KR100681719B1 - 혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현을 위한 ｄｎａ-작제물 - Google Patents

혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현을 위한 ｄｎａ-작제물 Download PDF

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Abstract

혈액 응고 인자의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 및 조혈세포에서의 발현에 특이적인 프로모터를 암호화하는 DNA를 포함하는, 제9인자와 같은 혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현에 적합한 DNA-작제물이 개시되어 있다.
혈액 응고 인자, 조혈세포, 제9인자, 사람 혈소판 당단백질 IIb, 형질감염, 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA)

Description

혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현을 위한 ＤＮＡ-작제물{DNA-construct for the tissue-specific expression of a blood coagulation factor}
도 1은 pcDNA3 벡터에서 GPIIb 프로모터의 클로닝을 나타낸다.
도 2는 β-갈락토시다제 리포터 유전자 벡터를 나타낸다.
도 3은 HeLa 세포 (패널 A) 및 HEL 세포(패널 B)에서의 GPIIb에 의해 지시되는 β-Gal의 일시적 발현을 나타낸다.
도 4는 PMA 1nM 유도 후 HEL 세포에서의 CMV 프로모터 조절하에서의 일시적인 FIX 생산을 나타낸다.
도 5는 PMA 1nM 유도 후 HEL 세포에서의 CMV 또는 GPIIb 프로모터 조절하에서의 일시적인 FIX WT 생산을 나타낸다.
도 6은 안정적으로 형질감염된 HEL 세포에서 CMV 프로모터를 사용한 FIX 일일 생산을 나타낸다.
도 7은 PMA 유도의 존재 또는 부재하의 안정적으로 형질감염된 HEL 세포에서의 GPIIb 프로모터하의 FIX 생산을 나타낸다.
도 8은 HEL 세포 상층액의 혈액응고촉진 FIX 활성을 나타낸다.
도 9a는 PMA 없이 배양한 HEL 세포에서의 FIX(WT) 작제물의 안정적 발현을 나타낸다.
도 9b는 PMA 1nM의 존재하에 배양한 HEL 세포에서의 FIX(WT) 작제물의 안정적 발현을 나타낸다.
도 10은 PMA 없이 배양한 HEL 세포에서의 GPIIb-FIX(WT) 및 GPIIb-FIX(WT.I1) 작제물의 안정적 발현을 나타낸다.
도 11은 PMA-자극된 GPIIb-FIX(WT.I1) 발현 HEL 세포의 FIX 혈액응고촉진 활성을 나타낸다. 수치는 3번의 개개 실험의 평균을 나타낸다.
본 발명의 주제는 혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현을 위한 DNA-작제물이다.
제9인자(FaxtorIX; FIX)는 간세포에 의해 생산되고 혈액 순환계 내로 분비되는 비타민-K 의존성 당단백질임이 공지되어 있다(Kurachi et al., 1995; Salier et al., 1990). FIX 유전자는 X-염색체 상에 위치하고 8개의 엑손 및 7개의 인트론을 갖고 있다(Camerino et al., 1984; Boyd et al., 1984; Yoshitake et al., 1985). 제9인자의 부존재 또는 결핍은 B형 혈우병으로 불리는 심각한 출혈성 질환을 일으킨다(Roberts et al., 1993).
B형 혈우병은 단일의 공지된 유전자의 변형으로부터 발생하는 질환이다. 그러므로 B형 혈우병은 일찍이 유전자 요법의 잠재적인 표적으로서 의도되었다. 표적으로서 선택되는 세포는 유전자 전달을 달성하기가 용이해야 하고 제9인자를 상당량 발현할 필요가 있다. 이런 표적 세포에서, FIX 분자는 활성형 혈액 응고 인자가 되도록 변형(γ-카복실화 및 프로펩티드의 절단)될 필요가 있다. 몇몇 잠재적인 표적 세포가 시험되었다[예: 간 세포(Nakai et al., 1998), 각질세포(White et al., 1998), 근육 세포(Baru et al., 1995; Wang et al., 1997), 또는 골수 간질 세포(Cherington et al. 1998)]. 시험관 내에서, 사람 FIX cDNA를 갖고 있는 레트로바이러스성 벡터로 형질감염된 사람 골수성백혈병 세포주 (HL60)가 생물학적으로 활성인 FIX를 생산할 수 있는 것으로 나타났다(Hao et al., 1995). 본 발명은 조혈 세포 및 특히 혈소판에서의 혈액 응고 인자의 발현을 목표로 한다.
조혈 세포로서, 주로 적혈구계 표현형을 발현하는 사람 적백혈병 세포주 HEL이 이미 사용되었으나(Martin et al., 1982) 또한 혈소판 막 당단백질 같은 몇몇 거핵세포 마커도 사용되었다(Tabilio et al., 1984). 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA)에 의한 유도 후에, HEL 세포주는 증가된 양의 거핵세포 단백질(예: 당단백질 αIIb/IIIa 복합체, 혈소판 제4인자, 또는 폰 빌레브란트 인자)을 발현한다(Long and coll., 1990). PMA 효과는 단백질 키나제 C의 활성화를 통해 매개된다(Nashizuka et al., 1984; Hong et al., 1996).
사람 혈소판 당단백질 IIb (GPIIb)는 피브리노겐, 피브로넥틴 및 폰 빌레브란트 인자의 특이적 수용체로서 기능하는 IIb-IIIa 복합체로서도 공지된 혈소판 인테그린 αIIbβ3의 α 서브유닛이다(Haas and Plow, 1994). GPIIb cDNA는 HEL 세포 및 사람 거핵세포의 mRNA 라이브러리로부터 처음으로 분리되었다(Uzan et al., 1988; Frachet et al., 1990). 사람 GPIIb 유전자는 프란디니 등(1988)에 의해 확인되었다. 문헌 (WO 9300438)은 GPIIb 프로모터의 조절 요소를 기술한다. 문헌 (Hao et al., 1995)에서는 FIX를 사람 조혈 세포에서 발현시켰다. 문헌 (Jallat et al. 1990)에서는 유전자전이된(transgenic) 마우스에서 FIX를 발현시켰으며 문헌 (Kurachi et al., 1995)는 FIX 인트론 1의 절단된(truncated) 형을 FIX cDNA 내에 통합시킴으로써 FIX의 발현량이 어떻게 증가될 수 있는 지를 기술한다.
GPIIb 프로모터의 조직 특이성은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 리포터 유전자를 사용하여 평가되었다. GPIIb 프로모터의 조절하에서, CAT 발현은 오직 조혈 세포주 HEL에서만 검출되었다(Uzan et al., 1991).
B형 혈우병을 유전자 요법에 의해 치료하기 위해서는 제9인자의 조직-특이적 발현이 필요하다. 본 발명은 상기 조혈 세포에서 혈액 응고 인자를 발현하는 문제에 대한 해결을 제공한다.
본 발명에 이르러 혈액 응고 인자의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 및 조혈 세포내에서의 발현에 특이적인 프로모터를 암호화하는 DNA를 포함하는 DNA-작제물이 혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현에 적합함이 밝혀졌다. 전술한 문제에 대한 해결은 사람 혈소판 당단백질 IIb(GPIIb)를 암호화하는 DNA가 프로모터로서 사용된 DNA-작제물을 사용하여 입증되었다.
상기 DNA-작제물의 개발은 다음과 같이 수행되었다:
A. 키메라성 분자의 작제
1. FIX cDNA의 생성
야생형 FIX 유전자는 아미노산 -46, -41 및 39에서 단위를 이루며 프레임 내에 3개의 ATG 코돈을 포함한다. FIX 생산을 증가시키기 위하여, 상이한 ATG 부위를 가지고 CMV프로모터에 의해 지시되는 5개의 FIX cDNA 발현 벡터를 만들었다. 이미 HepG2 세포주에서 발현-증가 활성을 가지는 것으로 나타난(Kurachi et al., 1995), 절단된(trancated) FIX 제1 인트론을 클로닝해서 FIX cDNA에 도입시켰다. 본 프로젝트의 초기 부분에서, CHO 세포를 CMV-FIX(-41S) 및 CMV-FIX(-41S.I1) 작제물로 안정적으로 형질감염시키면, 배양물 상층액에서 가장 양호한 FIX 생산이 초래되었다. 그러므로, -41 ATG만을 가지는 상기 두 작제물 FIX(-41S) 및 FIX(-41S.I1) cDNA는 조혈 세포주를 감염시키기 위해 사용된 첫번째 FIX 작제물이었다. FIX(-41S)cDNA의 변형된 5'말단(서열 1)은 다음과 같다:
Figure 112000008573883-pat00001
그러나, FIX(-41S)cDNA를 사용하여 얻은 모든 결과는 FIX(WT) 및 FIX(WT.I1) cDNA를 사용하여 추가로 확인되었다. FIX WT cDNA의 5'말단(서열 2)은 다음과 같다:
Figure 112000008573883-pat00002
2. GPIIb 프로모터 벡터의 생성
계열(lineage)-특이적 프로모터 GPIIb는 조혈 세포 내에서 FIX 전이유전자(transgene)를 발현하도록 선택되었다. -643/+33 GPIIb 프로모터 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 리포터 유전자를 갖는 pBLCAT-GPIIb 벡터는 지. 우잔(G. Uzan)으로부터 얻었다.
pcDNA3 벡터 (인비트로겐, 네덜란드)를 FIX용 발현 벡터로서 사용하기 위하여(보다 많은 제한 효소 부위 및 네오마이신 내성 유전자를 가지므로 다음 연구에 좀더 편리한 것으로 보임), 내인성 CMV 프로모터를 GPIIb 프로모터로 대체했다. 본 프로모터는 HindIII-BamHI 분해 후에 pBLCAT-GPIIb 벡터로부터 선별했다. 상기 산물은 프로모터 특이성에 중요한 도메인을 포함하는 GPIIb 프로모터의 -597 내지 +33 단편(서열 3)을 포함한다(Uzan et al., 1991 and 1995). 동일한 효소에 의해 열려진 CMV-결실된 pcDNA3에 GPIIb 프로모터를 삽입했다. 수득된 작제물은 소위 pcDNA3-GPIIb이다(서열 4 및 도 1). 모든 FIX cDNA를 BamHI-XhoI 분해를 사용하여 pcDNA3-GPIIb 플라스미드 중에 서브-클로닝했다.
3.
Figure 112000008573883-pat00003
-갈락토시다제 벡터의 생성
HEL 세포주에서 절단된(-597/+33) GPIIb 프로모터의 활성을 시험하기 위하여,
Figure 112006050570209-pat00004
-갈락토시다제 리포터 유전자를 선택했다.
Figure 112006050570209-pat00005
-Gal 유전자 발현이 CMV 프로모터 및 인핸서에 의해 지시되는 pUT535 벡터(Cayla, Toulouse, France)를 선택했다(도 2). CMV 서열을 절단된 GPIIb 프로모터로 교체하기 위하여, GPIIb 프로모터를 HindIII-BamHI으로 분해하고, 클레나우 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활(blunt) 말단을 수득한 다음 클레나우 DNA 폴리머라제로 처리한 BstEII-NcoI에 의해 열려진 pUT535 내에 도입했다. GPIIb-
Figure 112006050570209-pat00006
-Gal 벡터를 pUT535-GPIIb라 명명했다(도 2). 음성 대조군 플라스미드(pUT535-δCMV)는 BstEII-NcoI 분해에 의해 CMV 서열이 결실된 pUT535이다.
B. 조혈 세포에서 GPIIb 프로모터의 조직-특이성
pUT535, pUT535δCMV 및 pUT535-GPIIb 작제물을 두가지 상이한 세포주, 즉 HEL 및 HeLa 세포 내에서 시험했다. HEL 세포주(사람 적백혈병 세포)는 거핵세포 프로모터 발현을 시험하기 위해 사용되는 전형적인 세포주이다. HeLa 세포(사람 자궁경부 상피 암종; Human cervix epitheloid carcinoma)는 전형적인 음성 대조군 상대물이다.
재료 및 방법:
HEL 세포를 5% CO2하 RPMI/10% FCS 배지 중에 유지시켰다. 푸겐(FUGENETM) 6 (Boehringer Mannheim)를 사용하여
Figure 112005001577953-pat00007
-Gal 벡터(2㎍ DNA)를 HEL 세포 (1×106개 세포)에 형질감염시켰다. 밤새 배양한 후에, 세포를 수거하여 RPMI/1% BSA (Boehringer, Mannheim) 10 ml 중에 두었다. PMA(시그마)를 두가지 분석중 하나에서 배지에 가했다(최종 농도: 1nM). HeLa 세포를 5% CO2와 함께 DMEM-10% FCS 중에 유지시켰다. 5×106개 세포가 들어 있는 90mm 페트리 디쉬를 형질감염 전날에 준비했다. 상기 세포를 20㎍ DNA 및 20㎕ 리포펙틴(LipofectinTM) 시약(Gibco)로 5시간 동안 처리했다. 상기 배양시간 후에, 세포를 세척하고 PMA 1nM이 포함되거나 포함되지 않은 DMEM-1% BSA에 넣었다. 상기 세포를 40시간 후에 수거하고, 용해 완충액과 함께 항온처리하고, 용해물을 1.5mg/ml의 최종 단백질 농도가 되도록 희석했다.
Figure 112005001577953-pat00008
-갈락토시다제를 정량하기 위해 화학발광성
Figure 112005001577953-pat00009
-Gal 리포터 유전자 분석 키트(Boehringer Mannheim)를 제조자에 의해 기술된 대로 사용했다.
결과:
HeLa 세포에서, 세포가 PMA 유도의 존재 또는 부재하에, CMV 프로모터를 포함하는 벡터로 형질감염된 경우에만
Figure 112000008573883-pat00010
-Gal 리포터 유전자가 발현되었다. GPIIb 프로모터에 의해 지시된 작제물의 경우
Figure 112000008573883-pat00011
-Gal 발현이 전혀 관측되지 않았다(도 3, 패널 A).
HEL 세포에서(도 3, 패널 B), CMV는 최고의
Figure 112000008573883-pat00012
-Gal 생산을 나타냈다(하기 표 1). 그러나, GPIIb 프로모터는 PMA 처리 후에
Figure 112000008573883-pat00013
-Gal의 생산을 상당량 증가시켰다. HEL 세포에서 pUt535로 수득된
Figure 112000008573883-pat00014
-Gal 양을 100%로 하는 경우, 절단된 GPIIb 프로모터로 수득된
Figure 112000008573883-pat00015
-Gal 양은 PMA 처리를 하지 않은 세포에서 13%이었다. 비교로, 우잔 등(1991)은 GPIIb 프로모터에 의한 CAT 활성이 동일한 세포주에서 RSV 프로모터 대조군으로 수득한 CAT 활성의 15%에 상당함을 발견했다.
일시적으로 형질감염된 HEL 세포에서의 β-Gal 활성
β-Gal
-PMA +PMA
U/ml % U/ml %
CMV 프로모터 2959 100 22910 100
GPIIB 프로모터 376 13 662 3
결론적으로, HeLa 세포에서
Figure 112005001577953-pat00017
-Gal 발현은 전혀 검출되지 않았으므로 -597/+33 GPIIb 프로모터는 조혈 세포주에서 리포터 유전자의 조직-특이적 발현을 유도했다. 상기 HEL 세포의 일시적 형질감염에서, 상기 조혈세포-특이적 프로모터로 수득된
Figure 112005001577953-pat00018
-Gal 생산은 CMV 프로모터로 측정된 결과와 비교하여 낮았다. 그러나, 시험관 내에서 수득된 결과는 우잔 등(1991)에 의해 보고된 결과와 유사하다.
C. HEL 세포에서 FIX의 일시적 발현
조혈 세포에서의 FIX 생산의 가능성을 시험하기 위해, HEL 세포를 각각 CMV-FIX 및 GPIIb-FIX라고 불리는 CMV 프로모터 또는 GPIIb 프로모터를 갖는 FIX 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 본 연구는 FIX(-41S) 작제물을 사용하여 처음으로 행해졌고 그 결과는 FIX WT 작제물을 사용하여 확인되었다.
1. 재료 및 방법
7.5×106개 HEL 세포를 슈퍼펙트 형질감염 시약 (Qiagen) 20㎕를 사용하여 20㎍ DNA로 형질감염시켰다. 6시간 후에, 상기 세포를 수거하여 최종 농도 2.5×105개 세포/ml로 RPMI/1%BSA±PMA 1nM 중에 넣었다. 상층액을 96시간 후에 수거하여 세포를 계수했다.
FIX WT 작제물의 경우, 6㎍ 푸겐 6 및 2㎍ DNA를 사용하여 pcDNA3-FIX WT 및 pcDNA3 WT.I1을 HEL 세포 (1×106개 세포)에 형질감염시켰다. 밤새 배양한 후, 상기 세포를 수거하여 CMV-FIX 형질감염을 위한 5ml의 RPMI/1% BSA/PMA 1nM 중에 넣고 GPIIb-FIX 형질감염을 위한 유도 배지 2.5ml에 넣었다. 형질감염 4일 후에, 상층액을 회수하고 세포를 계수했다.
2. FIX(-41S) 작제물에 대한 결과
세포를 PMA 없이 배양한 경우, CMV-FIX 작제물로 수득된 FIX 생산은 매우 낮았고 ELISA (Asserachrom FIX, Stago, Asnieres, France)에 의해 정확히 검출할 수 없었다. 도 4에 제시된 결과는 1nM PMA로 유도한 후 수득되었다. CMV 프로모터의 조절하에서, CMV-FIX(-41S)-형질감염된 HEL 세포에 의한 FIX 분비는 낮았고(408.66 pg/ml) 유의적이지 않았다. 최고의 생산은 FIX(-41S.I1)로 형질감염된 세포의 경우에 수득되었다. 평균 생산은 FIX(-41S) cDNA의 경우 보다 2배 더 많았고 FIX(-41S) cDNA의 경우에 수득된 결과와 상당히 달랐다(p<0.05). 유사한 결과가 세포수를 조정한 경우에 수득되었다. 실제로, FIX(-41S.I1)로 형질감염된 HEL은 4.5±2.5 ng/1×106개 세포를 생산했고 이런 결과는 FIX(-41S)로 형짐감염된 HEL 세포의 경우에 수득된 결과와 유의적으로 상이하였다(1.5±0.9 ng/1×106개 세포; p<0.01).
유사한 실험을 GPIIb-FIX 작제물을 사용하여 수행하였고, 이 경우에(형질감염후 2.5×105개 세포/ml), FIX 생산은 너무 미약해서 상층액 중에서 검출할 수 없었다. 3OKd 컷-오프(cut-off)를 가진 마이크로셉(MicrosepTM) 마이크로농축기(Pall Gelman Sciences)가 단백질을 농축하기 위해 사용되었다. PMA-자극된 HEL 세포로 수득된 농축된 GPIIb-FIX(-41S.I1) 상층액에서, FIX 단백질은 거의 검출되지 않았다. 상기 결과는
Figure 112005001577953-pat00019
-Gal 리포터 유전자로 수득된 결과와 일치했는데(표 1), 이는 GPIIb 능력이 CMV 프로모터와 비교하여 낮음을 확인시킨다.
3. FIX WT 작제물에 대한 결과
도 5는 FIX WT로 수득된 FIX 생산을 나타낸다. 이런 결과는 다음을 확인시킨다:
- HEL 세포는 일시적인 형질감염 후에 FIX를 생산할 수 있다.
- 최고의 생산 수준은 FIX WT.I1 작제물의 경우에 수득되었고 상응하는 FIX WT 결과와 유의적으로 상이하였다.
- 일시적인 형질감염 후에, GPIIb 프로모터는 HEL 세포 내에서 CMV 프로모터보다 FIX 생산에 대해 덜 효과적이었다. GPIIb-FIX WT.I1-형질감염된 HEL 세포는 CMV 프로모터 조절하에서 동일한 cDNA로 수득한 FIX 생산의 약 30%를 생산했다(257.71±85.38 pg/1×106개 세포 대 881.28±288.32 pg/1×106개 세포).
D. 안정적으로 형질감염된 HEL 세포에서의 FIX 발현
전술한 바와 같이, 일시적인 발현 시스템에서는, FIX 생산이 낮았다. 따라서, FIX를 안정적으로 발현하는 세포를 제조하였다.
1. 재료 및 방법
세포: HEL 세포(1×106개 세포)를 푸겐 6 형질감염 시스템 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 5시간 동안 2㎍의 Pvul 선형 플라스미드로 형질감염시켰다. 배양 후에, 세포를 수거하여 0.6 mg/ml G418로 보충된 신선한 배지에 넣었다.
FIX 생산을 비교하기 위해, G418-내성을 가진 세포를 비타민 K 1ng/ml±PMA 1nM(2.5×105개 세포/ml)로 보충된 RPMI/1% BSA에 넣었다. 배양한지 1, 2, 3 또는 4일 후에, 세포를 계수하고 상층액을 동결시켰다. FIX ELISA 키트(Asserachrom FIX, Stago, Asnieres, France)를 사용하여 FIX 농도를 측정했다.
면역블로팅 분석: 상층액 (1ml)를 평형 완충액 (Hepes 10 mM, KCl 100 mM, MgCl2 2 mM, Triton x100 0.1%) 속에 4배로 희석했다. 센테온(CenteonTM)(USA)에 의해 제공된 DEAE A50 세파덱스에 결합된 항-사람 제9인자 항체 50㎕를 상층액 용액에 가하고 4℃에서 1시간 동안 배양했다. 그후 DEAE를 원심분리(2500 rpm에서 2분)에 의해 수거한 다음 평형 완충액으로 3번 세척했다. 제9인자를 램리 완충액(Laemmli, 1970)에 의해 용출했다. 제9인자를 포함하는 샘플을 SDS-PAGE/10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동한 후 하이본드(HybondTM) C 퓨어 막 (Amersham) 상에서 반건조 블로팅했다. 블롯을 TBS-(0.15M MaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5) 트윈 (0.1%)으로 실온에서 1시간 동안 차단한 후 폴리클로날 래빗 항-사람 FIX 항체(DakoTM)의 1:3,000 희석액과 함께 배양했다. 막을 TBS-T로 3회 세척한 다음, 퍼옥시다제-표지된 항-래빗 항체(Biorad)의 1:10,000 희석액과 함께 30분간 배양했다. 3회 세척후, ECL 시스템 (AmershamTM)을 사용하여 자가방사선법에 의해 화학발광 시그날을 검출했다.
혈액응고촉진(procoagulant) 활성: 제9인자 활성을 1단계 응고 분석에 의해 측정했다. 대조 혈장 50㎕를 이미다졸 완충액(Diagnostica Stago, Asnieres, France)로 희석했다(1/10). 희석된 상층액 50㎕를 제9인자 결손 혈장(Immuno, IIIkirch, France) 50㎕에 가하고 실리마트(Silimat
Figure 112005001577953-pat00020
) 세팔린 (Bio-merieuxTM, Marcy I'Etoile, France) 50㎕에 가했다. 37℃에서 4분간 배양한 후, 50mM CaCl2 완충액 50㎕를 가함으로써 응고를 개시하였다. STA 콤팩트(STA Compact
Figure 112005001577953-pat00021
) 혈액응고측정기 (Diagnostica StagoTM Asnieres, France)로 혈액 응고 시간을 측정한 후 제9인자 활성을 로그-로그 표준 곡선로부터 측정했다.
제11a인자(FXIa)에 의한 FIX 활성: FIX를 면역침강시킨 후 효소/기질의 비를 1/40으로하여 제11a인자(Enzyme Research Lab., Swansea, UK)에 의해 시험관 내에서 추가로 활성화시켰다. 활성화 완충액은 Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5mM, 폴리에틸렌 글리콜 0.01%, pH 7.5로 이루어졌다. 반응물을 37℃에서 1시간 30분간 항온처리하고, 이어서 반응 샘플을 램리 완충액으로 희석했다.
노던 블롯 분석: 총 mRNA를 르니시 미니 키트(Rneasy Mini Kit; Qiagen, Courtaboeuf, France)를 사용하여 7×106개의 안정적으로 형질감염된 HEL 세포로부터 제조하였다. 포스페이트 완충액 (10mM NaH2PO4, 10mM Na2PO4, pH 7) 중의 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후, mRNA를 나일론 막(Hybond N, Amersham, Les Ulis, France)으로 옮겼다. 완전한 길이의 사람 제9인자 또는 래트 GAPDH로 이루어진 RNA 프로브를 생성시켜 T7 RNA 폴리머라제 키트(Boehringer Mannheim Meylan, France)로 시험관내 전사 시스템을 사용하여 디곡시제닌-UTP를 함유하는 NTP로 표지하였다. 하이브리드화 후에, Boehringer Mannheim (Meylan, France)의 DIG 발광 검출 키트를 사용하여 화학발광에 의해 시그날을 검출했다.
2. FIX(-41S.I1)를 발현하는 HEL 세포의 FIX 일일 생산
2.1. CMV-FIX (-41S.I1)로 형질감염된 HEL 세포
pcDNA3-형질감염된 HEL 세포의 상층액에서는 FIX가 전혀 검출되지 않았다(도 6). 4일 후에, 11.65 ng/ml의 FIX가 CMV-FIX(-41S.I1) 형질감염된 세포의 조건화된 배지에서 검출되었다. PMA 유도 후에, FIX 생산(259.87 ng/ml)은 PMA 없이 수득된 생산 보다 23배 더 많았고 일시적인 형질감염으로 수득된 결과 보다는 250배 더 많았다.
2.2. GPIIb-FIX (-41S.I1)로 형질감염된 HEL 세포
HEL 세포가 pcDNA3-GPIIb 벡터로 형질감염된 경우, 조건화된 배지에서 FIX가 전혀 검출되지 않았다. GPIIb-FIX (-41S.I1) HEL 세포의 경우에는, FIX가 배양 4일 동안에 규칙적으로 증가했다(도 7). 배양 4일 후, GPIIb-FIX (-41S.I1) 풀(pool)은 상층액 중에 35.0±7.8 ng/ml의 FIX를 생산했다. PMA 유도 후에, FIX 생산은 165.0±32.52 ng/ml에 달했다.
2.3. 혈액응고촉진 활성
FIX 혈액응고촉진 활성은 HEL 세포의 상층액 중의 FIX 항원과 직접적 관련이 있었다(도 8). GPIIb-FIX (-41S.I1)-발현 HEL 세포(배양 배지: RPMI/1% BSA)에 의해 생산된 FIX의 특이적 활성은 0.34±0.07 mU/ng이었다.
2.4. FIX 면역침강
형질감염된 HEL 세포의 상층액을 면역침강시키고 웨스턴 블로팅으로 분비된 단백질의 분자량을 확인하였다. 정제된 재조합 제9인자(모노닌(MononineTM))을 대조군으로 사용했다. pcDNA3-GPIIb 발현 세포의 상층액에서는, FIX가 전혀 검출되지 않았다. PMA 유도의 존재 또는 부재하의 GPIIb-FIX(-41S.I1) HEL 세포 상층액에서는, 1개의 특이 밴드가 대략적인 분자량 60 kDa로 검출되었다. 이 단백질은 면역정제된 FIX (모노닌)과 동일한 수준으로 이동했다.
3. FIX(WT) 및 FIX(WTI.1)를 발현하는 HEL 세포의 FIX 일일 생산
3.1. 안정적인 형질감염 후의 CMV 및 GPIIb 프로모터의 효율의 비교
HEL 세포를 다음 작제물로 안정적으로 형질감염시켰다: 음성 대조군으로서 사용된 pcDNA3 및 pcDNA3-GPIIb, GPIIb-FIX(WT), GPIIb-FIX(WT.I1), 및 또한 상응하는 CMV 작제물[CMV-FIX(WT) 및 CMV-FIX(WT.I1)]. 도 9는 CMV-FIX 및 GPIIb-FIX HEL 세포를 사용하여 수득된 결과를 나타낸다. 예상한 바와 같이, 두 음성 대조군(pcDNA3 및 pcDNA3-GPIIb)에서는 상층액에서 FIX가 전혀 검출되지 않았다. FIX(WT)의 발현이 GPIIb 프로모터에 의해 지시된 경우, CMV-FIX에 비하여 상당히 더 높은 FIX 생산이 상층액에서 측정되었다. GPIIb-FIX(WT) 발현 HEL 세포는 동일한 조건에서(±PMA) CMV-FIX(WT)로 형질감염된 HEL 세포 보다 5배 내지 10배 더 많은 양의 FIX를 생산했다.
3.2. 제1 인트론은 FIX 생산을 증가시킨다
본 발명자들은 GPIIb 프로모터에 의해 지시되는 FIX(WT.I1)이 HEL세포에서 FIX 생산을 증가시키는 능력을 연구했다. 상층액 중의 제9인자 농도의 평가는 가장 많은 생산이 FIX(WT.I1) 작제물의 경우에 수득됨을 입증했다. 실제로, 4일간 배양후에, GPIIb-FIX(WT.I1)-형질감염된 HEL 세포는 GPIIb-FIX-발현 HEL 세포 보다 약 30배 더 많은 양의 FIX를 분비했다(도 10). 세포를 PMA로 자극한 경우, GPIIb-FIX.I1-형질감염된 세포도 또한 GPIIb-FIX-발현 세포와 비교하여 더 많은 FIX 양(12배)을 생산했다(제4일 값: 398.04±94.23ng/ml 대 32.12±14.85 ng/ml (FIX의 ml))
3.3. HEL 세포 상층액에서 생산된 재조합 FIX의 특성
HEL 세포 상층액중의 FIX 단백질을 더욱 특성화하기 위하여, FIX를 면역침강시키고 샘플을 전기영동하고 블로팅했다. pcDNA3-GPIIb를 발현하는 HEL 세포에서, 하나의 비특이적 밴드가 단독의 이차 항체로 검출되었다. GPIIb-FIX(WT) 및 GPIIb-FIX(WT.I1) 형질감염된 HEL 세포에서, 특이적 밴드가 60 kDa 근처에서 검출되었다. 상기 분자량은 이전에 검출된 FIX(-41SI1), 대조물, 및 pcDNA3-CMV/FIX(WT.I1)-발현 HepG2 세포에 의해 생산된 FIX와 유사했다. 면역블로팅 분석상의 밴드의 강도 차이는 도 10에 제시된 항체 양과 직접적인 상관관계가 있었다.
3.4. FIX 혈액응고촉진 활성 및 FXIa에 의한 FIX 활성화
FIX는 완전한 활성을 위해 적당히 프로세싱될 필요가 있다는 것은 이전에 밝혀졌다. PMA-자극된 GPIIb-FIX(WT.I1) 형질감염된 HEL 세포의 상층액에서 제9인자 혈액응고 활성을 측정했다(도 11). FIX 혈액응고촉진 활성은 항원 농도와 직접적으로 상관이 있었는데, 이는 분자의 정확한 프로세싱을 나타낸다. 상층액 중의 평균 FIX 특이적 활성은 160±69 U/mg이었다. 혈액응고 케스케이드 동안에, FIX는 FXIa에 의해 활성화됨을 요한다. FXIa와 배양한 후의 FIX의 절단, 즉 HEL 세포로부터의 면역침강된 FIX의 활성화는 중쇄(29 kDa) 및 경쇄(19 kDa)에 상응하는 두개의 밴드가 나타나게 했다. 활성화율 및 HEL 상층액으로부터의 단백질 프로필은 모노닌으로 수득한 결과와 유사했다.
3.5. 노던-블롯 분석
본 발명자들은 HEL 세포에 의해 생산된 FIX 단백질의 양이 FIX cDNA의 FIX 제1 인트론의 존재와 밀접하게 관련됨을 밝혀냈다. 본 발명자들은 HEL 세포의 상이한 형질감염으로부터의 FIX mRNA를 분석했다. 어떤 mRNA도 PMA 유도의 존재 또는 부존재하에 pcDNA3-GPIIb 형질감염된 HEL 세포에서 FIX mRNA 프로브와 하이브리드화하지 않았다. FIX(WT.I1) 작제물로 형질감염된 세포에서, 1개의 특이적 밴드가 검출되었는데, 이는 정확한 1.4 Kb mRNA 크기를 나타냈다. GPIIb-FIX(WT) HEL 세포에서, FIX mRNA는 PMA 유도 후에만 검출되었다. 상기 mRNA는 GPIIb-FIX(WT.I1) HEL 세포에서 검출된 것과 동일한 크기였다. 상이한 용해물에서의 mRNA의 양은 상층액에서 검출된 항원의 양과 직접적으로 상관관계가 있었는데, 이는 자극되지 않은 GPIIb-FIX(WT) HEL 세포에서 검출되지 않은 것을 설명한다. 그러나, 더 많은 양의 총 mRNA를 사용하는 경우 예견된 mRNA가 상기 세포에서 검출됨을 확인했다.
3.1E. 결론
전술한 결과는 조혈 세포주 HEL이 완전히 활성인 FIX를 생산하고 분비할 수있음을 나타낸다. 일시적인 형질감염 후에, 최고의 생산은 CMV-FIX HEL 세포와 비교하여 CMV-FIX.I1 HEL 세포의 경우에 수득되었는데, 이는 상기 조혈 세포주에서 FIX 제1 인트론의 발현-증가 활성을 입증한다. GPIIb 프로모터를 사용하는 경우, FIX 생산은 조직-특이적이었다. 안정적인 형질감염은 GPIIb 프로모터가 HEL 세포에서 FIX 전사를 유도하는데 효율적이고 FIX 제1 인트론이 중요한 발현-증가 활성을 가짐을 입증했다. 분비된 FIX 단백질은 분자량이 약 60kDa로 모노닌에 함유된 FIX와 유사했고 정상적인 성숙 과정을 거치는 것으로 보인다. 마지막으로, 1단계 응고 분석을 사용한 FIX 혈액응고 활성은 FIX 항원에 상응했다. FXIa 활성화 후의 단백질의 프로필은 모노닌으로 수득된 프로필과 유사했는데, 이는 재조합 분자가 완전히 활성이었음을 나타낸다. HEL 세포로 수득된 상기 결과는 FIX 단백질이 CD34+ 조혈 줄기세포에 의해 생산될 수 있다는 가설을 강화한다.
혈액 응고 인자의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 및 조혈세포에서의 발현에 특이적인 프로모터를 암호화하는 DNA를 포함하는, 제9인자와 같은 혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현에 적합한 DNA-작제물이 생성되었다.
참조 문헌:
Figure 112000008573883-pat00022
Figure 112000008573883-pat00023
Figure 112000008573883-pat00024
Figure 112006050570209-pat00025

- Jallat et. al., EMBO Journal, 1990, Vol. 9, no. 10 pp3295-3301
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Claims (7)

  1. 혈액 응고 인자의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 및 혈소판 계열(platelet lineage)의 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터를 암호화하는 DNA를 포함하는, 혈액 응고 인자의 조직-특이적 발현을 위한 DNA-작제물.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터로서 사람 혈소판 당단백질 IIb (GPIIb)를 암호화하는 DNA가 삽입된 DNA-작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈액 응고 인자의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA가 제9인자(FIX)를 암호화하는 cDNA인 DNA-작제물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사람 FIX 유전자의 발현을 증가시키는 절단된(truncated) 제1 인트론(인트론 1)이 FIX-cDNA의 엑손(exon) 1과 엑손 2사이에 추가로 삽입된 DNA-작제물.
  5. 제9인자가 제1항 또는 제2항에 따른 DNA-작제물로 형질감염된 혈소판 계열의 세포에서 발현되는, 제9인자의 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제9인자의 생산이 유도물질에 의해 자극되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제9인자의 생산이 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA)에 의해 자극되는 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE489105T1 (de) 2004-03-19 2010-12-15 Baxter Int Faktor ixa zur behandlung von blutungsstörungen
CA2715080C (en) 2007-09-28 2021-09-28 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
CA2724630A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Bayer Healthcare Llc Targeted coagulation factors and method of using the same
CA2888982C (en) * 2012-10-24 2020-07-21 Platelet Targeted Therapeutics, Llc Platelet targeted treatment
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000438A1 (fr) * 1991-06-28 1993-01-07 Commissariat A L'energie Atomique SEQUENCES AMPLIFICATEUR ET SILENCEUR ISOLEES DU PROMOTEUR DE LA GPIIb

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08511423A (ja) * 1993-06-10 1996-12-03 ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド 血友病治療のためのアデノウイルスベクター
US6066778A (en) * 1996-11-06 2000-05-23 The Regents Of The University Of Michigan Transgenic mice expressing APC resistant factor V
FR2763959A1 (fr) * 1997-06-02 1998-12-04 Transgene Sa Nouveaux vecteurs adenoviraux recombinants comprenant une sequence d'epissage

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000438A1 (fr) * 1991-06-28 1993-01-07 Commissariat A L'energie Atomique SEQUENCES AMPLIFICATEUR ET SILENCEUR ISOLEES DU PROMOTEUR DE LA GPIIb

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Human Gene Therapy, vol.6, pp. 873 -880(1995. 7. 공개) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010020795A (ko) 2001-03-15
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EP1048736A1 (en) 2000-11-02
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AU779437B2 (en) 2005-01-27
CA2304376A1 (en) 2000-10-29

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