PT1048726E - Adnc modificado do factor viii - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "ADNc MODIFICADO DO FACTOR VIII"

Esta invenção é dirigida a um ADNc modificado de Factor VIII e à sua utilização para o melhoramento da produção do Factor VIII. 0 Factor VIII (FVIII) é um cofactor de coagulação de plasma implicado na activação do Factor X (FX). Uma redução na presença ou na actividade do Factor VIII na corrente sanguínea leva à hemofilia A. 0 nível da redução na actividade do Factor VIII é directamente proporcional à gravidade da doença (Foster e T. S., 1989; Kaufman, 1992; Vlot et al., 1998). 0 tratamento actual da hemofilia A consiste da substituição da proteína ausente por derivado de plasma ou FVIII recombinante. 0 FVIII recombinante é produzido em células de CHO ou de BHK depois da selecção dos melhores clones de produção e a amplificação do número de cópias do ADNc de FVIII. Vários estudos realçaram o nível baixo de produção de FVIII em sistemas celulares diferentes: a biossíntese de FVIII foi mostrada como sendo regulada pelo menos em três níveis diferentes. Primeiro, entre a sequência de ADNc de FVIII dois nucleótidos que se expandem, localizados no domínio de codificação de A2, foram demonstrados como actuando como silenciadores transcripcionais (Fallaux et al, 1996; Hoeben et al., 1995; Koeberl et al., 1995; Linchar et al., 1993). Em segundo lugar, a síntese da proteína de FVIII é justamente regulada através de vários chaperones endoplásmicos de retículo (BiP; Calreticulina; Calnexina; ERGIC- 2 53). Muitas destas interacções retêm o FVIII na célula e dirigem-no através do maquinismo de degradação celular (Dorner et al. , 1987;

Nichols et al., 1998; Pipe et al., 1998). Em terceiro lugar, uma vez segregado o FVIII é sensível à degradação da protease e tem de ser protegido pelo Factor de von Willebrand (vWF) (Kaufman et al., 1989). 0 documento WO 92 16557 descreve a expressão do FVIII humano recombinante empobrecido de domínio B biologicamente activo em células do ovário de ratos chineses depois de transdução de gene mediada pelo vector. 0 documento WO 94 29471 descreve um vector adenoviral que expressa o FVIII ou o FIX e em que o referido vector inclui adicionalmente pelo menos um elemento genómico. O vector pode ser utilizado para a terapia de gene para libertar factores de coagulação tais como o FVIII ou o FIX para o tratamento da hemofilia. No entanto, a utilização desta invenção é especialmente difícil com o FVIII. 0 documento de Lind et al., 1995 descreve a produção de moléculas recombinantes semelhantes à molécula do FVIII mais pequena activa derivada de plasma, um complexo de cadeia de polipéptido de 80 kDa e 90 kDa a que falta o domínio B, produzido por se utilizarem vários constructos de ADNc do FVIII com a finalidade de se obterem produtos de translação primários os quais foram eficientemente processados no complexo de 80 + 90 kDa. No entanto, este FVIII não apresenta vantagens particulares nos rendimentos da expressão do FVIII. O documento de Kurachi et al., 1995 descreve o efeito positivo do intrão I respectivamente o intrão I largamente truncado na expressão do factor IX. No entanto, a inserção de um tal intrão no FIX não indica qualquer aplicação no FVIII. Os Inventores já trabalharam na expressão do FVIII, como ilustrado no documento EP 1 038 959. 3 É, por conseguinte, um problema desenvolver processos melhorados que resultam em rendimentos de FVIII mais elevados. A presente invenção oferece uma solução para este problema através de um ADNc modificado de FVIII.

De acordo com esta invenção um ADNc modificado de FVIII é posto à disposição no qual o domínio B do ADNc de FVIII de tipo selvagem foi eliminado e um intrão I de FIX truncado foi inserido em uma ou várias posições do ADNc de FVIII . Além do mais o domínio B do ADNc de FVIII de tipo selvagem foi substituído por quatro argininas.

Estes constructos de FVIII foram preparados como se segue:

1. Clonagem do FVIII

Uma estratégia de clonagem de PCR foi projectada, baseada na síntese de quatro fragmentos de PCR, que geram o ADNc de FVIII e que exceptuam o domínio B. Baseado nos dados publicados, foi de interesse substituir o domínio B por quatro argininas. Por se utilizar a transcriptase inversa de MoMuLV (Promega, Charbonnières, França) uma transcrição inversa foi feita no ARN de célula humana isolada a partir de uma biópsia de figado com o consentimento informado escrito do paciente. Quatro fragmentos de PCR foram gerados por se utilizar o Sistema de Expansão (Boehringer-Mannheim, Alemanha), como descrito na Tabela 1. 4

Fragmento Antisentido do sentido cio oligonucleótido SEQ. ID N° Tamanho em bp Local de clonagem 5’ Local de r~· 1 Γ'ϊΓ'ι ía rrortl ”3 1 1 FVIII ATG N ° 1 1704 Not I Bgl 11 3'Bgl II N° . 2 2 5'Bgl II N° q 624 Bgl II Sal I 4R AS N° 4 3 4R S N° 5 1093 Sal I Bgl I 3 ' Bg I N° 6 4 5'Bgl I N° 7 1026 Bgl I Xho I paragem de FVIII N° 8

Tabela I: Sumário dos fragmentos de PCR de FVIII

Todas as sequências dos oligonucleótidos utilizadas para a clonagem são mostradas no Anexo 1.

Um melhoramento adicional foi levado a cabo através da optimização do ambiente de ATG seguindo as regras de Kozak (Kozak, 1997). Para esta finalidade o oligonucleótido ATG de FVIII (SEQ ID N°. 1) foi utilizado.

Comparação do ATG de FVIII de tipo selvagem e as sequências de ATG modificado de FVIII de Kozak

Sequência de WT: TAA GTC ATG CAA ATA

Kozak modificado: ACA CCC ATG GAA ATA

Os aminoácidos modificados são representados a negrito.

Quatro argininas substituem de acordo com a invenção o domínio B da 5 proteína de FVII I. Elas são introduzidas pelos oligonucleótidos utilizados para a clonagem dos dois fragmentos que rodeiam o domínio B (ver Fragmentos 2 e 3 da Tabela I ), a saber, os oligonucleótidos de 4R AS {SEQ. ID. No. 4) e 4R S { SEQ. ID. No. 5). 0 local de Sal I foi gerado pela sequência de codifxcacac as; argininas como se segue:

LOCAL DE SAL I

4R S: 5'-A AGA CGT CGA CGA GAA ATA ACT CGT ACT ACT CTT 4R AS TTG TTA CGG TAA CTT GGT TCT TCT GCA GCT GCT CTT SEQUÊNCIA PEPTÍDICA CORRESPONDENTE:

Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu

No FVIII de tipo selvagem a sequência peptídica é:

Pro-Arg-Domínio B-Arg-Glu

Isto indica que um local de restrição de Sal I foi inserido através do meio da sequência de codificação da quarta arginina sem qualquer alteração de sequência. Todos os fragmentos de PCR foram clonados num vector de pCR2 que utiliza o estojo de clonagem T/A (InVitrogen, Paises Baixos). Dois clones de cada fragmento foram inteiramente sequenciados. Algumas mutações foram encontradas numa proporção de 1 para 800 bases. Uma mutação foi silenciosa mas três outras modificaram a sequência de codificação e três partes do ADNc que sustentam as mutações foram sucessivamente trocadas.

Uma estratégia de sub-clonagem subsequente leva à produção de dois 6 fragmentos (sendo cada um a soma de dois produtos de PCR) : 2,3 kb de 5' (ATG de FVIII ) e 2,1 kb de 3' (Paragem de FVIII) . Os 2,3 kb de 5' (ATG de FVIII) e um 2,1 kb de 3' (Paragem de FVIII) foram construídos e inseridos no vector de expressão de pCADN3 (InVitrogen, Países Baixos) abertos por Not I e Xho I e tratados com fosfatase alcalina. A cassete de clonagem de pCADN3 apresenta uma sequência de restrição semelhante como o pCR2 e o vector possui o seu próprio gene de resistência (neomicina). Um ADNc que codifica o FVIII eliminado do domínio B (a partir daqui referido como ADNc do Factor VIII) foi directamente obtido no vector de expressão. A integridade do ADNc do FVIII final foi verificada pela análise de restrição extensa. 0 ADNc do factor VIII foi subclonado no Bluescript pKS II + vector aberto por Not I e Xho I. A utilização deste vector foi mais conveniente para a introdução de modificações subsequentes no ADNc do Factor VIII (por exemplo a adição de intrões; ver a partir daqui). 2. Inserção do intrão 1 de FIX truncado

De acordo com a invenção o ADNc do FVIII foi adicionalmente modificado através da inserção de um intrão 1 truncado do Factor IX (FIX Til = SEQ. ID. No. 9) . 0 FIX Til foi inserido em posições diferentes do ADNc do FVIII como se segue: - na posição do intrão 1 do FVIII, para utilizar uma estratégia semelhante como para o FIX (Kurachi et al., 1995) nas posições do intrão 12 e 13 do FVIII, porque uma sequência silenciadora transcripcional foi descrita nesta região, nas posições dos intrões 1 + 12 e 1 + 13 do FVIII. Uma vez que o 7 ADNc do FVI1I é muito maior do que o FIX (4,4 Kb versus 1,4 Kb) , pusemos a hipótese que ele poderia ter interesse para introduzir sequências supostamente de estabilização nas posições normalmente ocupadas pelos intrões 12 e 13 em adição ao intrão 1. Uma vez que a posição dos intrões 12 e 13 estão grosseiramente no meio da sequência de FVIII é possível que eles possam actuar de forma sinérgica com o intrão 1. A sequência de FIXT1I (= SEQ-ID No. 9) utilizada de acordo com a invenção em posições diferentes do ADNc do FVIII começa depois da sequência de codificação através da sequência dadora de junção e termina através da sequência de aceitação de junção do intrão 1 truncado. As letras do caso superior começam depois e param antes das posições de restrição de Nsi I e de Mlu I, respectivamente. Para os detalhes ver o Anexo 2.

Para clonar este fragmento numa sequência exógena, dois novos fragmentos de ligação de FVIII foram gerados, um a montante do FIX Til com a adição de um local de Nsi I e um a jusante com a adição de um local de Mlu. Os três fragmentos foram posteriormente ligados em conjunto utilizando estes locais.

Uma estratégia semelhante foi utilizada para inserir os três FIXTI1 em posições diferentes. Em cada caso três fragmentos de PCR (A, B, C) foram gerados com o Sistema de Expansão que utiliza o ADNc do Factor VIII como o padrão para os segmentos A e C, e o intrão 1 do

Factor IX para o fragmento B. As extremidades do fragmento A compreendem a sequ ência do Factor VIII na extremi dade de 5 1 , e na extremidade de 3' uma fusão entre a sequência de junção de 3' do FVIII e a sequência de junção de 5 ' do primeiro intrão do Fact .or IX. Um local de restrição de Nsi I foi adicionado entre estas duas 8 sequências. O fragmento B possui na extremidade 5' uma sequência complementar ao fragmento prévio, o intrão 1 do Factor IX truncado, e na extremidade 3' um local de restrição de Mlu I inserido. 0 fragmento C foi feito da sequência complementar da extremidade 3' do fragmento B seguido pela sequência de junção 3' do primeiro intrão do Factor IX e pelo ADNc do Factor VIII a jusante da sequência de codificação (ver a Figura I).

0 fragmento B foi o mesmo para todos os constructos ao passo que A e C foram todos diferentes, correspondendo às sequências 5' e 3' do FVIII dos locais de inserção do intrão.

As estratégias de inserção para as posições do intrão 12 e 13 são indicadas na Figura 2.

Cada fragmento de PCR foi gerado e primeiramente clonado no vector de pCR2 que utiliza o estojo de clonagem T/A (InVitrogen, Países Baixos). Eles foram ligados em conjunto em dois passos sucessivos (pCR2-B+C/MluI+Xhol; pCR2-AiBC/Nsi1+Xbal). Todos os fragmentos ABC (1, 12 e 13) foram sequenciados e mostrados como sendo livres de mutações. |Nome do fragmento Tamanho em bp 11-A 204 | TFIXIl (B) 2 81 Il-C 464 I12-A 234 I12-C 388 I13-A 434 I13-C 180 9

Tubela II: Sumário dos fragmentos de PCR necessários para introduzir o TFIXI1. 0 ABC1 foi clonado em pKS II + FVIII depois da digestão de Spe I Spe I. Depois de se verificar a orientação, o ADNc de FVIII II foi subclonado no vector de pCADN3 que utiliza uma digestão de Not I Xho I. Os ABC 12 e o ABC13 foram digeridos por Bgl II e Sal I e ligados em pKSII-FVIII digerido pelas mesmas enzimas. O FVIII 112 e o FVIII 113 resultantes foram subclonados em pCADN3 que utiliza uma restrição de Not I Xho I.

Para gerar um constructo que contém dois intrões, o FVIII II de pKS e os fragmentos de ABC 12 ou de ABC 13 foram digeridos por Bgl II e Sal I e ligados em conjunto, o FVIII II de pKSII +12 e o FVIII 11+13 foram obtidos e os ADNc de FVIII que contêm os intrões foram subclonados em pCADN3 através da mesma estratégia como a anteriormente descrita. 3. Geração de linhas de células de FVIII que se expressam de forma estável

Todos os constructos de pCADN3-FVIII foram transfectados em células de CHO através de electroporação. Resumidamente, 7 x I0D células de CHO lavadas foram electroporadas na presença de 10 g de constructo linearizado de Pvu I. As células foram seleccionadas 15 horas depois da electroporação em IMDM (= Meio de Dulbecco Modificado de Iscove) complementado por antibióticos e 10 % de soro de bezerro fetal que contém 0,6 mg/mL de G418. Para cada constructo (FVIII; II, 112; 113; 11+12; 11+13), duas coligações de clones que contêm mais do que 50 colónias individuais foram cultivadas e congeladas. Um conjunto de 25 colónias individuais foram seleccionadas, 10 cultivadas e avaliadas para a expressão do Factor VIII que utiliza um método de ELISA (Asserachrom VIIIC. Ag, Diagnostica STAGO, Asnières, França). Para todos os clones, a eficiência da transfecção foi de cerca de 40 - 60 % como determinado pelo número de clones de expressão. Os cinco melhores clones de produção de FVIII foram conservados e congelados. O antigénio de FVIII detectado variou dramaticamente de mm. constructo para o outro. A actividade do Factor VIII recombinante foi medida por se utilizar o ensaio de mudança de uma etapa clássica para coligação e cincc clones seleccionados. Uma actividade de coagulação foi verificada em cada sobrenadante das células de expressão do Factor VIII que indica que o constructo foi codificado para uma proteína funcional. A actividade foi correlacionada à quantidade de proteína detectada através de ELISA. Por conseguinte, foi demonstrado que cada constructo permitiu a produção de um pró-coagulante funcional de FVIII.

4, Avaliação da eficiência do constructo 4.1 Análise quantitativa em células de CHO A cinética da produção de FVIII foi analisada para cada coligação de células de CHO transfectadas. Para cada coligação, foram feitas experiências independentes através de duas experiências diferentes. No dia 0,4. 10° células foram disseminadas num prato de 6 cavidades em 2 mL de meio fresco que contém 0,6 mg/mL de G418. Do dia 1 ao dia 4, o sobrenadante de cultura foi reunido, centri fugado e analisado para o antigénio de FVIII e para a actividade de pró-coagulação. Cada dia, depois da remoção do meio, as células foram tripsinizadas e contadas em Azul Trypan. A acumulação de FVIII é 11 mostrada na Figura 3. Três constructos permitiram uma melhor produção do que o ADNc de FVIII não modificado, isto é o FVIII II, FvIII II + 12 e em particular FVIII li + 13. 0 FVIII II e o FVIII 11 + 12 levaram a uma produção de 2 a 3 vezes mais elevada e o FVIII II + 13 de 8 a 9 vezes mais. As actividades de pro-coagulação foram medidas a partir dos mesmos sobrenadantes e são apresentadas na Figura 4. Foram directamente correlacionados à quantidade de antigénio detectado. 4.2 Análise quantitativa em células de HepG2

Para confirmar os dados obtidos em células de CHO, foi escolhido um segundo modelo celular. Os constructos que apresentaram um melhoramento na expressão de FVIII foram testados (por exemplo FVIII; FVIII II, FVIII II + 12; FVIII II + 13) utilizando a linha de célula de HepG2 hepática transitoriamente transfectada. 2 g de ADN circular foram adicionados a 12 I de reagente de transfecção Fugene 6 (Boehringer Mannheim, Meylan, França). Depois de 15 minutos, o complexo foi adicionado gota a gota a um prato de 90 mm semeado com 5 x 106 células no dia anterior. A mistura de transfecção foi incubada durante 6 horas antes de ser substituída por 4 mL de meio fresco. 0 meio de cultura foi reunido 72 horas mais tarde e submetido a coagulação e ensaios de ELISA. Como mostrado na Figura 5, os resultados obtidos utilizando as células de HepG2 confirmaram os dados obtidos em células de CHO com a excepção do constructo de FVIII II + 12 que aqui não produziu qualquer antigénio de FVIII detectável. Estes dados reforçaram o potencial interesse no constructo de FVIII II + 13. 5. Análise dos níveis de expressão 12

0 ARN total de cada coligação A transfectada foi extraído com o mini estojo de Rneasy (Quiagen), 6,10° células a serem utilizadas para cada extracção. 10 g de ARN total foram migrados a 120V, 4 C em 0,8 % de gel de agarose em tampão de fosfato, transferidos durante a noite na membrana de Náilon de Hybond-N (Amersham) e cozidos durante 2 horas a 80 °C. Uma prova de ARN de FVIII, que contém 1,03 Kb do fragmento de Sal I-Bgl I, foi gerada através de polimerase T7 utilizando o estojo de marcação de ARN DIG (Boehringer). A membrana foi bloqueada 30 minutos pela solução de Hyb fácil de DIG (Boehringer) e incubada na mesma solução fresca durante a noite com 500 ng de prova de antisentido marcada. As lavagens foram conduzidas como recomendado pelo fabricante e a mancha foi revelada utilizando o estojo de detecção de DIG (Boehringer) analisada e quantificada. Os sinais de FVIII foram comparados com o ARN marcado por BET ribossómico e com o sinal de GAPDH.

As quantidades de ARNm de FVIII, FVIII II e FVIII I + 12 foram muito próximas umas das outras. O ARNm de FVIII II + 13 foi expresso em quantidades maiores. Estes resultados indicam uma correlação entre a quantidade de ARNm e a proteína produzida para os constructos (ver a Figura 6).

Um aumento de duas vez em ARNm de FVIII II + 13 levam a um aumento de proteína de 8 a 9 vezes. Por conseguinte, a adição do intrão I de FIX truncado poderia desempenhar um papel duplo na estabilização do ARNm de FVIII mas também provavelmente na actuação durante a tradução. 0 ARNm de FVIII é 4,4 Kb de comprido e as diferenças de 0,3 Kb devido a uma possível não junção do TFIXII podem não ser visíveis 13 na mancha de Northern. Um conjunto de experiências de RT-PCR foi feito no ARN total extraído de linhas de células diferentes. Em cada caso uma banda correspondente a um ARNm unido foi obtida indicando a junção do TFIXIl de ARNm de FVIII. 6. Caracterização da proteína

Um anticorpo anti-FVIII de ovelha de Cedarlane (Hornby, Canadá) foi comprada e positivamente testada num imuno-ruancheamento de controlo utilizando o FVIII recombinante. Este anticorpo foi utilizado no imuno-mancheamento no sobrenadante da célula mas nenhum sinal foi obtido devido à baixa quantidade de antigénio segregado. Uma imunoprecipitação foi feita no sobrenadante da célula mas aqui mais uma vez nenhum sinal foi obtido indicando a incapacidade deste anticorpo para imunoprecipitar o FVIII. Um imuno-mancheamento foi feito em lisados de célula solúvel de Triton-X100. Pratos de 90 mm foram lisados com 300 I de tampão de iise arrefecidos em gelo (20 mM de Hepes pH 7,5, 100 mM de KC1, 2 mM de MgCl2, 0,5 % de Triton X-100) . As células foram desfeitas e centrifugadas a 4 C, 10 minutos a 14 000 g. A concentração de proteína foi medida com o estojo de Ensaio de proteína Dc (BioRad, Hércules, EUA). 175 g de cada lisado de célula foram carregados em 7,5 % de gel de acrilamida e tratados seguindo o protocolo de Laemmli. Depois da transferência semi-seca (35 minutos a 400 mA) , a membrana de nitrocelulose foi incubada durante a noite em TBS-T (20 mM de Tris pH 7,5, 0,15 M de NaCl , 0,5 % de Tween-20). A membrana foi depois incubada durante 1 hora com o anticorpo de anti-FVIII (5 g/mL) em TBS-T. Depois de três lavagens de 10 minutos cada uma em TBS-T, a membrana foi incubada durante 30 minutos com um anticorpo ligado de peroxídase anti-ovelha de coelho (diluição 10“* em TBS-T). Foram conduzidas lavagens extensivas antes da revelação com o sistema de 14 ECL (Amersham).

Entre todos os lisados, só as células transfectadas com o constructo de FVIII II + 13 deram um sinal positivo com um peso molecular aprcximadamente correcto. O FVIII II + 13 apareceu como um produto de banda singular que migra a um peso molecular correspondente à cadeia pesada do Factor VIII desprovido do domínio B.

Com a finalidade de confirmar as diferenças observadas em quantidades de FVIII intracelulares, um ELISA foi feito em lisados solúveis de Triton-X 100. A presença de Triton X-100 foi mostrada como não influenciando o teste de ELISA no FVIII. O valor do antigénio de FVIII presente dentro das células confirma os dados obtidos no mancheamento de Western. 0 FVIII II + 13 levou a uma síntese 100 vezes mais elevada do antigénio do que todos os outros constructos (29 ng/mL contra 0,3 ng/mL de FVIII) (ver a Figura 7). 0 objectivo da invenção é, por conseguinte, os constructos eliminados do domínio B do FVIII que contém o intrão I truncado do Factor IX ligeiramente modificado em posições diferentes do ADNc. Entre estes constructos um ADNc que influencia o intrão I truncado em ambas as posições do intrão 1 do FVIII e do intrão 12 levou a uma produção intracelular 100 vezes mais elevada do que todos os outros constructos e a uma secreção 9 vezes mais elevada da proteína. Esta produção melhorada e a secreção foram observadas em duas linhas de célula diferentes: as células de CHO e de HepG2. O FVIII produzido foi totalmente activo num ensaio de coagulação de urna fase e parece homogénea em imuno-mancheamento. A quantidade de ÃRNm de todos os constructos testados difere não mais do que três vezes indicando que o benefício observado na produção vem tanto de 15 um eleito trarscripcional como de translação. A presente invenção indica que a produção de FVIII pode ser melhorada por se adicionarem intrões do ADNc do FVIII. As vantagens de tais ADNc de FVIII modificados para a produção de FVIII in vitro bem como para a terapia genética humana por se inserir um tal ADNc num vector de transferência conveniente, são importantes para o tratamento futuro da hemofilía A.

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Anexo 1

Lista de Sequências <110> Aventis Behring GmbH <12Q> ADNc do Factor VIII Modifi cado <130> 1999 /Z003-Ma 12 01-C35 <160> 9 <17 0> Patentln Ver. 2 1 • X <2 10> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 acacccatgg aaatagagct ctccacctgc 30 <210> 2 <211>2 4 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 00> 2 agtcctgaag ctagatctct ctcc 24 <210> 3 <2 11 > 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 00> 3 aatatggaga gagatctagc ttcagg 26 <210 > 4 <211 > 36 <2 Ϊ2> ADN <213> Homo sapiens <4 00> 4 ttctcg t g d cgtcttcttg gttcaatggc attgtt <210> c d 19 <211> 34

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5

aagacgtcga cgagaaataa ctcgtactac tctt 34 <210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6

agcatgtaga tgctcgccaa taaggc 26 <210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 atttggcggg tggaatgcct tattggcg 28 <210> 8 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 00> 8 acacctcgag tcagtagagg tcctgtgcct egc 33 <2i0> 9 <211>312

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 20 gtttgtttat gcatCCTTTT TTAAAATACA TTGAGTATGC TTGCCTTTTA GATATAGAAA 60 TATCTGATGC TGTCTTCTTC ACTAAATTTT GATTACATGA TTTGACAGCA ATATTGAAGA 120

GTCTAACAGC CAGCACGCAG GTTGGTAAGT ACTGTGGGAA CATCACAGAT TTTGGCTCCA 180 TGCCCTAAAG AGAAATTGGC TTTCAGATTA TTTGGATTAA AAACAAAGAC TTTCTTAAGA 240 GATGfAAAAT TTTCATGATG TTTTCTTTTT TGCTAAAACT AAAGAATTAa cgcgtattct 300 tttacatttc ag 312

Mexo 2

Oligonucleótidos utilizados para introduzir TFIXI1 na sequência de FVIII 0 sentido do oligonucleótido é sempre apresentado em primeiro lugar.

Oligonucleótidos utilizados para introduzir dois locais de restrição no TFIXI1:

FVIII IB-S: 5'-C AT GCA T CC TTT TTT AAA ATA CAT TGA G

local de Nsi I

FVIIIB-AS: 5'-A AC GCG T TA ATT CTT TAG TTT TAG CA

local de Mlu I

OS Oligonucleótidos utilizados para a geração de extremidades compatíveis de FVIII para clonagem na posição do intrão 1 do FVIII 21

GeiTâÇão dg Ti p,

FVIII ATG: 5' -ACA CCC ATG GAA ATA GAG CTC TCC ACC TGC

FVIII iA~AS: 5'-A AT GCA T (AA ACA AAC) CTT GCG TCC ACA GGC AGG TC dador de junção de FIX do local de Nsi I

- Geração de II B

FVIII IC-S: 5'-A AC GCG T (AT TCT TTT ACA TTT CAG) ATT TCC TCC TAG AGT GCC dador de junção de FIX do local de Mlu I

AAA ATCT

FVIII 585-AS: 5'-TtC TCT ACA T AC TAG T AG GGC

Local de Spel do FVIII endógeno

Oligonucleótidos utilizados para a geração de extremidades compatíveis de FVIII para clonagem na posição do intrão 12 do FVIII

-Geração de I12A

5' Bgl II: 5'-AAT ATG GAG AGA GAT CTA GCT TCA GG

FVIII 12-AS: 5'-A AT GCA T (AA ACA AAC) TGT GCA TGA TGT TGG AGG CT dador de junção de FIX do local de Nsi I - Geração de I12C

FVIII 12C-S: 5'-A AC GCG T (AT TCT TTT ACA TIT CAG) GCA TCA ATG GCT ATG TTT sequência aceitante de junção de FIX de local de Mlu I 22

4R AS: 5'-TTC TCG TCG ACG TCT TCT TGG TTC AAT GGC ATT GTT

Oligonucleótidos utilizados para a geração de extremidades compatíveis de FVIII para clonagem na posição do intrão 13 do FVIII

- Geração de I13A 5' Bgl II: 5'-AAT ATG GAG AGA GAT CTA GCT TCA GG

FVIII 13A-AS: 5'-A AT GCA T (AA ACA AAC) CTG GGT TTT CCA TCG ACA TGA A dador de junção de FIX do local de Nsi I

-Geração de I13C FVIII 13C-S:5'-A AC GCG T (AT TCT TTT ACA TTT CAG) GTC TAT GGA TTC TGG GGT aceitante da junção de FIX do local de Mlu 1

4R AS :5'-TTC TCG TCG ACG TCT TCT TGG TTC AAT GGC ATT GTT

Lisboa, 16 de Outubro de 2006

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. ADNc modificado do Factor VIII, caracterizado pelo facto do domínio B do ADNc do Factor VIII de tipo selvagem ter sido eliminado e um intrão 1 do Factor IX truncado ter sido inserido numa ou várias posições do ADNc do Factor VIII.
2. 2. ADNc modificado do Factor VIII de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do domínio B do ADNc do Factor VIII de tipo selvagem ter sido substituído por quatro argininas.
3. 3. ADNc modificado do Factor VIII de acordo com a reivindicação 1 2, caracterizado pelo facto do intrão 1 do Factor IX truncado, (SEQ. ID. No.), ter sido inserido na posição normalmente ocupada pelos intrões 1 e/ou pelo intrão 12 e/ou pelo intrão 13.
4. 4. Processo para a produção do Factor VIII, caracterizado pelo facto da produção ser levada a cabo numa linha de célula que contém um ADNc modificado de Factor VIII de acordo com as reivindicações reclamações 1 a 3.
5. 5. Vector de transferência para a utilização na terapia de gene humano, caracterizado pelo facto de compreender o ADNc modificado de Factor VIII de acordo com as reivindicações 1 a 3. Lisboa, 16 de Outubro de 2006