DE60117998T2

DE60117998T2 - Mutierte Furin-Polypeptide mit verbesserten Eigenschaften

Info

Publication number: DE60117998T2
Application number: DE60117998T
Authority: DE
Inventors: Barbara Plaimauer; Uwe Schlokat
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-05-26
Also published as: EP1294864A2; ES2260255T3; JP2004508015A; CA2411694A1; WO2001094383A2; JP2014155506A; EP1294864B1; AU7843101A; JP5591432B2; DE60117998D1; JP2011182802A; ATE320485T1; US6596526B1; WO2001094383A3; AU2001278431B2; CA2411694C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Furin-Polypeptide. Furin, das auch als PACE (steht für gepaarte basische Aminosäure-Spaltungsenzym) bezeichnet wird, gehört zur Familie von Säugersubtilisin-artigen Proproteinkonvertasen (SPC oder PC). Diese Proteine wurden mit der endoproteolytischen Reifungsverarbeitung inaktiver Vorläuferproteine an einzelnen, gepaarten oder mehrfachen basischen Consensus-Stellen innerhalb des sekretorischen Stoffwechselwegs in Verbindung gebracht (dargestellt in Nakayama, 1997, Biochem. J., 327, Seiten 625–635; Seidah und Chretien, Current Opinions in Biotechnology, 8, 1997, Seiten 602–607). Sieben unterschiedliche Mitglieder dieser Familie wurden bisher identifiziert, einschließlich Furin, PC1 (auch als PC3 bekannt), PC2, PACE4, PC4, PC5 (auch als PC6 bekannt), PC7 (oder LPC, PC8 oder SPC7), wobei jedes davon eine einzigartige Gewebeverteilung zeigt, obwohl in manchen Geweben eine überlappende funktionelle Redundanz verschiedener PC's vorkommen kann (Seidah et al., Biochem., 1994, 76, Seiten 197–209).
Furin wird ubiquitär in allen untersuchten Säugergeweben und Zelllinien exprimiert und kann einen breiten Bereich bioaktiver Vorläuferproteine in dem sekretorischen Stoffwechselweg verarbeiten, einschließlich Wachstumsfaktoren, Hormone, Plasmaproteine, Rezeptoren, Virushüllenglykoproteine und bakterielle Toxine. Es handelt sich um eine Calcium-abhängige Serinendoprotease, die strukturell in mehreren Domänen angeordnet ist, nämlich ein Signalpeptid, ein Propeptid, eine katalytische Domäne, eine mittlere Domäne (auch als Homo-B- oder P-Domäne bezeichnet), die C-terminal angeordnete Cystein-reiche Domäne, eine Transmembrandomäne und der cytoplasmatische Schwanz. Beim Übergang des neu synthetisierten Furinvorläufers vom endoplasmatischen Retikulum in das Golgi-Kompartiment wird das Propeptid in einem zweistufigen Verarbeitungsereignis autokatalytisch entfernt (Leduc et al., J. Biol. Chem., 267, 1992, Seiten 14304–14308; Anderson et al., EMBO J., 1997, Seiten 1508–1518).
Furin ist vorwiegend am trans-Golgi-Netzwerk (TGN) lokalisiert, es bewegt sich jedoch mittels endosomaler Vesikel auch zyklisch zwischen dem TGN und der Zelloberfläche, wodurch sowohl Vorläuferproteine während ihres Transports durch den konstitutiven sekretorischen Stoffwechselweg als auch Moleküle, die in den endocytischen Stoffwechselweg eintreten, verarbeitet werden. Die zelluläre Verteilung von Furin auf die verschiedenartigen Verarbeitungskompartimente wird offensichtlich durch definierte strukturelle Merkmale innerhalb seines cytoplasmatischen Schwanzes bestimmt (Schäfer et al., EMBO J., 11, 1995, Seiten 2424–2435; Voorhees et al., EMBO J., 20, 1995, Seiten 4961–4975; Teuchert et al., J. Biol. Chem., 274, 1999, Seiten 8199–8207). Die Deletion der cytoplasmatischen Domäne führt zu einem verkürzten Furin-Polypeptid, das sich in erster Linie in der Plasmamembran befindet, zu der es möglicherweise durch eine Nonstop-Passage transportiert wird, und das aufgrund des Verlusts eines regulativen Sequenzmotivs innerhalb der cytoplasmatischen Domäne nicht im Zyklus zu dem TGN zurückkehren kann (Molloy et al., EMBO J., 13, 1994, Seiten 18–33; Schäfer et al., EMBO J., 14, 1995, Seiten 2424–2435).
Es wurde gefunden, dass die C-terminalen Domänen für die funktionelle Aktivität von Furin nicht erforderlich sind. Es wurde gefunden, dass mutiertes Furin, dem die Transmembrandomäne und der cytoplasmatische Schwanz fehlen, leicht in das Zellkulturmedium freigesetzt wird, während es nach wie vor eine signifikante Aktivität zeigt. Ein hohes Expressionsniveau eines rekombinanten Volllängen-Furins haben zu einer natürlichen Sekretion einer verkürzten Furinform geführt, die als „Shed"-Furin bekannt ist und der die Transmembrandomäne und der cytoplasmatische Schwanz fehlen (Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 1990, Seiten 9378–9382; Rehemtulla und Kaufman, Blood, 79, 1992, Seiten 2349–2355; Vidricaire et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 195, 1993, Seiten 1011–1018; Vey et al., J. Cell. Biol., 127, 1994, Seiten 1829–1842; Preininger et al., Cytotechnol., 30, 1999, Seiten 1–15). Es bleibt eine offene Frage, ob das Furin-"Shedding" auf gesättigte zelluläre Abrufungsmechanismen zurückzuführen ist, ob es einen Schutzmechanismus der Wirtszelle gegen überschüssige Protease darstellt, oder ob es Teil eines natürlichen regulatorischen Prozesses ist, der die intrazelluläre Furinkonzentration/aktivität durch eine Sekretion moduliert. Die Isolierung eines verkürzten endogenen Furins von der Golgifraktion von Rindernierenzellen kann die Ansicht stützen, dass das „Shedding" nicht nur ein künstlicher Sekretionsprozess ist, der durch eine Überexpression verursacht wird (Vey et al., 1994). Es wurde gezeigt, dass die Umwandlung von Furin in die lösliche sezernierte Form intrazellulär innerhalb eines sauren Kompartiments stattfindet, was die Gegenwart von Calcium erfordert (Vey et al., 1994).
Die Gegenwart einer C-terminal verkürzten und somit löslichen Form von Furin, die aktiv bleibt, wurde jedoch nahezu ausschließlich in einem konditionierten Medium von Zellen nachgewiesen, die natives Volllängen-Furin rekombinant überexprimieren (Wise et al., 1990; Rehemtulla und Kaufman, 1992; Vidricaire et al., 1993; Vey et al., 1994; Preininger et al., 1999).
Ein anderer Stand der Technik, der Furin-Polypeptide beschreibt, umfasst die WO 91/06314, die ein Furinfragment beschreibt, das aus den Aminosäuren 108 bis 464 besteht und dem folglich ein Teil der homo-B-Domäne, des Cystein-reichen Bereichs, der Transmembrandomäne und des cytoplasmatischen Schwanzes fehlt. Die WO 92/09698 beschreibt Volllängen- Furin und Furin, dem die Transmembrandomäne fehlt. Darüber hinaus beschreiben Preininger et al. (Cytotechnology 30, 1999, Seiten 1 bis 15) Furinmutanten, denen der Cysteinreiche Bereich, die Transmembrandomäne und die cytosolische Domäne fehlen. Zellen, die solche Mutanten exprimieren, enthielten erhöhte intrazelluläre Konzentrationen der Furinderivate, wiesen jedoch variierende Sekretionsniveaus auf. Die Autoren haben angegeben, dass der Mangel einer extrazellulären Akkumulierung dieser Moleküle nahe legt, dass diese Moleküle am wahrscheinlichsten abgebaut worden sind. Die Autoren haben ferner angegeben, dass rekombinantes Volllängen-Furin, das intrazellulär vorliegt, größtenteils inaktiv zu sein scheint und dass eine potenzielle Toxizität größerer Mengen an Volllängen-Furin für dessen Wirtszelle vorliegt.
Wir haben gefunden, dass lösliches Furin in einem Zellkulturmedium dazu führen kann, dass Proteine, die nicht natürlicherweise von Furin verarbeitet werden, unspezifisch gespalten werden. Beispielsweise kann Faktor VIII, obwohl Faktor VIII nicht natürlicherweise durch Furin verarbeitet wird, ein Ziel für eine unbeabsichtigte Verarbeitung durch lösliches Furin werden, wenn er für einen längeren Zeitraum Furin ausgesetzt ist, z.B. in einem Zellkulturmedium. Dies führt zu einer verminderten Ausbeute an strukturell intaktem Faktor VIII-Protein in einem solchen Zellkulturmedium. Dies kann der Fall sein, wenn Faktor VIII zusammen mit einem natürlichen Substrat von Furin, wie z.B. von Willebrand-Faktor, coexprimiert wird, oder wenn rekombinante Proteine, die natürlicherweise durch Furin verarbeitet werden, für einen längeren Zeitraum Furin ausgesetzt sind, so dass zusätzlich unbeabsichtigte Stellen gespalten werden.
Die vorliegende Erfindung vermindert oder verhindert eine unspezifische Spaltung von Proteinen in einer Zellkultur durch die Verwendung von modifizierten Furin-Polypeptiden, die eine proteolytische Aktivität aufweisen, die jedoch nicht durch Wirtszellen in ein Kulturmedium sezerniert werden oder die verglichen mit der Sekretion von Wildtyp-Furin in verminderten Mengen sezerniert werden. Es wurde gefunden, dass solche Furin-Polypeptide selbst dann für Wirtszellen nicht toxisch sind, wenn sie in großen Mengen intrazellulär exprimiert werden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Furin-Polypeptid mit einer verglichen mit der Aminosäuresequenz von Wildtyp-Furin zwischen der homo-B-Domäne und der Transmembrandomäne, d.h. zwischen den Aminosäuren Ala 557 und Leu 713 gemäß der in den 1 und 2 gezeigten Aminosäuresequenz, modifizierten Aminosäuresequenz bereit. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Furin-Polypeptide, die eine solche modifizierte Aminosäuresequenz aufweisen, eine proteolytische Aktivität aufweisen, die derjenigen von nativem (d.h. Wildtyp-Furin) ähnlich ist, dass sie jedoch durch Wirtszellen, die solche Furin- Polypeptide exprimieren, in ein Kulturmedium verglichen mit nativem Furin in wesentlich verminderten Mengen sezerniert werden.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide in einer Zelle in großen Mengen exprimiert werden, ohne für die Zelle wesentlich toxisch zu sein. In einem weiteren Aspekt sind die physiologischen Spaltungseigenschaften des modifizierten Furinproteins nach wie vor vorhanden, jedoch ist eine unbeabsichtigte Spaltung der sezernierten oder extrazellulär lokalisierten Proteine in einem Zellkulturmedium stark vermindert, da weniger oder kein Furin in dem Medium vorliegt.
Zusätzlich besteht ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Furin-Polypeptids darin, dass, obwohl die proteolytische Verarbeitung Furin-abhängiger Proteine intrazellulär stattfinden kann, eine unspezifische Verarbeitung von Proteinen durch Furin zumindest vermindert, wenn nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Daher wird eine unspezifische Spaltung von Proteinen, die vorkommen kann, wenn Proteine löslichem Furin in einem konditionierten Medium in einer Zellkultur ausgesetzt werden, durch das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid vermieden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein rekombinantes Polynukleotid bereit, welches das erfindungsgemäße Furin-Polynukleotid codiert. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Furin-Polypeptids, einen rekombinanten Vektor, der die Polynukleotidsequenz umfasst, die das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid codiert, eine Wirtszelle, die einen solchen Vektor umfasst, und eine Zubereitung, die das erfindungsgemäße Polypeptid umfasst, bereit.
1 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem Wildtyp-Furin.
2 ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenzen von Wildtyp-Furin und Furinmutanten.
3 ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, die „Shed"-Furin in einem konditionierten Medium zeigt, in dem FD11-CHO-rvWF-Zellen, die transient mit Furinkonstrukten transfektiert worden sind, gezüchtet wurden.
4 ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, welche die Verarbeitung von rvWF-Vorläufer in FD11-CHO-rvWF-Zellen, die transient mit Furinkonstrukten transfektiert worden sind, zeigt.
Die 5A bis 5C zeigen die Furinexpression in transient transfektierten HEK 293-Zellen:
5A ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, das rekombinantes „Shed"-Furin (rFurin) in konditioniertem Medium von transient transfektierten HEK 293-Zellen zeigt;
5B ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, das die intrazelluläre rFurin-Expression in HEK 293-Lysaten zeigt; und
5C zeigt die Ergebnisse eines in vitro-Furintests unter Verwendung von konditioniertem Medium und fluorogenem Substrat (in willkürlichen Einheiten).
6 ist eine Photographie von drei SDS-PAGE-Gelen, welche die Korrelation zwischen dem Grad der rvWF-Vorläuferverarbeitung und der Gegenwart von „Shed"-Furin in konditioniertem Medium zeigt.
Furin-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung umfasst Furin-Polypeptide, die verglichen mit Wildtyp-Säugerfurin, wie z.B. menschlichem Furin (dessen Aminosäuresequenz in der 1 gezeigt ist), eine modifizierte Aminosäuresequenz zwischen den Aminosäuren Ala 557 und Leu 713 aufweisen. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung soll sich ein Furin-Polypeptid auf ein Polypeptid beziehen, das mindestens einen Abschnitt der Aminosäuresequenz eines Wildtyp-Säugerfurinproteins umfasst, der eine proteolytische Aktivität aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Modifikation in einem erfindungsgemäßen Furin-Polypeptid zwischen den Aminosäuren Ala 557 und Leu 713. In einer alternativen Ausführungsform liegt die Modifikation bei Arg 683. In einer weiteren Ausführungsform sind die Aminosäuren zwischen Gly 577 und His 712 deletiert.
In der vorliegenden Offenbarung sollen die Begriffe „modifiziert" und „Modifikation" bezüglich der Aminosäuresequenz eines Furin-Polypeptids darüber hinaus eine Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäure(n) bedeuten. Eine solche Modifikation kann z.B. durch eine direkte Mutagenese oder eine PCR oder andere bekannte Verfahren der Gentechnik durchgeführt werden, die zur spezifischen Veränderung einer DNA-Sequenz zur Steuerung einer Änderung der Aminosequenz des resultierenden Polypeptids geeignet sind (Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Kapitel 8 (Ausubel et al., Hrsg., J. Wiley and Sons, 1989 & Ergänz. 1990–93); Protein Engineering (Oxender & Fox, Hrsg., A. Liss, Inc., 1987)). Die Modifikationen der vorliegenden Erfindung liegen in dem Bereich zwischen der homo-B-Domäne und der Transmembrandomäne, d.h. in dem Bereich zwischen den Aminosäuren Ala 557 und Leu 713 des Furinmoleküls.
Vorzugsweise weist das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid Aminosäuresubstitutionen und/oder -hinzufügungen auf, die Schleifen- oder Alpha-Helix-Strukturen erzeugen. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Aminosäuren mehrere verschiedene Sekundärstrukturen in Polypeptiden bilden können, d.h. helikale Strukturen oder Schleifenstrukturen (A. Lehninger, „Biochemie", VCH, 1985, Seiten 102–107; P. Karlson et al., „Kurzes Lehrbuch der Biochemie", Georg Thieme Verlag, 1994, Seiten 29–32). Diese Strukturen können durch Auswählen spezifischer Aminosäuren erzeugt werden, die z.B. Alpha-Helices und Schleifen bilden und dadurch Strukturen wie Helices oder Schleifen in dem resultierenden Polypeptid erzeugen (B. Rost und C. Sander, Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, Seiten 7558–7562, B. Rost und C. Sander, 1994, Proteins: Structure, Function and Genetics, 19, Seiten 55–72). Zusätzlich können gemäß J. Kyte und R. Doolittle (1983, J. Mol. Biol., 157, Seiten 105–132) solche Aminosäuren auf der Basis ihrer Hydropathiewerte ausgewählt werden, und zwar im Hinblick auf die Erkenntnis, dass Aminosäuren, die negative Hydropathiewerte zeigen, hydrophil sind, wodurch diese Seitenketten zu dem wässrigen Lösungsmittel Zugang haben, wohingegen Aminosäuren, die positive Hydropathiewerte aufweisen, hydrophobe Aminosäuren sind, die dazu neigen, innere Abschnitte der Proteine einzunehmen. Zusätzlich ist bekannt, dass Aminosäuren, die sehr hohe positive oder negative Hydropathiewerte zeigen, bevorzugte Ziele für verschiedene Proteasen sind.
Daher liegt in einer bevorzugten Ausführungsform eine Insertion mehrerer Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 5 und 30, mehr bevorzugt zwischen 10 bis 20, vor, die in dem erfindungsgemäßen modifizierten Furin-Polypeptid eine Schleifen- oder Helixstruktur erzeugt.
In einer alternativen Ausführungsform führt die Insertion von Aminosäuren zu einer Helixstruktur. In einer solchen Ausführungsform werden die Aminosäuren vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Alanin (A), Leucin (L), Phenylalanin (F), Tryptophan (W), Methionin (M), Histidin (H), Glutamin (Q), Valin (V) und Glutaminsäure (E) ausgewählt. Beispielsweise werden die Aminosäuren 558 bis 738, vorzugsweise die Aminosäuren 578 bis 711, durch die Aminosäuresequenzen EAMHA (SEQ. ID. No 1), AWFQW (SEQ. ID. No 2) oder AQMWHEAMEFWAMQFEAMHA (SEQ. ID. No 3) substituiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Aminosäuren 578 bis 711 des Furin-Polypeptids durch die Aminosäuresequenz AEMWHQAMEV (SEQ. ID. No 4) substituiert.
In einer weiteren Ausführungsform bildet eine Aminosäureinsertion eine Schleifenstruktur, wobei die Aminosäuren vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Serin (S), Isoleucin (I), Threonin (T), Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Lysin (K), Arginin (R), Glycin (G), Tyrosin (Y), Cystein (C), Asparagin (N), Prolin (P), Glutamin (Q) und Hydroxyprolin ausgewählt werden. Beispielsweise werden die Aminosäuren 558 bis 738, vorzugsweise die Aminosäuren 578 bis 711, durch die Aminosäuresequenzen SYNPG, SYQPD oder GSPYQTNGPS substituiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Aminosäuren 578 bis 711 des Furin-Polypeptids durch die Aminosäuresequenz GSPNSQPYDG (SEQ. ID. No 5) substituiert.
Die Auswahl von Aminosäuren zur Bildung von schleifenförmigen und helikalen Strukturen ist dem Fachmann bekannt (A. Lehninger, „Biochemie", VCH, 1985, Seiten 102–107).
In einer alternativen Ausführungsform kann das Arginin an der Aminosäureposition 683 der Furinsequenz durch jedwede der Aminosäuren, vorzugsweise durch Lysin, Glutaminsäure oder Isoleucin, ersetzt werden.
Nukleinsäuren und Vektoren
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Polynukleotide bereit, welche die erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide codieren. Die in solchen Polynukleotiden verwendeten Nukleinsäuren können DNA und/oder RNA sein.
Als Ausgangsmaterial zum Aufbau der erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide kann bzw. können ein Volllängen-Furin-Polypeptid sowie jedwede Derivate davon, die ein Furin-Polypeptid mit einer proteolytischen Aktivität codieren, verwendet werden. Die cDNA-Sequenz, die natives menschliches Furin codiert, wurde von A.M.W. van den Ouweland et al. (Nucleic Acid Res., 1990, 18(3), Seite 664) und R.S. Fuller et al. (Science, 1989, 246, 482) veröffentlicht. Ein solches Furin-Polynukleotid kann von jedweder Säugerart stammen, vorzugsweise vom Menschen, vom Schwein oder vom Rind als Quelle.
Das Polynukleotid wird durch einen Vektor exprimiert, der die geeigneten Elemente für die heterologe Expression der DNA oder RNA bereitstellt. Der Expressionsvektor umfasst z.B. einen Transkriptions-Regulationsbereich und einen Translations-Initiationsbereich, der in einer Wirtszelle funktionsfähig bzw. wirksam ist, eine DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Furin-Polynukleotid codiert, und translationale und transkriptionale Terminationsberei che, die in der Wirtszelle funktionsfähig bzw. wirksam sind, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz durch die Initiations- und Terminationsbereiche reguliert wird.
Der Expressionsvektor kann auch Elemente zur Replikation der DNA oder RNA aufweisen. Der Expressionsvektor kann ein DNA- oder RNA-Vektor sein. Beispiele für DNA-Klonierungs- und Expressionsvektoren sind pBSSKII (J.M. Short, J.M. Fernandez, J.A. Sorge und W.D. Huse, Lambda ZAP, 1988, Nucleic Acids Research 16 (15), 7583–7600; M.A. Alting. Mees und J.M. Short, 1989, Nucleic Acids Research 17 (22), 9494), pBPV, pSVL, pCMV, pRc/RSV, myogene Vektorsysteme (WO 93/09236) oder Vektoren, die von viralen Systemen abgeleitet sind, z.B. von Vakzinia-Virus, Adenoviren, Adeno-assoziiertem Virus, Herpesviren, Retroviren oder Baculoviren. Beispiele für RNA-Expressionsvektoren sind Vektoren, die von RNA-Viren wie z.B. Retroviren oder Flaviviren abgeleitet sind.
In manchen Fällen kann es bevorzugt sein, dass eine Mehrzahl von Kopien des Gens vorliegt, welches den Proteinvorläufer bezogen auf das Furin-Polypeptid exprimiert oder umgekehrt. Dies kann durch Verfahren erreicht werden, die im Stand der Technik gut beschrieben sind. Alternativ können zwei Transkriptions-Regulationsbereiche mit verschiedenen Raten der Transkriptionsinitiation oder mit verschiedenen Promotoren eingesetzt werden, die für eine verstärkte Expression entweder des erfindungsgemäßen Furin-Polypeptids oder für eine Expression des Vorläufer-Polypeptids und/oder eines weiteren Polypeptids, das nicht durch Furin proteolytisch verarbeitet werden soll, sorgen.
Der Expressionsvektor, der das Polynukleotid enthält, welches das erfindungsgemäße modifizierte Furin-Polypeptid codiert, kann zur Transformation von Wirtszellen verwendet werden, die dann das Polypeptid erzeugen. Die transformierten Wirtszellen können in einem Zellkultursystem zur Erzeugung des Polypeptids in vitro gezüchtet werden.
Für einige spezifischen Anwendungen in der Gentherapie, d.h. wenn die Nukleinsäure als solche in ein Organ eines Säugers injiziert wird, kann die Nukleinsäure, DNA sowie RNA, chemisch modifiziert werden. Die chemischen Modifikationen können Modifikationen sein, welche die Nukleinsäure vor einem Nukleaseabbau schützen, z.B. durch Stabilisierung des Grundgerüsts oder der Termini.
Der Expressionsvektor, der die Nukleinsäure enthält, die ein erfindungsgemäße Furin-Polypeptid codiert, kann ferner an einen Säuger ohne vorherige in vitro-Transformation in Wirtszellen verabreicht werden. Der praktische Hintergrund für diese Art von Gentherapie ist in mehreren Patentanmeldungen beschrieben, z.B. in der WO 90/11092. Der Expressions vektor, der die Nukleinsäure enthält, wird mit einem geeigneten Träger gemischt, z.B. einer physiologischen Pufferlösung, und in ein Organ, vorzugsweise einen Skelettmuskel, die Haut oder die Leber eines Säugers injiziert.
Wirtszellen
Das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid wird vorzugsweise durch eine rekombinante Expression erzeugt. Es kann mittels Gentechnik mit bekannten Expressionssystemen hergestellt werden, wie z.B. permanenten Zelllinien oder durch virale Expressionssysteme. Permanente Zelllinien werden durch eine stabile Integration der Fremd-DNA in das Wirtszellengenom von z.B. Vero-, MRC5-, CHO-, BHK-, 293-, HEK 293-, Sk-Hep1-, Leberzellen, Nierenzellen, Fibroblasten, Keratinocyten oder Myoblasten, Hepatocyten oder Stammzellen, wie z.B. hämatopoetischen Stammzellen, oder durch einen episomalen Vektor, der z.B. von Papillomavirus abgeleitet ist, hergestellt.
Alternativ können Zelllinien verwendet werden, die keine endogene Furinaktivität aufweisen (J.M. Moehring und T.J. Moehring, Infect. Immun., 41, 1983, Seiten 998–1009). Beispielsweise können CHO-RPE40- oder FD11-CHO-Zellen verwendet werden. Dabei kann die proteolytische Aktivität des transfektierten erfindungsgemäßen Furins leicht gemessen werden, wodurch die Hintergrundaktivität von endogenem Furin vermieden wird.
Virale Expressionssysteme, wie z.B. das Vakzinia-Virus, das Baculovirus oder retrovirale Systeme, können ebenfalls verwendet werden. Als Zelllinien werden im Allgemeinen Vero-, MRC5-, CHO-, BHK-, 293-, Sk-Hep1-, Drüsen-, Leber- oder Nierenzellen verwendet. Eukaryotische Expressionssysteme, wie z.B. Hefen, endogene Drüsen (z.B. Drüsen transgener Tiere) und transgene Tiere, können ebenfalls zur Expression der erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide verwendet werden. Zur Expression von rekombinanten Proteinen haben sich CHO-DHFR-Zellen als besonders nützlich erwiesen (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 77, Seiten 4216–4220, 1980).
Die erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide werden in den jeweiligen Expressionssystemen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert. Zur Expression in Eukaryoten sind bekannte Promotoren geeignet, wie z.B. SV40, CMV, RSV, HSV, EBV, β-Aktin, hGH oder induzierbare Promotoren, wie z.B. hsp oder ein Metallothionein-Promotor.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Furin-Polypeptids und eines Vorläufer-Polypeptids bereit.
Vorzugsweise wird das Furin-Polypeptid mit von Willebrand-Faktor-Protein und/oder Faktor VIII-Protein coexprimiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Furin-Polypeptids bereit. Dieses Verfahren umfasst das Züchten einer Wirtszelle in einem Nährmedium, umfassend einen Expressionsvektor, der in Transkriptionsrichtung einen Transkriptions-Regulationsbereich und einen Translations-Initiationsbereich, welcher in einer Wirtszelle funktionsfähig bzw. wirksam ist, eine DNA-Sequenz, welche ein erfindungsgemäßes Furin-Polypeptid codiert, und in der Wirtszelle funktionsfähige bzw. wirksame translationale und transkriptionale Terminationsbereiche umfasst. Die Expression dieser DNA-Sequenz wird durch die Initiations- und Terminationsbereiche reguliert. Das Verfahren kann ferner das Messen der Sekretionsrate von exprimierten Furin-Polypeptiden mit proteolytischer Aktivität und das Isolieren von Wirtszellen umfassen, die Furin-Polypeptide exprimieren, und die verglichen mit Wirtszellen, die Wildtyp-Furin exprimieren, eine reduzierte Sekretion zeigen.
Pharmazeutische Zubereitung
Das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid kann als pharmazeutische Zubereitung, die ein erfindungsgemäßes modifiziertes Furin-Polypeptid aufweist, als Einzelkomponentenzubereitung oder in Kombination mit anderen Komponenten als Mehrkomponentensystem bereitgestellt werden. In einer speziellen Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Furin-Polypeptid mit Proproteinen, wie z.B. von Willebrand-Faktor, kombiniert werden.
Spezifische Aktivität
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung weist das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid verglichen mit der proteolytischen Aktivität von Wildtyp-Furinprotein, wie z.B. menschlichem Wildtyp-Furin, eine proteolytische Furinaktivität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 100 % auf.
Die Bewertung der proteolytischen Aktivität kann mit jedwedem geeigneten Test durchgeführt werden, wie z.B. unter Verwendung von fluorogenen Substraten, die eine zweibasige Spaltungsstelle umfassen, für die Furin spezifisch ist (A. Preininger et al., 1999, U. Schlokat et al., 1996, Biotechnol. Appl. Biochem., Band 24, Seiten 257–267). Alternativ kann die proteolytische Aktivität auch durch Inkubieren von Furin mit Proproteinen, wie z.B. pro-rvWF, für eine ausreichende Zeit, gemessen werden. Der Grad der pro-rvWF-Verarbeitung kann durch Western-Blotting analysiert werden.
Sekretionsrate
Die Sekretionsrate kann als die Menge an sezerniertem Furin-Polypeptid („Shed"-Furin) definiert werden, die sich in einem Zellkulturmedium innerhalb einer gegebenen Zeit ansammelt. Die Verminderung der Sekretionsrate des erfindungsgemäßen modifizierten Furin-Polypeptids beträgt mindestens 25 %, vorzugsweise mindestens 50 %, mehr bevorzugt mindestens 90 % und insbesondere mindestens 100 %, verglichen mit der Sekretionsrate von rekombinant exprimiertem Furin, das die Wildtyp-Sequenz aufweist (wie z.B. menschliches Wildtyp-Furin) oder Furin, dem der Transmembranbereich und/oder der cytoplasmatische Bereich fehlt.
Beispielsweise kann die Sekretionsrate durch die immunologische Reaktivität mit Anti-Furin-Antikörpern gemessen werden. Ein geeigneter Antikörper kann gegen die katalytische Domäne von Furin gerichtet werden (Preininger et al., 1999).
Isolationsverfahren
Das erfindungsgemäße Furin-Polypeptid kann von Zellen durch Lyse isoliert und mit herkömmlichen Verfahren, gegebenenfalls in der Gegenwart von Protease-Inhibitoren, weiter gereinigt werden. Die Reinigung kann durch bekannte chromatographische Verfahren durchgeführt werden, vorzugsweise durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern gegen das Furin-Polypeptid oder durch Koppeln des Furin-Polypeptids an eine His-Tag-Gruppe und selektives Binden des Proteins an Ni²⁺-NTA-Agarose (Preininger et al., 1999).
Aufgrund der Tatsache, dass die proteolytischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide verglichen mit Wildtyp-Furin im Wesentlichen unverändert sind, können Proteine, die durch Wildtyp-Furin verarbeitet werden, auch durch die erfindungsgemäßen Furin-Polypeptide verarbeitet werden, d.h. Proteine mit gepaarten Aminosäureresten können als Substrat dienen. Beispiele für Vorläufermoleküle zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können unter anderem von Willebrand-Faktor, Faktor IX, Protein C, Protein S, Prothrombin, Faktor X, Faktor VII, von transformierten Zellen gebildeten Wachstumsfaktor (TGF) beta und dessen Überfamilie, einschließlich Aktivin und Inhibin, morphogenetische Knochenproteine (BMP), Insulin, Relaxin, Wachstumsfaktoren, wie aus von Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Viruspolypeptide, einschließlich die von Cytomegalovirus (CMV), menschlichem Immunschwächevirus und Herpes simplex-Virus abgeleiteten Viruspolypeptide umfassen.
Die Erfindung wird in den anschließend beschriebenen Beispielen veranschaulicht. Variationen innerhalb eines Rahmens, den ein Fachmann in Betracht zieht, werden als zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gehörend betrachtet. Falls nichts anderes definiert ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise vom Fachmann des Fachgebiets verstanden wird, zu dem diese Erfindung gehört. Obwohl jedwede Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen Verfahren und Materialien entsprechen oder zu diesen äquivalent sind, bei der Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, beschränken jedoch den Schutzbereich der Erfindung in keinerlei Weise.
Beispiele
1. Aufbau von Furin R683A
Die Volllängen-Furin-Mutante R683A, die an der Position 683 anstelle von nativem Arginin die Aminosäure Alanin enthält, wurde unter Verwendung eines Ansatzes auf PCR-Basis mit überlappenden verlängerten Primern aufgebaut (Ho et al., 1989, Gene, 77, Seiten 51–59). Anfänglich wurden zwei Standard-PCR-Reaktionen unter Verwendung von Plasmid-pCMV-Furin wt (das die Wildtyp-Furin-cDNA enthält) als Templat und den Primerpaaren 4953 (5' GGGGGATCCC TCTGGCGAGT GG 3') (SEQ. ID. NO 6) und 5210 (5' CGGGGACTCT GCGCTGCTCT G 3') (SEQ. ID. NO 7) oder 5209 (5' CAGAGCAGCG CAGAGTCCCC G 3') (SEQ. ID. NO 8) und 4954 (5" GGGGGATCCC CGCGGCCTAG G 3') (SEQ. ID. NO 9) durchgeführt, wobei 5210 und 5209 die inneren komplementären verlängerten Primer sind, welche die Mutation einführen, und 4953 und 4954 die äußeren Primer sind, die eine Bam HI-Restriktionsstelle enthalten. In einem zweiten PCR-Durchlauf wurden die zwei gereinigten Amplifikationsprodukte der ursprünglichen PCR-Reaktionen für eine Überlappungsverlängerung in der Gegenwart von zwei äußeren Primern 4953 und 4954 kombiniert. Das gereinigte PCR-Endprodukt wurde mit Bam HI abgebaut und zum Ersetzen des Wildtyp-Bam HI-Fragments in Plasmid-pCMV-Furin wt verwendet.
2. Aufbau von Furin-Deletionsmutanten Helix 10, Schleife 10 und Δ578-711
Furin-Expressionskonstrukte Helix 10 (das eine Deletion der Aminosäurereste 578-711 umfasst, die durch 10 helikal strukturierte Reste ersetzt worden sind), Schleife 10 (das eine Deletion der Aminosäurereste 578-711 umfasst, die durch 10 schleifenförmig strukturierte Reste ersetzt worden sind), und Δ578-711 (das eine Deletion der Aminosäurereste 578-711 umfasst) wurden mit inverser PCR erzeugt. Zu diesem Zweck wurde das interne 1176bp Bam HI-Fragment von Wildtyp-Furin in die Bam HI-Stelle des Vektors pBS SKII(+) (Stratagene) subkloniert. Das resultierende Plasmid pBS/fur1176 wurde als Templat für die inversen PCR-Reaktionen der einzelnen Konstrukte verwendet. Im Fall von Helix 10 und Schleife 10 enthielten die spezifischen Sense- und Reverse-Primer jeweils an ihrem 5'-Ende zusätzliche überhängende 15 Nukleotide, die für 5 helikale oder schleifenförmig strukturierte Aminosäuren codierten. Die folgenden Primersätze wurden verwendet: Für Helix 10 der Sense-Primer 5699 (5' CAGGCCATGG AGGTGCACCT GCCTGAGGTG GTGGCCGGCC TCAGC 3') (SEQ. ID. No 10) und der Reverse-Primer 5700 (5' GTGCCACATC TCGGCCCCCT CAGGGGCGGT GCCATAGAGT ACGAG 3') (SEQ. ID. No 11), für Schleife 10 der Sense-Primer 5701 (5' CAGCCCTACG ACGGCCACCT GCCTGAGGTG GTGGCCGGCC TCAGC 3') (SEQ. ID. No 12) und der Reverse-Primer 5702 (5' GCTGTTGGGG CTGCCCCCCT CAGGGGCGGT GCCATAGAGT ACGAG 3') (SEQ. ID. No 13) und für Δ578-711 der Sense-Primer 5723 (5' CACCTGCCTG AGGTGGTGGC C 3') (SEQ. ID. No 14) und der Reverse-Primer 5724 (5' CCCCTCAGGG GCGGTGCCAT A 3') (SEQ. ID. No 15). Die resultierenden PCR-Fragmente wurden gereinigt, mit T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) behandelt, mit T4-DNA-Ligase (Roche) religiert und in den E. coli-Stamm XL1 Blue MRF' (Stratagene) transformiert. Positive Klone, welche die eingeführte Mutation enthielten, wurden durch Sequenzieren selektiert und das mutierte BamHI-Fragment wurde zum Ersetzen des wt 1176bp-BamHI-Fragments in pCMV-Furin wt verwendet.
Im Allgemeinen wurde die Amplifizierung der Zielsequenzen routinemäßig innerhalb von 30 PCR-Zyklen unter Verwendung von 10 bis 20 ng Templat-DNA in einem Gesamtvolumen von 100 μl, das 30 pmol jedes Primers, 200 μM jedes dNTP, 2 mM MgSO₄ in dem eingesetzten 10× PCR-Puffer und 2,5U Vent_R ^®-DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthielt, bei 55 °C Hybridierungstemperatur und 72°C Verlängerungstemperatur durchgeführt. PCR-Fragmente wurden unter Verwendung von QIAEX II-Gelextraktionskit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Die Helix 10-Insertion in die Furin-Deletionsmutante Δ578-711 umfasst die Aminosäuresequenz AEMWHQAMEV (SEQ. ID. No 4).
Die Schleife 10-Insertion in die Furin-Deletionsmutante Δ578-711 umfasst die Aminosäuresequenz GSPNSQPYDG (SEQ. ID. No 15).
3. Transfektion, Zellkultur und Proteingewinnung
Furinkonstrukte wurden transient in 293 HEK-Zellen (menschliche embryonale Nierenfibroblasten; ATCC CRL 1573) und FD11-CHO-rvWF-Zellen (FD11-CHO sind Zellen mit Furinmangel) exprimiert. Die Zellen wurden in DMEM/Ham's F12 (1:1) Medium (Life Technologies), das mit 10 % fetalem Kälberserum ergänzt war (vollständiges Medium), gezüchtet. Zur Transfektion wurden Zellen auf 5 cm-Kulturschalen (Costar) zu einer Konfluenz von 50 bis 75 % gezüchtet und durch eine Calciumphosphat-Copräzipitation in bekannter Weise transfektiert (Fischer et al., 1994). Die transienten Transfektionen wurden mit 20 μg Expressionsplasmid durchgeführt.
Rekombinantes Protein wurde durch Aufbringen von serumfreiem vollständigen Medium auf die transfektierten Zellen nach der Konfluenz (im Allgemeinen 48 Stunden nach der Transfektion) gewonnen, nachdem sie zweimal mit PBS (Ca²⁺- und Mg²⁺-frei, Life Technologies) gewaschen worden sind. Das konditionierte Medium wurde gesammelt und durch Zentrifugation geklärt. Anhaftende Zellen wurden trypsinisiert, mit PBS gewaschen und die Zellgesamtzahl wurde mit einem CASY-Zähler (Schärfe Systems, Deutschland) unter Verwendung einer 30 μm-Kapillare gezählt. Zellextrakte wurden durch Lysieren der Zellen bei einer Konzentration von 5 × 10⁷ Zellen/ml Lysepuffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,5 % Triton^® X100 enthielt, hergestellt. Nach der Inkubation für 30 min bei 4°C wurden die Lysate durch Zentrifugieren für 15 min bei 10000 × g bei 4°C geklärt.
4. Western-Blotting
Proben wurden reduziert und denaturiert, mittels SDS-PAGE auf 4 % Sammel/8 %- oder 10 -Trenngelen getrennt und in bekannter Weise mittels Western-Blotting sichtbar gemacht (Schlokat et al., 1996). Konditioniertes Medium, das von transienten FD11-CHO-rvWF-Transfektionen abgeleitet war, wurde mittels Speed-Vac-Zentrifugation vor dem Beladen 20× konzentriert. Lysate wurden schlitzweise auf SDS-PAGE äquivalent zu 7,5 × 10 Zellen angewandt. Zum Nachweisen von Furinmolekülen wurden monoklonaler Mäuse-Antikörper MON-148 (Alexis), der gegen die katalytische Domäne von Furin gerichtet ist, und alkalische Phosphatase, die an Anti-Maus-IgG-Ziegenserum (Sigma) konjugiert war, als zweiter Antikörper verwendet. Rekombinantes vWF wurde unter Verwendung von Hasen-Anti-vWF- Antiserum (DAKO) und alkalischer Phosphatase, die an Anti-Hase-IgG-Ziegenserum (Promega) als zweiter Antikörper konjugiert war, sichtbar gemacht.
Die 3 zeigt die Menge an „Shed"-Furin in konditioniertem Medium von transient transfektierten FD11-CHO-rvWF-Zellen. Das konditionierte Medium wurde 20× konzentriert und auf 4 Sammel/10 %-SDS-PAGE-Gel aufgebracht und denaturiert. Der Western-Blot wurde mit MON-148 und AP-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper sichtbar gemacht.
Als Kontrolle wurde ein pCMV-Vektor, Wildtyp-Furin-Polypeptid und Δ577G-4xG-10xH verwendet. Das Furinkonstrukt Δ577G-4xG-10xH wurde gemäß Preininger et al. (1999) hergestellt.
Die Figur zeigt deutlich, dass die erfindungsgemäßen Furinkonstrukte keinerlei „Shedding" zeigen, d.h. die Sekretionsrate der Moleküle in das Medium ist verglichen mit rFurin, das die Wildtyp-Sequenz aufweist, oder Furin, das die Transmembrandomäne und die cytoplasmatische Domäne nicht aufweist, wesentlich reduziert.
5. Analyse der in vitro-Furinaktivität in konditioniertem Medium
Die funktionelle Aktivität von „Shed"-Furinmolekülen wurde mit einem fluorogenen Substrat bestimmt, wie es bereits beschrieben worden ist (Schlokat et al., 1996).
6. Beweise für eine intrazelluläre rFurin-Aktivität
FD11-CHO-rvWF-Zellen, welche die Furin-Mutante R683A oder Wild-Typ-Furin stabil exprimieren, wurden durch eine Cotransfektion unter Verwendung von 20 μg Furinexpressionsplasmid und 1 μg Selektionsplasmid pCMV-hyg, das die Beständigkeit bezüglich Hygromycin B vermittelt (Roche), etabliert. Resistente Klone wurden zwei Wochen nach der Transfektion isoliert und durch Subklonieren unter Selektionsdruck stabilisiert. Drei FD11-CHO-rvWF/R683A-Klone (Klon 1, 2 und 3), die sich bezüglich der Menge an sezerniertem rFurin unterschieden und folglich variable Grade der rvWF-Vorläuferverarbeitung zeigten, wurden ausgewählt.
Die intrazelluläre Furinaktivität wurde durch Korrelieren des Grads der rvWF-Vorläuferverarbeitung und der Gegenwart von „Shed"-Furin in FD11-CHO-rvWF/R683A-konditionierten Medien über einen Zeitraum von 24 Stunden gezeigt. Als Kontrollen wurden FD11-CHO-rvWF/Furin wt- und FD11-CHO-rvWF-Zellen verwendet. Zellen wurden in 6-Well- Schalen (1 Well/Zeitpunkt) bis zur Konfluenz gezüchtet und zweimal mit PBS gewaschen, bevor serumfreies Medium für einen Zeitraum von 4, 8, 16 und 24 Stunden angewandt wurde. Das konditionierte Medium wurde mittels Zentrifugation geklärt und zum Nachweis von „Shed"-Furin 20× konzentriert. Eine Abschätzung der rvWF-Vorläuferverarbeitung wurde mittels Western-Blot durchgeführt.
Die 4 zeigt die Verarbeitung von rvWF-Vorläufer in transient transfektierten FD11-CHO-rvWF-Zellen. 100 ng rvWF wurden pro Spur aufgebracht. Die Sonden wurden reduziert, denaturiert und auf ein 4 % Sammel/5 %-SDS-PAGE-Trenngel aufgebracht. Der Western-Blot wurde mit polyklonalem Hase-anti-vWF- und AP-konjugiertem Anti-Hase-IgG-Antikörper entwickelt. Obwohl die Zellen nur transient transfektiert worden sind, zeigen die R683A-, Helix 10-, Schleife 10- und Δ578-711-Furinkonstrukte eine proteolytische Aktivität. Der Ausdruck „transient transfektiert" steht für eine genetisch nicht-homogene, gemischte Zellpopulation. Abhängig von der Transfektionseffizienz werden nur einige der Zellen transfektiert.
Die 5 (welche die 5A bis 5C umfasst) zeigt die Furinexpression in transient transfektierten HEK293-Zellen:
Die 5A zeigt „Shed"-Furin in konditioniertem Medium von transient transfektierten HEK293-Zellen. 15 μl konditioniertes Medium wurden pro Schlitz angewandt. Sonden wurden reduziert, denaturiert und auf eine 4 % Sammel/10 % Trenn-SDS-PAGE aufgebracht. Der Western-Blot wurde mit MON-148- und AP-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper entwickelt.
Die 5B zeigt die Messung von intrazellulärem rFurin in HEK293-Lysaten. Pro Schlitz wurden 7,5 × 10⁵ Zelläquivalente angewandt.
Die 5C zeigt die Ergebnisse eines in vitro-Tests unter Verwendung von konditioniertem Medium und eines fluorogenen Substrats.
Die 5A zeigt, dass die Menge an sezernierten Furin-Polypeptiden in dem Medium, die durch einen spezifischen Antikörper nachgewiesen werden kann, stark reduziert ist. Dies wird durch die in der 5C gezeigten in vitro-Aktivitätsmessungen bestätigt. Die Daten der 5B zeigen, dass die Furin-Polypeptide intrazellulär lokalisiert sind.
Die 6 zeigt die intrazelluläre proteolytische Aktivität des Furinkonstrukts R683A. Der Grad der rvWF-Vorläuferproteinverarbeitung und die Gegenwart von „Shed"-rFurin in dem konditionierten Medium werden verglichen. Die Figur zeigt, dass eine signifikante proteolytische Verarbeitung von vWF-Protein stattfindet, obwohl in dem Medium kein „Shed"-Furin nachgewiesen wird. Dies zeigt, dass dieses Furin-Polypeptid proteolytisch aktiv ist, obwohl es nicht in das Medium sezerniert wird.
Die obere Spur ist ein vWF-Western-Blot, bei dem 100 ng rvWF pro Spur aufgebracht worden sind. Als Positivkontrolle wurde CHO-rvWf verwendet.
Die untere Spur ist ein Furin-Western-Blot von konditioniertem Medium. Das Material wurde 20× pro Spur konzentriert. Als Positivkontrolle wurde „Shed"-Wildtyp-rvWF verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Furin-Polypeptid, umfassend Aminosäuren, wobei die Aminosäuren eine Sequenz aufweisen, welche eine Modifikation, verglichen mit der Aminosäuresequenz von Wildtyp-Furin, umfasst, wobei die Modifikation zwischen den Aminosäuren Ala 557 und Leu 713 von Wildtyp-Furin vorliegt, wobei das Furin-Polypeptid proteolytische Aktivität aufweist, und wobei das Furin-Polypeptid nicht von Wirtszellen in das Kulturmedium sezerniert wird, oder welches in reduzierten Mengen, verglichen mit der Sekretion von Wildtyp-Furin, sezerniert wird.
Furin-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Modifikation zur Bildung einer Schleifen- oder Alpha-Helix-Struktur zwischen den Aminosäuren Ala 557 und Leu 713 von Wildtyp-Furin führt.
Furin-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Modifikation zwischen den Aminosäuren 577 und 713 liegt.
Furin-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Modifikation eine Substitution von 5 bis 30 Aminosäuren ist.
Furin-Polypetid nach Anspruch 1, wobei die Modifikation eine Substitution von 10 oder mehr Aminosäuren ist, welche zur Bildung einer Helix- oder Schleifen-Struktur innerhalb des mutierten Furin-Polypeptids führt.
Furin-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Modifikation das Hinzufügen oder Substituieren von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alanin (A), Leucin (L), Phenylalanin (F), Tryptophan (W), Me thionin (M), Histidin (H), Glutamin (Q) und Valin (V), umfasst.
Furin-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Modifikation das Hinzufügen oder Substituieren von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Serin (S), Isoleucin (I), Threonin (T), Glutaminsäure (E), Asparaginsäure (D), Lysin (K), Arginin (R), Glycin (G), Tyrosin (Y), Cystein (C), Asparagin (N), Glutamin (Q), Prolin (P) und Hydroxyprolin, umfasst.
Furin-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 578 bis 711 deletiert sind.
Furin-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 577 und 713 durch Aminosäuren ersetzt sind, welche die Sequenz AEMWHQAMEV umfassen.
Furin-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 577 und 713 durch Aminosäuren ersetzt sind, welche die Sequenz GSPNSQPYDG umfassen.
Furin-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Modifikation bei Arg 683 vorliegt.
Rekombinantes DNA-Molekül, welches ein Furin-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 12, welches funktionell an eine heterologe Expressions-Kontroll-Sequenz gebunden ist, welcher die Expression des Furin-Polypeptids erlaubt.
Wirtszelle, umfassend einen rekombinanten DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 13.
Wirtszelle nach Anspruch 14, welche zusätzlich ein Polynukleotid umfasst, wel ches mindestens ein rekombinant exprimiertes Vorläufer-Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid ein Substrat für das codierte Furin-Polypeptid ist.
Verfahren zur Herstellung eines Furin-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verfahren: (a) das Züchten einer Wirtszelle in einem Nährmedium, umfassend einen Expressionsvektor, wobei der Expressionsvektor der Reihe nach in Transkriptionsrichtung umfasst: – einen Transkriptions-Regulationsbereich und einen Translations-Initiationsbereich, welcher in der Wirtszelle funktionsfähig bzw. wirksam ist, – eine DNA-Sequenz, welche ein mutiertes Furin-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert, und – in der Wirtszelle funktionsfähige bzw. wirksame translationale und transkriptionale Terminationsbereiche, – wobei die Expression der DNA-Sequenz durch die Initiations- und Terminationsbereiche reguliert wird; (b) das Messen der Sekretionsrate von Furin-Polypeptiden mit proteolytischer Aktivität; und (c) das Isolieren von Furin-Polypeptiden, welche eine reduzierte Sekretion zeigten, umfasst.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend ein Furin-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11.