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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, ein Verfahren
zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung und pharmazeutische Zusammensetzungen,
die die neuen Verbindungen enthalten. Die neuen Verbindungen eignen
sich für
die Therapie und insbesondere zur Behandlung von Schmerzen.
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Hintergrund
und Stand der Technik
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Man
hat festgestellt, daß der δ-Rezeptor
bei vielen körperlichen
Funktionen wie z.B. in Kreislauf- und Schmerzsystemen eine Rolle
spielt. Liganden für
den δ-Rezeptor könnten daher
eine potentielle Verwendung als Analgetika und/oder als Mittel gegen
Bluthochdruck finden. Weiterhin wurde gezeigt, daß Liganden
für den δ-Rezeptor
immunmodulatorische Wirkungen haben.
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Wenigstens
drei verschiedene Populationen von Opioidrezeptoren (μ, δ und K) sind
inzwischen gut charakterisiert, und alle drei treten sowohl bei
zentralen als auch bei peripheren Nervensystemen vieler Spezies
einschließlich
des Menschen in Erscheinung. In verschiedenen Tiermodellen wurde
bei Aktivierung eines oder mehrerer dieser Rezeptoren eine analgetische
Wirkung beobachtet.
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Mit
nur wenigen Ausnahmen sind die gegenwärtig verfügbaren selektiven opioiden δ-Liganden
peptidisch und für
eine Verabreichung auf systemischem Wege ungeeignet. Ein Beispiel
für einen
nichtpeptidischen δ-Agonisten ist SNC80
(Bilsky E.J. et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,
273(1), S. 359–366
(1995)). Es besteht jedoch weiterhin ein Bedarf nach selektiven δ-Agonisten,
die nicht nur eine verbesserte Selektivität, sondern auch ein verbessertes
Nebenwirkungsprofil haben.
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Das
der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem war daher, neue
Analgetika mit im Vergleich zu den gegenwärtig Verwendung findenden μ-Agonisten
verbesserter analgetischer Wirkung, jedoch auch mit einem verbesserten
Nebenwirkungsprofil sowie auch mit besserer systemischer Wirksamkeit
zu finden.
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Die
bislang identifizierten Analgetika aus dem Stand der Technik haben
viele Nachteile, da sie eine unvorteilhafte Pharmakokinetik zeigen
und bei einer Verabreichung auf systemischem Wege keine analgetische
Wirkung haben. Weiterhin wurde dokumentiert, daß bevorzugte δ-Agonisten,
die im Stand der Technik beschrieben sind, bei einer systemischen
Verabreichung eine signifikante konvulsive Wirkung haben.
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Es
wurde nun festgestellt, daß bestimmte
Verbindungen, die mit in den Schutzbereich von WO 98/28275 fallen,
jedoch in dieser Schrift nicht spezifisch offenbart werden, überraschenderweise
verbesserte δ-agonistische
Eigenschaften und in-vivo-Wirksamkeit zeigen.
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Kurze Darstellung
der Erfindung
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Die
neuen Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung sind durch die Formel I definiert.
wobei
R
1 ausgewählt ist
aus
wobei
der R
1-Phenylring und der heteroaromatische
R
1-Ring
jeweils unabhängig
voneinander durch 1, 2 oder 3 Substituenten, ausgewählt aus
geradkettigem und verzweigtem C
1-C
6-Alkyl, NO
2, CF
3, C
1-C
6-Alkoxy,
Chlor, Fluor, Brom und Iod weiter substituiert sein können. Die
Substitutionen am Phenylring und am heteroaromatischen Ring können in
einer beliebigen Stellung dieser Ringsysteme erfolgen.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung nach I,
in welcher R1 wie oben definiert ist und
jeder R1-Phenylring
und jeder heteroaromatische R1-Ring unabhängig weiter durch
eine Methylgruppe substituiert sein kann.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung nach I,
in welcher R1 für Pyridinyl, Thienyl oder Furanyl
steht.
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Der
Schutzbereich der Erfindung schließt auch Salze und Enantiomere
der Verbindungen der Formel I sowie Salze von Enantiomeren ein.
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Sind
der Phenylring und der/die heteroaromatische(n) Ring(e) substituiert,
so sind die bevorzugten Substituenten unter CF3,
Methyl, Iod, Brom, Fluor und Chlor ausgewählt.
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Reaktionsschritt
g in Schema 1, siehe unten, wird durchgeführt, indem an ein Zwischenprodukt
der allgemeinen Formel II
in welcher PG für ein Urethan
oder eine benzylähnliche
Schutzgruppe wie Boc steht, in Gegenwart von einer Base, z.B. Na
2CO
3, und unter Einsatz
eines Palladiumkatalysators, z.B. Pd(PPh
3)
4, mit 3-Hydroxyphenylboronsäure umsetzt,
wodurch man die Verbindungen der allgemeinen Formel III erhält
die anschließend unter
Standardbedingungen entschützt
und unter reduktiven Bedingungen mit einer Verbindung der allgemeinen
Formel R
1-CHO alkyliert werden, was Verbindungen
der allgemeinen Formel I liefert.
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Als
Palldiumkatalysatoren eignen sich beispielsweise PdCl2 (mit
einem Phosphin), Pd(OAc)2 (mit einem Phosphin),
Pd(dba)2, PdCl2(dppf)CH2Cl2, Pd(PPh3)4, Pd/C, jedoch
ist diese Aufzählung
nicht erschöpfend.
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Als
Basen eignen sich beispielsweise Triethylamin und Natrium- und Kaliumcarbonat,
jedoch ist diese Aufzählung
nicht erschöpfend.
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Als
Reduktionsmittel eignen sich beispielsweise Natriumcyanoborhydrid
und Natriumtriacetoxyborhydrid, jedoch ist diese Aufzählung nicht
erschöpfend.
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Die
neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich für die Therapie,
insbesondere für die
Behandlung verschiedener Schmerzzustände wie chronische Schmerzen,
neuropathische Schmerzen, akute Schmerzen, Krebsschmerzen, durch
rheumatoide Arthritis verursachte Schmerzen, Migräne, viszerale Schmerzen
usw. Diese Aufzählung
sollte jedoch nicht als erschöpfend
angesehen werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
eignen sich als Immunmodulatoren, insbesondere für Autoimmunerkrankungen wie
Arthritis, für
Hauttransplantationen, Organtransplantationen und ähnliche
chirurgische Bedürfnisse,
für Kollagenerkrankungen,
verschiedene Allergien, für
eine Verwendung als Antitumormittel und als antivirale Mittel.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
eignen sich für
Leiden, bei denen eine Degeneration oder Dysfunktion von Opioidrezeptoren
vorliegt oder in diesem Paradigma impliziert wird. Hierbei kann
es zur Anwendung von isotopenmarkierten Versionen der erfindungsgemäßen Verbindungen
in diagnostischen Verfahren und Anwendungen zur Bilddarstellung
wie der Positronenemissionstomographie (PET) kommen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
eignen sich zur Behandlung von Diarrhöe, Depressionen, Angstzuständen, Harninkontinenz,
verschiedenen Geisteskrankheiten, Husten, Lungenödem, verschiedenen Erkrankungen
des Magen-Darm-Systems, Rückenmarksverletzungen
und Drogenabhängigkeit,
einschließlich der
Behandlung des Mißbrauchs
von Alkohol, Nikotin, Opioiden und anderen Drogen, und für Erkrankungen des
sympathetischen Nervensystems, beispielsweise Bluthochdruck.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
eignen sich als Analgetika für
eine Verwendung während
einer Vollnarkose und einer kontrollierten anästhetischen Betreuung. Um eine
Balance der zur Aufrechterhaltung des anästhetischen Zustands (z.B.
Amnesie, Analgese, Muskelentspannung und Sedation) benötigten Wirkungen
zu erzielen, werden häufig
Kombinationen von Mitteln mit verschiedenen Eigenschaften angewendet. Diese
Kombination schließt
inhalierbare Anästhetika,
Hypnotika, Anxiolytika, neuromuskuläre Blocker und Opioide ein.
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Der
Schutzbereich der Erfindung schließt weiterhin die Verwendung
der Verbindungen gemäß der obigen
Formel I zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines
der oben angesprochenen Leiden ein.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines
an einer der oben angesprochenen Erkrankungen leidenden Patienten,
bei dem man einem einer solchen Behandlung bedürftigen Patienten eine wirksame
Menge einer Verbindung gemäß der obigen
Formel I verabreicht.
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Ein
weiterer Apsekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zwischenprodukte
der allgemeinen Formel II
in welcher PG für ein Urethan
oder eine benzylähnliche
Schutzgruppe wie Boc steht.
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Darstellungsverfahren
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Die
Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung lassen sich nach den folgenden bekannten Vorschriften
darstellen, die beispielsweise in "Advanced Organic Chemistry" 3. Auflage, von
Jerry March, John Wiley and Sons, Inc.; New York (1985); Schritt
(a): S. 848; Schritt (b): S. 848; Schritt (c): S. 657; Schritt (d)
S. 875; Schritt (e): S. 371–373;
Schritt (f): S. 364- 366;
Schritt (g): N. Miyaura und A. Suzuki, Chem. Rev., 95, 2457–2483 (1995);
Schritt (h): "Protective
Groups in Organic Synthesis" S.
327–329,
von Theodora W. Greene und Peter G.M. Wuts, 2. Auflage, John Wiley
and Sons Inc.; New York (1991) beschrieben sind. Diese Literaturstellen
werden hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird nun ausführlicher
durch die folgenden Beispiele beschrieben, durch die die Erfindung
jedoch nicht eingeschränkt
werden soll.
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Beispiel 1
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Darstellung von N,N-Diethyl-4-(3-hydroxyphenylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid
(Verbindung 7)
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(i) Darstellung von 4-(4-Methoxycarbonylbenzyliden)-piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester
(Verbindung 3)
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Eine
Mischung von Verbindung 1 (11,2 g, 49 mmol) und Trimethylphosphit
(25 ml) wurde unter N2 5 Stunden lang auf
Rückfluß erhitzt. Überschüssiges Trimethylphosphit
wurde durch gemeinsames Destillieren mit Toluol entfernt, wodurch
man die Verbindung 2 in quantitativer Ausbeute erhielt: 1H-NMR
(CDCl3) δ 3,20
(d, 2H, J=22 Hz), 3,68 (d, 3H 10,8 Hz), 3,78 (d, 3H, 11,2 Hz), 3,91
(s, 3H), 7,38 (m, 2H), 8,00 (d, 2H, J=8 Hz).
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(ii) Eine Lösung des
obigen Produkts (Verbindung 2)
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In
trockenem THF (200 ml) wurde bei –78°C tropfenweise mit Lithiumdiisopropylamid
(32,7 ml, 1,5 M in Hexan, 49 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung
wurde dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und anschließend mit
N-tert.-Butoxycarbonyl-4-piperidon
(9,76 g, 49 mmol in 100 ml trockenem THF) versetzt. Nach 12 Stunden
wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (300 ml) gequencht und mit
Essigsäureethylester (3 × 300 ml)
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingedampft, wodurch man
ein Rohprodukt erhielt, das durch Flash-Chromatographie aufgereinigt wurde,
was die Verbindung 3 als einen weißen Feststoff (5,64 g, 35%)
lieferte:
IR (NaCl) 3424, 2974, 2855, 1718, 1688, 1606, 1427,
1362, 1276 cm–1;
1H-NMR (CDCl3) δ 1,44 (s,
1H), 2,31 (t, J=5,5 Hz, 2H), 2,42 (t, J=5,5 Hz, 2H), 3,37 (t, J=5,5
Hz, 2H), 3,48 (t, J=5,5 Hz, 2H), 3,87 (s, 3H), 6,33 (s, 1H), 7,20
(d J=6,7 Hz, 2H), 7,94 (d, J=6,7 Hz, 2H); 13C-NMR
(CDCl3) 6 28,3, 29,2, 36,19, 51,9, 123,7,
127,8, 128,7, 129,4, 140,5, 142,1, 154,6, 166,8.
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(iii) Darstellung von
4-Brom-4-[brom-(4-methoxycarbonylphenyl)methyl]piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester (Verbindung
4)
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Eine
Mischung von Verbindung 3 (5,2 g, 16 mmol) und K2CO3 (1,0 g) in trockenem Dichlormethan (200 ml)
wurde bei 0°C
mit einer Lösung
von Brom (2,9 g, 18 mmol) in 3 0 ml CH2Cl2 versetzt. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur
wurde die Lösung
nach Abfiltrieren des K2CO3 kondensiert.
Der Rückstand
wurde dann in Essigsäureethylester
(200 ml) gelöst,
mit Wasser (200 ml), 0,5 M HCl (200 ml) und Kochsalzlösung (200
ml) gewaschen und über
MgSO4 getrocknet. Entfernen der Lösungsmittel
lieferte ein Rohprodukt, das aus Methanol umkristallisiert wurde,
wodurch man die Verbindung 4 als einen weißen Feststoff (6,07 g, 78%)
erhielt:
IR (NaCl) 3425, 2969, 1725, 1669, 1426, 1365, 1279,
1243 cm–1;
1H-NMR (CDCl3) δ 1,28 (s,
9H), 1,75 (m, 2H), 1,90 (m, 2H), 2,1 (m, 4H), 3,08 (br, 4H), 3,90
(s, 3H), 4,08 (br, 4H), 5,14 (s, 1H), 7,57 (d, J=8,4 Hz, 2H) 7,98
(d, J=8,4 Hz, 2H);
13C-NMR (CDCl3) δ 28,3,
36,6, 38,3, 40,3, 52,1, 63,2, 72,9, 129,0, 130,3, 130,4, 141,9,
154,4, 166,3.
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(iv) Darstellung von 4-[Brom-(4-carboxyphenyl)-methylen]piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester
(Verbindung 5)
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Eine
Lösung
von Verbindung 4 (5,4 g, 11 mmol) in Methanol (300 ml) und 2,0 M
NaOH 2,0 M (100 ml) wurde 3 Stunden lang auf 40°C erhitzt. Der Feststoff wurde
abfiltriert und über
Nacht im Vakuum getrocknet. Das trockene Salz wurde in 40% Acetonitril/Wasser
gelöst
und mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 2 eingestellt.
Das gewünschte
Produkt, Verbindung 5, (3,8 9, 87%) wurde durch Filtrieren als weißes Pulver isoliert: 1H-NMR (CDCl3) δ 1,45 (s,
9H), 2,22 (dd, J=5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 2,64 (dd, J=5,5 Hz, 6,1 Hz,
2H), 3,34 (dd, J=5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 3,54 (dd, J=5,5 Hz, 6,1 Hz,
2H), 7,35 (d, J=6,7 Hz, 2H), 8,08 (d, J=6,7 Hz, 2H);
13C-NMR (CDCl3) δ 28,3, 31,5,
34,2, 44,0, 115,3, 128,7, 129,4, 130,2, 137,7, 145,2, 154,6, 170,3.
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(v) Darstellung von 4-[Brom-(4-diethylcarbamoylphenyl)methylen]piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester (Verbindung
6)
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Chlorameisensäureisobutylester
(450 mg, 3,3 mmol) wurde bei –20°C zu einer
Lösung
von Verbindung 5 (1,0 g, 2,5 mmol) in trockenem Dichlormethan (10
ml) gegeben. Nach 20 min bei –20°C wurde mit
Diethylamin (4 ml) versetzt, und der Ansatz wurde auf Raumtemperatur
erwärmen
gelassen. Nach 1,5 Stunden wurden die Lösungsmittel abgedampft, und
der Rückstand
wurde zwischen Essigsäureethylester
und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen
und über
MgSO4 getrocknet. Entfernen der Lösungsmittel
lieferte ein Rohprodukt, das durch Flash-Chromatographie aufgereinigt
wurde, wodurch man die Verbindung 6 als weiße Nadeln (800 mg, 73%) erhielt:
IR (NaCl) 3051, 2975, 1694, 1633, 1416, 1281, 1168, 1115 cm–1; 1H-NMR (CDCl3) δ 1,13 (br,
3H), 1,22 (br, 3H), 1,44 (s, 9H), 2,22 (t, J=5,5 Hz, 2H), 2,62 (t, J=5,5
Hz, 2H), 3,33 (m, 4H), 3,55 (m, 2H), 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,36
(d, J=8,0 Hz, 2H);
13C-NMR (CDCl3) δ 12,71,
14,13, 28,3, 31,5, 34,2, 39,1, 43,2, 79,7, 115,9, 126,3, 129,3,
136,8, 137,1, 140,6, 154,6, 170,5.
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(vi) Darstellung von 3-Hydroxyphenylboronsäure
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3-Bromphenol
(8,65 g, 50 mmol) in trockenem THF (150 ml) wurde bei RT mit Natriumhydrid
(60%, 2,4 g, 60 mmol) behandelt. Nach 1 Stunde wurde die Reaktionslösung bei –78°C tropfenweise
mit sek.-Buthyllithium
(1,3 M, 50 ml, 65 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann
weitere 30 min bei der gleichen Temperatur rühren gelassen, worauf mit Trimethylborat
(15 ml) versetzt wurde. Nach Erwärmen
auf RT über
2 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (50 ml) gequencht
und mit Dichlormethan (2 × 100
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingedampft, wodurch man die
Titelverbindung als einen weißen
Feststoff (4,0 g, 58%) erhielt, der ohne weitere Aufreinigung für die Suzuki-Kupplungsreaktionen
verwendet wurde.
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(vii) Darstellung von
N,N-Diethyl-4-(3-hydroxyphenylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid
(Verbindung 7)
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Eine
Mischung von Verbindung 6 (451 mg, 1,0 mmol), 3-Hydroxyphenylboronsäure (230
mg, 1,7 mmol), Na2CO3 2
M (2,5 ml) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (20 mg) in
Toluol (entgast, 5 ml) und Ethanol (entgast, 5 ml) wurde unter N2 4 Stunden lang unter Rückfluß auf 90°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde
dann auf Raumtemperatur abgekühlt
und mit Essigsäureethylester
(2 × 100
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingedampft, wodurch man
ein Rohprodukt erhielt.
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Das
obige Produkt wurde bei 50°C
2 Stunden lang mit 4,0 M HCl in Dioxan behandelt. Nach dem Eindampfen
wurde der Rückstand
in 1 M HCl (100 ml) gelöst,
und Verunreinigungen wurden mit Diethylether (3 × 100 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase
wurde mit NH4OH basisch gestellt und mit
Dichlormethan (3 × 100
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingedampft, wodurch man
die Titelverbindung 7 (305 mg, 88%) erhielt: 1H-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ 1,12 (3H, br m, CH3CH2-), 1,23 (3H, br m, CH3CH2-), 2,33 (4H, m, CH- Piperidin), 2,89 (4H, m, CH- Piperidin), 3,29
(3H, br m, NH und CH3CH2N-),
3,53 (2H, br m, CH3CH2N-),
4,71 (1H, s, OH), 6,57 (2H, m, ArH), 6,65 (1H, m, ArH), 7,09 (1H,
m, ArH), 7,12 (2H, d, J=8,0 Hz, ArH), 7,28 (2H, d, J= 8,0 Hz, ArH);
HCl-Salz: Schmp. >130°C (Zers.);
IR (NaCl) 2975, 1598, 1442, 1293 cm–1.
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Beispiel 2
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Darstellung von N,N-Diethyl-4-(3-hydroxyphenyl-N-benzylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid
(Verbindung 9)
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(i) Darstellung von N,N-Diethyl-(4-brom-N-benzylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid
(Verbindung 8)
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Die
in Beispiel 1(v) oben dargestellte Verbindung 6 (2,26 g, 5,0 mmol)
wurde bei Raumtemperatur mit TFA (25 ml) in Dichlormethan (25 ml)
behandelt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung eingeengt, wodurch
man einen Rückstand
erhielt, der in Acetonitril (20 ml) gelöst und dann bei RT 2 Stunden
lang mit Benzylbromid (5,0 mmol) umgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung
wurde kondensiert und dann in Essigsäureethylester (100 ml) gelöst. Die
organische Lösung
wurde mit 1 N NH4OH und Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Entfernen der Lösungsmittel
lieferte ein Rohprodukt, das durch Flash-Chromatographie aufgereinigt
wurde, wodurch man die Verbindung 8 als ein Öl (1,0 g, 45%) erhielt: IR
(NaCl) 2971, 1630, 1427, 1287, 1094 cm–1; 1H-NMR
(CDCl3) δ 1,13
(br, 3H), 1,23 (br, 3H), 2,28 (m, 2H), 2,37 (m, 2H), 2,55 (m, 2H),
2,69 (m, 2H), 3,27 (m, 2H), 3,53 (br, 4H), 7,31 (m, 4H).
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(ii) Darstellung von N,N-Diethyl-4-(3-hydroxyphenyl-N-benzylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid
(Verbindung 9)
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Eine
Mischung der oben in Schritt (i) hergestellten Verbindung 8 (600
mg, 1,36 mmol) mit 3-Hydroxyphenylboronsäure (414 mg, 3,0 mmol), 2 M
Na2CO3 (3,0 ml)
und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (20 mg) in Toluol (entgast,
5 ml) und Ethanol (entgast, 5 ml) wurde unter N2 2
Stunden lang auf 90°C
unter Rückfluß erhitzt.
Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und
mit Essigsäureethylester
(2 × 100 ml)
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen
und über
MgSO4 getrocknet. Entfernen der Lösungsmittel
lieferte ein Rohprodukt, das durch Flash-Chromatographie aufgereinigt
wurde, wodurch man die Titelverbindung 9 (482 mg, 78%) erhielt:
IR (NaCl) 3350, 2974, 1606, 1442, 1291 cm–1;
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,11 (3
H, br m, CH3CH2-),
1,24 (3 H, br m, CH3CH2-),
2,36 (4 H, m, CH- Piperidin), 2,46 (4 H, m, CH- Piperidin), 3,26
(2 H, br m, CH3CH2N-),
3,53 (4 H, br m, PhCH2N und CH3CH2N-), 6,53 (1 H, m, ArH), 6,57 (1 H, m, ArH),
6,63 (1 H, m, ArH), 7,07 (3 H, m, ArH), 7,25 (7 H, m, ArH).
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Beispiele 3–11
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Die
Verbindungen 10–18
der Beispiele 3–11
wurden nach den Synthesevorschriften von Schema 2 unten dargestellt.
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Beispiel 3
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Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl)[1-(2-thienylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid
(Verbindung 10)
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Eine
Lösung
des sekundären
Amins (600 mg; 1,65 mmol) in Methanol (15 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit Thiophen-2-carboxaldehyd
(153,8 μl;
1,65 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(1 ml) versetzt. Die Mischung wurde zwei Stunden lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (311 mg; 4,95 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt
und dann mit Wasser versetzt, und die Mischung wurde mit Methylenchlorid
extrahiert.
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Die
vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung durch
Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet: 461,64, (M+1)
beobachtet: 461,06
Anal.: berechnet für (C28H32N2O2S × 1,60 C2HO2F3 × 0,20 H2O): C:57,95%; H:5,30%; N:4,33%; gefunden: C:57,90%;
H:5,34%; N:4,36%
1H-NMR (CD3OD): 7,54 (dd, 1H, J=5,2, 1,6Hz), 7,25 (d,
2H, J=8Hz), 7,23–7,24
(m, 1H), 7,15 (d, 2H, J=8Hz), 7,03-7,08 (m, 2H), 6,58–6,62 (dd, 1H, J=8,0, 2,8Hz),
6,52-6,55 (dd, 1H,
J=7,6, 1,6Hz), 6,44–6,46
(dd, 1H, J=2,8, 1,6Hz), 4,50 (s, 2H), 3,40–3,50 (m, 4H), 3,15–3,25 (m,
2H), 2,95–3,05
(m, 2H), 2,60–2,80
(m, 2H), 2,35–2,45
(m, 2H), 1,10–1,15
(m, 3H), 1,00–1,05
(m, 3H).
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Beispiel 4
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Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl)[1-(3-thienylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid
(Verbindung 11)
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Eine
Lösung
des sekundären
Amins (500 mg; 1,37 mmol) in Methanol (13 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit Thiophen-3-carboxaldehyd
(144,0 μl;
1,65 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(1 ml) versetzt. Die Mischung wurde drei Stunden lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (258 mg; 4,11 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt
und dann mit Wasser versetzt, und die Mischung wurde mit Methylenchlorid
extrahiert. Die wäßrige Phase
wurde mit Kaliumhydrogencarbonat neutralisiert und nochmals mit
Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte
wurden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Aufreinigung durch Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet:
461,64, (M+1) beobachtet: 461,07
Anal.: berechnet für (C28H32N2O2S × 1,10
C2HO2F3 × 0,50 H2O): C:60,96%; H:5,78%; N:4,71 %; gefunden: C:60,97%;
H:5,78%; N:4,65%
1H-NMR (CD3OD): 7,59 (dd, 1H, J=3,2, 1,6Hz), 7,49 (dd,
1H, J=5,2, 3,2Hz), 7,26 (d, 2H, J=8,0Hz), 7,16 (d, 2H, J=8,0Hz),
7,15 (m, 1H), 7,07 (dd, 1H, J=8,0, 7,2Hz), 6,61 (dd, 1H, J=8,0,
2,0Hz), 6,55 (d, 1H, J=7,2Hz), 6,47 (dd, 1H, J=2,0, 1,6Hz), 4,29
(s, 2H), 3,40–3,50
(m, 4H), 3,15–3,25
(m, 2H), 2,95–3,05
(m, 2H), 2,60–2,80
(m, 2H), 2,35–2,45
(m, 2H), 1,15–1,20
(t, 3H, J=6,4Hz), 1,00–1,05
(t, 3H, J=6,4Hz).
-
Beispiel 5
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-[[1-(2-furylmethyl)-4-piperidinyliden](3-hydroxyphenyl)methyl]benzamid
(Verbindung 12)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (500 mg; 1,37 mmol) in Methanol (13 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 2-Furaldehyd
(136,0 μl;
1,65 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(1 ml) versetzt. Die Mischung wurde drei Stunden lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (258 mg; 4,11 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt
und dann mit Wasser versetzt, und die Mischung wurde mit Methylenchlorid
extrahiert. Die wäßrige Phase
wurde mit Kaliumhydrogencarbonat neutralisiert und nochmals mit Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung
durch Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet: 445,57,
(M+1) beobachtet: 445,13
Anal.: berechnet für (C28H32N2O3 × 1,30 C2HO2F3 × 0,10 H2O): C:61,81%; H:5,68%; N:4,71%; gefunden: C:61,88%;
H:5,74%; N:4,73%
1H-NMR (CD3OD): 7,58 (d, 1H, J=1,6Hz), 7,26 (d, 2H,
J=8,0Hz), 7,16 (d, 2H, J=8,0Hz), 7,07 (t, 1H, J=8,0Hz), 6,62–6,64 (m,
1H), 6,60–6,61
(m, 1H), 6,53–6,55
(m, 1H), 6,46–6,47
(m, 1H), 6,43–6,45
(m, 1H), 4,34 (s, 2H), 3,40-3,50
(m, 4H), 3,15–3,25
(m, 2H), 2,95–3,05
(m, 2H), 2,55–2,80
(m, 2H), 2,35–2,50
(m, 2H), 1,15–1,20
(t, 3H, J=6,4Hz), 1,00–1,05
(t, 3H, J=6,4Hz).
-
Beispiel 6
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-([1-(3-furylmethyl)-4-piperidinyliden](3-hydroxyphenyl)methyl]benzamid
(Verbindung 13)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (300 mg; 0,82 mmol) in Methanol (8 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 3-Furaldehyd
(214,0 μl;
2,47 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(0,5 ml) und Natriumcyanoborhydrid (155 mg; 2,47 mmol) versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt,
mit Natriumhydrogencarbonat gequencht und mit Methylenchlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung durch
Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet: 445,57, (M+1)
beobachtet: 445,15
Anal.: berechnet für (C28H32N2O3 × 0,50 C2HO2F3 × 0,10 H2O): C:69,20%; H:6,55%; N:5,56%; gefunden: C:69,14%;
H:6,57%; N:5,28%
1H-NMR (CD3OD): 7,75 (s, 1H), 7,61–7,62 (m, 1H), 7,33 (d, 2H,
J=8,0Hz), 7,23 (d, 2H, J=8,0Hz), 7,13 (dd, 1H, J=8,4, 8,0Hz), 6,66–6,69 (m,
1H), 6,57–6,63
(m, 2H), 6,51–6,53
(m, 1H), 4,22 (s, 2H), 3,45–3,55
(m, 4H), 3,25–3,30
(m, 2H), 2,95–3,10
(m, 2H), 2,65–2,85
(m, 2H), 2,40–2,55
(m, 2H), 1,15–1,25
(m, 3H), 1,05–1,15
(m, 3H).
-
Beispiel 7
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl)[1-(2-pyridinylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid (Verbindung
14)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (384,3 mg; 1,05 mmol) in Methanol (10 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 2-Pyridincarboxaldehyd
(201,0 μl;
2,11 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(1 ml) versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (199 mg; 3,16 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt
und dann mit Wasser versetzt, und die Mischung wurde mit Methylenchlorid
extrahiert. Die wäßrige Phase
wurde mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und nochmals mit
Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte
wurden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Aufreinigung durch Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet:
456,60, (M+1) beobachtet: 456,12
Anal.: berechnet für (C29H33N3O2 × 1,70
C2HO2F3 × 0,40 H2O): C:59,26%; H:5,45%; N:6,40%; gefunden: C:59,21%;
H:5,46%; N:6,35%
1H-NMR (CD3OD): 8,57 (d, 1H, J=5,2Hz), 7,78 (dt, 1H,
J=8,0, 1,2Hz), 7,38(d, 1H, J=8,0Hz), 7,34 (dd, 1H, J=8,0, 5,2Hz),
7,24 (d, 2H, J=8,0Hz), 7,15 (d, 2H, J=8,0Hz), 7,05 (t, 1H, J=8,0Hz),
6,59 (dd, 1H, J=8,0, 2,4Hz), 6,54 (d, 1H, J=8,0Hz), 6,45 (dd, 1H,
J=2,4, 1,2Hz), 4,39 (s, 2H), 3,40–3,46 (m, 2H), 3,26–3,34 (m,
4H), 3,16–3,22
(m, 2H), 2,54–2,64
(m, 4H), 1,13 (t, 3H, J=6,4Hz), 1,01 (t, 3H, J=6,4Hz).
-
Beispiel 8
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl)[1-(4-pyridinylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid (Verbindung
15)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (300 mg; 0,82 mmol) in Methanol (8 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 4-Pyridincarboxaldehyd
(236 μl;
2,47 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(0,5 ml) versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (155 mg; 2,47 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt,
mit Natriumhydrogencarbonat gequencht und mit Methylenchlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung durch
Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet: 456,60, (M+1)
beobachtet: 456,10
Anal.: berechnet für (C29H33N3O2 X
1,80 C2HO2F3 X 0,40 H2O): C:58,61
%; H:5,37%; N:6,29%; gefunden: C:58,64%; H:5,32%; N:6,46%
1H-NMR (CD3OD): 8,64
(s, 2H), 7,61 (d, 2H, J=5, 2Hz), 7,25 (2H, J=8,0Hz), 7,14 (d, 2H,
J=8,0Hz), 7,05 (t, 1H, J=8,0Hz), 6,59 (dd, 1H, J=8,0, 1,6Hz), 6,53
(d, 1H, J=8,0Hz), 6,43–6,46
(m, 1H), 4,34 (s, 2H), 3,42–3,44
(m, 2H), 3,18–3,24
(m, 6H), 2,54–2,57
(m, 4H), 1,13 (t, 3H, J=6,4Hz), 1,02 (t, 3H, J=6,4Hz).
-
Beispiel 9
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl-)[1-(1H-imidazol-2-ylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid
(Verbindung 16)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (300 mg; 0,82 mmol) in Methanol (8 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 2- Imidazolcarboxaldehyd
(237,3 mg; 2,47 mmol) und anschließend mit Essigsäure (0,5
ml) und Natriumcyanoborhydrid (155 mg; 2,47 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt,
mit Natriumhydrogencarbonat gequencht und mit Methylenchlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung durch Umkehrphasenchromatographie.
(M+1)
berechnet: 445,58, (M+1) beobachtet: 445,16
Anal.: berechnet
für (C27H32N4O2 × 2,10
C2HO2F3 × 0,50 H2O): C:54,07%; H:5,11 %; N:8,08%; gefunden: C:54,04%;
H:5,05%; N:8,09%
1H-NMR (CD3OD): 7,38 (s, 2H), 7,20–7,22 (m, 2H), 7,11 (d, 2H,
J=8,0Hz), 7,0 (t, 1H, J=8,0Hz), 6,55 (dd, 1H, J=8,0, 3,6Hz), 6,49–6,50 (m,
1H), 6,42–6,43
(m, 1H), 4,08 (s, 2H), 3,41–3,43
(m, 2H), 3,18–3,20
(m, 3H), 2,79–2,82
(m, 4H), 2,39–2,45
(m, 4H), 1,08–1,16
(m, 3H), 0,96–1,16
(m, 3H).
-
Beispiel 10
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl)[1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid
(Verbindung 17)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (300 mg; 0,82 mmol) in Methanol (10 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 4(5)-Imidazolcarboxaldehyd
(94,9 mg; 0,99 mmol) und anschließend mit Essigsäure (0,5
ml) versetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (62,1 mg; 0,99 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt,
mit Natriumhydrogencarbonat gequencht und mit Methylenchlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung durch Umkehrphasenchromatographie.
(M+1)
berechnet: 445,58, (M+1) beobachtet: 445,16
Anal.: berechnet
für (C27H32N4O2 × 2,20
C2HO2F3)
C:54,23%; H:4,96%; N:8,06%; gefunden: C:54,43%; H:4,99%; N:7,73%
1H-NMR (CD3OD): 8,54
(s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,23 (d, 2H, J=8,4Hz), 7,13 (d, 2H, J=8,0Hz),
7,03 (dd, 1H, J=8,0, 7,6Hz), 6,57–6,59 (m, 1H), 6,51–6,53 (m,
1H); 6,43–6,44
(m, 1H), 4,35 (s, 2H), 3,41–3,43
(m, 2H), 3,18–3,23 (m,
8H), 2,53–2,56
(m, 4H), 1,08–1,16
(m, 3H), 0,96–1,04
(m, 3H).
-
Beispiel 11
-
Darstellung von N,N-Diethyl-4-{(3-hydroxyphenyl)(1-(1,3-thiazol-2-ylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl}benzamid
(Verbindung 18)
-
Eine
Lösung
des sekundären
Amins (143,2 mg; 0,39 mmol) in Methanol (4 ml) wurde bei Raumtemperatur
mit 2-Thiazolcarboxaldehyd
(41,4 μl;
0,47 mmol) und anschließend
mit Essigsäure
(0,2 ml) versetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und
dann mit Natriumcyanoborhydrid (129,6 mg; 1,48 mmol) versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde über
Nacht gerührt,
mit Natriumhydrogencarbonat gequencht und mit Methylenchlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Aufreinigung durch
Umkehrphasenchromatographie.
(M+1) berechnet: 462,63, (M+1)
beobachtet: 462,10
Anal.: berechnet für (C27H31N3O2S × 1,10 C2HO2F3 × 1,10 H2O): C:57,79%; H:5,70%; N:6,92%; gefunden: C:57,75%;
H:5,60%; N:7,13%
1H-NMR (CD3OD): 7,86 (d, 1H, J=4,0Hz), 7,68 (d, 1H,
J=4,0Hz), 7,26 (d, 2H, J=8,0Hz), 7,16 (d, 2H; J=8,0Hz), 7,07 (dd,
1H, J=8,4, 8,0Hz), 6,60–6,62
(m, 1H), 6,54-6,56
(m, 1H), 6,46–6,47
(m, 1H), 4,65 (s, 2H); 3,21-3,45 (m,
8H), 2,56–2,58
(m, 4H), 1,12–1,20
(m, 3H), 1,00–1,08
(m, 3H).
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen
-
Die
neuen Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
oral, intramuskulär,
subkutan, topisch, intranasal, intraperitoneal, intrathorakal, intravenös, epidural,
intrathekal, intracerebroventrikulär und durch Injektion in die
Gelenke verabreicht werden.
-
Eine
bevorzugte Verabreichungsweise ist oral, intravenös oder intramuskulär.
-
Die
Dosierung richtet sich nach der Verabreichungsweise, dem Schweregrad
der Krankheit, dem Alter und Gewicht des Patienten und anderen Faktoren,
die normalerweise vom behandelnden Arzt bei der Festlegung des individuellen
Verabreichungsplans und der für
einen bestimmten Patienten am besten geeigneten Dosierung in Betracht
gezogen werden.
-
Bei
der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen aus den erfindungsgemäßen Verbindungen
können
die inerten, pharmazeutisch annehmbaren Träger entweder fest oder flüssig sein.
Zu den Zubereitungen in fester Form zählen Pulver, Tabletten, dispergierbare
Granulate, Kapseln, Oblatenkapseln und Zäpfchen.
-
Bei
einem festen Träger
kann es sich um eine oder mehrere Substanzen handeln, die auch als
Verdünnungsmittel,
Geschmacksstoffe, Lösungsvermittler,
Gleitmittel, Suspendiermittel, Bindemittel oder Tablettensprengmittel
dienen können;
es kann sich dabei auch um ein Verkapselungsmaterial handeln.
-
Bei
Pulvern handelt es sich bei dem Träger um einen feinteiligen Feststoff,
der sich in einer Mischung mit der feinteiligen aktiven Komponente
befindet. Bei Tabletten wird die aktive Komponente in geeigneten
Verhältnissen
mit dem Träger
mit den erforderlichen Bindungseigenschaften gemischt und zu der
gewünschten Größe und Form
verpreßt.
-
Bei
der Zubereitung von Zäpfchenzusammensetzungen
schmilzt man zunächst
ein Wachs mit niedrigem Schmelzpunkt, wie z.B. eine Mischung aus
Fettsäureglyzeriden
und Kakaobutter, und dispergiert den Wirkstoff darin, beispielsweise
durch Rühren.
Die geschmolzene homogene Mischung wird dann in Formen der entsprechenden
Größe gegossen
und abkühlen
und verfestigen gelassen.
-
Geeignete
Träger
sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Lactose, Zucker,
Pektin, Dextrin, Stärke,
Tragacanth, Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, ein
Wachs mit niedrigem Schmelzpunkt, Kakaobutter und dergleichen.
-
Salze
schließen
pharmazeutisch annehmbare Salze ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele
für pharmazeutisch
annehmbare Salze innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung
schließen die
folgenden ein: Acetat, Benzolsulfonat, Benzoat, Hydrogencarbonat,
Bitartrat, Bromid, Calciumacetat, Camsylat, Carbonat, Chlorid, Citrat,
Dihydrochlorid, Edetat, Edisylat, Estolat, Esylat, Fumarat, Glucaptat,
Gluconat, Glutamat, Glycollylarsanilat, Hexylresorcinat, Hydrabamin,
Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroxynaphthoat, Isethionat, Lactat,
Lactobionat, Malat, Maleat, Mandelat, Mesylat, Methylbromid, Methylnitrat,
Methylsulfat, Mucat, Napsylat, Nitrat, Pamoat (Embonat), Pantothenat,
Phosphat/Diphosphat, Polygalacturonat, Salicylat, Stearat, Subacetat,
Succinat, Sulfat, Tannat, Tartrat, Teoclat, Triethiodid, Benzathin,
Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, Meglumin, Procain,
Aluminium, Calcium, Lithium, Magnesium, Kalium, Natrium und Zink.
-
Beispiele
für pharmazeutisch
nicht annehmbare Salze innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung
schließen
die folgenden ein: Hydroiodid, Perchlorat, Tetrafluorborat.
-
Bevorzugte
pharmazeutisch annehmbare Salze sind die Hydrochloride, Sulfate
und Bitartrate. Besonders bevorzugt sind die Hydrochlorid- und die
Sulfatsalze.
-
Der
Ausdruck „Zusammensetzung" soll die Formulierung
der aktiven Komponente mit Verkapselungsmaterial als Träger, der
eine Kapsel bereitstellt, in der die aktive Komponente (mit oder
ohne andere Träger) von
einem Träger
umgeben ist, mit dem er somit assoziiert ist, einschließen. In ähnlicher
Weise sind Oblatenkapseln eingeschlossen.
-
Tabletten,
Pulver, Oblatenkapseln und Kapseln können als für eine orale Verabreichung
geeignete feste Dosierungsformen verwendet werden.
-
Zu
Flüssigkeit
aus Zusammensetzungen gehören
Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen. Als Beispiel für für eine parenterale Verabreichung
geeignete flüssige
Zubereitungen können
sterile Wasser- oder Wasser-Propylenglykol-Lösungen der
Wirkstoffe angeführt
werden. Flüssige
Zusammensetzungen können auch
in Lösung
in wäßriger Polyethylenglykollösung formuliert
werden.
-
Wäßrige Lösungen für die orale
Verabreichung lassen sich darstellen, indem man die aktive Komponente
in Wasser löst
und wie gewünscht
geeignete Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Stabilisatoren und Verdickungsmittel
zusetzt. Wäßrige Suspensionen
für die
orale Anwendung lassen sich herstellen, indem man die feinteilige
aktive Komponente zusammen mit einem zähflüssigen Material wie natürlichen
synthetischen Gummis, Harzen, Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose
und anderen in der Galenik bekannten Suspendiermitteln in Wasser
dispergiert.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen liegen vorzugsweise in Einheitsdosisform
vor. In dieser Form ist die Zusammensetzung in Einheitsdosen unterteilt,
die entsprechende Mengen der aktiven Komponente enthalten. Bei der
Einheitsdosisform kann es sich um eine abgepackte Zubereitung handeln,
wobei die Packung getrennte Mengen der Zubereitungen enthält, beispielsweise
abgepackte Tabletten, Kapseln und Pulver in Vials oder Ampullen.
Bei der Einheitsdosisform kann es sich auch selbst um eine Kapsel,
eine Oblatenkapsel oder eine Tablette handeln oder um die entsprechende
Anzahl einer dieser abgepackten Formen.
-
BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG
-
in-vitro-Modell
-
Zellkultur
-
- A. Humane 293S-Zellen, die klonierte humane μ-, δ und κ-Rezeptoren
exprimierten und neomycinresistent waren, wurden in Suspension bei
37°C und
5% CO2 in Schüttelflaschen, die calciumfreies
DMEM 10% FBS, 5% BCS, 0,1% Pluronic F-68 und 600 μg/ml Geneticin
enthielten, herangezogen.
- B. Mäuse-
und Rattenhirne wurden gewogen und mit eiskaltem PBS (mit 2,5 mM
EDTA, pH 7,4) abgespült. Die
Hirne wurden mit einem Polytron 15 sec (Maus) bzw. 30 sec (Ratte)
in eiskaltem Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7,0, 2,5 mM EDTA, wobei
unmittelbar vor der Verwendung 0,5 MmM einer 0,5 M Stammlösung in DMSO
mit Phenylmethylsulfonylfluorid versetzt wurden) homogenisiert.
-
Membranzubereitung
-
Die
Zellen wurden pelletiert und in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7,0,
2,5 mM EDTA, wobei unmittelbar vor der Verwendung aus einer 0,1
M Stammlösung
in Ethanol PMSF bis zu einer Konzentration von 0,1 mM zugesetzt
wurde) resuspendiert, 15 min auf Eis inkubiert und dann 30 s mit
einem Polytron homogenisiert. Die Suspension wurde bei 4°C 10 min
lang bei 1000 g (max) zentrifugiert. Der Überstand wurde auf Eis zurückgelegt,
und die Pellets wurden resuspendiert und wie oben zentrifugiert.
Die Überstände aus
beiden Zentrifugierungen wurden vereinigt und 30 min bei 46.000
g (max) zentrifugiert. Die Pellets wurden in kaltem Tris-Puffer (50
mM Tris/Cl, pH 7,0) resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Die
letztendlich erhaltenen Pellets wurden in Membranpuffer (50 mM Tris,
0,32 M Saccharose, pH 7,0) resuspendiert. Aliquots (1 ml) in Polypropylenröhrchen wurden
in Trockeneis/Ethanol gefroren und bis zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt.
Die Proteinkonzentrationen wurden durch einen modifizierten Lowry-Assay
mit SDS bestimmt.
-
Bindungsassays
-
Die
Membranen wurden bei 37°C
aufgetaut, auf Eis gekühlt,
3mal durch eine 25-G-Nadel gegeben und in Bindungspuffer (50 mM
Tris, 3 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA (Sigma A-7888),
pH 7,4, der nach dem Filtrieren durch einen 0,22-m-Filter bei 4°C aufbewahrt
und dann frisch mit 5 μg/ml
Aprotinin, 10 μM
Bestatin und 10 μM Diprotin
A ohne DDT versetzt worden war) verdünnt. 100- μl-Aliquots
wurden in eisgekühlte
12×75-mm-Polypropylenröhrchen gegeben,
die 100 μl
des entsprechenden Radioliganden und 100 μl Testverbindung in verschiedenen
Konzentrationen enthielten. Die Gesamtbindung (TB) und die nichtspezifische
Bindung (NS) wurden in Abwesenheit bzw. Gegenwart von 10 μM Naloxon
bestimmt. Die Röhrchen
wurden gevortext und 60-75 min
bei 25°C
inkubiert, woraufhin die Inhalte schnell vakuumfiltriert und mit
etwa 12 ml/Röhrchen
eiskaltem Waschpuffer (50 mM Tris, pH 7,0, 3 mM MgCl2)
durch GF/B-Filter (Whatman), die wenigstens 2 h in 0,1% Polyethylenimin
voreingeweicht worden waren, gewaschen wurden. Die auf den Filtern
zurückgehaltene
Radioaktivität
(dpm) wurde mit einem Beta-Zähler
gemessen, nachdem die Filter wenigstens 12 h in Minivials mit 6–7 ml Szintillationsflüssigkeit
eingeweicht worden waren. Wird der Assay in Platten mit 96 tiefen
Vertiefungen durchgeführt,
so erfolgt die Filtration durch in PEI eingeweichte Unifilter mit
96 Vertiefungen, die mit 3 × 1
ml Waschpuffer gewaschen und 2 h bei 55°C in einem Ofen getrocknet wurden.
Die Filterplatten wurden nach Zugabe von 50 μl MS-20-Szintillationsflüssigkeit/Vertiefung in einem
TopCount (Packard) ausgezählt.
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Funktionsassays
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Die
Agonistenaktivität
der Verbindungen wird gemessen, indem man das Ausmaß bestimmt,
zu dem der Komplex aus Verbindung und Rezeptor die Bindung von GTP
an die G-Proteine,
an die die Rezeptoren gekoppelt sind, aktiviert. Beim GTP-Bindungsassay
wird GTP[γ]35S mit den Testverbindungen und den Membranen
von HEK-293S-Zellen, die die klonierten humanen Opioidrezeptoren
exprimieren, oder von homogenisiertem Ratten- und Mäusehirn
kombiniert. Agonisten stimulieren die GTP[γ]35S-Bindung
in diesen Membranen. Die EC50- und Emax-Werte
der Verbindungen werden aus den Dosis-Reaktions-Kurven bestimmt. Mit dem delta-Antagonisten
Naltrindol werden Rechtsverschiebungen der Dosis-Reaktions-Kurve
vorgenommen, wodurch verifiziert wird, daß die Agonistenaktivität über delta-Rezeptoren
vermittelt wird.
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Datenanalyse
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Die
spezifische Bindung (SB) wurde als TB-NS berechnet, und die SB in
Gegenwart von verschiedenen Testverbindungen wurde in Prozent der
Kontroll-SB ausgedrückt.
Die IC50-Werte und Hill-Koeffizienten (nH) für
Liganden beim Verdrängen
von spezifisch gebundenen Radioliganden wurden aus Logit-Auftragungen oder
mittels Kurvenanpassungsprogrammen wie Ligand, GraphPad Prism, Sigma-Plot
oder ReceptorFit berechnet. Die Ki-Werte
wurden aus der Cheng-Prussoff-Gleichung berechnet. Für Liganden,
die in wenigstens drei Verdrängungskurven
getestet wurden, wurden Mittelwert ± Standardabweichung von IC50, Ki und nH angegeben. Die biologischen Daten sind
auf den folgenden Seiten in Tabelle 1 aufgeführt.
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Tabelle
1: biologische Daten
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Experimente zur Rezeptorabsättigung
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Die
Radioligand-Kδ-Werte
wurden bestimmt, indem man die Bindungsassays auf Zellmembranen
mit den entsprechenden Radioliganden bei Konzentrationen im Bereich
vom 0,2fachen bis zum 5fachen des geschätzten Kδ (bis zum 10fachen Wert, wenn
die erforderlichen Mengen an Radioligand nicht unpraktisch sind) durchführt. Die
spezifische Radioligandenbindung wurde in pmol/mg Membranprotein
ausgedrückt.
Die Werte für
Kδ und Bmax aus den einzelnen Experimenten wurden
aus den nichtlinearen Anpassungen von spezifisch gebundenen (B)
gegenüber
nM freien (F) Radioliganden von einem individuellen gemäß einem
Ein-Stellen-Modell erhalten.
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BESTIMMUNG
DER MECHANOALLODYNIE MIT DEM VON-FREY-TEST
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Der
Test wurde zwischen 08:00 und 16:00 Uhr unter Anwendung der von
Chaplan et al. (1994) beschriebenen Methode durchgeführt. Ratten
wurden in Käfige
aus Plexiglas auf einem Boden aus Drahtnetz, der Zugang zu der Pfote
erlaubte, gesetzt, woraufhin sich die Tiere 10–15 min eingewöhnen konnten.
Bei der getesteten Region handelte es sich um die Mitte der Sohle
der linken Hinterpfote, wodurch die weniger empfindlichen Fußballen
vermieden wurden. Die Pfote wurde mit einer Reihe von 8 Von-Frey-Haaren
mit logarithmisch zunehmender Steifheit (0,41, 0,69, 1,20, 2,04,
3,63, 5,50, 8,51, und 15,14 Gramm, Stoelting, Ill., USA) berührt. Das
Von-Frey-Haar wurde von der Unterseite des Bodennetzes senkrecht
zur Oberfläche
der Sohle herangeführt,
mit einer Kraft, die so stark war, daß es gegen die Pfote zu einer
leichten Verbiegung kam, und ungefähr 6–8 Sekunden gehalten. Eine
positive Reaktion wurde festgehalten, wenn die Pfote ruckartig zurückgezogen
wurde. Ein Zucken während
des Entfernens des Haars wurde ebenfalls als positive Reaktion gewertet.
Ein Umherwandern wurde als zweideutige Reaktion betrachtet, und
in diesen Fällen
wurde der Stimulus wiederholt.
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TESTVERFAHREN
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In
der mit FCA behandelten Gruppe wurden die Tiere am Tag 1 nach der
Operation getestet. Die Schwelle, bei der es bei 50% zu einem Zurückziehen
kam, wurde mit der Up-Down-Methode von Dixon (1980) bestimmt. Der
Test wurde mit dem 2,04-g-Haar aus der Mitte der Reihe begonnen.
Die Stimuli wurden in jedem Fall in einer aufeinanderfolgenden Weise
präsentiert,
gleich ob ansteigend oder absteigend. Kam es bei dem zunächst ausgewählten Haar
nicht zu einer Reaktion, bei der die Pfote zurückgezogen wurde, so wurde ein stärkerer Stimulus
präsentiert;
wurde die Pfote zurückgezogen,
so wurde der nächstschwächere Stimulus
gewählt.
Für eine
optimale Schwellenwertberechnung mittels dieser Methode sind 6 Reaktionen
in unmittelbarer Nähe
des 50%-Schwellenwerts
erforderlich, wobei mit dem Zählen
dieser 6 Reaktionen begonnen wurde, wenn die erste Reaktionsveränderung
auftrat, z.B. wenn der Schwellenwert das erste Mal überschritten
wurde. In Fällen,
bei denen die Schwellenwerte außerhalb
des Stimulusbereichs fielen, wurden Werte von 15,14 (normale Empfindlichkeit)
beziehungsweise 0,41 (maximal allodyn) zugeordnet. Das so erhaltene
Muster an positiven und negativen Reaktionen wurde tabellarisch
erfaßt,
wobei X = kein Zurückziehen,
0 = Zurückziehen
ist, und der Schwellenwert, bei der es bei 50% zu einem Zurückziehen
kam, wurde mit der Formel:
interpoliert, mit Xf = Wert
des letzten verwendeten Von-Frey-Haars (log-Einheiten); k = Tabellenwert
(aus Chaplan et al. (1994)) für
das Muster von positiven/negativen Reaktionen; und δ = mittlerer
Unterschied zwischen Stimuli (log-Einheiten). Hier ist δ = 0,224.
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Die
Von-Frey-Schwellenwerte wurden gemäß Chaplan et al., 1994, in
Prozent der maximal erzielbaren Wirkung (% MPE (maximum possible
effect)) umgerechnet. Zur Berechnung von % MPE wurde die folgende Gleichung
angewendet:
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VERABREICHUNG VON TESTSUBSTANZ
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Vor
dem Von-Frey-Test wurde den Ratten eine Testsubstanz injiziert (subkutan,
intraperitoneal, intravenös
oder oral); die Zeitspanne zwischen der Verabreichung der Testverbindung
und dem Von-Frey-Test richtete sich nach der Art der Testverbindung.
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KRÜMMUNGSTEST
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Bei
intraperitonealer Verabreichung an Mäuse löst Essigsäure Kontraktionen in der Bauchgegend
aus. Die Mäuse
strecken dann ihren Körper
auf eine typische Weise. Werden analgetische Arzneimittel verabreicht, so
wird diese beschriebene Bewegung weniger häufig beobachtet, und das Arzneimittel
wird als potentieller guter Kandidat ausgewählt.
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Als
vollständiger
und typischer Krümmungsreflex
werden nur die betrachtet, bei denen die folgenden Elemente vorhanden
sind: Das Tier befindet sich nicht in Bewegung; der untere Rücken ist
leicht durchgedrückt;
von beiden Pfoten sind die Sohlen zu sehen. In diesem Assay zeigen
Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine signifikante Inhibierung
der Krümmungsreaktionen
nach oraler Verabreichung von 1–100 μmol/kg.
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(i) Zubereitung der Lösungen
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Essigsäure (AcOH):
120 μl Essigsäure werden
zu 19,88 ml destilliertem Wasser gegeben, so daß man ein Endvolumen von 20
ml mit einer Endkonzentration von 0,6% AcOH erhält. Die Lösung wird dann gemischt (Vortex)
und ist fertig für
die Injektion.
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Verbindung
(Arzneimittel): Die einzelnen Verbindungen werden hergestellt und
nach Standardvorschriften in dem am besten geeigneten Vehikel gelöst.
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(ii) Verabreichung der
Lösungen
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Die
Verbindung (das Arzneimittel) wird 20, 30 oder 40 Minuten (entsprechend
der Klasse der Verbindung und ihren Eigenschaften) vor dem Test
oral, intraperitoneal (i.p.), subkutan (s.c.) oder intravenös (i.v.)
in einer Dosis von 10 ml/kg (unter Beachtung des durchschnittlichen
Körpergewichts
der Mäuse)
verabreicht. Bei zentraler Verabreichung der Verbindung: Ein Volumen
von 5 μl
wird intraventrikulär
(i.c.v.) oder intrathekal (i.t.) verabreicht.
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Die
AcOH wird unmittelbar vor dem Test an zwei Stellen in einer Dosis
von 10 ml/kg (wobei das durchschnittliche Körpergewicht der Mäuse beachtet
wird) intraperitoneal (i.p.) verabreicht.
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(iii) Test
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Das
Tier (Maus) wird über
einen Zeitraum von 20 Minuten beobachtet, und die Anzahl an Ereignissen (Krümmungsreflexen)
wird aufgezeichnet und am Ende des Experiments zusammengestellt.
Die Mäuse
werden einzeln in „Schuhkarton"-Käfigen mit
Kontaktstreu gehalten. Gewöhnlich
werden insgesamt 4 Mäuse gleichzeitig
beobachtet: eine Kontrolle und drei, denen Arzneimittel verabreicht
worden ist.