DE3927073A1 - Verfahren zur herstellung von mikrokuegelchen durch vernetzung von proteinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von mikrokuegelchen durch vernetzung von proteinen

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DE3927073A1
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen durch Vernetzung von Proteinen, die daraus erhaltenen Mikrokügelchen sowie deren Verwendung.
Proteine werden häufig zur Herstellung von Mikrokügelchen oder Mikrokapseln verwendet. Diese Mikrokügelchen oder Mikro­ kapseln werden insbesondere in der Pharmazie, z.B. zur Her­ stellung retardierender Medikamente oder als Vektor zur Ein­ führung eines Medikamentes in ein bestimmtes Organ verwendet.
Verfahren zur Emulsions-Vernetzung von Mikrokügelchen oder Mikrokapseln sind bekannt, worin das Protein mit Hilfe eines bifunktionellen Reagens wie z.B. Glutaraldehyd oder einem Säuredichlorid vernetzt wird. In diesem Verfahren verbleibt das bifunktionelle Reagens zur Ausbildung der Verbrückung auf dem vernetzten Protein. Diese Verfahren besitzen den Nachteil, daß ein künstlicher Spacer zwischen den Proteinen einzufügen ist.
Außerdem ist bekannt, daß Reaktionen zwischen Carboxylgruppen und Aminogruppen mit Hilfe von Carbodiimiden und/oder Succinimid-Derivaten aktiviert werden. Insbesondere wurde eine Aktivierung mit Hilfe dieser Verbindungen bei der Ver­ netzung von Proteinen über eine Reaktion von freinen Carboxyl- und Aminogruppen des Proteins vorgeschlagen. In diesem Fall, wird eine direkte isopeptidische Verbrückung bewirkt. Dieser Vernetzungstyp wird in der internationalen Patentanmeldung WO 85/04 413 für die Herstellung einer schwammförmigen oder blattförmigen vernetzten Matrix auf der Basis von Kollagen beschrieben. Bei diesem Verfahren arbeitet man in einer wäßrigen Phase und versetzt das Kollagen mit einem Carbodiimid und/oder einem bifunktionellen Succinimidylester und heizt dann auf eine erhöhte Temperatur auf, wobei man die vernetzte Kollagenmatrix erhält. In der Patentschrift FR-A 22 80 352 ist ein Verfahren beschrieben, worin man ein Proteintoxin in Gegenwart eines Carbodiimids in einem wäßrigen gepufferten Milieu vernetzt, welches inerte Polystyrollatex-Partikel enthält. Anschließend erhitzt man oder läßt bei Umgebungs­ temperatur stehen wobei man ein vernetztes Protein erhält, welches auf Polystyrollatex absorbiert ist.
Keinem der oben erwähnten Dokumente ist zu entnehmen, daß die Reaktion in einer Emulsion durchgeführt wird und daß man homogene Mikrokügelchen erhält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, von Proteinen in Emulsion Mikrokügelchen durch direkte isopeptidische Verbrückung in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivator herzustellen. Auf diese Weise werden die Vorzüge der Mikrokügelchen beibehalten ohne das Protein kovalent an ein Reagens zu binden, das im ungebundenen Zustand biologisch schädlich oder reizend sein kann. Die vorliegende Erfindung besitzt im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren den Vorteil, daß die Anwesenheit eines Spacers zwischen den Proteinen nicht benötigt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Ver­ fahren zur Herstellung von Mikrokügelchen aus Protein(en) durch Vernetzung in einer Emulsion, das dadurch gekennzeichnet ist, das man unter Rühren eine Emulsion herstellt, deren kontinuierliche Phase aus einem organischen Lösungsmittel besteht, das mit einem oberflächenaktiven Mittel versetzt ist, und daß die diskontinuierliche Phase aus einer hydro­ philen Flüssigphase besteht, welche mindestens ein Protein enthält. Man fügt zu der Emulsion ein Carbodiimid zur Akti­ vierung der Proteinvernetzung hinzu und erhält so einen Mikrokügelchen-Niederschlag, welchen man abtrennt und wäscht.
Das zur kontinuierlichen Phase zugesetzte oberflächenaktive Mittel ist in dieser Phase löslich und richtet die Emulsion in der Art aus, daß die hydrophile Phase in der organischen Phase dispergiert wird. Das oberflächenaktive Mittel kann z.B. ein Sorbitanester sein.
Gemäß einer ersten Ausführungsform ist die diskontinuierliche Flüssigphase eine wäßrige Phase. In diesem Fall befinden sich das Protein und das Carbodiimid in dieser Flüssigphase in Lösung. Die Flüssigphase ist vorzugsweise eine gepufferte Lösung mit bestimmtem pH-Wert. In dieser wäßrigen Phase löst man gegebenenfalls wasserlösliche Produkte auf, welche man einzukapseln wünscht. Gegebenenfalls fügt man ein Solu­ bilisierungsmittel hinzu, welches die Solubilisierung des aktiven Prinzips erleichtert.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform ist die diskontinuierliche Flüssigphase eine Gemisch aus einer wäßrigen Phase und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel. Letzteres ist vorzugsweise Dimethylformamid(DMF). Auf Grund des starken Lösungsvermögens des organischen Lösungsmittels können Moleküle solubilisiert werden, welche in Wasser un­ löslich sind so daß die Einkapselung von Produkten wie z.B. Medikamenten möglich ist, welche in Wasser unlöslich sind. Das einzuschließende Produkt kann sich auch in dem, das organische Lösungsmittel enthaltenden, Gemisch gelöst sein. Die Zugabe eines Reduktionsmittels wie z.B. Dithioerythritol zur diskontinuierlichen Phase kann die Haltbarkeit und Wirksamkeit verbessern.
Zur Bildung der Mikrokügelchen kann jedes Protein verwendet werden, welches eine peptidische Verbrückung ausbilden kann. Weiterhin können hierzu Gemische verschiedener Proteine ver­ wendet werden. Dies können Proteine menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs wie z.B. Enzyme, Transportpro­ teine (Hämoglobin oder Serumalbumin), Nahrungsproteine (Ovalbumin oder Kasein), Strukturproteine (Keratin, Kollagen vom Typ I,II,III oder IV oder Gelatine), bestimmte Abwehrproteine (Antikörper oder immunregulatorische Proteine) sowie andere Proteine wie Toxine, Membranrezeptoren oder Hormone sein. Insbesondere verwendet man Serumalbumin und Lysozym. Die Verbrückungen sind vom Isopeptid-Typ, die man durch Reaktion von NH2-Gruppen des Proteins mit COOH-Gruppen er­ hält. Weiterhin können SH- oder OH-Gruppen eine Verbrückung mit den COOH-Gruppen ausbilden.
Das Lösungsmittel, welches die kontinuierliche Phase bildet, ist ein hydrophobes Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, welches mit der diskontinuierlichen Phase nicht mischbar ist. Insbesondere verwendet man einen aliphatischen C5-C10 Kohlen­ wasserstoff oder einen cycloaliphatischen C5-C8 Kohlenwasser­ stoff. Besonders bevorzugt ist Cyclohexan. Außerdem können Polysiloxane verwendet werden, wie z.B. Hexamethyldisiloxan oder Polymethylsiloxane und Polydimethylcyclosiloxane mit geringer Viskosität oder in flüssigem Zustand.
Das als Aktivator für die Vernetzungsreaktion verwendete Carbodiimid besitzt folgende Formel:
R-N=C=N-R′
worin R und R′ gleich oder verschieden sind und ein Wasser­ stoffatom, einen gegebenenfalls vernetzten aliphatischen C1-C10-Rest, einen cycloaliphatischen Rest, der gegebenenfalls ein Heteroatom trägt, oder einen aromatischen Rest bedeuten. Diese Reste können einen oder mehrere saure oder basische Substituenten tragen, welche die Solubilisierung von Neben­ produkten der Reaktion erleichtern. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Chlorids von 1-Ethyl-3- (3-dimethylamino­ propyl) carbodiimid welches im folgenden als EDCI, HCl be­ zeichnet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann zusätzlich zum Aktivator Carbodiimid ein Katalysator verwendet werden. Dieser Katalysator ist ein Succinimid, insbesondere das N-Hydroxysuccinimid. Der Katalysator wird in die diskonti­ nuierliche Phase mit dem Protein eingeführt. Für den Fall daß man die Proteinvernetzung in Gegenwart eines Carbodiimides und von N-Hydroxysuccinimid durchführt, kann die Vernetzungs­ reaktion, wie in Fig. 1 dargestellt, beschrieben werden. Die Reaktionsgleichung zeigt, daß das Carbodiimidmolekül nicht in die Brücke eingebaut, sondern in ein Harnstoffderivat überführt wird, das anschließend durch einfaches Waschen eliminiert werden kann.
Am Ende der Reaktion erhält man einen Niederschlag von Mikro­ partikelchen, der mehrmals mit Wasser zu Eliminierung von Nebenprodukten, wie z.B. Harnstoffderivaten von Carbodiimid, gewaschen wird. Weiterhin kann man mit einem geeigneten wäßrigen Puffer waschen, insbesondere dann, wenn in den Mikrokügelchen ein Medikament eingeschlossen ist und man das Medikament nicht extrahieren will.
Falls notwendig, kann das Waschen in zwei Schritten erfolgen. Zusätzlich zu dem Waschschritt mit Wasser, um Sekundärprodukte wie z.B. das Harnstoffderivat von Carbodiimid oder N-Hydroxy­ succinimid zu entfernen, kann man einen Waschschritt mit einem wasserfreien Lösungsmittel, wie z.B. Äthylalkohol, vor oder nach dem Waschschritt mit Wasser durchführen, um die konti­ nuierliche Phase, welche mit der flüssigen diskontinuierlichen Phase nicht mischbar ist, zu eliminieren.
Die so erhaltenen Kügelchen werden nach dem Waschen getrocknet, gegebenenfalls lyophilisiert und falls notwendig durch einen Percoll-Gradienten in einem reduzierenden Milieu gereinigt. Durch chromatographische Analyse kontrolliert man auf Abwe­ senheit von Harnstoff in den getrockneten Kügelchen.
Die gewaschenen Mikrokügelchen können mit der Lösung einer Verbindung in Kontakt gebracht werden, welche man an den Mikrokügelchen fixieren will. Nach einer bestimmten Kontakt­ zeit, welche für die Fixierung erforderlich ist, werden die Mikrokügelchen gewaschen und getrocknet.
Die Menge der zu verwendenden Reagenzien ist je nach Versuchs­ bedingungen unterschiedlich:
1. Für Albumin in einer diskontinuierlichen wäßrigen Phase verwendet man 200 mg bis 600 mg EDCI, HCl für 50 mg Protein.
2. Für Albumin in einer diskontinuierlichen Phase zusammen­ gesetzt aus 20% DMF in Wasser, können 200 mg bis 600 mg EDCI, HCl für 500 mg Protein verwendet werden.
Die Temperatur für die Herstellung der Mikrokügelchen beträgt im allgemeinen zwischen 2 und 40°C. Die Reaktionszeit ist variabel und beträgt mindestens fünf Stunden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die neuartigen Mikrokügelchen aus Protein(en), das (die) durch Isopeptidbrücken vernetzt ist (sind). Diese Mikrokügelchen können beispielsweise durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt werden.
In Abhängigkeit vom verwendeten Proteintyp, von der Natur der diskontinuierlichen Phase und der Menge der verwendeten Rea­ genzien können die Merkmale der dabei erhaltenen Mikrokügel­ chen unterschiedlich sein. Tabelle I zeigt, daß die Mikro­ kügelchen ein unterschiedliches mechanisches und physiko­ chemisches Verhalten besitzen können. Weiterhin sind die erzeugten Mikrokügelchen in Abhängigkeit von der gewählten diskontinuierlichen Phase mehr oder weniger durch Verdauungs­ enzyme abbaubar. In Abhängigkeit von der beabsichtigten Ver­ wendung können Mikrokügelchen erzeugt werden, welche mehr oder weniger biologisch abbaubar sind.
Durch Auswahl des pH-Wertes des Reaktionsmediums in Abhängig­ keit vom isoelektrischen Punkt des Proteins kann man Mikro­ kügelchen erzeugen, welche eine positive oder negative Ladung besitzen. Die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen sind somit in der Lage, Produkte mit ionischem Charakter, z.B. Medikamente, einzukapseln oder zu fixieren.
Der Durchmesser der erhaltenen Mikropartikelchen variiert zwischen 3 µm und 1 mm. Die Größe der hergestellten Mikro­ kügelchen ist abhängig von der Rührgeschwindigkeit und dem verwendeten emulgierenden System. Unter Verwendung von Ultraschall kann man einen großen Prozentsatz an Mikropar­ tikeln mit einem Durchmesser kleiner als 10 µm herstellen. Mikrokügelchen mit einem geringeren Durchmesser sind her­ stellbar durch Einbringen eines geeigneten Stabilisierungs­ mittels in die externe organische Phase.
Für die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen eröffnet sich ein weiter Anwendungsbereich.
Ungeladene Mikrokügelchen können in kosmetischen Trägern zur Massage oder Hautpflege verwendet werden. Man nutzt außerdem den Proteincharakter der Mikrokügelchen sowie deren Ähnlich­ keit mit biologischen Gebilden wie Corneocyten aus. Ungeladene Mikrokügelchen können auch als Verdünnungs- oder Fluidisierungs­ mittel in trockenen pharmazeutischen Mitteln sowie in Mittel zur oralen Verabreichung verwendet werden.
Tabelle 1
Die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen können zur Konditionie­ rung von Verbindungen mit pharmazeutischer, kosmetischer oder biologischer Aktivität verwendet werden. Sie können insbe­ sondere als Träger für Medikamente, wie Antiseptika, Fungizide, Bakterizide, antiinflamatorische Mittel, Retinoide oder Anthranoide, sowie für kosmetische Mittel wie Haarfärbemittel oder Sonnenfilter, oder für biologisch aktive Substanzen dienen. Die Produkte können während der Herstellung der Mikrokügelchen eingeschlossen werden. Sie können auch bedingt durch den ionischen Charakter der Mikrokügelchen durch Ein­ tauchen der Partikel in einer Lösung des einzuschließenden Produkts fixiert werden.
Die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen können instabile Medi­ kamente schützen. Die Partikelchen können im Falle besonderer Hauterkrankungen wie bestimmten Ausschlägen, topisch verab­ reicht werden. Die mit einem Medikament beladenen Mikro­ kügelchen können ebenso systemisch verabreicht werden.
In die Zusammensetzung der Mikropartikelchen können Proteine eingeschlossen werden, welche spezifisch mit Bereichen mit bestimmten biologischen Eigenschaften (immunologische oder enzymatische) wechselwirken.
Die Mikrokügelchen können mit Farbstoffen beladen und in kosmetischen Produkten verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen dem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1: Massagecreme
Man stellt folgende Formulierung her
Mikrokügelchen aus vernetztem Albumin 100 µm < ⌀ < 200 µm|7,00 g
Gemisch aus Lanolinalkoholen, emulgiert in Fetten und raffinierten Ölen auf der Basis von Kohlenwasserstoffen, unter der Bezeichnung "Eucerin anhydre" von der Firma "BDF" vertrieben 37,00 g
Parahydroxybenzoesäuremethylester 0,07 g
Parahydroxybenzoesäurepropylester @ Steriles Wasser 55,85 g
Man erhält eine relativ feste Creme mit homogenem Aussehen. Bei ihrer Anwendung ergibt die Creme eine fettige Textur, die Mikrokügelchen sind auf der Haut erkennbar und ver­ stärken den Massageeffekt.
Beispiel 2: Hautpflegecreme
Man stellt folgene Formulierung her
Mikrokügelchen aus vernetztem Albumin ⌀ = 100 µm|6,00 g
Ketostearylalkohol 5,00 g
Ketostearylalkohol polyoxyethyleniert mit 20 mol Ethylenoxyd 0,70 g
Ketosterylalkohol polyoxythyleniert mit 12 mol Ethylenoxyd 0,30 g
Cetylalkohol 1,50 g
Glycerinmonostearat 2,00 g
Vaselineöl 6,00 g
Parahydroxymethylbenzoat 0,08 g
Parahydroxypropylbenzoat 0,07 g
Siliconöl 1,00 g
Steriles Wasser 77,35 g
Man erhält eine weiche Creme, welche zur Reinigung der Haut anwendbar ist. Die Mikropartikelchen sind erkennbar, aber aufgrund ihrer Morphologie bei Berührung nicht zu fühlen.
Beispiel 3: Kapseln mit Mikrokügelchen enthaltend Quinacrin
Quinacrin ist ein Anthelmintikum und Antimalariamittel, welches gewöhnlich auf oralem Weg verabreicht wird. In diesem Beispiel wird ein pharmazeutisches Mittel vorgeschlagen, in dem Quinacrin von Mikrokügelchen getragen wird, welche dessen zunehmende Freisetzung gewährleisten. Die mit Quinacrin be­ ladenen Mikrokügelchen werden in Form von Kapseln bereitge­ stellt, die jeweils 500 mg Mikrokügelchen enthalten.
Zur Herstellung dieser Mikrokügelchen solubilisiert man 50 mg Quinacrinchlorhydrat und anschließend 500 mg Albumin in 2 ml Wasser. Anschließend emulgiert man das Gemisch 3 Minuten unter den unter Beispiel 4 angegebenen Bedingungen in 20 ml Polydimethylcyclosiloxan (von der Firma DOW CORNING unter der Bezeichnung "FLUID DOW CORNING 344", auch bekannt unter dem Namen "Cyclomethicone" der auch später verwendet wird). Dieses flüchtige Silicon wird zu 5 Gew.-% in Sorbitantrioleat, vertrieben von der Firma ICI unter der Handelsbezeichnung "Span 85" hinzugefügt. Man solubili­ siert 600 mg EDCI, HCl in 1 ml Wasser und gibt dies zur oben beschriebenen Emulsion hinzu. Die Vernetzung wird über einen Zeitraum von 12 Stunden unter Rühren und Ausschluß von Licht verfolgt. Mach Beendigung der Vernetzung erhält man die Mikrokügelchen in Form eines intensivgelben Nieder­ schlages, der zentrifugiert, mit 40 ml Wasser gewaschen und lyophilisiert wird.
Unter dem Mikroskop ist zu beobachten, daß das Lyophilisat in Form von individuellen Mikrokügelchen vorliegt. Auf der Kugeloberfläche sind praktisch keine kristallinen Strukturen zu erkennen. Die Gesamtausbeute beträgt 75 Gew.-%, bezogen auf die Masse des eingesetzten Proteins, und der Prozentsatz für den Einschluß von Quinacrin in die Kügelchen beträgt 1 Gew.-%.
Beispiel 4:
Methylenblau wird in Albumin-Mikrokügelchen in einer diskon­ tinuierlichen wäßrigen Phase eingeschlossen. 20 mg Methylen­ blau und 500 mg Serumalbumin werden in 2 ml Wasser gelöst. Das Gemisch wird in 15 ml "Cyclomethicone" (5 Gew.-% in "SPAN 85") emulgiert. Die Emulsion wird in einem 50 ml Kolben mit einem Rührer hergestellt, welcher ein ankerförmiges Blatt aufweist und sich mit einer Geschwindigkeit von 500 Um­ drehungen pro Minute dreht. Nach dreiminütigem Rühren gibt man 1 ml einer wäßrigen Lösung von 300 mg EDCI, HCl hinzu. Der Vernetzungsprozeß wird unter fortgesetztem Rühren über einen Zeitraum von 5 Stunden verfolgt wobei man eine vollständige Verdunstung der externen Phase vermeidet. Nach 5 Stunden erhält man Mikrokügelchen in Form eines intensiv­ blauen Niederschlags, den man zentrifugiert, und nachein­ ander einmal mit Ethanol und zweimal mit Wasser wäscht. Die Waschschritte werden sehr schnell durchgeführt um eine Frei­ setzung von Methylenblau zu begrenzen. Die Mikrokügelchen werden anschließend lyophilisiert. Die Bestimmung des Anteils an eingeschlossenem Methylenblau erfolgt durch quantitative spektrophotometische Analyse bei λ=655,8 nm nach Zermahlen der Mikrokügelchen in einem wäßrigen Milieu. Der Anteil an eingeschlossenem Methylenblau beträgt 1 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Mikrokügelchen.
Beispiel 5:
Methylenblau wird in Mikrokügelchen aus Serumalbumin in einer diskontinuierlichen wasserfreien Phase eingeschlossen. Hier­ zu löst man Methylenblau (20 mg) und N-Hydroxysuccinimid (10 mg) in 2 ml Dimethylformamid. Hierzu gibt man an­ schließend Serumalbumin (500 mg) welches man 3 Minuten in einem Ultraschallbad dispergiert. Das Gemisch wird anschlie­ ßend in 15 ml "Cyclomethicone" (5 Gew.-% in "SPAN 85") gemäß Beispiel 4 emulgiert. Man löst 10 mg EDCI, HCl und überführt dies in die Emulsion. Das Vernetzen, Waschen, Lyophilisieren und die Bestimmung des Anteils an einge­ schlossenem Methylenblau erfolgt gemäß Beispiel 4. Es ergibt sich ein Anteil von 0,59 Gew.-% für eingeschlossenes Methy­ lenblau.
Man bestimmt die Freisetzungskurven für Methylenblau in Wasser für Mikrokügelchen gemäß Beispiel 4 und 5. Die in Fig. 2 gezeigten Kurven zeigen den Prozentsatz an freige­ setzten Methylenblau in Abhängigkeit von der Zeit, ausge­ drückt in Minuten. Die Kurve 1 entspricht der Verwendung von EDCI, HCl in Wasser und Kurve 2 entspricht der Verwendung von EDCI, HCl in Dimethylformamid.
Man kann beobachten, daß die Freisetzung von Methylenblau in entscheidender Weise von Albumin-Mikrokügelchen verzögert wird, welche in einer diskontinuierlichen wäßrigen Phase hergestellt werden. Die Hälfte des Methylenblaus wird in 2 Minuten von Mikrokügelchen freigesetzt, welche in einer wasserfreien Phase hergestellt wurden. Mikrokügelchen, her­ gestellt in einer wäßrigen Phase, setzen die Hälfte des Methylenblaus innerhalb von 35 Minuten frei.
Von beiden Typen von Mikrokügelchen wird mehr als 90 Gew.-% des Methylenblaus innerhalb von 90 Minuten freigesetzt.

Claims (26)

1. Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen aus Protein(en) durch Vernetzung in einer Emulsion, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Rühren eine Emulsion herstellt, deren kontinuierliche Phase aus einem organischen Lösungsmittel und einem ober­ flächenaktiven Mittel und die diskontinuierliche Phase aus einer flüssigen hydrophilen Phase besteht, welche mindestens ein Protein enthält, zu der erhaltenen Emulsion ein Carbodiimid zur Aktivie­ rung der Vernetzung hinzufügt und ein Präzipitat von Mikrokügelchen erhält, das Präzipitat abtrennt und wäscht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in der kontinuierlichen Phase ein Sorbitanester ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die dis­ kontinuierliche Flüssigphase eine wäßrige Phase ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Phase auf einen bestimmten pH-Wert gepuffert ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die dis­ kontinuierliche Flüssigphase ein Gemisch aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und einer wäßrigen Phase ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das or­ ganische Lösungsmittel Dimethylformamid ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich das einzuschließende Produkt in der diskontinuierlichen Flüssig­ phase in Lösung befindet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Re­ duktionsmittel zur diskontinuierlichen Phase hinzugefügt ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel, das die kontinuierliche Phase bildet, ein mit der diskontinuierlichen Phase nicht mischbares Lösungsmittel ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Lö­ sungsmittel,welches die kontinuierliche Phase bildet ein aliphatischer C5-C10-Kohlenwasserstoff oder ein cycloali­ phatischer C5-C8-Kohlenwasserstoff ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Lö­ sungsmittel, welches die kontinuierliche Phase bildet Cyclohexan ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Lö­ sungsmittel, welches die kontinuierliche Phase bildet ein Polysiloxan ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Carbodiimid folgende Formel besitzt: R-N=C=N-R′worin R und R′ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff­ atom, einen gegebenenfalls verzweigten aliphatischen C1-C10-Rest, einen cycloaliphatischen Rest, der gegebenen­ falls ein Heteroatom trägt, oder einen aromatischen Rest bedeutet, wobei diese Reste einen oder mehrere saure oder basiche Substituenten tragen können.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Carbodiimid das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbo­ diimid ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man zu­ sätzlich zum Aktivator einen Katalysator einführt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Katalysator ein Succinimid ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Katalysator N-Hydroxysuccinimid ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikrokügelchen-Niederschlag entweder mit Wasser oder mit einem Puffer oder in zwei Stufen wäscht, wobei die eine Stufe mindestens einen Waschschritt mit Wasser und die andere Stufe einen Waschschritt mit einem wasserfreien Lösungs­ mittel umfaßt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserfreie Lösungsmittel Äthylalkohol ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine aktive Verbindung in den Mikrokügelchen einschließt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Einschluß der aktiven Substanz in die Mikrokügelchen nach dem Vernetzungsvorgang, durch Eintauchen der Mikrokügel­ chen in eine Lösung erfolgt, welche die einzuschließende Verbindung enthält.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Einschluß der aktiven Substanz in die Mikrokügelchen während der Herstellung der Mikrokügelchen erfolgt.
23. Mikrokügelchen aus Protein(en) vernetzt durch isopeptidi­ sche Verbrückung, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19.
24. Mikrokügelchen aus Protein(en) vernetzt durch isopeptidi­ sche Verbrückung, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22.
25. Verwendung von Mikrokügelchen nach Anspruch 23 als Ver­ dünnungs- oder Fluidisierungsmittel in Zusammensetzungen, welche auf oralem Weg verabreichbar sind sowie in trockenen pharmazeutischen Formulierungen.
26. Verwendung von Mikrokügelchen nach Anspruch 24 zur Kon­ ditionierung von Verbindungen mit pharmazeutischer, kos­ metischer oder biologischer Aktivität.
DE3927073A 1988-08-17 1989-08-16 Verfahren zur herstellung von mikrokuegelchen durch vernetzung von proteinen Withdrawn DE3927073A1 (de)

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