit einem neuen wärmetoleranten Stamm der Hefe Kluyveromyces mancianus.
- Hintergrund der Erfindung
- Die Erzeugung von Ethanoltreibstoff aus Biomasse trägt zur Sicherheit der Energieversorgung bei, da sie eine Alternative zu Treibstoff aus fossilem Ursprung bildet. Sie trägt auch zur regionalen Entwicklung bei, wobei Vorteile, die mit der Entstehung von Arbeitsplätzen verbunden sind, entstehen. Wie bei anderen erneuerbaren Energiequellen weist die Herstellung von Bioethanol und dessen Verwendung in der Transportwirtschaft Umweltvorteile gegenüber Treibstoff aus Öl auf, da die Schadstoffemission verringert und der Treibhauseffekt nicht weiter verstärkt wird.
- Bei der Herstellung von Ethanol aus erneuerbaren Rohstoffen kann eine breite Vielfalt von Substraten verwendet werden. Bei den Rohstoffen, die für die Herstellung dieser Art von Alkohol verwendet werden, handelt es sich um carbohydrierte Produkte aus Zucker oder Stärke, die einem Fermentationsverfahren entweder direkt (Saccharose) oder nach einer Hydrolyse (Stärke, Inulin) unterzogen werden können. Erntegut, wie z. B. Zückerrüben oder Zuckerrohr (die erste Gruppe), und Getreide, wie z. B. Korn (die zweite Gruppe), bilden einige Beispiele der Rohstoffe, die gegenwärtig für die Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Lignocellulose-haltige Materialien (organische Rückstände und Waldrückstände, sowie krautiges und hölzernes Erntegut) können ebenfalls als Rohstoffe für die Herstellung von Bioethanol verwendet werden.
- Sowohl bei zuckerartigen als auch bei stärkeartigen Substraten hängen die Gesamtkosten des Verfahrens vom Rohstoffpreis, der zwischen 60 und 70 % der Gesamtkosten des Produkts beträgt, ab. Zur Verbesserung der Wettbewerbsfähigkeit von Bioethanol-Treibstoff gegenüber Treibstoffen aus Öl müssen neue Verfahren zur Herstellung des Produkts aus billigeren Substraten, wie z. B. bestimmten Lignocellulose-haltigen Rohstoffen, entwickelt werden.
- Vor der Umwandlung in Ethanol ist für die Cellulosefraktion von Lignocellulosehaltigen Materialien eine Hydrolyse notwendig, um sie in Glucose, die durch Mikroorganismen fermentierbar ist, umzuwandeln. Dieser Schritt, der mit Hilfe von Säure- oder enzymatischen Katalysatoren durchgeführt werden kann, stellt wegen der chemischen Stabilität der Cellulosekette und des Schutzes des Pflanzengewebes durch Lignin ein Problem dar, weshalb das Verfahren in Bezug auf Wirtschaftlichkeit und Energieaufwand kostspielig ist.
- Die enzymatische Hydrolyse von Cellulose weist wenigstens drei potentielle Vorteile gegenüber Säurekatalysator-Verfahren auf:
- • Höhere Ausbeuten.
- • Geringere Ausrüstungskosten, da sie bei atmosphärischem Druck und niedrigen Temperaturen durchgeführt wird.
- • Beim Abbau von Zuckern entstehen keine giftigen Substanzen, die ein Hindernis bei der Fermentation darstellen könnten.
- Wegen der Struktur der Lignocellulose-haltigen Materialien sind die Kohlenhydrate jedoch für hydrolytische Enzyme nicht direkt zugänglich, weshalb eine Reihe von Vorbehandlungen notwendig ist, um die Ausbeute der Hydrolyse zu verbessern. Die starke Hemmung der Cellulasen durch die Anhäufung der Endprodukte der Umsetzung, hauptsächlich Cellobiose und Glucose, stellt einen weiteren Faktor dar, der die Ausbeute der Hydrolyse beschränkt.
- Im Allgemeinen umfassen die Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Lignocellulose-haltiger Biomasse folgende Stufen: Vorbehandlung, Hydrolyse der Cellulose und Fermentation der Glucose. Der Zweck der Vorbehandlungsstufe ist es, das Eindringen und die Ausbreitung der Enzyme und Mikroorganismen zu erleichten.
- Vorbehandlung
- Seit Beckmann 1919 eine Alkali-Vorbehandlung durch Imprägnieren mit Natriumhydroxid zum Verbessern der Aufschließbarkeit von Stroh patentieren liess, sind viele Vorbehandlungen von Lignocellulose-haltigen Materialien entwickelt worden.
- Von den untersuchten Vorbehandlungen scheinen hydrothermische Verfahren zu den wirkungsvollsten zur Verbesserung der Zugänglichkeit dieser Materialien zu gehören. Ein Beispiel dieser hydrothermischen Verfahren, bei dem Dampf mit einer Temperatur von 200–250 °C in einem hermetisch verschlossenen Reaktor zur Behandlung von zuvor gemahlener Biomasse verwendet wird, ist im spanischen Patent ES87/6829 von Shell International Research beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Reaktor nach der Behandlung der Biomasse allmählich auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Wenn auch die Zugänglichkeit der Biomasse für einen enzymatischen Angriff dadurch verbessert wird, ist gezeigt worden, dass die „Dampfexplosionsbehandlung" genannte Variante des hydrothermischen Verfahrens, die ein schlagartiges Druckablassen des Reaktors umfasst, eines der wirksamsten Verfahren darstellt, wenn es darum geht, die nachfolgende Wirkung der cellulolytischen Enzyme zu erleichtern. Die Dampfexplosion ist ein thermisch-mechanisch-chemisches Verfahren, bei dem das Vorhandensein von Wärme (als Dampf), mechanischer Kräfte (Scherwirkung) und chemischer Vorgänge (Hydrolyse) kombiniert sind. Das Ergebnis ist die Veränderung der Mikrofaserpackung innerhalb der Zellwand und das Zerreissen der Faser, wodurch eine Verbesserung der Zugänglichkeit der Cellulose für hydrolytische Enzyme bewirkt wird. Die Optimalbedingungen von Temperatur und die Reaktionszeit hängen von der Art des Materials ab.
- Die diskontinuierliche Dampfexplosionsbehandlung wurde 1929 von Mason (US-Patent 1,655,618) für die Herstellung von Holzbrettern zum Patent angemeldet; sie kombiniert eine thermische Behandlung mit Dampf und den mechanischen Abbau der Organisation von Lignocellulose-haltigen Fasern. Bei diesem Verfahren werden Holzsplitter in einem senkrechten Stahlzylinder bei einem Druck von 3,5 MPa oder mehr mit Dampf behandelt. Nach Abschluss der Behandlung wird das Material mit Heftigkeit vom Boden des Zylinders entfernt. Dieses Verfahren kombiniert die Wirkungen von hohen Drücken und Temperaturen und dem abschließenden schlagartigen Druckablassen auf das Lignocellulose-haltige Material. Die Wirkung dieses Verfahrens ist eine Kombination von physikalischen (Trennung und Zerreissen der Lignocellulose-haltigen Fasern) und chemischen (Abbau der Polymerisation und Brechen der C-O-C Bindungen) Änderungen. Bei der Dampfbehandlung wird der größte Teil der Hemicellulose zu wasserlöslichen Oligomeren oder freien Zuckern hydrolysiert.
- Es gibt sehr verschiedene Anwendungen der Dampfexplosionsbehandlung. Beispielsweise beschreibt das US-Patent 4,136,207 (1979) die Verwendung dieser Art von Vorbehandlung zur Verbesserung der Aufschließbarkeit von harten Hölzern, wie z. B. Pappel und Birke, durch Wiederkäuer. Dabei wird die STAKE-Technologie verwendet, wobei kontinuierlich mit einem Hochdruck-Rohrreaktor bei Temperaturen zwischen 200 und 250 °C und mit verschiedenen Behandlungszeiten gearbeitet wird.
- Bei dem von der IOTECH Corporation entwickelten diskontinuierlichen Dampfexplosionsverfahren, das als „Flash-Hydrolyse" bekannt ist, wird Holz zu einer kleinen Teilchengröße gemahlen und Temperaturen und Drucken nahe 230 °C bzw. 500 psi ausgesetzt; wenn diese Bedingungen erreicht sind, wird es dem Reaktor schlagartig entnommen. Die organischen Säuren des Holzes bestimmen den pH- Wert, und Essigsäure ist stets in dem gasförmigen Ausfluss vorhanden. Die Bauweise des Reaktors in dem allgemein als „IOTECH-Verfahren" bekannten Verfahren ist im US-Patent 4,461,648 beschrieben.
- Mit Bezug auf eine andere Anwendung einer Dampfexplosionsbehandlung von Lignocellulose-haltige Materialien beschreibt das Kanadische Patent CA 1,212,505 die Anwendung einer Kombination des STAKE- und des IOTECH-Dampfexplosionsverfahrens zur Herstellung von Papierbrei aus hartem Holz bei hohen Ausbeuten.
- Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Dampfexplosionsbehandlung verwendet, um die Aufschließbarkeit der Cellulose bei enzymatischer Hydrolyse mit Hilfe mikrobieller Cellulasen in einem Verfahren von gleichzeitiger Verzuckerung und Fermentation (SSF; engl.: „simultaneous saccharification and fermentation") zu verbessern. Diese Verwendung der Dampfexplosionsbehandlung als Vorbehandlung bei einem SSF-Verfahren ist eine neue Anwendung dieser Behandlung und stellt eine der Neuheiten der vorliegenden Erfindung dar.
- Der hauptsächliche Zweck dieser Vorbehandlung ist das Verringern der Kristallinität der Cellulose und das Aufbrechen des Hemicellulose/Cellulose-Komplexes. Die Aufschließbarkeit der Cellulose nimmt mit der Stärke der Vorbehandlung zu, wobei die Zunahme der Aufschließbarkeit mit der Zunahme der verfügbaren Oberfläche (ASA; engl: „available surface area") der Cellulosefasern direkt verbunden ist und wodurch gegebenenfalls der enzymatische Angriff durch Cellulasen erleichtert wird. Die Zunahme der ASA ist eine Folge der teilweisen oder vollständigen Entfernung der Hemicellulose und des Lignins.
- Die Forschungsarbeit über die Zunahme der Substratzugänglichkeit nach einer Dampfexplosionsbehandlung konzentrierte sich auf die Untersuchung einer Reihe von Faktoren, die mit dem Substrat verbunden sind, wie z. B. die Porengrößenverteilung, der Kristallinitätsgrad, der Polymerisationsgrad und der Xylan-Restgehalt, die dessen letztliche Wirksamkeit bestimmen (K. K. Y. Wong et al., Biotechnol. Bioeng. 31, 447 (1988); H. L. Chum et al., Biotechnol. Bioeng. 31, 643, (1988)). Die erstgenannten Forscher richteten ihre Arbeit auf die Wirkung des schlagartigen Druckablassens auf das Brechen der Cellulose, wobei sie mit Experimenten bei hohen Temperaturen (220–270 °C) und kurzen Behandlungszeiten (40–90 Sekunden) vorgingen. In neueren Arbeiten (Wright, J. D. SERI/TP-231-3310, 1988; Schwald et al., in: Steam Explosion Technigues. Fundamentals and Industrial Applications, Facher, Marzetti und Crecenzy (Herausgeber), Seiten 308–320 (1989)) wurde gezeigt, dass die Verwendung von niedrigeren Temperaturen (nicht über 200–220 °C) und längeren Behandlungszeiten (zwischen 5 und 10 Minuten) geeignete Solubilisierungsraten erzeugt und dass sie ferner die Möglichkeit vermeidet, ein bestimmtes Maß an Pyrolyse zu bewirken, welche die Entstehung von hemmenden Produkten verursachen könnte. Die bei der vorliegenden Anmeldung verwendeten Bedingungen liegen auf dieser Linie, und es wurde ermittelt, dass sie zu einer umfangreicheren Gewinnung von Glucose im Rückstand führen (Ballesteros et al., in: Biomass for Energy, Environment, Agriculture and Industry, Chartier, Beenackers und Grassi (Herausgeber), Band 3., Seiten 1953–1958 (1995)). Enzymatic hydrolysis of cellulose and fermentation of glucose. Simultaneous saccharification and fermentation process (SSF).
- Die enzymatische Hydrolyse von Cellulose wird mit Hilfe eines Gemischs von enzymatischen Aktivitäten, die als Gruppe der cellulolytische Enzyme oder Cellulasen bekannt sind, durchgeführt. Eines der Enzyme, das Endoglucanase genannt wird, wird auf der Oberfäche der Celulose adsorbiert und greift das Innere der Polymerkette an, wobei diese an einer Stelle aufgebrochen wird. Ein zweites Enzym, das Exoglucanase genannt wird, trennt dann zwei Glucoseeinheiten, die Cellobiose genannt werden, vom nichtreduzierenden Ende der Kette ab. Die bei dieser Umsetzung erzeugte Cellobiose kann sich im Medium anhäufen und die Exoglucanaseaktivität wesentlich hemmen. Als dritte enzymatische Aktivität spaltet die β-Glucosidase die beiden Zuckereinheiten, um die Glucose freizusetzen, die später zu Ethanol fermentiert wird. Hierbei kann sich die Glucose im Medium anhäufen und die Wirkung der Glucosidase hemmen, wodurch dann eine Anhäufung von Cellobiose entsteht, die wiederum, wie oben erwähnt, die Exoglucanaseaktivität hemmt.
- Obwohl es verschiedene Arten von Mikroorganismen gibt, die Cellulasen herstellen können, einschließlich Bakterien und verschiedene Arten von Pilzen, werden üblicherweise genetisch veränderte Stämme des Fadenpilzes Trichoderma ressei verwendet, da sie größere Ausbeuten liefern. Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Cellulase sind diskontinuierlich und verwenden für das Wachstum des Pilzes und die Enzymproduktion unlösliche Kohlenstoffquellen sowohl als Auslöser als auch als Substrate. Bei diesen Systemen sind die Wachstumsgeschwindigkeit und die Rate der Cellulaseproduktion beschränkt, da der Pilz die Cellulasen absondern und zum Gewinnen des benötigten Kohlenstoffs eine langsame enzymatische Hydrolyse des Feststoffs durchführen muss. Die besten Ergebnisse werden im Allgemeinen mit Verfahren mit diskontinuierlicher Beschickung erhalten, bei denen das feste Substrat, wie z. B. Solka Floc oder vorbehandelte Biomasse, der Fermentationsablagerung langsam zugesetzt wird, so dass diese nicht zu viel Substrat enthält (Watson et al., Biotech. Lett., 6, 667, 1984). Nach Wright, J.D. (SERI/TP-231-3310, 1988) beträgt die mittlere Produktivität bei Verwendung von Solka Floc und vorbehandelten landwirtschaftlichen Rückständen etwa 50 IU/I·h. Die Verbesserung der Produktionsraten und das Steigern der ihrer Natur nach außerordentlich niedrigen spezifischen Aktivität dieser Enzyme liegen in einer Linie mit den hauptsächlichen Zielen gegenwärtiger Forschungen auf dem Gebiet.
- Bei dem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Lignocellulose-haltigen Materialien wird dem in einem Reaktor vorbehandelten Material eine Cellulase zur Verzuckerung der Cellulose zu Glucose zugesetzt, und nach dem Abschluss der Umsetzung wird die Glucose in einem zweiten Reaktor zu Ethanol fermentiert. Dieses Verfahren, das „getrennte Verzuckerung und Fermentation" genannt wird, erfordert zwei getrennte Schritte bei dem Verfahren zur Herstellung von Ethanol. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist die Umwandlungsrate von Cellulose zu Glucose niedrig, da von der Anhäufung von Glucose und Cellobiose eine Hemmung der Wirkung des Enzymkomplexes verursacht wird und daher große Mengen von nicht-hydrolysierten Cellulose-haltigen Rückständen, die eine geringe Ethanolausbeute aufweisen, erhalten werden. Tatsächlich stellt nach Wright, J. D. (SERI/TP-231-3310, 1988) diese Hemmung des Endprodukts den größten Nachteil des Verfahrens der getrennten Verzuckerung und Fermentation dar und bildet einen der Hauptfaktoren, die für dessen hohe Kosten verantwortlich sind, da beim Versuch, dieses Problem zu lösen, große Mengen an cellulolytischem Enzym verwendet werden.
- Das Britische Patent
GB 2 186 289 B - Eine der interessantesten Möglichkeiten für das oben erläuterten Verfahrens ist das Verfahren der gleichzeitigen Verzuckerung und Fermentation (SSF). Bei diesem Verfahren verringert das gemeinsame Vorhandensein der Hefen und des cellulolytischen Enzyms die Anhäufung von Zuckern im Reaktor, wodurch es möglich ist, höhere Ausbeuten und Verzuckerungsraten als bei dem Verfahren der getrennten Verzuckerung und Fermentation zu erhalten. Ein weiterer Vorteil liegt bei der Verwendung einer einzigen Fermetationsablagerung im gesamten Verfahren, wodurch die Investitionskosten verringert werden. Das Vorhandensein von Ethanol im Medium verringert auch die Anfälligkeit des Gemischs für Befall durch unerwünschte Mikroorganismen (Wyman, C. E. Bioresource Technology, 50, 3–16, 1994).
- Bei dem Verfahren der gleichzeitigen Hydrolyse und Fermentation müssen die Fermentation und die Verzuckerung miteinander kompatibel sein und ähnliche pH-Werte, Temperaturen und optimale Substrattemperaturen aufweisen. Ein mit dem SSF-Verfahren verbundenes Problem liegt in den unterschiedlichen Optimaltemperaturen von Verzuckerung und Fermentation. Da die Optimaltemperatur der Verzuckerung im Bereich von 45–50 °C liegt, ist die Verwendung von wärmetoleranten Hefen für gleichzeitige SSF-Verfahren empfehlenswert.
- In den letzten Jahre wurden über die verschiedenen Hefestämme, die zum Wachstum bei Temperaturen über 40 °C fähig sind, Forschungsarbeiten durchgeführt und es wurde eine Bibliographie darüber geschrieben; es liegt jedoch nur wenig Literatur über Ethanol-Fermentationen bei hohen Ausbeuten unter Verwendung dieser Mikroorganismen vor. Szczodrak und Targonski (Biotechnology and Bioengineering, Band 31, Seiten 300–303, 1988) haben insgesamt 58 Hefestämme aus 12 Familien mit Bezug auf ihr Vermögen, bei Temperaturen von 40–46 °C zu wachsen und Zucker zu fermentieren, untersucht. Mehrere Stämme der Familien Saccharomyces, Kluyveromyces und Fabospora wurden wegen ihres Vermögens, Glucose, Galactose und Mannose bei 40, 43 bzw. 46 °C zu fermentieren, ausgewählt. Die größten Ethanolausbeuten wurden bei zwei Stämmen der Spezies F. Fragilis und K. Fragilis, die 56 bzw. 35 g/l Ethanol aus 140 g/l Glucose bei 43 bzw. 46 °C produzierten, gefunden.
- Bei der vorliegenden Erfindung verwenden wir einen neuen, durch chemische Mutagenese und nachfolgende Selektion erhaltenen Stamm der Spezies Kluyveromyces marxianus, CECT 10875, der fähig ist, die durch Hydrolyse der Cellulose hergestellte Glucose bei 42 °C zu Ethanol zu fermentieren, und dessen Ausbeute gegenüber jener des ursprünglichen Stamms verbessert worden ist.
- Forschungsarbeiten, die in den letzten Jahren über das SSF-Verfahren durchgeführt wurden, haben zu wesentlichen Verbesserungen der Ethanolproduktion geführt, die Gegenstand mehrerer Patente waren. Diese Untersuchungen basierten in erster Linie auf der Auswahl der Mikroorganismen, der optimalen Konzentration des Enzyms und verschiedenen Vorbehandlungen des Substrats, sie betrafen jedoch hauptsächlich diskontinuierliche Verfahren. Beispielsweise beschreibt das Patent WO 96/37627 von MAXOL & C. B. ein diskontinuierliches SSF-Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus einem Pflanzenmaterial, bei dem ein Gemisch von Hemicellulasen und im Handel erhältlichen Cellulasen für das Verzuckerungsverfahren, und eine Hefe aus den Familien Candida, Kluyveromyces, Pichia und Saccharomyces, oder einem Gemisch von ihnen, zum Fermentieren der verschiedenen hergestellten Zucker verwendet wird. Bei diesem Verfahren wird das Pflanzenmaterial einer Vorbehandlung mit einer Säure oder einer Base unterzogen, obwohl dies den Nachteil aufweist, dass das Material zuvor auf eine Größe von etwa 1 mm gemahlen werden muss, was einen hohen Energieeinsatz bedeutet. Die verwendeten Materialien pflanzlichen Ursprungs sind sehr heterogen, und wenn ein Material verwendet wird, das dem der vorliegenden Erfindung ähnlich ist, wie z. B. Futterstroh, sind die erhaltenen Ausbeuten etwa zehnmal geringer als diejenigen, die mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren, das eine wärmetolerante Hefe verwendet, erhalten werden. Diese niedrige Ausbeute könnte dem Umstand zugeschrieben werden, dass das Verfahren eine Temperatur von 35 °C verwendet, die, wenn sie auch der Fermentierung mit den gewählten Hefen angemessen ist, ausserhalb des Optimalbereichs des Verzuckerungsvorgangs liegt.
- Andere Beispiele von SSF-Verfahren zur Herstellung von Ethanol, die in der Bibliographie beschrieben sind, stammen von Wyman et al. (Biotech. Bioeng. Symp., Seiten 21–238, 1998) und Spindler et al. (Appl. Biochem. Biotechnol., 28/29, Seiten 773, 1991), die ein Medium verwenden, bei dem es sich um ein Gemisch von Bretanomyces clousenii und Saccharomyces cerevisiae handelt, das sowohl die Cellobiose als auch die Glucose, die durch Hydrolyse der Cellulose hergestellt sind, fermentiert. Dieses Verfahren, das bei 37 °C stattfindet, weist eine Behandlungsdauer von 7 Tagen auf, was als ein für diese Art von Verfahren sehr hoher Wert angesehen werden kann.
- Eine frühere Arbeit dieser Autoren (Applied Biochemistry and Biotechnology, Band 70–72, Seiten 369–381) unter Verwendung des Stamms Kluyveromyces marxianus EMS-26 beschreibt Verweilzeiten von 144 Stunden bei einem Verfahren zur Ethanolproduktion, das von vorbehandelten hölzernen Biomassen ausgeht. Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene SSF-Verfahren verwendet den neuen wärmetoleranten Stamm von Kluyveromyces marxianus CECT-10875, wodurch eine beträchtliche Verringerung der Fermentationszeit bei der gleichen Temperatur von 42 °C ermöglicht wird, was eine bedeutende Verbesserung gegenüber der oben genannten Arbeit darstellt. Die Ethanolausbeute des neuen Stamms (Gramm Ethanol/Gramm im Rohmaterial enthaltener Glucose) ermöglicht es, Ethanolkonzentrationen zu erzielen, die den mit K. marxianus erhaltenen ähnlich sind, jedoch innerhalb von nur 72 Stunden. Somit ist die volumetrische Produktivität (Ethanolmenge pro Volumen- und Zeiteinheit) des Verfahrens weitaus grösser als diejenige, die mit dem Stamm EMS-26 erhalten wird. Eine weitere wesentliche Verbesserung des vorgeschlagenen Verfahrens liegt bei der Verwendung von Teilchengrößen von bis zu 30 mm bei der Stufe der Vorbehandlung. Trotz des Umstands, dass das Dokument Biotechnology for biomass conversion (1997-03-27) (http://calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/bioprocessing/bioconversion.html) erwähnt, dass die bei den Verfahren zur Umwandlung von Biomasse verwendeten Teilchengrößen in Bereich von 3/4'' bis 1/B'' liegen, ist dies nicht offensichtlich, wenn vor dem SSF-Verfahren eine Dampfexplosionsbehandlung als Vorbehandlung verwendet wird. Es gibt dokumentierte Beweise dafür, dass die Teilchengröße der Biomasse einen wichtigen Einfluss auf mögliche Veränderungen, die bei der Vorbehandlung stattgefunden haben könnten und die zugleich die Zugänglichkeit des Enzyms zum Substrat während des SSF beeinflussen, aufweist. Als Ergebnis stellt die Möglichkeit der Verwendung von großen Teilchengrößen bis zu 30 mm bei der Vorbehandlung ohne Beeinträchtigung der Endausbeuten von Hydrolyse und Fermentation eine Neuheit und große Verbesserung dar, da dadurch eine wesentliche Verringerung der zum Mahlen benötigten Energie erreicht wird und somit die Kosten verringert werden.
- Herkömmliche Bauweisen von kontinuierlichen SSF-Systemen sind kontinuierlich geschüttelte Tankreaktoren, die in Reihe oder in einer Kaskade angeordnet sind. Einer der größten Nachteile dieser Art von Systeme liegt in deren hohen Kosten, da lange Behandlungsdauern und heftiges Schütteln benötigt werden, wodurch Denaturierung der Enzyme und häufiger Bedarf an deren Ersatz entstehen. Das Patent WO 98/30710 von Nguyen, Q. A. beschreibt ein System, bei dem es sich um einen Turm-Bioreaktor auf der Grundlage der Kolbenfluss-Reaktortechnologie handelt, das eine wesentliche Verringerung des Volumens der Fermentationsablagerungen und der zum Schütteln benötigten Energie erreicht. Dieses System ermöglicht die Verwendung von Gemischen mit einem hohen Gehalt an suspendierten Feststoffen, wie z. B. die vorbehandelten Lignocellulose-haltigen Materialien, während die oben beschriebenen Systeme nur auf wässrige Gemische anwendbar sind. Die Bibliographie enthält jedoch noch keine Beschreibung der Entwicklung eines kontinuierlichen SSF-Verfahrens, das hohe Ausbeuten und Produktionsraten liefert.
- Beschreibung der Erfindung
- Das von der vorliegenden Erfindung umfasste Verfahren ist ein diskontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Lignocellulose-haltiger Biomasse, umfassend eine Dampfexplosions-Vorbehandlung und die gleichzeitige Verzuckerung (mit Hilfe von im Handel erhältlichen Cellulasen) und Fermentation (unter Verwendung einer neuen wärmetoleranten Hefe, insbesondere Kluyveromyces mancianus CECT 10875) von Cellulose zu Ethanol. Das Verfahren wird bei 42 °C durchgeführt, wobei mit 1500 Upm geschüttelt wird und die Behandlungsdauer 72 h beträgt. Nach der Vorbehandlung ergeben 1000 g Biomasse mit einem Cellulosegehalt von 30–40 % (nicht für einen Enzymangriff geeignet) 270–360 g Cellulose, die für eine Hydrolyse geeignet ist. Diese Cellulose wird mit Hilfe eines SSF-Verfahrens in 90–120 g Ethanol umgewandelt.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
- Um die oben stehende Beschreibung zu vervollständigen und mit Hinblick darauf, ein besseres Verständnis der Kennzeichen der Erfindung zu ermöglichen, wird eine ausführliche Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform gegeben; die Beschreibung steht auf der Grundlage eines Satzes erläuternder aber nicht beschränkender Zeichnungen, die dieser Beschreibung angehängt sind und folgendes darstellen:
-
1 zeigt ein Schaubild des Verfahrens, das die Erfindung bildet. - Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
- Das bei dieser Erfindung verwendete Rohmaterial ist ein Material, das hauptsächlich Cellulose enthält, wie z. B. forstwirtschaftliche und landwirtschaftliche Rückstände, Papierbrei, Bimoasse aus Lignocellulose-haltigem Erntegut und der organische Anteil von Hausabfällen. Dieses Material ist normalerweise luftgetrocknet und enthält zwischen 10 und 15 % Feuchtigkeit.
- Obwohl das Material vor der Vorbehandlung gemahlen werden muss, sind die benötigten Teichengrößen (15–30 mm) bedeutend grösser als diejenigen, die bei anderen Reaktorbauweisen verwendet werden, wodurch die mit dem Mahlen verbundenen Energiekosten verringert werden. Die Wärmebehandlung mit Dampf führt zu Kondensation und zur Bildung einer feuchten Lignocellulose-haltigen Masse. Es tritt Selbsthydrolyse auf, da die Temperatur hoch genug ist, um die Dissoziation des flüssigen Wassers thermodynamisch zu bewirken, wodurch ein saures Medium erzeugt wird, das die Energiebarrieren der Hydrolyse überwindet. Das Einbringen von Dampf in die Strukturen der Lignocellulose-haltigen Materialien ist sichergestellt, da die Diffusion der Dampfphase größer als die Diffusion der flüssigen Phase ist. Zuerst dringt der Dampf ein, dann wird er kondensiert. Dieses Kapillarwasser steht wegen des hohen Drucks im Gleichgewicht. Wenn von dem Material der Druck abgelassen wird, verdampft das Kapillarwasser schnell, was zu der mechanischen Wirkung der Trennung und des Brechens einiger Fasern führt, vermutlich mit einer stärkeren Auswirkung auf die schwächsten Bereiche (amorphe Cellulose). Die mechanische Wirkung wird eindeutig von der schnellen Verdampfung des internen Wassers verursacht. Die Verdampfung erzeugt Scherkräfte, welche die Trennung der Fasern bewirken.
- Die für die Vorbehandlung bei dieser Erfindung verwendete Anlage wird von drei Einheiten gebildet: ein Dampfspeicher (
1 ), ein Dampfexplosionsreaktor (2 ) und ein Entladungszyklon (3 ), deren Kennzeichen nachfolgend beschrieben werden; siehe1 . - Der Dampfspeicher (
1 ) muss Dampf mit einer Temperatur von 245 °C und einem Druck zwischen 1 und 3 MPa an den Dampfexplosionsreaktor (2 ) liefern. Er besteht aus einem Druckrezipienten, der mit mehreren elektrischen Widerständen (6 ) ausgestattet ist. Am Dampfauslass ist eine zur Atmosphäre führende Entlüftung angeordnet, so dass während des anfänglichen Befüllens ein Luftauslass besteht, während sie unter Druck und bei Beriebstemperatur mit zwei Ventilen (8 ) verschlossen ist. Die Druckschalter (7 ), wie auf die Widerstände (6 ) wirken, sind auf skalierte Drucke eingestellt und jeder wirkt auf einen Widerstand (6 ), wobei er ihn abhängig davon, ob der eingestellte Druck erreicht ist oder nicht, ein- oder ausschaltet. - Der Dampfexplosionsreaktor (
2 ) ist die Kammer, in der die Lignocellulose-haltige Biomasse komprimiert und der Druck dann schlagartig abgelassen wird. Er besteht aus einem senkrechten Rohr mit 3'' Durchmesser aus rostfreiem Stahl 316, das von zwei Drosselventilen mit 3'' Durchmesser aus rostfreiem Stahl 316 begrenzt ist. Das Einlassventil (4 ) am oberen Ende der Kammer wird von Hand geöffnet und geschlossen und wird zum Beladen der Lignocellulose-haltigen Biomasse in den Reaktor (2 ) verwendet. Das Auslassventil (5 ) am Boden der Kammer wird durch eine Vorrichtung mit einem Abzugshebel und einer Feder innerhalb von weniger als 1 Sekunde geöffnet. Das Gemisch aus Dampf und Biomasse wird dann mit Heftigkeit entladen und passiert durch ein Rohr, das es zu dem Zyklon (3 ) befördert. Die Reaktorkammer (2 ), die Ventile und das Entladungsrohr sind mit 70 mm dicker Mineralwolle isoliert, um die Kondensation des Dampfs während des Kompressions/Expansions-Vorgangs so weit wie möglich zu verringern. - Der Entladungszyklon (
3 ) ist aus rostfreiem Stahl 316 gefertigt und verfügt über einen zylindrischen Teil mit einem Durchmesser von 16'' und einen kegelförmigen Teil, der vom zylindrischen Teil mit einem Winkel von 60° nach unten ausgeht und an einem DN-80 und PN-16 Flanschhals endet, an dem ein Heizventil angeordnet ist, durch welches das in dem Reaktor expandierte Material entfernt wird. Das obere Ende des zylindrischen Teils des Zyklons ist von einem 16''-Flansch abgeschlossen, der mit Verschlusszungen und Befestigungselementen ausgestattet ist, welche die Augenschrauben, die den als Deckel des Zyklons fungierenden Blindflansch befestigen, festhalten. Der Zyklon ist mit einem Thermometer und einem Manometer ausgestattet. - Bei dem SSF wird eine Fermentationsablagerung (
10 ) verwendet, die aus rostfreiem Stahl gefertigt und mit einem mechanischen Schüttler, einer pH-Wert- und einer Temperatursteuerung ausgerüstet ist. Am Einlass ist eine Filterpresse (9 ) angeordnet. - Das Verfahren verläuft folgendermassen:
Das gemahlene Material wird in die Dampfexplosionsanlage (2 ) eingefüllt und einem Druck zwischen 1 und 3 MPa und Temperaturen zwischen 190 und 230 °C ausgesetzt, indem aus dem Dampfspeicher (1 ) gesättigter Dampf für einen Zeitraum von zwischen 1 und 10 Minuten, der vom verwendeten Rohmaterial abhängt, eingespritzt wird. Nach Abschluss der Vorbehandlungsstufe wird das Gemisch aus Dampf und Lignocellulose-haltiger Biomasse ausgestossen und in den Entladungszyklon (3 ) horizontal und tangential eingeführt, wo die flüchtigen Bestandteile entfernt werden; anschließend wird es filtriert, um die flüssige Fraktion von der festen Fraktion abzutrennen. Die flüssige Fraktion enthält im Wesentlichen den Hauptteil der Hemicellulosezucker (Xylose, Arabinose, Mannose und Galactose), die Abbauprodukte dieser Zucker (Furfural, Hydroxymethylfurfural), organische Säuren (hauptsächlich Essigsäure) und Phenolverbindungen, die durch die Solubilisierung des Lignin erzeugt worden sind. Die feste Fraktion enthält im Wesentlichen Cellulose und Lignin, und dies wird als Rohmaterial für die Hydrolyse der Cellulose zu Glucose verwendet. Die Glucose ist das Substrat für die Fermentation zu Ethanol. - Nach dem Verlassen der Filterpresse (
9 ) wird das Material in den Fermentationssatz (10 ) eingeführt, wobei das festflüssig-Verhältnis in Abhängigkeit des Materials, das die Lignocellulose-haltige Biomasse bildet, zwischen 8 und 15 % (Gewicht/Volumen) variiert. Nachdem das Material in den Fermentationssatz eingeführt und in geeigneter Weise verdünnt worden ist, werden eine im Handel erhältliche cellulolytische Verbindung (wie z. B. CELLUCLAST 1.5L der Firma NOVO-NORDISK) mit einer Konzentration von 15 Filterpapiereinheiten (FPU; engl: „Filter Paper Units") pro Gramm Cellulose und 12,6 internationale Einheiten β-Glucosidaseenzym, wie z. B. NOVOZYME 188 von NOVO-NORDISK, pro Gramm Cellulose zugesetzt, die beide in Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,8 resuspendiert worden sind. Die Enzymaktivitäten werden nach den von Ghose, T. K. (Pure and Appl. Chem., Band 59, Nummer 2, Seiten 257–268, 1987) beschriebenen Verfahren der IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) durchgeführt. - Wegen der oben erwähnten Hemmung des Endprodukts der cellulolytischen Komplexe stellt ein SSF-Verfahren wie das in dieser Erfindung beschriebene, bei dem die Glucose aus dem Medium entfernt wird, sobald sie produziert ist, eine wesentliche Verbesserung der Hydrolyseausbeute dar. Zu diesem Zweck verwendet die Erfindung einen neuen wärmetoleranten Stamm von Kluyveromyces marxianus (CECT 10875), der einen grundlegenden Vorteil aufweist, da er die Wirkung des Enzymkomplexes mit der Fermentation nahe der Optimaltemperaturen beider Fälle kompatibel macht. Dieser neue Stamm wurde durch chemische Mutagenese aus dem Stamm DER-26 von Kluyveromyces marxianus, der zur Sammlung des Department of Renewable Energies des CIEMAT gehört, erhalten. Der ursprüngliche Stamm wurde verschiedenen Dosen des Alkylierungsmittels Ethylmethansulfonat ausgesetzt und anschließend nach seiner Fähigkeit, bei Temperaturen im Bereich von 42–45 °C zu wachsen und Glucose zu Ethanol zu fermentieren, selektiert, wie in Applied Biochemistry and Biotechnology, Band 39/40, Seiten 201–211 (1993) beschrieben ist. Dieser Stamm ist in der Colección Espaňola de Cultivos Tipo (CECT – Spanish Medium Collection) unter der Hinterlegungsnummer 10876 hinterlegt.
- Bei dem SSF-Verfahren, das Teil dieser Erfindung ist, wird die Fermentationsablagerung (
10 ), die wie oben beschrieben die vorbehandelte Biomasse und den cellulolytischen Komplex enthält, mit einer Suspension eines Mediums des Kluyveromyces marxianus CECT 10875, das bei 42 °C über einen Zeitraum von 16 h bei einer Konzentration von 10 Vol.-% gewachsen ist, inokuliert. Dieses Gemisch wird 72 h mit 150 Upm bei 42 °C geschüttelt. Es wurde gezeigt, dass nach dieser Zeitspanne kein Anstieg der Ethanolkonzentration mehr stattfindet, so dass der Vorgang nach 72 Stunden als abgeschlossen betrachtet wird und die Endkonzentrationen von Ethanol und den restlichen Zuckern im Medium mit HPLC bestimmt werden.
Claims (6)
- Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: Mahlen der lignocellulosehaltigen Biomasse zu einer Partikelgröße von 15–30 mm. Unterziehen der gemahlenen lignocellulosehaltigen Biomasse einer Dampfexplosionvorbehandlung, wobei sie unter einem Druck zwischen 1 und 3 MPa und auf eine Temperatur zwischen 190 und 230°C während eines Zeitraumes zwischen 1 und 10 Minuten gehalten wird, je nach eingesetztem Materialtyp und späteres Auslösen eines schnellen Druckablassen. Einsammeln des vorbehandelten Materials und Trennen der flüssigen und festen Fraktionen durch Filtration und Einbringen der festen Fraktion in die Fermentationsablagerung (
10 ). Zusetzen einer Zellulase zu der Fermentationsablagerung (10 ) in einer Konzentration von 15 FPU per Gramm von Zellulose und 12,6 internationale Einheiten von β-Glukosidase-Enzym. Inokulieren der Fermentationsablagerung (10 ) mit einer Suspension einer Kultur von der thermotolerante Hefe Kluyveromyces marxianus CECT 10875. Rühren der Mischung 72 Stunden bei 42°C. Bestimmen der Konzentration von Ethanol und restlichen Zuckern in der Mischung einmal die Reaktion zu Ende ist. - Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Feuchtigkeitsgehalt der lignocellulosehaltigen Biomasse zwischen 10 und 15% liegt.
- Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die feste Fraktion, die in die Fermentationsablagerung eingebracht ist, ein Flüssig/Fest-Verhältnis hat, das zwischen 8 und 15% (w/v) variiert.
- Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulase und die β-Glukosidase in Zitratpuffer pH 4,8 gelöst werden.
- Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Kluyveromyces marxianus CECT 10875 Inokulum in einer Konzentration von 10% v/v liegt.
- Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung bei 150 Upm gerührt wird.
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