DE60030621T2 - DNA-Konstrukt zur gewebespezifischen Expression eines Blutkgerinnungsfaktors - Google Patents

DNA-Konstrukt zur gewebespezifischen Expression eines Blutkgerinnungsfaktors Download PDF

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Description

  • Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-Konstrukt für die gewebespezifische Expression eines Blutgerinnungsfaktors.
  • Es ist bekannt, daß der Faktor IX (FIX) ein von Vitamin K abhängiges Glycoprotein ist, welches durch Hepatocyten produziert und in den Blutkreislauf ausgeschieden wird (Kurachi et al., 1995; Sailer et al., 1990). Das FIX-Gen befindet sich auf dem X-Chromosom und enthält 8 Exons und 7 Introns (Camerino et al., 1984; Boyd et al., 1984; Yoshitake et al., 1985). Das Fehlen oder Defizite von Faktor IX verursachen eine schwere Blutungsstörung, die als Hämophilie B bezeichnet wird (Roberts et al., 1993).
  • Hämophilie B ist eine Störung, welche aus Modifikationen eines einzelnen bekannten Gens herrührt. Sie wurde daher früh als potentielles Ziel einer Gentherapie vorgeschlagen. Die als Zellen ausgewählten Ziele müssen für den Gentransfer leicht zugänglich sein und müssen Faktor IX in signifikanter Menge exprimieren. In diesen Targetzellen muß das Faktor IX-Molekül modifiziert werden, um ein aktiver Gerinnungsfaktor zu werden (γ-Carboxylierung und Spaltung des Propeptids). Es wurden mehrere potentielle Targetzellen, wie Leberzellen (Nakai et al., 1998), Keratinocyten (White et al., 1998), Meskelzellen (Baru et al., 1995; Wang et al., 1997) oder Knochenmarkstammzellen (Cherington et al., 1998) getestet. In vitro wurde von der Humanmyeloidleukämiezelllinie (HL60), welche mit einem eine Human FIX-cDNA-tragenden retroviralen Vektor transfisziert war, gezeigt, daß sie fähig ist, einen biologisch aktiven FIX zu produzieren (Hao et al., 1995). Diese Erfindung ist auf die Expression von Blutgerinnungsfaktoren in hämatopoetischen Zellen und insbesondere in Plättchen gerichtet.
  • Als hämatopoetische Zellen wurde die Humanerythroleukämiezelllinie HEL bereits verwendet, welche überwiegend einen Erythroidphenotyp exprimiert (Martin et al., 1982) aber auch einige megakaryocytische Marker, wie Plättchenmembranglycoproteine (Tabilio et al., 1984). Nach der Induktion durch Phorbol-12-myristat-l3-acetat (PMA) exprimiert die HEL-Zelllinie erhöhte Mengen an megakaryocytischen Proteinen, wie Glycoprotein IIb/IIIa-Komplex, Plättchenfaktor 4 oder von Willebrand-Faktor (Long and coll., 1990). Die PMA-Effekte werden durch die Aktivierung von Proteinkinase C mediiert (Nishizuka et al., 1984; Hong et al., 1996).
  • Das Humanplättchenglycoprotein IIb (GPIIb) ist die α-Untereinheit des Plättchenintegrins αIIbβ3, auch als IIb-IIIa-Komplex bekannt, welche als spezifischer Rezeptor für Fibrinogen, Fibronectin und von Willebrand-Faktor wirkt (Haas and Plow, 1994). GPIIb cDNA wurde ursprünglich aus mRNA-Bibliotheken von HEL-Zellen und Humanmegakaryocyten isoliert (Uzan et al., 1988; Frachet et al., 1990). Das Human GPIIb-Gen wurde von Prandini et al. (1988) identifiziert. In WO 9300438 sind die regulatorischen Elemente des GPIIb-Promotors beschrieben. Hao et al. (1995) exprimierten FIX in humanhämatopoetischen Zellen. Jallat et al. (1990) exprimierten FIX in transgenen Mäusen und Kurachi et al. (1995) beschrieben, wie durch Integrieren von trunkierten Versionen von FIX Intron I in die FIX cDNA das Expressionsniveau von FIX erhöht werden konnte.
  • Die Gewebespezifität des GPIIb-Promotors wurde unter Verwendung des Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Reportergens bewertet. Unter GPIIb-Promotorkontrolle wurde eine CRT-Expression nur in der hämatopoetischen Zelllinie HEL festgestellt (Uzan et al., 1991).
  • Um Hämophilie B durch Gentherapie zu behandeln, ist eine gewebespezifische Expression von Faktor IX erforderlich. Die vor liegende Erfindung liefert eine Lösung für das Problem der Expression von Blutgerinnungsfaktoren in derartigen hämatopoetischen Zellen.
  • Es wurde nun festgestellt, daß ein DNA-Konstrukt für eine gewebespezifische Expression eines Blutgerinnungsfaktors geeignet ist, wenn dieses eine DNA umfaßt, welche für eine Aminosäuresequenz eines Blutgerinnungsfaktors codiert und eine DNA, welche für einen Promotor codiert, der für die Expression in hämatopoetischen Zellen spezifisch ist. Die Lösung für das vorstehend erwähnte Problem wurde mit einem DNA-Konstrukt gezeigt, worin als Promotor die DNA verwendet wurde, welche für das Humanplättchenglycoprotein IIb (=GPIIb) codiert.
  • Die Entwicklung des genannten DNA-Konstrukts wurde wie folgt durchgeführt:
  • A. Konstruktion von chimeren Molekülen
  • 1. Ausbildung der FIX cDNAs:
  • Wildtyp FIX-Gen enthält 3 ATG Codons in einem Raster, welche bei der Aminosäure –46, –41 und –39 als Cluster vorliegt. Um eine Verbesserung der FIX Produktion zu versuchen, wurden 5 FIX cDNA-Expressionsvektoren mit verschiedenen ATG-Stellen hergestellt, gesteuert vom CMV-Promotor. Das trunkierte FIX-Intron 1, von welchem zuvor gezeigt wurde, daß es eine die Expression erhöhende Aktivität in der HepG2-Zelllinie besitzt (Kurachi et al., 1995), wurde geklont und in FIX cDNAs eingeführt. In einem Anfangsteil dieses Projekts lieferten stabile Transfektionen von CHO-Zellen mit CMV-FIX(–41S)- und CMV-FIX (–41S.I1)-Konstrukten die beste FIX-Produktion in den Kulturüberständen. Diese beiden cDNA-Konstrukte FIX(–41S) und FIX (–41S.I1), welche nur das –41 ATG tragen, waren daher die ersten FIX-Konstrukte, die zur Transfektion der hämatopoetischen Zelllinie verwendet wurden. Die modifizierte 5'-Extremität der FIX(–415)cDNA (SEQ.ID.No.1) ist
    Figure 00040001
  • Alle mit FIX(–41S) cDNAs erhaltenen Ergebnisse wurden jedoch weiter mit den FIX(WT) und FIX(WT.I1) cDNAs bestätigt. Die 5'-Extremität von FIX WT cDNA (SEQ.ID.No.2) ist
    Figure 00040002
  • 2. Ausbildung der GPIIb-Promotorvektoren
  • Der linienspezifische Promotor GPIIb wurde ausgewählt, um FIX-Transgene in hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Der pBLCAT-GPIIb-Vektor, welcher den –643/+33 GPIIb-Promotor trägt und das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Reportergen wurden von G. Uzan erhalten.
  • Um pcDNA3-Vektoren (Invitrogen, Niederlande) als Expressionsvektor für FIX zu verwenden (welche mehr Restriktionsenzymstellen und ein Neomycinresistenzgen aufweisen und daher für die nächsten Studien zweckmäßiger erschienen), wurde der endogene CMV-Promotor durch den GPIIb-Promotor ersetzt. Dieser Promotor wurde aus dem pBLCAT-GBIIb-Vektor nach einer HindIII-BamHI-Verdauung ausgewählt. Dieses Produkt umfaßte das –597 bis +33-Fragment des GPIIb-Promotors (SEQ.ID.No.3), welches die wesentlichen Domainen für die Promotorspezifität umfaßt (Uzan et al., 1991 und 1995). Es wurde in eine CMV-deletierte pcDNA3 eingeführt, welche durch die gleichen Enzyme geöffnet wurde. Das erhaltene Konstrukt war das sogenannte pcDNA3-GPIIb (SEQ.ID.No.4 und 1). Alle FIX cDNAs wurden in pcDNA3- GPIIb-Plasmid unter Verwendung von BamHI-Xhol-Verdauung subkloniert.
  • 3. Ausbildung des β-Galactosidase-Vektors
  • Um die Aktivität des trunkierten (–597/+33) GPIIb-Promotors in der HEL-Zelllinie zu untersuchen, wurde das β-Galactosidase-Reportergen ausgewählt. Der pUT535-Vektor (Cayla, Toulouse, Frankreich), worin die β-Gal-Genexpression durch den CMV-Promotor und den Enhancer (2) gesteuert wird, wurde ausgewählt. Um die CMV-Sequenzen durch den trunkierten GPIIb-Promotor auszutauschen, wurde der GPIIb-Promotor durch HindIII-BamHI verdaut, mit Klenow DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Extremitäten zu erhalten und anschließend in mit BstEII-Ncol geöffneten pUT535, behandelt mit Klenow DNA-Polymerase, eingebracht. Der GPIIb-β-Gal-Vektor wurde als pUT535-GPIIb (2) bezeichnet. Das negative Kontrollplasmid (pUT535-δCMV) war pUT535, welches durch BstEII-Ncol-Verdauung von den CMV-Sequenzen deletiert war.
  • B. Gewebespezifität des GPIIb-Promotors in hämatopoetischen Zellen
  • pUT535, pUT535δCMV und pUT535-GPIIb-Konstrukte wurden in zwei verschiedenen Zelllinien getestet: HEL- und HeLa-Zellen. Die HEL-Zelllinie (Humanerythroleukemiezellen) ist eine klassische Zelllinie, die verwendet wird, um die megakaryocytische Promotorexpression zu untersuchen. HeLa-Zellen (Humangebärmutterepitheloidkarzinom) sind deren klassisches Negativkontrollgegenstück.
  • Materialien und Methoden:
  • HEL-Zellen wurden in RPMI/10% FCS-Medium mit 5% CO2 gehalten. β-Gal-Vektoren (2 μg DNA) wurden in HEL-Zellen (1 × 106-Zellen) unter Verwendung von FUGENETM 6 (Boehringer Mannheim) trans fisziert. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Zellen geerntet und in 10 ml RPMI/1% BSA (Boehringer, Mannheim) eingebracht. PMA (Sigma) wurde dem Medium in einem der beiden Assays zugesetzt (Endkonzentration: 1 nM). HeLa-Zellen wurden in DMEM-10% FCS mit 5% CO2 gehalten. 90 mm Petrischalen mit 5 × 106-Zellen wurden am Tag vor der Transfektion hergestellt. Die Zellen wurden mit 20 μg DNA und 20 μl LipofectinTM-Reagens (Gibco) während 5 Stunden behandelt. Nach dieser Inkubationsdauer wurden die Zellen gewaschen und in DMEM-1% BSR mit oder ohne PMA 1 nM eingebracht. Die Zellen wurden 40 Stunden später geerntet, mit einem Lysis-Puffer inkubiert und die Lysate wurden auf eine Endproteinkonzentration von 1,5 mg/ml verdünnt. Der chemiluminescente β-Gal-Reportergen-Assaykit (Boehringer Mannheim) wurde wie vom Hersteller beschrieben verwendet, um die β-Galactosidase zu quantifizieren.
  • Ergebnisse:
  • In HeLa-Zellen wurde das β-Gal-Reportergen nur exprimiert, wenn die Zellen mit einem den CMV-Promotor enthaltenden Vektor, mit oder ohne PMA-Induktion, transfisziert wurden. Es wurde keine β-Gal-Expression mit dem Konstrukt gefunden, welches vom GPIIb-Promotor gesteuert wurde (3, Gruppe A).
  • In HEL-Zellen (3, Gruppe B) ergab CMV die höchste β-Gal-Produktion (nachstehende Tabelle 1). Der GPIIb-Promotor führte jedoch zur Produktion einer signifikanten Menge an β-Gal mit einem Anstieg in der Produktion nach der PMA-Behandlung. Wenn die mit pUt535 in HEL-Zellen erhaltene β-Gal-Menge als 100 angenommen wurde, betrug die β-Gal-Menge mit trunkiertem GPIIb-Promotor 13% in den Zellen ohne PMA-Behandlung. Zum Vergleich fanden Uzan et al. (1991), daß die CAT-Aktivität mit dem GPIIb-Promotor 15% der CAT-Aktivität entsprach, welche mit der RSV-Promotorkontrolle in der gleichen Zelllinie erhalten wurde.
    Figure 00070001
    Tabelle 1: β-Gal-Aktivität in vorübergehend transfiszierten HEL-Zellen
  • Zusammengefaßt rief der –597/+33 GPIIb-Promotor eine gewebespezifische Expression des Reportergens in der hämatopoetischen Zelllinie hervor, da keine β-Gal-Expression in HeLa-Zellen festgestellt wurde. In diesen vorübergehenden Transfektionen von HEL-Zellen war die mit diesem hämatopoetisch-spezifischen Promotor erhaltene β-Gal-Produktion im Vergleich zu den Ergebnissen, welche mit dem CMV-Promotor gemessen wurden, gering. Die in vitro erhaltenen Ergebnisse waren jedoch ähnlich zu den von Uzan et al. (1991) publizierten Ergebnissen.
  • C. Vorübergehende FIX-Expression in HEL-Zellen
  • Um die Möglichkeit der Produktion von FIX in hämatopoetischen Zellen zu überprüfen, wurden HEL-Zellen vorübergehend mit FIX-Vektoren transfisziert, welche entweder CMV- oder GPIIb-Promotoren trugen, die als CMV-FIX und GPIIb-FIX bezeichnet werden. Die Studie erfolgte zuerst mit den FIX(–41S)-Konstrukten und die Ergebnisse wurden mit den FIX WT-Konstrukten bestätigt.
  • 1. Materialien und Methoden
  • 7,5 × 106 HEL-Zellen wurden mit 20 μg DNA unter Verwendung von 20 μl Superfect Transfection-Reagens (Qiagen) transfisziert.
  • Nach 6 Stunden wurden die Zellen geerntet und in RPMI/1%BSA ± PMA 1nM in einer Endkonzentration von 2,5 × 105 Zellen/ml eingebracht. Die Überstände wurden nach 96 Stunden gesammelt und die Zellen wurden gezählt.
  • Für die FIX WT-Konstrukte wurden pcDNA3-FIX WT und pcDNA3 WT.I1 in HEL-Zellen (1 × 106-Zellen) unter Verwendung von 6 μg Fugene 6 und 2 μg DNA transfisziert. Auf eine über Nacht-Inkubation folgend, wurden die Zellen geerntet und in 5 ml RPMI/1% BSA/PMA 1nM für CMV-FIX-Transfektionen und in 2,5 ml Induktionsmedium für die GPIIb-FIX-Transfektionen eingebracht. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Überstände gewonnen und die Zellen wurden gezählt.
  • 2. Ergebnisse mit FIX(–41S)-Konstrukten
  • Wenn die Zellen mit PMA inkubiert wurden, war die mit dem CMV-FIX-Konstrukt erhaltene FIX-Produktion sehr gering und durch ELISA (Asserachrom FIX, Stago, Asnieres, Frankreich) nicht genau feststellbar. Die in 4 dargestellten Ergebnisse wurden nach einer Induktion mit 1nM PMA erhalten. Unter CMV-Promotorkontrolle war die FIX-Sekretion durch CMV-FIX (–41S)-transfiszierte HEL-Zellen gering (408,66 pg/ml) und nicht signifikant. Die beste Produktion wurde mit den Zellen erhalten, welche mit FIX(–41S.I1) transfisziert waren. Die mittlere Produktion war zweimal höher als mit FIX(–41S) cDNA und sie unterschied sich deutlich von dem mit FIX(–41S) cDNA (p < 0,05) erzielten Ergebnis. Ein ähnliches Ergebnis wurde erhalten, wenn die Zellzahl eingestellt wurde. Tatsächlich lieferten HEL, transfisziert mit FIX (–41S.I1), 4,5 ± 2,5 ng/1 × 106 Zellen und dieses Ergebnis unterschied sich signifikant von dem Ergebnis, welches mit FIX(-41S)-transfiszierten HEL-Zellen erhalten wurde, (1,5 ± 0,9 ng/1 × 106-Zellen; p < 0,01).
  • Ähnliche Experimente wurden mit den GPIIb-FIX-Konstrukten durchgeführt und in diesem Fall (2,5 × 105-Zellen/ml nach der Transfektion) war die FIX-Produktion zu schwach, um in den Überständen feststellbar zu sein. MicrosepTM-Mikrokonzentratoren (Pall Gelman Sciences) mit einem 30Kd Cut-Off wurden verwendet, um die Proteine zu konzentrieren. In dem konzentrierten GPIIb-FIX(-41S.I1)-Überstand, welcher mit PMA-stimulierten HEL-Zellen erhalten wurde, war das FIX-Protein kaum feststellbar. Dieses Ergebnis stimmte mit den Ergebnissen überein, welche mit dem β-Gal-Reportergen erhalten wurden (Tabelle 1), was bestätigt, daß das GPIIb-Potential im Vergleich zum CMV-Promotor gering war.
  • 3. Ergebnisse mit FIX WT-Konstrukten
  • 5 stellt die FIX-Produktion dar, welche mit dem FIX WT erhalten wurde. Diese Ergebnisse bestätigen, daß:
    • – HEL-Zellen fähig sind, FIX nach einer vorübergehenden Transfektion zu produzieren.
    • – Die besten Produktionsniveaus mit FIX WT.I1-Konstrukten erhalten wurden und von den entsprechenden FIX WT-Ergebnissen signifikant verschieden sind.
    • – Nach vorübergehenden Transfektionen der GPIIb-Promotor für die FIX-Produktion weniger wirksam war als der CMV-Promotor in HEL-Zellen. GPIIb-FIX WT.I1-transfiszierte HEL-Zellen lieferten etwa 30% der FIX-Produktion, welche mit der gleichen cDNA unter CMV-Promotorkontrolle erhalten wurde (257,71 ± 85,38 pg/1 × 106-Zellen versus 881,28 ± 288,32 pg/1 × 106-Zellen).
  • D. FIX-Expression in stabil transfiszierten HEL-Zellen
  • Wie vorstehend erwähnt, wurde im vorübergehenden Expressionssystem eine geringe FIX-Produktion erhalten. Es wurden daher Zellen ausgebildet, die FIX stabil exprimieren.
  • 1. Materialien und Methoden
  • Zellen: HEL-Zellen (1 × 106-Zellen) wurden mit 2 μg Pvul linearisiertem Plasmid während 5 Stunden unter Verwendung des FUGENETM 6 Transfektionssystems (Boehringer, Mannheim) transfisziert. Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und in frisches Medium eingebracht, welches mit 0,6 mg/ml G418 ergänzt wurde.
  • Um die FIX-Produktion zu vergleichen wurden die G418-resistenten Zellen in RPMI/1% BSA eingebracht, ergänzt mit Vitamin K 1ng/ml ± PMA 1nM (2,5 × 105-Zellen/ml). Nach 1, 2, 3 oder 4 Tagen der Inkubation wurden die Zellen numeriert und die Überstände wurden eingefroren. Die FIX-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines FIX ELISA-Kits (Asserachrom FIX, Stago, Asnieres, Frankreich) gemessen.
  • Immunoblotting-Analyse: Überstände (1 ml) wurden in einem Äquilibrierungspuffer (Hepes 10 mM, KCl 100 mM, MgCl2 2 mM, Triton × 100 0,1%) vierfach verdünnt. Fünfzig Mikroliter von Antihumanfaktor IX-Antikörper, gebunden an DEAE A50 Sephadex, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von CenteonTM (USA), wurden den Überstandslösungen zugesetzt und eine Stunde bei 4°C inkubiert. Das DEAE wurde anschließend durch Zentrifugieren (2 min bei 2500 UpM) gesammelt und dreimal mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen. Der Faktor IX wurde durch Laemmli-Puffer (Laemmli, 1970) eluiert. Proben, welche den Faktor IX enthielten, wurden einer Elektrophorese auf SDS-PAGE/10% Polyacrylamidgel unterzogen und auf einer HybondTM C Pure-Membran (Amersham) halbtrocken einem Blotting-Verfahren unterzogen. Die Blots wurden mit TBS-(0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) Tween (0,1%) während 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und anschließend mit 1:3.000 Verdünnung eines polyklonalen Hasen-Antihuman FIX-Antikörpers (DakoTM) inkubiert. Die Membran wurde dreimal in TBS-T gewaschen und anschließend mit einer 1:10.000 Verdünnung eines Peroxydase-markierten Anti-Hasen-Antikörpers (Biorad) während 30 min inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurde ein chemilumineszentes Signal durch Autoradiographie unter Verwendung des ECL-Systems (AmershamTM) detektiert.
  • Progerinnungsaktivität: Die Faktor IX-Aktivität wurde durch ein einstufiges Gerinnungsassay ermittelt. Fünfzig Mikroliter des Kontrollplasmas wurden in Imidazolpuffer (Diagnostica Stago, Asnières, Frankreich) (1/10) verdünnt. Fünfzig Mikroliter von verdünntem Überstand wurden zu 50 μl eines deffizienten Faktor IX Plasmas (Immuno, Illkirch, Frankreich) und zu 50 μl Silimat® Cephalin (Bio-merieuxTM, Marcy l'Etoile, Frankreich) zugesetzt. Nach 4 min Inkubation bei 37°C wurde die Gerinnung durch Zusetzen von 50 μl 50 mM CaCl2-Puffer initiiert. Die Ge-rinnungszeiten wurden in einem STA Compact®-Koagulometer (Diagnostica StagoTM, Asnières, Frankreich) gemessen und die Faktor IX-Aktivität wurde aus einer log-log-Standardkurve bestimmt.
  • FIX-Aktivierung durch Faktor XIa: FIX wurde immunogefällt und in vitro durch den Faktor XIa (Enzyme Research Lab., Swansea, Großbritannien) in einem Verhältnis von Enzym/Substrate von 1/40 weiter aktiviert. Der Aktivierungspuffer bestand aus Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Polyethylenglycol 0,01%, pH 7,5. Die Reaktionen wurden während 30 min und 1 Stunde bei 37°C inkubiert und die Proben wurden anschließend in Laemmli-Puffer verdünnt.
  • Northern-Blot-Analyse: Gesamt-mRNAs wurden aus 7 × 106 stabil transfiszierten HEL-Zellen unter Verwendung des Rneasy Mini Kits (Qiagen, Courtaboeuf, Frankreich) hergestellt. Nach einer Elektrophorese auf 1,2% Agarosegel in Phosphatpuffer (10 mM NaH2PO4, 10 mM Na2PO4, pH 7), wurden die mRNAs auf eine Nylon membran (Hybond N, Amersham, Les Ulis, Frankreich) übergeführt. RNA-Sonden, welche aus dem Volllänge-Humanfaktor IX oder Ratten-GAPDH bestehen, wurden ausgebildet und mit NTP-enthaltendem Digoxigenin-UTP unter Verwendung des in vitro Transkriptionssystems mit T7 RNA-Polymerasekit (Boehringer Mannheim, Meylan, Frankreich) markiert. Auf die Hybridisierung folgend, wurden die Signale durch Chemilumineszenz unter Verwendung des DIG Luminescent Detection Kits von Boehringer Mannheim (Meylan, Frankreich) detektiert.
  • 2. Tägliche FIX-Produktion von FIX(–41S.I1) exprimierenden HEL-Zellen
  • 2.1. CMV-FIX(–41S.I1) transfiszierte HEL-Zellen
  • Es war kein FIX in den Überständen der pcDNA3-transfiszierten HEL-Zellen feststellbar (6). Nach 4 Tagen wurden 11,65 ng/ml FIX im konditionierten Medium der CMV-FIX(–41S.I1) transfiszierten Zellen festgestellt. Auf die PMA-Induktion folgend, war die FIX-Produktion (259,87 ng/ml) 23 Mal höher als die Produktion, welche ohne PMA erhalten wurde, und sie war 250-fach höher als das Ergebnis, welches mit den vorübergehenden Transfektionen erhalten wurde.
  • 2.2. GPIIb-FIX(–41S.I1) transfiszierte HEL-Zellen
  • Wenn HEL-Zellen mit pcDNA3-GPIIb-Vektor transfisziert wurden, wurde kein FIX im konditionierten Medium festgestellt. Mit den GPIIb-FIX(–41S.I1) HEL-Zellen stieg der FIX regelmäßig während der 4 Tage der Inkubation an (7). Nach 4 Tagen Kultur lieferten die GPIIb-FIX(–41S.I1)-Pools 35,0 ± 7,8 ng/ml FIX im Überstand. Auf die PMA-Induktion folgend, erreichte die FIX-Produktion 165,0 ± 32,52 ng/ml.
  • 2.3. Progerinnungsaktivität
  • Die FIX-Progerinnungsaktivität war mit dem FIX-Antigen in den Überständen aus den HEL-Zellen direkt korreliert (8). Die spezifische Aktivität des FIX, welcher durch GPIIb-FIX(–41S.I1)-exprimierende HEL-Zellen erhalten wurde (Kulturmedium: RPMI/1% BSA), betrug 0,34 ± 0,07 mU/ng.
  • 2.4. FIX-Immunofällungen
  • Die Überstände der transfiszierten HEL-Zellen wurden immunogefällt und einer Western-Blot-Analyse unterzogen, um das Molekulargewicht des ausgeschiedenen Proteins zu verifizieren. Gereinigter rekombinanter Faktor IX (MononineTM) wurde als Kontrolle verwendet. In den Überständen von pcDNA3-GPIIb-exprimierenden Zellen wurde kein FIX festgestellt. In den GPIIb-FIX(–41S.I1) HEL-Zellüberständen mit oder ohne PMA-Induktion, wurde eine spezifische Bande mit einem ungefähren Molekulargewicht von 60 kDa festgestellt. Dieses Protein migrierte auf das selbe Niveau wie immunogereinigter FIX (MononineTM).
  • 3. Tägliche FIX-Produktion von FIX(WT) und FIX(WT.I1)-exprimierenden HEL-Zellen
  • 3.1. Vergleich der Effizienz des CMV- und des GPIIb-Promotors nach stabilen Transfektionen
  • HEL-Zellen wurden mit den folgenden Konstrukten stabil transfisziert: pcDNA3.1 und pcDNA3-GPIIb, verwendet als negative Kontrollen, GPIIb-FIX(WT), GPIIB-FIX(WT.I1) und auch die entsprechenden CMV-Konstrukte (CMV-FIX(WT) und CMV-FIX(WT.I1)). 9 stellt die mit CMV-FIX und GPIIb-FIX HEL-Zellen erhaltenen Ergebnisse dar. Wie erwartet, wurde in den beiden negativen Kontrollen (pcDNA3 und pcDNA3-GPIIb) kein FIX in den Ü berständen festgestellt. Wenn die Expression von FIX(WT) durch den GPIIb-Promotor gesteuert wurde, wurde eine im Vergleich zu CMV-FIX bedeutend höhere FIX-Produktion in den Überständen gemessen. GPIIb-FIX(WT)-exprimierende HEL-Zellen lieferten eine etwa 5 bis 10-fach höhere Menge an FIX als die HEL-Zellen, welche mit CMV-FIX(WT) unter den gleichen Bedingungen (± PMA) transfiszierten wurden.
  • 3.2. Das Intron 1 erhöht die FIX-Produktion
  • Wir untersuchten die Fähigkeit von FIX(WT.I1), gesteuert durch den GPIIb-Promotor, zur Erhöhung der FIX-Produktion in den HEL-Zellen. Die Bewertung der Faktor IX-Konzentration in den Überständen zeigte, daß die höchste Produktion mit dem FIX(WT.I1)-Konstrukt erhalten wurde. Tatsächlich schieden nach 4 Tagen Kultur GPIIb-FIX(WT.I1)-transfiszierte HEL-Zellen etwa 30-fach höhere Mengen an FIX als die GPIIb-FIX-exprimierenden HEL-Zellen aus (10). Wenn die Zellen mit PMA stimuliert wurden, produzierten die GPIIbFIX.I1-transfiszierten Zellen auch höhere FIXC-Mengen (× 12) im Vergleich zu den GPIIb-FIX-exprimierenden Zellen (Tag-4-Werte: 398,04 ± 94,23 ng/ml versus 32,12 ± 14,85 ng/ml von FIX).
  • 3.3. Charakteristika von produziertem rekombinantem FIX im HEL-Zellen-Überstand
  • Um das FIX-Protein in den Überständen von HEL-Zellen weiter zu charakterisieren, wurde FIX immunogefällt und die Proben wurden einer Elektrophorese und einer Blotting-Analyse unterzogen. In pCDNA3-GPIIb-exprimierenden HEL-Zellen wurde eine einzelne unspezifische Bande mit dem sekundären Antikörper alleine festgestellt. In GPIIb-FIX(WT) und GPIIb-FIX(WT.I1)-transfiszierten HEL-Zellen wurde eine spezifische Bande bei etwa 60 kDa festgestellt. Das Molekulargewicht war ähnlich zu dem zuvor detektierten FIX(–41SI1), zur Kontrolle und zu dem FIX, welcher durch pcDNA3-CMV/FIX(WT.I1)-exprimierende HepG2-Zellen produziert wurde. Der Unterschied in der Intensität der Banden bei der Immunoblot-Analyse war direkt mit der in 10 dargestellten Antigenmenge korreliert.
  • 3.4. FIX-Progerinnungsaktivität und FIX-Aktivierung durch FXIa
  • Es wurde zuvor gezeigt, daß FIX geeignet hergestellt werden muß, um vollständig wirksam zu sein. Die Faktor IX-Gerinnungsaktivität wurde im Überstand von PMA-stimulierten GPIIb-FIX(WT.I1)-transfiszierten HEL-Zellen gemessen (11). Die FIX-Progerinnungsaktivität war direkt mit der Antigenkonzentration korreliert, was auf eine korrekte Herstellung des Moleküls hinweist. Die mittlere FIX-spezifische Aktivität in den Überständen betrug 160 ± 69 U/mg. Während der Gerinnungskaskade muß FIX durch FXIa aktiviert werden. Die FIX-Spaltung nach der Inkubation mit FXIa, d.i. die Aktivierung des immunogefällten FIX aus den HEL-Zellen, führte zum Auftreten von zwei Banden, welche der schweren Kette (29 kDa) und der leichten Kette (19 kDa) entsprechen. Die Aktivierungsrate und das Proteinprofil von HEL-Überständen war ähnlich den mit Mononine erhaltenen Ergebnissen.
  • 3.5. Northern-Blot-Analyse
  • Wir haben gezeigt, daß die Menge an durch HEL-Zellen produziertem FIX-Protein eng mit dem Vorhandensein des FIX-Introns 1 in der FIX cDNA in Beziehung steht. Wir haben FIX mRNAs aus unterschiedlichen Transfektionen von HEL-Zellen analysiert. Keine mRNA-hybridisierte mit der FIX mRNA-Sonde in pcDNA3-GPIIb-transfiszierten HEL-Zellen ohne oder mit PMA-Induktion. In Zellen, welche mit den FIX(WT.I1)-Konstrukten transfisziert wurden, wurde eine spezifische Bande detektiert, welche die korrekte 1,4 Kb mRNA-Größe zeigte. In den GPIIb-FIX(WT) HEL-Zellen war FIX mRNA nur auf die PMA-Induktion folgend detek tierbar. Diese mRNAs haben die gleiche Größe wie jene, welche in GPIIb-FIX(WT.I1) HEL-Zellen detektiert werden. Die mRNA-Mengen in den verschiedenen Lysaten korrelierten direkt mit den in den Überständen detektierten Antigenmengen, wodurch das Fehlen einer Detektion in unstimulierten GPIIb-FIX(WT) HEL-Zellen erklärt wird. Es wurde jedoch bestätigt, daß die erwartete mRNA in diesen Zellen detektiert wurde, wenn größere Mengen an Gesamt-mRNA verwendet wurden.
  • 3.1 E. Schlußfolgerung
  • Die vorstehend erwähnten Ergebnisse zeigen, daß die hämatopoetische Zelllinie HEL vollständig wirksamen FIX produzieren und ausscheiden kann. Nach vorübergehenden Transfektionen wurde die höchste Produktion mit CMV-FIX.I1 HEL-Zellen im Vergleich zu den CMV-FIX HEL-Zellen erhalten, was die Expression erhöhende Aktivität des FIX-Introns 1 in dieser hämatopoetischen Zelllinie zeigt. Unter Verwendung des GPIIb-Promotors war die FIX-Produktion gewebespezifisch. Stabile Transfektionen haben gezeigt, daß der GPIIb-Promotor beim Induzieren der FIX-Transkription in HEL-Zellen wirksam war und daß das FIX-Intron 1 eine wichtige, die Expression erhöhende Aktivität besaß. Das ausgeschiedene FIX-Protein besaß ein Molekulargewicht von etwa 60 kDa, ähnlich dem in MononineTM erhaltenen FIX und scheint dann einem normalen Reifungsprozeß zu unterliegen. Abschließend entsprach die FIX-Gerinnungsaktivität unter Verwendung eines einstufigen Gerinnungsassays dem Faktor FIX-Antigen. Das Proteinprofil nach der FXIa-Aktivierung war ähnlich dem mit Mononine erhaltenen Profil, was darauf hinweist, daß das rekombinante Molekül vollständig wirksam war. Diese mit HEL-Zellen erhaltenen Ergebnisse stärken die Hypothese, daß FIX-Protein durch CD34+ hämatopoetische Stammzellen produziert werden kann.
  • Referenzen:
    • – Kurachi K, Kurachi S. Regulation mechanism of the Factor IX gene. Thrombosis and Haemostasis 1995, 73, 333–339.
    • – Salier JP, Hirosawa S, Kurachi K. Functional characterization of the 5'regulatory region of the human factor IX gene. J. Biol. Chem. 1990, 265, 7062–7068.
    • – Camerino G, Grzeschik KH, Jaye M, De La Salle H, Tolstoshev P, Lecocq JP, Hellig R, Mandel JL. Regional localization on the human X chromosome and polymorphism of the coagulation factor IX gene (hemophilia B locus). Proc. Natl. Acad. Sci USA 1984, 81, 498502.
    • – Boyd Y, Buckle VJ, Munro EA, Migeon BR, Craig IW. Assignment of the hemophilia B (factor IX) locus to the q26-gter region of the X chromosome. Ann. Hum. Genet. 1984, 48, 145–152.
    • – Yoshitake S, Schach B, Foster DC, Davie EW, Kurachi K. Nucleotide sequence of the gene for human factor IX (antihemophilic factor B). Biochemistry 1985, 24, 3736–3750.
    • – Roberts HR. Molecular Biology of the Hemophilia B. Thrombosis and Haemostasis 1993, 70, 1–9.
    • – Nakai H, Herzog RW, Hagstrom JN, Walter J, Kung SH, Yang EY, Tai SJ, Iwaki Y, Kurtzman GJ, Fisher KJ, Colosi P, Couto LB, High KA. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer of human blood coagulation factor IX into mouse liver. Blood 1998, 91, 4600–4607.
    • – White SJ, Page SM, Margaritis P, Brownlee GG. Long-term expression of human clotting factor IX from retrovirally transduced primary human keratinocytes in vivo. Hum. Gene Ther. 1998, 9, 1187–1195.
    • – Baru M, Sha'anani J, Nur I. Retroviral-mediated in vivo gene transfer into muscle Zellen and synthesis of human factor IX in mice. Intervirology 1995, 38, 356–360.
    • – Wang JM, Zheng H, Blaivas M, Kurachi K. Persistent systemic production of human factor IX in mice by skeletal myoblast-mediated gene transfer: feasibility of repeat application to obtain therapeutic levels. Blood 1997, 90, 1075–1082.
    • – Cherington V, Chiang GG, McGrath CA, Gaffney A, Galanopoulos T, Meriill W, Bizinkauskas CB, Hansen M, Sobolewski J, Levine PH, Greenberger JS, Hurwitz DR. Retroviral vectormodified bone marrow stromal Zellen secrete biologically active factor IX in vitro and transiently deliver therapeutic levels of human factor IX to the plasma of dogs after reinfusion. Hum. Gene Ther. 1998, 9, 1397–1407.
    • – Hao QL, Malik P, Salazar R, Tang H, Gordon EM, Kohn DB-Expression of biologically active human factor IX in human hematopoietic Zellen after retroviral vector-mediated gene transduction. Hum. Gene Ther. 1995, 6, 873–880.
    • – Martin P, Papayannopoulou T. HEL Zellen: a new human erythroleukemia cell line with spontaneous and induced globin expression. Science 1982, 216, 1233–1235.
    • – Tabilio A, Rosa JP, Testa U, Kieffer N, Nurden AT, Del Canizo MC, Breton-Gorius J, Vainchenker W. Expression of platelet membrane glycoproteins and alpha-granule proteins by a human erythroleukemia cell line (HEL). EMBO J. 1984, 3, 453–459.
    • – Long MW, Heffner CH, Williams JL, Peters C, Prochownik EV. Regulation of megakaryocyte phenotype in erythroleukemia Zellen. J. Clin. Invest. 1990, 85, 1072–1084.
    • – Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumor promotion. Nature 1984, 308, 693–698.
    • – Hong Y, Martin JF, Vainchenker W, Erusalimsky JD. Inhibition of protein kinase C suppresses megakaryocytic differentiation and stimulates erythroid differentiation in HEL Zellen. Blood 1996, 87, 123–131.
    • – Haas TA, Plow EF. Integrin-ligand interactions: a year in review. Curr. Opin. Cell Biol. 1994, 6, 656–662.
    • – Uzan G, Frachet P, Lajmanovich A, Prandini MH, Denarier E, Duperray A, Loftus J, Ginsberg M, Plow E, Marguerie G. cDNAs clones for human platelet GPIIb corresponding to mRNA from megakaryocytes and HEL Zellen. Evidence for an extensive homology to other Arg-GlyAsp adhesion receptors. Eur. J. Biochem. 1988, 171, 87–93.
    • – Frachet P, Uzan G, Thevenon D, Denarier E, Prandini MH, Marguerie G. GPIIb and GPIIIa amino acid sequences deduced from human megakaryocyte cDNAs. Mol. Biol. Rep. 1990, 14, 27–33.
    • – Prandini MH, Denarier E, Frachet P, Uzan G, Marguerie G. Isolation of the human platelet glycoprotein IIb gene and characterization of the 5'flanking region. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1988, 156, 595–601.
    • – Bray PF, Rosa JP, Johnston Gl, Shiu DT, Cook RG, Lau C, Kan YW, Mc Ever RP, Shuman MA. Platelet glycoprotein IIb. Chromosomal localization and tissue expression. J. Clin. Invest. 1987, 80, 1812–1817.
    • – Uzan G, Prenant M, Prandini MH, Martin F, Marguerie G. Tissue specific expression of the platelet GPIIb gene. J. Biol. Chem. 1991, 266, 8932–8939.
    • – Uzan G, Prandini MH, Beilhier R. Regulation of gene transcription during the differentiation of megakaryocytes. Thromb. Haemost. 1995, 74, 210–212.
    • – Jallat et al.; EMBO Journal, 1990, Vol. 9, no. 10, pp. 3295–3301.
  • Sequenzliste
    Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001

Claims (10)

  1. DNA-Konstrukt für die gewebespezifische Expression eines Blutgerinnungsfaktors, umfassend eine DNA, welche für eine Aminosäuresequenz eines Blutgerinnungsfaktors codiert, und eine DNA, welche für einen Promotor codiert, spezifisch für die Expression in Zellen der Plättchen-Abstammungslinie.
  2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin als Promotor die DNA, welche für das Humanplättchenglycoprotein IIb (GPIIb) codiert, insertiert wird.
  3. DNA-Konstrukt nach den Ansprüchen 1 und 2, worin die DNA, welche für die Aminosäuresequenz eines Blutgerinnungsfaktors codiert, die für den Faktor IX codierende cDNA ist.
  4. DNA-Konstrukt nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin ein die Expression erhöhendes trunkiertes erstes Intron (Intron 1) des Human FIX-Gens zusätzlich in die FIX-cDNA insertiert wurde.
  5. Verwendung eines DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung einer Blutgerinnungsstörung.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Behandlung die Humangentherapie umfaßt.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, worin die Blutgerinnungsstörung Hämophilie ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Blutgerinnungsstörung Hämophilie B ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Produktion von Faktor IX durch einen Induktor stimuliert wird.
  10. Verwendung nach Anspruch 6, worin die Produktion von Faktor IX durch Phorbol-12-myristat-l3-acetat (PMA) stimuliert wird.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN104045716A (zh) 2008-05-16 2014-09-17 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
WO2014066663A1 (en) * 2012-10-24 2014-05-01 Platelet Targeted Therapeutics, Llc Platelet targeted treatment
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2678282B1 (fr) * 1991-06-28 1994-08-26 Commissariat Energie Atomique Sequences amplificateur et silenceur isolees du promoteur de la gpiib, et leurs applications.
DE69434689D1 (de) * 1993-06-10 2006-05-18 Genetic Therapy Inc Adenovirale vektoren für die behandlung der hämophilie
US6066778A (en) * 1996-11-06 2000-05-23 The Regents Of The University Of Michigan Transgenic mice expressing APC resistant factor V
FR2763959A1 (fr) * 1997-06-02 1998-12-04 Transgene Sa Nouveaux vecteurs adenoviraux recombinants comprenant une sequence d'epissage

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