DE602004002933T2

DE602004002933T2 - 4-ä'3-(SULFONYLAMINO)PHENYLÜ'1-(CYCLYMETHYL)PIPERIDIN-4-YLIDENEÜMETHYLüBENZAMIDEDERIVATE ALS DELTA-OPIOID-REZEPTORLIGANDEN ZUR BEHANDLUNG VON SCHMERZEN,ANGSTZUSTÄNDEN UND FUNKTIONELLEN GASTROINTESTINALEN ERKRANKUNGEN

Info

Publication number: DE602004002933T2
Application number: DE602004002933T
Authority: DE
Inventors: William St Laurent BROWN; Andrew St. Laurent GRIFFIN; Christopher St. Laurent WALPOLE
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2003-01-16
Filing date: 2004-01-13
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2024-01-14
Also published as: TW200500356A; US20060148850A1; AR042885A1; JP2006515352A; SE0300104D0; ATE343571T1; DE602004002933D1; WO2004063193A1; ES2274415T3; EP1590346B1; EP1590346A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die neuen Verbindungen enthalten. Die neuen Verbindungen eignen sich für die Therapie und insbesondere zur Behandlung von Schmerzen, Angstzuständen und funktionellen gastrointestinalen Erkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Man hat festgestellt, daß der Rezeptor bei vielen körperlichen Funktionen wie z.B. in Kreislauf- und Schmerzsystemen eine Rolle spielt. Liganden für den δ-Rezeptor könnten daher eine potentielle Verwendung als Analgetika und/oder als Mittel gegen Bluthochdruck finden. Weiterhin wurde gezeigt, daß Liganden für den δ-Rezeptor immunmodulatorische Wirkungen haben.
Wenigstens drei verschiedene Populationen von Opioidrezeptoren (μ, δ und κ) sind inzwischen gut charakterisiert, und alle drei treten sowohl bei zentralen als auch bei peripheren Nervensystemen vieler Spezies einschließlich des Menschen in Erscheinung. In verschiedenen Tiermodellen wurde bei Aktivierung eines oder mehrerer dieser Rezeptoren eine analgetische Wirkung beobachtet.
Mit nur wenigen Ausnahmen sind die gegenwärtig verfügbaren selektiven opioiden δ-Liganden peptidisch und für eine Verabreichung auf systemischem Wege ungeeignet. Ein Beispiel für einen nichtpeptidischen δ-Agonisten ist SNC80 (Bilsky E.J. et al., Journal of Pharmacology und Experimental Therapeutics, 273 (1), S. 359-366 (1995)).
Viele bislang identifizierte δ-Agonisten aus dem Stand der Technik haben viele Nachteile, da sie eine unvorteilhafte Pharmakokinetik zeigen und bei einer Verabreichung auf systemischem Wege keine analgetische Wirkung haben. Weiterhin wurde dokumentiert, daß viele dieser δ-Agonisten bei einer systemischen Verabreichung eine signifikante konvulsive Wirkung haben.
In der US-Patentschrift Nr. 6,187,792 von Delorme et al. werden einige δ-Agonisten beschrieben.
Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an verbesserten δ-Agonisten.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wenn in dieser Beschreibung nicht anders angegeben folgt die in dieser Beschreibung verwendete Nomenklatur im allgemeinen den Beispielen und Regeln, die in Nomenclature of Organic Chemistry, Abschnitte A, B, C, D, E, F und H, Pergamon Press, Oxford, 1979, angeführt sind, wobei dieses Dokument hinsichtlich seiner beispielhaften Namen für chemische Strukturen und seiner Regeln für die Benennung chemischer Strukturen durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Beschreibung wird. Gegebenenfalls läßt sich der Name einer Verbindung mit einem Programm zur Benennung chemischer Verbindungen erstellen: ACD/ChemSketch, Version 5.09/September 2001, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canada.
Der für sich oder als Präfix verwendete Ausdruck „C_m-n" oder „C_m-n-Gruppe" bezieht sich auf eine beliebige Gruppe mit m bis n Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Kohlenwasserstoff" bezieht sich auf eine beliebige Struktur, die ausschließlich Kohlenstoff- und Wasserstoffatome und bis zu 14 Kohlenstoffatome enthält.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Kohlenwasserstoffrest" oder „Hydrocarbyl" bezieht sich auf eine beliebige Struktur, die man erhält, wenn man ein oder mehrere Wasserstoffe aus einem Kohlenwasserstoff entfernt.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Alkyl" bezieht sich auf monovalente geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen. Wenn nicht anders angegeben schließt „Alkyl" im allgemeinen sowohl gesättigtes Alkyl als auch ungesättigtes Alkyl ein.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Alkylen" bezieht sich auf divalente geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen, die dazu dienen, zwei Strukturen miteinander zu verbinden.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Alkenyl" bezieht sich auf einen monovalenten geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und mit wenigstens 2 bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Alkinyl" bezieht sich auf einen monovalenten geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung und mit wenigstens 2 bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Cycloalkyl" bezieht sich auf einen monovalen ten ringhaltigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens 3 bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Cycloalkenyl" bezieht sich auf einen monovalenten ringhaltigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und mit wenigstens 3 bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Cycloalkinyl" bezieht sich auf einen monovalenten ringhaltigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung und mit etwa 7 bis zu etwa 12 Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Aryl" bezieht sich auf einen monovalenten Kohlenwasserstoffrest mit einem oder mehreren mehrfach ungesättigten Kohlenstoffringen mit aromatischem Charakter (zum Beispiel 4n + 2 delokalisierte Elektronen) und mit 5 bis zu etwa 14 Kohlenstoffatomen.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Arylen" bezieht sich auf einen divalenten Kohlenwasserstoffrest mit einem oder mehreren mehrfach ungesättigten Kohlenstoffringen mit aromatischem Charakter (zum Beispiel 4n + 2 delokalisierte Elektronen) und mit 5 bis zu etwa 14 Kohlenstoffatomen, der dazu dient, zwei Strukturen miteinander zu verbinden.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heterocyclus" bezieht sich auf eine ringhaltige Struktur bzw. ein ringhaltiges Molekül mit einem oder mehreren unabhängig voneinander aus N, O und S ausgewählten multivalenten Heteroatomen als Teil der Ringstruktur und einschließlich wenigstens 3 und bis zu etwa 20 Atomen im Ring/in den Ringen. Der Heterocyclus kann gesättigt oder ungesättigt sein, eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten, und der Heterocyclus kann mehr als einen Ring umfassen. Umfaßt ein Heterocyclus mehr als einen Ring, so können die Ringe kondensiert oder nicht kondensiert sein. Kondensierte Ringe bezieht sich im allgemeinen auf wenigstens zwei Ringe, die sich wenigstens zwei Atome teilen. Der Heterocyclus kann einen aromatischen Charakter haben oder keinen aromatischen Charakter haben.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heteroalkyl" bezieht sich auf einen Rest, der gebildet wird, wenn man ein oder mehrere Kohlenstoffatome eines Alkylrests durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus N, O und S ersetzt.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „heteroaromatische Gruppe" bezieht sich auf eine ringhaltige Struktur bzw. ein ringhaltiges Molekül mit einem oder mehreren unabhängig voneinander aus N, O und S ausgewählten multivalenten Heteroatomen als Teil der Ringstruktur und einschließlich wenigstens 3 und bis zu etwa 20 Atomen im Ring/in den Ringen, wobei die ringhaltige Struktur bzw. das ringhaltige Molekül einen aromatischen Charakter hat (zum Beispiel 4n + 2 delokalisierte Elektronen).
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „heterocyclische Gruppe", „heterocyclische Einheit", „heterocyclisch" oder „heterocyclo" bezieht sich auf einen von einem Heterocyclus durch Entfernen eines oder mehrerer Wasserstoffatome abgeleiteten Rest.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heterocyclyl" bezieht sich auf einen von einem Heterocyclus durch Entfernen eines Wasserstoffatoms abgeleiteten monovalenten Rest.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heterocyclylen" bezieht sich auf einen von einem Heterocyclus durch Entfernen von zwei Wasserstoffatomen abgeleiteten divalenten Rest, der dazu dient, zwei Strukturen miteinander zu verbinden.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heteroaryl" bezieht sich auf eine Heterocyclylgruppe mit aromatischem Charakter.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heterocycloalkyl" bezieht sich auf eine Heterocyclylgruppe ohne aromatischen Charakter.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heteroarylen" bezieht sich auf eine Heterocyclylengruppe mit aromatischem Charakter.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Heterocycloalkylen" bezieht sich auf eine Heterocyclylengruppe ohne aromatischen Charakter.
Der als Präfix verwendete Ausdruck „sechsgliedrig" bezieht sich auf eine Gruppe mit einem Ring mit sechs Ringatomen.
Der als Präfix verwendete Ausdruck „fünfgliedrig" bezieht sich auf eine Gruppe mit einem Ring mit fünf Ringatomen.
Eine Heteroarylgruppe mit einem fünfgliedrigen Ring ist eine Heteroarylgruppe mit einem Ring mit fünf Ringatomen, wobei 1, 2 oder 3 Ringatome unabhängig voneinander aus N, O und S ausgewählt sind.
Heteroarylgruppen mit einem fünfgliedrigen Ring sind zum Beispiel Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Pyrazolyl, Isothiazolyl, Isoxazolyl, 1,2,3-Triazolyl, Tetrazolyl, 1,2,3-Thiadiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,4-Triazolyl, 1,2,4-Thiadiazolyl, 1,2,4-Oxadiazolyl, 1,3,4-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl und 1,3,4-Oxadiazolyl.
Eine Heteroarylgruppe mit einem sechsgliedrigen Ring ist eine Heteroarylgruppe mit einem Ring mit sechs Ringatomen, wobei 1, 2 oder 3 Ringatome unabhängig voneinander aus N, O und S ausgewählt sind.
Heteroarylgruppen mit einem sechsgliedrigen Ring sind zum Beispiel Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Triazinyl und Pyridazinyl.
Der als Präfix verwendete Ausdruck „substituiert" bezieht sich auf eine Struktur, ein Molekül oder eine Gruppe, wobei ein oder mehrere Wasserstoffatome durch eine oder mehrere C_1-12-Kohlenwasserstoffgruppen oder ein oder mehrere chemische Gruppen mit einem oder mehreren Heteroatomen ausgewählt aus N, O, S, F, Cl, Br, I und P ersetzt sind. Beispielhafte chemische Gruppen mit einem oder mehreren Heteroatomen schließen Heterocyclyl, -NO₂, -OR, Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R, Oxo (=O), Imino (=NR), Thio (=S) und Oximino (=N-OR) ein, wobei „R" jeweils für C_1-12-Hydrocarbyl steht. So kann sich substituiertes Phenyl beispielsweise auf Nitrophenyl, Pyridylphenyl, Methoxyphenyl, Chlorphenyl, Aminophenyl usw. beziehen, wobei die Nitro-, Pyridyl-, Methoxy-, Chlor- und Aminogruppen jedes geeignete Wasserstoffatom am Phenylring ersetzen können.
Der als Suffix einer ersten Struktur, eines ersten Moleküls oder einer ersten Gruppe verwendete Ausdruck „substituiert", auf den ein oder mehrere Namen chemischer Gruppen folgen, bezieht sich auf eine zweite Struktur, ein zweites Molekül bzw. eine zweite Gruppe, die sich als Folge des Ersetzens eines oder mehrerer Wasserstoffatome der ersten Struktur, des ersten Moleküls bzw. der ersten Gruppe durch die eine oder mehreren angeführten chemischen Gruppen ergeben. So bezieht sich zum Beispiel „Phenyl substituiert durch Nitro" auf Nitrophenyl.
Der Ausdruck „gegebenenfalls substituiert" bezieht sich sowohl auf substituierte als auch nicht substituierte Gruppen, Strukturen bzw. Moleküle.
Heterocyclus schließt beispielsweise monocyclische Heterocyclen wie Aziridin, Oxiran, Thiiran, Azetidin, Oxetan, Thietan, Pyrrolidin, Pyrrolin, Imidazolidin, Pyrazolidin, Pyrazolin, Dioxolan, Sulfolan, 2,3-Dihydrofuran, 2,5-Dihydrofuran, Tetrahydrofuran, Thiophan, Piperidin, 1,2,3,6-Tetrahydropyridin, Piperazin, Morpholin, Thiomorpholin, Pyran, Thiopyran, 2,3-Dihydropyran, Tetrahydropyran, 1,4-Dihydropyridin, 1,4-Dioxan, 1,3-Dioxan, Dioxan, Homopiperidin, 2,3,4,7-Tetrahydro-1H-azepin, Homopiperazin, 1,3-Dioxepan, 4,7-Dihydro-1,3-dioxepin und Hexamethylenoxid ein.
Darüber hinaus schließt Heterocyclus aromatische Heterocyclen ein, zum Beispiel Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Thiophen, Furan, Furazan, Pyrrol, Imidazol, Triazol, Oxazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, 1,2,3-Triazol, Tetrazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Triazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,3,4-Triazol, 1,3,4-Thiadiazol und 1,3,4-Oxadiazol.
Zusätzlich umfaßt Heterocyclus polycyclische Heterocyclen, zum Beispiel Indol, Indolin, Isoindolin, Chinolin, Tetrahydrochinolin, Isochinolin, Tetrahydroisochinolin, 1,4-Benzodioxan, Coumarin, Dihydrocoumarin, Benzofuran, 2,3-Dihydrobenzofuran, Isobenzofuran, Chromen, Chroman, Isochroman, Xanthen, Phenoxathiin, Thianthren, Indolizin, Isoindol, Indazol, Purin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, Phenanthridin, Perimidin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenothiazin, Phenoxazin, 1,2-Benzisoxazol, Benzothiophen, Benzoxazol, Benzthiazol, Benzimidazol, Benztriazol, Thioxanthin, Carbazol, Carbolin, Acridin, Pyrolizidin und Chinolizidin.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen polycyclischen Heterocyclen schließt Heterocyclus polycyclische Heterocyclen ein, in denen die Ringfusion zwischen zwei oder mehreren Ringen mehr als eine gemeinsame Bindung zwischen den beiden Ringen und mehr als zwei beiden Ringen gemeinsame Atome umfaßt. Beispiele für solche überbrückten Heterocyclen schließen Chinuclidin, Diazabicyclo[2.2.1]heptan und 7-Oxabicyclo[2.2.1]heptan ein.
Heterocyclyl schließt beispielsweise monocyclische Heterocyclyle wie Aziridinyl, Oxiranyl, Thiiranyl, Azetidinyl, Oxetanyl, Thietanyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Pyrazolinyl, Dioxolanyl, Sulfolanyl, 2,3-Dihydrofuranyl, 2,5-Dihydrofuranyl, Tetrahydrofuranyl, Thiophanyl, Piperidinyl, 1,2,3,6-Tetrahydropyridinyl, Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Pyranyl, Thiopyranyl, 2,3-Dihydropyranyl, Tetrahydropyranyl, 1,4-Dihydropyridinyl, 1,4-Dioxanyl, 1,3-Dioxanyl, Dioxanyl, Homopiperidinyl, 2,3,4,7-Tetrahydro-1H-azepinyl, Homopiperazinyl, 1,3-Dioxepanyl, 4,7-Dihydro-1,3-dioxepinyl und Hexamethylenoxidyl ein.
Darüber hinaus schließt Heterocyclyl aromatische Heterocyclyle bzw. Heteroaryl, zum Beispiel Pyridinyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Thienyl, Furyl, Furazanyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Triazolyl, Oxazolyl, Pyrazolyl, Isothiazolyl, Isoxazolyl, 1,2,3-Triazolyl, Tetrazolyl, 1,2,3-Thiadiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,4-Triazolyl, 1,2,4-Thiadiazolyl, 1,2,4-Oxadiazolyl, 1,3,4-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl und 1,3,4-Oxadiazolyl ein.
Zusätzlich umfaßt Heterocyclyl polycyclische Heterocyclyle (sowohl aromatische und nichtaromatische), zum Beispiel Indolyl, Indolinyl, Isoindolinyl, Chinolinyl, Tetrahydrochinolinyl, Isochinolinyl, Tetrahydroisochi nolinyl, 1,4-Benzodioxanyl, Coumarinyl, Dihydrocoumarinyl, Benzofuranyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Isobenzofuranyl, Chromenyl, Chromanyl, Isochromanyl, Xanthenyl, Phenoxathiinyl, Thianthrenyl, Indolizinyl, isoindolyl, Indazolyl, Purinyl, Phthalazinyl, Naphthyridinyl, Chinoxalinyl, Chinazolinyl, Cinnolinyl, Pteridinyl, Phenanthridinyl, Perimidinyl, Phenanthrolinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxazinyl, 1,2-Benzisoxazolyl, Benzothiophenyl, Benzoxazolyl, Benzthiazolyl, Benzimidazolyl, Benztriazolyl, Thioxanthinyl, Carbazo-lyl, Carbolinyl, Acridinyl, Pyrolizidinyl und Chinolizidinyl.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen polycyclischen Heterocyclylen schließt Heterocyclyl polycyclische Heterocyclyle ein, in denen die Ringfusion zwischen zwei oder mehreren Ringen mehr als eine gemeinsame Bindung zwischen den beiden Ringen und mehr als zwei beiden Ringen gemeinsame Atome umfaßt. Beispiele für solche überbrückten Heterocyclen schließen Chinuclidinyl, Diazabicyclo[2.2.1]heptyl und 7-Oxabicyclo[2.2.1]- heptyl ein.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Alkoxy" bezieht sich auf Reste der allgemeinen Formel -O-R, wobei R aus Kohlenwasserstoffresten ausgewählt ist. Alkoxy schließt beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, t-Butoxy, Isobutoxy, Cyclopropylmethoxy, Allyloxy und Propargyloxy ein.
Der für sich oder als Suffix oder Präfix verwendete Ausdruck „Amin" oder „Amino" bezieht sich auf Reste der allgemeinen Formel -NRR', wobei R und R' unabhängig voneinander aus Wasserstoff und Kohlenwasserstoffresten ausgewählt sind.
„Acyl", für sich oder als Präfix oder Suffix verwendet, bedeutet -C(=O)-R, wobei R für gegebenenfalls substitu iertes Hydrocarbyl, Wasserstoff, Amino oder Alkoxy steht. Acylgruppen schließen zum Beispiel Acetyl, Propionyl, Benzoyl, Phenylacetyl, Carboethoxy und Dimethylcarbamoyl ein.
Halogen schließt Fluor, Chlor, Brom und Iod ein.
„Halogeniert", verwendet als Präfix einer Gruppe, bedeutet, daß ein oder mehrere Wasserstoffatome der Gruppe durch ein oder mehrere Halogenatome ersetzt sind.
„RT" bedeutet Raumtemperatur.
Wenn eine erste Ringgruppe mit einer zweiten Ringgruppe „kondensiert" ist, so bedeutet das, daß der erste Ring und der zweite Ring sich wenigstens zwei Atome teilen.
„Bindung", „gebunden" oder „verbindend" bedeutet, wenn nicht anders angegeben, kovalent ver- bzw. gebunden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen der Formel I, deren pharmazeutisch annehmbare Salze, Diastereomere, Enantiomere oder Mischungen davon bereit:
wobei
R¹ ausgewählt ist aus C_6-10-Aryl und C_2-6-Heteroaryl, wobei diese C_6-10-Aryl- und C_2-6-Heteroarylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen; und
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl und C_3-6-Cycloalkyl, wobei die C_1-6-Alkyl- und C_3-6-Cycloalkylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, – C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)– OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen.
Eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen können die Verbindungen der Formel I sein, in denen R¹ ausgewählt ist aus Phenyl, Pyridyl, Thienyl, Furyl, Imidazolyl, Triazolyl, Pyrrolyl, Thiazolyl und N-Oxidopyridyl, wobei R¹ gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, halogeniertem C_1-6-Alkyl, -NO₂, -CF₃, C_1-6-Alkoxy, Chlor, Fluor, Brom und Iod substituiert ist;
R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander für C_1-3-Alkyl oder halogeniertes C_1-3-Alkyl stehen;
R⁵ ausgewählt ist aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl und C_3-6-Cycloalkyl, wobei die C_1-6-Alkyl- und C_3-6-Cycloalkylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, halogeniertem C_1-6-Alkyl, -NO₂, -CF₃, C_1-6-Alkoxy, Chlor, Fluor, Brom und Iod substituiert sind.
Eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen können die Verbindungen der Formel I sein, in denen R¹ ausgewählt ist aus Phenyl, Pyridyl, Thienyl, Furyl, Imidazolyl, Pyrrolyl und Thiazolyl, wobei R¹ gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, halogeniertem C_1-6-Alkyl, -NO₂, -CF₃, C_1-6-Alkoxy, Chlor, Fluor, Brom und Iod substituiert ist;
R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander für C_1-3-Alkyl oder halogeniertes C_1-3-Alkyl stehen; und
R⁵ für Wasserstoff steht.
Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen können die Verbindungen der Formel I sein, in denen R¹ ausgewählt ist aus Phenyl, Pyridyl, Thienyl, Furyl, Imidazolyl, Pyrrolyl und Thiazolyl;
R² und R³ für Ethyl stehen;
R⁴ für C_1-3-Alkyl steht; und
R⁵ für Wasserstoff steht.
Es versteht sich, daß, wenn Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Chiralitätszentren enthalten, die erfindungsgemäßen Verbindungen als enantiomere oder diastereomere Formen oder als eine racemische Mischung vorliegen und als solche isoliert werden können. Die vorliegende Erfindung schließt alle möglichen Enantiomere, Diastereomere, Racemate oder Mischungen davon einer Verbindung der Formel I ein. Die optisch aktiven Formen der erfindungsgemäßen Verbindung lassen sich beispielsweise durch chirale chromatographische Auftrennung eines Racemats, durch Synthese aus optisch aktiven Ausgangsmaterialien oder durch asymmetrische Synthese auf Grundlage der hier beschriebenen Vorschriften darstellen.
Man wird sich weiterhin bewußt sein, daß bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung als geometrische Isomere vorliegen können, zum Beispiel als E und Z Isomere von Alkenen. Die vorliegende Erfindung schließt alle geometrischen Isomere einer Verbindung der Formel I ein. Es versteht sich weiterhin, daß die vorliegende Erfindung die Tautomere der Verbindungen der Formel I umfaßt.
Außerdem versteht sich, daß bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung in solvatisierter Form, zum Beispiel hydratisierter Form, sowie auch nicht solvatisierten Formen vorliegen können. Es versteht sich weiterhin, daß die vorliegende Erfindung alle diese solvatisierten Formen der Verbindungen der Formel I umfaßt.
In den Schutzbereich der Erfindung fallen auch Salze der Verbindungen der Formel I. Im allgemeinen lassen sich pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung unter Anwendung von im Stand der Technik gut bekannten Standardvorschriften erhalten, zum Beispiel indem man eine ausreichend basische Verbindung, beispielsweise ein Alkylamin, mit einer geeigneten Säure, zum Beispiel HCl oder Essigsäure, umsetzt, wodurch man ein physiologisch annehmbares Anion erhält. Ein entsprechendes Alkali- (z.B. Natrium-, Kalium- oder Lithium-) oder Erdalkali- (z.B. Calcium-) Salz läßt sich auch herstellen, indem man eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einem ausreichend sauren Proton wie einer Carbonsäure oder einem Phenol mit einem Äquivalent eines Alkali- oder Erdalkalihydroxids oder -alkanolats (wie dem Ethanolat oder Methanolat) oder einem ausreichend basischen organischen Amin (wie Cholin oder Meglumin) in einem wäßrigen Medium umsetzt, worauf sich herkömmliche Aufreinigungsverfahren anschließen.
Bei einer Ausführungsform kann man die obige Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat davon, insbesondere ein Säureadditionssalz wie ein Hydrochlorid, Hydrobromid, Phosphat, Acetat, Fumarat, Maleat, Tartrat, Citrat, Methansulfonat oder p-Toluolsulfonat, umwandeln.
Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich für die Therapie, insbesondere für die Behandlung verschiedener Schmerzzustände wie chronische Schmerzen, neuropathische Schmerzen, akute Schmerzen, Krebsschmerzen, durch rheumatoide Arthritis verursachte Schmerzen, Migräne, viszerale Schmerzen usw. Diese Aufzählung sollte jedoch nicht als erschöpfend angesehen werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich als Immunmodulatoren, insbesondere für Autoimmunerkrankungen wie Arthritis, für Hauttransplantationen, Organtransplantationen und ähnliche chirurgische Bedürfnisse, für Kollagenerkrankungen, verschiedene Allergien, für eine Verwendung als Antitumormittel und als antivirale Mittel.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich für Leiden, bei denen eine Degeneration oder Dysfunktion von Opioidrezeptoren vorliegt oder in diesem Paradigma impliziert wird. Hierbei kann es zur Anwendung von isotopenmarkierten Versionen der erfindungsgemäßen Verbindungen in diagnostischen Verfahren und Anwendungen zur Bilddarstellung wie der Positronenemissionstomographie (PET) kommen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Diarrhöe, Depressionen, Angstzuständen und streßbedingten Erkrankungen wie durch posttraumatischen Streß verursachte Erkrankungen, Panikanfällen, allgemeinen Angstneurosen, sozialer Phobie und Zwangsneurosen; Harninkontinenz, vorzeitiger Ejakulation, verschiedenen Geisteskrankheiten, Husten, Lungenödem, verschiedenen Erkrankungen des Magen-Darm-Systems, zum Beispiel Verstopfung, funktionellen Störungen des Magen-Darm-Systems wie Reizkolon und funktionelle Dyspepsie, Parkinson-Krankheit und anderen motorischen Störungen, traumatischer Hirnverletzung, Schlaganfall, Kardioprotektion nach Herzinfarkt, Rückenmarksverletzungen und Drogenabhängigkeit, einschließlich der Behandlung des Mißbrauchs von Alkohol, Nikotin, Opioiden und anderen Drogen, und für Erkrankungen des sympathischen Nervensystems, beispielsweise Bluthochdruck.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich als Analgetika für eine Verwendung während einer vollnarkose und einer kontrollierten anästhetischen Betreuung. Um eine Balance der zur Aufrechterhaltung des anästhetischen Zustands (z.B. Amnesie, Analgese, Muskelentspannung und Sedation) benötigten Wirkungen zu erzielen, werden häufig Kombinationen von Mitteln mit verschiedenen Eigenschaften angewendet. Diese Kombination schließt inhalierbare Anästhetika, Hypnotika, Anxiolytika, neuromuskuläre Blocker und Opioide ein.
Der Schutzbereich der Erfindung schließt weiterhin die Verwendung jeglicher der Verbindungen gemäß der obigen Formel I zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines der oben angesprochenen Leiden ein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines an einer der oben angesprochenen Erkrankungen leidenden Patienten, bei dem man einem einer solchen Behandlung bedürftigen Patienten eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß der obigen Formel I verabreicht.
Die Erfindung stellt somit eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat davon, wie oben definiert, zur Verwendung in der Therapie bereit.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel I, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Solvates davon, wie oben definiert, bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Therapie bereit.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung schließt der Ausdruck „Therapie" auch „Prophylaxe" ein, es sei denn, es wird ausdrücklich das Gegenteil angegeben. Der Ausdruck „therapeutisch" ist entsprechend aufzufassen. Der Ausdruck „Therapie" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung weiterhin die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Linderung entweder eines bereits vorliegenden Krankheitszustands, eines akuten oder chronischen Leidens oder eines episodischen Leidens. Diese Definition umfaßt auch prophylaktische Therapien zur Prävention von episodischen Leiden und eine anhaltende Therapie chronischer Erkrankungen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich für die Therapie, insbesondere für die Therapie verschiedener Schmerzleiden wie akuter Schmerzen, chronischer Schmerzen, neuropathischer Schmerzen, akuter Schmerzen, Rückenschmerzen, Krebsschmerzen und viszeraler Schmerzen.
Bei der Verwendung in der Therapie in einem Warmblüter wie einem Menschen kann die erfindungsgemäße Verbindung in Form einer herkömmlichen pharmazeutischen Zusammensetzung auf eine beliebige Route einschließlich der oralen, intramuskulären, subkutanen, topischen, intranasalen, intraperitonealen, intrathorakalen, intravenösen, epiduralen, intrathekalen, intracerebroventrikulären Route und durch Injektion in die Gelenke verabreicht werden.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann die Verabreichungsroute oral, intravenös oder intramuskulär sein.
Die Dosierung richtet sich nach der Verabreichungsweise, dem Schweregrad der Krankheit, dem Alter und Gewicht des Patienten und anderen Faktoren, die normalerweise vom behandelnden Arzt bei der Festlegung des individuellen Verabreichungsplans und der für einen bestimmten Patienten am besten geeigneten Dosierung in Betracht gezogen werden.
Bei der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen aus den erfindungsgemäßen Verbindungen können die inerten, pharmazeutisch annehmbaren Träger entweder fest oder flüssig sein. Zu den Zubereitungen in fester Form zählen Pulver, Tabletten, dispergierbare Granulate, Kapseln, Oblatenkapseln und Zäpfchen.
Bei einem festen Träger kann es sich um eine oder mehrere Substanzen handeln, die auch als Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe, Lösungsvermittler, Gleitmittel, Suspendiermittel, Bindemittel oder Tablettensprengmittel dienen können; es kann sich dabei auch um ein Verkapselungsmaterial handeln.
Bei Pulvern handelt es sich bei dem Träger um einen feinteiligen Feststoff, der sich in einer Mischung mit der feinteiligen erfindungsgemäßen Verbindung oder aktiven Komponente befindet. Bei Tabletten wird die aktive Komponente in geeigneten Verhältnissen mit dem Träger mit den erforderlichen Bindungseigenschaften gemischt und zu der gewünschten Größe und Form verpreßt.
Bei der Zubereitung von Zäpfchenzusammensetzungen schmilzt man zunächst ein Wachs mit niedrigem Schmelzpunkt, wie z.B. eine Mischung aus Fettsäureglyceriden und Kakaobutter, und dispergiert den Wirkstoff darin, beispielsweise durch Rühren. Die geschmolzene homogene Mischung wird dann in Formen der entsprechenden Größe gegossen und abkühlen und verfestigen gelassen.
Geeignete Träger sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Lactose, Zucker, Pektin, Dextrin, Stärke, Tragacanth, Methylcellulose, Natriumcarboxy methylcellulose, ein Wachs mit niedrigem Schmelzpunkt, Kakaobutter und dergleichen.
Der Ausdruck „Zusammensetzung" soll die Formulierung der aktiven Komponente mit Verkapselungsmaterial als Träger, der eine Kapsel bereitstellt, in der die aktive Komponente (mit oder ohne andere Träger) von einem Träger umgeben ist, mit dem er somit assoziiert ist, einschließen. In ähnlicher Weise sind Oblatenkapseln eingeschlossen.
Tabletten, Pulver, Oblatenkapseln und Kapseln können als für eine orale Verabreichung geeignete feste Dosierungsformen verwendet werden.
Zusammensetzungen in flüssiger Form schließen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Als Beispiel für für eine parenterale Verabreichung geeignete flüssige Zubereitungen können sterile Wasser- oder Wasser-Propylenglykol-Lösungen der Wirkstoffe angeführt werden. Flüssige Zusammensetzungen können auch in Lösung in wäßriger Polyethylenglykollösung formuliert werden.
Wäßrige Lösungen für die orale Verabreichung lassen sich darstellen, indem man die aktive Komponente in Wasser löst und wie gewünscht geeignete Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Stabilisatoren und Verdickungsmittel zusetzt. Wäßrige Suspensionen für die orale Anwendung lassen sich herstellen, indem man die feinteilige aktive Komponente zusammen mit einem zähflüssigen Material wie natürlichen synthetischen Gummis, Harzen, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und anderen in der Galenik bekannten Suspendiermitteln in Wasser dispergiert.
Je nach Verabreichungsweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise 0,05 Gew.-% bis 99 Gew.-% (Gewichtsprozent), besonders bevorzugt 0,10 bis 50 Gew.-%, der erfindungsgemäßen Verbindung enthalten, wobei alle Angaben in Gewichtsprozent auf die gesamte Zusammensetzung bezogen sind.
Eine therapeutisch wirksame Menge für die Durchführung der vorliegenden Erfindung läßt sich vom Durchschnittsfachmann unter Berücksichtigung bekannter Kriterien einschließlich Alter, Gewicht und Reaktion des individuellen Patienten bestimmen und im Rahmen der zu behandelnden bzw. zu verhindernden Krankheit interpretieren.
Der Umfang der Erfindung schließt die Verwendung einer beliebigen wie oben definierten Verbindung der Formel I für die Herstellung eines Medikaments ein.
Ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung liegt die Verwendung einer beliebigen Verbindung der Formel I zur Herstellung eines Medikaments für die Schmerztherapie.
Darüber hinaus wird die Verwendung einer Verbindung der Formel I für die Herstellung eines Medikaments für die Therapie verschiedener Schmerzleiden wie akuter Schmerzen, chronischer Schmerzen, neuropathischer Schmerzen, akuter Schmerzen, Rückenschmerzen, Krebsschmerzen und viszeraler Schmerzen bereitgestellt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren für die Therapie eines an einem der oben aufgeführten Erkrankungen leidenden Patienten, bei dem man einem einer solchen Therapie bedürftigen Patienten eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß der obigen Formel I verabreicht.
Zusätzlich wird eine eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt.
Insbesondere wird eine eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung für die Therapie, ganz besonders die Schmerztherapie, bereitgestellt.
Weiter wird eine eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung Verwendung bei einem der oben angeführten Leiden bereitgestellt.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I.
Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I bereit, bei dem man:
eine Verbindung der Formel II mit X-S(=O)₂-R⁴ oder R⁴S(=O)₂-O-S(=O)₂R⁴ umsetzt,
wobei
X ausgewählt ist aus Cl, Br und I;
R¹ ausgewählt ist aus C_6-10-Aryl und C_2-6-Heteroaryl,
wobei diese C_6-10-Aryl- und C_2-6-Heteroarylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen; und
R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl und C_3-6-Cycloalkyl, wobei die C_1-6-Alkyl- und C_3-6-Cycloalkylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und die für deren Herstellung verwendeten Zwischenprodukte lassen sich nach den in den Schemata 1, 2 und 3 beispielhaft angeführten Synthesewegen herstellen.
Schema 1
Schema 2
Schema 3
BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG
Die erfindungsgemäßen Verbindungen erweisen sich als aktiv gegenüber δ-Rezeptoren in Warmblütern, z.B. dem Menschen. Insbesondere erweisen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als wirksame δ-Rezeptor-Liganden. In-vitro-Assays, siehe unten, zeigen diese überraschenden Aktivitäten, insbesondere hinsichtlich Wirksamkeit und Wirkstärke der Agonisten, wie aus dem Rattenhirnfunktionsassay und/oder dem Funktionsassay mit dem humanen δ-Rezeptor (niedrig) ersichtlich ist. Dieses Merkmal kann mit der in-vivo-Wirkung in Zusammenhang stehen und muß nicht linear mit der Bindungsaffinität korrelieren. Bei diesen in-vitro-Assays wird eine Verbindung auf ihre Aktivität gegenüber δ-Rezeptoren getestet und der IC₅₀-Wert festgestellt, wodurch sich die selektive Aktivität einer bestimmten Verbindung gegenüber δ-Rezeptoren bestimmen läßt. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der IC₅₀-Wert allgemein auf die Konzentration an Verbindung, bei der man eine 50%ige Verdrängung eines radioaktiven Standardliganden des δ-Rezeptors beobachtet.
Die Aktivitäten gegenüber κ- und μ-Rezeptoren werden ebenfalls in einem ähnlichen Assay gemessen.
In-vitro-Modell
Zellkultur
Humane 2935-Zellen, die klonierte humane μ-, δ und κ-Rezeptoren exprimierten und neomycinresistent sind, werden in Suspension bei 37°C und 5% CO₂ in Schüttelflaschen, die calciumfreies DMEM 10% FBS, 5% BCS, 0,1% Pluronic F-68 und 600 μg/ml Geneticin enthalten, herangezogen.
Rattenhirne werden gewogen und mit eiskaltem PBS (mit 2,5 mM EDTA, pH-Wert 7,4) gewaschen. Die Hirne werden mit einem Polytron 30 Sekunden lang (Ratten) in eiskaltem Lysepuffer (50 mM Tris, pH-Wert 7,0, 2,5 mM EDTA, wobei unmittelbar vor der Verwendung aus einer 0,5 M Stammlösung in DMSO:Ethanol Phenylmethylsulfonylfluorid bis zu einer Konzentration von 0,5 mM zugesetzt wird) homogenisiert.
Membranzubereitung
Die Zellen werden pelletiert und in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7,0, 2,5 mM EDTA, wobei unmittelbar vor der Verwendung aus einer 0,1 M Stammlösung in Ethanol PMSF bis zu einer Konzentration von 0,1 mM zugesetzt wird) resuspendiert, 15 min auf Eis inkubiert und dann 30 s mit einem Polytron homogenisiert. Die Suspension wird bei 4°C 10 min lang bei 1000 g (max) zentrifugiert. Der Überstand wird auf Eis zurückgelegt, und die Pellets werden resuspendiert und wie oben zentrifugiert. Die Überstände aus beiden Zentrifugierungen werden ver einigt und 30 min bei 46.000 g (max) zentrifugiert. Die Pellets werden in kaltem Tris-Puffer (50 mM Tris/Cl, pH 7,0) resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Die letztendlich erhaltenen Pellets werden in Membranpuffer (50 mM Tris, 0,32 M Saccharose, pH 7,0) resuspendiert. Aliquots (1 ml) in Polypropylenröhrchen werden in Trockeneis/Ethanol gefroren und bis zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt. Die Proteinkonzentrationen werden durch einen modifizierten Lowry-Assay mit Natriumdodecylsulfat bestimmt.
Bindungsassays
Die Membranen werden bei 37°C aufgetaut, auf Eis gekühlt (oder auf Eis aufbewahrt, wenn nicht sofort verwendet), 3mal durch eine 25-G-Nadel gegeben und in. Bindungspuffer (50 mM Tris, 3 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA (Sigma A-7888), pH 7,4, der nach dem Filtrieren durch einen 0,22-m-Filter bei 4°C aufbewahrt und dann frisch mit 5 μg/ml Aprotinin, 10 μM Bestatin und 10 μM Diprotin A, wenn die Membranen von gewebe stammen (Ratt, Maus, Affe, ohne DDT), versetzt wurde) verdünnt. 100-μl-Aliquots werden in eisgekühlte 12 × 75-mm-Polypropylenröhrchen gegeben, die 100 μl des entsprechenden Radioliganden und 100 μl Testverbindung in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Die Gesamtbindung (TB) und die nichtspezifische Bindung (NS) werden in Abwesenheit bzw. Gegenwart von 10 μM Naloxon bestimmt. Die Röhrchen werden gevortext und 60-75 min bei 25°C inkubiert, woraufhin die Inhalte schnell vakuumfiltriert und mit etwa 12 ml/Röhrchen eiskaltem Waschpuffer (50 mM Tris, pH 7,0, 3 mM MgCl₂) durch GF/B-Filter (Whatman), die wenigstens 2 h in 0,1% Polyethylenimin voreingeweicht wurden, gewaschen werden. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität (dpm) wird mit einem Beta-Zähler gemessen, nachdem die Filter wenigstens 12 h in Minivials mit 6-7 ml Szintillationsflüssigkeit eingeweicht worden waren. Wird der Assay in Platten mit 96 tiefen Vertiefungen durchgeführt, so erfolgt die Filtration durch in PEI eingeweichte Unifilter mit 96 Vertiefungen, die mit 3 × 1 ml Waschpuffer gewaschen und 2 h bei 55°C in einem Ofen getrocknet wurden. Die Filterplatten werden nach Zugabe von 50 μl MS-20-Szintillationsflüssigkeit/Vertiefung in einem TopCount (Packard) ausgezählt. Wird der Assay in Platten mit 96 tiefen Vertiefungen durchgeführt, so erfolgt die Bestimmung der IC₅₀-Werte der Verbindungen im Fall von Delta aus Verdrängungskurven mit 10 Punkten and im Fall von Mu und Kappa aus Verdrängungskurven mit 5 Punkten. Der Assay wird in 300 μl mit der entsprechenden Menge an Membranprotein (2 μg, 35 μg und 1 μg im Fall von Delta, Mu bzw. Kappa) und 50.000-80.000 dpm/Vertiefung an entsprechendem Tracer (125I-Deltorphin II, 125I-FK33824 und 125I-DPDYN für Delta, Mu bzw. Kappa) durchgeführt. Gesamtbindung und nichtspezifische Bindung werden in Abwesenheit und Gegenwart von 10 μM Naloxon bestimmt.
Funktionsassays
Die Agonistenaktivität der Verbindungen wird gemessen, indem man das Ausmaß bestimmt, zu dem der Komplex aus Verbindungen und Rezeptor die Bindung von GTP an die G-Proteine, an die die Rezeptoren gekoppelt sind, aktiviert. Beim GTP-Bindungsassay wird GTP[γ]³⁵S mit den Testverbindungen und den Membranen von HEK-2935-Zellen, die die klonierten humanen Opioidrezeptoren exprimieren, oder von homogenisiertem Ratten- und Mäusehirn kombiniert. Agonisten stimulieren die GTP[γ]³⁵S-Bindung in diesen Membranen. Die EC₅₀- und E_max-Werte der Verbindungen werden aus den Dosis-Reaktions-Kurven bestimmt. Mit dem delta-Antagonisten Naltrindol werden Rechtsverschiebungen der Dosis-Reaktions-Kurve vorgenommen, wodurch verifiziert wird, daß die Agonistenaktivität über delta-Rezeptoren vermittelt wird. Bei dem Funktionsassay mit dem humanen δ-Rezeptor wird die EC₅₀ (niedrig) gemessen, wenn die im Assay verwendeten humanen δ-Rezeptoren im Vergleich zu den bei der Bestimmung der EC₅₀ (hoch) verwendeten in geringerem Maße exprimiert wurden. Die E_max-Werte wurden bezogen auf den Standard-δ-Agonisten SNC80 bestimmt, d.h. mehr als 100% bedeutet eine Verbindung, die eine bessere Wirksamkeit hat als SNC80.
Vorschrift für Rattenhirn-GTP
Rattenhirnmembranen werden bei 37°C aufgetaut, dreimal durch eine 25-G-Nadel mit stumpfem Ende gegeben und mit GTPγS-Bindungspuffer (50 mM Hepes, 20 mM NaOH, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, pH-Wert 7,4, frisch zugesetzt: 1 mM DTT, 0,1% BSA) verdünnt. 120 μM GDP Ende wird Membranverdünnungen zugesetzt. EC50 und Emax der Verbindungen werden aus aus 10 Punkten erstellten Dosis-Reaktions-Kurven abgeleitet, die in 300 μl mit der entsprechenden Menge an Membranprotein (20 μg/Vertiefung) und 10.0000-13.0000 dpm GTPγ³⁵S pro Vertiefung (0,11-0,14 nM) aufgenommen wurden. Der Bindungsgrundwert und der Bindungswert bei maximaler Stimulierung werden in Abwesenheit und Gegenwart von 3 μM SNC-80 bestimmt. Der mit HEK 293s-Zellen, die stabil geklonte Delta-Rezeptoren exprimieren, durchgeführte Assay wird in einem etwas anderen Puffer (50 mM Hepes, 20 mM NaOH, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, pH 7,4, frisch zugeben: 0,5% BSA, kein DTT) und mit einer Endkonzentration von 3 μM GDP durchgeführt.
Datenanalyse
Die spezifische Bindung (SB) wurde als TB-NS berechnet, und die SB in Gegenwart von verschiedenen Testverbindungen wurde in Prozent der Kontroll-SB ausgedrückt. Die IC₅₀-Werte und Hill-Koeffizienten (n_H) für Liganden beim Verdrängen von spezifisch gebundenen Radioliganden wurden aus Logit-Auftragungen oder mittels Kurvenanpassungsprogrammen wie Ligand, GraphPad Prism, Sigma-Plot oder ReceptorFit berechnet. Die K_i- Werte wurden aus der Cheng-Prussoff-Gleichung berechnet. Für Liganden, die in wenigstens drei Verdrängungskurven getestet wurden, wurden Mittelwert ± Standardabweichung von IC₅₀, K_i und n_H angegeben. Die biologische Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Rezeptorsättigungsexperimente
Die K_δ-Werte für die Radioliganden werden bestimmt, indem man die Bindungsassays an Zellmembranen mit den entsprechenden Radioliganden in Konzentrationen im Bereich des 0,2- bis 5fachen (bis zum 10fachen, wenn dies die erforderlichen Mengen an Radioligand zuliessen) des geschätzten K_δ durchführt. Die spezifische Bindung des Radioliganden wird in pmol/mg Membranprotein ausgedrückt. K_δ- und B_max-Werte der einzelnen Experimente werden aus nichtlinearen Anpassungen von spezifisch gebundenem (B) im Vergleich zu nM an freiem (F) Radioliganden der einzelnen gemäß einem Ein-Bindungsstellen-Modell erhalten.
Bestimmung der Mechanoallodynie mit dem von-Frey-Test
Der Test wird zwischen 08:00 und 16:00 Uhr unter Anwendung der von Chaplan et al. (1994) beschriebenen Methode durchgeführt. Ratten werden in Käfige aus Plexiglas auf einen Boden aus Drahtnetz, der Zugang zu der Pfote erlaubte, gesetzt, woraufhin sich die Tiere 10-15 min eingewöhnen konnten. Bei der getesteten Region handelt es sich um die Mitte der Sohle der linken Hinterpfote, wodurch die weniger empfindlichen Fußballen vermieden wurden. Die Pfote wird mit einer Reihe von 8 Von-Frey-Haaren mit logarithmisch zunehmender Steifheit (0,41, 0,69, 1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51, und 15,14 Gramm, Stoelting, Ill., USA) berührt. Das Von-Frey-Haar wird von der Unterseite des Bodennetzes senkrecht zur Oberfläche der Sohle herangeführt, mit einer Kraft, die so stark war, daß es gegen die Pfote zu einer leichten Verbiegung kam, und ungefähr 6-8 Sekunden gehalten. Eine positive Reaktion wird festgehalten, wenn die Pfote ruckartig zurückgezogen wurde. Ein Zucken während des Entfernens des Haars wird ebenfalls als positive Reaktion gewertet. Ein Umherwandern wird als zweideutige Reaktion betrachtet, und in diesen Fällen wird der Stimulus wiederholt.
Testverfahren
In der mit FCA behandelten Gruppe werden die Tiere am Tag 1 nach der Operation getestet. Die Schwelle, bei der es bei 50% zu einem Zurückziehen kam, wird mit der Up-Down-Methode von Dixon (1980) bestimmt. Der Test wird mit dem 2,04-g-Haar aus der Mitte der Reihe begonnen. Die Stimuli werden in jedem Fall in einer aufeinanderfolgenden Weise präsentiert, gleich ob ansteigend oder absteigend. Kommt es bei dem zunächst ausgewählten Haar nicht zu einer Reaktion, bei der die Pfote zurückgezogen wird, so wird ein stärkerer Stimulus präsentiert; wird die Pfote zurückgezogen, so wird der nächstschwächere Stimulus gewählt. Für eine optimale Schwellenwertberechnung mittels dieser Methode sind 6 Reaktionen in unmittelbarer Nähe des 50%- Schwellenwerts erforderlich, wobei mit dem Zählen dieser 6 Reaktionen begonnen wird, wenn die erste Reaktionsveränderung auftritt, z.B. wenn der Schwellenwert das erste Mal überschritten wird. In Fällen, bei denen die Schwellenwerte außerhalb des Stimulusbereichs fallen, werden Werte von 15,14 (normale Empfindlichkeit) beziehungsweise 0,41 (maximal allodyn) zugeordnet. Das so erhaltene Muster an positiven und negativen Reaktionen wird tabellarisch erfaßt, wobei X = kein Zurückziehen, O = Zurückziehen ist, und der Schwellenwert, bei dem es bei 50% zu einem Zurückziehen kam, wird mit der Formel: 50% g Schwelle = 10(Xf + kδ)/10.000interpoliert, mit Xf = Wert des letzten verwendeten Von-Frey-Haars (log-Einheiten); k = Tabellenwert (aus Chaplan et al. (1994)) für das Muster von positiven/negativen Reaktionen; und δ = mittlerer Unterschied zwischen Stimuli (log-Einheiten). Hier ist δ = 0,224.
Die Von-Frey-Schwellenwerte werden gemäß Chaplan et al., 1994, in Prozent der maximal erzielbaren Wirkung (% MPE (maximum possible effect)) umgerechnet. Zur Berechnung von % MPE wird die folgende Gleichung angewendet:
VERABREICHUNG VON TESTSUBSTANZ
Vor dem Von-Frey-Test wird den Ratten eine Testsubstanz injiziert (subkutan, intraperitoneal, intravenös oder oral); die Zeitspanne zwischen der Verabreichung der Testverbindung und dem Von-Frey-Test richtet sich nach der Art der Testverbindung.
KRÜMMUNGSTEST
Bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse löst Essigsäure Kontraktionen in der Bauchgegend aus. Die Mäuse strecken dann ihren Körper auf eine typische Weise. Werden analgetische Arzneimittel verabreicht, so wird diese beschriebene Bewegung weniger häufig beobachtet, und das Arzneimittel wird als potentieller guter Kandidat ausgewählt.
Als vollständiger und typischer Krümmungsreflex werden nur die betrachtet, bei denen die folgenden Elemente vorhanden sind: Das Tier befindet sich nicht in Bewegung; der untere Rücken ist leicht durchgedrückt; von beiden Pfoten sind die Sohlen zu sehen. In diesem Test zeigten die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine signifikante Inhibierung der Krümmungsreaktionen nach Verabreichung einer oralen Dosis von 1-100 μmol/kg.
(i) Zubereitung der Lösungen

Essigsäure (AcOH): 120 μl Essigsäure werden zu 19,88 ml destilliertem Wasser gegeben, so daß man ein Endvolumen von 20 ml mit einer Endkonzentration von 0,6% AcOH erhält. Die Lösung wird dann gemischt (Vortex) und ist fertig für die Injektion.
Verbindung (Arzneimittel): Die einzelnen Verbindungen werden hergestellt und nach Standardvorschriften in dem am besten geeigneten Vehikel gelöst.

(ii) Verabreichung der Lösungen
Die Verbindung (das Arzneimittel) wird 20, 30 oder 40 Minuten (entsprechend der Klasse der Verbindung und ihren Eigenschaften) vor dem Test oral, intraperitoneal (i.p.), subkutan (s.c.) oder intravenös (i.v.) in einer Dosis von 10 ml/kg (unter Beachtung des durchschnittlichen Körpergewichts der Mäuse) verabreicht. Bei zentraler Verabreichung der Verbindung: Ein Volumen von 5 μl wird intraventrikulär (i.c.v.) oder intrathekal (i.t.) verabreicht.
Die AcOH wird unmittelbar vor dem Test an zwei Stellen in einer Dosis von 10 ml/kg (wobei das durchschnittliche Körpergewicht der Mäuse beachtet wird) intraperitoneal (i.p.) verabreicht.
(iii) Test
Das Tier (Maus) wird über einen Zeitraum von 20 Minuten beobachtet, und die Anzahl an Ereignissen (Krümmungsreflexen) wird aufgezeichnet und am Ende des Experiments zusammengestellt. Die Mäuse werden einzeln in „Schuhkarton"-Käfigen mit Kontaktstreu gehalten. Gewöhnlich werden insgesamt 4 Mäuse gleichzeitig beobachtet: eine zur Kontrolle und drei, denen Arzneimittel verabreicht worden ist.
Was Angstzustände und Indikationen, die Angstzuständen ähnlich sind, betrifft, so wurde die Wirksamkeit durch den Geller-Seifter-Konflikttest an Ratten bestätigt.
Was die Indikation von funktionellen Erkrankungen des Magen-Darm-Systems betrifft, so läßt sich die Wirksamkeit durch den von Coutinho SV et al. in American Journal of Physiology – Gastrointestinal & Liver Physiology 282(2): G307-16, Feb. 2002, beschriebenen Assay an Ratten bestätigen.
ZUSÄTZLICHE VORSCHRIFTEN FÜR IN-VIVO-TESTS
Versuchstiere und Unterbringung
Naive männliche Sprague-Dawley-Ratten (175-200 g) werden in 5er-Gruppen in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (22°C, 40-70% Feuchtigkeit, 12 Stunden Licht/Dunkel) untergebracht. Die Experimente werden während der Lichtphase des Zyklus durchgeführt. Die Tiere bekommen Futter und Wasser ad libitum und werden unmittelbar nach der Datenaufnahme getötet.
Probe
Beim Testen der Verbindungen (Arzneimittel) werden Gruppen von Ratten mitgetestet, die nicht behandelt wurden, und andere, die mit E. coli-Lipopolysaccharid (LPS) behandelt wurden. Beim Experiment mit den LPS-behandelten Tieren wird vier Gruppen LPS injiziert, eine der vier Gruppen wird dann mit Vehikel behandelt, während den anderen drei Gruppen das Arzneimittel mit seinem Vehikel injiziert wird. Ein zweiter Satz Experimente wird mit fünf Gruppen Ratten durchgeführt, die alle jeweils keine LPS-Behandlung erfahren. Die naive Gruppe erhält weder Verbindung (Arzneimittel) noch Vehikel, die anderen vier Gruppen werden mit Vehikel mit oder ohne Arzneimittel behandelt. Diese Tests werden zur Bestimmung der anxiolytischen oder sedativen Wirkungen der Arzneimittel, die zu einer USV-Senkung beitragen können, durchgeführt.
Verabreichung von LPS
Vor der Behandlung haben die Ratten die Möglichkeit, sich 15-20 min mit dem Experimentallabor vertraut zu machen. Durch Verabreichung von LPS (Endotoxin des gram-negativen E. coli-Bakteriums mit dem Serotyp 0111:B4, Sigma) wird eine Entzündung induziert. Das LPS (2,4 μg) wird intracerebroventrikulär (i.c.v.) in einem Volumen von 10 μl unter Anwendung von stereotaxischen chirurgischen Standardverfahren mit Isofluran-Narkose injiziert. Die Haut zwischen den Ohren wird zum Rücken hin zurückgeschoben, und mit einem Schnitt von etwa 1 cm in Längsrichtung wird die Schädeloberfläche freigelegt. Die Punktionsstelle ist durch die folgenden Koordinaten festgelegt: 0,8 mm hinter dem Bregma, 1,5 mm seitlich (links) von der Lambda (Sagittalnaht) und 5 mm unter der Schädeloberfläche (vertikal) im lateralen Ventrikel. Das LPS wird mit einer sterilen Nadel aus Edelstahl (26-G 3/8) mit einer Länge von 5 mm, die über einen Polyethylenschlauch (PE20; 10-15 cm) an einer Hamilton-Spritze befestigt ist, injiziert. Ein aus einer abgeschnittenen Nadel (20-G) angefertigter 4-mm-Stopring wird über die 26-G-Nadel geschoben und mit Silikonkleber an dieser befestigt, so daß man die gewünschte Tiefe von 5 mm erhält.
Nach der Injektion von LPS verbleibt die Nadel noch weitere 10 s in Position, damit die Verbindung wegdiffundieren kann, und wird dann entfernt. Der Einschnitt wird verschlossen und die Ratte wird in ihren ursprünglichen Käfig zurückgesetzt, wo sie sich vor dem Test mindestens 3,5 h ausruhen darf.
Experimentelle Anordnung für die Luftstoß-Stimulierung
Nach der LPS-Injektion und der Verabreichung von Verbindung (Arzneimittel) verbleiben die Ratten im Experimentallabor. Für den Test werden alle Ratten aus dem Labor herausgenommen. Jeweils eine Ratte zur Zeit wird im Testlabor in einen durchsichtigen Kasten (9 × 9 × 18 cm) gesetzt, der dann in eine schallgedämpfte, belüftete Kammer mit den Abmessungen 62(B) × 35(T) × 46(H) cm (BRS/LVE, Div. Tech-Serv Inc) gegeben wird. Die Verabreichung von Luftstößen mittels einer Luftausstoßdüse von 0,32 cm wird durch ein System (AirStim, San Diego Instruments) gesteuert, das dazu in der Lage ist, Luftstöße einer festgelegten Dauer (0,2 s) und Intensität mit einer Frequenz von 1 Stoß alle 10 s zu verabreichen. Es werden maximal 10 Stöße verabreicht, oder bis es zu einer Lautäußerung kommt, je nachdem, was zuerst eintritt. Die Aufnahme beginnt mit dem ersten Luftstoß.
Experimentelle Anordnung für die Ultraschallaufnahme
Die Lautäußerungen werden 10 Minuten lang mit Mikrophonen (G.R.A.S. Sound and Vibrations, Vedbaek, Dänemark), die sich in den Kammern befinden und über LMS-Software (LMS CADA-X 3.5B, Data Aquisition Monitor, Troy, Michigan, USA) gesteuert werden, aufgenommen. Die Frequenzen zwischen 0 und 32.000 Hz werden mit der gleichen Software aufgenommen, gespeichert und analysiert (LMS CADA-X 3.5B, Time Data Processing Monitor und UPA (User Programming and Analysis)).
Verbindungen (Arzneimittel)
Alle Verbindungen (Arzneimittel) sind auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 eingestellt und werden in einem Volumen von 4 ml/kg verabreicht. Nach der Verabreichung der Verbindung (des Arzneimittels) werden die Tiere bis zum Zeitpunkt des Tests in ihre ursprünglichen Käfige zurückgesetzt.
Analyse
Die Aufnahme wird zum Filtern (zwischen 20-24 kHz) und zur Berechnung der interessanten Parameter einer Reihe von statistischen Analysen und Fourieranalysen unterzogen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wird mit dem T-Test zum Vergleich von naiven und mit LPS behandelten Ratten und mit dem Einweg-ANOVA-Test und einem darauf folgenden multiplen Dunnett-Vergleichstest (post-hoc) auf die Wirksamkeit des Arzneimittels untersucht. Ein Unterschied zwischen einzelnen Gruppen wird als signifikant betrachtet, wenn der minimale p-Wert ≤ 0,05 beträgt. Die Experimente werden wenigstens zweimal wiederholt.
Bestimmung der thermalen Hyperalgesie mit dem Plantartest von Hargreaves
Verabreichung von FCA oder Carrageen
Freunds komplettes Adjuvans (FCA): SIGMA Kat.-Nr. F 5881, Mycobacterium tuberculuosis (H37Ra, ATCC 25177), 1 mg/ml, hitzedesaktiviert, getrocknet, 0,85 ml Paraffin, 0,15 ml Mannidmonooleat. Oder Carrageenan vom Lambda-Typ IV(Cg): SIGMA Kat.-Nr. C-3889, (Pflanzengelatine; Irisches Moos), (1,0%ige Lösung) in NaCl.
Die Injektionen erfolgen mit einer Hamilton-Spritze mit einer sterilen Nadel der Größe 26G5/8". Die Ratten werden aufgenommen und in eine Narkosekammer mit Isofluran gesetzt. Ist die gewünschte Wirkung eingetreten, wird die Ratte herausgenommen und auf einen ventralen Dekubitus gelegt (sternale Position). Die linke Hinterpfote wird festgehalten und die Nadel wird subkutan, ventraler Aspekt, zwischen dem Fußballen von Finger Nr. 2 und Nr. 3 eingeführt, so daß man bis zur Mitte der Pfote (Metatarsusregion) gelangt. Schließlich wird ein Volumen von 100 μl FCA oder 100 μl Carrageenanlösung langsam in die Pfote injiziert und nach dem Herausziehen der Nadel 3-4 Sekunden lang ein leichter Druck ausgeübt.
Wachen die Tiere während der Prozedur auf, werden sie wieder in die Inhalationskammer zurückgesetzt, bis die gewünschte Wirkung eingetreten ist. Nach der intraplantaren Injektion läßt man die Tiere unter Beobachtung in ihren Käfigen wieder zu sich kommen.
Bei der FCA-Behandlung gibt man den Ratten 48 Stunden Zeit, damit sich die Entzündung entwickeln kann. Bei der Carrageenanbehandlung gibt man den Ratten 3 Stunden Zeit, damit sich die Entzündung entwickeln kann. Am Morgen des Tests werden die Ratten in das Labor (in ihren Käfigen) gegeben. Sie dürfen sich wengstens 30 Minuten lang an den Raum gewöhnen.
Teststelle
Der Hitzestimulus erfolgt im Zentrum der Sohlenoberfläche zwischen den Ballen. Die Teststelle muß sich im Kontakt mit dem Glas befinden, ohne Urin oder Fäzies dazwischen, so daß die korrekten Hitzetransfereigenschaften vom Glas zur Haut beibehalten werden.
Der Plantarapparat besteht aus einem Kasten mit einem Oberteil/einer Plattform aus Glas, die Glasoberfläche wird über einen internen Rückkopplungsmechanismus auf 30°C gehalten. Unter der Glasplattform befindet sich eine auf einem beweglichen Arm angebrachte Glühbirne, unter die ein Spiegel gelegt wird, so daß das Licht unter der Pfote der Ratte positioniert werden kann. Ist das Licht angeschaltet, so scheint es durch eine Öffnung mit einem Durchmesser von ~2 mm. Der Experimentator schaltet das Licht an, und automatische Sensoren schalten das Licht aus, wenn die Pfote weggezogen wird; mit einem Cut-off von 20,48 Sekunden wird sichergestellt, daß es zu keiner Gewebeschädigung kommt, wenn die Ratte ihre Pfote nicht wegzieht. Dem Experimentator ist es weiterhin möglich, das Licht zu jedem beliebigen Zeitpunkt auszuschalten. Ein Zeitnehmer hält fest, wielange das Licht angeschaltet ist.
Fluxmesser: mißt den Flux/cm2, wenn das Licht angeschaltet ist. Dies sollte auf ~97-98 gehalten werden; der Flux läßt sich durch Einstellen des Plantargeräts modifizieren, darf jedoch nie in der Mitte eines Experiments geändert werden.
Zeitlicher Verlauf
Das Experiment kann über verschiedene Zeitspannen nach der Induktion der Entzündung durchgeführt werden. Die Hyperalgesie wird 48 h nach der FCA-Injektion bzw. 3 h nach der Carrageenan-Injektion gemessen.
Testprotokoll

Naive Ratten: Für das Protokoll zum Erstellen einer Dosis-Reaktions-Kurve wird eine Gruppe von 7 Ratten als Kontrollgruppe verwendet; sie werden zusammen mit den restlichen 28 Ratten betäubt, erhalten jedoch keine Injektion. Das Testen der naiven Gruppe kann entweder vor Beginn oder unmittelbar nach dem Experiment erfolgen. Die Ratten werden unter möglichst geringem Streß in einzelne, oben auf dem Plantargerät befindliche Plexiglaskästchen (14 × 21 × 9 cm) gesetzt; sie dürfen sich 30 Minuten lang eingewöhnen. Wenn die Tiere bereit sind für den Test, wird die Lichtquelle direkt unter die Teststelle positioniert und angeschaltet, und die Latenz bis zum Wegziehen wird festgehalten. Nach 5-8 Minuten, damit die Hauttemperatur wieder auf Normal zurückkehren kann, wird ein zweiter Meßwert bestimmt, und die Ratten werden dann herausgenommen und wieder in ihren Käfig gegeben.
Baseline-Werte: Die verbliebenen 28 Ratten (aufgeteilt in 4 Gruppen), denen FCA (oder Carrageenan) injiziert worden war, werden in einzelnen Kästchen auf der Maschine gesetzt, wo sie sich 30 Minuten lang eingewöhnen können. Der Experimentator sollte sich des Entzündungsgrads der Pfote vergewissern und überprüfen, ob Verfärbungen aufgetreten sind. Der Hitzestimulus wird unter der Teststelle positioniert, und die Latenz bis zum Wegziehen wird festgehalten; wie oben werden zwei Meßwerte bestimmt. Durch den Vergleich dieser Baseline-Werte mit denen der naiven Tiere wird festgestellt, ob eine Hyperalgesie vorliegt.
Testen nach Verabreichung des Arzneimittels: Nachdem sich die Hyperalgesie etabliert hat, wird den Ratten die Verbindung, um die es geht, injiziert. Die Verbindungen werden jeweils gemäß Standardvorschriften zubereitet und in dem geeignetsten Vehikel gelöst. Verabreichungsroute, Dosen, Volumen und die Zeit bis zum Testen nach der Injektion sind jeweils spezifisch für die Verbindung (bzw. Verbindungsklasse). Werden die Verbindungen 20-30 Minuten nach der Injektion getestet, wie bei i.v.-oder s.c.-Injektionen, so werden die Ratten auf das Plantargerät gesetzt und dürfen sich daran gewöhnen, während die Arzneimittelwirkung einsetzt. Werden die Verbindungen 60 Minuten oder später nach der Injektion getestet, so werden die Ratten wieder in ihren ursprünglichen Käfig mit ihren Käfiggenossen gesetzt. Die Ratten werden stets in ihren ursprünglichen Käfig mit ihren Käfiggenossen zurückgesetzt, um den Streß des Wiederaufbaus einer sozialen Struktur in einer Gruppe von Ratten auf ein Mindestmaß zu reduzieren. 30 Minuten später werden die Ratten auf das Plantargerät gesetzt, und sie dürfen sich 30 Minuten lang an das Gerät gewöhnen. Der Test erfolgt wie oben beschrieben. Es werden zwei Meßwerte bestimmt. Testkriterien:

Das Tier muß ruhig, aber dennoch aufgeweckt und in der korrekten Position sein, ohne daß sich zwischen der Haut der Pfote und der Glasoberfläche der Maschine Urin oder Fäzies befinden. Ein Tier sollte nicht getestet werden, wenn

– das Tier sich bewegt, einschließlich Schnüffeln, Fellpflege und Erkunden.
– das Tier schläft.
– das Tier offensichtliche Anzeichen von Streß zeigt (tonische Bewegungslosigkeit, Lautäußerungen, Ohren angelegt), es sei denn, dies sind mögliche Folgen der Nebenwirkungen einer Verbindung und lassen sich nicht vermeiden.
– das Tier so positioniert ist, daß sich die Pfote nicht in direktem Kontakt mit dem Glas befindet (die Pfote ruht auf dem Schwanz).
– die Pfote des Tieres als Folge einer schlechten Injektion eine blaue Verfärbung zeigt. In diesem Fall wird das Tier ganz vom Experiment ausgeschlossen (zu Beginn).

Sind Urin oder Fäzies vorhanden, so wird das Tier heruntergenommen, die Glasoberfläche wird saubergewischt und dann wird das Tier wieder zurückgesetzt. Schläft das Tier oder zeigt es tonische Bewegungslosigkeit, so kann der Experimentator den Kasten vorsichtig bewegen oder seine Hand vor dem Kasten bewegen, um kurzfristig die Aufmerksamkeit des Tieres zu erwecken. Während des gesamten Tests sollte das Verhalten des Tieres genau beobachtet werden.
Testwiederholungen:
Ist sich der Experimentator während des Experiments zu einem Zeitpunkt nicht sicher, ob es sich bei dem Wegziehen der Pfote um eine Reaktion auf den Hitzestimulus gehandelt hat, so kann das Tier nach 5-8 Minuten nochmals getestet werden. Dies kann seine Ursache in einer plötzlichen Bewegung des Tieres oder Urinieren oder Defäkieren während der Anwendung des Stimulus haben.
Akzeptable Reaktionen:
Als Reaktionen auf den Hitzestimulus werden die folgenden Reaktionen angesehen:

– wegziehende Bewegung der Pfote vom Glas (häufig gefolgt von Pfotenlecken)
– seitliche Bewegung des Körpers (zur der der stimulierten Pfote gegenüberliegenden Seite)
– die Zehen werden vom Glas genommen
– der zentroplanare (mittlere Pfote) Aspekt der entzündeten Pfote wird vom Glas genommen.

Analyse
Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wird mit dem T-Test zum Vergleich von naiven Ratten und Ratten mit Entzündungen und mit dem Einweg-ANOVA-Test und einem darauf folgenden multiplen Dunnett-Vergleichstest (post-hoc) auf die Wirksamkeit des Arzneimittels untersucht. Ein Unterschied zwischen einzelnen Gruppen wird als signifikant betrachtet, wenn der p-Wert ≤ 0,05 beträgt.
BEISPIELE
Die Erfindung wird weiter ausführlicher durch die folgenden Beispiele beschrieben, in denen Verfahren beschrieben werden, nach denen sich die Verbindungen der vorliegenden Erfindung herstellen, auf reinigen, analysieren und biologisch untersuchen lassen, die jedoch nicht als die Erfindung einschränkend aufzufassen sind.
ZWISCHENPRODUKT 1: 4-[(Dimethoxyphosphinyl)methyl]benzoesäuremethylester
Eine Mischung von 4-(Bromomethyl)benzoesäuremethylester (11,2 g, 49 mmol) und Trimethylphosphit (25 ml) wurde 5 Stunden lang unter N₂ am Rückfluß erhitzt. Überschüssiges Trimethylphosphit wurde durch gemeinsames Destillieren mit Toluol entfernt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 1 in quantitativer Ausbeute erhielt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 3,20 (d, 2H, J = 22 Hz, CH₂), 3,68 (d, 3H, 10,8 Hz, OCH₃), 3,78 (d, 3H, 11,2 Hz, OCH₃), 3,91 (s, 3H, OCH₃), 7,38 (m, 2H, Ar-H), 8,00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H).
ZWISCHENPRODUKT 2: 4-(4-Methoxycarbonylbenzyliden)piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 1 in trockenem THF (200 ml) wurde bei –78°C tropfenweise mit Lithiumdiisopropylamid (32,7 ml, 1,5 M in Hexan, 49 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und anschließend mit N-tert.-Butoxycarbonyl-4-piperidon (9,76 g, 49 mmol in 100 ml trockenem THF) versetzt. Nach 12 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (300 ml) gequencht und mit Essigsäureethylester (3 × 300 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, wodurch man ein Produkt erhielt, das durch Flash-Chromatographie zum ZWISCHEN-PRODUKT 2 als weißem Feststoff (5,64 g, 35%) aufgereinigt wurde. IR (NaCl) 3424, 2974, 2855, 1718, 1688, 1606, 1427, 1362, 1276 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 1,44 (s, 9H), 2,31 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 2,42 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,37 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,48 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,87 (s, 3H, OCH₃), 6,33 (s, 1H, CH), 7,20 (d, J = 6, 7 Hz, 2H, Ar-H), 7,94 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 28,3, 29,2, 36,19, 51,8, 123,7, 127,8, 128,7, 129,4, 140,5, 142,1, 154,6, 166,8.
ZWISCHENPRODUKT 3: 4-[brom-4-[brom-(4-methoxycarbonylphenyl)methyl]piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester
Eine Mischung von ZWISCHENPRODUKT 2 (5,2 g, 16 mmol) und K₂CO₃ (1,0 g) in trockenem Dichlormethan (200 ml) wurde bei 0°C mit einer Lösung von Brom (2,9 g, 18 mmol) in 30 ml CH₂Cl₂ versetzt. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung nach dem Abfiltrieren von K₂CO₃ eingedampft. Der Rückstand wurde dann in Essigsäureethylester (200 ml) gelöst, mit Wasser (200 ml), 0,5 M HCl (200 ml) und Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, und über MgSO₄ getrocknet. Durch Entfernen der Lösungsmittel erhielt man ein Produkt, das aus Methanol umkristallisiert wurde, wodurch man ZWISCHEN-PRODUKT 3 als einen weißen Feststoff (6,07 g, 78%) erhielt. IR (NaCl) 3425, 2969, 1725, 1669, 1426, 1365, 1279, 1243 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃) 1,28 (s, 9H), 1,75 (m, 1H), 1, 90 (m, 1H), 2,1 (m, 2H), 3,08 (br, 2H), 3,90 (s, 3H, OCH₃), 4,08 (br, 3H), 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H) 7,98 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 28,3, 36,6, 38,3, 40,3, 52,1, 63,2, 72,9, 129,0, 130,3, 130,4, 141,9, 154,4, 166,3.
ZWISCHENPRODUKT 4: 4-[Brom-(4-carboxyphenyl)methylen]piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 3 (5,4 g 11 mmol) in Methanol (300 ml) und 2,0 M NaOH (100 ml) wurde 3 Stunden lang auf 40°C erhitzt. Der Feststoff wurde abfiltriert und über Nacht im Vakuum getrocknet. Das trockene Salz wurde in 40% Acetonitril/Wasser gelöst und mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. ZWISCHENPRODUKT 4 (3,8 g, 87%) wurde durch Filtrieren als weißes Pulver isoliert: ¹H-NMR ^t(CDCl₃) δ 1,45 (s, 9H, ^tBu), 2,22 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 2,64 (dd, J = 5, 5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 3,34 (dd, J = 5, 5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 3,54 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H), 8,08 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 28,3, 31,5, 34,2, 44,0, 115,3, 128,7, 129,4, 130,2, 137,7, 145,2, 154,6, 170,3.
ZWISCHENPRODUKT 5: 4-[Brom-(4-diethylcarbamoylphenyl)methylen]piperidin-1-carbonsäure-tert.-butylester
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 4 (1,0 g, 2,5 mmol) in trockenem Dichlormethan (10 ml) wurde bei –20°C mit Chlorameisensäureisobutylester (450 mg, 3,3 mmol) versetzt. Nach 20 min bei –20°C wurde Diethylamin (4 ml) zugesetzt, und der Ansatz wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Nach 1,5 Stunden wurden die Lösungsmittel abgedampft, und der Rückstand wurde zwischen Essigsäureethylester und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Durch Entfernen der Lösungsmittel erhielt man ein Produkt, das durch Flash-Chromatographie aufgereinigt wurde, was ZWISCHENPRODUKT 5 als weiße Nadeln (800 mg, 73%) lieferte: IR (NaCl) 3051, 2975, 1694, 1633, 1416, 1281, 1168, 1115 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 1,13 (br, 3H, CH₃), 1,22 (br, 3H, CH₃), 1,44 (s, 9H, ^tBu), 2,22 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 2,62 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,33 (m, 4H), 3,55 (m, 4H), 7,31 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar-H), 7,36 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar-H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 12,71, 14,13, 28,3, 31,5, 34,2, 39,1, 43,2, 79,7, 115,9, 126,3, 129,3, 136,8, 137,1, 140,6, 154,6, 170,5.
ZWISCHENPRODUKT 6: 4-[Brom(piperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 5 (15,6 g, 34,6 mmol) in Dichlormethan (200 ml) wurde mit Trifluoressigsäure (30 ml, 311 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann mit gesättigter NaHCO₃-Lösung neutralisiert, die wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingeengt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 6 als einen hellgelben Feststoff (12,05 g, 99%) erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 7a: 4-{Brom-[1-(thien-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 6 (1,4 g, 3,99 mmol) in 1,2-Dichlorethan (30 ml) wurde mit 2-Thiophencarboxaldehyd (746 μl, 7,99 mmol) und Natriumtriacetoxyborhydrid (1,694 g, 7,99 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 18 Stunden wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan (7:3) als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 7a (1,702 g, 95%) als ein dickes farbloses Öl erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 8a: 4-{(3-Aminophenyl)[1-(thien-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 7a (1,702 g, 3,81 mmol) in einer Mischung aus Toluol (40 ml) und Ethanol (5 ml) wurde mit m-Aminobenzolboronsäure-monohydrat (0,886 g, 5,71 mmol) und wäßriger Natriumcarbonatlösung (2 M, 4, 76 ml, 9, 52 mmol) versetzt. Dann wurde 25 min Stickstoff durch die Lösung geleitet und anschließend mit Palladiumtetrakistriphenylphosphin (0,439 g, 0,38 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 5 Stunden lang auf 90°C erhitzt und dann abgekühlt und mit gesättigter Ammoniumchloridlösung (40 ml) und Essigsäureethylester versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Essigsäureethylester extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel auf gereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 8a als einen gelben Schaum (1,605 g, 91%) erhielt.
VERBINDUNG 1: N,N-Diethyl-4-{{3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl}[1-(thien-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 8a (325 mg, 0,7 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde mit Triethylamin (302 μl, 0,78 mmol) und anschließend mit Methansulfonsäureanhydrid (135 mg 2,17 mmol) versetzt. Die Lösung wurde eine Stunde lang gerührt, und dann wurde gesättigte wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (10 ml) zugegeben. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von 10% bis 40% Acetonitril in Wasser mit 0,1 Trifluoressigsäure als Laufmittel auf gereinigt. Das Produkt wurde als das Trifluoressigsäuresalz erhalten und lyophilisiert, was einen weißen Feststoff (152 mg, 33%) lieferte. Reinheit (HPLC): > 99% (215 nm); > 99% (254 nm); > 99% (280 nm). Gefunden: C, 53,83; H, 5,18; N, 6,13. C₂₉H₃₅N₃O₃S₂ × 1,5 CF₃CO₂H × 0,3 H₂O erfordert C, 53,82; H, 5,24; N, 5,88%. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,10-1,15 (m, 3H), 1,22-1,28 (m, 3H), 2,65-2,81 (m, 6H), 2,95 (s, 3H), 3,28 (br s, 2H), 3,54-3,62 (m, 4H), 4,44 (s, 2H), 6,84 (d, J = 7,68 Hz, 1H), 7,01 (br s, 1H), 7,04-7,10 (m, 3H), 7,13-7,19 (m, 1H), 7,20-7,23 (m, 1H), 7,30 (d, J = 8,25 Hz, 2H), 7,44 (d, J = 4,96 Hz, 1H), 7,56 (br s, 1H).
ZWISCHENPRODUKT 7b: 4-{Brom-[1-(2-furylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 6 (1,4 g, 3,99 mmol) in 1,2-Dichlorethan (30 ml) wurde mit 2-Furaldehyd (62 μl, 7,99 mmol) und Natriumtriacetoxyborhydrid (1,694 g, 7,99 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 18 Stunden wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan (7: 3) als Laufmittel auf gereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 7b (1,503 g, 87%) als ein hellgelbes Öl erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 8b: 4-{(3-Aminophenyl)-[1-(2-furylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 7b (2,120 g, 4,93 mmol) in einer Mischung aus Toluol (50 ml) und Ethanol (10 ml) wurde mit m-Aminobenzolboronsäure-monohydrat (1,145 g, 7,39 mmol) und wäßriger Natriumcarbonatlösung (2 M, 6,15 ml, 12,31 mmol) versetzt. Dann wurde 25 min Stickstoff durch die Lösung geleitet und anschließend mit Palladiumtetrakistriphenylphosphin (0,569 g, 0,49 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 5 Stunden lang auf 90°C erhitzt und dann abgekühlt und mit gesättigter Ammoniumchloridlösung (40 ml) und Essigsäureethylester versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Essigsäureethylester extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel auf gereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 8b als einen gelben Schaum (1,967 g, 90%) erhielt.
VERBINDUNG 2: N,N-Diethyl-4-[[1-(2-furanylmethyl)-4-piperidinyliden][3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl]methyl]benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 8b (427 mg, 0,96 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde mit Triethylamin (416 μl, 2,97 mmol) und anschließend mit Methansulfonsäureanhydrid (184 mg 1,06 mmol) versetzt. Die Lösung wurde eine Stunde lang gerührt, und dann wurde gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (10 ml) zugegeben. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von 10% bis 40% Acetonitril in Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure als Laufmittel aufgereinigt. Das Produkt wurde weiter durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 1% Ammoniumhydroxid 10% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt. Das Produkt wurde in Diethylether (15 ml) gelöst und mit einer 1M Lösung von HCl in Diethylether (2 ml) versetzt und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wodurch man VERBINDUNG 2 als das entsprechende HCl-Salz und als ein weißes Pulver (128 mg; 23% Ausbeute) erhielt. Reinheit (HPLC) : > 99% (215 nm); > 99% (254 nm); > 99% (280 nm). Gefunden: C, 59,67; H, 6,58; N, 7,18. C₂₉H₃₅N₃O₄S × 1,2 HCl × 1,0 H₂O erfordert C, 59,70; H, 6,60; N, 7,20% ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1,12-1,24 (m, 6H), 1,87 (br s, 2H), 2,68 (br s, 2H), 2,98 (s, 3H), 3,00 (br s, 2H), 3,27 (br s, 2H), 3,45-3,60 (m, 4H), 4,29 (br s, 2H), 6,46 (br s, 1H), 6,80 (br s, 2H), 7,08 (br s, 2H), 7,14 (br s, 1H), 7,26 (br s, 2H), 7,30 (br s, 2H), 7,51 (br s, 1H).
ZWISCHENPRODUKT 7c: 4-{Brom-[1-(phenylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 6 (7,7838, 22,2 mmol) in Dichlormethan (160 ml) wurde mit Triethylamin (9,3 ml, 66,8 mmol) und Benzylbromid (3,2 ml, 26,9 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 24 Stunden wurde der Ansatz mit Wasser gewaschen, und die wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Essigsäureethylester/Hexan (7: 3) als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 7c (6,89 g, 70%) als einen farblosen Feststoff erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 8c: 4-{(3-Aminophenyl)[1-(phenylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 7c (8,50 g, 19,3 mmol) in einer Mischung aus Xylol (120 ml) und Ethanol (80 ml) wurde mit m-Aminobenzolboronsäure-monohydrat (3,96 g, 28,9 mmol) und wäßriger Natriumcarbonatlösung (2M, 29,0 ml, 58 mmol) versetzt. Dann wurde 25 min Stickstoff durch die Lösung geleitet und anschließend mit Palladiumtetrakistriphenylphosphin (1,67 g, 1,4 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 18 Stunden lang auf 90°C erhitzt und dann abgekühlt und mit Wasser (60 ml) und Essigsäureethylester versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Essigsäureethylester extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 2% bis 4% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 8c als einen orangefarbenen Schaum (8,14 g, 93%) erhielt.
VERBINDUNG 3: N,N-Diethyl-4-[[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyliden][3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl]methyl]benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 8c (392 mg, 0,87 mmol) in Dichlormethan (15 ml) wurde mit Triethylamin (145 μl, 1,04 mmol) und anschließend mit Methansulfonylchlorid (80 μl, 1,03 mmol) versetzt. Die Lösung wurde vier Stunden lang gerührt, und dann wurde gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (10 ml) zugegeben. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 3% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt. Der Rückstand wurde weiter durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von 20% bis 50% Acetonitril in Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure als Laufmittel aufgereinigt. VERBINDUNG 3, die als das Trifluoressigsäuresalz erhalten wurde, wurde lyophilisiert, was einen farblosen Feststoff (170,4 mg, 44% Ausbeute) lieferte. Reinheit (HPLC): > 99% (215 nm); > 99% (254 nm); > 99% (280 nm). Gefunden: C, 58,9; H, 5,61; N, 6,15. C₃₁H₃₇N₃O₃S × 1,3 TFA × 0,3 H₂O erfordert C, 58,9; H, 5,72; N, 6,13%. ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,10 (t, J = 6,5Hz, 3H), 1,22 (t, J = 6,5Hz, 3H), 2,48-2,51 (m, 2H), 2,72-2,83 (m, 2H), 2,89 (s, 3H), 3,06-3,11 (m, 2H), 3,27-3,29 (m, 2H), 3,50-3,53 (m, 4H), 4,34 (s, 2H), 6,91 (d, J = 7,5Hz, 1H), 7,09-7, 11 (m, 2H), 7,24 (d, J = 8,5Hz, 2H), 7,28-7,36 (m, 3H), 7,49 (s, 5H). ZWISCHENPRODUKT 7d: 4-[Brom-[1-(3-pyridinylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl]-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 6 (0,5 g, 1,42 mmol) in 1,2-Dichlorethan (15 ml) wurde mit 3-Pyridincarboxaldehyd (160 μl, 1,71 mmol) und Natriumtriacetoxyborhydrid (392 mg, 1,85 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 18 Stunden wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 7d (630 mg, 100%) als ein gelbes Öl erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 8d: 4-((3-Aminophenyl)[1-(3-pyridinylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl]-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 7d (630 mg, 1,42 mmol) in einer Mischung aus Toluol (9 ml) und Ethanol (2 ml) wurde mit m-Aminobenzolboronsäure-monohydrat (264 mg, 1,70 mmol) und wäßriger Natriumcarbonatlösung (2M, 1,8 ml, 3,55 mmol) versetzt. Dann wurde 25 min Stickstoff durch die Lösung geleitet und anschließend mit Palladiumtetrakistriphenylphosphin (98 mg, 0,09 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 5 Stunden lang auf 90°C erhitzt und dann abgekühlt und mit gesättigter Ammoniumchloridlösung (40 ml) und Essigsäureethylester versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Essigsäureethylester. extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 3% bis 5% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 8d als einen farblosen Schaum (559 mg, 84%) erhielt.
VERBINDUNG 4: N,N-Diethyl-4-[[3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl][1-(3-pyridinylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl]benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 8d (272 mg, 0,60 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde mit Triethylamin (290 μl, 2,09 mmol) und anschließend mit Methansulfonylchlorid (60 μl, 0,77 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (10 ml) versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von 10% bis 40% Acetonitril in Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure als Laufmittel aufgereinigt. VERBINDUNG 4, die als das Trifluoressigsäuresalz erhalten wurde, wurde lyophilisiert, was einen farblosen Feststoff (193,2 mg, 43% Ausbeute) lieferte. Reinheit (HPLC): > 99% (215 nm); > 99% (254 nm); > 99% (280 nm). Gefunden: C, 51,23; H, 4,75; N, 6,93. C₃₀H₃₆N₄O₃S × 0, 1 H₂O × 2, 5 TFA erfordert C, 51,29; H, 4,76; N, 6,84%. ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,10 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,22 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 2,65 (br s, 4H), 3,26-3,54 (m, 8H), 4,47 (s, 2H), 6,92 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,10-7,12 (m, 2H), 7,24 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,29-7,37 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,1, 8,0 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 8, 0 Hz, 1H), 8,73-8,77 (m, 2H).
ZWISCHENPRODUKT 9: 4-[[4-[(Diethylamino)carbonyl]phenyl](3-nitrophenyl)methylen]-1-piperidincarbonsäure-1,1-dimethylethylester
Synthetisiert wie für ZWISCHENPRODUKT 8c gezeigt, wobei allerdings als Vinylbromid ZWISCHENPRODUKT 5 und als Boronsäure m-Nitrobenzolboronsäure verwendet wurde.
ZWISCHENPRODUKT 10: N,N-Diethyl-4-[(3-nitrophenyl)-4-piperidinylidenmethyl]benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 9 (1,0 g, 2,03 mmol) in Dichlormethan (15 ml) wurde mit Trifluoressigsäure (1,6 ml, 20,7 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Natronlauge (2 M, 15 ml) gequencht. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit Dichlormethan (20 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 35% Methanol in Dichlormethan ansteigend auf 50% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 10 (613,5 mg, 77%) als einen gelben Schaum erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 11: N,N-Diethyl-4-{(3-nitrophenyl)[1-(1,3-thiazol-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 10 (341 mg, 0,87 mmol) in 1,2-Dichlorethan (10 ml) wurde mit 2-Thiazolcarboxaldehyd (91 μl, 1,71 mmol) und Natriumtriacetoxyborhydrid (392 mg, 1,04 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 3% Methanol in Dichlormethan als Laufmittel aufgereinigt, wodurch man ZWISCHENPRODUKT 11 (332 mg, 78%) als einen farblosen Schaum erhielt.
ZWISCHENPRODUKT 12: 4-{(3-Aminophenyl)[1-(1,3-thiazol-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}-N,N-diethylbenzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 11 (266 mg, 0,54 mmol) in einer Mischung aus Ethanol, Tetrahydrofuran, Wasser und gesättigter wäßriger Ammoniumchloridlösung (Verhältnis 4:2:1:1 v/v) (3 ml) wurde mit einer kleinen Menge an Eisenpulver versetzt, und der Ansatz wurde in einem Mikrowellenofen 5 Minuten lang auf 150°C erhitzt. Die Feststoffe wurden abfiltriert und das Produkt wurde mit Essigsäureethylester extrahiert, wodurch man ZWISCHEN-PRODUKT 12 (249,7 mg, 100) als einen farblosen Schaum erhielt.
VERBINDUNG 5: N,N-Diethyl-4-[[3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl][1-(3-thiazolylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl]benzamid
Eine Lösung von ZWISCHENPRODUKT 12 (171 mg, 0,37 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde mit Triethylamin (181 μl, 1,31 mmol) und anschließend mit Methansulfonylchlorid (45 μl, 0,58 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (10 ml) versetzt. Die wäßrige Phase wurde mit zwei Portionen Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von 10% bis 40% Acetonitril in Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure als Laufmittel aufgereinigt. VERBINDUNG 5, die als das Trifluoressigsäuresalz erhalten wurde, wurde lyophilisiert, was einen farblosen Feststoff (40,7 mg, 14% Ausbeute) lieferte. Reinheit (HPLC): > 99% (215 nm); > 99% (254 nm); > 99% (280 nm). Gefunden: C, 51,23; H, 4,75; N, 6,93. C₃₀H₃₆N₄O₃S × 0,1 H₂O × 2,5 TFA erfordert C, 51,29; H, 4,76; N, 6,84%. NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1,10 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,22 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 2,65 (br s, 4H), 3,26-3,54 (m, 8H), 4,47 (s, 2H), 6,92 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,10-7,12 (m, 2H), 7,24 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,29-7,37 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,1, 8,0 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,73-8,77 (m, 2H).

Claims

Verbindungen der Formel I, deren pharmazeutisch annehmbare Salze, Diastereomere, Enantiomere oder Mischungen davon:
wobei R¹ ausgewählt ist aus C_6-10-Aryl und C_2-6-Heteroaryl, wobei diese C_6-10-Aryl- und C_2-6-Heteroarylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen; und R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl und C_3-6-Cycloalkyl, wobei die C_1-6-Alkyl- und C_3-6-Cycloalkylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen.
Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R¹ ausgewählt ist aus Phenyl, Pyridyl, Thienyl, Furyl, Imidazolyl, Triazolyl, Pyrrolyl, Thiazolyl und N-Oxidopyridyl, wobei R¹ gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, halogeniertem C_1-6-Alkyl, -NO₂, -CF₃, C_1-6-Alkoxy, Chlor, Fluor, Brom und Iod substituiert ist; R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander für C_1-3-Alkyl oder halogeniertes C_1-3-Alkyl stehen; R⁵ ausgewählt ist aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl und C_3-6-Cycloalkyl, wobei die C_1-6-Alkyl- und C_3-6-Cycloalkylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, halogeniertem C_1-6-Alkyl, -NO₂, -CF₃, C_1-6-Alkoxy, Chlor, Fluor, Brom und Iod substituiert sind.
Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R¹ ausgewählt ist aus Phenyl, Pyridyl, Thienyl, Furyl, Imidazolyl, Pyrrolyl und Thiazolyl, wobei R¹ gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, halogeniertem C_1-6-Alkyl, -NO₂, -CF₃, C_1-6-Alkoxy, Chlor, Fluor, Brom und Iod substituiert ist; R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander für C_1-3-Alkyl oder halogeniertes C_1-3-Alkyl stehen; und R⁵ für Wasserstoff steht.
Verbindungen nach Anspruch 1, wobei R¹ ausgewählt ist aus Phenyl, Pyridyl, Thienyl, Furyl, Imidazolyl, Pyrrolyl und Thiazolyl; R² und R³ für Ethyl stehen; R⁴ für C_1-3-Alkyl steht; und R⁵ für Wasserstoff steht.
Verbindungen nach Anspruch 1, ausgewählt aus: N,N-Diethyl-4-{{3-[(methylsulfonyl]amino]phenyl}[1-(thien-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl}benzamid; N,N-Diethyl-4-[[1-(2-furanylmethyl)-4-piperidinyliden][3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl]methyl]benzamid; N,N-Diethyl-4-[[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyliden][3-[(methylsulfonyl)amino]phenyl]methyl]benzamid; N,N-Diethyl-4-[[3-[(methylsulfonyl]amino]phenyl][1-(3-pyridinylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl]benzamid; N,N-Diethyl-4-[[3-[(methylsulfonyl]amino]phenyl][1-(3-thiazolylmethyl)-4-piperidinyliden]methyl]benzamid; und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 bei der Herstellung eines Medikaments für die Therapie von Schmerzen, Ängstlichkeit oder funktionellen gastrointestinalen Erkrankungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, bei dem man:
eine Verbindung der Formel II mit X-S(=O)₂-R⁴ oder R⁴S(=O)₂-O-S(=O)₂R⁴ umsetzt,
wobei X ausgewählt ist aus Cl, Br und I; R¹ ausgewählt ist aus C_6-10-Aryl und C_2-6-Heteroaryl, wobei diese C_6-10-Aryl- und C_2-6-Heteroarylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen; und R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl und C_3-6-Cycloalkyl, wobei die C_1-6-Alkyl- und C_3-6-Cycloalkylreste gegebenenfalls durch eine oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -R, -NO₂, -OR, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -C(=O)R, -C(=O)OH, -NH₂, -SH, -NHR, -NR₂, -SR, -SO₃H, -SO₂R, -S(=O)R, -CN, -OH, -C(=O)OR, -C(=O)NR₂, -NRC(=O)R und -NRC(=O)-OR substituiert sind, wobei die Reste R unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl stehen.